WO1996038479A1

WO1996038479A1 - Procede de diagnostic du diabete sucre insulino-dependant et kit de diagnostic

Info

Publication number: WO1996038479A1
Application number: PCT/JP1996/001440
Authority: WO
Inventors: Tetsuro Kobayashi; Hiroshi Marusawa
Original assignee: Fujisawa Pharmaceutical Co., Ltd.
Priority date: 1995-05-30
Filing date: 1996-05-29
Publication date: 1996-12-05

Description

明細書

インスリン依存型糖尿病の診断方法およびそれに用いるキット

技術分野

この発明はィンスリン依存型糖尿病の診断に有用な蛋白質、および該蛋白質のフラグメントを有するペプチド並びに蛋白質など、該蛋白質または該蛋白質のフラグメントを有するぺプチドまたは蛋白質などを用いるィンスリン依存型糖尿病の診断方法およびその診断に用いるキットに関するものであり、医療の分野で利用される。

背景技術

糖尿病はィンスリン依存型糖尿病とィンスリン非依存型糖尿病に大別される。

このうち、インスリン依存型糖尿病（以下、「 I D D M」ということがある）は、糖尿病全体に対する比率は 5〜 1 0 %と低いものの若年齢で発症することが多く、症状の発現は急性でインスリン治療を行わなければ、ケトアシドーシス、昏睡を起し死亡する危険性の高い疾患である。

また、インスリン分泌能が低下した結果、インスリン非依存型糖尿病からインスリン依存型糖尿病に進行する場合もある。

インスリン依存型糖尿病患者は、脬島細胞抗体（以下、「 I C A」ということがある）という自己抗体を産生することが知られており、 I D D Mかどうかを診断する方法としては、血液中の I C Aの存在を螢光抗体間接法で確認する方法が従来から行われてレ、る。しかしながら、この螢光抗体間接法はヒト豚切片を使用するため、その測定がルーチン検査の規模では困難であり、またラットゃサルの脾臓を用いる場合には、感度および再現性の点で不充分である。

そのため、血液中の I C Aの存在をルーチン検査において簡単に高感度かつ再現性良く確認し、 I D D Mを診断できる方法の確立が持ち望まれている。

発明の開示

I C Aの対応抗原には複数のものが考えられているが、その本体は現在までのところ不明である。

この発明の発明者は、その I C Aの対応抗原を明らかにし、その対応抗原を用いて I C Aの測定をより簡便な測定系で高感度で再現性良く行うことを目的とし、鋭意研究を行った。

その結果、ブタの豚臓から得たミトコンドリア分画と、 I C A陽性の I D D M患者血清とを反応させ、得られた抗原抗体複合体から抗原を分離し、ドデシル硫酸ナトリウム一ポリアクリルアミド電気泳動（ S D S - P A G E ) および 2次元電気泳動により、その抗原である蛋白質の分子量および等電点を求めた。

そして、 2次元電気泳動ゲルを染色し、該分子量および等電点の位置に存在する蛋白スポットから、該蛋白質の N端からのアミノ酸配列を決定し、 I C Aの対応抗原である蛋白質を同定した。さらに、その蛋白質のフラグメントを有するペプチドを合成した。

そして、この蛋白質などまたはこのペプチドなどと、被験者から採取した血液などの試料とを反応させ、この反応の有無または程度を検出することにより試料中の I C Aの存在を高感度で再現性良く検出でき、インスリン依存型糖尿病の診断が簡便に精度良く行えることを見い出した。

さらに、この診断の際に用い！）キットを作製することで、この発明を完成した。

この発明は次の 3つの発明に分けられる。 [ I ] I C Aを認識する蛋白質およびペプチド [ 1 — 1 ] 脬島細胞抗体（ I C A ) を認識する、少なくともブタの脬臓から得られうる次の特性を有する蛋白質、および該蛋白質のフラグメントを有するペプチド並びに蛋白質。

( 1 ) 分子量：ドデシル硫酸ナトリウム一ポリアクリルアミドゲル電気泳動法による測定で 1 5 KD ( 2 ) 等電点： p I = 5. 5

( 3 ) N末端から 1 5残基目までのァミノ酸配列：

(1) (5)

Leu— Pro— Pro— A 1 a— Gl y— Asp— I 1 e— Leu—

(10) (15)

P r o— As n— As p— Th r— P r o- (Cys)— Ty r [ I - 2 ] I C Aを認識する、以下のアミノ酸配列を有するぺプチドおよび該ぺプチドまたはそのフラグメントを有するペプチド並びに蛋白質。

(1) (5)

Leu— Pro— Pro— Ala-Gl y— Asp— I 1 e— Leu—

(10)

Pro— Asn— Asp— Thr— Pro— Cy s [ I I ] インスリン依存型糖尿病の診断方法

[ I I 一 1 ] 被験者から採取した試料と、 [ I一 1 ] に記載の蛋白質、または該蛋白質のフラグメントを有するペプチドまたは蛋白質とを反応させ、該反応の有無または程度を検出することを特徴とするインスリン依存型糖尿病の診断方法。

[ I I 一 2 ] 被験者から採取した試料と、 [ I 一 2 ] に記載のペプチド、または該ペプチドまたはそのフラグメントを有するペプチドまたは蛋白質とを反応させ、該反応の有無または程度を検出することを特徴とするインスリン依存型糖尿病の診断方法。

[ I I I ] インスリン依存型糖尿病の診断用キット

[ I I I 一 1 ] 構成成分として、（ 1 ) [ I一 1 ] に記載の蛋白質、または該蛋白質のフラグメントを有するペプチドまたは蛋白質、および（ 2 ) 該蛋白質、または該蛋白質のフラグメントを有するペプチドまたは蛋白質と、生体から採取した試料との反応を検出する手段を含むことを特徴とするインスリン依存型糖尿病の診断用キット。

[ I I I 一 2 ] 構成成分として、（ 1 ) [ I 一 2 ] に記載のぺプチド、または該ペプチドまたはそのフラグメントを有するぺプチドまたは蛋白質、および（ 2 ) 該ペプチド、または該ぺプチドまたはそのフラグメントを有するペプチドまたは蛋白質と、生体から採取した試料との反応を検出する手段を含むことを特徴とするインスリン依存型糖尿病の診断用キット。

以下、それぞれの発明について詳細に説明する。

[ I ] I C Aを認識する蛋白質およびペプチドこの発明の I C Aを認識する蛋白質は、少なくともブタの脬臓から得られうるものであって、後記実施例 1 に示す手順によって明らかにされ、次の特性を有するものである。

( 1 ) 分子量：ドデシル硫酸ナトリウム—ポリアクリルアミドゲル電気泳動法による測定で 1 5 KD

( 2 ) 等電点： P l = 5. 5

( 3 ) N末端から 1 5残基目までのァミノ酸配列：

(1) (5)

Leu— Pro— Pro— A 1 a— Gl y— Asp— I 1 e— Leu—

(10) (15)

Pro-Asn— Asp-Thr— Pro—（Cys) -Tyr この発明の I C Aを認識する蛋白質は、例えば上記の 1 5個のアミノ酸配列を有するペプチドを常法に従い固相法によって合成し、それをゥサギ等の動物に投与して免疫し、得られる抗血清から硫安等の塩析、遠心分離、透析、カラムクロマトダラフィ一などの常法の操作に付して、単離 · 精製することによりポリクローナル抗体を得た後、該ポリクローナル抗体を樹脂に固定させたァフィ二ティークロマトグラフィーを用いて、ブタの脬臓のミトコンドリア分画などから目的とするこの発明の蛋白質を抽出することにより得ることができる。

また、上記の 1 5個のアミノ酸配列に基づき、常法により、ブタまたはヒトの脬臓 c D N Aライブラリーとの R T— P C R を行い、目的とする c D N Aをクローユングし、遺伝子工学的に該蛋白質を製造することもできる。

この発明の蛋白質のフラグメントとは、該蛋白質のアミノ酸配列の一部、すなわち 2個以上の連続するアミノ酸配列を有する該蛋白質の断片およびこれらを修飾する糖鎖をいう。この発明の蛋白質のフラグメントを有するぺプチドおよび蛋白質とは、 I C Aを認識するものであって、該蛋白質のフラグメントを少なくとも 1つ以上そのァミノ酸配列の中に有するぺプチドおよび蛋白質をいい、その例として例えば、上記 1 5個のアミノ酸配列を有するペプチド、そのアミノ酸配列または、その一部を有するペプチドおよび蛋白質などが挙げられる。

[ 1 — 1 ] の蛋白質およびそのフラグメントを有するぺプチド並びに蛋白質は、 I C Aを認識し特異的に反応するので、次に述べるインスリン依存型糖尿病の診断およびその診断に用いるキットの構成成分として極めて有用である。

[ I 一 2 ] の 1 4個のアミノ酸配列を有するペプチドは、 [ 1 — 1 ] の蛋白質の N端を構成するもので、後記実施例 2の手順により合成されたものである。

このペプチドのフラグメントとは、該ペプチドの 1 4個のァミノ酸配列の一部、すなわち 2個以上の連続するアミノ酸配列を有する該蛋白質の断片およびこれらを修飾する糖鎖をいう。このべプチドまたはそのフラグメントを有するペプチドおよび蛋白質とは、 I C Aを認識するものであって、該ペプチドまたはそのフラグメントを少なくとも 1 つ以上そのアミノ酸配列の中に有するぺプチドおよび蛋白質をいう。

[ I 一 2 ] の 1 4個のアミノ酸配列を有するぺプチドは、後記実施例 4 により I C Aを認識することが確認された。従つて、 [ I 一 2 ] のペプチドおよび該ペプチドまたはそのフラグメントを有するペプチド並びに蛋白質は、 I C Aを認識し特異的に反応するので、次に述べるィンスリン依存型糖尿病の診断およびその診断に用いるキットの構成成分として極めて有用である。

以下の説明において、上記の [ I 一 1 ] の蛋白質、および該蛋白質のフラグメントを有するペプチド並びに蛋白質を、「 [ 1 — 1 ] の蛋白質など」ということがある。

同様に、上記 [ I 一 2 ] のペプチドおよび該ぺプチドまたはそのフラグメントを有するペプチド並びに蛋白質を、「 [ I一 2 ] のペプチドなど」ということがある。

[ I I ] インスリン依存型糖尿病の診断方法

この発明のインスリン依存型糖尿病の診断方法は、 [ I I — 1 ] 被験者から採取した試料、好ましくは血液と、上記 [ I一 1 ] の蛋白質、または該蛋白質のフラグメントを有するぺプチドまたは蛋白質とを反応させ、該反応の有無または程度を検出することを特徴とするものである。

この発明のインスリン依存型糖尿病の別の診断方法は、 [ I I 一 2 ] 被験者から採取した試料、好ましくは血液と、上記 [ I 一 2 ] のペプチド、または該ペプチドまたはそのフラグメントを有するペプチドまたは蛋白質とを反応させ、該反応の有無または程度を検出することを特徴とするものである。

すなわち、被験者の血液などの試料中に I C Aが存在するか否かを、 [ 1 — 1 ] の蛋白質などまたは [ 1 — 2 ] のペプチドなどと反応させることによって検知し、その反応の有無または程度によりインスリン依存型糖尿病の診断を行うものである。

具体的には、被験者において、血液中から I C Aがこの発明の [ I 一 1 ] の蛋白質などまたは [ I 一 2 ] のペプチドなどとの反応によって検出された場合に、インスリン依存型糖尿病であると診断することができる。

さらに、この反応の程度により、インスリン依存型糖尿病の細胞破壊の程度を診断もしくはその進行を予想することができる。

被験者の血液を試料として用いる場合には、これに直接かまたは前処理（遠心分離など）した後、この発明の [ I一 1 ] の蛋白質などまたは [ I 一 2 ] のペプチドなどを反応させる。

反応には [ I 一 1 ] の蛋白質などおよび [ I 一 2 ] のぺプチドなどをそれぞれ [ I I I 一 1 ] および [ I I I一 2 ] のキットの形態で用いることが好ましい。

該反応を検出する方法としては、 [ I I 一 1 ] においても [ I I 一 2 ] においても、ェンザィムリンクトイムノソ一ベントアツセィ（ E L I S A ) 、ェンザィムィムノアッセィ（ E I A ) 、フルォレツセンスィムノアッセィ（ F I A ) 、ラジオィムノアッセィ（ R I A ) 、ィムノラジオメトリックアツセィ ( I R MA ) 、化学発光免疫測定法（ C L I A ) 、化学発光酵素免疫測定法（ C L E I A ) 、ラテツクス凝集法などが挙げられる。

[ I I I ] インスリン依存型糖尿病の診断用キット

この発明のィンスリン依存型糖尿病の診断に用いるキットは、 [ I I I 一 1 ] 構成成分として（ 1 ) [ I 一 1 ] の蛋白質、または該蛋白質のフラグメントを有するぺプチドまたは蛋白質、および（ 2 ) 該蛋白質、または該蛋白質のフラグメントを有するぺプチドまたは蛋白質と被験者から採取した試料との反応を検出する手段を含むことを特徴とする。

この発明のィンスリン依存型糖尿病の診断に用いる別のキットは、 [ I I I 一 2 ] 構成成分として（ 1 ) [ I一 2 ] に記載のペプチド、または該ペプチドまたはそのフラグメントを有するペプチドまたは蛋白質、および（ 2 ) 該ペプチド、または該ぺプチドまたはそのフラグメントを有するペプチドまたは蛋白質と、生体から採取した試料との反応を検出する手段を含むことを特徴とする。

この診断用キットにおける [ 1 — 1 ] の蛋白質などおよび [ I - 2 ] のペプチドなどは、例えば担体、例えば 9 6穴マイクロタイタープレート、マイクロカップ、ビーズなどに、室温で固定され、 0. l %T w e e n 2 0含有 T B S (T r i s 生食液）で洗浄後、ブロッキッグ緩衝液（例えば、 1 %牛血清アルブミン含有リン酸緩衝液など）と室温でインキュベートすることにより調製されて用いられる。

この発明の診断用キットに含まれる反応を検出する手段としては [ I I 一 1 ] および [ I I 一 2 ] に記載された検出方法に用いられるもので、例えば免疫組織化学的手法、例えば E I A や E L I S Aの場合には酵素標識 2次抗体、基質、緩衝液、反応停止液、陽性コントロール、陰性コントロールなどが挙げられる。また、 R I Aや I R M Aの場合には、例えば¹²⁵ I で標識した上記 [ I — 1 ] の蛋白質などまたは [ I 一 2 ] のべプチドなど、緩衝液、陽性コントロール、陰性コントロールなどが挙げられる。次に、実施例によってこの発明を詳細に説明する。

実施例 1

(1) ブタ豚よりミトコンドリァ分画の抽出および電気泳動用サンプルの調製

「生化学実験法 I 」（丸善、 3 3 0頁、 1 9 7 4 ) に記載の脬細胞分画抽出法に従って、ブタ脬より、 0. 2 5 M s u e r o s e を用いてミトコンドリァ分画を採取した。

次に、採取した分画の蛋白を 1 % T r i t o n X l 0 0により可溶化し、ラクトパーォキシダーゼ法により I ¹²⁵を標識した。この可溶化抗原に I C A陽性の I D DM患者血清を加え反応させた後、 p r o t e i n A s e p h a r o s eにより抗原抗体複合物を吸着し、遠心により沈降させた。このべレットを 1 % S D S溶液もしくは 1 % N P— 4 0および 9 M U r e aにより溶出し、それぞれ S D S— P A G Eおよび 2次元電気泳動の検体とした。

(2) I C Aを認識する蛋白質の解析

(a) 免疫沈降 S D S— P A G Eによる分子量の同定

(1)の免疫沈降で得た標識抗原を常法に従って S D S— P A G E (アト一社ラビダスミニスラブ電気泳動装置 A E— 6 5 0 0 を使用）を行い、その分子量を同定した（ I C A 陽性血清 n = 5，対照： I C A陰性血清 n = 5 ) ところ、 1 5 K dであった。

(b) 2次元電気泳動による蛋白質スポットの分析

(1)の免疫沈降後の標識抗原を常法に従ってまず等電点電気泳動（ミリポア社 2次元電気泳動装置インべスティゲー

0 ― ターおよびアト一社ラビダスミニスラブ電気泳動装置 A E 一 6 5 0 0 を使用）を行った。その後 S D S— P A G Eに展開し 2次元電気泳動を行った。放射活性は B A S— 2 0 0 0 によるオートラジオグラフィ一によつて検出した。その結果、等電点は P I = 5. 5であることが明らかになつた。

(c) ァミノ酸配列の決定分取用一次元電気泳動ゲルに 3 0 0 μ 1 (タンパク量 3 m g に相当）を a p p 1 y し、等電点電気泳動を行った。その後 S D S — P A G Eに展開し、 C B B染色によって染色を行った。予め求めてあった p I および分子量に相当するスポットを同定した。次いで、この二次元電気泳動を行なったゲルを転写バッファー（ 5 mM T r i s , 1 0 %メタノール）を用いて P V D F膜に転写を行い、 C B B染色後、先に求めた位置の蛋白スポットを切り抜いた。この切り抜いた P V D F膜を洗浄した後、気相シーケンサー（アプライドバイオシステムズ社製の 4 7 6 A P r o t e i n シークェンサ一）に装着し、エドマン反応を行つた。得られた P T H—アミノ酸は順次液体ク口マトグラフ法（測定波長 U V 2 6 9 n m ) によりァミノ酸配列を決定した。

その結果、この蛋白質の N末端から 1 5残基目までのァミノ酸配列は、

(1) (5)

Leu— Pro— Pro— A 1 a— Gl y— As — I 1 e— Leu—

(10) (15)

Pr o-Asn-Asp-Thr-Pro- (Cys) -Tyr と決定された。

なお、 1 4残基目は本法によって検出されなかったので、 C y s と考えられた。実施例 2

N端ペプチドの合成実施例 1 の蛋白質スポットのシークェンス解析によって得られた 1 4個のアミノ酸配列

(1) (5)

Leu— Pro— Pro— A 1 a— Gl y— Asp— I 1 e— Leu—

(10)

Pro-Asn— Asp— Thr— Pro— Cys に基づいて、 A n g e w. c h e m i e . ( V o l 1 0 3， 1 1 7 - 1 3 3 ( 1 9 9 1 ) および I n t . J . P e p t i d e P r o t e i n R e s ( V o l 3 6， 2 5 5〜 2 6 6 ( 1 9 9 0 ) ) に記載の方法に準じて、 M i 1 1 i g e n社製自動合成機（ 9 0 5 0 P e p S y n t h e s i z e r ) を用いて F m o c 固相法にてペプチドを合成した。尚、 F m o c保護アミノ酸としては F m o c — L一口イシン、 F m o c — L一プロリン、 F m o c - L—ァラニン、 F m o c — Lーグリシン、 F m o c — L一イソロイシン、 F m o c — Lーァスパラギン酸 β — 0 t B u ) 、 F m o c — L一ァスノ、°ラギン（ T r t ) 、 F m o c — Lースレオニン（ t B u ) を用いた。ぺプチドは T e n t a g e 1 樹脂を介して C末側から N末側へと合成した。反応溶媒としては、脱保護に 2 0 %ピぺリジン含有 N， N—ジメチルホルムアミド（ D M F ) を、また縮合剤としては、 1 一ハイドロキシベンゾトリアゾール（ H 0 B T ) 及び N， N—ジイソプロピル一 N—ェチルァミン（ D I P E A ) '存在下べンゾトリアゾールー 1 一ィルォキシトリス（ジメチルァミノ）フォスフォニゥムへキサフルオロフォスフェート（ B 0 P ) を用いた。

合成したペプチド樹脂はメタノール（ 5分間）及び N， N— ジメチルホルムアミド（ 5分間）にて洗浄し、乾燥した。そして 8 2 . 5 % トリフルォロ醉酸、 5 %水、 5 %チオアニソール、 5 %ァニソール及び 2. 5 % 2—メルカプトエタノールで処理してペプチドを樹脂から切り離し、合わせて側鎖の脱保護も行った（ 2時間）。

出来たぺプチドはエーテルノ石油エーテル Z 2 —メルカプトエタノール（ 1 ： 2 ： 0. 0 1 ) を加え析出させることにより分散した。その後酢酸/ァセトニトリル/水（ 2 ： 1 ： 7 ) 溶液にて目的ペプチドを抽出し、凍結乾燥して分取した。

その後、逆相 H P L C — M a s s にて目的ペプチドを同定し、同定したピークに担当するぺプチドを分取用逆相 H P L C にて精製した。精製品は凍結乾燥品の状態で保存し、更にこれを M o l I mm u n o l o g y ( v o l 1 7， 7 4 9〜 7 5 6 ( 1 9 8 0 ) ) に記載の方法に準じて K H Lとコンジヱゲーシヨンを行った。

実施例 3

N端べプチドに対する抗体の作成

実施例 2 で合成した N端ペプチドと完全フロイントアジュバントを充分に憑濁し、 2匹のゥサギの皮下に 5回に分けて接種して免疫し、抗血清を作成した。この抗血清を用いてブタ脾ミトコンドリア分画の一次元電気泳動上での W e s t e r n b 1 o t t i n g を行った。その結果、 1 5 K dのバンドに反応が認められた。以上の結果よりこのペプチドを用いて作成したポリクローナル抗体は I C A抗原を一部認識しているものと考えられた。また、このブタ脬抽出分画を二次元電気泳動をし、さらにこのゥサギ血清を用いて W e s t e r n b 1 o t t i n g を行ったところ、先の I C Aを認識する抗原の等電点および分子量に相当するスポットに反応を認めた。さらにこの抗血清を 1 m gZm 1 の合成された実施例 2 の抗原べプチドによつて 4 °Cー晚 p r e i n c u b a t i o n を行った後、 W e s t e r n b l o t t i n g を行った際にはこの反応性は消失し、作成した抗体はこの抗原ペプチドを認識しているものと考えられた。

実施例 4 I C Aの E L I S A法による検出実験

実施例 2 で得た 1 4個のアミノ酸配列：

(1) (5)

Leu-Pro-Pro-Al a-Gl y-Asp-I 1 e-Leu-

(10)

Pro— Asn— Asp— Thr— Pro— Cy s を有するペプチドを N a H C 0 ₃溶液に 2 0 / ₂ !11 1 となるよう溶解し、コ一二ング 9 6穴マイクロタイタープレートに 1 0 0 μ 1 ずつ添加し、 4 °C 1 3時間インキュベートした（ 2 μ g抗原 Ζゥエル）。内容物を除き、リン酸緩衝液（ P B S ) で 3 回洗浄後、 2 % B S A (牛血清アルブミン）一 P B Sを各ウエノレあたり 2 0 0 1 ずつ添加し、 3 7 。C 1 時間インキュペートした。次いで、内容物を除き P B Sで 3回洗浄後、予め I C A陽性の患者血清を 2 % B S A— P B Sにて希釈系列を作成したものを各ゥヱルあたり 1 0 Q μ 1 ずつ添加し、 3 7 °C 1 時間インキュベートした。さらに、内容物を除き P B Sで 3回洗浄後、予め 0. 0 5 %T w e e n 2 0含有 2 % B S A - P B Sを用いて調製したペルォキシダーゼ標識抗ヒトゥサギ I g G 2次抗体を各ゥヱルあたり 1 0 0 1 ずつ添加し、 3 7 °C 1時間インキュベートした。そして、内容物を除き 0. 0 5 %T w e e n 2 0含有 2 % B S A— P B Sで 2回および P B Sで 3回洗浄後、 3, 3'， 5, 5'—テトラメチルベンジジン二塩酸塩水和物 0. 5 m g "m 1 および過酸化水素 0. 3 l Zm l含有基質溶液を 1 0 O 1 ずつ添加し、室温（ 2 5 "C ) 暗所にて 1 5分間インキュベートした。最後に 1 N硫酸 1 0 0 μ 1 ずつ添加し、 1 0分後マイクロプレートリーダー 4 5 0 n mにて各ゥェルの吸光度を測定した。

その結果、 I C A陰性の血清を用いた対照と比べ、明らかに大きい吸光度が濃度依存的に検出された。

このことから、本願発明の蛋白質のフラグメントを有するぺプチドは、脬島細胞抗体（ I C A ) を認識可能であり、インスリン依存型糖尿病の診断に利用できることがわかる。

実施例 5

キットの作成

実施例 2 で得た 1 4個のァミノ酸配列： (1) (5)

Leu— Pro— Pro— A 1 a— Gl y— Asp— I 1 e— Leu—

(10)

Pr o— Asn-As -Thr— Pro-Cy s を有するペプチドを N a H C 0₃溶液に S O /i g Zm l となるよう溶解し、コーニング 9 6穴マイクロタイタープレートに 1 0 0 μ 1 ずつ添加し、 4 °C 1 3時間インキュベートした（ 2 g抗原ゥエル）。内容物を除き、リン酸緩衝液（ P B S ) で 3 回洗浄後、 2 % B S A (牛血清アルブミン）一 P B Sを各ゥエルあたり 2 0 0 μ 1 ずつ添加し、 3 7 °C 1 時間インキュペートした。そして、このプレートを常法により凍結乾燥した。次に示す品目をセットして、この発明のキットを得た。 ( 1 ) 上記のぺプチド固相化プレート

( 2 ) P B S (洗浄液）

( 3 ) ペルォキシダーゼ標識抗ヒトゥサギ I g G ( 2次抗体） ( 4 ) 3, 3', 5, 5'—テトラメチルベンジジン二塩酸塩水和物

(基質）

( 5 ) I N硫酸（反応停止液） ( 6 ) I C A陽性血清

( 7 ) I C A陰性血清産業上の利用可能性この発明の [ 1 — 1 ] の蛋白質、および該蛋白質のフラグメントを有するペプチド並びに蛋白質、 [ 1 — 2 ] のペプチドおよび該ぺプチドまたはそのフラグメントを有するぺプチド並びに蛋白質は、いずれも脾島細胞抗体（ I C A ) を認識し特異的に反応するので、インスリン依存型糖尿病の診断およびその診断に用いるキットの構成成分として極めて有用である。

この発明の [ I 1 — 1 ] および [ I I 一 2 ] のインスリン依存型糖尿病の診断方法によれば、試料中の I C Aの存在を高感度かつ再現性良く検出できるため、インスリン依存型糖尿病の診断を簡便かつ精度良く行うことができる。

この発明の [ I I I 一 1 ] および [ I I I 一 2 ] のインスリン依存型糖尿病の診断用キットを用いれば、インスリン依存型糖尿病の診断が、ルーチン検査において簡便に行える。

Claims

請求の範囲

1 . 脬島細胞抗体（ I C A ) を認識する、少なくともブタの脬臓から得られうる次の特性を有する蛋白質、および該蛋白質のフラグメントを有するペプチド並びに蛋白質。

( 1 ) 分子量：ドデシル硫酸ナトリウ厶ーポリァクリルァミドゲル電気泳動法による測定で 1 5 K D ( 2 ) 等電点： P I = 5. 5

( 3 ) N末端から 1 5残基目までのアミノ酸配列：

(1) (5)

Leu— Pro— Pro— A 1 a— Gl y— Asp— 11 e— Leu—

(10) (15)

P ro-As n-As p-Th r-P r o- (Cys) -Tyr

2 . I C Aを認識する、以下のァミノ酸配列を有するぺプチド、および該ペプチドまたはそのフラグメントを有するぺプチド並びに蛋白質。

(1) (5)

Leu— Pro— Pro-Al a— Gl y-Asp-I 1 e-Leu-

(10)

Pro-Asn-As -Th r-P ro-Cys 3. 被験者から採取した試料と、請求項 1 に記載の蛋白質、または該蛋白質のフラグメントを有するペプチドまたは蛋白質とを反応させ、該反応の有無または程度を検出することを特徴とするィンスリン依存型糖尿病の診断方法。

4. 被験者から採取した試料と、請求項 2 に記載のペプチド、または該ぺプチドまたはそのフラグメントを有するぺプチドまたは蛋白質とを反応させ、該反応の有無または程度を検出することを特徴とするインスリン依存型糖尿病の診断方法。

5. 反応の有無または程度の検出に、ェンザィムリンクトイムノソーベントアツセィ（ E L I S A ) 、ェンザィムィムノアツセィ（ E I A ) 、フノレオレツセンスィムノアッセィ（ F I A ) 、ラジオィムノアッセィ（ R I A ) 、ィムノラジオメトリックアツセィ（ I R M A ) 、化学発光免疫測定法（ C L I A ) 、化学発光酵素免疫測定法（ C L E I A ) およびラテックス凝集法の中から選ばれた 1 つを用いる請求項 3 または 4 に記載のィンスリン依存型糖尿病の診断方法。

6. 構成成分として、（ 1 ) 請求項 1 に記載の蛋白質、または該蛋白質のフラグメントを有するペプチドまたは蛋白質、および（ 2 ) 該蛋白質、または該蛋白質のフラグメントを有するぺプチドまたは蛋白質と、生体から採取した試料との反応を検出する手段を含むことを特徴とするインスリン依存型糖尿病の診断用キット。

7. 構成成分として、（ 1 ) 請求項 2 に記載のぺプチド、または該ぺプチドまたはそのフラグメントを有するペプチドまたは蛋白質、および（ 2 ) 該プチド、または該ペプチドまたはそのフラグメントを有するペプチドまたは蛋白質と、生体から採取した試料との反応を検出する手段を含むことを特徴とするィンスリン依存型糖尿病の診断用キット。

8. 反応を検出する手段がェンザィムリンクトイムノソ一ベントアツセィ（ E L I S A ) 、ェンザィムィムノアツセィ（ E I A ) 、フノレオレツセンスィムノアッセィ（ F I A ) 、ラジオィムノアッセィ（ R I A ) 、ィムノラジオメトリックアツセィ ( I R M A ) 、化学発光免疫測定法（ C L I A ) 、化学発光酵素免疫測定法（ C L E I A ) およびラテツクス凝集法の中から選ばれた 1 つに用いられる手段である請求項 6 または 7に記載のインスリン依存型糖尿病の診断用キット。