JPH11316227A - 自己免疫性肝炎の診断薬及び治療薬 - Google Patents

自己免疫性肝炎の診断薬及び治療薬

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JPH11316227A
JPH11316227A JP11072428A JP7242899A JPH11316227A JP H11316227 A JPH11316227 A JP H11316227A JP 11072428 A JP11072428 A JP 11072428A JP 7242899 A JP7242899 A JP 7242899A JP H11316227 A JPH11316227 A JP H11316227A
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Abstract

(57)【要約】 【課題】 本発明の目的は、自己免疫性肝炎診断薬及び
それをコードするＤＮＡ、免疫検定法に基づく抗体検出
方法、及び自己免疫性肝炎治療薬を提供することにあ
る。 【解決手段】 配列番号２又は配列番号４のアミノ酸配
列の全長又一部を有し、患者の血清中に存在するＳＬＡ
／ＬＰ自己抗体を、抗原抗体反応を用いて検出すること
が可能な自己免疫性肝炎診断薬が提供される。更に、Ｓ
ＬＡ／ＬＰ抗原と該抗原をコードするＤＮＡ、及び免疫
検定法に基づくＳＬＡ／ＬＰ抗体検出方法又は、ＳＬＡ
／ＬＰ抗原を含有する自己免疫性肝炎治療薬も提供され
る。

Description

【発明の詳細な説明】
【０００１】
【発明の属する技術分野】本発明は、免疫反応を用いて
ＳＬＡ／ＬＰ自己抗体を検出する自己免疫性肝炎診断薬
及び治療薬に関するものである。
【０００２】
【従来の技術】自己免疫性肝炎（ａｕｔｏｉｍｍｕｎｅ
ｈｅｐａｔｉｔｉｓ，ＡＩＨ）は、放っておくと肝硬
変に進行する慢性肝炎であるが、治療をすれば予後は非
常によいことが知られている。従って、ＡＩＨの治療に
は、早期診断が重要である。西洋諸国において、全慢性
肝炎患者の５パーセントがＡＩＨと診断されている。し
かし、ＡＩＨを特異的に検出するための診断方法は未だ
確立されていない。現在ＡＩＨの診断は、ウイルス性肝
炎ではないことの確認、患者血液が高い免疫グロブリン
含有量を有していることの確認、主要組織適合抗原［Ｈ
ＬＡ（ヒト白血球抗原）タイプ］の同定、及び自己抗体
の検出等のいくつかの基準に基づいて行われる。自己抗
体は、ＡＩＨ患者の約９０パーセントで検出されるが、
しかし、殆どの検出可能な自己抗体が、例え微量であっ
てもＡＩＨ以外の肝炎患者においても検出される。特
に、抗核抗体（ａｎｔｉ−ｎｕｃｌｅａｒ ａｎｔｉｂ
ｏｄｙ，ＡＮＡ）、抗平滑筋抗体（ｓｍｏｏｔｈ ｍｕ
ｓｃｌｅ ａｎｔｉｂｏｄｙ、ＳＭＡ）、及び非常にま
れではあるが、シトクロムＰ−４５０に対する抗体［肝
臓と腎臓のミクロソーム（ｌｉｖｅｒ−ｋｉｄｎｅｙ−
ｍｉｃｒｏｓｏｍｅ，ＬＫＭ）に対する抗体］等が検出
される。
【０００３】一般的にＳＬＡ［ｓｏｌｕｂｌｅ ｌｉｖ
ｅｒ ａｎｔｉｇｅｎ］（可溶性肝臓抗原）自己抗体に
ついて１９８７年に報告されている（Ｍａｎｎｓ Ｍ．
ｅｔａｌ．，Ｌａｎｃｅｔ １９８７，１：２９２−
４）。この抗体は、これまでの研究によってＡＩＨ患者
の約２５〜３０パーセントに検出されることがわかって
いるが、しかし、現在知られている限り、ＡＩＨ以外の
患者には検出されていない（又は、殆ど検出されていな
い）し、その他の自己免疫性疾患の患者においては検出
されていない（Ｌｏｈｓｅ Ａ．Ｗ．ｅｔ ａｌ．，
Ｚ．Ｇａｓｔｒｏｅｎｔｅｒｏｌ．１９９５，３３：５
２７−３３）。その後の研究により、ＳＬＡ抗原はいわ
ゆるＬＰ（肝臓−膵臓）抗体によっても認識されること
が明らかとなった（Ｓｔｅｃｈｍｅｓｓｅｒ ｅｔ ａ
ｌ，Ｈｅｐａｔｏｌｏｇｙ １９９３，１８：１−
８）。ＳＬＡ抗体を含む血清とＬＰ抗体を含む血清は、
いずれもＳＬＡ抗原に対して同じような反応を示すこと
から、ＳＬＡ抗体とＬＰ抗体の両抗体系は同一である。
それ故、以下、上記ＳＬＡ抗原をＳＬＡ／ＬＰ抗原と呼
ぶ。上記の説明から明らかなように、ＳＬＡ／ＬＰ自己
抗体を検出することは、ＡＩＨを検出する上で大きな価
値がある。
【０００４】患者の血清中でＳＬＡ／ＬＰ抗体を検出す
るための特異的免疫検定法を開発するには、初めにＳＬ
Ａ／ＬＰ抗原を特定する必要がある。しかし、今までこ
れには成功していない。既に１９９０年に肝細胞のケラ
チン８と１８がＳＬＡ／ＬＰ自己抗体の標的抗原である
との報告（Ｊｏｕｒｎａｌ ｏｆ Ｈｅｐａｔｏｌｏｇ
ｙ，１９９０，１１：２３２〜２３９）がなされている
が、その後この研究結果は確認されておらず、反駁さえ
されている（Ｗｉｅｓ Ｉ．ｅｔ ａｌ．，Ｚ．Ｇａｓ
ｔｒｏｅｎｔｅｒｏｌ．，１９９８，３６：９３）。
【０００５】
【発明が解決しようとする課題】上記したように、自己
免疫性肝炎の診断及び治療に有効なＳＬＡ／ＬＰ抗原を
提供することが望まれていた。本発明の課題は、ＳＬＡ
／ＬＰ抗原とそれをコードするＤＮＡ、及びそれらを用
いた診断薬や治療薬を提供することにある。
【０００６】
【課題を解決するための手段】本発明者らは、上記課題
を解決すべき鋭意研究を行った結果、配列表配列番号２
及び配列番号４に記載のアミノ酸配列の全長又一部を有
する、ＳＬＡ／ＬＰ自己抗体により認識されるタンパク
質を知見した。そして、このタンパク質は、患者の血清
中に存在するＳＬＡ／ＬＰ抗体を検出することができ
る。又、ＳＬＡ／ＬＰ自己抗体をコードするＤＮＡも知
見した。本発明は、これらの知見に基づいて完成したも
のである。
【０００７】従って、本発明の主たる１つの目的は配列
番号２又は配列番号４のアミノ酸配列の全長又はその一
部を有し且つＳＬＡ／ＬＰ自己抗体により認識されるポ
リペプチドであることを特徴とする、ＡＩＨの診断薬に
用いられる抗原またはその部分ペプチド、あるいは該抗
原の天然又は人工の変異体が提供することにある。
【０００８】本発明の他の１つの目的は、ＳＬＡ／ＬＰ
自己抗体により認識される、上記の抗原をコードする配
列番号１又は配列番号３の塩基配列の全長又は一部を有
するＤＮＡ、あるいは該抗原の天然又は人工の変異体を
コードするＤＮＡを提供することにある。
【０００９】本発明の他の１つの目的は、ＳＬＡ／ＬＰ
抗原を用いた自己免疫性肝炎の診断薬及び治療薬を提供
することにある。
【００１０】本発明の上記及び他の諸目的、諸特徴並び
に諸利益は、添付の配列表を参照しながら述べる次の詳
細な説明及び請求の範囲の記載から明らかになる。
【００１１】配列表のフリーテキスト 配列番号１の１１８６番〜１１８８番目の塩基はａｇａ
又はａａａである。
【００１２】配列番号２の３９６番目のアミノ酸はａｇ
ａ又はａａａでコードされるアミノ酸である。
【００１３】配列番号３の１００番〜１０２番の塩基は
ｇｃａ又はｇｃｔであり、１０３番目の塩基は不明であ
り、１３４２番〜１３４４番目の塩基はａｇａ又はａａ
ａである。
【００１４】配列番号４の３５番目のアミノ酸はｇｃａ
又はｇｃｔでコードされるアミノ酸であり、３６番目の
アミノ酸は不明であり、４４８番目のアミノ酸はａｇａ
又はａａａでコードされるアミノ酸である。
【００１５】本発明の１つの態様によれば、配列番号２
又は配列番号４に相当するアミノ酸配列の全長又はその
一部を有し且つＳＬＡ／ＬＰ自己抗体により認識される
抗原に対する、患者の血清中に存在する抗体を検出する
ことができることを特徴とする自己免疫性肝炎の診断薬
が提供される。
【００１６】次に本発明の理解を容易にするために、ま
ず本発明の基本的特徴及び好ましい態様を列挙する。
【００１７】（１）配列番号２又は配列番号４に相当す
るアミノ酸配列の全長又はその一部を有し且つＳＬＡ／
ＬＰ自己抗体により認識される抗原に対する、患者の血
清中に存在する抗体を検出することができることを特徴
とする自己免疫性肝炎の診断薬。
【００１８】（２）配列番号２又は配列番号４に相当す
るアミノ酸配列の全長又は一部を有し且つＳＬＡ／ＬＰ
自己抗体により認識されるタンパク質であることを特徴
とする抗原、または該抗原の天然又は人工の変異体。
【００１９】（３）前項２に記載の抗原をコードする配
列番号１又は配列番号３の塩基配列を有し且つＳＬＡ／
ＬＰ自己抗体により認識されるタンパク質をコードする
ＤＮＡ、あるいは該抗原の天然又は人工の変異体をコー
ドするＤＮＡ。
【００２０】（４）ＳＬＡ／ＬＰ抗原をマトリックスに
結合し、結合されたＳＬＡ／ＬＰ抗原を、ＳＬＡ／ＬＰ
自己抗体の有無を試験するための患者の血清及び目的に
適合したトレーサーと共にインキュベートし、次いで未
結合のトレーサーを除去した後、該ＳＬＡ／ＬＰ抗体に
結合したトレーサーの量を定量することを特徴とする、
前項２に記載のＳＬＡ／ＬＰ抗原を用いるＳＬＡ／ＬＰ
自己抗体の検出方法。
【００２１】（５）前項４に記載の検出方法を実施する
ための免疫検定法。
【００２２】（６）前項２に記載の抗原、あるいは該抗
原の天然又は人工の変異体を含有することを特徴とす
る、自己免疫性肝炎の治療薬。
【００２３】（７）前項２に記載の抗原、あるいは該抗
原の天然又は人工の変異体を含有することを特徴とする
体外免疫吸着材。
【００２４】以下、本発明について具体的に説明する。
【００２５】配列番号２及び配列番号４に記載のアミノ
酸配列の全長又一部を有し且つＳＬＡ／ＬＰ自己抗体に
より認識される２つのタンパク質に対する抗体を患者の
血清中で検出することが可能な自己免疫性肝炎診断薬が
初めて発見された。これらのタンパク質をＳＬＡ／ＬＰ
抗原−１及びＳＬＡ／ＬＰ抗原−２と呼ぶ。また、配列
表に挙げられたアミノ酸配列の一部分であり且つＳＬＡ
／ＬＰ自己抗体により（全長ＳＬＡ／ＬＰ抗原が認識さ
れるのと同様に）認識される部分ペプチド、あるいはそ
れの天然または人工の変異体も、本発明により提供され
る。
【００２６】更に、本発明により、配列番号１及び配列
番号３に記載の塩基配列からなる、ＳＬＡ／ＬＰ抗原の
ｃＤＮＡも発見された。これらのｃＤＮＡには２つのス
プライシングによる変異体があり、長い方のＤＮＡ（即
ち、配列番号３のＤＮＡ）は、配列番号１の塩基配列よ
りも１５６塩基長い配列を有している。２種類のスプラ
イシング産物の存在により、ＳＬＡ／ＬＰ抗体陽性の血
清のウエスタンブロッティングにおいて２本のバンドが
現れる理由が説明できる。２本のバンドは、ＳＬＡ／Ｌ
Ｐ抗原（ＳＬＡ／ＬＰ抗原−１及び−２）の分子量であ
る５０ｋＤａの位置に検出されるバンドであるが、この
バンドは、ＳＬＡ／ＬＰ陽性の血清を本発明の抗原を含
む融合タンパク質（タグ等のタンパク質と本発明の抗原
とが融合している組み替えタンパク質）とインキュベー
トして、ウエスタンブロッティングを行った際には検出
されない。これは、インキュベートしている間にＳＬＡ
／ＬＰ陽性の血清に含まれるＳＬＡ／ＬＰ抗体とが本発
明の抗原と結合するためである。一方、ＳＬＡ／ＬＰ陽
性の血清と、同一のベクターを用いて得られた他の融合
タンパク質とをインキュベートしてウエスタンブロッテ
ィングを行うと、（上記のように、他の融合タンパク質
が同一のベクターを用いて得られたものであっても）上
記の他の融合タンパク質は２本のバンドに影響を与えな
い。従って、配列番号１又は配列番号３に対応する塩基
配列の少なくとも１部を有し、ＳＬＡ／ＬＰ自己抗体に
より認識されるタンパク質をコードするＤＮＡであれ
ば、ＳＬＡ／ＬＰ抗原の部分配列及び天然又は人工の変
異体をコードするＤＮＡも本発明により提供される。
【００２７】本発明のＤＮＡを用いれば、ＳＬＡ／ＬＰ
抗原を遺伝子組換え技術または合成によって多量に製造
することが可能であり、得られた抗原は、抗原に対して
特異的なＳＬＡ／ＬＰ自己抗体を用いる公知の方法によ
って同定される。
【００２８】ＳＬＡ／ＬＰ抗原を用いることにより、Ｓ
ＬＡ／ＬＰ自己抗体検出のための確実で特異的な免疫検
定法を開発することが初めて可能になった。ラジオイノ
アッセイ（ＲＩＡ）、化学発光免疫検定法（ＣＩＡ）、
イムノブロッティングおよび酵素免疫検定法（ＥＩＡ）
は、いずれも同じように、ＳＬＡ／ＬＰ自己抗体の検出
に適している。いずれの方法を用いる場合も、本発明の
ＳＬＡ／ＬＰ抗原の１つを、マトリックス、例えばマイ
クロプレートやブロッティング膜に結合しておき、そこ
に被検体となる患者の血清をピペットで加える。インキ
ュベートした後、被検体である血清を除去し、トレーサ
ーでラベルした二次抗体（抗ヒト免疫グロブリン又は抗
免疫グロブリンサブクラスに属する抗体）を用いて、テ
ストされるＳＬＡ／ＬＰ自己抗体による特異的な結合を
検出する。トレーサーとして用いる物質としては、ペル
オキシダーゼやアルカリ性ホスファターゼのような酵素
化合物、あるいは放射性又は化学発光性物質等を使用す
ることができる。ＳＬＡ／ＬＰ自己抗体が被検体である
血清中に多く存在するほど、抗原との結合が強くなる。
スタンダードとしては、健康な献血者から得られた正常
血清（負のコントロール）や、ＳＬＡ／ＬＰ抗体を有す
る患者の血清をさまざまな希釈段階で用いられる。ま
た、被検体である血清中にＳＬＡ／ＬＰ自己抗体が存在
することが明らかな場合には、上記の方法の代わりに、
トレーサーを付したＳＬＡ／ＬＰ自己抗体を含む患者の
特定の血清と本発明の抗原とを結合させることにより、
他の抗原と血清中の抗体との結合を抑制する、本発明の
ＳＬＡ／ＬＰ抗原を用いた抑制免疫検定法（ｉｎｈｉｂ
ｉｔｉｏｎ ｉｍｍｕｎｏａｓｓａｙ）を行うこともで
きる。
【００２９】ＳＬＡ／ＬＰ抗原は、自己免疫性肝炎の患
者においてのみ免疫学的に認識されるため、この抗原は
この疾病（自己免疫性肝炎）の病因解明に重要な意味を
持つ。そのため、ＳＬＡ／ＬＰ抗原を（ＡＩＨに対して
特異的に作用する）特異的な免疫治療薬として利用する
ことが可能である。本発明は上記の抗原を含有する自己
免疫性肝炎治療薬にも関する。この治療薬は、ＡＩＨに
とって特異的な免疫療法、例えば、抗原の経口又は経鼻
接種による免疫寛容の誘導、Ｔ細胞ワクチン又は体外免
疫吸着法などに用いることができる。本発明のＳＬＡ／
ＬＰ抗原の同定及び単離により、この抗原を用いた自己
免疫性肝炎にとって特異的な免疫治療薬の製造が可能と
なった。
【００３０】
【実施例】以下に実施例により本発明を具体的に説明す
るが、これらは本発明の範囲を限定するものではない。 実施例１ 組換えＳＬＡ／ＬＰ抗原（配列番号２）を用いたＥＬＩ
ＳＡによるＳＬＡ／ＬＰ抗体の検出
【００３１】組換えＳＬＡ／ＬＰ抗原をＨｉｓタグを用
いて精製した。得られたＳＬＡ／ＬＰ抗原５０μｇを５
０μｌのＰＢＳの入ったマイクロプレートに加えて一晩
静置した。この溶液をピペットで取出した後、マイクロ
プレートを洗浄し、続いて１％ＢＳＡ／ＰＢＳ溶液を用
いて室温で１時間マイクロプレートの前処理を行った。
その後、５０μｌの１００倍に希釈した正常血清、ＳＬ
Ａ／ＬＰ抗体を含む血清、又はコントロール血清（ＡＩ
Ｈ以外の肝臓病患者の血清）のいずれかをマイクロプレ
ートに加え、３０分インキュベートした。マイクロプレ
ートを洗浄した後、ペルオキシダーゼでラベルした抗ヒ
ト免疫グロブリンの８，０００倍希釈溶液を二次抗体と
してマイクロプレートに添加してインキュベートした。
抗体と結合しない過剰な二次抗体をマイクロプレートか
ら洗浄した後、ＡＢＴＳ溶液［５５ｍｇの２，２’−ア
ジドジ−３−エチル−べンズチアジン−６−スルホン酸
（ドイツ国、Ｓｅｒｖａ社製）と５０μｌのＨ２Ｏ２を
含む５ｍｌの０．０１ＭＫ２ＨＰＯ４溶液（ｐＨ ６．
０）をＰＢＳで３００倍に希釈したもの］を添加し、吸
光度を測定した。測定結果を以下の表に示す。
【００３２】
【表１】
【００３３】タイターテック マルチスキャンＭＣ（Ｔ
ｉｔｅｒｔｅｃ Ｍｕｌｔｉｓｃａｎ ＭＣ）（ドイツ
国、Ｆｌｏｗ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ社製）による
測定結果から、ＳＬＡ／ＬＰ抗原を含む患者の血清の全
てが、正常血清及びＡＩＨ以外の肝臓疾患の患者の血清
と比較して、著しく高い吸光度を示した。
【００３４】
【発明の効果】本発明によれば、配列番号２又は配列番
号４のアミノ酸配列の全長又はその一部を有するＳＬＡ
／ＬＰ抗原とそれをコードするＤＮＡが提供される。本
発明の抗原を用いることにより、自己免疫性肝炎の診断
薬及び治療薬を作成することができる。
【配列表】
───────────────────────────────────────────────────── フロントページの続き (51)Int.Cl.6 識別記号 ＦＩ Ｇ０１Ｎ 33/564 Ｇ０１Ｎ 33/564 Ｚ

Claims (7)

    【特許請求の範囲】
  1. 【請求項１】 配列番号２又は配列番号４に相当するア
    ミノ酸配列の全長又はその一部を有し且つＳＬＡ／ＬＰ
    自己抗体により認識される抗原に対する、患者の血清中
    に存在する抗体を検出することができることを特徴とす
    る自己免疫性肝炎の診断薬。
  2. 【請求項２】 配列番号２又は配列番号４に相当するア
    ミノ酸配列の全長又は一部を有し且つＳＬＡ／ＬＰ自己
    抗体により認識されるタンパク質であることを特徴とす
    る抗原、または該抗原の天然又は人工の変異体。
  3. 【請求項３】 請求項２に記載の抗原をコードする配列
    番号１又は配列番号３の塩基配列を有し且つＳＬＡ／Ｌ
    Ｐ自己抗体により認識されるタンパク質をコードするＤ
    ＮＡ、あるいは該抗原の天然又は人工の変異体をコード
    するＤＮＡ。
  4. 【請求項４】 ＳＬＡ／ＬＰ抗原をマトリックスに結合
    し、結合されたＳＬＡ／ＬＰ抗原を、ＳＬＡ／ＬＰ自己
    抗体の有無を試験するための患者の血清及び目的に適合
    したトレーサーと共にインキュベートし、次いで未結合
    のトレーサーを除去した後、該ＳＬＡ／ＬＰ抗体に結合
    したトレーサーの量を定量することを特徴とする、請求
    項２に記載のＳＬＡ／ＬＰ抗原を用いるＳＬＡ／ＬＰ自
    己抗体の検出方法。
  5. 【請求項５】 請求項４に記載の検出方法を実施するた
    めの免疫検定法。
  6. 【請求項６】 請求項２に記載の抗原、あるいは該抗原
    の天然又は人工の変異体を含有することを特徴とする、
    自己免疫性肝炎の治療薬。
  7. 【請求項７】 請求項２に記載の抗原、あるいは該抗原
    の天然又は人工の変異体を含有することを特徴とする体
    外免疫吸着材。
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