WO1996030509A1 - Promoteur vegetal et expression genetique l'utilisant - Google Patents

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WO1996030509A1
WO1996030509A1 PCT/JP1996/000777 JP9600777W WO9630509A1 WO 1996030509 A1 WO1996030509 A1 WO 1996030509A1 JP 9600777 W JP9600777 W JP 9600777W WO 9630509 A1 WO9630509 A1 WO 9630509A1
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plant
gene
promoter
dna
seq
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PCT/JP1996/000777
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Toshiharu Oba
Syuichi Takahashi
Yoshiko Anma
Kiyozo Asada
Ikunoshin Kato
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Takara Shuzo Co., Ltd.
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    • C12N9/10—Transferases (2.)
    • C12N9/1048—Glycosyltransferases (2.4)
    • C12N9/1051—Hexosyltransferases (2.4.1)

Definitions

  • the present invention relates to a plant promoter and a gene expression method using the promoter.
  • the present invention relates to the development of new varieties of plants using gene recombination technology, plant engineering such as functional modification, and plant cell engineering such as functional modification of plant cultured cells that produce useful metabolites.
  • the present invention relates to a plant-derived promoter useful for the above, a DNA fragment ligated in a state where the useful gene can be expressed, and a vector containing the DNA fragment.
  • the present invention also relates to a plant or plant cell transformed with the DNA fragment or a vector containing the DNA fragment, or a transgenic plant regenerated from the plant cell. Furthermore, the present invention relates to a method for cloning the plant promoter.
  • Promoters that induce the expression of useful substances and enzymes in a tissue-specific manner have so far been described in various tissues of seeds [Plant Cell Engineering, Vol. 3, pp. 568-576 (1991)], leaf and flower. Each tissue [Science, Vol. 250, pp. 931-936 (1990)], tuber [plant cell engineering, Vol. 3, pp. 577-587 (1991)], tuberous root, nodule [Science, No. 250, 948-954 (1990)], a gene that is specifically expressed has been isolated and its promoter expression has been analyzed in transgenic plants.
  • promoters that have been used in these vector systems in the past are mostly promoters derived from Ti plasmid possessed by Agrobacterium tumefaciens and promoters derived from the gene of cauliflower mosaic virus (CaMV). . These promoters are constantly expressed irrespective of the growth stage or tissue of the plant into which the gene has been introduced, cannot be controlled, and have low expression levels. In addition, a promoter containing an expression control region that induces tissue-specific expression,
  • a chimeric gene containing a promoter that induces the expression of a substance or enzyme that is strongly useful at the time of cell growth instead of these promoters, secondary metabolism can be achieved under the conditions where the cells grow.
  • a promoter that induces the expression of a substance or enzyme that is strongly useful at the time of cell growth instead of these promoters, secondary metabolism can be achieved under the conditions where the cells grow.
  • the biosynthesis of the product can be promoted, it is particularly strongly expressed during cell growth, and there is no promoter that induces the expression of useful substances and enzymes.
  • an inducible promoter biosynthesis of secondary metabolites becomes possible as the cells proliferate, and the productivity of useful secondary metabolites can be greatly improved.
  • a promoter capable of inducing expression in a tissue-specific manner and a promoter capable of controlling expression with a plant hormone or the like are desired.
  • An object of the present invention is to enable tissue-specific expression, particularly at the site and time required for Xyloglucan reconstitution of plant cell walls, to induce the expression of plant hormones.
  • a plant-derived promoter whose expression can be controlled, a DNA fragment containing the promoter, a vector containing the DNA fragment, a plant or a plant cell transformed with the DNA fragment or the vector, or regenerated from the plant cell. And a method of cloning the plant promoter.
  • the present inventors paid attention to the fact that the plant-derived endokindroglucan transferase (EXT) gene and its family gene are expressed in a tissue-specific manner, and cannot provide a promoter whose expression can be controlled and its vector. I thought. Furthermore, it was thought that plant cells and plants could be improved using this promoter. Thus, the present inventors attempted to clone a region containing a promoter that would be upstream of a plant-derived EXT ⁇ gene, but found that many families including pseudogenes (pseudogenes) were used.
  • pseudogenes pseudogenes
  • the inventors of the present invention have conducted intensive studies and, as a result, succeeded in cloning the bromoester of the EXT gene, analyzed the promoter portion, and determined the nucleotide sequence of the promoter. Then, this promoter was cut out, connected to a gene for glucuronidase (GUS) derived from Escherichia coli (E. coli), and this chimeric gene was introduced into plant cells. . It was confirmed that the GUS gene was strongly expressed in the transfected cells. Similarly, for the family gene of the EXT gene, the nucleotide sequence of a portion of the promoter was determined, the promoter was connected to the GUS gene derived from E. coli, and this chimeric gene was introduced into plant cells. Of course, it was confirmed that the GUS gene was strongly expressed.
  • GUS glucuronidase
  • Northern hybridization allows the EXT gene containing this promoter to be expressed in a tissue-specific manner, particularly at the site and time required for Xyloglucan reconstitution of plant cell walls, and to allow for the logarithmic growth phase or constant growth of cultured cells.
  • the present inventors confirmed that the EXT gene containing the promoter expressed in a normal period and the family gene thereof were present, respectively.
  • an aspect of the first invention of the present invention relates to a plant promoter that induces tissue-specific expression, and relates to a gene encoding an enzyme having a function of reconstituting Xyloglucan of a plant cell wall.
  • a plant promoter that regulates expression which has bromo overnight activity at sites requiring Xyloglucan reconstitution of plant cell walls, particularly, or has promoter activity at the time of Xyloglucan reconstitution of plant cell walls. .
  • the second embodiment of the present invention relates to the plant promoter of the first invention, which is contained in any one of the nucleotide sequences selected from SEQ ID NOs: 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7 and 8 in the sequence listing. It is characterized by that.
  • a third aspect of the present invention is characterized in that it can hybridize to the nucleotide sequence of the second aspect, and has a promoter activity in a plant or a plant cell, or a transgenic plant regenerated from the plant cell. .
  • a fourth aspect of the present invention relates to a DNA fragment containing the plant promoter according to the first, second, or third aspect, which is capable of expressing a useful gene in the plant promoter. It is a DNA fragment that has been packed in a state.
  • a fifth aspect of the present invention relates to a vector, characterized by containing the plant promoter of the first, second or third aspect, or the DNA fragment of the fourth aspect.
  • a sixth aspect of the present invention relates to a plant or a plant cell transformed with the DNA fragment of the fourth aspect or the vector of the fifth aspect, or a transgenic plant regenerated from the plant cell.
  • a seventh aspect of the present invention relates to a method for producing a protein, wherein at least one of the transformed plant or plant cell of the sixth aspect and a transgenic plant regenerated from the plant cell is used. It is characterized by.
  • An eighth aspect of the present invention relates to a method for controlling a plant form, comprising using the DNA fragment of the fourth aspect or the vector of the fifth aspect.
  • a ninth aspect of the present invention relates to a method for cloning a plant promoter, which encodes a gene encoding an enzyme having a function of performing Xyloglucan prototyping of a plant cell wall, in particular, an end-type kinloglucan transferase or a functional equivalent thereof. It is characterized by using a gene. '' Detailed description of the invention
  • promoter refers to a TATA box that is located 20 to 30 base pairs upstream from the transcription start point (+1) and has the function of initiating transcription by RNA polymerase from a precise position. Or a region similar to the TATA box, but not necessarily before or after these regions.In addition to this region, it is necessary for proteins other than RNA polymerase to associate for expression networking. A region may be included.
  • promoter region may be used, which indicates the region containing the promoter described herein.
  • promoter activity refers to a method in which a useful gene is ligated in a state capable of being expressed downstream of a promoter and introduced into a host (eg, a plant, a plant cell, or a transgenic plant regenerated from the plant cell). In this case, it has the ability and function to produce a gene product of a useful gene in the host or outside the host.
  • a protein that can be easily quantified is coded downstream of the promoter.
  • a gene reporter gene
  • a gene is linked in an expressible state, introduced into a host, and the expression level of these proteins is measured. The presence or absence and strength of the promoter are expressed as promoter activity.
  • a useful gene is ligated in such a way that it can be expressed downstream of the promoter and introduced into the host, if the expression of the gene product of the useful gene is confirmed inside or outside the host, The promoter will have promoter activity in the introduced host.
  • the term "gene encoding an enzyme having a function of reconstituting Xyloglucan of a plant cell wall” means a gene encoding an enzyme which is specifically expressed upon reconstitution of Xyloglucan of a plant cell wall. It is a gene, especially the gene encoding the end-type quinone glucan transferase (EXT) and the family of the EXT gene. Family genes of the EXT gene include, for example, the BRU1 gene [Blunt 'Plant Physiology, Vol. 104, No. 161-1: L page 70 (1994)], and the meri-5 gene [The-Brant' Cell, Vol. 3, pp. 359-370 (1991)], and the XRP gene obtained by the present invention.
  • EXT end-type quinone glucan transferase
  • site required for Xyloglucan regeneration in the plant cell wall refers to a site specifically expressed by a gene encoding an enzyme having a function of regenerating Xyloglucan in the plant cell wall.
  • Xyloglucan of these plant cell walls As long as the gene encoding the enzyme having the function of performing the configuration is specifically expressed, the site where the gene is expressed is located in the plant cell wall as referred to herein.
  • the EXT gene which is one of the genes encoding enzymes having the function of reconstituting Xyloglucan of the plant cell wall, and the family gene of the EXT gene, each of which has a specific expression site. Although they may be different, they are also included in the site required for Xyloglucan reconstitution of the plant cell wall referred to herein.
  • time of Xyloglucan reconstitution of the plant cell wall refers to the time at which the gene encoding the enzyme having the function of reconstituting Xyloglucan of the plant cell wall is specifically expressed.
  • these genes encoding enzymes having a function of reconstituting Xyloglucan in the cell wall of the plant are specifically expressed, and the timing of their expression is based on the Xyloglucan reconstitution of the plant cell wall referred to in this specification. Included in the period.
  • the EXT gene which is one of the genes encoding an enzyme having the function of remodeling the plant cell wall Xyloglucan
  • the family gene of the EXT gene are specific, respectively.
  • the expression time is different, and these are also included in the Xyloglucan reconstitution time of the plant cell wall referred to herein.
  • cultured cells have a large number of dividing cells in the logarithmic growth phase, and cell wall synthesis and cell wall reconstruction are active. Also, in the stationary phase, cell expansion is active, which requires reconstitution of the cell wall. At each of these times, cell wall regeneration is required.
  • the stage of expression in cultured cells is completely different between the tobacco-derived EXT gene and the XRP gene, which is a family of the tobacco-derived EXT gene. One ing. In other words, the EXT gene derived from tobacco is specifically and strongly expressed during the logarithmic breeding season, and is about one-twentieth in the stationary phase.
  • the XRP gene a family gene of the tobacco-derived EXT EX gene, is specifically and strongly expressed during the stationary phase. In this way, the time at which an enzyme having the same enzyme activity is specifically expressed is controlled by the promoter of the gene that the enzyme encodes. In such a case, the logarithmic growth phase or stationary phase is also included in the period of Xyloglucan reconstitution of the plant cell referred to herein.
  • methionine residue at the N-terminus of a protein expressed in E. coli is often removed by the action of methionine aminopeptidase, but depending on the type of protein, methionine residue may be present. Both with and without radicals are generated. However, the presence or absence of this methionine residue often does not affect the activity of the protein.
  • IL-2 human interleukin 2
  • an N-terminal peptide chain derived from another protein may be added to the N-terminal of the target protein, or may be added to the N-terminal or C-terminal of the target protein.
  • a polypeptide in which one or more amino acid residues have been deleted, added, inserted, or substituted with at least one amino acid residue in the amino acid sequence of the target protein is also functionally equivalent to the target protein.
  • the gene encoding such a polypeptide, whether isolated from a natural source or artificially produced has a functional property of the present invention. Included in equivalents.
  • “useful gene” includes a gene encoding a protein that can be expressed in a plant or a plant cell or a transgenic plant regenerated from the plant cell, a plant or a plant. Binding of a cell, or a transgenic plant-derived antisense RNA regenerated from the plant cell, or a transcription factor derived from a plant or a plant cell, or a transgenic plant regenerated from the plant cell Arrestor or transcript that encodes a protein Examples include a decoy having a sequence of a factor binding site or a similar sequence, a plant or a plant cell, or a ribozyme that cleaves mRNA derived from a transgenic plant regenerated from the plant cell.
  • Examples of a gene encoding a protein that can be expressed in a plant or a plant cell, or a transgenic plant regenerated from the plant cell include a plant-derived gene.However, the present invention is not limited thereto. If it can be expressed in a plant or a plant cell, or a transgenic plant regenerated from the plant cell, those derived from microorganisms such as bacteria, yeasts, actinomycetes, filamentous fungi, fungi assigning fungi, and basidiomycetes; Alternatively, useful genes referred to herein include those derived from organisms such as animals.
  • the term “decoy” refers to a gene or a binding site of a transcription factor that encodes a binding protein of a transcription factor derived from a plant or a plant cell or a transgenic plant regenerated from the plant cell. Refers to DNA that has a sequence or a similar sequence, and that suppresses the action of transcription factors by introducing them into cells as “decoys”.
  • ribozyme refers to one that cleaves the mRNA of a particular protein and one that inhibits the translation of these particular proteins. Ribozymes can be designed from gene sequences encoding specific proteins, and cleave mRNAs of specific proteins irrespective of the type of ribozyme, such as hammerhead ribozymes, hairpin ribozymes, and delta ribozymes If they inhibit the translation of these specific proteins, they are included in the ribozyme referred to in the present specification.
  • the plant used in the present invention may be any plant having an enzyme capable of reconstituting Xyoglucan of the plant cell wall.
  • dicotyledons examples include azuki, soybean, Arabidopsis, tomato, jasimo, rape, rape, castor, citrus, tobacco, etc.
  • plants having EXT and EXT-like enzymes expressed in a tissue-specific manner can be used.
  • the EXT gene is a housekeeping gene for plants, there are many family genes.
  • the DNA fragment containing the promoter region of these family genes is responsible for the presence of many family genes, including pseudogenes, as well as the EXT gene and the region upstream from the family gene.
  • the plaque formation ability of the plaque obtained when a phage containing a fragment containing the phage is infected with a host bacterium is reduced.In the plaque hybridization method known in the art, the promoter of the EXT gene is cloned. It is not easy.
  • an EXT arrested gene of a plant different from the target and the cDNA of the family gene can be used.However, in order to perform more efficient hybridization, the same species as the target is used. It is desirable to make the cDNA of the plants of this species a probe.
  • EXT telegene cDNA the present inventors have previously described azuki (Vigna angularis), soybean (Glycine max), Arabidopsis thaliana, and tomato.
  • the cDNA of the family gene can also be isolated by using the full-length or-part of the EXT gene cDNA as a probe.
  • EXT gene cDNA for example, all of the above-mentioned EXT gene cDNA and the xyloglucanase gene of Tropaeolum majus [The Plant. Journal, Vol. 3, pp. 701-711 (1993)]
  • the cDNA of the family gene can be efficiently isolated from a wide range of plants.
  • PCR is performed by synthesizing primers based on the conserved regions [Consensus PCR: Molecular and Cellular Biology (Molecular and Cellular Biology)]
  • a cDNA library is, for example, RNA from Azuki Is prepared, and poly (A) + RNA is purified using Oligotex-1 dT30 (manufactured by Nippon Roche). Next, for example, reverse transcription is performed using the poly (A) + RNA and an oligo dT primer. The enzyme acts to synthesize cDNA.
  • a cDNA library can be prepared from the cDNA using a cDNA synthesis kit system plus (Amersham). By using this cDNA library and performing plaque hybridization using the EXT gene cDNA as a probe, for example, 96 positive plaques can be obtained from 5 ⁇ 10 4 breaks. These plaques were subjected to the bleach lysate method [Molecular Cloning A Laboratory Manual, 2nd Edition, Chapter 2, pages 60-66, T. Maniateis (T. Maniatis et al., Cold Spring Harbor Laboratory (Cold Spring Harbor Laboratory, published in 1989), amplified using this method, and performed dot hybridization using the amplified signal. Can be classified.
  • Phage is isolated from two types of plaques that show a different signal intensity from the Azuki EXT gene, and the inserted DNA is extracted. Cleavage these DNAs with the restriction enzyme EcoB I (Takara Shuzo) and confirm the length of the DNA fragments by agarose gel electrophoresis. The confirmed DNA fragments of about 730 bp, 430 bp and 109 Obp were purified, subcloned into EcoUC site of pUC18 (Takara Shuzo), and the plasmids were respectively pVX411 and pVX44-2.p VX45—named 1.
  • the DNA fragment inserted in the phage vector of the plaque was extracted and, for example, the EXT gene and the BRU1 gene, which is a family gene [Brand Physiology, Vol. 104, pp. 161-170] (1994)], the meri-1 gene
  • a part of the DNA base sequence of the fragment is shown in SEQ ID NO: 14 (Azuki XRP1) in the sequence listing.
  • PCR can be performed using the above-mentioned cDNA library and the above-mentioned conserved sequence and oligo dT primer.
  • a DNA fragment of a family gene different from Azuki EXT, Azuki EXT2, Azuki EXT3 and Azuki XRP1 can be obtained.
  • a part of the DNA base sequence of the fragment is shown in SEQ ID NO: 15 in the sequence listing.
  • the cDNA of the family gene can be isolated by plaque hybridization using one of the above conserved sequences (SEQ ID NO: 13) as a probe.
  • SEQ ID NO: 13 conserved sequences
  • the search yields 30 positive plaques.
  • a DNA fragment inserted into the phage vector of the plaque was extracted, and for example, the EXT gene and the BRU1 gene were extracted.
  • a genomic DNA is prepared from azuki leaves according to a conventional method, and partially digested with a restriction enzyme Sau3A I.
  • a partially digested product is obtained by using the following method: I GEM-11 Xho I Half-Site Arms Cloning System ( Ligation to Vector-GEM-11 using Promega, and in vitro packaging kit
  • fragments are used for Southern hybridization using a DNA fragment containing the EXT gene cDNA as a probe, and then the target fragment is subcloned into a plasmid vector for partial nucleotide sequence analysis. It can be carried out. As a result, for example, it is found that the DNA fragments inserted into the phage vectors of all the blacks have a similar sequence to the EXT gene.
  • the first problem is the presence of many family genes, including pseudogenes, that cannot be easily distinguished by ordinary hybridization. Therefore, in order to clone a genomic DNA clone that is the true counterpart of the cDNA clone of interest, once the genomic DNA clone that may be the counterpart is roughly screened, then each genomic DNA Either analyze the nucleotide sequence of the entire clone and clarify it, or analyze a large number of family genes from cDNA to find a nucleotide sequence that can distinguish individual genes within the family gene. It is necessary to identify genomic DNA clones by performing hybridization using a sequence-specific oligo probe (SSOP).
  • SSOP sequence-specific oligo probe
  • the second problem is that the EXT gene and the DNA fragment containing the promoter region of the family gene are introduced into the host cell, and the phage suppresses the anti-fertility effect and the phage.
  • ⁇ Decreased plaque-forming ability caused by infection with E. coli.
  • phage containing the EXT gene promoter identified as described above have very small plaques formed compared to normal phage and are difficult to search.
  • the present inventors have conducted intensive studies to solve the above problems, and as a result, have used various genetic engineering techniques, including the improved PCR method, to solve the problems one by one.
  • the first attempt to promote the XT ⁇ We successfully cloned the region containing one of the proteins.
  • EXT gene and its family gene are collectively described as the EXT family gene group.
  • genomic DNA is completely digested with various restriction enzymes purple, and then genomic Southern hybridization is performed to determine the size of the promoter region of the target EXT gene at which end of the restriction enzyme site. It is necessary to predict whether the DNA fragment is contained in the DNA fragment.
  • the determined DNA fragment size is averaged, the surrounding DNA fragments are recovered from the agarose gel, and a partial genomic DNA library limited to this size is obtained. Can be created.
  • a genomic DNA is prepared from azuki leaves according to a conventional method, and digested with, for example, restriction enzymes BamHI, EcoRI, and HindIII (all manufactured by Takara Shuzo Co., Ltd.). Two or three bands were observed when the genome was subjected to Southern hybridization. The BamHI digestion was 15 kbp or more, the EcoBI digestion was about 8.5 kbp, and the Hind III digestion was about 8.5 kbp, EcoRI -Hind III It can be confirmed that the signal of the band of about 5.5 kbp is the strongest in the double digestion of.
  • restriction enzymes BamHI, EcoRI, and HindIII all manufactured by Takara Shuzo Co., Ltd.
  • the approximately 5.5 kbp band confirmed by double digestion of EcoR I-Hind III was recovered from agarose gel and, for example, EcoE I and Hind III sites of ⁇ ⁇ (manufactured by Novagen) were used. After inoculation with an in vitro packaging kit (Stratagene) and infecting it with a host bacterium, an EcoRI and HindIII site of about 5.5 kb A partial genomic DNA library enriched from the entire genomic DNA library can be obtained with the average size of DNA fragments. By carrying out the hybridization using the EXT gene cDNA as a probe in the same manner as described above, a phage having a DNA fragment containing one region of the promoter of this gene can be more efficiently searched.
  • 8 positive plaques were obtained from 1.3 ⁇ 10 5 plaques, and oligonucleotide VAN synthesized based on a 5 ′ non-coding region with low homology to family gene cDNA other than EXT gene
  • U7 SEQ ID NO: 17
  • four out of eight positive plaques are found to be DNA fragments containing EXTII gene cDNA.
  • ⁇ ⁇ is capable of automatic subcloning, in which a region automatically cloned in the host is converted to pUC-type brassamide by infecting the host with the ⁇ 1Cre ⁇ gene. This DNA fragment can also be subjected to automatic subcloning.
  • DNA sequence analysis is performed using the plasmid into which the fragment has been inserted, and the fragment is compared with the sequence of the EXT gene cDNA to determine whether the fragment contains the EXT gene promoter.
  • Part of the DNA base sequence of the fragment is shown in SEQ ID NO: 18 (upstream from the EXT coding region) and SEQ ID NO: 19 (downstream of the DNA fragment) in the sequence listing.
  • the 5 'upstream from the EcoBI site is referred to as the promoter upstream region
  • the 3' downstream is referred to as the promoter downstream region.
  • the plasmid incorporating the fragment was named PVXG303, and the E. coli J Ml09 strain transformed with pVXG303 was named and displayed as Escherichia coli J M109ZpVXG303, and based on the Budapest Treaty, March 15, 2015 (according to the Deposit of Hara), said that it was the home country of 1-3-1, Higashi, Tsukuba City, Ibaraki Prefecture, Japan under the accession number FE RM ⁇ ⁇ - ⁇ 390 at the Institute of Biotechnology and Industrial Technology, Ministry of Industry and Industry. Has been deposited.
  • the promoter upstream region can be obtained by cloning a fragment of Hind III of about 8.5 kbp as confirmed above. Therefore, as in the above, after completely digesting the Azuki genomic DNA with the restriction enzyme Hind III, separate and collect by subjecting it to 0.7% agarose gel compress electrophoresis. After completely decomposing ⁇ ⁇ ⁇ ⁇ ⁇ I (Stratagene) with the restriction enzyme Spe I (Takara Shuzo Co., Ltd.), the reaction was carried out in the presence of!
  • IDNA is the size limit for packaging as phage, and it is expected that the library titer will not increase. In fact, the library has a low titer and is efficient No screening was possible. Also, this size is too small to use a substitution type phage vector such as iDASHI I (Stratagene). In fact, the titer of the library obtained by ligating the HindIII fragment of Azuki genomic DNA (average about 8.5 kbp) recovered from the HindIII site of DASH II was low, and the efficiency of scripting was low. I could't do that.
  • oligonucleotide VAN—U7 (SEQ ID NO: 17) synthesized based on the 5 ′ non-coding region having low homology with the cDNA of the family gene other than the EXT gene in the secondary screening Simultaneously performing the hybridization using the DNA as a probe, clones containing the target EXTII gene can be efficiently selected from many families.
  • the above Azuki EXT gene genomic DNA is probed and subjected to Southern hybridization to reduce the promoter region of this gene. Shorter DNA fragments can be identified.
  • This fragment is inserted into the restriction enzyme site of the plasmid, and the appropriate host can be transformed using the plasmid into which the fragment has been inserted.
  • a nucleotide sequence analysis is performed using the plasmid into which the fragment has been inserted, and the fragment is compared with the sequence of the EXT gene cDNA to determine whether the fragment contains the EXT gene promoter. You can judge.
  • FIG. 1 shows a restriction map of the fragment. This nucleotide sequence is shown as SEQ ID NO: 20 in the sequence listing.
  • Plasmid obtained by incorporating the fragment containing the upstream region of the desired promoter into Hind III and EcoRI sites of pUC118 was named pVXP101 and transformed into pVXP101.
  • the 09 strain was named and designated Escherichia coli JM109 pVXPlOl, and based on the Budapest Treaty, it was traded on February 23, 1995 (Hara Deposit Date), 1-3 1-3 Higashi, Tsukuba, Ibaraki, Japan Deposited under the accession number FERM B P-5389 at the Institute of Biotechnology and Industrial Technology, Ministry of Industry.
  • the above method it is not always possible to clone a DNA fragment containing the promoter region of the EXT E gene. This is the case, for example, when the fragment is lethal to a host bacterium or acts to suppress growth.
  • the phage containing the above-mentioned EXT gene promoter has very small plaques formed compared to normal phage, making it difficult to search for and is difficult to screen.
  • a PCR method can be considered as another method for closing a DNA fragment containing the promoter region of the EXT gene.
  • PCR methods for amplifying such unknown sequences include inverse PCR [The Plant Journal, Vol. 7, pp. 157-164 (1995)] and PCR using cassettes [protein nucleic acid enzyme, 35, 3157-3163 (1990)].
  • the present inventors have studied the conditions of self-ligation by inverse PCR, and have been able to amplify only short DNA strands by using a TaKaRaLAPCR kit (Takara Shuzo). It was found that those that did not can be improved so that DNA with a length of about 2 kbp or more can be efficiently amplified.
  • genomic DNA prepared from azuki leaves is completely degraded using the restriction enzyme Hind III, and this is self-ligated with T4 DNA ligase (Takara Shuzo). Whether the self-ligation reaction occurs efficiently depends largely on the capacity of the reaction system. It is desirable that the volume of the reaction system be such that the DNA concentration is less than 4 g / ml.
  • the PCR is performed using the circular genomic DNA thus obtained as type II.
  • the primer is, for example, the sequence of the EXT gene genome DNA of pVXG303 described above.
  • Primer VAN-UH1 (SEQ ID NO: 21), Primer VAN—L (SEQ ID NO: 22), Primer VAN—UH2 (SEQ ID NO: 23), Primer VAN synthesized based on (SEQ ID NO: 18 and SEQ ID NO: 19) —: L 16
  • a two-step PCR is effective.
  • the primers VAN-UH1 (SEQ ID NO: 21) and VAN-L (SEQ ID NO: 22) are used as primers.
  • the first PCR is carried out using, and the reaction product is used as a type III primer VAN— UH 2
  • the PCR reaction is performed according to the protocol of TaKaRa LA PCR Kit (Takara Shuzo). However, the reaction temperature and cycle conditions were 94 ° C (0.5 minutes) and 55. C (1.0 min), 72 ° C (2.0 min), first PCR with 50 I reaction at 30 cycles, then second PCR under the same conditions n During the second PCR, the reaction mixture of the first PCR It is advisable to consider the amount of carry-in by making several diluted samples.
  • the expanded product of about 1.8 kbp can be subcloned, for example, into the Hinc II site of PUC119 (Takara Shuzo).
  • the fragment was contiguous with the previous sequence.
  • the DNA fragment containing the promoter of the EXT gene is determined.
  • FIG. 2 shows a restriction map of the fragment.
  • the base sequence of the fragment is shown as SEQ ID NO: 27 in the sequence listing.
  • the plasmid incorporating this PCR product was named pVXP-H3, and the E.
  • coli J Ml09 strain transformed with pVXP-H3 was named and displayed as Escherichia coli JM109ZpVXP-H3. Based on the Budapest Treaty, the contract number was given to the Institute of Biotechnology and Industrial Technology of the Ministry of International Trade and Industry of 1-3-1 Tsukuba-Higashi, Ibaraki Pref. Deposited under FERM BP—5388.
  • SEQ ID NO: 18 Based on SEQ ID NO: 18, SEQ ID NO: 19 and SEQ ID NO: 27 in the sequence listing, the nucleotide sequence upstream of the gene encoding the N-terminal amino acid sequence of EXT is shown in SEQ ID NO: 1 and SEQ ID NO: 2 in the sequence listing.
  • a DNA fragment containing the promoter region of the family gene can be cloned in the same manner as the method of cloning a DNA fragment containing the promoter of the EXT gene.
  • tissue-specific Region required for the target expression can be identified.
  • the region required for particularly strong expression in the logarithmic growth phase in cultured cells can be identified.
  • the expression site and expression in Azuki plants Time can be measured by Northern hybridization.
  • the expression time in tobacco cultured cells can be measured by Northern hybridization.
  • the Azuki EXT gene and the tobacco EXT gene cDNA can be cloned, for example, by the methods described in EP-A-0562836 A1 (1993) and JP-A-7-79778.
  • the guanidine thiosinate method and the phenol SDS method are used.
  • the total RNA thus extracted can be analyzed by, for example, agarose gel electrophoresis, transferred to a membrane, and used for hybridization.
  • the same Jt can be produced by comparing the nobleness of rRNA by agarose gel electrophoresis.
  • the amount of the expressed EXT gene mRNA can be accurately compared.
  • RNA is extracted from stems, buds, and leaves using the 40th plant using the guanidine thiosinate method.
  • Northern hybridization can be carried out by using a DNA having a sequence specific to the EXT gene cDNA different from the cDNA of the family gene.
  • the probe having a sequence specific to the EXT gene cDNA cannot keep a pair with the mRNA of another family gene, and the target By washing under conditions that maintain pairing only with the mRNA of the EXT gene, only the expression of the target EXT gene can be detected. This can also be confirmed from the size of the mRNA.
  • the amount of mRNA of the EXT gene when the amount of mRNA of the EXT gene is compared in each plant tissue, it is expressed at any site, but it is particularly strongly expressed in the stem of the plant cell wall where Xyloglucan reformation is performed. Can be confirmed.
  • stems were cut at 1 cm intervals using azuki mushrooms, total RNA was extracted from each site, analyzed by agarose gel electrophoresis, and the EXT ⁇ gene cDNA was used as a probe. It can perform hybridization. In this way, it can be confirmed that the expression is strongest in a portion where stem growth is remarkable, in other words, a site where Xyloglucan rearrangement of the plant cell wall is active.
  • each family gene can be more clearly identified by Northern hybridization using a specific probe of each family gene.
  • the tobacco X RP1 gene which is a family gene, is strongly expressed in the stationary phase, but not so strongly in the logarithmic growth phase.
  • RT Reverse Transcriptase
  • the RT (Reverse Transcriptase) -PCR method can be used to easily analyze the expression controlled by the promoter of the family of EXT X gene families.
  • RNA extraction For example, after sowing Azuki, the leaves, stems, buds, and roots of the 40th plant are collected separately, then rapidly frozen using liquid nitrogen, and subjected to RNA extraction until the extraction is performed. To save. Using this tissue, total RNA is extracted using, for example, the guanidinium thiosinate method. Using this total RNA as a type III, RT-PCR can be performed using TaKaRa RNA PCR Kit (Takara Shuzo) to identify the expression site. At this time, the specificity of the expression site controlled by the promoter of each family gene can be identified by using a sequence specific to each family gene as a primer as a primer for the PCR reaction.
  • TaKaRa RNA PCR Kit Takara Shuzo
  • RNA extraction For example, after sowing Azuki, cultivating it in the dark and using the 5th plant Cut the hypocotyl into 1-cm pieces, collect them separately, freeze them quickly using liquid nitrogen, and store them in one cup until RNA extraction is performed.
  • the total RNA was extracted using the guanidine thiosocyanate method, and this was transformed into type III, and RT-PCR was purified using TaKaRa RNA PC RK it (Takara Shuzo). The specificity of the expression site and timing can be identified in more detail.
  • RT-PCR can be performed using TaKaRa RNA PCR Kit (Takara Shuzo) to identify the expression site.
  • TaKaRa RNA PCR Kit Takara Shuzo
  • the expression site specificity controlled by the promoter of each family gene group is determined. Can be identified.
  • a reporter gene is a gene that is linked downstream of the promoter region of a gene of interest in order to examine the promoter activity of the gene or the function of other cis-elements. Since it is necessary to have no enzyme activity, the coding region of the enzyme gene derived from E. coli is mainly used.
  • reporter genes include GUS derived from E. coli, chloramphenicol acetyltransferase (CAT), ⁇ -galactosidase (1ac ⁇ ), and neomycin phosphotransferase (NPT11). Luciferase and other genes, but GUS derived from E. coli is particularly frequently used recently.
  • the GUS activity was determined by using 4-methylumberiferal dalcuronide (4-1 MUG, manufactured by Wako Pure Chemical Industries, Ltd.) as a substrate, the product of which was 4-methylumbelliferone (4.1 MU, Nacalai Tesque). It is determined by the specific fluorescence emitted by the company. 4-MU is easy to measure due to its high stability and low background. Further, as a substrate, 5-bromo-4-chloro-3-indole ⁇ -D-glucuronide [X-Gluc, molecular probe
  • the 35S promoter of cauliflower mosaic virus can be used, which is contained in pBI121 (Clontech) and pBI221 (Clontech).
  • the transcription termination sequence may be derived from the EXT gene, or may be derived from another gene.
  • translation efficiency can be increased by linking the poly-A additional sequence downstream of the inserted sequence.
  • the poly-A additional sequence may be derived from the EXT gene, or may be derived from another gene, for example, Agrobacterium octobin synthetase [The EMB0 Journal, Vol.
  • a method for introducing a vector containing this chimeric gene into an organism for example, a microinjection method [Molecular & General Genetics, Volume 202, 179-; L85 (1986) )], Polyethylene dali call method [Nachiya
  • the transfected gene introduced by these methods is used for the first few days by temporarily transcribing and expressing in cells.
  • Transient assay to analyze the expression product of is possible.
  • a plasmid vector that can be digested in E. coli the cauliflower mosaic virus 35S promoter, the GUS gene derived from E. coli, and a transcription termination sequence cassette derived from nopaline synthetase are used.
  • PBI221 manufactured by Clontech
  • This plasmid was digested with the restriction enzymes Hind III and Xba I (Takara Shuzo) to remove the 35 S promoter region of the cauliflower mosaic virus of this plasmid, and then agarose gel electrophoresis was performed to amplify the plasmid outside the 35 S promoter region. The desired fragment is excised and purified, and a DNA fragment containing the promoter region of the EXT gene can be introduced into this site.
  • the thus-created DNA fragment containing the EXT gene promoter region and the vector containing the GUS gene chimera gene can be introduced into tobacco BY2 cultured cells using, for example, the electroporation method.
  • 1% cellulase-Onozuka RS manufactured by Yakult Honsha
  • 0.1% ethanolase Y23 0.1% ethanolase Y23
  • an enzyme solution containing 0.4 M mannitol (pH 5.5) at 30 ° C. for 2 hours can be treated as an enzyme solution containing 0.4 M mannitol (pH 5.5) at 30 ° C. for 2 hours to obtain protoplasts without cell walls.
  • the obtained 2 ⁇ 10 6 tobacco BY 2 cultured cell protoblasts were suspended in electoroboration buffer (7OmMKC1, 5mMMES, 0.3M mannitol), and the vector DNA3pmo1 and 10% PEG600 Add troporation buffer, mix, and apply an electric pulse (300 V, 125 / zF) using, for example, GenePalza II (manufactured by Bio-Rad) to introduce DNA into plant cells. Introduce. After the introduction 1-2, for example, Rinsmeyer-Skoog medium containing 0.2 mg Zl 2,4-D, 1% sucrose, 0.4 M mannitol as auxin [Fiziology blantalum, Vol. 18, p.
  • GUS which is an expression product in an extract
  • GUS can be analyzed by a fluorescence method using an extract of cells cultured at 26 ° C.
  • the harvested cells were added to the extraction buffer [50 mM phosphate buffer (pH 7.0), 1 OmMEDTA. 0.1% Triton X-100, 0.1% Sarkosyl, 10 mM 2-mercaptoethanol] Transfer to a pen tube, sonicate, and use the supernatant after centrifugation for GUS activity measurement and protein amount measurement to measure the specific activity of GUS.
  • GUS activity is measured, for example, using the specific fluorescence (excitation wavelength: 365 nm, emission wavelength: 455 nm) emitted by the product, 41 MU, when using 41 MUG as a substrate.
  • the extract 301 is placed in a 96-well microtiter plate for fluorescence, and 45/1 of the extraction buffer and 4 mM 4-MUG251 are added thereto and reacted. 5, 35, after 95 minutes, quenched with stop solution (lMNa 2 C0 3) 50 1 .
  • the amount of protein was measured using, for example, 2,5,10,15 of 1Z5 diluted extract and 800 ug / m1 BSA standard solution (ImgZml BSA 80/21 added to 20 / il extraction buffer). , 20, 30 1 into a 96-well microtiter plate, and distill water 158, 155, 150, 145, 140, 130 1 and Biorad, Brotin, Atsushi, Kit 1 Reagent (manufactured by Bio-Rad) 401 was added, and the mixture was gently stirred. Next, allow the sample to stand at room temperature for 20 minutes, and then quantify the amount of protein by measuring with a blade reader (wavelength: 590 nm) within 60 minutes.
  • a blade reader wavelength: 590 nm
  • the fluorescence intensity of the 41 MU standard solution was measured at the same time, and the results were plotted on a graph with the 41 MU amount (pmo 1) on the horizontal axis and the fluorescence intensity on the vertical axis, and the slope was plotted.
  • the amount of 41 MU per degree was calculated, and the results obtained with the sample were plotted on a graph as time (minutes) on the horizontal axis and the fluorescence intensity on the vertical axis, and the ⁇ acceleration of the fluorescence intensity was calculated.
  • One MUG degradation rate GUS activity can be determined.
  • the specific activity of GUS can be determined from the amount of protein.c
  • the DNA fragment containing the EXT gene promoter region is higher than that of the cauliflower mosaic virus 3 ⁇ S promoter, which is said to exhibit strong expression in plants. Can also be confirmed to show strong activity.
  • a transformant can be produced by introducing a vector into which a DNA fragment containing the promoter region of the EXT gene and a chimeric gene of the GUS gene inserted as described above are inserted into a plant or a plant cell.
  • the vector into which the chimeric gene is inserted facilitates transformed plants or plant cells :! It is desirable to contain a selection marker gene so that it can be distinguished.
  • a selection marker gene for example, a gene (antibiotic resistance gene) which brings about a trait of antibiotic resistance can be used. Examples of such a gene include a gene that provides resistance to G418, hygromycin, bleomycin, kanamycin, gentamicin, and chloramphenicol. If the antibiotic-resistant gene is contained in the vector, transformed plants or plant cells, i.e., these cassettes, are introduced by selecting plants or plant cells that grow in a medium containing the antibiotic. Plants or plant cells can be easily selected.
  • Methods for directly introducing a vector into which a chimeric gene has been inserted into a plant include a microphone-injection method, a polyethylene glycol method, a particle gun method, and a method for contacting a protoplast with small cells, cells, lysosomes, etc. containing a vector. Examples of such methods include legal and electroporation methods.
  • a chimeric gene can be introduced into a plant.
  • a plant virus to be used for example, cauliflower mosaic virus can be used. That is, first, the viral genome is once inserted into a vector derived from E. coli or the like to prepare a recombinant, and then these cassettes are inserted into the viral genome. These cassettes can be inserted into plants by cutting out the modified viral genome from the recombinant with restriction enzymes and inoculating the plants [Molecular biology ob 'Plant' Tumors (Molecular Biology of Plant Tumors), pp. 549-560, Academic Press, published in 1982, U.S. Patent No. 4,407,955 No. 6].
  • bacteria belonging to the agrobacterium when bacteria belonging to the agrobacterium infect plants, they can transfer a part of the brassmid DNA that they possess into the genome of the plant, and use these cassettes to grow plants. Can also be introduced.
  • Agrobacterium tumefumens infects plants with crown gall
  • Agrobacterium * rhizogenes infects plants with hairy roots. (Hairy root), which are T-DNA regions on the plasmid that are present in each bacterium, called Ti or Brasmid during infection.
  • Transferred DNA is caused by the fact that a region called (Transferred DNA) moves into plants and is integrated into the genome of plants.
  • Vir region there is a region on the Ti brasmid or Ri brassmid called the Vir region, which is essential for the T-DNA region to migrate into the plant and to be integrated into the plant genome.
  • the Vir region itself is not transferred into the plant, and this Vir region is a T-DNA region. May function on a different plasmid than the one on which it exists [Nature-Vol. 303, Vols. 179-189 (1983)].
  • DNA that you want to integrate into the plant genome into the T-DNA region on the Ti Brasmid or Ri Brasmid it can be used for the purpose of infecting plants with Agrobacterium.
  • DNA can be integrated into the plant genome.
  • the part of the Ti- or Ri-brasmid that causes the gall or hairy root in the T-DMA is removed without impairing the intended transfer function, and the resulting vector is used as a vector.
  • the resulting vector is used as a vector.
  • such various vectors can be used.
  • pB1121 (Clontech) called a binary vector was used to ligate to the 35S promoter of the cauliflower mosaic virus of PBI121.
  • the GUS gene site can be prepared by replacing the DNA fragment containing the promoter region of the EXT gene with a chimeric gene of the GUS gene and introducing the chimeric gene into a plant.
  • the simultaneous use of negative control having a GUS gene without a promoter pBI101, manufactured by Clontech
  • pBI121 manufactured by Clontech
  • 35S of the force reflower mosaic virus It can be compared with the expression mode of the promoter.
  • these vectors are examples of negative control having a GUS gene without a promoter (pBI101, manufactured by Clontech), pBI121 (manufactured by Clontech), etc.
  • a bacterium of Agrobacterium which does not have a Vir region and is used by introducing the vector needs to contain another plasmid having a Vir region.
  • these vectors are shuttle vectors that can be expanded not only in bacteria of Agrobacterium but also in E. coli. Therefore, the recombination operation of Ti plasmid can be performed using E. coli.
  • these vectors contain antibiotic resistance genes and Transformants can be easily selected when transforming bacteria, plants and the like of the genus Escherichia coli and Agrobacterium.
  • any plant that can be infected with bacteria of the genus Agrobacterium and whose regeneration system has been established can be transformed.
  • Most dicotyledonous plants can be transformed using agrobacterium bacteria, especially plants that naturally host agrobacterium bacteria in vitro. be able to.
  • Monocotyledonous plants, including cereals are not hosts for bacteria of the genus Agrobacterium in nature, but include, for example, rye [Neichia, Vol. 325, pp. 274-276 (1987)], corn [Science, 24]. 0, pp. 204-207 (1988)], rice [Nichiya, 338, 274-276 (1989)] and the like can be transformed in a test tube.
  • Transformation can be performed (1) using protoplasts, (2) using tissue explants or untreated cells.
  • it is necessary to establish a system for regenerating plants from transformed protoplasts.
  • it is necessary to establish a system for transforming tissue fragments or untreated cells using bacteria of Agrobacterium and regenerating them into plants.
  • Transformed plants can be selected by growing the plants in a medium containing an agent that can help the above transformation.
  • the method of regenerating a plant from a plant cell varies depending on the type of plant. Generally, in (1), a suspension of transformed protoplasts, and in (2), a transformed protoplast is used. By inducing callus from explants or untreated cells on the plated plate and then forming shots Can be.
  • the medium may contain hormones such as auxin and cytokinin in addition to various amino acids.
  • the desired cassette is inserted in the genome of the transformed plant can be confirmed by a method such as Southern hybridization, and the reporter gene mRNA is generated in the plant. Whether it has been performed can be confirmed by a method such as Northern hybridization.
  • the chimera gene can be transferred to a next-generation plant by crossing using the plant into which the chimeric gene prepared as described above is inserted.
  • a plasmid containing a chimeric gene of a GUS gene and a DNA fragment containing the promoter region of the EXT gene obtained by the present invention can be constructed in pBI121 (manufactured by Clontech).
  • a strain belonging to an appropriate agrobacterium for example, agrobacterium tumefaciens LBA4404 [Agrobacterium tumefaciens LBA 4404 Nayiya, Vol. 303, Vol. 179-: L 80 (1983), available from Clontech Co., Ltd.]
  • infecting the target plant with the transformant to transform the plant. can do.
  • Arabidopsis seeds (available from Notlingham Arabidopsis Stock Center (NASC)) were added to an MS 0 plate [Murashige 'Skoog inorganic salts (manufactured by Wako Pure Chemical Industries) in an amount of 2% according to a conventional method. After adding sucrose, 3mg / l thiamine hydrochloride, 5mg mono nicotinic acid, 0.5mg Zl pyridoxine hydrochloride, adding 0.2% dielan gum to pH 6.3, autoclaving and brazing] CIM plate (0.5mg / 2,4-dichlorophenoxyacetic acid on MS0 plate) Callus culture on top
  • the agrobacterium transformed with the plasmid containing the chimeric gene and the agrobacterium transformed with pB1211 and pBI101 are each cultured, and the diluted one is dispensed into tubes.
  • the callus root sections are then soaked and co-cultured on CIM plates for several days.
  • Transformed sections continue to grow and become massive callus, while non-transformed sections turn brown.
  • the transformant is cultured until a rosette discard is formed.
  • the root of the transformant is cut off with a scalpel so as not to contain a callus part, and the RIM plate (IAA on a MS0 plate, final concentration of 0.5 g / m 1).
  • transfer to a rock fiber minipot (Nitto Boseki) immersed in an inorganic salt medium [Hibonex (Hibonex Japan) diluted 1000 times with water].
  • Plants that have flowered and formed pods can be transplanted to soil immersed in an inorganic salt medium to obtain seeds.
  • the seeds are sterilized, seeded on an MSK plate (MS0 plate with kanamycin added to a final concentration of 5 Omg / 1) and allowed to germinate, whereby transformants can be obtained.
  • DNA is extracted from this transformant according to a standard method, and this DNA is restricted. After digestion with Hind III and EcoE I, pVXP-H3 can be used as a probe for Southern hybridization using the promoter region digested with Hind III and EcoRI to confirm the presence or absence of transformation.
  • pVXP-H3 can be used as a probe for Southern hybridization using the promoter region digested with Hind III and EcoRI to confirm the presence or absence of transformation.
  • the transformant obtained in this way can produce insoluble indigo dye called indigotin as a product when X-Glue is used as a substrate for measuring GUS activity.
  • the localization of GUS activity within an organization or organization can be easily determined. That is, the seedlings obtained by sterilizing the seeds, sowing the seeds on an MSK plate (MS0 plate added with kanamycin to a final concentration of 5 OmgZ1) and germinating are directly used. After degassing under reduced pressure in distilled water containing 2 mM MDTT, the plants were transferred to a GUS reaction solution [ImMX-GIuc, 5 OmM phosphate buffer (pH 7.0), 20% methanol]. And react for 30 minutes to 4 hours.
  • a promoter capable of hybridizing to the plant promoter of the present invention and having promoter activity in at least one of a plant, a plant cell, and a transgenic plant regenerated from the plant cell is obtained. For example, the following method can be applied.
  • a library is prepared by connecting a chromosomal DNA obtained from a target gene source to a host by connecting it to a plasmid or phage vector according to a conventional method.
  • the library is cultured on a plate, and the grown colonies or blacks are transferred to a nitrocellulose or nylon membrane, and the DNA is fixed to the membrane by denaturation.
  • Probes obtained by labeling this membrane with 32 P or the like in advance probes to be used include the nucleotide sequences shown in SEQ ID NOs: 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, and 8, or a part thereof). The gene can be used.
  • a membrane on which DNA is immobilized may be prepared using 6xSSC :, 1% sodium lauryl sulfate, salmon sperm DNA at 100 i £ g / m1 and 5x denhaltz (0.1% serum albumin, polyvinyl virolidone, and ficoll each).
  • the target plant Mouth motor is inserted.
  • the nucleotide sequence of the obtained gene is determined as follows, and it is confirmed whether the obtained gene is a target plant promoter.
  • the recombinant is E. coli
  • culture is performed in a test tube or the like, and plasmid is extracted according to a conventional method. This is cut with a restriction enzyme to remove the inserted fragment,
  • nucleotide sequence is determined by the didequin method.
  • the nucleotide sequence can be determined by basically the same steps.
  • the determined nucleotide sequence is compared with the plant promoter of the present invention and 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7,
  • the gene structure can be known by comparing with the nucleotide sequence described in 8.
  • a synthetic DNA primer is prepared based on the obtained gene, and the missing region is expanded by PCR, or a fragment of the obtained gene is used.
  • the nucleotide sequence of the entire region of the plant promoter that hybridizes with the plant promoter of the present invention can be determined.
  • a part of the base sequence is modified by at least one of substitution, insertion and deletion by site-directed mutagenesis of a gene containing the base sequence.
  • the plant By modifying the function of the mouth motor, a plant promoter similar to the plant promoter of the present invention can be obtained.
  • This site-directed mutagenesis is based on the geared 'gapped duples' method [methods 'in' enzymology.
  • a gene containing the nucleotide sequence or a part thereof is bound to or substituted with a known gene or a part of a plant promoter or the like.
  • Chimera Plant Promoter Public Seedings of the National 'Academy' of Sabbensees of the USA, Volume 88, pp. 7266-7270 (1991)] In the same manner as the plant promoter of the present invention,
  • a plant promoter having promoter activity at a site and at a time necessary for Xyloglucan regeneration can be obtained.
  • the plant promoter thus obtained is ligated downstream thereof in such a manner that a useful gene can be expressed, and the promoter activity is measured in the same manner as in the plant promoter of the present invention. Can be confirmed to function in at least one plant or plant cell or at least one transgenic plant regenerated from the plant cell.
  • the expression site specificity controlled by the plant promoter can be identified.
  • Extrachromosomal vectors and chromosomal integration vectors are known in the art, and can be introduced into plants and transgenic plants regenerated from plant cells by microinjection, polyethylene glycol, or the like. Methods, a particle gun method, a method of fusing protoplasts with small cells, cells, lysosomes and the like containing a vector, and a method of electoral poration can be used.
  • the vector includes a chimeric gene in which a gene encoding an N-terminal several amino acid of an enzyme having a function of reconstituting Xyloglucan of a plant cell wall is downstream of a plant promoter in a state capable of being expressed upstream of a useful gene. Can be a gene.
  • EXT gene or EXT family gene promoter obtained in the present invention or a polynucleotide that has a sequence that hybridizes to the promoter or a sequence thereof or a partial sequence thereof a useful gene is downstream thereof.
  • gene expression can be induced specifically at the site and time required for Xyloglucan regeneration in the plant cell wall, and plant morphology can be controlled .
  • a gene or ribozyme encoding antisense RNA, decoy, or the like is ligated so as to function downstream of the promoter of the present invention, and is used as a plant, a plant cell, or a transgenic plant regenerated from the plant cell.
  • Dwarfed plants can be produced by controlling the morphology of the plant, and male-sterile plants can be produced by suppressing the expansion of pollen tubes.
  • it can improve the quality of a plant that uses stalks that grow and grow as edible parts, which are necessary for Xyloglucan regeneration of plant cells, as food or feed.
  • a gene encoding an enzyme having a function of reconstituting Xyloglucan of a plant cell wall in particular, a gene encoding EXT or a functional equivalent, Xyloglucan reconstitution of a plant cell wall can be performed as in the present invention.
  • the plant promoter having the promoter one activity can be cloned at the site and time required for cloning.
  • EXT end-type xyloglucan transferase
  • Vigna angularis Vigna angularis
  • Takara Ohwi et Ohashi, cv. Takara
  • Habe Seed Co., Ltd. seeds of Takara (Ohwi et Ohashi, cv. Takara) (Watanabe Seed Co., Ltd.) were used to prepare the seeds of Physiological Brontalum, Vol. 82, No. 490- Germination was carried out by the method described on page 497 (1991).
  • a plaque hybridization method was performed on the cDNA library prepared above.
  • This membrane was prehybridized in a prehybridization buffer (6 XSSC :, 0.1% SDS, 5X Denhardt's solution, 10 ⁇ gZm1 salmon sperm DNA) at 50 ° C for 2 hours. Performed. Next, so that the probes 2 x 10 5 ⁇ 10 6 c pm / m 1, the hybrida I internalization buffer solution was added, 50. C. Hybridized for 15 hours.
  • Ix SSC different from Azuki's EXT3 ⁇ 4 gene than the group that is not detected when washed at 65 ° C
  • Two plaques showing signal intensity were obtained. Phage was isolated from these plaques, and the inserted DNA was extracted. These DNAs were cut with the restriction enzyme EcoK I, and the length of the DNA fragments was confirmed by agarose gel electrophoresis. As a result, about 73 O bp and about 430 bp were confirmed from one plaque, and about 1090 bp from another plaque.
  • the plaque should not be too dense on the plate to avoid this
  • the sphage DNA was simply purified by performing the reaction twice and ethanol precipitation. The total amount of this DNA was converted into type II, and the mixed primers were used as sense primers, and oligo (dT) 18 primers with dTTP 18 bases were used as antisense primers.
  • PCR was performed using a kit (Takara Shuzo). The reaction was repeated 25 times at 94 ° C. (1 minute), 55 ° C. (1 minute) and 72 ° C. (1 minute), and then maintained at 72 ° C. for 7 minutes.
  • this reaction solution was used as type III, and PCR was performed in the same manner using a mixed synthetic oligonucleotide (SEQ ID NO: 13) as a sense primer and an oligo (dT) 18 primer as an antisense primer, and The cycle was repeated 25 times.
  • the reaction solution was analyzed by 3% agarose gel electrophoresis, and it was confirmed that DNA fragments of about 26 Obp, 350 bp, 450 bp, 500 bp, 600 bp, 750 bp, 800 bp, and 13 OObp were specifically amplified. .
  • the probe is a protein that acts on xyloglucan.
  • a mixed synthetic oligonucleotide (27mer, SEQ ID NO: 13) corresponding to the amino acid (SEQ ID NO: 28) of the existing DE I DFEFLG was prepared using DNA 5 'end labeled kit MEGALABEL TM (Takara Shuzo) [ 32].
  • plaque hybridization was performed on the cDNA library prepared above under the same conditions as in Example 2. As a result, about 3 ⁇ 10 4 plaques were searched, and as a result, 30 positive plaques were obtained.
  • ⁇ ZAP (manufactured by Stratagene) is co-infected with the M13 helper phage and the host strain of the F * strain, and the cloned region in the host is automatically transformed into pB1uescript SK (—) (Stratagene). Automatic subcloning that converts to From this, a plasmid was prepared from the above 30 plaques, cut with the restriction enzyme EcoRI, and the length of the DNA fragment was confirmed by agarose gel electrophoresis. Of these, two types of plasmids containing DNA fragments of about 1.5 kbp and about 0.9 kbp were named pTM3D and pTMlID, respectively.
  • Seedlings of Vigna anguillaris ouvie oohashi cv. Evening seeds are germinated by the method described in Fiziologia Blantalum, Vol. 82, pp. 490-497 (1991). About 10 g of leaves were obtained. Approximately 10 g of the leaves were placed in a mortar and ground in liquid nitrogen to a white powder.
  • a 10-fold diluted sample 11 of this DNA solution was subjected to 0.4% agarose gel electrophoresis and analyzed. As a result, it was confirmed that the concentration of the high-molecular-weight DNA was about 100 ng. That is, 150 g of genomic DNA was obtained from about 2.5 g of the plant.
  • Black-mouthed form Add isomayl alcohol (25: 24: 1), mix gently, centrifuge at 12000 rpm for 5 minutes, transfer supernatant to a new tube, and precipitate ethanol. went. For precipitation, 20 1 TE buffer
  • Bc ABest TM labeling kit (Takara Shuzo Co., Ltd.) using labeled with (one 32 P) d C TP, as a probe for plaque hybrida I See Chillon. That is, 25 ng of the above-mentioned DNA fragment and 21 random primers were placed in a tube, made up with distilled water, heated at 95 ° C for 3 minutes, and then rapidly cooled in ice. Then add 2.51 each of a 10-fold concentration buffer and dNTP mixed solution and 51 of labeled dCTP, and make it 24 // 1 with distilled water. BeaBEST TM DNA polymerase (Takara Shuzo) 1 ⁇ 1 And incubated for 10 minutes at 52 days. After inactivating the enzyme, heat at 95 ° C for 3 minutes, quench in ice and heat After denaturation, the whole amount was used for hybridization. The specific activity of this probe was 7.2 ⁇ 10 8 cpmZg.
  • Plaque hybridization was performed in the same manner as in Example 1. However, the pre-hybridization and hybridization temperatures were 65 ° C.
  • each DNA sample was subjected to 1% agarose gel electrophoresis, electrophoresed, alkali-denatured, and subjected to overnight overnight blotting on a nylon membrane (Hybond-N, manufactured by Amersham).
  • the DNA was immobilized by irradiating it to an ultraviolet transilluminator (254 nm) for 5 minutes.
  • Using this membrane in buffer hybridization buffer (5x Denha Ruhybridization was performed in Ruth solution, 6 ⁇ SSC, 0.1% SDS, 10 gZm 1 salmon sperm DNA) 51111 for 2 hours. Next, the probe was added, 65. A hybridization was conducted at C.
  • the membrane was washed twice with a washing solution containing 2xSSC and 0.1% SDS for 10 minutes at room temperature, and then twice with the same washing solution at 50 ° C for 30 minutes. After drying, the membrane was exposed to 180 ° C- ⁇ in a cassette containing X-ray film (manufactured by Kodak), and autoradiography was performed.
  • the ten phages were classified into three types.
  • the DNA fragment detected when using the Azuki EXT gene cDNA as a probe was subcloned into a plasmid vector, and the base sequence was partially Analysis was performed.
  • the DNA fragment inserted into the phage vector of all plaques contained a gene similar to the EXT gene, that is, the family gene. However, none contained the EXT gene itself.
  • Genomic DNA extracted from azuki leaves in the same manner as in Example 5 was digested with restriction enzymes EcoR I and Hind III, and double-digested with EcoE I-Hind III, and subjected to 0.7% agarose gel electrophoresis.
  • the cells were transferred to a nylon membrane and subjected to Southern hybridization using the Azuki EXT gene cDNA prepared in the same manner as in Example 5, (3) as a probe.
  • the Southern hybridization was performed according to the method of Example 5, (3). However, after the hybridization, the membrane was washed three times with a washing solution containing 2 XSSC and 0.1% SDS for 20 minutes at room temperature, and then washed twice with the same washing solution at 50 ° C for 20 minutes. The plate was washed twice with a washing solution containing lxSSC and 0.1% SDS for 20 minutes.
  • plaque hybridization was performed in the same manner as in Example 5 using the Azuki EXT gene cDNA as a probe.
  • 3xl0 10 plaques were obtained from 5 blurs. This plaque was suspended in SM buffer, and each plaque was secondarily screened.
  • the probe for secondary screening was oligonucleotide VAN synthesized based on the 5 'non-coding region having low homology to the above-mentioned isozymes of the Azuki EXT gene cDMA and the Azuki EXT gene cDNA. — U7 (SEQ ID NO: 17) was used for each.
  • the one using the Azuki EXT gene cDNA as a probe Plaque hybridization and washing were performed as described above.
  • DNA 5' synthetic oligonucleotide VAN- end labeling kit MEGALABEL TM (manufactured by Takara Shuzo Co., Ltd.) (7- 32 P) was 5 'end labeled with ATP, hybrida I See Chillon probe And The specific activity of this probe was about 2 ⁇ 10 8 c pin g. Plaque hybridization was performed in the same manner as in Example 2 using this probe. However, the temperature of the blur hybridization and the hybridization was 47 ° C. After the hybridization, the membrane was washed twice with a washing solution containing 6 ⁇ SSC and 0.1% SDS at room temperature for 20 minutes, and then washed twice with the same washing solution for 47 and 20 minutes.
  • pVXG303 was used to transform E. coli J Ml09 strain (Takara Shuzo), the transformant was named and designated Escherichia coli JM109ZpVX303, and based on the Budapest Treaty, March 15, 1995: It was deposited under the accession number FERM BP-5390 at the Institute of Biotechnology and Industrial Technology, the Ministry of International Trade and Industry of 1-3-1 Tsukuba East, Ibaraki, Japan.
  • the base sequence of the DNA fragment was determined from this brassmid using Bca BEST TM Dioxygen Sequencing Kit (Takara Shuzo) according to Sanger's method. A part of the nucleotide sequence is shown in SEQ ID NO: 18 and SEQ ID NO: 19 in the sequence listing. Comparison of this sequence with the sequence of the Azuki EXT gene cDNA revealed that the fragment contained the promoter of the Azuki EXT gene. ( Example 7
  • PVXG303 in Example 6 is a plasmid of about 9.5 kbp having a 5.5 kbp genomic DNA-derived EcoRI / HindIII fragment containing the promoter region of the Azuki EXT gene.
  • This plasmid was used as a control for self-ligation and inverse PCR, and after digestion with the restriction enzyme Hind III, the DNA concentration was adjusted to 1 OngZ 1.3.3 ng / n 1.2 ng / 1, 1 ng / 1 and self-ligated. Gated. After ligation, each 5-1 was transformed into E. coli JM109, and the efficiency of self-ligation was determined from the number of colonies formed. As a result, it was confirmed that the more the DNA concentration was lower, the higher the efficiency of self-ligation was.
  • the ligated solution was subjected to PCR using primer VAN-UH1 (SEQ ID NO: 21) as a sense primer and VAN-L (SEQ ID NO: 22) as an antisense primer.
  • Primer VAN—UH2 (SEQ ID NO: 23) as a sense primer
  • Primer VAN—L16 (SEQ ID NO: 24) as an antisense primer
  • Primer VAN—UH3 (SEQ ID NO: 25) as a sense primer
  • Primer VAN—L3 (SEQ ID NO: 26) as an antisense primer
  • VAN—UH2 primer SEQ ID NO: 23
  • VAN—L3 SEQ ID NO: 26
  • PCR was performed in the same manner using Primer VAN-UH3 (SEQ ID NO: 25) as a sense primer and Primer VAN-L16 (SEQ ID NO: 24) as an antisense primer, and the above cycle was repeated 30 times.
  • the DNA fragment obtained by the combination of the primers in 3) is recovered from the gel, the ends are blunted using a DNA blunting kit (Takara Shuzo), and the 5 'end labeled kit MEGALABEL TM
  • the 5'-end of the PCR product was phosphorylated using (Takara Shuzo) and subcloned into the Hinc II site of PUC119 (Takara Shuzo).
  • Three brasmids were selected from these, and the nucleotide sequence of the DMA fragment was determined using BeaBEST TM Diodekin 'Sequencing Kit (Takara Shuzo) according to Sanger's method.
  • BeaBEST TM Diodekin 'Sequencing Kit (Takara Shuzo) according to Sanger's method.
  • the base sequences were identical in all of the brasmids. Therefore, the whole base sequence was determined using one of the brasmids.
  • FIG. 2 shows a restriction enzyme map of the DNA fragment.
  • E. coli JMl09 strain transformed with the pVXP-H3 was named and designated Escherichia coli JM109ZpVXP-H3, and based on the Budapest Treaty, February 17, 1995 ( It was deposited under the accession number FERM BP-5388 at the Institute of Biotechnology, Institute of Industrial Science and Technology, Ministry of International Trade and Industry, 1-3-1, Tsukuba-Higashi, Ibaraki, Japan.
  • the sambre was subjected to phenol extraction twice and then ethanol precipitation. After that, all of the nokia is packaged with an in vitro packaging kit (Stratagene) and infected with the host fungus I. coli LE392 to produce azuki genotype. A DNA library was obtained. When the titer of this library was measured, the titer was 1.1 ⁇ 10 5 u ⁇ m / m 1.
  • Genomic DN A fragment obtained in Example 6 was labeled with (alpha-32 P) dCTP using a B ca BE ST TM labeling kit (Takara Shuzo Co., Ltd.), as a probe of High Priestess Daizeshiyon. Using this probe, plaque hybridization was performed on the genomic DNA library prepared above in the same manner as in Example 5. After hybridization, the membrane is washed three times with a washing solution containing 2xSSC and 0.1% SDS at room temperature for 20 minutes, and then once with a washing solution containing lxSSC and 0.1% SDS at 50 ° C for 20 minutes. did.
  • the secondary screening probe is a sequence of the genomic DNA fragment and Azuki EXT cDNA obtained in Example 6, which is the same as in the primary screening, and is a family of other isozymes (Azuki EXT 2 and Azuki EXT3).
  • Oligonucleotide VAN-U7 SEQ ID NO: 17
  • Hybridization and washing were performed as in the case of the leaning.
  • Oligonucleotide VAN-U7 was used as a probe, the same procedure as in Example 6 was performed.
  • This DNA fragment was double-digested with the restriction enzyme EcoR I-Hind III, containing the promoter region of this gene by performing Southern hybridization using the DNA fragment of the Azuki EXT gene genomic DNA fragment of Example 6 as a probe. Shorter DNA fragments could be identified. Nucleotide sequence analysis is performed using the plasmid into which the DNA fragment has been inserted, and this fragment is compared with the sequence of the Azuki EXT gene cDNA. Turned out to contain. Figure 1 shows the restriction enzyme map of the fragment. Further, a part of the nucleotide sequence of the fragment was replaced with SEQ ID NO: 20 in the sequence listing.
  • Pulverize and extract with a polytron for 5 minutes add 2.5 ml of phenol: chloroform: isoamyl alcohol (25: 24: 1), mix gently for about 15 minutes, and then mix at 3000 rpm, 10 min. Centrifuged for minutes. Next, 2.5 ml of phenol: chloroform: isoamyl alcohol (25: 24: 1) was added to the aqueous layer, the mixture was stirred well, and the suspension was centrifuged to separate the aqueous layer. Repeated times.
  • RNA precipitation was obtained by adding 3 M sodium acetate and ethanol and centrifuging. This precipitate was completely dissolved in 2 ml of Tris-SDS solution [50 mM Tris-HC1 (pH 9.0), 1% SDS], placed in a tube containing 2 ml of saturated phenol, and shaken well. The aqueous layer was separated by centrifugation of the suspension.
  • RNA precipitate To this aqueous layer, 2 ml of water-saturated phenol (2: 1) in form of isoform: 49 ml of isoamyl alcohol (49: 1) was added in sequence, and the mixture was stirred well. The suspension was centrifuged to separate the aqueous layer. Next, 2 ml of chloroform: isoamyl alcohol (49: 1) was added to the aqueous layer, the mixture was stirred well, and the suspension was centrifuged to separate the aqueous layer. 3M sodium acetate and ethanol were added to this aqueous layer, and the mixture was centrifuged to obtain RNA precipitate.
  • RNA precipitate Dissolve the precipitate completely in 0.5 ml sterile water, measure the absorbance, adjust the concentration to lmgZm ⁇ , add 1Z4 volume of 10M lithium chloride, mix, and leave at 4 ° C for 2 hours.
  • the precipitate was obtained by centrifugation. This was completely dissolved in 1 ml of sterile water, 3M sodium acetate and ethanol were added, and the mixture was centrifuged to obtain about 0.6 mg of RNA precipitate.
  • a probe for Northern hybridization was prepared by using a fragment of the Azuki EXT gene cDNA [European Patent Publication No. 0562836 A1 (1993)] using a Bca BEST TM labeling kit (Takara Shuzo). was labeled with ⁇ - 32 P) dCTP, it was created.
  • the 32 P-labeled probe prepared by the above method was used in hybridization buffer [50% formaldehyde, 0.65 M NaC], 0.1 mM Na—PI PES (pH 6.8), 5x Denhardt's solution, 0.1 % SDS, 5mM EDTA, 10% dextran sulfate], and transfer the membrane that had been pre-hybridized to the probe solution.
  • C performed 10 high predication.
  • the membrane was washed three times for 20 minutes with 50% washing solution containing 2 ⁇ SSC and 0.1% SDS. After drying, the membrane was exposed to light at 180 ° C in a cassette containing an X-ray film (manufactured by Kodak) and autoradiographed.
  • RNA precipitate To this aqueous layer, add 2 ml of chloroform: isoamyl alcohol (49: 1), stir well, centrifuge the suspension to separate the aqueous layer, and add 3M sodium acetate and ethanol to this aqueous layer. , And centrifuged to obtain about 0.7 mg of RNA precipitate.
  • Probes for Northern hybridization were prepared using the tobacco EXT ⁇ cDNA (JP-A-7-79778) and the cDNA fragment of the family ⁇ tobacco XRP1 shown in Example 4 (SEQ ID NO: 16). ,
  • FIG. 3 is a diagram showing the expression of EXT and XRP, in which the upper row shows the expression level of tobacco EXT mRNA, the middle row shows the expression level of tobacco XRP mRNA, and the lower row shows the amount of rRNA.
  • growth curves of cultured tobacco BY2 cells were drawn by measuring cell number and packed cell volume (PCV).
  • the number of cells was determined using an enzyme solution containing 1% cellulase and Onozuka RS (manufactured by Yakult Honsha), 0.1% Ectolyase Y23 (manufactured by Seishin Pharmaceutical), and 0.4 M mannitol.
  • the cells were treated with (pH 5.5) at 30 for 2 hours to obtain protoblasts without cell walls, and the number of protoplasts was determined by counting the number of protoplasts using a hemocytometer.
  • FIG. 4 is a diagram showing the culture of tobacco BY-2 cell culture.
  • the vertical axis indicates PCV ⁇ %)
  • the horizontal axis indicates time (say).
  • This plasmid was digested with the restriction enzymes HindIII and XbaI to remove the 35S promoter region of the cauliflower mosaic virus of this plasmid, and the desired fragment other than the 35S promoter region was cut out and purified by agarose gel electrophoresis. .
  • PCR was performed using pVXG303 prepared in Example 6 as type III, VAN-UHE (SEQ ID NO: 29) as a sense primer, and VAN-LX (SEQ ID NO: 30) as an antisense primer.
  • the reaction was 94 ° C (1 minute), 55. A cycle of C (2 minutes) and 72 ° C (3 minutes) was repeated 10 times.
  • This fragment was separated and recovered by 2.5% agarose gel electrophoresis, ligated to HindIII and XbaI sites of pBI221EL, and then transformed into E. coli JMl09 strain.
  • This plasmid was named pEXT EGUS, and the E. coli JM109 strain transformed with pEXTAEGUS was designated as Escherichia coli JM109ZpEXTAEGUS. Named.
  • pVXP-H3 prepared in Example I was completely digested with a restriction enzyme XbaI (Takara Shuzo), blunt-ended in the same manner as described above, and completely digested with a restriction enzyme EcoRI.
  • E. coli JM109 strain was transformed. This plasmid was named £ 115 and the E. coli J Ml09 strain transformed with pEXTXGUS was named Escherichia coli JillOgZpEnAXGUS.
  • pEXTAEGUS After complete digestion of pEXTAEGUS with restriction enzymes Hind I and EcoRI, pVXP-H3 prepared in Example 7 was ligated with a DNA fragment containing a promoter completely digested with restriction enzymes Hind III and EcoRI, followed by ligation. E. coli JMl09 strain was transformed. This plasmid was named pEXTGUS, and the E. coli JM109 strain transformed with pEXTGUS was
  • Escherichia coli JMlOS / pEXTGUS It was named Escherichia coli JMlOS / pEXTGUS.
  • ⁇ B1101 black
  • pGUS produced by Tektronix, Inc., pGUS in Figure 5
  • pB1221 produced by Clontech
  • the tobacco BY 2 cultured cells were treated with an enzyme solution containing 1% cellulase 'Onozuka RS (manufactured by Yakult Honsha), 0.1% Ectolyase Y23 (manufactured by Seishin Pharmaceutical Co., Ltd.), and 0.4 M mannitol. ⁇ 5. ⁇ ) at 30 ° C for 2 hours to obtain protoplasts without cell walls.
  • an enzyme solution containing 1% cellulase 'Onozuka RS manufactured by Yakult Honsha
  • 0.1% Ectolyase Y23 manufactured by Seishin Pharmaceutical Co., Ltd.
  • An electric pulse (300 V, 125 ⁇ F) was applied using (Bio-Rad) to introduce DNA into plant cells.
  • the extract 301 was placed in a 96-well microtiter plate for fluorescence, and the extraction buffer 45] and the substrate 4 ⁇ 4-MUG2 ⁇ ] were added and reacted. 5, 35, 95 minutes after, the reaction was stopped by adding stop solution (lMNa 2 C0 3) 50 1 . Then, specific fluorescence emitted by the reaction product (41 MU) was measured using a fluorescent plate reader [Fluoroscyan II (manufactured by Lab Systems)] under the conditions of an excitation wavelength of 36 ⁇ and a fluorescence wavelength of 4 ⁇ 5 nm.
  • a fluorescent plate reader [Fluoroscyan II (manufactured by Lab Systems)] under the conditions of an excitation wavelength of 36 ⁇ and a fluorescence wavelength of 4 ⁇ 5 nm.
  • the protein amount was measured using 2, 5, 10, 15, 20, and 15 dilutions of the extract and 800 / gZm1 BSA standard solution (BSAlmgZml 80 ⁇ 1 added to the extraction buffer 201). Transfer 30 nI to a 96-well microtiter plate, and add distilled water 158, 155, 150, 145, 140, 1 30 ⁇ ⁇ and Bio-Rad Protein Kit Kit (Bio-Rad) 40 Then, the mixture was gently stirred, allowed to stand at room temperature for 20 minutes, and then measured with a plate reader (wavelength 590 nm) within 60 minutes to quantify the amount of protein.
  • a plate reader wavelength 590 nm
  • Figure 5 shows the results. That is, Fig. 5 shows the measurement of the EXT promoter activity using the transformed tobacco BY2 cultured cells. In the figure, the bar graph indicates the GUS specific activity (pmo Zmg protein) Indicates a restriction map of the promoter region of each plasmid.
  • each plasmid of pEXTGUS prepared in Example 11 and the above pEX TAXGUS was digested with restriction enzymes Hind III and SnaB I, followed by agarose electrophoresis to cut out a fragment containing the promoter region of the Azuki EXT gene, followed by purification. did.
  • Each of these fragments was ligated to the above-mentioned HindIII and SnaBI sites of PBI-HI-35 SIG, and then transformed into E. coli JM109 strain.
  • These transfection brasmids were named pB VEG101 and pB VEG 121, respectively, and the E. coli J Ml09 strain transformed with these These were named Escherichia coli JM109 / pBVEG10K and Escherichia coli JM109 / PBVEG121, respectively.
  • pBI101 produced by Klontec
  • ⁇ which has the 3 ⁇ S promoter of the force flower mosaic virus
  • ⁇ which has the 3 ⁇ S promoter of the force flower mosaic virus
  • Agrobacterium transformed by each of the plasmids was used for Agrobacterium tumefaciens EHAlOl / pBVEGlOU Agrobacterium tumefaciens EHA101 / pBVEG121,
  • Agrobacterium tumefaciens EHAlOlZpBI-H-101 and Agrobacterium tumefaciens EHAlOlZpBI-H-121 were named.
  • Arabidopsis thaliana (Arabidopsis thaliana) Ecotype WS seed [notringham arabidobusis 'stock' center
  • Root sections were lined with CIM plate (MS 0 plate plus 0.5 mg Z12,4-dichlorophenoxyacetic acid, 0.0 SmgZ 1 strength rice), 22. , 30001 ux, continuous light for 2 days.
  • CIM plate MS 0 plate plus 0.5 mg Z12,4-dichlorophenoxyacetic acid, 0.0 SmgZ 1 strength rice
  • the agrobacterium obtained in (2) was cultured at 30 for 2 days, and the root slices cultured for 2 days were immersed in a solution diluted 5 times with MS solution for 30 seconds, and excess water was absorbed.
  • the cells were arranged on a new CIM plate and cultured for 2 days.
  • the infected sections were transferred to SIMC plates (5 ml N6-2-isopentenyl adenine, 0.15 mg / 1 indoleacetic acid, 0.3 g Zl carbenicillin were added to the MS0 plate) for 2 days. After culturing, the cells were transplanted to SIMCS plate (5 Omg / 1 kanamycin and 2 OmgZ1 hygromycin were added to SIMC plate). Thereafter, the shoots were replanted once or twice a week into new SIMCS plates until the shoots regenerated.
  • T2 seeds were obtained.
  • the T2 plants obtained in (3) were seeded on MS KH plates (50 mg Zl kanamycin and S Omg Zl hygromycin were added to an MS 0 plate) to select resistant strains.
  • the resistant strains were planted in rock wool and cultivated in a solution of Hyponex (manufactured by Hyponex Japan) diluted 1000 times with water.
  • primer B44-1 SEQ ID NO: 31
  • primer IV44-5 SEQ ID NO: 32
  • PCR was performed using a TaKaRa LA PCR kit (Takara Shuzo). The reaction was 94 C (1 minute), 98 ° C (20 seconds), 67. The C (10 min) cycle was repeated 30 times, ending at 72 ° C (10 min). After the reaction, 5 // 1 of the reaction solution was subjected to 1% agarose gel electrophoresis. As a result, a band of about 6.0 kbp was confirmed only in the sample digested with the restriction enzyme purple HindIII.
  • this PCR fragment was blunt-ended, and digested with the restriction enzyme Hind III. As a result, bands of about 3. 1 kbp and about 2.9 kbp were separated.
  • This DNA fragment was simultaneously inserted and ligated to the HindIII-HincII site of pUC118, and then transformed into E. coli JMl09. The resulting plasmid had a 2.9 kbp plasmid. Only those containing the insert fragment, about 3.1 kbp, could not be obtained.
  • the primer -PCR of I P44-2 (SEQ ID NO: 33) and Ml3 primer M4 (Takara Shuzo), and PCR of primer IP44-6 (SEQ ID NO: 34) and Ml3 primer M4 (Takara Shuzo) was amplified only with primers IP4 4-6 (SEQ ID NO: 34) and Ml3 primer M4.
  • This 2.9 kbp insert contains the 3 'downstream region of the Azuki EXT2 gene and contains the promoter region. Included was a 3.1 kbp fragment.
  • Figure 11 shows a restriction map of the approximately 6. Ok bp PCR fragment spanned by primers IP44-3 and IP44-5.
  • the upper part of the restriction enzyme map corresponds to the base sequence of primer IP44-5, and the lower part corresponds to the base sequence of primer IP44-3.
  • the PCR fragment was blunt-ended after digestion with the restriction enzymes HindIII and EcoRI, since there were two EcoRI sites on the approximately 6.0 kbp fragment.
  • the bands were divided into bands of about 0.4 kbp, about 0.5 kbp and about 2.55 kbp.
  • the promoter regions are about 0.5 kbp and about 2.55 kbp. Therefore, the EcoR I-Hinc II site and the EcoR I-Hind III site of pUC118, respectively.
  • the cells were transformed into E. coli JM109.
  • a Pst I site adapter prepared using Rigomer E / P site (2) (SEQ ID NO: 36) was introduced. As a result, only the PstI site could be introduced into pEXT2pro (F) f3 on the opposite side of the EcoRI site insert.
  • the plasmid was completely digested with restriction enzymes Pst I and EcoR I, followed by a Kilo-Sequence delanyon kit.
  • pVX2 P501 p VX2 P 503.
  • the nucleotide sequence of the insert fragment contained in pVX2P 505 and the base sequence of the insert fragment contained in pECT2 pro (F) f3 are not contiguous on the genome. This was confirmed by the PCR and direct sequence in this boundary region.
  • the sequence of the promoter region of about 3.0 kbp upstream of the N-terminal amino acid sequence of Azuki EXT2 is shown in SEQ ID NO: 3 in the sequence listing.
  • Azuki genome DNA was completely digested with restriction enzymes HindIII, NspV, and XbaI and self-ligated in the same manner as in Example 13.
  • genomic DNAO.lig type as primer
  • Primer IP 45-3 SEQ ID NO: 37
  • Primer IP 45-5 SEQ ID NO: 38
  • PCR was carried out by Takara Shuzo Co., Ltd. The reaction was repeated 30 times at 94 ° C (1 minute), 98 ° C (20 seconds), and 67 ° C (10 minutes) and ended at 72 ° C (10 minutes). After the reaction, 51 of the reaction solution was subjected to 1% agarose gel electrophoresis.
  • pVX3P237 was sequenced using M13 Primer M4 (Takara Shuzo) and M13 Primer RV (Takara Shuzo) to decipher the base sequence at both ends of each insert according to Sanger's method. .
  • these sequences contained the primers used in the PCR and had exactly the same overlap as compared with the sequence of the base Azuki EXT3 cDNA (SEQ ID NO: 12).
  • all three clones had exactly the same sequence in the analyzed range.
  • two main bands of about 4.5 kbp and about 3.5 kbp in the second PCR of the sample digested with the restriction enzyme XbaI should be used. I made it.
  • the band of about 4.4 kbp was separated into two bands of about 0.5 kbp and about 3.9 kbp.
  • the band at about 3.5 kbp was not digested with the restriction enzyme NspV. Therefore, it was considered that about 4.5 kbp contained the promoter region.
  • a DNA fragment of about 4.5 kbp was digested with the restriction enzymes NspV and XbaI and double digested with NspV-XbaI to obtain a restriction enzyme map of the DNA fragment of about 4.5 kbp. Created.
  • FIG. 12 shows a restriction enzyme map of about 4.5 kbp amplified by the primers IP45-3 and IP45-5.
  • the upper part of the restriction map corresponds to the base sequence of Brimer-IP45-5, and the lower part corresponds to the base sequence of Brimer-IP45-3.
  • a DNA fragment of about 3.0 kbp generated by double digestion of a DNA fragment of about 4.4 kbp with restriction enzymes NspV—XbaI was recovered from the gel, and then pB1uescript II SK (— The plasmid was introduced into an XbaI-AccI site (manufactured by Stratagene), and this plasmid was transformed into I. coli JM109.
  • pVX3P101, pVX3P103, and pVX3P104PVX3P107 were converted to the respective Ml3Blimer M4 (Takara Shuzo) and Ml3Blimer RV (Takara Shuzo) according to Sanger's method.
  • Ml3Blimer M4 Takara Shuzo
  • Ml3Blimer RV Takara Shuzo
  • pVX3P107 was completely digested with the restriction enzymes Kpn I (Takara Shuzo) and Xho I (Takara Shuzo), followed by a dilution kit for Kirosequence Kit (Takara Shuzo). From the XhoI site, a clone of deletion into the insert fragment side was obtained. Of these, several of the appropriate lengths were selected, and using Ml3 primer M4 (Takara Shuzo) and M13 Primer RV (Takara Shuzo) according to Sanger's method.
  • nucleotide sequence of the insert fragment contained in PVX3P107 was determined based on these results.
  • PVX3P206, pVX3P234> pVX3P237 The nucleotide sequence of the inserted DNA fragment of p237 and the nucleotide sequence of the inserted fragment contained in pVX3P107 are contiguous on the genome.
  • the Direct Sequence The thus obtained nucleotide sequence of about 3.4 kbp in the promoter region upstream of the N-terminal amino acid sequence of Azuki EXT3 is shown in SEQ ID NO: 4 in the sequence listing.
  • the Azuki genomic DNA was completely digested with restriction enzymes Hind III, Nsp V, and Xba I, self-ligated, and the obtained circular genomic DNA O.
  • PCR was performed using a TaKaRa LA PCR kit (Takara Shuzo) using primer I PM6-3 (SEQ ID NO: 41) as a sense primer and primer I PM6-4 (SEQ ID NO: 42) as an antisense primer.
  • Reaction 94. C (1 minute), 98. C (20 seconds), 67. C (10 minutes) cycle was repeated 30 times, ending at 72 ° C (10 minutes). After the reaction, 51 of the reaction solution was subjected to 1% agarose gel electrophoresis, and no width was confirmed.
  • pXRG403, pXRG404, and pXRG406 were cleaved only at one site existing in the vector. From this, it was considered that pXRG301, pXRG 302, pXRG 303, pXRG 304, and pXRG 305 contain the promoter region of the target Azuki XRP1.
  • PXRG30 pXRG 302 pXRG303 and pXRG 304 were sequenced using Ml 3 Primer M4 (Takara Shuzo) and Ml 3 Primer RV (Takara Shuzo) according to Sanger's method, at both ends of each insert. .
  • the sequences of pXRG302 and pXRG303, including the primer used in PCR were exactly the same in the overlap region as compared with the sequence of the original Azuki XRP1 cDNA (SEQ ID NO: 14). Also, the two clones had exactly the same sequence.
  • FIG. 13 shows a restriction map of the insert fragment of about 2.5 kbp amplified by the primers IPM6-2 and IPM6-5.
  • the upper part of the restriction map corresponds to the base sequence of the primer IPM6-5, and the lower part corresponds to the base sequence of the primer IPM6-2.
  • Ml3 primer M4 (Takara Shuzo)
  • Ml3 primer RV (Takara Shuzo)
  • the nucleotide sequence of the inserted fragment was decoded according to Sanger's method, and based on the sequence in the inserted fragment. After analyzing with the synthesized primers, these results were combined to determine the nucleotide sequence of about 1.1 kbp of the promoter region of Azuki XRP1 in the insert fragment contained in pXRG302.
  • the sequence of the promoter region of about 1.1 kbp upstream of the N-terminal amino acid sequence of Azuki XRP1 is shown in SEQ ID NO: 5 in the sequence listing.
  • Lycopersicon esculentum The seeds of Lycopersicon esculentum (Lycopersicon esculentum) were germinated and cultivated for about one month to obtain about 10 g of leaves and stems. Approximately 2.5 g of the leaves and stems were placed in a mortar and ground in liquid nitrogen until a white powder was obtained. Immediately place the crushed leaves in a 5 Om 1 volume polystyrene tube and add 1 Om 1 urea-phenol DNA extraction buffer [0.05 M Tris-I HC I (pH 7.6), 0.02 MEDTA, 5% phenol , 8 M urea, 0. 35MNaC l, 2% N- lauroyl sarcosine sodium] and 25% SD S was added and the mixture was extracted with 65 e C, 1 hour.
  • the precipitated white thread-like genomic DNA was wound up using a Pasteur pit and taken out into a new tube.
  • 1.5 ml of TE buffer [10 mM Tris-HCl (pH 8.0), lmMEDTA] was added to the tube, and the mixture was dissolved at 55 ° C for 1 hour.
  • TE buffer 10 mM Tris-HCl (pH 8.0), lmMEDTA
  • One 10 of a 10-fold diluted sample of this DNA solution was subjected to 0.4% agarose gel electrophoresis and analyzed. As a result, it was confirmed that the concentration was about 100 ng Z ⁇ 1 for the high molecular weight DNA. In other words, about 2.5 g of plant DNA and about 150 g of genomic DNA were obtained.
  • p LXG101 p LXG 102 pLXG106 was sequenced using M13 Primer-M4 (manufactured by Takara Shuzo) and M13 Primer RV (manufactured by Takara Shuzo) according to Sanger's method to determine the nucleotide sequence of each insert. These sequences had exactly the same overlap as those of the original tomato EXT cDNA sequence [EP 0562836 A1 (1993)]. However, within the analysis range of the nucleotide sequence, it was found that there were 2-3 base substitutions. This is Ne s t e d
  • FIG. 14 shows a restriction map of an insert of about 6.6 kbp amplified by the primers I PLE-2 and I PLE-5.
  • the upper part of the restriction enzyme map corresponds to the base sequence of the primer IMPLE-5, and the lower part corresponds to the base sequence of the primer IPLE-2.
  • Plasmids were extracted from four of the obtained colonies and named pLXG601, pLXG602, pLXG603, and ⁇ LXG604, respectively. These pLXG601, pLXG 602, pLXG6
  • Plasmids were extracted from 6 of the obtained colonies, and named as pLXP101, pLXP102, pLXP103, pLXP106, pLXP109 and pLXP111, respectively. These pLXP101, pLXP102, pLXP103, and pLXP106> pLXP109, pLXP111 were digested twice with the restriction enzymes EcoR I-PstI and subjected to agarose gel electrophoresis. 1. It was confirmed that there was an insert fragment of 4 kbp.
  • M13 primer M4 (manufactured by Takara Shuzo)
  • Ml3 primer RV (manufactured by Takara Shuzo) were used to decipher the nucleotide sequence of each insert fragment according to Sanger's method.
  • p LXP101 was completely digested with restriction enzymes KpnI and BamHI, followed by a release for kit for Kirosequence (Takara Shuzo). Was used to obtain a clone of deletion from the BamHI site toward the insert. From these, select some of which had an appropriate length of derivation and use M13 primer M4 (Takara Shuzo) and Ml3 primer RV (Takara Shuzo) according to Sanger's method. After decoding the nucleotide sequence of each insert fragment, these results were combined to determine the inserts contained in PLXP101.
  • the nucleotide sequence of the fragment was determined. Furthermore, by sequencing and comparing the promoter region of about 1.4 kbp of PLXG102 and PLXG103 synthesized based on the base sequence of the inserted fragment of pLXP101, the tomato EXT ⁇ A sequence of about 1.4 kb P in the promoter region upstream of the N-terminal amino acid sequence of the offspring was estimated. This sequence is shown as SEQ ID NO: 6 in the sequence listing.
  • a DNA fragment of about 1.1 kbp was amplified.
  • the DNA fragment obtained by the second PCR was recovered from the gel, introduced into pT7B1ue TV ector (produced by NONOKU'GEN), and the plasmid was transferred to a Nova Blue Combitent cell (Novaziyun). ).
  • FIG. 15 shows a restriction map of the inserted fragment of about 1.1 kbp.
  • the upper part of the restriction enzyme map corresponds to the base sequence of the primer I PTE-5, and the lower part corresponds to the base sequence of the primer IPTE-2.
  • EXT was inserted in the opposite direction in pNXGlO1 and five of pNXG102, pNXG103, pNXG104, pNXG104, and pNXG105.
  • PCR was performed using these plasmids as type III with Ml3 primer M4 (Takara Shuzo) and primer I PTE-1 (SEQ ID NO: 55) or primer I PTE-6 (SEQ ID NO: 56).
  • pNXG103 was completely digested with the restriction enzyme HindIII and precipitated with ethanol.
  • To the ethanol-precipitated DNA was added 2681 distilled water, 30 ⁇ 10X ligation buffer, and T4DNA lycase (Takara Shuzo Co., Ltd.), followed by self-ligation at 16 ° C overnight, followed by self-ligation.
  • Brasmid was transformed into I. coli J Ml09. Brasmid was extracted from three colonies and named pT—EXT—4, pT-EXT-15, and pT—EXT-6, respectively.
  • ⁇ — ⁇ —4, ⁇ — ⁇ —5, and ⁇ —EXT-6 are digested twice with Hind III-EcoRI and subjected to agarose gel electrophoresis. The presence of a 4 kbp insert was confirmed.
  • pT—EXT—4, ⁇ - ⁇ XT—5, and pT—EXT—6 were prepared using Ml3 primer M4 (Takara Shuzo) and T7 promoter'Brimer (Novagen) according to Sanger's method. The nucleotide sequence of the inserted fragment was decoded.
  • pNXG102 was completely digested with restriction enzymes HindIII and XbaI, and a band of about 0.5 kbp was cut out by agarose gel electrophoresis and purified.
  • pUCl8 (manufactured by Takara Shuzo Co., Ltd.) was double-digested with Hind III-Xba I, and this DNA fragment was ligated and transformed into E. coli JM109.
  • Brasmid was extracted from three of the obtained colonies and named pT—EXT—1, pT— ⁇ —2, and pT— ⁇ —3, respectively. These pT- ⁇ -1, pT- ⁇ -2, and pT-EXT-3 were double-digested with Hind III-EcoR I and subjected to agarose gel electrophoresis. Make sure there is a 5 kbp insert And confirmed.
  • pT—EXT—1, pT—EXT—2, pT—EXT—3 were converted to Ml 3 Primer M4 (Takara Shuzo) and Ml 3 Primer RV (Takara Shuzo) according to Sanger's method. The nucleotide sequence of the insert fragment of was analyzed.
  • the first PC uses primers KOM-2 (SEQ ID NO: 59) as the sense primer and primer KOM-5 (SEQ ID NO: 60) as the antisense primer, and use the TaKaRa LA PCR kit (Takara Shuzo Co., Ltd.). Nested PCR was performed in a 50/1 reaction system. The reaction was repeated 30 times at 94 ° C (1 minute), 98 ° C (20 seconds), and 67 ° C (10 minutes), and ended at 72 ° C (10 minutes). After the reaction, 51 of the reaction solution was subjected to 1% agarose gel electrophoresis, and only a band of about 3.3 kbp was confirmed.
  • the obtained DNA fragment is recovered from the gel, the ends are blunted using a DNA blunting kit (manufactured by Takara Shuzo), and the 5 'end labeled kit MEGARABEL TM (manufactured by Takara Shuzo) ) Was used to phosphorylate the 5 'end of the PCR product.
  • This DNA fragment was introduced into the Hinc II site of pUC19 (manufactured by Takara Shuzo), and this plasmid was transformed into E. coli JM109.
  • Figure 16 shows the restriction map of the inserted fragment of approximately 3.3 kbp spanned by the primers KOM-2 and KOM-5.
  • the upper part of the restriction map corresponds to the base sequence of primer KOM-5, and the lower part corresponds to the base sequence of primer KOM-2.
  • pKOM-1, pKOM-2, pKOM-3, pKOM-4, pKOM-5, and pKOM-6 are completely digested with the restriction enzyme Hind ⁇ , and subjected to agarose gel electrophoresis.
  • pKOM-1 was completely digested with the restriction enzyme Hind III, and a DNA fragment of about 1.3 kbp, that is, a DNA fragment containing the promoter region of the wheat EXT gene, was purified by agarose gel electrophoresis, and TaKaRa DNA ligation was performed.
  • a Self-ligated with a kit (Takara Shuzo). This plasmid was transformed into E. coli J Ml09.
  • pKEP-1 When the size of the inserted fragment was examined by PCR for 6 of the obtained colonies, a DNA fragment of about 1.3 kbp was detected in each case. Therefore, plasmids were extracted from three of these colonies and named pKEP-1, pKEP-2, and pKEP-3, respectively.
  • pKEP-1, pKEP-2, and pKEP-3 are completely digested with restriction enzymes EcoR I, Sac I, Kpn I, Sma I, BaoH I, Xba I, Pst I, and Hind III, and subjected to agarose gel electrophoresis. From there, a restriction map was created. Among these, the restriction enzyme map of pKEP-1 is shown in Figure 1 ⁇ .
  • each of pKEP-1, pKEP-2 and pKEP-3 was completely digested with a restriction enzyme SacI, and a band of about 3.8 kbp was purified by agarose gel electrophoresis.
  • This was self-ligated using TaKaRa DNA ligation 'kit (Takara Shuzo).
  • the thus obtained brasmids were named pKEPS-1, pKEPS-2 and pKEPS-3.
  • pKEP-1, pKEP-2, and pKEP-3 were each double-digested with restriction enzymes EcoEI-PstI, and a band of about 1.1 kbp was purified by agarose gel electrophoresis.
  • PUC 19 (manufactured by Takara Shuzo Co., Ltd.) was double-digested with restriction enzymes EcoB I-Pst I, and this DNA fragment was ligated and transformed into E. coli JM109.
  • PCR was performed using Ml3 Primer M4 (manufactured by Takara Shuzo) and Ml3 Primer RV (manufactured by Takara Shuzo) using 5 colonies, and the size of the inserted fragment was approximately 1. 1 kb p. Were screened. Brasmid was extracted from the positive colonies and named pKE PEP-11, pKEPEP-2, and pKEPEP-3, respectively.
  • pKEP—1, pKEP—2, pKEP—3, pKEPS—1, pKE PS-2, pKEPS-3, pKEPEP-1, pKEPEP-2, and pKEPEP-3 were prepared by using Ml 3 primer M4 (Takara Shuzo) and M13 Primer RV (Takara Shuzo) according to Sanger's method. The nucleotide sequence of the inserted fragment was decoded.
  • Probes for hybridization were cDNA fragments of Tomato EXT [European Patent Publication No. 0562836 A1 (1993)] and cDNA fragments of tomato polygalacturonase (tomato PG) [Molecular 'and 'General' Jiweneteikusu (Molecular & General Genetics), # 208 Certificates, the 30-36 pages the (1987)], B c aBE ST TM using labeling kit (Takara Shuzo Co., Ltd.) (one 32 P) d Labeled with CTP and prepared.
  • Northern Hybridization is described in Molecular Cloning Laboratory Manual, Second Edition, Chapter 7, pages 39-52 (T. Mania Teis et al., Edited by Cold Spring Harbor Laboratory, Inc.).
  • RNA was subjected to brehybridization in 251111 in a hybridization buffer (6 ⁇ SSC, 0.1% SDS, 5 Denhardt's solution, 100 g / ml 1 salmon sperm DNA) for 2 hours.
  • a hybridization buffer (6 ⁇ SSC, 0.1% SDS, 5 Denhardt's solution, 100 g / ml 1 salmon sperm DNA) for 2 hours.
  • the 32 P-labeled probe prepared by the above method was added to 25 ml of hybridization buffer (6 ⁇ SSC, 0.1% SDS, 5 ⁇ Denhardt's solution), and the membrane subjected to brehybridization was transferred to this probe solution. Then, 10-hour hybridization was performed at 65 ° C.
  • the membrane was washed three times with a washing solution containing 2 ⁇ SSC and 0.1% SDS for 20 minutes three times. After drying the membrane, the membrane was exposed to light for 180 minutes in a cassette containing X-ray film (manufactured by Kodak), and autoradiography was performed.
  • Figure 18 shows the results. That is, Fig. 18 shows Northern hybridization using tomato tissue.
  • the upper row shows the mRNA expression level of Tomato EX
  • the middle row shows the expression level of tomato PG mRNA
  • the lower row Indicates the amount of rRNA.
  • lane 1 is red fruit (mature red)
  • lane 2 is blue fruit (mature green, fruit surface is blue, jelly-like substance is formed inside)
  • lane 3 is growing.
  • Lane 4 shows the stem after elongation
  • lane 5 shows the leaves.
  • Example 19 (Immature green. The surface of the fruit is blue, but no jelly-like substance is formed inside.)
  • Total RNA was prepared by the method described in 1). Using these total RNAs, TaKaRa RNA PCR Kit with AMV Ver. 2 (Takara Shuzo) was used to analyze expression of tomato EXT mRNA and tomato PG mRNA by RT-PCR as follows.
  • Reverse transcription was performed using the random primer (9mer) attached to the kit. C (1 minute), 55 ° C (15 minutes), 99. C (5 minutes) at 5 ° C (5 minutes). After that, the whole reaction solution was made into type II,
  • Primer PG—SP3 (SEQ ID NO: 63) synthesized from the nucleotide sequence of a cDNA fragment of tomato PG [Molecular 'and' General 'Genetics, Vol. 208, pp. 30-36 (1987)]
  • Primer PG-AP2 (SEQ ID NO: 64)
  • FIG. 19 is a diagram showing RT-PCR using tomato tissue.
  • the expression (amplification product) of tomato PG at each maturation stage amplified by the described primers is shown.
  • the first and second are immature green fruits (immature green, fruit surface is green, and jelly-like substance inside).
  • 3 and 4 are ⁇ fruits (mature green. Fruit surface is green, jelly-like substance is formed inside), 5 and 6 are turning (10-30% of fruit surface 7) and 8 are pink (30-60% of the fruit surface is red.), 9 and 10 are red fruits (mature red, fruit The actual surface is 100% red).
  • Tomato EXT promoter is a promoter that strongly induces gene expression especially in growing stems and growing fruits (from immature green to mature green). In other words, it was found that both induce gene expression at the site where Xyloglucan reconstitution of plant cell wall is required and at the time of Xyloglucan reconstitution of plant cell wall.
  • Plasmid containing the chimeric gene of the DNA fragment containing the promoter region of the Azuki EXT2 gene and the GUS gene was constructed as shown in Fig. 20 c.
  • PB1221 manufactured by Clontech
  • this plasmid was digested with restriction enzymes Hind III and Sma I (Takara Shuzo Co., Ltd.) to remove the 35S promoter region of pBI221 power reflower mosaic virus, followed by agarose gel electrophoresis. The target fragment other than the target region was excised and purified.
  • PVX2P501 prepared in Example 13 was completely digested with restriction enzymes EcoE I and Hinc II, and an insert fragment of about 0.5 kbp was cut out by agarose gel electrophoresis and purified.
  • pEXT2pr0 (F) f3 prepared in Example 13 was completely digested with restriction enzymes HindIII and EcoRI, and an inserted fragment of about 2.55 kbp was cut out by agarose gel electrophoresis and purified. After ligation of these DNA fragments, I. coli was transformed into M109. This plasmid was named p VAEXT2 GUS, and E. coli J Ml09 transformed with ⁇ VA ⁇ X ⁇ 2GUS was named Escherichia coli JM109 / pVAEXT2GUS.
  • this pVAEXT2GUS After digestion with restriction enzymes Hind III and SnaB I, this pVAEXT2GUS generated a band of about 3.4 kbp by agarose gel electrophoresis, and was found to contain the entire promoter region of the Azuki EXT2 gene of about 3. Ok bp. .
  • a vector containing a chimeric gene of the DNA fragment containing the promoter region of the Azuki EXT3 gene and the GUS gene was constructed as shown in FIG. That is, pB1221 (manufactured by Clontech), which has a GUS gene derived from the 35S promoter of cauliflower mosaic virus, a GUS gene derived from i'-coli, and a transcription termination sequence force set derived from nopaline synthetase.
  • pB1221 manufactured by Clontech
  • this plasmid was digested with restriction enzymes Hind III and Xba I in order to remove the 35S promoter region of the force reflower mosaic virus of pBI221, and then agarose gel electrophoresis was performed to purify the target region other than the 35S promoter region.
  • agarose gel electrophoresis was performed to purify the target region other than the 35S promoter region.
  • the pV X3P 206 prepared in Example 14 was replaced with a zigzag of about 0.
  • Primer VX3UH (SEQ ID NO: 65) and primer VX3LX (SEQ ID NO: 66) contain an Xba I site and a Hind III site, respectively, so this approximately 0.4 kbp DNA fragment was subjected to agarose gel electrophoresis.
  • This brassmid was named p VAEXT3GUS, Y'coli J Ml 09 transformed at ⁇ 8
  • Escherichia coli JM109 pVAEXT3GUS It was named Escherichia coli JM109 pVAEXT3GUS.
  • this PVAEXT3GUS After digestion with the restriction enzymes Hind III and Xba I, this PVAEXT3GUS generates an approximately 0.4 kbp band by agarose gel electrophoresis, and thus can contain the entire promoter region of the approximately 0.4 kbp Azuki EXT3 gene. Do you get it.
  • the vector was constructed as shown in FIG. That is, pB1221 (Clontech) having the 35S promoter of cauliflower mosaic virus, the GUS gene derived from E. coli, and a transcription termination sequence cassette derived from nopaline synthetase was used.
  • pBI221 was digested with restriction enzymes XbaI and SmaI, and the DNA fragment was cut out and purified by agarose gel electrophoresis.
  • PXRG302 prepared in Example 15 was double-digested with a restriction enzyme XbaI-HincII, and then a DNA fragment of about 1. 1 kbp was cut out and purified by agarose gel electrophoresis. After ligation to the previously purified DNA fragment of PBI221, it was transformed into E. coli JM109.
  • a brassmid was prepared. After digestion with the restriction enzymes HindIII and XbaI, self-ligation, and transformation into yeast JM109. Plasmid was purified from the obtained colonies. This plasmid was named pVAXRP1t1GUS, and E. coli J Ml09 transformed with pVA XRP1t1GUS was
  • this pVAXRPtltl GUS was used to determine the translocation between GUS having the N-terminal amino acid sequence of the Azuki XRP1 gene.
  • the gene encoding the N-terminal amino acid sequence of Azuki XRP1 must be followed by a gene derived from pBI221 (SEQ ID NO: 68) for GUS expression to form a fusion protein. And confirmed.
  • Hind III and Xba I sites were added to the primer LXUH1 (SEQ ID NO: 69) and the primer LXLX (SEQ ID NO: 70), respectively, and these sites were introduced at both ends of the PCR product. It was synthesized as follows. The reaction was repeated 10 times at 94 ° C (1 minute), 55 ° C (1 minute) and 72 ° C (2 minutes). After the reaction, 51 of the reaction mixture was subjected to 1% agarose gel electrophoresis. As a result, a band of about 1.4 kbp was confirmed in addition to the band of type I plasmid.
  • Primer LXUH1 (SEQ ID NO: 69) and Primer LXLX (SEQ ID NO: 70) contain HindIII and XbaI sites, respectively. After excision and purification by electrophoresis, the fragment was digested with the restriction enzymes HindIII and XbaI, ligated to the previously purified DNA fragment of pBI221, and transformed into E. coli JMl09. This plasmid was named pLEEXTl.4GUS, and E. coli JMl09 transformed with pLEEXTl.4GUS was named Escherichia coli J109 / pLEEXTl.4GUS.
  • this pLEEXTl. 4GUS After digestion with the restriction enzymes Hind III and Xba I, this pLEEXTl. 4GUS generates a band of about 1.4 kbp by agarose gel electrophoresis. As a result, it was found that it contained the promoter region of the tomato EXT gene of about 1.4 kbp. Further, as shown in FIG. 24, a brassmid having a fusion gene with the GUS gene (transfusion fusion) using only the region having homology with the promoter region of the tobacco EXT gene was prepared.
  • PCR was performed using primer LXUH2 (SEQ ID NO: 71) located 5 ′ upstream of the region and primer LXLX (SEQ ID NO: 70) having a sequence immediately before the translation initiation site.
  • LXUH2 SEQ ID NO: 71
  • LXLX SEQ ID NO: 70
  • the reaction is 94 ° C (1 minute), 55. C (1 minute), 72.
  • the cycle of C (2 minutes) was repeated 10 times.
  • 5 ⁇ 1 of the reaction mixture was subjected to 1% agarose gel electrophoresis.
  • Hind I site and Xba I site were introduced into the primers LXUH2 (SEQ ID NO: 71) and LXLX (SEQ ID NO: 70), respectively.
  • the DNA fragment of about 0.7 kbp was subjected to agarose gel electrophoresis.
  • the vector containing the translational fusion of the GUS gene with the approximately 4.9 kb pDNA fragment containing the N-terminal amino acid sequence of tomato EXT (SEQ ID NO: 72) and the promoter region is shown in Figure 25. It was built as follows. That is, pB1221 (Clontech) having the 35S promoter of cauliflower mosaic virus, the GUS gene from E. coli, and the transcription termination sequence cassette from nopaline synthetase was used.
  • this plasmid was digested with the restriction enzymes PstI and BamHI to remove the 35S promoter region of the pBI221 power reflower mosaic virus, followed by agarose gel electrophoresis for the purpose other than the 35S promoter region. Was cut out and purified.
  • pLXG601 prepared in Example 16 was completely digested with restriction enzymes PstI and BamHI, a DNA fragment of about 4.9 kbp was cut out and purified by agarose gel electrophoresis. After ligation to the previously purified DNA fragment of pBI221, it was transformed into E. coli J109. This plasmid was named pLEEXT t14.9 GUS, and E.
  • coli JM109 transformed with pLEEXT t14.9 GUS was named Escherichia coli JM109 / pLEEXTtl4.9GUS.
  • Escherichia coli JM109 / pLEEXTtl4.9GUS After completely digesting this pLEEXTt l4.9GUS with the restriction enzymes Pst I and BamHI, agarose gel electrophoresis generates a DNA fragment of about 4.9 kbp, resulting in a promoter of the tomato EXT gene of about 4.9 kbp. It was found to contain a single region.
  • this pLEEXTt14.9GUS was used to transduce the GUS gene with the N-terminal amino acid sequence of tomato EXT.
  • the gene encoding pB1221 (SEQ ID NO: 73) has been integrated for GUS expression following the gene encoding the N-terminal amino acid of tomato EXT so that a fusion protein can be formed. It was confirmed.
  • FIG. 26 a vector containing translational fusion between the GUS gene and a gene encoding the N-terminal amino acid sequence of tomato EXT (SEQ ID NO: 72) and a promoter region is shown in FIG. 26. Constructed as shown. That is, pB1221 (manufactured by Clontech) having the 35S promoter of cauliflower mosaic virus, the GUS gene derived from E. coli, and a transcription termination sequence cassette derived from nopaline synthetase was used.
  • this plasmid was digested with the restriction enzymes HindIII and BamHI to remove the 35S promoter region of the pBI221 force reflower mosaic virus, followed by agarose gel electrophoresis for the purpose other than the 35S promoter region. Was excised and purified.
  • pL XP101 prepared in Example 16 was completely digested with restriction enzymes HindIII and BamHI, a DNA fragment of about 1.4 kbp was cut out and purified by agarose gel electrophoresis. After ligation to the previously purified DNA fragment of pBI221, E. coli J Ml09. This plasmid was named pLEEXTt11.4GUS, and E.
  • coli JM109 transformed with pLEEXTt11.4GUS was named Escherichia coli J109 / pLEEXTtll.4GUS.
  • Escherichia coli J109 / pLEEXTtll.4GUS After completely digesting this pLEEXTt l.4GUS with the restriction enzymes Hind III and BamHI, an approximately 1.4 kbp DNA fragment is generated by agarose gel electrophoresis, resulting in an approximately 1.4 kbp tomato EXT gene. was found to contain a promoter region.
  • the nucleotide sequence of the GUS gene upstream of pLEEXTt11.4GUS up to the promoter region was determined.
  • the transgenic GUS having the N-terminal amino acid sequence of tomato EXT was determined.
  • the gene encoding the N-terminal amino acid of tomato EXT is inserted after the gene encoding pBI221 (SEQ ID NO: 73) so that GUS is expressed, so that the fusion protein is formed. confirmed.
  • a vector containing a chimeric gene of the DNA fragment containing the promoter region of the tobacco EXT gene and the GUS gene was constructed as shown in FIG. That is, pB1221 (manufactured by Clontech) having the 35S promoter of the force reflower mosaic virus, the GUS gene derived from E. coli, and the transcription termination sequence cassette derived from nopaline synthetase was used.
  • this plasmid was digested with restriction enzymes PstI and XbaI to remove the 35S promoter region of the cauliflower mosaic virus from pBI221. After that, the target DNA fragment other than the 3 ⁇ S promoter region was excised and purified by agarose gel electrophoresis. Next, the pNXG prepared in Example 17
  • primer NXUP located in the downstream region of HindIII site of the promoter region of the tobacco EXT gene in pNXG102 and immediately before the translation initiation site PCR was performed using the primer N XLX (SEQ ID NO: 75) having the following sequence:
  • E. coli JM109 After excision and purification by electrophoresis, the fragment was digested with restriction enzymes PstI and XbaI, ligated to the previously purified DNA fragment of pB1221, and transformed into E. coli JM109.
  • This plasmid was named pNTEXTO.8GUS
  • E. coli JM109 transformed with pNTEXTO.8GUS was named Escherichia coli JM109 / pNTEXTO.8GUS.
  • This pNTEXTO.8GUS after digestion with the restriction enzymes Pst I and Xba I, generates an approximately 0.8 kbp band by agarose gel electrophoresis, thereby increasing the promoter region of the approximately 0.8 kbp tobacco EXT telegene. It is a component that can be included. 7. Wheat EXT gene DNA fragment containing promoter region and GU gene chimera ⁇ ⁇ Preparation of plasmid containing gene (Transscriptional Fusion)
  • a vector containing a chimeric gene of the DNA fragment containing the promoter region of the wheat EXT gene and the GUS gene was constructed as shown in FIG.
  • pB1221 (Clontech) which has the 35S promoter of the reflowering mosaic virus, the GUS gene from I. coli, and a transcription termination sequence cassette derived from nopaline synthetase, was used. I went.
  • this plasmid was digested with the restriction enzymes HindIII and SmaI, followed by agarose gel electrophoresis to remove the region other than the 35S promoter region.
  • the desired DNA fragment was excised and purified.
  • the DNA fragments of about 0.61 61 and about 0.5 kbp were cut by agarose gel electrophoresis. And purified.
  • the DNA fragment of pBI221 previously purified was ligated with both a DNA fragment of about 0.6 kbp and a DNA fragment of about 0.5 kbp, and transformed into E. coli JMl09.
  • These plasmids were named pTAEXTl.1GUS, and E. coli JMl09 transformed with them was named Escherichia coli JM109 / pTAEXTl.1GUS.
  • This pTAEXT1.1GUS was found to contain about 1.lkbp of the wheat EXT gene promoter region by digestion with the restriction enzymes Hind III and EcoRI and then generating an about 3.3 kbp band by agarose gel electrophoresis.
  • the tobacco BY 2 cultured cells were treated with 1% cellulase 'Onozuka RS. (Manufactured by Seishin Pharmaceutical Co., Ltd.), 0.4M mannitol (pH 5.5), and treated at 30 for 2 hours. Protoblasts without cell walls were used. 2 ⁇ 10 6 tobacco BY 2 cultured cell protoplasts were suspended in an electroporation buffer (70 mM MKC 5 mM MES, 0.3 M mannitol, pH 5.8), and the plasmids prepared in steps 1 to 7 above were suspended.
  • an electroporation buffer 70 mM MKC 5 mM MES, 0.3 M mannitol, pH 5.8
  • DNA 3 pmo 1 and 10% PEG6000 Noele electrophoresis buffer were added and mixed, and an electric pulse (300 V, 125 ⁇ F) was applied using Gene Palza II (manufactured by Bio-Rad). DNA was introduced into plant cells.
  • the amount of protein was measured, for example, as 2, 5, 10 of 15 dilution of extract and 800 g / m 1 BSA standard solution [add lmgZm 1 BSA 80 ⁇ 1 to extraction buffer 20a1]. , 15, 20, and 30 1 in a 96-well microtiter plate, and distill water 158, 155, 150, 145, 140, 1301 and biorad protein, ats, kit, and quantitative reagents to a total volume of 2001, respectively. (Manufactured by Bio-Rad Co.) 401 and gently stirred. Then, it was left at room temperature for 20 minutes, and then the protein amount was quantified by measuring with a plate reader (wavelength 590 nm) within 60 minutes thereafter.
  • a plate reader wavelength 590 nm
  • the fluorescence intensity of the 41 MU standard solution was measured at the same time as the above measurement, and the result was plotted on a graph with the horizontal axis representing 41 MUS (pmo 1) and the vertical axis representing the fluorescence intensity.
  • the amount of 41 MU per fluorescence intensity was calculated, and the results of the sample were plotted on a graph as time (minutes) on the horizontal axis and fluorescence intensity on the vertical axis.
  • the specific activity of GUS was determined from the amount of protein.
  • FIG. 29 is a diagram comparing the specific activities of GUS of the transformed tobacco BY2 cultured cells.
  • Fig. 29 compares the introduction experiments performed a total of seven times.
  • the specific activity at the time of introduction of pLEEXTl.4GUS was set to 100, and the specific activity of GUS at the time of introduction of each brassmid was determined and displayed as a graph comparing the strength of each promoter's one activity.
  • the vertical axis shows the specific activity value when introducing another plasmid when the specific activity of GUS when introducing pLEEXTl.4GUS was 100, and the horizontal axis was used for the introduction experiment. Indicates plasmid. Further, n number of 35 thereby is 2 to 7 c, these DN A fragment containing the promoter region of E XT gene, force Refla Wa Moza I click virus which is said to exhibit strong expression in plants It was confirmed that the activity was stronger than that of the S promoter. As can be seen from the figure, particularly, the promoter activity of Azuki XRP1 and Tomato EXT is remarkably high.
  • a method for cloning the promoter of the EXT gene and its family gene, a vector for plant transformation containing the EXT gene and its promoter, and a method for producing the same, the EXT gene and its family (4) A method for regulating the expression of a gene promoter, a method for controlling the morphology of a plant using a promoter of an EXT gene and a gene of a family thereof, and a plant.
  • FIG. 1 is a restriction map of the inserted fragment of pVXP101.
  • FIG. 2 is a restriction map of the inserted fragment of pVXP-H3.
  • FIG. 3 is a drawing-substituting photograph showing the electrophoresis pattern of Northern hybridization of cultured cells in Example 10.
  • FIG. 4 is a graph showing the growth state of the cultured cells in Example 10.
  • FIG. 5 is a graph showing the results of the transient assay of Example 11.
  • FIG. 6 is a construction diagram of pB VEG101.
  • FIG. 7 is a construction diagram of pBVEGl21.
  • FIG. 8 is a construction diagram of pBI-H-101.
  • FIG. 9 is a construction diagram of pB I—H—121.
  • FIG. 10 is a drawing-substituting photograph showing the result of GUS staining of transformed Arabidopsis thaliana in Example 12.
  • FIG. 11 is a restriction map of an approximately 6. Okbp DNA fragment amplified by PCR in Example 13.
  • FIG. 12 is a restriction map of a DNA fragment of about 4.5 kbp amplified by PCR in Example 14.
  • FIG. 13 is a restriction map of the inserted fragment of pXRG302.
  • FIG. 14 is a restriction map of the inserted fragment of pLXG101.
  • FIG. 15 is a restriction map of the inserted fragment of pN'XG102.
  • FIG. 16 is a restriction map of the inserted fragment of pKOM-1.
  • FIG. 17 is a restriction map of pKEP-1.
  • FIG. 18 is an electrophoretogram showing a migration pattern of Northern hybridization of a plant in Example 19.
  • FIG. 19 is an electrophoretogram showing a migration pattern after RT-PCR of the plant in Example 19.
  • FIG. 20 is a construction diagram of ⁇ 8, £ 10,000.
  • FIG. 21 is a construction diagram of p VAEXT3GUS.
  • FIG. 22 is a construction diagram of pVAXRPlt1GUS.
  • Figure 23 is the construction diagram of pLEEXTl. 4GUS.
  • Figure 24 is the construction diagram of pLEEXTO. 7GUS.
  • Figure 25 is the construction diagram of pLEEXTt l4.9GUS.
  • Figure 26 is the construction diagram of pLEEXT t11.4GUS.
  • FIG. 27 is a construction diagram of pNTEXTO.8.
  • FIG. 28 is a diagram showing the construction of pTAEXTl.1GUS.
  • FIG. 29 is a graph comparing the specific activities of GUS of the transformed tobacco cultured cells in Example 11 and Example 20.
  • Sequence type nucleic acid
  • Organism name Vigna angularis
  • Sequence type nucleic acid
  • Organism name Vigna angularis
  • Sequence type nucleic acid
  • Organism name Vigna angularis
  • AATTGAHAA AATAAAATTA CATATAATAA TTTATTTTGA TACATATTGC CAGACCTCAT 900
  • CTCCTTCTCA CTAAAAACTC
  • TCCCTTCTCT CTATAAAATA 1140 - ⁇ -
  • Sequence type nucleic acid
  • Sequence type nucleic acid
  • Organism name Tomato (Lycopersicon esculentum
  • Sequence type nucleic acid
  • Organism name Tano, Ko (Nicotiana tabacum)
  • Sequence type nucleic acid
  • Organism name Wheat (Triticum aestivum)
  • Sequence type nucleic acid
  • Organism name Rice (Oryza sativa)
  • Sequence type nucleic acid
  • Organism name Maize (Zea mays) Array:
  • Sequence type nucleic acid
  • Organism name Vigna angularis
  • TCACTTCAGC ATGAACATAA AGATGGTTCC TGGTGATTCA GCTGGCACAG TCACTGCTTT 300
  • Sequence type nucleic acid
  • Organism name Vigna anguillaris
  • Sequence type nucleic acid
  • Sequence type Other nucleic acids (synthetic DNA)
  • Sequence type nucleic acid
  • Organism name Vigna angularis
  • ATCTGTCTTC AAAAGGAGCA ACGTGGGATG AGATTGACTT TGAATTCTTG GGGAATTTGA 360
  • Sequence type nucleic acid Number of chains: single strand
  • Organism Name Vigna Anguillaris
  • GAAGGAGCTA CATACCAAGC TCHAATGCC ATGGAAGCTC GAAGGTACAG GTGGGCTCGT 480
  • Sequence type nucleic acid
  • Organism name Tobacco Array:
  • CTGTCTTTGG ACAAAGTTTC TGGCTCTGGT TTTCAATCTA AGAAAGAGTA TCTCTTTGGG 60 AGAATTGATA TGCAAATCAA ACTTGTTGCT GGAAATTCTG CTGGAACTGT CACTACATAC 120 TATTTATCTT CTCAGGGACC CACACATGAT GAAATTGACT TTGAATTCTT GGGATG
  • Sequence type nucleic acid
  • Sequence type Other nucleic acids (synthetic DNA)
  • Sequence type nucleic acid
  • Organism name Vigna anguillaris
  • Sequence type nucleic acid
  • Organism name Vigna angularis
  • ACTCTTTGTA AHTTATCGA AGAGTTAGTG TGCAATAGAA ATTTAACATT GAGTATTTAC 60 AATTGTTAAA ACTATACAH CACTTCATTT TCATGCATTT ATAAACATTT CAATTTCAAT 120 TTCATGTTAA AATCAACTCA AAGTAATACT CAAATCTTAT TCCTAGTGAC TTTAATATAT 180 TGTTAACTTA TCAAGTTTCA ATTCCTTCAA TCATCAACAA GCAATCAAGA ATTAAGTTCA 240 AGAGTCTTAA GATTACTAAT AAATCATGTT CTATCCCTAG ATATAAGCTT 290 SEQ ID NO: 20
  • Sequence type nucleic acid
  • Sequence type Other nucleic acids (synthetic DNA)
  • Sequence type nucleic acid
  • Sequence type Other nucleic acid (synthetic DNA) Sequence:
  • Sequence type nucleic acid
  • Sequence type Other nucleic acid (synthetic DNA) Sequence:
  • Sequence type nucleic acid
  • Sequence type Other nucleic acid (synthetic DNA) Sequence: TAATAATGTT CATTGTATTT GAGAACTGGT 30 SEQ ID NO: 25
  • Sequence type nucleic acid
  • Sequence type Other nucleic acid (synthetic DNA) Sequence:
  • Sequence type nucleic acid
  • Sequence type Other nucleic acid (synthetic DNA) Sequence:
  • Sequence type nucleic acid
  • Organism name Vigna ⁇ Angularis
  • Sequence type nucleic acid
  • Sequence type nucleic acid
  • Sequence type Other nucleic acid (synthetic DNA) Sequence:
  • Sequence type nucleic acid
  • Sequence type Other nucleic acid (synthetic DNA) Sequence:
  • Sequence type nucleic acid Number of chains: single strand
  • Sequence type Other nucleic acid (synthetic DNA) Sequence:
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  • Sequence type nucleic acid
  • Type of row E Other nucleic acids (synthetic DNA) Sequence: TCTATCCATT GCCACTTTAT TTATGAATTG 30 SEQ ID NO: 41
  • Sequence type nucleic acid
  • Sequence type Other nucleic acid (synthetic DNA) Sequence:
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  • Sequence type nucleic acid
  • Sequence type nucleic acid
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Description

明細書 植物プロモーターおよび該プロモーターを用いた遺伝子発現方法 発明の技術分野
本発明は、 遠伝子組換え技術を用いた植物の新品種の開発や、 機能改変 等の植物工学、 さらには、 有用な代謝産物を生産させる植物培養細胞の機 能改変等の植物細胞工学に有用な植物由来のプロモーター、 該ブロモータ 一に有用遗伝子が発現可能な状態で連結された D N A断片、 該 D N A断片 を含むベクターに関する。 また、 該 DNA断片または該 DNA断片を含む ベクタ一により形質転換された植物または植物細胞、 あるいは該植物細胞 から再生されたトランスジュニック植物に関する。 さらに、 該植物プロモ 一ターのクローニング方法に関する。 従来の技術
遗伝子工学的手法を用いた植物の改良は、 近年、 実用的になりつつある [サイエンス （Science) 、 第 244卷、 第 1293〜1299頁 （19 89) ] 。 なかでも、 土壌細菌であるァグロパクテリゥム 'チュメファン エンス (Agrobacterium tumefaciens) ゃァスロノヽクテリウム * リゾケ不 ス (Agrobacterium rhizogenes) の持つ T iブラスミ ドゃ R iブラスミ ド を利用した形質転換系はその進歩が著しく、 従来から行われてきた、 タパ コ、 シロイヌナズナ、 ペチュニアのみならずァズキの双子葉植物 [日本植 物組織培養学会講演要旨集、 第 124頁 （1990) ] やイネなどの単子 菜植物 [ザ 'ブラント · ジャーナル （The plant journal) 、 第 6卷、 第 271頁〜 282頁 （1994) ] にまで応用可能になってきている。 ま た、 イネに代表される単子葉植物では、 プロ トプラストを作成して、 これ にエレク 卜ロボレ一シヨンで遺伝子導入する方法 [ネィチヤ一（Nature)、 第 338卷、 第 274頁 （1989) ] が実用化されている。 さらに、 パ 一ティクルガン （遺伝子銃） を用いた植物への遺伝子直接導入も多くの例 がある [ザ ·プラント · ジャーナル、 第 2巻、 第 275頁〜 281頁 （1 992) ] o
組織特異的に有用な物質や酵素の発現を誘導するプロモーターとしては、 これまでに、 種子の各組織 [植物細胞工学、 第 3卷、 第 568頁〜 576 頁 （1991) ] 、 葉および花の各組織 [サイエンス、 第 250巻、 第 9 31頁〜 936頁 （1990) 〕 、 塊茎 [植物細胞工学、 第 3卷、 第 57 7頁〜 587頁 （1991) ] 、 塊根、 根粒 [サイエンス、 第 250卷、 第 948頁〜 954頁 （1990) 〕 で特異的に発現する遺伝子が単離さ れ、 そのプロモーターによる発現がトランスジヱニック植物で解析されて いる。
しかしな力くら、 従来、 これらベクター系に用いられてきたプロモーター はァグロバクテリウ厶 · チュメファシエンスの持つ T iブラスミ ド由来の プロモーターやカリフラワーモザイクウィルス （C aMV) の遺伝子由来 のプロモーターがほとんどである。 これらのプロモーターは、 遠伝子を導 入した植物の生育段階や組織に関係なく恒常的に発現するものであり、 制 御が不可能で、 発現量も少ない。 また、 組織特異的に発現を誘導する発現 調節領域を含むプロモーターにおいて、 植物細胞壁のキシログルカン
(Xyloglucan) 再構成の必要な部位や時期に特異的に発現を誘導している プロモーターはない。
また、 植物細胞工学の分野において、 植物組織培養に用いる植物細胞で 有用な二次代謝産物を生産しょうとしても、 細胞の増殖に不可欠な植物ホ ルモンの存在でその産物の生合成系の酵素遺伝子の発現が抑制され、 生産 が抑制される例が多く知られている [フィジォロジァ ·ブランタルム
(Physiologia plantarum) 、 第 8 0卷、 第 3 7 9頁〜 3 8 7頁 （1 9 9 0 ) ] 。 従って、 細胞が増殖する植物ホルモン存在下の条件で、 かつ、 細 胞の二次代謝産物の生合成を最適化することは、 非常に困難であり、 その ため、 2段階培養を用 L、て増殖と二次代謝産物生合成を別々の条件で行う 必要がある [農芸化学会誌、 第 6 0卷、 第 8 4 9〜8 5 4頁（1 9 8 6 )]。 これらの原因は、 植物ホルモンなどのシグナルによって、 生合成系の酵 素遺伝子のプロモーターが調節を受けて、 発現の抑制に働くからと考えら れる。
よって、 これらプロモーターに代えて、 細胞の増殖する時期に強く有用 な物質や酵素の発現を誘導するプロモーターを入れたキメラ遗伝子を細胞 に導入することにより、 細胞が増殖する条件で二次代謝産物の生合成を促 進できると考えられるが、 細胞増殖時に特に強く発現し、 有用な物質ゃ酵 素の発現を誘導するプロモーターはなく、 細胞の増殖している時期に、 特 に強く発現を誘導するプロモーターがあれば、 細胞の増殖と共に二次代謝 産物の生合成が可能となり、 有用な二次代謝産物の生産性の大幅な向上が 見込まれる。
このように、 植物工学や植物細胞工学において、 組織特異的に発現を誘 導させることのできるプロモーターや、 植物ホルモンなどで発現制御が可 能なプロモーターが望まれる。 発明の目的
本発明の目的は、 組織特異的、 特に植物細胞壁の Xyloglucan再構成の必 要な部位、 時期に発現を誘導させることができ、 さらには植物ホルモンな どで発現制御が可能な植物由来のプロモーター、 該プロモーターを含む D N A断片、 該 D N A断片を含むベクター、 該 D N A断片またはベクターに より形質転換された植物または植物細胞、 あるいは該植物細胞から再生さ れたトランスジュニック植物、 該植物プロモーターのクローニング方法を 提供することにある。 発明の概要
本発明者らは、 植物由来のエンド型キンログルカン転移酵素 （E X T) 遺伝子およびそのファミ リー遺伝子が、 組織特異的に発現するのに着目し、 発現制御が可能なプロモーターおよびそのべクタ一を提供できないかと考 えた。 さらに、 このプロモーターを利用して植物細胞および植物の改良を 行えないかと考えた。 そこで、 本発明者らは、 植物由来の E X T遗伝子よ り上流にあるであろうプロモーターを含む領域をクローニングしょうと試 みたが、 シユード遺伝子 （偽遠伝子） を含めた多くのファミ リー遺伝子の 存在、 さらには E X T遗伝子およびそのファミ リー遗伝子より上流の領域 を含む断片を持つファージを作製し、 宿主菌に感染させた際、 得られるプ ラークのプラーク形成能が低下し、 従来知られているプラークハイプリダ ィゼーション法では、 E X T遺伝子のプロモーターをクローニングするこ とは容易ではなかった。
そこで、 本発明者らは、 鋭意研究を重ねた結果、 E X T遗伝子のブロモ 一ターのクローニングに成功し、 プロモーター部分の解析を行い、 該プロ モーターの塩基配列を決定した。 そして、 このプロモーター部分を切り出 し、 ィ一' コリ [Escherichia coli (E. coli) ] 由来の ーグルクロ二 ダーゼ （G U S ) 遗伝子に接続し、 このキメラ遠伝子を植物細胞に導入し た。 遺伝子導入を行った細胞では、 G U S遺伝子が強く発現していることが 確認された。 また、 E X T遺伝子のファミ リー遺伝子についても同様にプ 口モータ一部分の塩基配列を決定し、 該プロモーター部分をィー ' コリ由 来の G U S遺伝子に接続し、 このキメラ遺伝子を植物細胞に導入したとこ ろ、 G U S遺伝子が強く発現していることが確認された。
さらに、 ノーザンハイブリダィゼーシヨンにより、 このプロモーターを 含む E X T遺伝子が組織特異的に、 特に植物細胞壁の Xyloglucan再構成に 必要な部位、 時期に発現していること、 培養細胞の対数増殖期あるいは定 常期に発現しているプロモーターを含む E X T遺伝子およびそのファミ リ ー遗伝子がそれぞれ存在することことを確認し、 本発明を完成するに至つ 0
すなわち、 本発明を概説すれば、 本発明の第 1の発明の態様は、 組織特 異的に発現を誘導する植物プロモーターに関し、 植物細胞壁の Xyloglucan 再構成を行う機能を有する酵素をコードする遺伝子の発現を制御する植物 プロモータ一、 特に植物細胞壁の Xyloglucan再構成の必要な部位でブロモ 一夕一活性を有し、 または植物細胞壁の Xyloglucan再構成の時期にプロモ 一ター活性を有することを特徴とする。
本発明の第 2の態様は、 第 1の発明の植物プロモーターに関し、 配列表 の配列番号 1、 2、 3、 4、 5、 6、 7および 8から選択されるいずれか の塩基配列に含有されることを特徴とする。
本発明の第 3の態様は、 第 2の態様の塩基配列にハイブリダイズ可能で、 かつ植物または植物細胞、 あるいは該植物細胞より再生されたトランスジェ ニック植物においてプロモーター活性を有することを特徴とする。
本発明の第 4の態様は、 第 1、 2、 3の態様の植物プロモーターを含有 する D N A断片に関し、 該植物プロモーターに有用遗伝子を発現可能な状 態で連詰させた D N A断片であることを特徵とする。
本発明の第 5の態様は、 ベクターに関し、 第 1、 2または 3の態様の植 物プロモーター、 または第 4の態様の D N A断片を含有することを特徴と する。 本発明の第 6の態様は、 第 4の態様の D N A断片または第 5の態 様のベクターにより形質転換された植物または植物細胞、 あるいは該植物 細胞から再生されたトランスジェニック植物に関する。
本発明の第 7の態様は、 タンパク質の製造方法に関し、 第 6の態様の形 質転換された植物または植物細胞、 該植物細胞から再生されたトランスジェ ニック植物の少なくともいずれか 1つを用いることを特徴とする。
本発明の第 8の態様は、 植物の形態の制御方法に関し、 第 4の態様の D N A断片または第 5の態様のベクターを用いることを特徴とする。
本発明の第 9の態様は、 植物プロモーターのクローニング方法に関し、 植物細胞壁の Xyloglucan苒構成を行う機能を有する酵素をコードする遺伝 子、 特にェンド型キンログルカン転移酵素またはその機能的同等物をコー ドする遺伝子を用いることを特徴とする。 ' 発明の詳細な説明
本明細害で言う 「プロモーター」 とは、 転写開始点 （+ 1 ) から 2 0 ~ 3 0塩基対上流にあって、 正確な位置から R N Aポリメラーゼに転写を開 始させる機能を担っている T A T Aボックスまたは T A T Aボックス類似 の領域が含まれるが、 必ずしもこれらの領域の前後に限定されるものでは なく、 この領域以外に、 発現網整のために R N Aポリメラーゼ以外のタン パク質が会合するために必要な領域を含んでいてもよい。
また本明細書中で 「プロモーター領域」 と記載する場合があるが、 これ は本明細書で言うプ口モーターを含む領域のことを示す。 本明細書で言う 「プロモーター活性」 とは、 プロモーターの下流に発現 可能な状態で有用遺伝子を連結し、 宿主 （植物、 植物細胞、 該植物細胞か ら再生させたトランスジュニック植物等） に導入した際、 宿主内または宿 主外において有用遺伝子の遗伝子産物を生産する能力および機能を有する ことを示す。
一般的に、 プロモーターの下流に、 定量が容易に行えるタンパク質をコ ードする遗伝子 （レポーター遺伝子） を発現可能な状態で連結させ、 宿主 に導入し、 これらタンパク質の発現量を測定することでプロモーターの有 無や強弱をプロモーターの活性として表す。 このようにプロモーターの下 流に発現可能な状態で有用遗伝子を連結し、 宿主に導入した際、 宿主内ま たは宿主外において有用遺伝子の遠伝子産物の発現が確認された場合、 そ のプロモータ一は導入した宿主においてプロモーター活性を有することに なる。
本明細書で言う 「植物細胞壁の Xyloglucan再構成を行う機能を有する酵 素をコードする遗伝子」 とは、 植物細胞壁の Xyloglucan再構成の際に特異 的に発現している酵素をコードする遗伝子であり、 特に、 エンド型キン口 グルカン転移酵素 （EXT) をコードする遺伝子および EXT遠伝子のファ ミ リー遗伝子を言う。 EXT遺伝子のファミ リー遺伝子としては、 例えば BRU1¾伝子 [ブラント 'フィジオロジー （Plant Physiology) 、 第 1 04巻、 第 161〜： L 70頁 （1994) ] 、 me r i— 5遺伝子 [ザ - ブラント 'セル （The Plant Cell) 、 第 3卷、 第 359〜370頁 （19 91) ] 、 本発明で得られた XRP遺伝子が挙げられる。
本明細害で言う 「植物細胞壁の Xyloglucan再 «成の必要な部位」 とは、 植物細胞壁の Xyloglucan再榱成を行う機能を有する酵素をコ一ドする遺伝 子が特異的に発現している部位を言い、 これら植物細胞壁の Xyloglucan再 構成を行う機能を有する酵素をコードする遺伝子が特異的に発現している 限り、 それらの発現している部位は本明細書で言う植物細胞壁の
Xyloglucan再構成の必要な部位に含まれる。
例えば、 同一植物においても、 植物細胞壁の Xyloglucan再構成を行う機 能を有する酵素をコードする遺伝子の 1つである E X T遺伝子および E X T遺伝子のフアミ リー遗伝子では、 それぞれ特異的に発現する部位が異なつ ている場合があるが、 これらも本明細書で言う植物細胞壁の Xyloglucan再 構成の必要な部位に含まれる。
本明細書で言う 「植物細胞壁の Xyloglucan再構成の時期」 とは、 上記の 植物細胞壁の Xyloglucan再構成を行う機能を有する酵素をコ一ドする遗伝 子が特異的に発現している時期を言い、 これら植物細胞壁の Xyloglucan再 構成を行う機能を有する酵素をコードする遺伝子が特異的に発現している Ρδり、 それらの発現している時期は本明細書で言う植物細胞壁の Xylogluc an再構成の時期に含まれる。
例えば、 同一植物においても、 植物細胞壁の Xyloglucan再樣成を行う機 能を有する酵素をコ一ドする遠伝子の 1つである E X T遺伝子および E X T遠伝子のファミ リー遺伝子では、 それぞれ特異的に発現する時期が異なつ て L、る場合があり、 これらも本明細書で言う植物細胞壁の Xyloglucan再構 成の時期に含まれる。
例えば、 培養細胞は、 対数增殖期には分裂細胞が多く、 細胞壁の合成お よび細胞壁の再構成が盛んである。 また、 定常期では、 細胞の伸長が盛ん であり、 このため細胞壁の再構成が必要である。 これらいずれの時期にも 細胞壁の再榱成が必要である。 本明細書の実施例 1 0に記載しているよう に、 タバコ由来 E X T遺伝子とタバコ由来 E X T遗伝子のファミ リー ¾伝 子である X R P遺伝子とでは、 培養細胞での発現のステージは全く異なつ ている。 つまりタバコ由来 E X T遺伝子は対数增殖期に特異的に強く発現 しており、 定常期では約 2 0分の 1になっている。 また、 タバコ由来 E X T¾伝子のファミ リー遺伝子である X R P遺伝子は、 定常期に特異的に強 く発現している。 このように、 同じ酵素活性を示す酵素が、 その酵素がコ 一ドする遺伝子のプロモーターにより、 特異的に発現する時期が制御され ている。 この様な場合の対数増殖期または定常期も本明細書で言う植物細 胞の Xyloglucan再構成の時期に含まれる。
本明細書で言う 「機能的同等物」 とは、 以下のものをいう。
天然に存在するタンパク質にはそれをコードする遺伝子の多型や変異の 他に、 生成後のタンパク質の生体内および精製中の修飾反応などによって、 そのアミノ酸配列中にアミノ酸の欠失、 挿入、 付加、 置換等の変異が起こ りうるが、 それにも関わらず変異を有しないタンパク質と実質的に同等の 生理、 生物学的活性を示すものがあることが知られている。 このように構 造的に差異があっても、 その機能については大きな違いが認められないも のを機能的同等物と呼ぶ。
人為的にタンパク質のアミノ酸配列に上記のような変異を導入した場合 でも同様であり、 この場合はさらに多種多様の変異体を作製することが可 能であるが、 変異を有しないものと実質的に同等の生理活性を示す限り、 これらの変異体は機能的同等物と解釈される。
例えば、 ィー · コリで発現されたタンパク質の N末端に存在するメチォ ニン残基は、 多くの場合、 メチォニンアミノぺプチダーゼの作用により除 去されるとされているが、 タンパク質の種類によってはメチォニン残基を 持つもの、 持たないものの両方が生成される。 しかしながら、 このメチォ ニン残基の有無はタンパク質の活性に影響を与えない場合が多い。 また、 ヒ トインターロイキン 2 ( I L— 2 ) のアミノ酸配列中の、 あるシスティ ン残基をセリンに置換したポリペプチドがインターロイキン 2活性を保持 することが知られている [サイエンス、 第 2 2 4卷、 第 1 4 3 1頁 （1 9 8 4 ) ]
さらに、 遺伝子工学的にタンパク質の生産を行う際には、 融合タンパク 質として発現させることがしばしば行われる。 例えば、 目的のタンパク質 の発現量を增加させるために、 目的のタンパク質の N末端に他のタンパク 質由来の N末端ペプチド鎖を付加したり、 目的のタンパク質の N末端、 あ るいは C末端に適当なぺプチド鎖を付加して発現させ、 この付加したぺプ チド鎖に親和性を持つ担体を使用することにより、 目的のタンパク質の精 製を容易にすることなどが行われている。
また、 遠伝子上でアミノ酸を指定するコ ドン （3つの塩基の組合せ） は、 アミノ酸の種類ごとに 1〜6種類ずつが存在することが知られている。 従つ て、 アミノ酸配列をコードする遺伝子はそのアミノ酸配列にもよるカ^ 多 数存在することができる。 遺伝子は自然界において決して安定に存在して いるものではなく、 その核酸に変異が起こることはまれではない。 遗伝子 上に起こった変異がコードされるァミノ酸配列には変化を与えない場合 (サイレント変異と呼ばれる） もあり、 この場合には同じアミノ酸配列を コードする異なる遺伝子が生じたと言える。 従って、 ある特定のアミノ酸 配列をコードする遺伝子が単離されても、 それを含有する生物が継代され ていくうちに同じアミノ酸配列をコードする多種類の遠伝子ができていく 可能性は否定できない。
さらに、 同じアミノ酸配列をコードする多種類の遗伝子を人為的に作製 することは、 種々の遗伝子工学的手法を用いれば困難なことではない。 例えば、 遺伝子工学的なタンパク質生産において、 目的のタンパク質を コードする本来の *伝子上で使用されているコ ドンが、 使用している宿主 中では使用頻度の低いものであった場合、 タンパク質の発現量が低いこと がある。 このような場合には、 コードされているアミノ酸配列に変化を与 えることなく、 コ ドンを宿主で繁用されているものに人為的に変換するこ とにより、 目的のタンパク質の高発現を図ることが行われている。 このよ うに特定のァミノ酸配列をコードする遗伝子を、 人為的に多種類作製する ことが可能なことは言うまでもない。 従って、 これらの人為的に作製され た異なるポリぺブチドであつても、 本発明に開示された塩基配列から推測 されるアミノ酸配列がコードされている限り、 本発明に包含されるもので あ 。
さらに、 目的のタンパク質のァミノ酸配列に 1個もしくは複数個のァミ ノ酸残基を欠失、 付加、 挿入、 もしくは置換の少なくとも 1つを行ったポ リベプチドも目的のタンパク質と機能的に同等の活性を有する場合が少な くないが、 このようなポリべプチドをコ一ドする遺伝子も、 天然由来の単 離されたものであれ人為的に作製されたものであれ、 本発明の機能的同等 物に包含される。
一般に、 機能的同等物は、 それをコードする遺伝子が相同性を有するこ とが多い。 従って、 本発明に用いる E X T遗伝子とハイブリダィズし、 同 様の機能を有するポリべプチドをコ一ドする遺伝子も本発明で言う機能的 同等物に含まれる。
本明細害で言う 「有用遠伝子」 には、 植物または植物細胞、 あるいは該 植物細胞から再生されたトランスジュニック植物にお t、て発現可能なタン パク質をコードする遺伝子、 植物または植物細胞、 あるいは該植物細胞か ら再生されたトランスジヱニック植物由来の遗伝子のアンチセンス R N A、 植物または植物細胞、 あるいは該植物細胞から再生されたトランスジ Xニッ ク植物由来の転写因子の結合タンパク質をコードする逮伝子あるいは転写 因子の結合部位の配列または類似の配列を持つデコイ、 植物または植物細 胞、 あるいは該植物細胞から再生されたトランスジュニック植物由来の m R N Aを切断するリボザィムが挙げられる。
植物または植物細胞、 あるいは該植物細胞から再生されたトランスジェ ニック植物において発現可能なタンパク質をコードする遺伝子としては植 物由来のものが挙げられるが、 本発明においてこれは限定されるものでは なく、 植物または植物細胞、 あるいは該植物細胞から再生されたトランス ジ Xニック植物において発現可能であれば、 細菌類、 酵母類、 放線菌類、 糸状菌類、 子蠹菌類、 担子菌類等の微生物由来のもの、 あるいは動物等の 生物由来のものも本明細書で言う有用遺伝子に含まれる。
本明細書で言う 「デコイ」 とは、 植物または植物細胞、 あるいは該植物 細胞から再生されたトランスジュニック植物由来の転写因子の結合タンパ ク質をコードする遗伝子あるいは転写因子の結合部位の配列または類似の 配列を持つ D N Aを示し、 これらを 「おとり」 として細胞内に導入するこ とで転写因子の作用を抑制するものを言う。
本明細書で言う 「リボザィム」 とは、 特定のタンパク質の m R N Aを切 断するものを言い、 これら特定のタンパク質の翻訳を阻害するものを言う。 リボザィムは特定のタンパク質をコードする遺伝子配列より設計可能であ り、 ハンマーへッ ド型リボザィム、 ヘアピン型リボザィ厶、 デルタ型リボ ザィムなどのリボザィムの種類に拘わらず、 特定のタンパク質の m R N A を切断するもので、 これら特定のタンパク質の翻訳を阻害するものであれ ば本明細害で言うリボザィ厶に含まれる。 本発明において用いられる植物は、 植物細胞壁の Xyoglucan再構成を行 う機能を有する酵素を持つ植物であれば、 いかなるものでもよく、 例えば、 双子葉植物であれば、 ァズキ、 ダイズ、 シロイヌナズナ、 トマト、 ジャガ ィモ、 アブラナ、 ヒマヮリ、 ヮタ、 タバコ等が、 また単子葉植物であれば、 コムギ、 イネ、 トウモロコシ、 サトウキビ等が挙げられ、 特に組織特異的 に発現する E XTおよび E XT類似酵素を有する植物を用いることができ る。
E XT遗伝子は、 植物のハウスキーピング遺伝子であることから、 多く のフアミ リー遗伝子が存在する。 これらのファミ リー遺伝子のプロモータ 一領域を含む DN A断片は、 シユード遺伝子 （偽遺伝子） を含めた多くの ファミ リー遺伝子の存在、 さらには E XT遺伝子およびそのファミ リー遗 伝子より上流の領域を含む断片を持つファージを作製し、 宿主菌に感染さ せた際に得られるプラークのプラーク形成能が低下し、 従来知られている プラークハイプリダイゼーシヨン法では、 E XT遺伝子のプロモーターを クローニングすることは容易ではない。 しかしながら、 この 2つの困難点 を克服することにより、 双子葉植物だけでなく単子葉植物も含め、 どのよ うな植物からでも、 EXT遺伝子およびそのファミ リー遺伝子の cDNA をプローブに用い、 ゲノム DNAをターゲッ トとしてハイブリダィゼーシ; ンを行うことにより、 また、 PCR法を詳細に検討を行うことにより、 単 離することができる。
プローブとしては、 ターゲッ 卜と異なる植物の EXT逮伝子およびその ファミ リー遗伝子の cDN Aを用いることもできるが、 より効率の良いハ イブリダィゼーシヨンを行うために、 ターゲッ 卜と同種の植物の cDN A をブローブにすることが望ましい。 EXT遠伝子 c DNAについて本発明 者らは、 これまでに、 ァズキ （Vigna angularis) 、 ダイズ （Glycine max) 、 シロィヌナズナ (Arabidopsis thaliana) 、 卜マ卜
(Lycopersicon esculentum) 、 小麦 (Triticum aestivum) 、 タノ、'コ (Nicotiana tabacum) イネ (Oryza sativa) 、 卜ゥモロコシ (Zea mays) より単離しており、 そのうち、 ァズキ、 ダイズ、 シロイヌナズナ、 トマト、 小麦の全長もしくは一部の塩基配列およびイネの制限酵素地図、 トウモロコシの制限酵素地図は、 欧州特許公開第 0562836号 A 1公 報 （1993) に記載しており、 タバコの塩基配列の一部は特開平 7— 7 9778号公報に記載されている。 また、 イネおよびトウモロコシの一部 の塩基配列は、 それぞれ配列表の配列番号 9と配列番号 10に示す。
ファミ リー遗伝子の cDNAは、 EXT遺伝子cDNAの全長、 または —部をプローブとして用いることによつても単離することができる。 例え ば、 上記の全ての E XT遺伝子 c DNAとノウゼンハレン （Tropaeolum majus) のキシログルカナーゼ遗伝子 [ザ .プラント . ジャーナル、 第 3 卷、 第 701〜711頁 （1993) ] の間で保存されている配列をプロ ーブとして用いることにより、 広い範囲の植物から効率よく該ファミ リー 遺伝子の cDNAを単離することができる。 また、 保存されている領域を もとに、 ブライマーを合成して P CRを行う [Consensus PCR :モレキ: ラー .アンド ··セルラー ·バイオロジー （Molecular and Cellular
Biology) 、 第 13巻、 第 4745頁〜 4752頁 （1993) ] ことに よっても、 広い範囲の植物から効率よく該ファミ リー遺伝子の cDNAを 単離することができる。 以下、 ァズキを例として本発明を具体的に説明する。
ァズキの種子 （渡辺種子社製） を用いて、 欧州特許公開第 056283 6号 A1公報 （1993) に記載の方法により調製した cDNAライブラ リーより、 E XT遺伝子のファミ リー遺伝子を組込んだクローン体を検索 することができる。 cDNAライブラリ一は、 例えば、 ァズキより RNA を調製し、 オリゴテックス一 dT30 (日本ロシュ社製） を用いてポリ (A) +RNAの精製を行い、 次に、 例えば、 該ポリ （A) +RNAと、 オリゴ dTブライマーを用い、 逆転写酵素を作用させ、 cDNAを合成す る。 該 cDNAより cDNA合成キッ トシステムプラス （アマシャム社製） を用いて c DN Aライブラリーを調製することができる。 この c DNAラ ィブラリーを用いて、 E XT遺伝子 cDN Aをブローブにしてプラークハ イブリダィゼ一シヨンを行うことにより、 例えば、 5x 104個のブラー クより 96個の陽性プラークが得られる。 これらのプラークをブレートラ ィゼート法 [モレキュラー · クローニング ·ァ · ラボラ トリー 'マ二ユア ル （Molecular Cloning A Laboratory Manual) 、 第 2版、 第 2章、 第 6 0〜66頁、 T. マニアテイス （T. Maniatis) ら著、 コールドスブリン グノヽ一 · ノくーラボラ 卜 リー (Cold Spring Harbor Laboratory) 、 19 89年発行] を用いてアンプリファイし、 これを用いてドッ トハイブリダ ィゼーションを行い、 シグナルの強弱で分類することができる。
ァズキの E XT遺伝子とは異なるシグナル強度を示す 2種のプラークよ りファージを単離し、 挿入されている DNAを抽出する。 これらの DNA を制限酵素 EcoB I (宝酒造社製） により切断し、 ァガロースゲル電気泳動 により DNA断片の長さを確認する。 確認された約 730 b p、 430 b pおよび 109 Obpの DNA断片を精製し、 pUC18 (宝酒造社製） の EcoE Iサイ 卜にサブクローニングし、 該プラスミ ドをそれぞれ pVX4 4一 1、 p VX44-2. p VX45— 1と命名した。 また、 このブラス ミ ドを用いてサンガー （Sanger) の方法に従い、 Bc aBESTTMダイデ ォキシ · シークェンシング ·キッ ト （宝酒造社製） を用いて DNA断片の 塩基配列を決定したところ、 EXT遺伝子 （ァズキ EXT) と相同性の高 I、遠伝子 2種がクローニングされた。 その塩基配列の一部を配列表の配列 番号 11および配列番号 12に示す （ァズキ E XT 2、 ァズキ EXT 3) £ また、 上記の cDNAライブラリーを用い、 上記の保存されている配列 の 1つ （配列番号 13) をプローブとしてプラークハイブリダィゼーショ ンを行うことにより、 例えば、 約 8 X 103個のプラークについて検索を 行った結果、 8個の陽性プラークが得られる。 該プラークのファージべク ターに挿入されている DNA断片を抽出して、 例えば、 EXT遺伝子およ びファミ リー遺伝子である BRU 1遺伝子 [ブラン ト · フィジオロジー、 第 104巻、 第 161〜 170頁 （1994) ] 、 me r i一 5遺伝子
[ザ，プラント ·セル、 第 3卷、 第 359〜 370頁 （1991) ] と相 同性の高い DNA断片 （約 1. 2kbp) を得ることができる。 該断片の DN A塩基配列の一部を配列表の配列番号 14 (ァズキ XRP1) に示す。 また、 例えば、 上記の cDNAライブラリーを用い、 上記の保存されて いる配列とオリゴ dTプライマーを用いて、 P CRを行うことができる。 この結果、 例えば、 ァズキ EXT、 ァズキ EXT2、 ァズキ EXT3およ びァズキ XRP 1とは異なるファミ リー遺伝子の DNA断片も得ることが できる。 該断片の DNA塩基配列の一部を配列表の配列番号 15に示す
(ァズキ XRP2)。
ァズキ以外の植物でも、 上記の保存されている配列の 1つ （配列番号 1 3) をブローブとしてプラークハイブリダィゼ一シヨンを行うことにより、 ファミ リー遺伝子の cDN Aを単離することができる。 例えば、 市販の夕 バコ cDNAライブラリーを用い、 保存されている配列 1つ （配列番号 1 3) をプローブとしてプラークハイブリダィゼーシヨンを行うことにより、 例えば、 約 3 X 10<個のプラークについて検索を行った結果、 30個の 陽性プラークが得られる。 該プラークのファージベクターに挿入されてい る DNA断片を抽出して、 例えば、 EXT遠伝子および BRU 1遺伝子 [プラント · フィジオロジー、 第 104巻、 第 161〜 170頁 （199 4) ] . me r i一 5遗伝子 [ザ 'プラント 'セル、 第 3卷、 第 359〜 370頁 （1991) ] と相同性の高い DN A断片 （約 1. 2 k b p) を 得ることができる。 該断片の DN A塩基配列の一部を配列表の配列番号 1 6に示す （タバコ XRP 1)。
次に、 例えば、 ァズキの葉より常法に従いゲノム DN Aを調製し、 制限 酵素 Sau3A Iを用いて部分分解し、 例えば、 部分分解物を； I GEM— 11 Xho I Half-Site Arms Cloning System (プロメガ社製） を用いてベクタ —ス GEM— 11にライゲーシヨンし、 インビトロパッケージングキッ ト
(ストラタジーン社製） によりパッケージングし、 これを宿主菌に感染す ることによりァズキのゲノム DN Aライブラリーを得ることができる。 こ のライブラリーを用いて、 例えば、 欧州特許公開第 0562836号 A 1 公報 （1993) に記載の EXT遺伝子 cDNAをプローブにしてハイブ リダイゼーションを行うことにより、 この遺伝子のプロモーター領域を含 む DN A断片を持つファージを検索できる。 例えば、 lxl 05のブラー クより 10個の陽性プラークが得られ、 該プラークのファージベクターに 挿入されている DN A断片を抽出して、 平均約 15kbpの長さの DNA 断片を得ることができる。 これらの断片を用いて、 EXT遠伝子 cDNA を含む DNA断片をプローブとしてサザンハイプリダイゼーシヨンを行つ た後、 目的の断片をブラスミ ドベクターにサブクローニングして、 部分的 に塩基配列の解析を行うことができる。 その結果、 例えば、 全てのブラー クのファージベクターに挿入されている DN A断片が E XT遺伝子と類似 の 列を有することが分かる。
これらのことから、 EXT遗伝子およびそのファミ リー遺伝子のブロモ 一ターを含む領域のクローニングは容易に行うことができると考えられる が、 実際には、 下記の 2つの問題にぶっかり、 従来知られているプラーク ハイプリダイゼーション法では E XT遺伝子のプロモーターのクローニン グすることはできなかった。
1つ目の問題点は、 シユード遗伝子を含めた、 通常のハイブリダィゼー ションでは容易に区別できない多くのファミ リ一遺伝子の存在である。 そ のために、 目的の c DN Aクローンの真のカウンターパートであるゲノム DN Aクローンをクローニングするには、 カウンターパートである可能性 のあるゲノム DN Aクローンを一旦粗くスクリーニングした後、 各ゲノム DNAクローン全ての塩基配列を解析し明らかにするか、 または、 多くの ファミ リ一遗伝子を c DNAから解析し、 ファミ リ一遺伝子内の個々の遠 伝子を区別できる塩基配列を見つけだし、 その塩基配列特異的オリゴプロ ーブ （S SOP) を用いてハイプリダイゼーションを行うことによりゲノ ム DN Aクローンを特定する必要がある。
2つ目の問題点は、 EXT遺伝子およびそのファミ リー遗伝子のプロモ 一ター領域を含む DN A断片を宿主菌に導入したときに引き起こされる強 ぃ增殖抑制作用やファージを宿主菌 （ィー · コリ） に感染させた際に起こ るプラーク形成能の低下である。 実際、 上記のように特定された EXT遗 伝子のプロモーターを含むファージは、 通常のファージに比べて、 その形 成するプラークが非常に小さく検索が困難である。 このような問題点は、 目的のプロモーター領域を単離するために試行錯誤を操り返す過程で初め て明らかになつたことであり、 クローニングを実際に行ってみるまでは全 く予想できないことである。
そこで、 本発明者らは、 上記の問題点を解決すべく鋭意研究を行った結 果、 改良された PCR法も含め、 種々の遺伝子工学の手法を駆使し、 問題 点を 1つ 1つ地道に解決することによって、 初めて E XT遗伝子のプロモ 一ターを含む領域をクローニングすることに成功した。
以下、 EXT¾伝子およびそのファミ リ一遗伝子を総称して、 EXTファ ミ リ一遺伝子群として説明する。
[プロモーターのクローニング]
上記したプラークの形成能の阻害の影響がある場合、 全体のゲノム D N Aライブラリーから何回ものスクリーニングをしても、 E XT遺伝子のプ 口モータ一領域をクローニングできる可能性はない。 そこで、 阻害の起き にくいように短いゲノム断片にすることにより、 阻害の影響を小さく して クローニングすることが考えられる。 そのため、 まず、 さまざまな制限酵 紫でゲノム DNAを完全分解した後、 ゲノムサザンハイプリダイゼーショ ンを行い、 目的の EXT遗伝子のプロモーター領域がどの制限酵素サイ ト を末端に持つどの大きさの DN A断片に含まれるかどうかを予測する必要 がある。
このことにより決定された制限酵素で完全分解した後、 決定された D N A断片の大きさを平均とし、 周辺の DNA断片をァガロースゲルから回収 して、 このサイズに限定された部分的なゲノム DNAライブラリーを作成 することができる。
この結果、 もとの全体のゲノム DNAライブラリーより約 10倍以上も 濃縮された部分的ゲノム DNAライブラリーを得ることができる。 例えば、 ァズキの葉より常法に従いゲノム DN Aを調製し、 例えば、 制限酵素 BamH I、 EcoR I、 Hind III (全て宝酒造社製） で消化し、 上記の E XT遺伝子 c DNAをブローブにして、 ゲノムサザンハイブリダィゼーションを行う と、 2、 3本のバンドが見られ、 BamH I消化で 15 k b p以上、 EcoB I消 化で約 8. 5 k b p Hind III消化で約 8 · 5 k b p、 EcoR I -Hind III の 2重消化で約 5. 5 k b pのバンドのシグナルが最も強いことが確認で きる。
これらのうち、 EcoR I— Hind IIIの 2重消化で確認できた約 5. 5 k b pのバンドをァガロースゲルから回収して、 例えば、 λΕΧ Ι οχ (ノバ ジェン社製） の EcoE I、 Hind IIIサイ 卜にライゲーシヨンし、 インビトロ パッケージング.キッ ト （ストラタジーン社製） によりパッケージングし、 これを宿主菌に感染することにより、 EcoR I、 Hind IIIサイ 卜を両端に持 つ約 5. 5 k b ρの DNA断片を平均としたサイズで、 全体のゲノム DN Aライブラリーより濃縮された部分的ゲノム DN Aライブラリーを得るこ とができる。 これを、 上記と同様に、 EXT遺伝子 cDNAをプローブに してハイプリダイゼーションを行うことにより、 この遺伝子のプロモータ 一領域を含む D N A断片を持つファージをより効率よく検索できる。 例え ば、 1. 3 X 105のプラークより 8個の陽性プラークが得られ、 EXT 遺伝子以外のファミ リー遺伝子 cDNAと相同性の低い 5' ノンコード領 域をもとに合成したオリゴヌクレオチド VAN— U7 (配列番号 17) を プローブにしてハイブリダィゼーシヨンを行うことにより、 例えば、 8個 の陽性プラークの内、 4個が EXT遗伝子 c DNAを含む DNA断片であ ることが分かる。 λΕΧ Ι οχは、 Ρ 1 C r e遗伝子を持つ宿主菌に感染 させることにより、 宿主内で自動的にクローニングされた領域が pUC型 ブラスミ ドに変換するォートマチックサブクローニングが可能であること から、 この DNA断片もォートマチックサブクローニングを行うことがで さる。
該断片の挿入されたブラスミ ドを用いて DNA配列解析を行い、 該断片 を EXT遗伝子 cDNAの配列と比較することにより、 該断片が、 EXT 遺伝子のプロモーターを含むかどうか判明する。 該断片の DN A塩基配列の一部を配列表の配列番号 18 (E XTのコー ド領域より上流部分） および配列番号 19 (該 DNA断片の下流部分） に 示す。
なお、 以下、 便宜上、 この EcoB Iサイ 卜より 5' 上流側をプロモーター 上流領域、 3' 下流側をプロモーター下流領域と呼ぶことにする。
該断片を組込んだプラスミ ドは、 PVXG 303と命名され、 pVXG 303で形質転換されたィー ' コリ J Ml 09株は、 Escherichia coli J M109ZpVXG303と命名、 表示され、 ブダペスト条約に基づき、 平成 7年 3 月 15曰 （原寄託曰） に、 曰本国茨城県つくば市東 1丁目 1番 3号の通商 産業省工業技術院生命工学工業技術研究所に受託番号 F E RM Β Ρ-δ 390の下に寄託されている。
プロモーター上流領域は、 上記で確認されたように、 約 8. 5 k b ρの Hind IIIの断片をクローニングすることによって得ることができる。 この ため、 上記と同様に、 ァズキゲノム DN Aを制限酵素 Hind IIIにて完全に 消化した後、 0. 7%ァガロースゲル罨気泳動にかけて分離、 回収する。 また、 λ ΖΑΡ Ι I (ストラタジーン社製） を制限酵素 Spe I (宝酒造社 製） で完全分解した後、 （！じ丁 と 丁丁 の存在下で i 1 1一 i n反 応を行うことにより h a I f f i l l - i nしたサイ 卜ができる。 これ に、 ァズキゲノム DNAの Hind ΙΠ断片 （平均約 8. 5 k b p) を同様に d ATPと dGTPの存在下で h a 1 f f i l l一 i nし、 ； I ZAP I Iの h a l f f i l l - i nしたサイ 卜にライゲーションを行い、 ゲノ ム DN Aライブラリーの作成を試みることができる。
しかしな力 ら、 この； I D N Aの大きさはファージとしてパッケージング されるための限界の大きさであり、 ライブラリーのタイターが上がらない ことが予想される。 事実、 このライブラリーのタイターは低く、 効率よく スクリーニングすることはできなかった。 また、 ；iDASHI I (ストラ タジーン社製） などの置換タイプのファージベクターを用いるには、 この サイズは小さ過ぎる。 事実、 ス DASH I Iの Hind IIIサイ 卜に回収し得 られたァズキゲノム DNAの Hind III断片 （平均約 8. 5 k b p) をライ ゲーションして得られたライブラリーのタイターも低く、 効率よくスクリ 一二ングすることはできなかった。
また、 ス GEM11 (プロメガ社製） を用いた全体のゲノム DNAライ ブラリーより、 E XT遺伝子 c DN Aをプローブにしたスクリ一二ングを 行うことしか方法がないが、 上述したように、 プラークの形成阻害の影響 があり、 さらに、 多くのファミ リー遺伝子が存在するため、 目的の E XT 遺伝子のプロモーターを含む断片を得ることができないことが予想される。 そこで、 プローブとして、 新たにクローニングしたゲノム断片を使用す ることにより、 c DN Aを用いた場合よりも目的のプロモーターを含む断 片により強くハイプリダイズすることが期待されるので、 このゲノム DN A断片をブローブに用いてプラークハイプリダイゼーションを行い、 でき るだけ多くのプラークをスクリーニングすることが望ましい。
このスクリーニングの結果、 例えば、 2x105個のプラークより 20 個の陽性シグナルが得られ、 これよりスクリーニングを進めて陽性クロー ンを単離することができるが、 目的のプロモーターを含む断片の挿入され ているファージベクターを基づきプラークはその大きさが非常に小さいた めに、 他のプラークの混入が少しでもあると、 混入したファージの増殖の ほうが早いために、 ファージ DNAの抽出を行う際、 ブレートライゼ一ト 法でも液体培養法でも混入したファージが增殖してしまい、 ほとんどが混 入したファージ由来の DN Aとなってしまう。
実際に、 スクリーニングを行うまでは、 これらのことは全く予期できな いことであった。 このため、 希釈した 1次ファージ液を疎にまいて何回か 2次スクリーニングを行う力、、 さらに 3次スクリーニングを行うと、 シグ ナルに対応するプラークを得ることができる。 3次スクリーニングにおい ても、 一見したところでは、 シグナルと認められるプラークの位置は対応 しないが、 注意深くプレートを観察してみると、 驚くべきことにシグナル に対応する位置に、 かろうじてその存在を認めることのできる、 他の陰性 プラークより非常に小さいプラークがあることが分かる。 こうして得られ た非常に小さいプラークを他のプラークが混入しないように慎重に扱うこ とにより、 このブラーク由来のファージのみを増殖させ、 ファージべクタ 一に挿入されている D N A断片を抽出し、 例えば、 約 1 1 k b pの長さの D N A断片を得ることができる。
また、 2次スクリーニングの際に上記の E X T遗伝子以外のファミ リー 遺伝子 c D N Aと相同性の低い 5 ' ノンコード領域をもとに合成したオリ ゴヌクレオチド V A N— U 7 (配列番号 1 7 ) をプローブにしたハイプリ ダイゼーションも同時に行うことにより、 多くのフアミ リー遠伝子群の中 から、 目的の E X T遗伝子を含むクローンが効率よく絞り込まれる。
該断片を適当な制限酵素、 例えば Hind III (宝酒造社製） で消化した後、 上記のァズキ E X T遺伝子ゲノム D N Aをブローブにして、 サザンハイブ リダィゼーションを行うことにより、 この遗伝子のプロモーター領域を含 むさらに短い D N A断片を特定することができる。 この断片をブラスミ ド の制限酵素部位に挿入し、 該断片の挿入されたブラスミ ドを用いて適当な 宿主に形質転換することができる。 また、 該断片の挿入されたプラスミ ド を用いて塩基配列解析を行い、 該断片を E X T遺伝子 c D N Aの配列と比 較することにより、 該断片が、 E X T遗伝子のプロモーターを含むかどう か判断することができる。 さらに、 該断片を用いて目的のプロモーター上 流領域を含む断片としてサブクローニングすることができる。 こうして得 られた Hind III、 EcoR Iを両端に持つサブクローニングされた D N A断片 は、 pUC 118 (宝酒造社製） の Hind III、 EcoR Iサイ 卜に組込み、 塩 基配列を決定できる。 該断片の制限酵素地図を図 1に示す。 この塩基配列 を配列表の配列番号 20に示す。
目的のプロモーター上流領域を含む該断片を pUC 118の Hind III、 EcoR Iサイ トに組込んだプラスミ ドは、 p VX P 101と命名され、 pV XP 101で形質転換されたィー ' コリ J Ml 09株は、 Escherichia coli JM109ノ pVXPlOlと命名、 表示され、 ブダぺスト条約に基づき、 平成 7年 2月 23日 （原寄託日） に、 日本国茨城県つくば市東 1丁目 1番 3号 の通商産業省工業技術院生命工学工業技術研究所に受託番号 FERM B P-5389の下に寄託されている。
上記の方法では、 必ずしも E XT遗伝子のプロモーター領域を含む DN A断片をクロ一ニングできるとは限らない。 それは、 例えば、 該断片が、 宿主菌などに致死的あるいは、 増殖抑制に働く場合などである。 実際、 上 記の E XT遺伝子のプロモーターを含むファージは、 通常のファージに比 ベて、 その形成するプラークが非常に小さく検索が難しく、 そのスクリー ニングは困難である。
そこで、 E XT遗伝子のプロモーター領域を含む DN A断片をクロ一二 ングする別の方法として、 PCR法が考えられる。
このような未知の配列を増幅する PCR法には、 インバース PCR [ザ プラント · ジャーナル、 第 7卷、 第 157頁〜 164頁 （1995) ] お よびカセッ トを用いた PCR [蛋白質核酸酵素、 第 35卷、 第 3157頁 〜3163頁 （1990) ] がある。
しかしながら、 従来のインバース P CRでは、 高等動植物のゲノム DN Aを铸型とした場合に、 約 1 k b pまでの長さの DN A鎖しか効率よく增 幅できない。 また、 カセッ トを用いた P CRでも同様に、 1 k b p以下の 大きさの断片しか効率よく増幅されない。
また、 ィンバース P CRではセルフライゲーションするための制限酵素 の選択が限られ、 確実に増幅断片を得るには 4 b p認識の制限酵素を使う しかなく、 カセッ トを用いた P CRでもさまざまな 6 b p認識の制限酵素 サイ トを持つ多くのカセッ トを試すことが必要があり、 多くの労力が必要 である。 さらに、 プロモーター領域のように ATリッチの偏った配列を含 む DNA断片では、 6 b p認識の制限酵素サイ トはおろか、 4 b p認識の 制限酵素サイ トも存在する確率が低く、 インバース P C Rでもカセッ トを 用いた P CRでも長いターゲッ ト DNAの増幅が必要となる。 そこで、 本 発明者らは、 インバース P C Rでセルフライゲーションの条件を検討する こと、 および T a K a R a LA P CR キッ ト （宝酒造社製） を用い ることにより、 従来短い DNA鎖しか増幅できなかったものを、 2 k b p 程度以上の長さの DNAでも効率よく増幅できるように改良できることを 見い出した。
また、 目的の DNA断片を効率よく増幅するには、 2段階の P CRが効 果的であり、 第 2回目の P C Rの時に铸型として用いる第 1回目の P C R の反応液は希釈して用いることがよいことを見い出し、 上記問題点を解決 することができた。
例えば、 ァズキの葉より調製したゲノム DNAを制限酵素 Hind IIIを用 いて完全に分解し、 これを T4 DNAリガーゼ （宝酒造社製） でセルフラ ィゲーシヨンする。 セルフライゲーシヨン反応が効率よく起きるかどうか は、 その反応系の容量に大きく依存する。 反応系の容量は、 DNA濃度が 4 g/m 1より小さくなるようにするほうが望ましい。 こうしてできた環状ゲノム DNAを铸型にして P CRを行う。 プライマ 一は、 例えば、 上記の p VXG 303の E XT遣伝子ゲノム DN Aの配列
(配列番号 18および配列番号 19) をもとに合成されたブライマー V A N-UH1 (配列番号 21) 、 ブライマー VAN— L (配列番号 22) 、 ブライマー VAN— UH 2 (配列番号 23) 、 プライマー V A N—： L 16
(配列番号 24) 、 プライマー VAN— UH3 (配列番号 25) 、 プライ マー VAN— L 3 (配列番号 26) の配列が用いられる。
目的の DN A断片を効率よく増幅するには、 2段階の PC Rが効果的で、 例えば、 プライマーとして、 上記のプライマー VAN— UH 1 (配列番号 21) およびプライマー VAN— L (配列番号 22) を用いて 1回目の P CRを行い、 この反応生成物を铸型としてのブライマー VAN— UH 2
(配列番号 23) およびプライマー VAN— L 3 (配列番号 26) を用い て PCRを行うことにより、 約 1. 8 k b pの DNA断片が増幅される。 しかしながら、 上記と同様に 1回目の P CRを行い、 この後ブライマー として、 ブライマー VAN— UH2 (配列番号 23) およびプライマー V AN-L 16 (配列番号 24) を用いる PCR、 またはプライマー VAN 一 UH3 (配列番号 25) およびプライマー VAN— L 3 (配列番号 26) を用いる PCRを行うと効率よく増幅しない。 つまり、 選択するプライマ 一によつて、 その增幅効率が異なる。 従って、 いくつかのプライマ一の組 み合わせを行って、 最適な組み合わせを探すことが望ましい。
PCR反応は、 TaKaRa LA PCR キッ ト （宝酒造社製） の プロトコールに従って行う。 但し、 反応の温度およびサイクル条件は、 9 4°C (0. 5分） 、 55。C (1. 0分） 、 72°C (2. 0分） 、 30サイ クルで 50 Iの反応液で 1回目の PC Rを行った後、 同じ条件で 2回目 の PCRを行う n また、 2回目の PCRの際、 1回目の PCRの反応液の 持ち込みの量は、 希釈したサンプルをいくつか作って検討することが望ま しい。
增幅された約 1. 8 k b pの産物は、 例えば、 PUC 119 (宝酒造社 製） の Hinc IIサイ 卜にサブクローニングできる。 該断片の両端の塩基配 列を先に部分的にクローニングした上記の E X T遺伝子ゲノム D N Aの配 列 （配列番号 18および配列番号 19) と比較することにより、 該断片が、 先の配列に連続した E XT遺伝子のプロモーターを含む DN A断片かどう か判明する。 該断片の制限酵素地図を図 2に示す。 また、 該断片の塩基配 列を配列表の配列番号 27に示す。 この PC R産物を組込んだブラスミ ド は p VXP— H3と命名され、 p VXP— H 3で形質転換されたィー · コ リ J Ml 09株は Escherichia coli JM109ZpVXP-H3と命名、 表示され、 ブダペスト条約に基づき、 平成 7年 2月 1ヮ 曰 （原寄託曰） に、 曰本国茨 城県つくば巿東 1丁目 1番 3号の通商産業省工業技術院生命工学工業技術 研究所に受託番号 FERM BP— 5388の下に寄託されている。
配列表の配列番号 18および配列番号 19と配列番号 27より、 EXT の N末端アミノ酸配列をコードする遗伝子より上流部分の塩基配列を、 配 列表の配列番号 1と配列番号 2に示す。
塩基配列の解析の結果、 配列表の配列番号 1と配列番号 2を比較すると、 両配列は、 配列番号 1の 782番目の A残基から下流および配列番号 2の A残基から下流の全領域で、 わずか 2つの相違を除いて、 全く同じ配列を 有している。 この 2つの相違は配列番号 1の 829番目の A残基から下流 および配列番号 2の 921番目の A残基から下流の連続する Aの数 （配列 番号 1で 16個、 配列番号 2で 14個） と、 配列番号 1の 947番目の T 残基と配列番号 2の 1037番目の C残基の相違だけである。 このことか ら、 この共通領域が、 植物細胞壁の Xyloglucan再榱成に必要な部位および 時期において特異的発現を調節する領域を含有していることが分かる。
E XT遗伝子のプロモーターを含む DN A断片のクローニングの方法と 同様にして、 これらの問題点を克服することにより、 ファミ リー遺伝子の プロモーター領域を含む DNA断片のクローニングもできる。 そして、 こ れらフアミ リー遗伝子のうち植物細胞壁の Xyloglucan再構成に必要な部位 および時期に特異的に発現することが確実に分かったものとの比較を行う ことにより、 植物体において組織特異的発現に必要な領域を同定すること ができる。 また、 同様にして培養細胞において対数増殖期に特に強く発現 するのに必要な領域も同定することができる。
[発現部位および発現時期の測定一ノーザンハイプリダイゼーション] プロモーターによる発現を解析するために、 例えば、 ァズキの EXT遺 伝子 c DNAをプローブに用いて、 ァズキの植物体での発現部位および発 現時期をノーザンハイブリダィゼーシヨンにより測定できる。 また、 例え ば、 タバコの EXT遺伝子 c DNAをプローブに用いて、 タバコ培養細胞 での発現時期をノーザンハイブリダイゼーションにより測定できる。
ァズキの EXT遠伝子 c DNAおよびタバコ EXT遺伝子 c DNAは、 例えば、 欧州特許公開第 0562836号 A 1公報 （1993) および特 開平 7— 79778号公報に記載された方法によってクローニングできる。 ァズキ植物体やタパコ培養細胞などの植物組織から RNAを抽出するに は、 例えば、 グァニジンチオシァネート法ゃフヱノール SDS法などが用 いられる。 このように抽出された total RNAは、 例えば、 ァガロースゲ ル鴛気泳動にて解析した後、 メ ンブランに転写し、 それを用いてハイプリ ダイゼーシヨンを行うことができる。 total RNA量は、 例えば、 ァガロ ースゲル電気泳動にて r RN Aの貴を比較することで、 同じ Jtを绸製でき、 発現している EXT遺伝子 mRN Aの量を正確に比較することができる。 例えば、 ァズキの播種後、 40曰目の植物体を用いて、 茎、 芽、 葉から それぞれグァニジンチオシァネート法を用いて、 total RNAを抽出して. ァガロースゲル電気泳動を行った後、 他のファミ リ一遺伝子の c DNAと は異なつた E X T遺伝子 c D N Aに特異的な配列を有する DN Aをプロ一 ブにしてノーザンハイプリダイゼーションを行うことができる。 この際、 ハイブリダィゼーシヨン後のフィルタ一は、 上記の EXT遺伝子 c DNA に特異的な配列を有するプローブが、 他のフアミ リー遺伝子の mRN Aと は対合を保てず、 ターゲッ 卜の EXT遺伝子の mRNAとのみ対合を保て る強さの条件で洗うことにより目的の E XT遺伝子の発現のみを検出する ことができる。 また、 このことは、 mRNAのサイズからも確認すること ができる。 このように E X T遗伝子の mR N Aの量を各植物組織で比較す ると、 いずれの部位でも発現しているが、 特に植物細胞壁の Xyloglucan再 樣成が行われている茎で強く発現していることが確認できる。 また、 ァズ キのモャシを用いて茎を 1 c m間隔で切断してそれぞれの部位から、 total RNAを抽出して、 ァガロースゲル電気泳動にて解析し E XT遗伝 子 c DNAをブローブとし、 ノーザンハイプリダイゼーションを行うこと ができる。 このようにすると、 茎の成長の著しい部分、 言い換えれば植物 細胞壁の Xyloglucan再構成が盛んである部位での発現が最も強いことが確 認できる。
各ファミ リー遠伝子についても、 上記と同様に、 それぞれのファミ リー 遗伝子の特異的なプローブを用いてノーザンハイプリダイゼーションする ことにより、 その発現部位をより明確に特定することができる。
タバコ BY2培養細胞 [ファーメンテーシヨン 'テクノロジー ' トウデ ィ （Formentation Technology Today) 、 第 689頁、 日本薛酵工学会、 1972年発行] の培養 1、 4、 6、 8、 10曰目の細胞を吸引濾過で回 収し、 直ちに液体窒素を用いて急速凍結した後、 RNAの抽出操作を行う まで一 80。Cに保存しておく。 これらの細胞からフエノール S D S法を用 いて、 total RNAを抽出して、 ァガロースゲル電気泳動にて解析し、 タ バコ E XT遗伝子 c DN Aに特異的な配列を有する DN Aをプローブにし てノーザンハイブリダィゼーションを行うことができる。 この発現を比較 するといずれの時期でも発現しているが、 特に対数増殖期 （4曰目） での 発現が著しいことが確認できる。 また、 ファミ リー遺伝子であるタバコ X RP1遺伝子は、 これとは逆に定常期に強く発現しており、 対数増殖期に はあまり強く発現していないことが確認できる。
[RT— PCRによる発現部位および時期の同定]
さらに、 簡便にこれら E XT遗伝子のファミ リー遺伝子群のプロモータ 一の制御する発現を解析するために、 RT (Reverse Transcriptase) ― P CR法を用いることができる。
例えば、 ァズキの播種後、 40曰目の植物体の葉、 茎、 芽、 根をそれぞ れ分けて採取した後、 液体窒素を用いて急速凍結し、 RNAの抽出操作を 行うまで一 80てに保存しておく。 この組織を用いて、 例えば、 グァニジ ンチオシァネート法を用いて、 total RNAを抽出する。 この total RN Aをこれを铸型にして、 TaKaRa RNA PCR K i t (宝酒造 社製） を用いて、 RT— PCRを行い、 発現部位の同定を行うことができ る。 この際、 P CR反応のブライマーとして、 それぞれのファミ リー遗伝 子に特異的な配列をブライマーとすることにより、 各ファミ リー遺伝子の プロモーターの制御する発現部位特異性を同定することができる。
例えば、 ァズキの播種後、 暗所で栽培し、 5曰目の植物体を用いて、 上 胚軸を 1 cmきざみに切断してそれぞれ分けて採取した後、 液体窒素を用 いて急速凍結し、 R N Aの抽出操作を行うまで一 80てに保存しておく。 この組織を用いて、 例えば、 グァニジンチオシァネート法を用いて、 total RNAを抽出し、 これを铸型にして、 TaKaRa RNA PC R K i t (宝酒造社製） を用いて、 RT— PC Rを行い発現部位、 時期 の特異性をさらに詳細に同定することができる。
例えば、 タバコ培養細胞を用いて、 培養 0、 1、 2、 4、 6、 8、 10 曰目の細胞を吸引濾過で回収し、 直ちに液体窒素を用いて急速凍結し、 R NAの抽出操作を行うまで一 80てに保存しておく。 この細胞からフエノ ール SD S法を用いて total RNAを抽出し、 これを铸型にして、
TaKaRa RNA PCR K i t (宝酒造社製） を用いて、 RT— PCRを行い、 発現部位の同定を行うことができる。 この際、 PCR反応 のブライマーとして、 タバコ E XT遺伝子とそのファミ リー遗伝子それぞ れに特異的な配列をブライマーとすることにより、 各ファミ リー遺伝子群 のプロモーターの制御する発現部位特異性を同定することができる。
[遺伝子直接導入と GUS活性測定一トランジユントアツセィ] 上記のプロモーターを含む配列の全長あるいは一部を切り出し、 各種レ ポーター遺伝子に接続しキメラ遺伝子を作製する。 このキメラ遺伝子を植 物細胞に直接導入する辜で、 プロモーターの活性を測定することができる。
レポーター遺伝子とは、 遗伝子のプロモーター活性あるいは他のシス · エレメン卜の働きを調べるために目的の遺伝子のプロモーター領域の下流 に結合させる遗伝子で、 キメラ遺伝子を入れる細胞が同一もしくは類似の 酵素活性を持っていないことが必要であるため、 主として、 ィー · コリ由 来の酵素遺伝子のコード領域を用いる。 植物の場合、 例えば、 レポーター遺伝子としては、 ィー ' コリ由来の G US、 クロラムフエニコールァセチルトランスフェラーゼ （CAT) 、 β ーガラク トシダーゼ （ 1 a c Ζ) 、 ネオマイシンホスホ トランスフエラー ゼ （NPT 1 1) 、 ルシフヱラーゼなどの遺伝子であるが、 最近特によく 用いられているのはィー · コリ由来の GU Sである。
G US活性は、 4ーメチルゥンベリフェリルダルクロニド （4一 MUG、 和光純薬社製） を基質としたとき、 その産物である 4—メチルゥンベリフエ ロン （4一 MU、 ナカライテスク社製） の発する特異的な蛍光によって定 量する。 4—MUは安定性が高いうえにバックグラウンドが低いので、 容 易に測定できる。 さらに基質として 5—ブロモ一4一クロロー 3—インド イル^ー D—グルクロニド [X— G l u c、 モレキュラー .プローブ
(Molecular Probes)社製] を用いると、 産物としてインジゴチンという 不溶性の藍色の色素ができるので、 この性質を利用して、 細胞内あるいは 組截内の G U S活性の局在を容易に調べることができる。
プロモーターの活性の比較のため、 例えば、 カリフラワーモザイクウイ ルスの 35 Sプロモーターを用いることができ、 これは p B I 121 (ク ロンテック社製） や pB I 221 (クロンテック社製） に含まれている。 レベルポーター遺伝子の下流に、 転写終止配列を連結させることによつ て、 転写を効率よく終了させることができる。 該転写終止配列は、 EXT 遺伝子に由来するものであってもよいし、 また、 他の遺伝子に由来するも のでもよい。 また、 ポリ A付加配列を挿入配列の下流に連結させることに よつて翻訳の効率を高めることができる。 該ポリ A付加配列は E X T遺伝 子に由来するものであってもよいし、 他の遺伝子、 例えば、 ァグロバクテ リゥムのォク トビンシンテターゼ [ジ♦ェンボ ' ジャーナル （The EMB0 Journal) 、 第 3卷、 第 835〜 846頁 （1984) ] やノバリ ンシン テターゼ [ジャーナル ·ォブ ·モレキュラー 'アンド ·アプライ ド ' ジェ ネティクス (Journal of Molecular and Applied Genetics) 、 1 ヽ 第 561〜 573頁 （1982) ] に由来するものであってもよい。 これ らのキメラ遺伝子カセッ トは、 生物体に直接導入するために、 適当なべク ターに挿入し、 ブラスミ ドとしてィー · コリで增やすこともできる。
このキメラ遺伝子を含むベクターを生物体に導入する方法としては、 例 えば、 マイクロインジェクション法 [モレキュラー 'アンド ' ジェネラル ジヱネテイクス （Molecular & General Genetics) 、 第 202巻、 第 1 79〜； L 85頁 （1986) ] 、 ポリエチレンダリコール法 [ネイチヤー
(Nature) 、 第 296卷、 第 72〜 74頁 （1982) ] 、 パーティクル ガン法 [ネイチヤー、 第 327巻、 第 70〜73頁 （1987) ] や、 力 セッ ト DNAもしくは RNAを含有する小細胞、 細胞、 リソソーム等とプ ロトブラス卜との融合法 [プロシーディングズ 'ォブ 'ザ 'ナショナル ' アカデミー ·ォブ ·ザ ·サイエンシーズ ·ォブ ·ザ · US A
(Proceedings of the National Academy of Sciences of the USA) 、 第 79卷、 第 1859〜 1863頁 （1982) ] 、 エレク ト口ポレーショ ン法 [プロシーディングズ 'ォブ ·ザ ·ナショナル'アカデミー ·ォブ · ザ ·サイエンシーズ *ォブ ·ザ ' USA 第 82巻、 第 5824〜 582 8頁 （1985) ] 等の方法を挙げることができる。
これらの方法で導入された遗伝子は、 始めの数日間、 細胞内で一時的に 転写発現することを利用して、 導入後 1〜2曰培養した細胞の抽出液を用 いて抽出液中の発現産物を解析するトランジユントアツセィが可能である。 例えば、 ィー · コリで增やすことのできるブラスミ ドベクターとして、 カリフラワーモザイクウィルスの 35Sプロモーター、 ィー * コリ由来の GUS遺伝子、 ノパリンシンテターゼに由来する転写終止配列カセッ トを 持つ pB I 221 (クロンテック社製） を用いることができる。 このブラ スミ ドのカリフラワーモザイクウィルスの 35 Sプロモーター領域を除く ために、 このプラスミ ドを制限酵素 Hind IIIおよび Xba I (宝酒造社製） で消化した後、 ァガロースゲル電気泳動により 35 Sプロモーター領域以 外の目的のフラグメントを切り出し精製して、 このサイ 卜に E XT遺伝子 のプロモーター領域を含む DN A断片を導入することができる。
こうして作られた EXT遺伝子のプロモーター領域を含む DNA断片と GUS遗伝子のキメラ遗伝子を含むベクターを、 例えば、 エレク トロポレ ーシヨン法を用いてタバコ BY 2培養細胞に導入することができる。
エレク 卜ロボレ一シヨン法を用いてタバコ BY 2培養細胞に導入するた めに、 タバコ BY2培養細胞を、 例えば、 1 %セルラーゼ ·オノズカ R S (ヤクルト本社製） 、 0. 1%ぺク トリアーゼ Y 23 (盛進製薬社製） 、 0. 4Mマンニトールを含む酵素液 （pH5. 5) を用いて 30°Cで 2時 間処理することにより、 細胞壁の除いたプロ トプラス卜にすることができ る。 得られた 2 X 106個のタバコ BY 2培養細胞プロトブラストを、 ェ レク トロボレーション緩衝液 （7 OmMKC 1、 5mMME S、 0. 3M マンニトール） に懸濁し、 ベクター DNA3pmo 1と 10%PEG60 00 エレク トロポレーション緩衝液を加えて混合し、 例えば、 ジーンパ ルザ一 I I (バイオ ·ラッ ド社製） を用いて、 電気パルス （300 V、 1 25/zF) を与え、 植物細胞内に DN Aを導入する。 導入後 1〜2曰、 例 えば、 オーキシンとして 0. 2mgZl 2, 4— D、 1%シユークロー ス、 0. 4Mマンニトールを含むリンスマイヤー ·スクーグ培地 [フイジ ォロジァ ·ブランタルム、 第 18卷、 第 100頁 （1965) ] で、 26 °Cで培養した細胞の抽出液を用いて抽出液中の発現産物である G U Sを蛍 光法で解析することができる。 つまり、 回収した細胞に抽出緩衝液 [50 mMリ ン酸緩衝液 （pH7. 0) 、 1 OmMEDTA. 0. 1%ト リ トン (Triton) X— 100、 0. 1%サルコシル （Sarkosyl) 、 10mM2 - メルカプトエタノール] 200 Iを加えて、 エツペンチューブに移し超 音波破砕し、 遠心分離後の上清を GU S活性測定およびタンパク量の測定 に用いることで G USの比活性を測定できる。
GUS活性測定は、 例えば、 4一 MUGを基質とした時、 その産物であ る 4一 MUの発する特異的な蛍光 （励起波長 365 nm、 蛍光波長 455 nm) によって定量する。 つまり、 抽出液 30 1を蛍光用の 96穴マイ クロタイタープレートにとり、 これに抽出緩衝液 45 / 1と 4mM4—M UG 25 1を加えて反応させる。 5、 35、 95分後に、 反応停止液 (lMNa2C03) 50 1を加えて反応を停止する。 そして、 蛍光ブレ 一卜リーダーで 4一 MUの発する特異的な蛍光 （励起波長 365 nm、 蛍 光波長 455 nm) を測定することにより、 4一 MU Gを基質とした時の 産物である 4一 MUを定量する。
また、 タンパク量の測定は、 例えば、 抽出液の 1Z5希釈液および 80 0 u g/m 1 B S A標準液 （抽出緩衝液 20/i lに ImgZml BSA 80 /21を加える） の 2、 5、 10、 15、 20、 30 1を 96穴マイ クロタイタープレートにとり、 それぞれに全 i 200 1になるように蒸 留水 158、 155、 150、 145、 140、 130 1とバイオラッ ド ·ブロティン ·アツセィ ·キッ ト定量試薬 （バイオ ·ラッ ド社製） 40 1を加え、 静かに援拌した。 次に、 室温で 20分間放置し、 その後 60 分以内にブレートリーダー （波長 590 nm) で測定することにより、 タ ンパク量を定量する。 上記測定の際に、 同時に 4一 MU標準液の蛍光強度 を測定し、 その結果を、 横軸に 4一 MU量 （pmo 1 ) 、 縦軸に蛍光強度 としてグラフにプロッ トした後、 その傾きを求めることにより、 1蛍光強 度当たりの 4一 MU量を求め、 さらに、 試料で行った結果を、 横軸に時間 (分） 、 縦軸に蛍光強度としてグラフにプロッ 卜し、 蛍光強度の增加速度 を求めることにより、 4一 MU Gの分解速度 = G U S活性を求めることが できる。 さらに、 タンパク量より、 G U Sの比活性を求めることができる c これにより、 この E X T遺伝子のプロモーター領域を含む D N A断片は、 植物内で強い発現を示すと言われるカリフラワーモザイクウイルスの 3 δ Sプロモーターよりも強い活性を示すことが確認できる。
[形質転換植物]
上述のように作られた E X T遺伝子のプロモーター領域を含む D N Α断 片と G U S遗伝子のキメラ遗伝子を挿入したベクターを植物または植物細 胞に導入し形質転換体を作ることができる。
キメラ遗伝子を挿入するベクターは、 形質転換された植物または植物細 胞を容易に:！別できるように選別マーカー遺伝子を含有することが望まし い。 選別マーカー遗伝子としては、 例えば、 抗生物質耐性の形質をもたら す遗伝子 （抗生物質耐性遺伝子） を用いることができる。 このような遺伝 子として、 例えば G 4 1 8、 ハイグロマイシン、 ブレオマイシン、 カナマ イシン、 ゲンタマイシン、 クロラムフエ二コールに対する耐性をもたらす 遺伝子を挙げることができる。 抗生物質耐性遗伝子がベクターに含有され ていれば、 抗生物質を含む培地中で生育する植物または植物細胞を選ぶこ とによって形質転換された植物または植物細胞、 すなわちこれらのカセッ 卜が導入された植物または植物細胞を容易に選択することができる。
キメラ遺伝子を挿入したベクターを直接植物に導入する方法は、 マイク 口インジヱクション法、 ボリエチレングリコール法、 パーテイクルガン法、 ベクターを含有する小細胞、 細胞、 リソソーム等とプロ トプラストとの触 合法、 エレク トロポレーション法等の方法を挙げることができる。
また、 植物ウィルスをべクタ一として用いることによって、 キメラ遗伝 子を植物に導入することができる。 利用する植物ウィルスとしては、 例え ば、 カリフラワーモザイクウィルスを用いることができる。 すなわち、 ま ずウィルスゲノムを、 一旦、 ィー · コリ等由来のベクターに挿入して組換 体を調製した後、 ウィルスのゲノム中にこれらのカセッ トを挿入する。 こ のようにして修飾されたウィルスゲノムを制限酵素により該組換体から切 り出し、 植物に接種することによって、 これらのカセッ トを植物に挿入す ることができる [モレキュラー ·バイオロジー ·ォブ 'プラント 'チュー モアーズ （Molecular Biology of Plant Tumors) 、 第 5 4 9〜 5 6 0頁、 アカデミ ック ·プレス （Academic Press) 、 1 9 8 2発行、 米国特許第 4 , 4 0 7 , 9 5 6号] 。
さらにまた、 ァグロパクテリゥム厲に属する細菌が植物に感染すると、 それが持っているブラスミ ド D N Aの一部を植物のゲノム中に移行させる という性質を利用して、 これらのカセッ トを植物に導入することもできる。 ァグロパクテリゥム厲に厲する細菌のうちァグロパクテリゥム ·チュメ ファンエンスは植物に感染してえい瘤 （crown gall) を、 また、 ァグロバ クテリウム * リゾゲネスは植物に感染して毛状根 （hairy root) を引起こ すが、 これらは感染の際に T iブラスミ ドまたは R iブラスミ ドと呼ばれ るそれぞれの細菌中に存在するブラスミ ド上の T一 D N A領域
(Transferred D N A ) と呼ばれる領域が植物中に移行し植物のゲノム中 に組込まれることに起因する。 さらに、 T iブラスミ ドまたは R iブラス ミ ド上には T一 D N A領域が植物中に移行し、 植物のゲノム中に組込まれ るために必須である V i r領域と言われる領域がある。 V i r領域自身は、 植物中に移行されることはなく、 また、 この V i r領域は T一 D N A領域 が存在するのと異なったプラスミ ド上にあっても機能しうる [ネイチヤー- 第 303卷、 第 179〜 189頁 （1983) ] 。
T iブラスミ ドまたは R iブラスミ ド上の T— DNA領域中に、 植物の ゲノム中に組込みたい DNAを挿入しておけば、 ァグロパクテリゥム属の 細菌が植物に感染する際に目的とする DNAを植物ゲノム中に組込むこと ができる。 ここで、 T iブラスミ ドまたは R iブラスミ ドの T— DMA中 のえい瘤または毛状根を引起こす部分を、 目的とする移行機能を損なうこ となく取り除き、 得られたものをベクターとして使用することもできる。 本発明においてはこの様な種々のベクターを用いることができ、 例えば、 バイナリ一ベクターと呼ばれる pB 1121 (クロンテック社） を用いて、 PB I 121のカリフラワーモザイクウィルスの 35 Sプロモータ一に連 結された G US遺伝子部位を、 E XT遺伝子のプロモーター領域を含む D N A断片と G US遗伝子とのキメラ遺伝子に置換したものを作製し、 該キ メラ遺伝子を植物へ導入することができる。 このとき、 ネガティブコント ロールとしてプロモーターのない GU S遺伝子を持つもの （pB I 101、 クロンテック社製） 、 pB I 121 (クロンテック社製） 等を同時に用い ることにより、 力リフラワーモザイクウィルスの 35 Sプロモーターの発 現様式と比較することができる。 なお、 これらのベクターは、 上記の
V i r領域を有しておらず、 該ベクターを導入して用いるァグロパクテリ ゥム厲の細菌は、 V i r領域を有している他のブラスミ ドを含有している 必要がある。
また、 これらのベクターはァグロパクテリゥム厲の細菌だけではなく、 ィー · コリ中でも增幅することができるシャ トルベクターである。 従って、 T iブラスミ ドの組換え操作は、 ィー · コリを用いて行うことができる。 さらに、 これらのベクターは、 抗生物質耐性遗伝子を含んでおり、 ィー · コリ、 ァグロパクテリゥム属の細菌および植物等を形質転換する際に、 形 質転換体を容易に選別することができる。
形質転換を行う際には、 ァグロバクテリウム属の細菌が感染しうるもの でその再生系が確立されている植物であれば、 どの様な植物でも形質転換 を行うことができる。 ほとんどの双子葉植物は、 ァグロパクテリゥム厲の 細菌を用いて形質転換を行うことができ、 特に自然界でァグロパクテリゥ ム厲の細菌の宿主となっている植物は、 すべて試験管内で形質転換させる ことができる。 穀類を含め、 単子葉植物は自然界ではァグロパクテリゥム 属の細菌の宿主ではないが、 例えばライムギ [ネィチヤ一、 第 325巻、 第 274〜 276頁 （1987) ] 、 トウモロコシ [サイエンス、 第 24 0卷、 第 204〜 207頁 （1988) ] 、 イネ [ネィチヤ一、 第 338 卷、 第274〜276頁 （1989) ] 等は、 試験管内で形質転換させる ことができる。
形質転換は、 （1)プロトプラストを用いて行う、 （2)組織片または 未処理の細胞を用いて行う、 ことができる。 （1) の方法を用いるには形 質転換されたプロ トプラストから植物を再生させる系を予め確立しておく 必要がある。 （2) の方法を用いるにはァグロパクテリゥム厲の細菌を用 いて組織片または未処理の細胞を形質転換させ、 それを植物に再生する系 を確立しておく必要がある。 形質転換された植物は、 上記の形質転換のマ 一力一となりうる薬剤を含有する培地で植物を生育させることにより選択 することができる。
植物細胞からの植物の再生方法は、 植物の種類により異なっているが、 一般的に、 （1) の場合には形質転換されたプロ トプラストの懸濁液、 (2) の場合には形質転換されたブレート上の組織片または未処理の細胞 からカルスを誘導し、 次いでシユー卜を形成させることによって行うこと ができる。 また、 培地には種々のアミノ酸のほかにオーキシンやサイ トカ ィニン等のホルモンを含有させておくことができる。
形質転換された植物のゲノム中に目的のカセッ トが揷入されているかど うかはサザンハイプリダイゼーション等の方法で確かめることができ、 ま た、 レポーター遗伝子の mRN Aが植物内で生成されているかどうかはノ ーザンハイプリダイゼーション等の方法で確かめることができる。
上記のごとく作製されたキメラ遺伝子が挿入された植物を用いて、 交配 によってキメラ遗伝子を次世代の植物に移して行くことができる。
例えば、 pB I 121 (クロンテック社製） に、 本発明により得られる E XT遺伝子のプロモーター領域を含む DN A断片と GUS遗伝子とのキ メラ遗伝子を含むプラスミ ドを構築することができる。 次に、 このように して構築されたプラスミ ドを用いて、 適当なァグロパクテリゥム厲に属す る菌株、 例えば、 ァグロパクテリゥム ·チュメファシエンス L B A 440 4株 [Agrobacterium tumefaciens L B A 4404 ；ネイチヤー、 第 30 3卷、 第 179〜： L 80頁 （1983) 、 クローンテツク社より入手可能] を形質転換し、 該形質転換体を目的とする植物に感染させることにより、 植物を形質転換することができる。
例えば、 シロイヌナズナ種子 [ノ トリンガム ·ァラビドブシス ' ストツ ク 'センター （Notlingham Arabidopsis Stock Center： NASC) より入手 可能〕 を常法に従って、 MS 0プレート [ムラシゲ 'スクーグ無機塩類 (和光純薬社製） に 2%スクロース、 3mg/lチアミ ン塩酸塩、 5mg ノ 1ニコチン酸、 0. 5mgZlピリ ドキシン塩酸塩を加えた後、 pH6. 3にあわせ 0. 2%ジエランガムを加え、 オートクレーブし、 ブレーティ ングしたもの] 上に無菌的に栽培し、 その根の切片を用いて C I Mプレー ト （MS0プレートに 0. 5mg/ 2, 4ージクロロフエノキシ酢酸、 0. 05mg/ 1力イネチンを加えたもの） 上でカルス培養を行う。
上記のキメラ遗伝子を含むブラスミ ドにより形質転換したァグロバクテ リウムおよび p B 1 121、 p B I 101により形質転換したァグロバク テリゥムをそれぞれ培養し、 希釈したものをチューブに分注する。 その後、 カルス化した根の切片を浸し、 数日間 C I Mプレート上で共存培養する。 各々の菌株が肉眼で観察できるまで十分に増殖したら、 除菌操作を行い、 さらに S I MCプレート {MS 0プレートに、 2— i p [N6— （2—ィ ソペン夕ニル） アデニン、 和光純薬社製] を終濃度 5 ^ gZm l、 I AA (3—イン ドール酢酸、 和光純薬社製） を終濃度 0. 15 gZm l、 ク ラフオラン （へキスト社製） を終濃度 500 g/m 1 となるように加え たもの） 上で数日間培養を行う。 これらの切片を最終的に S I MC Sプレ ート （カナマンシンを含有する S I MCプレート） 上で培養し、 1週間ご とに、 新しいプレートに移植を繰返す。 形質転換した切片は増殖を続け、 塊状に盛り上がったカルスとなるが、 非形質転換切片は褐変する。 形質転 換体を、 ロゼッ ト棄を形成するまで培養し、 形質転換体の根元をカルス部 分を含まない様にメスで切り取り、 R I Mプレート （MS 0プレートに I AAを終濃度 0. 5 g/m 1となるように加えたもの） に移す。 8〜1 0曰後、 無機塩類培地 [ハイボネックス （ハイボネックス · ジャパン社製） を水で 1000倍希釈したものを使用] に浸したロックファイバーミニポッ ト （日東紡辗社製） 上に移して培養する。 開花し、 莢を形成した植物体は 無機塩類培地に浸した土に移植し、 種子を得ることができる。 この種子を 滅菌処理し、 MSKプレート （MS 0プレートにカナマイシンを終濃度 5 Omg/ 1 となるように加えたもの） に播種して発芽させることにより形 質転換体を得ることができる。
この形質転換体より、 常法に従って DNAを抽出し、 この DNAを制限 酵素 Hind IIIおよび EcoE Iで切断し、 プローブとして、 pVXP— H3を 制限酵素 Hind IIIおよび EcoR Iで消化したプロモーター領域を用いてサザ ンハイプリダイゼーションを行い、 形質転換の有無を確認することができ る。 すなわち、 （1) 形質転換を行っていない WS株、 （2) キメラ遺伝 子を導入した形質転換体、 （3) ベクタ一 p B I 121のみを導入した形 質転換体、 において、 （2) には （1) 〜 （3) 共通の内在性のシグナル のほかに、 制限酵素 Hind IIIおよび EcoR I消化したサンプルでは約 1. 8 k b pの特異的なシグナルが観察され、 EXT遺伝子のプロモーターを含 む DNAが （2) に組込まれていることが確認できる。
このようにして得られた形質転換体は、 GU S活性測定の基質として X 一 G l u eを用いると、 産物としてインジゴチンという不溶性の藍色の色 素ができるので、 この性質を利用して、 細胞内あるいは組織内の GUS活 性の局在を容易に調べることができる。 すなわち、 種子を滅菌処理し、 M SKプレート （MS 0プレー卜にカナマイシンを終濃度 5 OmgZ 1とな るように加えたもの） に播種して発芽させることにより得られた幼植物体 を、 そのまま 2mMDTTを含む蒸留水に入れて、 減圧脱気を行い、 その 後、 G US反応液 [ImMX— G I u c、 5 OmMリン酸緩衝液 （pH7. 0) 、 20%メタノール] に植物を移し、 37て、 30分〜 4時間反応す る。
反応後、 反応停止とクロロフィルなどの色素を除去する目的で、 ェタノ ールを注ぎ込み、 2、 3回洗った後、 3時間〜一夜静置後、 蒸留水を入れ たペトリ皿に移す。 これをスライ ドグラスに移し、 70%含水グリセリン を 1〜2滴たらしなじませた後、 さらにグリセリンを加え、 カバーグラス をのせて押しつぶし、 顕微鏡で観察することができる。 （1)形質転換を 行っていない WS株、 （2) キメラ遺伝子を導入した形質転換体、 （3) ベクター PB I 121のみを導入した形質転換体において、 （1) は全く 染色されない、 （3) はばらつきはあるが、 組織全体が染色されるのに対 して、 （2) は伸長成長している組锘の部分が青く染色されることが確認 できる。 本発明の植物プロモーターにハイブリダィゼーシヨ ン可能で、 かつ、 植 物、 植物細胞、 および該植物細胞より再生されたトランスジエニック植物 の少なくともいずれか 1つにおいてプロモーター活性を有するプロモータ 一を得る方法としては、 例えば、 以下の方法が適用できる。
まず、 目的の遺伝子源から得た染色体 DN Aを常法に従い、 プラスミ ド やファージベクターに接続して宿主に導入し、 ライブラリーを作製する。 そのライブラリーをプレート上で培養し、 生育したコロニーまたはブラー クをニトロセルロースやナイ口ンの膜に移し取り、 変性処理により DN A を膜に固定する。 この膜をあらかじめ32 P等で標識したプローブ （使用す るプローブとしては、 配列表の配列番号 1、 2、 3、 4、 5、 6、 7、 8 に記載した塩基配列、 またはその一部の遺伝子を使用することができる。 ） を含む溶液中で保温し、 膜上の DNAとブローブとの間でハイブリ ツ ドを 形成させる。 例えば DNAを固定化した膜を、 6xSSC：、 1%ラウリル 硫酸ナトリウム、 100 i£ g/m 1のサケ精子 DNA、 5 xデンハルツ (ゥシ血清アルブミン、 ポリビニルビロリ ドン、 フイコールをそれぞれ 0. 1%の濃度で含む） を含む溶液中で 65てで 20時間、 プローブとハイブ リダィゼーシヨンを行う。 ハイブリダィゼーシヨン後、 非特異的吸着を洗 い流し、 ォートラジオグラフィー等によりプローブとハイプリ ッ ド形成し たクローンを同定する。 この操作をハイプリッ ド形成したクローンが単一 になるまで繰り返す。 こうして得られたクローンの中には、 目的の植物ブ 口モーターが挿入されている。
得られた遗伝子は、 例えば、 次のように塩基配列を決定し、 得られた遗 伝子が目的の植物プロモーターであるかを確認する。
塩基配列の決定は、 ハイプリダイゼーションにより得られたクローンの 場合、 組換体がィ一' コリであれば試験管等で培養を行い、 プラスミ ドを 常法に従い抽出する。 これを制限酵素により切断し挿入断片を取り出し、
M l 3ファージベクター等にサブクローニングし、 ジデォキン法により塩 基配列を決定する。 組換体がファ一ジの場合も基本的に同様のステップに より塩基配列を決定することができる。 これら培養から塩基配列決定まで の基本的な実験法については、 例えば、 モレキユラ一 · クローニング .ァ ラボラ トリー ·マニュアル [ T. マニアティスら著、 コールドスプリング ハーバーラボラ トリー社、 1 9 8 2年発行] 等に記載されている。
得られた遗伝子が目的の植物プロモーターであるかどうかを確認するに は、 決定された塩基配列を本発明の植物プロモーターおよび配列表の 1、 2、 3、 4、 5、 6、 7、 8に記載した塩基配列と比較してその遗伝子構 造を知ることができる。
得られた遺伝子が植物プロモーター領域の全てを含まない場合には、 得 られた遺伝子をもとにして合成 D N Aブライマ一を作製し、 P C Rにより 足りない領域を增幅したり、 得られた遺伝子の断片をプローブとして、 さ らに D N Aライブラリーをスクリーニングすることにより、 本発明の植物 プロモーターハイプリダイズする植物プロモーターの全領域の塩基配列を 決定することができる。
また、 本発明の植物プロモーターの塩基配列をもとにして、 該塩基配列 を含む遺伝子の部位特異的変異誘発により、 該塩基配列の一部を置換、 挿 入および欠失の少なくとも一つによって修飾することで、 本発明の植物プ 口モーターの機能を改変させ本発明の植物プロモーター類似の植物プロモ 一ターを得ることができる。 この部位特異的変異誘発は、 ギヤブド 'デュ ブレックス （gapped duples) 法 [メ ソッズ ' イン 'ェンザィモロジ一
(Methods in Enzymology) 、 第 154巻、 第 350~367頁 （198
7) ] 、 ゥラシル DN A法 [メソッズ ' イン 'ェンザィモロジ一、 第 15
4卷、 第 367〜382頁 （1987) 、 亜硝酸法 [プロシーディングス · ォブ ·ザ ·ナショナル ·アカデミー 'ォブ *サイエンシーズ♦ォブ ·ザ ·
USA, 第 79巻、 第 7258〜 7262頁 （1982) ] 、 さらにカセッ ト変異法 [ジーン （Gene) 、 第 34巻、 第 315〜323頁 （1985) ] が知られている。
また、 本発明の植物プロモーターの塩基配列をもとにして、 該塩基配列 を含む遺伝子、 またはその一部を既知の植物プロモーター等の遗伝子、 も しくはその一部と結合、 あるいは置換し、 キメラの植物プロモーター [プ 口シーディングス ·ォブ ·ザ ·ナショナル 'アカデミー 'ォブ ·サイェン シーズ ·ォブ ·ザ ' US A、 第 88巻、 第 7266〜 7270頁（199 1)]を作製すること 、 本発明の植物プロモーターと同様に植物細胞の
Xyloglucan再 ¾成に必要な部位および時期にプロモーター活性を有する植 物プロモーターを得ることができる。
このようにして得られる植物プロモーターは、 その下流に有用遗伝子を 発現可能な状態で連結し、 本発明の植物プロモータ一と同様の方法でプ口 モーター活性を測定することにより、 該植物プロモーターが植物または植 物細胞、 あるいは該植物細胞より再生されたトランスジ ニック植物の少 なくとも t、ずれか 1つで機能するかどうか確認することができる。 また該 植物プロモーターの制御する発現部位特異性を同定することができる。 本発明で得られる植物プロモーターを植物、 植物細胞、 および該植物細 胞より再生されたトランスジエニック植物のいずれかに導入する場合、 染 色体外に留まるようなベクター、 または染色体内に組込まれるようなべク タ一の形で導入することができる。 染色体外保持べクタ一および染色体組 込み型ベクターは当該分野において知られており、 植物、 植物細胞より再 生されたトランスジヱニック植物に導入するには、 マイクロインジヱクショ ン法、 ポリエチレングリコール法、 パーティクルガン法、 ベクターを含有 する小細胞、 細胞、 リソソーム等とプロ トプラス卜との融合法、 エレク ト 口ポレーシヨン法等の方法を用いることができる。 また、 該ベクターは、 植物プロモーターの下流に植物細胞壁の Xyloglucan再構成を行う機能を有 する酵素の N末端の数ァミノ酸をコードする遺伝子を有用遺伝子の上流に 発現可能な状態で連結したキメラ逮伝子とすることができる。
本発明で得られる E X T遺伝子または E X Tファミ リー ¾伝子群のプロ モーターや該ブロモーターにハイプリダイズする配列またはその一部の配 列を有するボリヌクレオチドを用いて、 その下流に有用遗伝子を発現可能 な状態で連結し、 植物、 植物細胞に導入することにより、 植物細胞壁の Xyloglucan再檨成の必要な部位や時期に特異的に遺伝子発現を誘導させ、 植物の形態を制御することができる。 例えば、 アンチセンス R N A、 デコ ィ等をコードする遗伝子またはリボザィムを本発明のプロモーターの下流 に機能するように接铳し、 植物、 植物細胞、 該植物細胞から再生されたト ランスジュニック植物に導入することにより制御することができる。 植物 の形態をコントロールすることにより矮化植物体を作製し、 花粉管の伸張 を抑制することにより雄性不稔性の植物体を作成することができる。 また、 植物細胞の Xyloglucan再榱成の必要な部位である伸長成長する茎を食用と する植物の食品あるいは飼料としての品質の改良などができる。 また、 培 養細胞の対数増殖期や定常期に特有の遺伝子発現を誘導することにより、 例えば、 細胞の増殖のコントロールや有用二次代謝産物の生産性の改良な どができる。
また本発明により、 植物細胞壁の Xyloglucan再構成を行う機能を有する 酵素をコードする遺伝子、 特に EXTや機能的同等物をコードする遺伝子 を用いることで、 本発明と同様に、 植物細胞壁の Xyloglucan再構成に必要 な部位、 時期にプロモータ一活性を有する植物プロモーターをクローニン グすることができる。 次の実施例により本発明をさらに詳しく説明するが、 本発明はこれらの 実施例に限定されるものではない。 実施例 1
ェンド型キシログルカン転移酵素 （EXT) 遺伝子のファミ リー遺伝子 の単離 （ァズキ EXT2、 ァズキ EXT3)
(1) ポリ （A) +RNA
ビグナ ·アンギユラリス （Vigna angularis) 'ォゥヴィ ·ェ ·ォオノ、 シ · c v. . タカラ （Ohwi et Ohashi, cv. Takara) の種子 （渡辺種子社 製） をフィジォロジァ ·ブロンタルム、 第 82卷、 第 490〜 497頁 （1 991) に記載の方法で発芽させた。
発芽より一週間後、 地上部の茎、 葉を切り取り、 約 2 gの植物組織を得 た。 これを直ちに液体窒素中で凍結し、 液体窒素存在下、 乳鉢ですりつぶ して粉末にし、 20mlの変性液 [7Mグァニジンチオシァネート、 25 mMクェン酸ナ トリウム （pH7. 0) 、 0. 1 Mメルカブトエタノール、 2%ラウロイルサルコシン酸ナトリウム] で溶解した。 これをポリ トロン で破砕した後、 10m 1の変性液を加えて撹拌し、 3 Omlのフ ノール /クロ口ホルム溶液 [1 ： 1 =水飽和酸性フヱノール： クロ口ホルム/ /ィ ソァミルアルコール （49 : 1) ] を加えて、 よく攬拌し、 この懸濁液を 遠心して水層を分離し、 この水層にイソプロピルアルコール、 1ノ10容 の 3M酢酸ナトリウム、 1 300容の酢酸を加えて、 遠心分離すること により、 RNAの沈殿約 4mgを得た。
この沈殿を吸着用緩衝液 [20mMトリス （Tris) -HC 1 (pH7. 5) 、 2mMEDTA、 1MN a C 0. 5%SD S] 2m lに溶かし、 ォリゴ （d T) —セルロース ' タイプ 7カラム （ファルマンァ社製） に吸 着させた後、 溶出用緩衝液 [10mM卜リス一 HC 1 (pH7. 5) 、 1 mMEDTA] で約 25 のポリ （A) +RNAを回収した。
(2) cDNAライブラリ一の作製およびスクリ一二ング
実施例 1の （1) で得られたポリ （A) +RNAより c DNA合成キッ 卜 . システムブラス （アマシャム社製） を用いて、 [ジーン (Gene) 、 第 25卷、 第 263頁 （1983) ] に記載の方法に準じて、 ス g t 10 (ストラタジーン社製） をベクターとする c DN Aライブラリーを作製し た。 ァズキ EXT遺伝子 c DNA [欧州特許公開第 0562836号 A 1 公報 （1993) ] をランダムプライマー DN Aラベリングキッ ト （宝酒 造社製） を用いて [な一32 P] dCTPで標識し、 ハイブリダィゼーショ ンのブローブとした。 このプローブの比活性は、 7. 5 108 c pm/ gであった。 このプローブを用いて、 上記で作製した c DNAライブラ リーについてプラークハイプリダイゼーション法を行った。 つまり、 プレ 一卜 1枚当たり、 l x l 04個のプラークができるようにプラークを形成 させた後、 メンブランにトランスファーして、 変性、 中和、 固定処理後、 このメンブランをプレハイブリダィゼーシヨン緩衝液 （6 X S S C：、 0. 1%SDS、 5 Xデンハルツ液、 10 ^ gZm 1サケ精子 DNA) 中で、 50°C、 2時間プレハイブリダィゼーシヨ ンを行った。 次に、 プローブを 2 x 105〜106c pm/m 1になるように、 ハイブリダィゼーション緩 衝液を加え、 50。C、 15時間ハイブリダィゼ一シヨンを行った。 ハイブ リダィゼーシヨンの後、 メンブランを 6 x S S C、 0. 1%SDSを含む 洗浄液で室温、 20分間 2回洗浄した。 メ ンブランは、 X線フィルム （コ ダック社製） 增感紙をいれたカセッ ト内で、 一 80° (：、 一晚感光させ、 ォ 一トラジオグラフィーをとつた。 5 x 104のプラークについて検索を行つ た結果、 96個の陽性プラークが得られた。 次にそれぞれのプラークにつ いて、 2次スクリーニングを行い、 以下の実験に用いた。
(3) プラークの分類と EXT遺伝子のファミ リー遺伝子、 ァズキ EX T2 c DNAおよびァズキ EXT3 c DNAの単離
上記で得られたプラークよりプレートライゼート法 [モレキュラー · ク ローニング ·ァ .ラボラ トリー 'マニュアル （Molecular Cloning A Laboratory Manual) 、 第 2版、 第 2章、 第 60〜66頁、 T. マニアティ ス （T. aniatis) ら著、 コールド .スプリング'ハーバー ' ラボラ トリ 一 (Cold Spring Harbor Laboratory) 社、 1989年発行〕 を用いてファ ージ粒子を大量調製して、 これを用いてドッ トハイプリダイゼーションを 行った。 プローブは実施例 1の （2) で使用したァズキ EXT遺伝子 c D NAを用いた。 上述と同様に行ったハイプリダイゼーションのステップの 後、 フィルターを 6 x S S C、 4 x S S C、 2 x S S C l x S S C、 0. 1 S S Cで 50°Cおよび 0. 1 x S S Cで 65°Cと順次、 洗いの条件を 強く して処理し、 シグナルの強弱をもとにして分類した結果、 プラークは 6種のグループに分類された。 これらのグループのうち、 0. l x S S C、 50°Cではシグナルが検出されるカ^ 0. I x S S C：、 65°Cで洗うと検 出されなくなるグループより、 ァズキの EXT¾伝子とは異なるシグナル 強度を示す 2種のプラークを得た。 これらのプラークよりファージを単離 し、 挿入されている DNAを抽出した。 これらの DNAを制限酵素 EcoK I により切断し、 ァガロースゲル電気泳動により D N A断片の長さを確認し た。 その結果、 1種のプラークより約 73 O b p、 約 430 b p力、 もう 1つのプラークより約 1090 b pが確認された。 この DNA断片 （約 7 30 b p、 約 430 b p、 約 1090 b p) をそれぞれ精製した後、 pU C 18 (宝酒造社製） の EcoR Iサイ トにサブクローニングし、 該プラスミ ドを PVX44— 1、 PVX44— 2、 p V X 45— 1と命名した。 この プラスミ ドを用いて上記のサンガー （Sanger) の方法 [サイエンス
(Science) 、 第 214巻、 第 1205~1210頁 （1981) ] に従 い、 B c a BE STTMダイデォキシ · シークェンシング .キッ ト （宝酒造 社製） を用いて DNA断片の塩基配列を決定したところ、 pVX44-l と PVX44— 2よりァズキ EXT遺伝子と相同性の高い遺伝子 （ァズキ EXT2) 力、'、 さらに p VX45— 1よりァズキ EXT¾伝子と相同性の 高いもう 1種の遺伝子 （ァズキ EXT3) がクローニングされた。 その塩 基配列の一部を配列表の配列番号 11および配列番号 12に示す。 実施例 2
EXT遺伝子のファミ リー遠伝子、 ァズキ XRP 1 cDNAの単離 実施例 1の （1) で得られたポリ （A) +RNAより、 cDNA合成キッ ト （宝酒造社製） を用いて、 [ジーン、 第 25卷、 第 263頁 （1993) ] に記載の方法に準じて、 λ ΖΑΡ Ι I (ストラタジーン社製） をべクタ 一とする c DNAライブラリ一を作製した。 プローブにはキシログルカン に作用する蛋白質によく保存されている配列の 1つである DE I DFEF LGのアミノ酸 （配列番号 28) に対応する混合合成オリゴヌクレオチド
(27me r、 配列番号 13) を DNA5' 末端標識キッ ト ME GALA BEL™ (宝酒造社製） を用いて [ァ一32 P] ATPで標識したものを使 用した。 このプローブの比活性は、 約 1 X 108 c pm ί gであった。 このプローブを用いて、 上記で作製した c DNAライブラリ一について実 施例 1と同様にプラークハイブリダィゼーシヨンを行った。 但し、 ハイブ リダィゼーションの温度は 50°Cとし、 15時間ハイブリダィゼーション した。 その後、 フィルターを 2xSSC、 50°Cで 20分間、 2回洗い、 ォートラジオグラフィーを行った。 10x 14 cmのシャーレに 1枚当た り約 2万個のプラークを形成させ、 約 10万個のプラークについて検索を 行った結果、 陽性シグナルは全く得られなかった。 同時にポジティブコン トロールとして、 ァズキ EXT c DNAを組み込んだファージ粒子のブラ 一クを角シャーレ丄枚当たり 50個程度形成させて同じ条件でハイブリダ ィゼーシヨンを行った場合には、 各プラークに対応して明確な陽性シグナ ルを得ることができた。
それに対して、 不思議なことに、 ポジティブコントロールのファージ液 をそのプラークが角シャーレ 1枚当たり 50個程度形成するように cDN Aライブラリーのファージ液 （1万個プラーク相当） に混入させた場合に は、 賜性シグナルはまったく得られなかった。 このようなことは、 100 塩基以上の長さの c DN A断片をブローブに用いてプラークハイプリダイ ゼーシヨンを行う場合には起こらないことであり、 特に、 20〜30程度 の長さのオリゴマーをブローブに用いたときに問題になることが明らかに なった。 これは、 ポジティブクローンが存在しても、 共存する大多数の他 のファージに由来するプラークによる何らかの干渉作用によって、 陽性シ グナルを生じることができなくなっていると考えられる。
これを避けるためにプラークはプレート上であまり密にならないように
1プレート当たり 500〜： L 000プラーク形成させ、 約 8x 103個の プラークについて検索を行った結果、 8個の陽性プラークが得られた。 ス Z AP I Iは Ml 3ヘルパーファージと同時に F' 株の宿主菌に重感染 させることにより、 宿主内においてクローニングされた領域が自動的に p B 1 u e s c r i p t SK (—） （ス卜ラタジーン社製） に変換する ォートマチックサブクローニングができる。 これにより上記の 8プラーク よりブラスミ ドを調製し、 制限酵素 EcoR I (宝酒造社製） を用いて切断し ァガロースゲル電気泳動により DNA断片の長さを確認した。 このうち、 任意に選んだ約 1. 2 k b pの DNA断片を含む 3種のブラスミ ドをそれ ぞれ pVM104、 pVM106、 pVM109と命名した。
これらのブラスミ ドを用いて、 サンガーの方法に従い、
B c a BESTTMダイデォキシ · シークェンシング ·キッ ト （宝酒造社製） を用いて D N A断片の塩基配列を決定したところ、 ァズキ E X T遗伝子お よび BRU 1遗伝子 [ブラント ·フィジオロジー、 第 104卷、 第 161 〜170頁 （1994) ] 、 me r i— 5遺伝子 [ザ 'プラント 'セル、 第 3卷、 第 359〜370 (1991) ] と相同性の高い遺伝子が 2種ク ローニングされた （p VM106と p VM109は同一の遺伝子であつ た） 。 そのうちの 1種 （ァズキ XRP1) である p VM106について、 その塩基配列の一部を配列表の配列番号 14に示す。 実施例 3
PCRによる EXT遺伝子のファミリー遠伝子、 ァズキ XRP2 cDN Aの単離
実施例 2と同様にァズキの地上部より調製した c DNAライブラリ一 (λΖΑΡ Ι Ι) 約 l OOOOp f u (plaque forming unit) の； lファ ージ溶液 （33 1 ) をフエノールクロ口ホルム抽出を 2回、 およびエタ ノール沈殿を行うことにより、 スファージ DNAを簡易精製した。 この D NA全量を铸型にし、 センスプライマーとして混合合成ォリゴヌクレオチ ド （配列番号 13) を、 アンチセンスプライマーとして dTTPが 18塩 基繁がったオリゴ （dT) 18ブライマーそれぞれ用い、 PCRアンブリ フィケーション ·キッ ト （宝酒造社製） を用いて PCRを行った。 反応は 94°C (1分） 、 55°C (1分） 、 72°C ( 1分） のサイクルを 25回繰 返した後、 72てに 7分間維持した。 次いで、 この反応液 を铸型と して、 センスブライマーとして混合合成オリゴヌクレオチド （配列番号 1 3) を、 アンチセンスブライマーとしてオリゴ （dT) 18プライマーを それぞれ用いて同様に P CRを行い、 上記のサイクルを 25回繰返した。 反応後、 反応液を 3%ァガロースゲル電気泳動にて解析したところ約 26 Obp、 350bp、 450bp、 500bp、 600bp、 750bp、 800 bp、 13 OObpの DNA断片が特異的に增幅されていることを 確認した。 これらを回収した後、 DNAブランティング ·キッ ト （宝酒造 社製） を用いて末端の平滑化を行った、 さらに 5' 末端標識キッ ト MEG ALABEL™ (宝酒造社製） を用いて PC R産物の 5' 末端のリン酸化 を行い、 pUC119 (宝酒造社製） の Hinc IIサイ トにサブクローニン グした。 このブラスミ ドをサンガーの方法により B c a BESTTMダイデ ォキシ · シークェンシング*キッ ト （宝酒造社製） を用いてこの DNA断 片の塩基配列を決定したところ、 ァズキ EXT遺伝子にホモロジ一のある 2種類の遣伝子がクローニングされた。 このうち 1つは実施例 2の p V M 106, p VM109と同一であった。 もう 1つ （ァズキ XRP2) の塩 基配列の一部を配列表の配列番号 15に示す。 実施例 4
EXT¾伝子のファミ リー遗伝子、 タバコ XRP1 cDNAの単離 タバコの； I ZAPをベクターとする cDNAライブラリー （ストラタジ —ン社製） を用いて、 プローブにはキシログルカンに作用する蛋白質に保 存されている DE I DFEFLGのアミノ酸 （配列番号 28) に対応する 混合合成オリゴヌクレオチド （27me r、 配列番号 13) を DNA5' 末端標識キッ ト MEGALABELTM (宝酒造社製） を用いて [ァ— 32P] ATPで標識したものを使用した。 このプローブを用いて、 上記で作製し た c DNAライブラリ一について実施例 2と同様の条件でプラークハイブ リダイゼーションを行った。 その結果、 約 3 X 104個のプラークについ て検索を行った結果、 30個の陽性プラークが得られた。
λ ZAP (ストラタジーン社製） は Ml 3ヘルパーファージと同時に F* 株の宿主菌に重感染させることにより、 宿主内においてクローニング された領域が自動的に pB 1 u e s c r i p t SK (—） （ストラタジ ーン社製） に変換するオートマチックサブクローニングができる。 これに より上記の 30プラークよりブラスミ ドを調製し、 制限酵素 EcoR Iを用い て切断しァガロースゲル電気泳動により DN A断片の長さを確認した。 こ のうち、 約 1. 5kbp、 約 0. 9kbpの DNA断片を含む 2種のブラ スミ ドをそれぞれ pTM3D、 pTMl IDと命名した。
これらのブラスミ ドを用いて、 サンガーの方法に従い、
B c a BE STTMダイデォキシ ' シークェンシング♦キッ ト （宝酒造社製） を用いて DN A断片の塩基 82列を決定したところ、 ァズキ E XT遺伝子お よび上記の BRU 1遺伝子、 me r i一 5遺伝子と相同性の高い遺伝子が 2種クローニングされた。 そのうちの 1種 （タバコ XRP 1) の pTMl IDについて、 その塩基配列の一部を配列表の配列番号 16に示す。 実施例 5
EXT遺伝子のファミ リー遗伝子群ゲノム DNAクローンの単離 (1) ァズキの葉よりゲノム DNAの調製
ビグナ ·アンギユラリス ·ォゥヴィ ·ェ ·ォオハシ · c v. 夕カラの種 子 （渡辺種子社製） をフィジォロジァ ·ブランタルム、 第 82卷、 第 49 0〜497頁 （1991) に記戴の方法で発芽させ、 葉約 10 gを得た。 その約 10 gの葉を乳鉢にとり、 液体窒素中で白い粉末になるまで粉砕し た。 粉砕した葉約 2. 5gを、 直ちに 5 Oml容貴のポリスチレンチュー ブに入れて、 1 Om 1の尿素一フヱノール DNA抽出緩衝液 [0. 05M トリスー HC 1 (pH7. 6) 、 0. 02MEDTA, 5%フエノール、 8M尿素、 0. 35MNaC l、 2 %N—ラウロイルザルコシンナトリウ ム] および 25%SDSを加え、 65°C、 1時間で抽出した。 抽出液に 2 倍容量のフエノール： クロロホルム： イソアミルアルコール （25 ： 24 ： 1) を加え、 緩やかに約 15分間、 混合した後、 2000 r pm、 1 δ 分間遠心分離した。 遠心分離後の上清を新しいチューブに移し、 これに再 度 2倍容量のフヱノール： クロ口ホルム：イソァミルアルコール （25 ： 24 : 1) を加え、 緩やかに約 15分間、 混合した後、 2000 r pm、 15分間遠心分離した。 この違心分離後の上清を新しいチューブに移し、 2倍容量のエタノールを加えて、 緩やかに混合した後、 析出した白い糸状 のゲノム DNAをパスツールビぺッ トを用いて巻き取り、 新しいチューブ に取り出した。 このチューブに 1. 5mlの TE緩衝液 [10mM卜リス 一 HC 1 (pH8. 0) 、 ImMEDTA] を加えて 55°Cで一晚かけて- 溶解させた。 この DNA溶液の 10倍希釈のサンプル 1 1を、 0. 4% ァガロースゲル電気泳動に供し解析したところ、 高分子の DNAで、 濃度 が約 1 OOngノ^ 1であることが確認された。 すなわち、 植物体約 2. 5gから、 150 gのゲノム DNAが得られた。
(2) ゲノム DNAライブラリーの作製
上記のように得られたゲノム D N Aを制限酵素 Sau3A Iで部分消化する ために、 条件検討を行った。 すなわち、 1 OUZ 1の Sau3A I (宝酒造 社製） を希釈緩衝液で希釈し、 反応液 50 1 (DNA 1 n g) 中の濃度 が 1〜0. 035U_ gDNAになるようにして、 37て、 30分間反 応し、 1 1の 0. 5MEDTAを加えて反応を停止した。 反応後サンプ ノレ 20 Iを、 0. 4%ァガロースゲル電気泳動に供し解析したところ、 0. lU//zgDNAの条件が 15〜20 k b pの大きさの分子が最も多 いので、 この条件でラージスケールの反応を行った。 次に、 この条件で部 分消化を行った DNA10/igに 1 Ox f i 1 1— i n緩衝液 [0. 5M トリスー HC 1 (pH 7. 2) 、 0. 1M硫酸マグネシウム、 ImMDT T、 500 g/m 1ァセチル化 B S Α、 1 OmMd ATP, l OmMd GTP] U クレノー断片 1 OUを加え、 全量を蒸留水で 50 1と し、 37て、 30分間反応した。 反応後、 反応液に 50 1のフユノール
： クロ口ホルム： ィソァミルアルコール （25 : 24 : 1) を加え、 锾ゃ かに混合した後、 12000 rpm、 5分間遠心分離し、 上清を新しいチ: ーブに移し、 エタノール沈殿を行った。 沈殿に、 20 1の TE緩衝液
[10mMトリスー HC】 （pH8. 0) 、 ImMEDTA] を加えて溶 解した。 このように、 部分的に ί i 1 1 - i ηした Sau3A I部分消化ゲノ ム DNAO. 5 gおよび 1. 5^gと、 ス GEM11アーム （プロメガ 社製） 1. 0 gとを、 TaKaRa DN Aライゲ一シヨン 'キッ ト Ve r. 1 (宝酒造社製） を用いてライゲーシヨンした。 すなわち、 部分 的に f i I 1一 i nした Sau3A I部分消化ゲノム DN A 0. 5 ^ gおよび 1. 5 gを、 ；iGEMl lアーム （プロメガ社製） 1. 0 g溶液を乾 燥した後、 5 Iライゲーシヨン緩衝液に溶解し、 これに TaKaRa DNAライゲーシヨン ·キッ ト V e r. 1の B液 5 1を加え、 26°C、 10分間でライゲーシヨンを行った。 ライゲーシヨン後のサンプルは、 フエ ノール抽出を 2回行った後、 エタノール沈殿を行った。 その後、 全量をィ ンビトロ .パッケージング ·キッ ト （ストラタジ一ン社製） によりパッケ 一ジングし、 これを宿主菌ィー · コリ LE 392に感染することによりァ ズキのゲノム DN Aライブラリーを得た。 このライブラリーのタイターを 測定したところ、 そのタイターは、 2. 1 X 105p f uZm 1であった。
(3) ライブラリ一のスクリーニングと遺伝子の単離
このライブラリーを用いて、 ァズキ EXT遣伝子 cDNA [欧州特許公 開第 0562836号 A1公報 （1993) ] 約 1. l kbpを、
Bc aBESTTMラベリング ·キッ ト （宝酒造社製） を用いて （な一32 P) d C TPで標識し、 プラークハイブリダィゼーシヨンのプローブとした。 つまり、 上記 DN A断片 25 n g、 2 1のランダムブライマーをチュー ブにとり、 蒸留水で とし、 95°Cで 3分間加熱後氷中で急冷した。 そこに、 10倍濃度緩衝液、 dNTP混合液を各々 2. 5 1、 標識 dC TPを 5 1加え、 蒸留水で 24// 1とし、 Be aBESTTMDNAポリ メラーゼ （宝酒造社製） 1 β 1を加えて 52てで 10分間ィンキュベー卜 した。 酵素を失活させたあと、 95てで 3分間加熱し、 氷中で急冷して熱 変性させ、 全量をハイブリダィゼーシヨンに用いた。 このプローブの比活 性は 7. 2 X 108c pmZ gであった。
プラークハイプリダイゼーションは、 実施例 1と同様の方法で行った。 ただし、 プレハイブリダイゼーションおよびハイブリダイゼーションの温 度は 65°Cとした。
ハイブリダィゼーシヨン後、 メンブランを 2xSSC、 0. 1 %S D S を含む洗浄液で室温、 20分間 1回、 さらに 0. l xSSC、 1%SDS を含む洗浄液で 50eC、 20分間 1回洗浄した。 角型のシャーレに、 1枚 当たり 1 X 104個のブラークがでるようにブレー卜にファージをまいて 合計 10枚、 すなわち、 1 X 105個のファージからスクリーニングした 結果、 10個の陽性プラークが得られた。 次に、 それぞれのプラークを 2 次スクリ一二ングに用いた。 2次スクリ一ニングで得られたそれぞれのプ ラークからブレートライゼート法でファージ DN Aを抽出した。 このファ ージ DN Aを制限酵素 Sac I、 EcoR I、 Hind III、 BamH I、 Pst I (全て宝 酒造社製） をそれぞれ用いて消化後、 上記と同じプローブを用いて、 サザ ンハイプリダイゼーションを行った。
サザンハイブリダイゼーションは、 モレキュラー · クローニング ·ァ . ラボラ トリー ·マニュアル、 第 2版、 第 9章、 第 31~58頁 （T. マ二 ァテイスら著、 コールド 'スプリング 'ハーバー ·ラボラトリー社、 19 89年発行） に記載の方法に従って行った。
すなわち、 それぞれの DN A試料について 1%ァガロースゲル電気泳動 を行い、 泳動後、 アルカリ変性を行いナイロンメンブラン [ハイボンド一 N (Hybond-N) 、 アマシャム社製] に一晩サザンブロッ トした。 紫外線 トランスイルミネーター （254 nm) に 5分間照射させ、 DNAを固定 した。 このメンブランをブレハイブリダィゼーシヨン緩衝液 （5xデンハ ルツ液、 6xSSC、 0. 1%SDS、 10 gZm 1サケ精子 DNA) 51111中で65て、 2時間ブレハイブリダィゼーシヨンを行った。 次に、 プローブを加え、 65。Cで一晚ハイブリダィゼーシヨ ンを行った。 ハイブ リダィゼーシヨンの後、 メンブランを 2xSSC、 0. 1%SDSを含む 洗浄液で室温 10分間 2回洗浄し、 铳いて同じ洗浄液で 50°C、 30分間 で 2回洗浄した。 メンブランは乾燥させた後、 X線フィルム （コダック社 製） を入れたカセッ ト内で一 80°C—晚感光させ、 ォートラジオグラフィ 一をとつた。
得られたォートラジオグラフィーのパターンより、 10個のファージは 3種類に分類された。 この 3種類ファージベクターに挿入されている DN A断片のうち、 ァズキ E XT遗伝子 cDN Aをプローブにした際に検出さ れる DNA断片をブラスミ ドベクターにサブクローニングして、 部分的に 塩基配列の解析を行った。 その結果、 すべてのプラークのファージベクタ 一に挿入されている DN A断片が E XT遺伝子の類似の遺伝子、 すなわち ファミ リー遺伝子を含むことが分かった。 しかしながら、 EXT遺伝子そ のものを含むものはなかった。 実施例 6
ァズキ E XT遺伝子のプロモーター下流領域を含む DN A断片のァズキ の部分的ゲノム DN Aライブラリーからのクローニング
実施例 5と同様にァズキの葉より抽出したゲノム DN Aを制限酵素 EcoR I、 Hind IIIで消化、 および EcoE I— Hind IIIでの 2重消化し、 0. 7% ァガロースゲル踅気泳動した後、 ナイロンメンブランに移し、 実施例 5の (3) と同様に作成したァズキ E XT遺伝子 cDN Aをブローブにして、 サザンハイプリダイゼーションを行った。 サザンハイブリダィゼーシヨンは、 実施例 5の （3) の方法に従って行つ た。 但し、 ハイプリダイゼーションの後、 メンブランを 2 X S S C、 0. 1%SDSを含む洗浄液で室温 20分間 3回洗浄し、 続いて同じ洗浄液で 50°C、 20分間で 2回洗浄した後、 0. l xSSC、 0. 1%SDSを 含む洗净液で 50て、 20分間 2回洗浄した。
その結果、 どのレーンも約 3本のバンドが見られるが、 EcoR I消化物で 約 8. 5 k b p、 Hind III消化物で約 8. 5 k b p、 EcoR I、 Hind III 2 重消化物で約 5. δ k b pのバンドのシグナルが最も強いことが確認でき た。 そこで、 EcoE I— Hind IIIで完全に 2重消化した D N A 30 gを 0. 7%ァガロースゲル罨気泳動し、 約 5. 5 k b pのサイズを中心にァガロ ースゲルから切り出し回収して、 ス EX 1 0 X (ノバジユン社製） の EcoR I、 Hind IIIサイ 卜にライゲーシヨンし、 インビトロ ·パッケージング · キッ ト （ストラタジーン社製） によりパッケージングしこれを宿主菌のィ 一 · コリ ER1647に感染することにより、 EcoR I、 Hind IIIサイ トを 両端に持つ約 5. 5 k b pの DNA断片を中心としたサイズのァズキの部 分的ゲノム DNAライブラリーを得ることができた。 このライブラリーの タイターは、 1. 9 X 106p f uZm 1であった。
次に、 ァズキ EXT遗伝子 cDNAをプローブにして、 実施例 5と同様 にプラークハイブリダィゼーシヨンを行った。 1. 3xl05個のブラー クより 10個の隨性プラークが得られた。 このプラークを SM緩衝液に懸 濁し、 それぞれのプラークを 2次スクリーニングした。 2次スクリーニン グの際のプローブは、 上記のァズキ E XT遗伝子 c DMAおよびァズキ E XT遺伝子 c DN Aのアイソザィムと相同性の低い 5' ノンコード領域を もとに合成したオリゴヌクレオチド VAN— U7 (配列番号 17) をそれ ぞれ用いた。 ァズキ EXT遺伝子 c DNAをブローブとして用いたものは、 上記と同様にプラークハイブリダイゼーションおよび洗浄を行った。 合成 オリゴヌクレオチド VAN— ' 7を用いたものは、 DNA5' 末端標識キッ ト MEGALABELTM (宝酒造社製） を用いて （7—32 P) ATPで 5' 末端標識し、 ハイブリダィゼーシヨンのプローブとした。 このブロー ブの比活性は、 約 2 X 108 c pin gであった。 このプローブを用い て、 実施例 2と同様にプラークハイブリダィゼーションを行った。 但し、 ブレハイプリダイゼーションおよびハイプリダイゼーションの温度は 47 °Cとした。 ハイブリダィゼーシヨン後、 メンブランを、 6xSSC、 0. 1%SDSを含む洗浄液で室温、 20分間 2回洗净後、 同様の洗浄液で 4 7 、 20分間 2回洗浄した。 この結果、 10個の陽性プラークの内、 4 個が E XT遗伝子 c DN Aを含む DN A断片であることが分かった。 これ ら断片の挿入されたファージを P 1 C r e遺伝子を持つ宿主菌であるィー · コリ BM25. 8に感染させることにより、 宿主内で自動的にクローニン グされた領域が pUC型プラスミ ドに変換するォートマチックサブクロー ニングを行い、 ブラスミ ドを調製し、 PVXG303と命名した。
p VXG 303を用いてィー · コリ J Ml 09株 （宝酒造社製） を形質 転換し、 形質転換体を Escherichia coli JM109ZpVX303と命名、 表示し、 ブダペスト条約に基づき、 平成 7年 3月 15曰 （原寄託曰） に、 曰本国茨 城県つくば巿東 1丁目 1番 3号の通商産業省工業技術院生命工学工業技術 研究所に受託番号 FERM BP— 5390の下に寄託されている。 この ブラスミ ドをサンガーの方法に従って B c a BE STTMダイデォキシ · シ 一クェンシング ·キッ ト （宝酒造社製） を用いて DNA断片の塩基配列を 決定した。 その塩基配列の一部を配列表の配列番号 18および配列番号 1 9に示す。 この配列をァズキ E X T遺伝子 c D N Aの配列と比較すること により、 該断片が、 ァズキ EXT遺伝子のプロモーターを含むことが判明 した ( 実施例 7
ァズキ EXT遺伝子のプロモーター領域を含む DN A断片のィンバース P CRによるクローニング
( 1 ) セルフラィゲーションの効率の検討
実施例 6の p VXG303はァズキ E XT遺伝子のプロモーター領域を 含む 5. 5kbpのゲノム DNA由来 EcoR I/Hind III断片を持つ約 9. 5 k b pのブラスミ ドである。
このプラスミ ドをセルフライゲーションおよびィンバース P CRのコン トロールとし、 制限酵素 Hind IIIで消化した後、 DNA濃度を 1 OngZ 1. 3. 3 n g/ n 1. 2 n g/ 1 , 1 n g/ 1としてセルフライ ゲーションを行った。 ライゲーション後、 各 5〃 1をィー ' コリ JM10 9に形質転換し、 形成されたコロニー数よりセルフライゲーションの効率 を求めた。 この結果、 DN A濃度が希薄なほどセルフライゲ一シヨンの効 率が上がっていることが確認された。 し力、し、 このライゲ一シヨン溶液を 铸型とし、 センスブライマーとしてプライマー VAN— UH 1 (配列番号 21) 、 アンチセンスプライマーとしてプライマー VAN— L (配列番号 22) を使用して PCRを行ったところ、 铸型 Jtを增やすためにライゲー シヨン溶液の反応系への持ち込みを多くすると阻害がかかること、 また、 反応系への持ち込みを減らすためにエタノール沈殿を行うと、 DNA濃度 が希薄になるほど回収率が悪くなることから、 目的の環状化 D N Aを効率 良く得るためには、 ライゲーシヨンの際の DNA濃度を 3. 3 n / n 1 とし、 反応容量を 300 1とするのがよいことが分かった。 (2) ァズキゲノム DNAの Hind III断片を铸型とするインバース P C
R
実施例 5と同様にァズキの葉より調製したゲノム D N A 1 gを制限酵 素 Hind IIIを用いて完全消化し、 フユノール Zクロロフオルム抽出を 1回 行うことにより酵素を完全に失活させ、 エタノール沈殿した。 エタノール 沈殿した DNAに 268 1の蒸留水、 の l Oxライゲーシヨン 緩衝液、 2 1の T 4 DN Aリガーゼ （宝酒造社製） を加え、 16てで 1 晚反応することによりセルフライゲーションした。 得られた環状ゲノム D NAO. l gを铸型にして、 センスブライマーとしてプライマー VAN -UH 1 (配列番号 21) 、 アンチセンスプライマーとしてプライマー V AN-L (配列番号 22) を使用して、 TaKaRa LA PCRキッ ト （宝酒造社製） により PCRを行った。 反応は 94°C (0. 5分） 、 5 5°C (1分） 、 72て （2分） のサイクルを 30回繰り返した。 しかし、 この反応では増幅は確認されなかった。 次いで、 この反応液 1 1を铸型 として、
1) センスブライマーとしてブライマー VAN— UH2 (配列番号 23) 、 アンチセンスプライマーとしてブライマー VAN— L 16 (配列番号 24)、
2) センスブライマーとしてブライマ一 VAN— UH3 (配列番号 25) 、 アンチセンスブライマーとしてブライマー VAN— L 3 (配列番号 26) 、
3) センスプライマーとして VAN— UH2ブライマー （配列番号 23) 、 アンチセンスブライマーとしてプライマー VAN— L 3 (配列番号 26) 、
4) センスブライマーとしてブライマー VAN— UH3 (配列番号 25) 、 アンチセンスブライマーとしてブライマー VAN— L 16 (配列番号 24) を用いて同様に PCRを行い、 上記のサイクルを 30回繰り返した。
反応後、 反応液を 1 %ァガロースゲル電気泳動により解析したところ、 /JP96/00 77
3) の組み合わせにおいて、 約 1. 8 k b pの DNA断片が特異的に増幅 されていることを確認した。 その他の組み合わせでは多数の非特異的な D N A断片が增幅しており目的断片の同定は困難であつた。
3) のブライマーの組み合わせで得られた DNA断片をゲルより回収し た後、 DNAブランティング ·キッ ト （宝酒造社製） を用いて末端の平滑 化を行い、 さらに 5' 末端標識キッ ト MEGALABELTM (宝酒造社製） を用いて PCR産物の 5' 末端のリン酸化を行い、 PUC119 (宝酒造 社製） の Hinc IIサイ トにサブクローニングした。 この中からブラスミ ド 3個を選択し、 サンガーの方法に従って、 Be aBESTTMダイデォキン ' シークェンシング ·キッ ト （宝酒造社製） を用いて DMA断片の塩基配列 を決定した。 部分的に塩基配列を決定した結果、 全てのブラスミ ドで塩基 配列が一致していたので、 そのうちの 1つのブラスミ ドを用いて全塩基配 列を決定した。
その塩基配列の一部を配列表の配列番号 27に示した。 また、 該 DNA 断片の制限酵素地図を図 2に示した。 該 DNA断片を含むブラスミ ドを
？ー113と命名し、 該 pVXP— H3で形質転換されたィー ' コリ J Ml 09株は Escherichia coli JM109ZpVXP-H3と命名、 表示され、 ブ ダペスト条約に基づき、 平成 7年 2月 1 7日 （原寄託曰） に、 曰本国茨城 県つくば巿東 1丁目 1番 3号の通商産業省工業技術院生命工学技術研究所 に受託番号 FERM BP— 5388の下に寄託されている。 実施例 8
ァズキ E XT遺伝子のプロモーター上流領域を含む DN A断片のァズキ のゲノム DN Aライブラリ一からのクローニング
(1) ゲノム DNAライブラリーの作製
64一
訂正された 9 実施例 5のように得られたゲノム DN Aを Sau3A Iで部分消化するため に、 条件検討を行った。 すなわち、 10Uノ 1の Sau3A I (宝酒造社製） を希釈緩衝液で希釈し、 反応液 50 \ (D A 1 f g 中の澳度が 1〜 0. 035UZ z gDNAになるようにして、 37°C、 30分間反応し、 1 1の 0. 5MEDTAを加えて反応を停止した。 反応後サンブル 20 lを、 0. 4%ァガロースゲル電気泳動に供し解析したところ、 0. 1 UZ; gDNAの条件が 15〜20 k b pの大きさの分子が最も多いので、 この条件でラージスケールの反応を行った。
次に、 この条件で部分消化を行った DN A 160 gを用いて、
N a C 1密度勾配違心を行うことにより、 15〜20 k b pの大きさの分 子の分画を試みた。 すなわち、 曰立 RP S 40— Tローターに合う遠心管 に 1. 25〜5MONa C 1密度勾配を作り、 200 1の DNA (約 1
60 g) をゆっく りとのせ、 35000 r pmで、 3時間、 日立 S CP
7 OH超遠心機で超遠心を行った。 遠心後、 エツペンドルフチューブに、 2 5 0 Iづっ分画して、 そのうち 3本に 1本から 20 1 とり、 0. 4 %ァガロースゲル電気泳動に供し解析したところ、 フラクショ ン No. 1 8〜21が適当な大きさの DN A分子を含むと考えられたので、 このうち フラクション No. 20の DNAO. 3 / g、 0. 6 gおよび 1. 2 β gを、 A G EMI 1アーム （プロメガ社製） 1. 0 g溶液を足し 8〃 1 の溶液にした後、 TaKaRa DNAライゲーシヨン ·キッ ト V e r. 2 (宝酒造社製） の I I液 8 し I液 16 Iを加え、 26°Cにて 10 分間ライゲーシヨンを行った。 ライゲーシヨン後のサンブルは、 フエノー ル抽出を 2回行った後、 エタノール沈殿を行った。 その後、 全貴をインビ トロパッケージングキッ ト （ストラタジーン社製） によりパッケージング しこれを宿主菌ィー · コリ LE 392に感染することによりァズキのゲノ ム DNAライブラリ一を得た。 このライブラリ一のタイターを測定したと ころ、 そのタイターは、 1. 1 X 105Ρ ί u/m 1であった。
(2) ライブラリーのスクリーニング
実施例 6で得られたゲノム DN A断片を、 B c a BE STTMラベリング キッ ト （宝酒造社製） を用いて （α— 32 P) dCTPで標識し、 ハイプリ ダイゼーシヨンのプローブとした。 このプローブを用いて、 上記で作製し たゲノム DN Aライブラリ一について実施例 5と同様にして、 プラークハ イブリダィゼーシヨンを行った。 ハイブリダィゼ一シヨン後、 メンブラン は 2xSSC、 0. 1%SDSを含む洗浄液で、 室温、 20分間 3回洗浄 し、 続いて lxSSC、 0. 1%SDSを含む洗浄液で 50°C、 20分間 1回洗浄した。 すなわち、 角型のシャーレに、 1枚当たり 1 X 104個の プラークがでるようにブレー卜にファージをまいて合計 20枚、 すなわち、 2x105個のファージからスクリーニングした結果、 21個の陽性シグ ナルが得られ、 次に、 それぞれより陽性クローンを単離するために 2次ス クリ一二ングを行った。
2次スクリーニングは、 1次スクリーニングで得られた 21個の陽性シ グナルを示すブラークよりとつたファージ液を、 角型シャーレに 1枚当た り約 300のプラークができるように、 なるべく疎にファージをまき、 プ ラークハイプリダイゼーションを行った。 2次スクリ一二ングのプローブ は、 1次スクリーニングの時と同じ実施例 6で得られたゲノム DNA断片 およびァズキ EXT c DNAの配列で、 他のアイソザィム （ァズキ EXT 2、 ァズキ EXT3) などのファミ リー遺伝子と相同性の低い、 5' —ノ ンコード領域をもとに合成したオリゴヌクレオチド VAN— U 7 (配列番 号 17) を用いた。 ゲノム DNA断片をブローブとした場合は、 1次スク リーニングと同様にハイブリダィゼーシヨ ン、 洗浄を行った。 オリゴヌク レオチド VAN— U 7をブローブとした場合は、 実施例 6の場合と同様の 方法で行った。
2次スクリーニングで得られた 10個の陽性シグナルを示すプラークよ り、 シグナルの強い 1個を選んで 3次スクリーニングを行った。 し力、し、 このシグナルが強い 1つは、 2次スクリ一二ングにもかかわらず約 100 ◦プラーク中 1つしかなかった。 しかも、 その 1つのプラークは、 非常に 小さいものであった。 これを用いて、 さらに純化増殖する為に 3次スクリ 一二ングを行った。 3次スクリーニングは、 丸形 （Φ90πΊΐη) シャーレ に 1枚当たり 100〜200プラークになるように 6枚まいた。 これを用 いて、 2次スクリーニングの時と同様にハイブリダィゼーション洗浄を行つ た。 この結果、 一見したところではシグナルと認められるプラークの位置 は対応しな t、が、 注意深くプレートを観察してみるとシグナルに対応する 位置に針の先位の非常に小さいプラークがあることが確認された。 このプ ラークを用いて、 注意深くブレー卜ライゼ一ト法でファージ DNAを抽出 した。 該プラークのファージベクターに挿入されている DN A断片を抽出 して、 約 11 k b pの長さの DNA断片を得ることができた。
この DNA断片を制限酵素 EcoR I— Hind IIIで 2重消化して、 実施例 6 のァズキ E XT遺伝子ゲノム DN A断片をプローブにし、 サザンハイプリ ダイゼーションを行うことにより、 この遺伝子のプロモーター領域を含む さらに短い DN A断片を特定することができた。 この DN A断片の挿入さ れたプラスミ ドを用いて塩基配列解析を行い、 この断片をァズキ EXT遺 伝子 cDNAの配列と比較することにより、 この DNA断片が、 ァズキ E XT遗伝子のプロモーターを含むかどうか判明した。 該断片の制限酵素地 図を図 1に示す。 また、 該断片の塩基配列の一部を配列表の配列番号 20 に示す。 この断片を pU C I 1 8 (宝酒造社製） の EcoE I、 Hind IIIサイ 卜に組込んだブラスミ ドは、 P VXP 101と命名され、 p VXP 101 で形質転換されたィー ' コリ J Ml 09株は、 Escherichia coli JM109 pVXPlOl と命名、 表示され、 ブダペスト条約に基づき、 平成 7年 2月 23 曰 （原寄託曰） に、 曰本国茨城県つくば市東 1丁目 1番 3号の通商産業省 工業技術院生命工学工業技術研究所に受託番号 FERM BP— 5389 の下に寄託されている。 実施例 9
ァズキ幼植物体を用いたノーザンハイブリダイゼーション
(1) total RNAの調製
ァズキの播種後、 5日目、 および 40曰目の植物体を用いて、 茎、 芽、 子葉、 葉からとった組織をまとめて、 液体窒素中で凍結し、 RNAの抽出 操作を行うまで一 8 CTCで保存した。 凍結細胞から、 それぞれグァニジン チオシァネート/フユノール法を用いて、 total RNAを抽出した。 すな わち、 凍結細胞 1 gを 2. 5 m】のグァニジンチオシァネート溶液 [1 0 0 gのグァニジンチオシァネー卜と 1. 47 gのクェン酸ナトリゥ厶ニ水 和物を水に溶かして 200m 1 とし、 4 °Cに保存したものを、 使用前に 1 m 1に対して、 Ί β 1のメルカプトエタノールと 5 m gのラウロイルサル コシンナトリウムを加える] を加えたチューブに入れ、 ポリ トロンで 5分 間粉砕抽出し、 2. 5m 1のフヱノール： クロ口ホルム：イソアミルアル コール （25 ： 24 ： 1) を加え、 緩やかに約 15分間、 混合した後、 3 000 r pm、 10分間遠心分離した。 次に、 この水層に 2. 5m lのフエ ノール： クロロホルム：イソアミルアルコール （25 : 24 : 1) を加え、 よく授拌し、 この懸濁液を遠心して水層を分離し、 これを 2回繰り返した。 次に、 この水層に 2 · 0m 1のフエノール： クロロホルム ： イソアミルァ ルコール （25 : 24 : 1) を加え、 よく攪拌し、 この懸濁液を遠心して 水層を分離し、 この水層に、 3 M酢酸ナトリウムとエタノールを加えて遠 心分離することにより RNAの沈殿を得た。 この沈殿を 2m 1のトリス一 SDS溶液 [50mMトリスー HC 1 (pH9. 0) 、 1%SDS] に完 全に溶かし、 2m 1の飽和フユノールを加えたチューブに入れ、 よく振逢 し、 この懸濁液を遠心して水層を分離した。 この水層に水飽和フユノール 2 m クロ口ホルム： イソアミルアルコール （49 ： 1) 2m 1を順次 加え、 よく攪拌し、 この懸濁液を遠心して水層を分離した。 次に、 この水 層に、 クロ口ホルム： イソアミルアルコール （49 ： 1 ) 2m 1を加え、 よく攪拌し、 この懸濁液を遠心して水層を分離した。 この水層に、 3M酢 酸ナトリウムとエタノールを加えて遠心分離することにより RNAの沈殿 を得た。 この沈殿を 0. 5ml滅菌水に完全に溶かし、 吸光度を測定して 濃度を lmgZm〗に合わせ、 これに 1Z4容の 10M塩化リチウムを加 えて混合し、 4°Cに 2時間静置した後、 遠心分離し沈殿を得た。 これを 1 m 1の滅菌水に完全に溶かし、 3M酢酸ナトリウ厶とエタノールを加えて 遠心分離することにより R N Aの沈殿を約 0. 6 m g得た。
(2) ノーザンハイブリダィゼーシヨン
ノーザンハイブリダイゼ一ション用のプローブは、 ァズキ EXT遺伝子 cDNAの断片 [欧州特許公開第 0562836号 A 1公報 （1993) ] を、 B c a BESTTMラベリング ·キッ ト （宝酒造社製） を用いて （α— 32P) dCTPで標識し、 作成した。
ノーザンハイブリダィゼーションは、 モレキュラー ' クローニング 'ァ · ラボラ トリー ·マニュアル、 第 2版、 第 7章、 第 39〜52頁 （T. マ二 ァテイスら著、 コールド♦スプリング ·ハーバー社、 1989年発行） に 記載の方法に従い、 以下の方法で行った。 すなわち、 抽出した RN A全量 を、 ホルムアルデヒ ド · ランニングァガロースゲル （1%) で電気泳動し た後、 酢酸アンモニゥム溶液中で中和し、 ナイ口ンメンブラン （ハイボン ドー N) に一晩ノーザンブロッ トした。 紫外線トランスイルミネーター (254 nm) に 5分間照射させ、 RNAを固定した。 このメ ンブランを ブレハイブリダィゼ一シヨン緩衝液 [50%ホルムアルデヒ ド、 0. 65 MN a C K 0. lMNa-P I PES (pH6. 8) 、 5 xデンハルツ 液、 0. 1%SDS、 5mMEDTA、 100 / gZm Iサケ精子 D N A] 20011中で42て、 3時間ブレハイブリダィゼーシヨンを行った。 上記 の方法で調製した32 P標識プローブをハイプリダイゼーシヨン緩衝液 [5 0%ホルムアルデヒ ド、 0. 65MNaC】、 0. lMNa— P I PES (p H 6. 8) 、 5xデンハルツ液、 0. 1%SDS、 5mMEDTA、 10%硫酸デキストラン] 20mlに加え、 このプローブ溶液にブレハイ プリダイゼ一ションを行ったメンブランを移し、 42。Cで一晚ハイプリダ ィゼーションを行った。
ハイブリダィゼーシヨ ンの後、 メンブランを 2xSSC、 0. 1 %S D Sを含む洗浄液で 50て、 20分間 3回洗浄した。 メンブランは乾燥させ た後、 X線フィルム （コダック社製） を入れたカセッ ト内で一 80°Cで一 晚感光させ、 オートラジオグラフィーをとつた。
その結果、 茎に特異的に EXT遗伝子の発現が見られ、 特に伸長成長し ている部分に強く発現しているのが確認された。 実施例 10
タバコ培 *細胞を用いたノーザンハイブリダイゼーション (1) total RNAの調製
タバコ B Y2培養細胞の培養 1、 4、 6、 8、 10曰目の細胞をァスピ レーターでブフナーロート上に吸引ろ過して細胞を集めた。 この時、 液体 培地がまったく残らないように、 培地が口一ト上でなくなつてから 10〜 30秒間吸引した。 培地がなくなったら、 すばやく約 1 g秤量し回収し、 直ちに液体窒素中で凍結し、 RN Aの抽出操作を行うまで一 80°Cで保存 した。 凍結細胞を、 2mlの抽出液 [200mMトリス一 HC 1 (pH9. 0) 、 10 OmMN a C 10mMEDTA、 0. 5%SDS、 14m M2—メルカブトエタノール] と 2m 1の抽出液飽和フヱノールを加えた チューブに入れ、 ポリ トロンで 5分間粉砕抽出し、 クロ口ホルム ： イソァ ミルアルコール （49 ： 1) 2mlを加え、 さらにポリ トロンで 1分間よ く攪拌し、 この懸濁液を遠心して水層を分離した。 次に、 この水層に水飽 和フヱノール 2 m 1、 クロロホルム：イソアミルアルコール （49 ： 1 ) 2mlを順次加え、 よく攪拌し、 この懸濁液を遠心して水層を分離し、 こ れを 2回繰り返した。 この水層に、 クロ口ホルム：イソアミルアルコール (49 : 1) 2 m 1を加え、 よく «拌し、 この懸濁液を遠心して水層を分 離し、 この水層に、 3M酢酸ナトリウムとエタノールを加えて遠心分離す ることにより RNAの沈殿約 0. 7mgを得た。
(2) ノーザンハイブリダィゼーシヨン
ノーザンハイブリダイゼーション用のブローブは、 タバコの E XT遗伝 子 cDNA (特開平 7— 79778号公報） および実施例 4に示したファ ミ リー遗伝子タバコ XRP 1の cDNA断片 （配列番号 16) を、
B c aBESTTMラベリング ·キッ ト （宝酒造社製） を用いて （α— 32P) dCTPで標識し、 作製した。 ノーザンハイブリダィゼーシヨンは、 実施例 9の （2) の方法と同様に 行った。 その結果を図 3に示す。 すなわち図 3は EXTおよび XRPの発 現を示す図であり、 図中、 上段はタバコ EXTの mRNAの発現量、 中段 はタバコ XRPの mRNAの発現量、 下段は r RNAの量を示す。
図 3から分かるように、 培養 1曰目からタバコ E XT遗伝子の発現が見 られ、 4日目にピークとなっているのが確認された。 これとは逆に、 実施 例 4に示した EXT遺伝子のファミ リー遺伝子であるタバコ XRP 1遺伝 子は、 培養 1曰目および 6日以降に強く発現していた。
また、 これと同時にタバコ BY2培養細胞の成長曲線を、 細胞数および パック ド ·セル .ボリューム （P C V) を測定することにより、 描いた。 細胞数は、 タバコ BY 2培養細胞を 1%セルラーゼ ·オノズカ RS (ャク ルト本社製） 、 0. 1%ぺク トリアーゼ Y 23 (盛進製薬社製） 、 0. 4 Mマンニトールを含む酵素液 （pH5. 5) を用いて 30でで 2時間処理 することにより、 細胞壁の除いたプロ トブラストにし、 血球計算盤でプロ トプラストの数をカウントすることで求めた。 また、 PCVは、 タバコ B Y 2培養細胞の培養懸濁液 10m 1を 15m 1の目盛付き遠心管にとり、 スイングローターで、 2000 rpm、 5分間遠心分離し、 細胞ペレッ ト の体積を測定することで求めた。 また、 いずれも、 n = 5の平均値をグラ フに示した。 その結果を図 4に示す。 すなわち図 4はタバコ BY— 2細胞 培養の增殖を示す図であり、 図中、 縦軸は PC V {%) を、 横軸は時間 (曰） を示す。
図 3および図 4の結果より、 いずれの時期でもタバコ E XT遗伝子は発 現しているが、 特に対数增殖期の初期での発現が著しいことが示された。 また、 実施例 4に示した E XT遗伝子のファミ リー遺伝子であるタバコ XRP 1遗伝子は、 誘導期や定常期に発現が著しいことが示された。 実施例 11
タバコ培養細胞を用いた卜ランジヱン卜アツセィ
(1)導入用のブラスミ ドの構築
力リフラワーモザィクウイルスの 35 Sプロモータ一、 ィー ' コリ由来 の GUS遗伝子、 ノパリンシンテターゼに由来する転写終止配列カセッ ト を持つ pB 1221 (クロンテック社製） を用いて、 まずこのプラスミ ド の EcoE Iサイ トをなくすために、 制限酵素 EcoR Iで完全消化した後、 DN Aブランティング ·キッ ト （宝酒造社製） を用いて末端を平滑化し、 セル フライゲーシヨンした後、 ィー 'コリ JM109株に形質転換した。 この プラスミ ドを、 p B I 221 E Lと命名し、 p B I 221 E Lで形質転換 されたィ一. コリ JM109株を、 Escherichia coli JM109ZpBI221ELと 命名した。 このブラスミ ドのカリフラワーモザイクウィルスの 35 Sプロ モーター領域を除くために、 このプラスミ ドを制限酵素 Hind III、 Xba I で消化後、 ァガロースゲル電気泳動により 35 Sプロモーター領域以外の 目的のフラグメントを切り出し精製した。
次に、 実施例 6で作製した pVXG 303を铸型とし、 センスブライマ 一として VAN— UHE (配列番号 29) を、 また、 アンチセンスプライ マーとして VAN— LX (配列番号 30) を用いて PCRを行った。 反応 は 94°C (1分） 、 55。C (2分） 、 72°C (3分） のサイクルを 10回 繰返した。 このフラグメントを 2. 5%ァガロースゲル電気泳動により、 分離回収して、 上記 p B I 221 E Lの Hind III、 Xba Iサイ 卜にライゲ ーシヨンした後、 ィー · コリ J Ml 09株に形質転換した。 このブラスミ ドを、 pEXT厶 EGUSと命名し、 pEXTAEGUSで形質転換され たィー . コリ JM109株を、 Escherichia coli JM109ZpEXTAEGUSと命 名した。
次に、 pEXTAEGUSを制限酵素 Hind IIIで完全消化した後、 DN Aブランティ ング ·キッ ト （宝酒造社製） を用いて、 末端を平滑化した。 この DN A断片を制限酵素 EcoR Iで完全消化した後、 B A P処理を行い末 端を脱リン酸ィヒし、 ァガロースゲル電気泳動により精製した。
—方、 実施例 Ίで作製した pVXP— H3を制限酵素 Xba I (宝酒造社 製） で完全消化した後、 上記と同様に末端を平滑化し、 制限酵素 EcoR Iで 完全消化した。
ァズキ EXT遺伝子の Xba Iサイ トから EcoR Iサイ 卜までのプロモータ 一領域を含む約 960 b pの DNA断片をァガロースゲル電気泳動により、 精製を行った後、 上記の p EXTAEGUSの DNA断片とライゲーショ ンを行い、 ィー · コリ JM109株に形質転換した。 このブラスミ ドを £ 丁厶 〇115と命名し、 p EXT厶 XGUSで形質転換されたィー コリ J Ml 09株を、 Escherichia coli JillOgZpEnAXGUSと命名した。 pEXTAEGUSを制限酵素 Hind ΠΙ、 EcoR Iで完全消化した後、 実 施例 7で作製した pVXP— H 3を制限酵紊 Hind III、 EcoR Iで完全消化 したプロモーターを含む DN A断片とライゲーシヨンした後、 ィー · コリ J Ml 09株に形質転換した。 このプラスミ ドを pEXTGUSと命名し、 pEXTGUSで形質転換されたィー · コリ JM109株を、
Escherichia coli JMlOS/pEXTGUSと命名した。
(2) エレク トロボレーションによる遗伝子導入
エレク ト口ポレーション法を用いて上記で作製した p EXTAEGU S、 p EXT厶 XGUS、 pEXTGUSおよびコン トロールとして G US遗 伝子のカセッ トのみを持ち、 プロモーターを持たない ρ B 1 101 (クロ ンテック社製、 図 5中は pGUSと表示） とカリフラワーモザイクウィル スの 35 Sプロモーターおよび GU S遺伝子を持つ p B 1221 (クロン テック社製） を用いて、 それぞれをタバコ BY 2培養細胞に導入した。 まず、 タバコ BY 2培養細胞を、 1%セルラーゼ 'オノズカ RS (ャク ルト本社製） 、 0. 1%ぺク トリアーゼ Y 23 (盛進製薬社製） 、 0. 4 Mマンニトールを含む酵素液 （ρΗ5. δ) を用いて 30°Cで 2時間処理 することにより、 細胞壁の除いたプロ 卜プラストにした。 2x l 06個の タバコ BY 2培養細胞プロトプラストを、 エレク トロボレーション緩衝液
(7 OmMKC 1 5mMMES、 0. 3Mマンニトール、 pH5. 8) に懸濁し、 それぞれのブラスミ ド DNA3pmo 1と 10%PEG600 0ノエレク ト口ポレーシヨン緩衝液を加えて混合し、 ジーンパルサー I I
(バイオ ·ラッ ド社製） を用いて、 電気パルス （300 V、 125^F) を与え、 植物細胞内に DN Aを導入した。
導入後 40時間、 オーキシンとして 0. 2mgZ】 2. 4— D、 1%シュ 一クロース、 0. 4Mマンニトールを含むリ ンスマイヤー ' スクーグ培地
[フイジォロジァ ·ブランタルム、 第 18巻、 第 100頁 （1965) ] で、 26てで培養した細胞を回収し、 回収した細胞に抽出緩衝液 [50m Mリン酸緩衝液 （pH7. 0) 、 1 OmMEDTA, 0. 1%トリ トン X 一 100、 0. 1%サルコシル、 10mM2—メルカブトエタノール] 2 0 1を加えて、 エツペンチューブに移し氷上で超音波破碎機 W— 22 5 (ヒートシステムズ一ウルトラソニックス社製） を用いァゥトプッ ト · コントロールを 1. 5、 デューティサイクルを 50%として 30秒間超音 波破砕した。 その後、 遠心分離し、 その上清を G US活性測定およびタン パク量の測定に用いた。 (3) プロモータ一活性の測定
抽出液 30 1を蛍光用の 96穴マイクロタイタープレートにとり、 こ れに抽出緩衝液 45 】 と基質 4πιΜ4— MUG 2 δ 】を加えて反応さ せた。 5、 35、 95分後に、 反応停止液 （lMNa2C03) 50 1を 加えて反応を停止した。 そして、 蛍光プレートリーダー [フルォロスキヤ ン I I (ラボシステムズ社製） ] で励起波長 36 δ ητη、 蛍光波長 4 δ 5 nmの条件で反応産物 4一 MUの発する特異的な蛍光を測定した。
また、 タンパク量の測定は、 抽出液の 1 5希釈液および 800 / gZ m 1 B S A標準液 （抽出緩衝液 20 1に BSAlmgZm l 80^ 1を 加える） を 2、 5、 10、 15、 20、 30 n Iを 96穴マイクロタイタ 一プレートにとり、 それぞれに蒸留水 158、 155、 150、 145、 140、 1 30 β \ とバイオラッ ドプロティンァッセィキッ ト定量試薬 (バイオ ·ラッ ド社製） 40/ 1を加え、 静かに援拌した後、 室温で 20 分間放置し、 その後 60分以内にプレートリーダー （波長 590 nm) で 測定することにより、 タンパク量を定量した。
GUS活性は、 上記測定の際に、 同時に 4一 MU標準液の蛍光強度を測 定し、 その結果を、 横軸に 4一 MU量 （pmo I ) 、 縱軸に蛍光強度とし てグラフにプロッ 卜した後、 その傾きを求めることにより 1蛍光強度当た りの 4一 MU量を求め、 さらに、 試料で行った結果を、 横軸に時間 （分） 、 縦軸に蛍光強度としてグラフにプロッ 卜し、 蛍光強度の增加速度を求める ことにより、 4一 MUGの分解速度 =GUS活性を求めた。 さらに、 タン パク量より、 GUSの比活性を求めた。 その結果を図 5に示す。 すなわち 図 5は形質転換タバコ BY 2培養細胞を用いた E XTプロモーター活性の 測定を示す図であり、 図中、 棒グラフの部分は、 各ブラスミ ドを導入した 際の GUS特異活性 （pmo 14MU/分 Zmgタンパク） を示し、 下部 は各ブラスミ ドのプロモーター領域の制限酵素地図を示す。
図 5に示したように、 この E XT遺伝子のプロモーター領域を含む DN A断片は、 植物内で強い発現を示すといわれるカリフラワーモザイクウイ ルスの 35 Sプロモーターよりも強い活性を示すことが確認できた。 実施例 12
形質転換シロイヌナズナを用いた組織特異性の検出
(1) 導入用プラスミ ドの構築
導入用プラスミ ドを得るために、 図 6、 図 7に示すように、 カリフラヮ 一モザィクウィルスの 35Sプロモーター、 ィー ' コリ由来のィントロン を含んだ G US遗伝子、 ノパリンシンテターゼに由来する転写終止配列力 セッ ト、 さらにマーカー遺伝子としてハイグロマイシン （HPT) 、 カナ マイシン （NPT I I )耐性遺伝子を持つバイナリベクター p B I— H I - 3 δ S I G [ブラント ' アンド 'セル ' フィ ジオロジー （Plant and Cell Physiology) 、 第 31巻、 第 80 δ~813頁 （1990) ] を制 限酵素 Hind III、 SnaB I (宝酒造社製） で消化後、 ァガロースゲル電気泳 動により 3 δ Sプロモーター領域以外の目的のフラグメントを切り出し精 製した。 次に実施例 11で作製した pEXTGUSおよび上記の p E X TAXGUSのそれぞれのブラスミ ドを制限酵素 Hind III、 SnaB Iで消化 後、 ァガロース電気泳動により、 ァズキ EXT遺伝子のプロモーター領域 を含むフラグメントを切り出し、 精製した。 これらのフラグメントをそれ ぞれ上記の P B I— H I— 35 S I Gの Hind III、 SnaB Iサイ トにライゲ ーシヨンした後、 ィー ' コリ JM109株に形質転換した。 これら導入用 ブラスミ ドをそれぞれ p B VEG 101、 p B VEG 121と命名し、 こ れらのブラスミ ドによって形質転換されたィー · コリ J Ml 09株をそれ ぞれ、 Escherichia coli JM109/pBVEG10K Escherichia coli JM109/ PBVEG121と命名した。
また、 図 8、 図 9に示すように、 GUS遗伝子のカセッ トのみを持ち、 プロモーターを持たない p B I 101 (クロンテツク社製） 、 および力リ フラワーモザイクウィルスの 3 δ Sプロモーターを持つ ρ Β I 121 (ク ロンテック社製） の Hind III、 SnaB Iフラグメントを、 上記と同様の方法 によって p B I— H I— 35 S I Gの Hind III、 SnaB Iサイ 卜にサブク口 一二ングすることによってコントロール実験用のプラスミ ドを得た。 得ら れたプラスミ ドを pB I— H— 101、 p B I -H- 121と命名し、 こ れらのブラスミ ドによって形質転換されたィー · コリ J Ml 09株を Esch erichia coli J 109/pBI-H-10K Escherichia coli JM109ZpBI- H-121と 命名した。
(2) 感染用ァグロバクテリゥムの形質転換
上記のそれぞれのブラスミ ドとァグロバクテリゥム ·チュメファンェン ス (Agrobacterium tumefaciens) EHA 101コンビテン 卜セノレ [植物 細胞工学、 第 4卷、 第 3号、 第 193〜 203頁 （1992) ] を混合し、 ジーンパルサー I I (バイオ ·ラッ ド社製） を用いて、 電気パルス （2. 5 kV、 25 F、 200 Ω) を与え、 30°C、 2日間培養し、 ァグロバ クテリウム内にプラスミ ドを導入した。 各ブラスミ ドによって形質転換さ れたァグロバクテリゥムをそれぞれ、 Agrobacterium tumefaciens EHAlOl /pBVEGlOU Agrobacterium tumefaciens EHA101/pBVEG121、
Agrobacterium tumefaciens EHAlOlZpBI - H - 101、 Agrobacterium tumefaciens EHAlOlZpBI-H-121と命名した。 (3)形質転換植物の作製
ァラビドブシス ' タリアナ （Arabidopsis thaliana) のェコタイプであ る W Sの種子 [ノ トリンガム ·ァラビドブシス ' ストック 'センター
(Notlingham Arabidopsis Stock Center： NASC) より入手可能] を 20 %次亜塩素酸で表面殺菌した後、 MS 0プレート [厶ラシゲ ' スクーグ無 機塩類 （MS、 和光純薬社製） に 2%スクロース、 3mg_ 1チアミン塩 酸塩、 5mgZ】ニコチン酸、 0. 5mgZ】 ピリ ドキシン塩酸塩を加え た後、 pH6. 3にあわせ、 0. 2%ジエランガムを加え、 オートクレー ブした後、 ブレーティングしたもの] に播種し、 4°C、 2日間の低温処理 後、 22て、 30001 ux、 連続光で栽培した。 播種後 1週間、 2週間 目にそれぞれ新しい MS 0ブレー卜に植えかえ、 2週間目の植えかえの 2 曰後に 3〜4株を束にして約 1 cmの根の切片を作製する。 根の切片は C I Mブレート （MS 0プレートに 0. 5mgZ12, 4—ジクロロフエノ キシ酢酸、 0. 0 SmgZ 1力イネチンを加えたもの） に並べ、 22。 、 30001 ux、 連続光で 2日間培養した。 その後、 （2) で得られたァ グロパクテリゥムを 30てで 2日間培養し、 MS液で 5倍に希釈した液に、 2日間培養した根の切片を 30秒浸し、 余分な水分を吸い取った後、 新し い C IMプレートに並べ、 2日間培養した。 2日後、 感染させた切片を S I MCプレート （MS 0プレートに 5m 1 N 6— 2—イソペンテニル アデニン、 0. 15mg/ 1インドール酢酸、 0. 3gZlカルべニシリ ンを加える） に移し、 2日間培養した後、 S IMCSブレート （S IMC ブレートに 5 Omg / 1カナマイシン、 2 OmgZ 1ハイグロマイシンを 加える） に移植した。 以後、 シュートが再生するまで 1週間に 1〜2回、 新しい S I MC Sブレー卜に植えかえを行った。
シュートの再生が認められ、 再生植物体が 5 mm程度で完全なロゼッタ 葉を示すようになったら、 カルスより植物体を切り取り、 R I Mプレート (MS 0プレートに 0. SmgZ 1インドール酢酸を加える） に軽く乗せ 挿す。 発根が認められた個体はロックウールに定植し、 ハイボネックス (ハイボネックス · ジャパン社製） を水で 1000倍希釈した液で栽培し、
T 2種子を得た。
(4) 組織特異性の検出
(3) で得られた T 2植物を MS KHプレー卜 （MS 0プレートに 50 mgZlカナマイシン、 S OmgZ lハイグロマイシンを加える） 上に播 種し耐性株を選択した。 耐性株はロックウールに定植し、 ハイポネックス (ハイポネックス · ジャパン社製） を水で 1000倍希釈した液で栽培し た。
播種より約 30曰後、 花を付け、 鞘のできかけてきた植物体の地上部の 1部を切り取り、 サンプルとした。 切り取った植物体は、 固定液 （20% パラホルムアルデハイ ド、 0. 1Mリン酸バッファー、 lmMEDTA、 pH7. 0) に室温で 1時間浸した後、 0. 1Mリン酸バッファーで 2回 洗浄し、 基質液 [2mMX— G】 u c、 5 OmMリン酸バッファー （pH 7. 0) 、 0. 5%トリ トン X— 100、 20%メタノール] に浸した。 基質液の浸透を良くするために 25分間脱気した後、 37てで 1〜3日間 反応させた。 反応後、 水洗い、 Ί 0%エタノール洗いの後に 40%グリセ ロールに浸して観察、 保存した。
反応の結果、 野生型および p B I一 H— 101を導入した植物体では G USによる特異的な染色は見られず、 それに対し、 pB I一 H— 121 (力リフラワーモザイクウィルスの 35 Sプロモータ一） を導入した植物 体では全ての組織で染色が認められた。 —方、 ァズキ EXT遺伝子のプロモーター領域を含む P BVEG 101、 p B VEG 121を導入した植物体では、 茎の伸長部位、 葉、 莢の先端、 雌しべの先端などに G U Sによる染色が見られ、 これらの部位に強いプロ モーター活性があることが確認された。 これらの結果のうち、 野生株、 pB I— H— 121、 p BVEG 101の結果を図 10に示す。 実施例 13
ァズキゲノム DN Aの Hind III、 Nsp V、 Xba I断片を铸型とするインバ ース PC Rによるァズキ E XT 2遺伝子のプロモーターの単離
実施例 5と同様にァズキの葉より調製したゲノム DN A 1 ;tz gをそれぞ れ别々のチューブにとり、 制限酵素 Hind III、 Nsp V、 Xba Iを用いて完全 消化し、 フユノールクロロホルム抽出を 1回行うことにより酵素を完全に 失活させ、 エタノール沈殿した。 エタノール沈殿した DN Aに 268 1 の蒸留水、 30 1の 1 Oxライゲーシヨン緩衝液、 2〃 1の T4DNA リガーゼ （宝酒造社製） を加え、 16°Cで 1晚反応することによりセルフ ライゲーシヨンした。 得られた環状ゲノム DN A 0. 1 gを铸型にして、 センスブライマーとしてブライマー I P44— 3 (配列番号 31) 、 アン チセンスプライマーとしてブライマー I P44— 5 (配列番号 32) を使 用して、 TaKaRa LA PCR キッ ト （宝酒造社製） により P C Rを行った。 反応は 94 C (1分） 、 98°C (20秒） 、 67。C (10分） のサイクルを 30回繰り返し、 72°C (10分） で終わった。 反応の後、 反応液の 5// 1を 1%ァガロースゲル電気泳動したところ、 制限酵紫 Hind ΠΙで消化したサンブルにのみ、 約 6. 0 k b pのバンドが確認された。 他のサンプルでは、 この反応では增幅は確認されなかった。 次いで、 制限 酵素 Hind IIIで消化したサンブルにおいてのみ 100倍希釈して、 他はそ のままの反応液、 1 H 】を铸型として、 センスプライマーとしてプライマ 一 I P 44 - 2 (配列番号 33) 、 アンチセンスプライマーとしてプライ マー I P 44— 5 (配列番号 32) を用いて同様に P CRを行った。 反応 後、 反応液 5 1を 1%ァガロースゲル電気泳動により解析したところ、 制限酵素 Hind IIIで消化したサンプルにおいては、 約 6. Okbpのバン ドが非常に強く、 特異的に増幅されていることを確認した。 制限酵素 Nsp Vで消化したサンプルでは多数の非特異的と思われる DN A断片が増幅し ているが、 約 1. 2 k b pがメインバンドと思われた。 制限酵素 Xba Iで 消化したサンプルにおいては、 多数の非特異的と思われる DN A断片が增 幅しており目的断片の同定は困難であった。 そこで、 制限酵素 Hind IIIで 消化したサンプルにおいて、 1回目の P CRで得られた DNA断片をゲル より回収した後、 DNAブランティング ·キッ ト （宝酒造社製） を用いて 末端の平滑化を行い、 さらに 5' 末端標識キッ ト MEGALABELTM (宝酒造社製） を用いて PCR産物の 5' 末端のリン酸化を行い、 pUC 118の Hinc IIサイ 卜に導入し、 このプラスミ ドをィ一 · コリー J M 1 09に形質転換したが、 コロニーは得られなかった。
そこで、 この約 6. 0 k b pの P CRフラグメントの制限酵素地図を作 成して、 プロモーター領域を明らかにした後、 幾つかのフラグメントに分 けてサブクローニングすることにした。
まず、 この PCRフラグメントを末端の平滑化を行った後、 制限酵素 Hind IIIで消化したところ約 3. l kbpと約 2. 9 k bpのバンドに分 かれた。 この DN A断片を同時に入れて、 pUC118の Hind III— Hinc IIサイ 卜にライゲ一ションした後、 ィー ' コリー J Ml 09に形質 転換したが、 得られたプラスミ ドは、 2. 9 k b pの挿入断片が入ったも ののみで、 約 3. 1 k b pのものは、 得られなかった。 しかも、 プライマ - I P44-2 (配列番号 33) と Ml 3プライマー M 4 (宝酒造社製） の PCR、 ならびにプライマー I P44— 6 (配列番号 34) と Ml 3プ ライマー M 4 (宝酒造社製） の PC Rを行ったところ、 プライマー I P4 4-6 (配列番号 34) と Ml 3プライマー M4でのみ増幅され、 この 2. 9 k b pの挿入断片はァズキ EXT2遺伝子の 3' 下流領域を含み、 プロ モーター領域を含むのは 3. 1 k b pのフラグメントであることが明らか になった。
ブライマー I P44— 3と I P44— 5により增幅した約 6. Ok bp の PC Rフラグメン卜の制限酵素地図を、 図 11に示す。 図中、 制限酵素 地図の上部はプライマー I P 44— 5の塩基配列に相当し、 下部はプライ マー I P 44— 3の塩基配列に相当する。
次に、 この約 6. 0 k b pのフラグメント上に 2力所の EcoR Iサイ ト力く あることから、 PCRフラグメントを末端の平滑化を行った後、 制限酵素 Hind III、 EcoR Iで消化したところ約 0. 4kbpと約 0. 5 k b pと約 2. 55 k b pのバンドに分かれた。 制限酵素地図 （図 11) より、 約 0. 5 k bpと約 2. 55 k b pにプロモーター領域があることから、 それぞ れ、 pUC 118の EcoR I-Hinc IIサイ ト、 EcoR I— Hind IIIサイ 卜に ライゲーシヨンした後、 ィー ' コリー JM109に形質転換した。
得られたコロニーのうち、 EcoR I-Hinc IIサイ 卜のものについては、 コロニー 16個をブライマー I P44— 2 (配列番号 33) と M13ブラ イマ一 M4 (宝酒造社製） の PCRでスクリーニングしたところ、 7個が ポジティブであった。 そのうち、 3コロニーについて、 ブラスミ ドを抽出 して、 それぞれ pVX2P501、 pVX2P503、 p VX2 Ρ δ 05 と名付けた。
pVX2P501、 pVX2P503、 pVX2P505を、 M13ブ ライマー M4 (宝酒造社製） と Ml 3プライマー RV (宝酒造社製） を用 いて、 サンガーの方法に従って、 それぞれの挿入断片部分の塩基配列を解 読したうえ、 これらの結果を総合して P VX2 P 501、 VX2 P 50 3、 p VX2 P 505に含まれる挿入断片の塩基配列を決定した。 この配 列は、 もとになつたァズキ EXT2 c DNAの配列 （配列番号 11) と比 較するとオーバ一ラップ部分はまったく同じであった。 また、 3種のクロ ーンとも、 全く同じ配列であった。
EcoR I一 Hind IIIサイ 卜のものについては、 コロニー 46個を Ml 3プ ライマー (宝酒造社製） と Ml 3プライマ一 RV (宝酒造社製） の P CRでスクリーニングしたところ、 27個が約 2. 6kbpの挿入断片を 含むことが分かった。
次に、 これらの約 2. 6 k b pのフラグメントを制限酵素 Acc I (宝酒 造社製） で消化したところ、 3個が約 600 b pのフラグメントが現れ、 12個が約 500 b pのフラグメ ン卜が現れた。 先の制限酵素地図 （図 1 1) より約 600 b pのフラグメントが現れるものが、 プロモーター領域 を含むクローンであるので、 ポジティブの 3個について、 ブラスミ ドを抽 出して、 それぞれ p EXT2 ρ r 0 (F) f l、 p EXT2 p r o (F) f 2、 p EXT2 p ro (F) f 3と名付けた。
pEXT2p r o (F) f l、 p EXT2 p r o (F) f 2、 p EXT 2p r o (F) f 3を、 Ml 3プライマー M 4 (宝酒造社製） と Ml 3プ ライマー RV (宝酒造社製） を用いて、 サンガーの方法に従って、 それぞ れの挿入断片部分の塩基配列を一部解読した。 この結果、 3種のクローン とも、 全く同じ配列であった。 次に、 約 2. 55 k b pの挿入断片の全領 域をシークェンスするために、 pEXT2p r o (F) ί 3の EcoB Iサイ 卜に合成オリゴマー EZP s i t e (1) (配列番号 35) および合成ォ リゴマー E/P s i t e (2) (配列番号 36) を用いて作成した Pst I サイ トアダプターを導入した。 このことにより、 pEXT2 p r o (F) f 3上の EcoR Iサイ 卜の挿入断片と反対側に Pst Iサイ トのみを導入でき た。
さらに、 このプラスミ ドを制限酵素 Pst I、 EcoR Iで完全消化した後、 キローシークェンス (Kilo— Sequence) 用デレーンヨン ' キッ ト
(Deletion Kit. 宝酒造社製） を用いて、 EcoE Iサイ 卜から挿入断片側へ のデリーションのクローンを得た。 これらのうち適当な長さのデリーショ ンの起こったものをいくつか選び、 Ml 3プライマー M4 (宝酒造社製） と Ml 3ブライマー RV (宝酒造社製） を用いて、 サンガーの方法に従つ て、 それぞれの挿入断片部分の塩基配列を解読したうえ、 これらの結果を 総合して pEXT2 p r o (F) f 3に含まれる挿入断片の塩基配列を決 定した。
pVX2 P501、 p VX2 P 503. p VX 2 P 505に含まれる挿 入断片の塩基配列と pECT2 p r o (F) f 3に含まれる挿入断片の塩 基配列は、 ゲノム上で連続していることは、 この境界領域の PC Rならび にダイレク 卜シークェンスにより確認された。 このァズキ EXT2の N末 端ァミノ酸配列より上流のプロモーター領域約 3. 0 k b pの配列を、 配 列表の配列番号 3に示す。
実施例 14
ァズキゲノム DN Aの Hind III、 Nsp V、 Xba I断片を铸型とするインバ ース PC Rによるァズキ E XT 3遺伝子のプロモーターの単離
実施例 13と同様にして、 ァズキゲノム DN Aを制限酵素 Hind III、 Nsp V、 Xba Iを用いて完全消化し、 セルフライゲーシヨンしてできた環状 ゲノム DNAO. l i gを銬型にして、 センスプライマーとしてプライマ 一 I P 45— 3 (配列番号 37) 、 アンチセンスプライマーとしてプライ マー I P 45— 5 (配列番号 38) を使用して、 TaKaRa LA P CRキッ ト （宝酒造社製） により PCRを行った。 反応は 94°C (1分） 、 98°C (20秒） 、 67°C (10分） のサイクルを 30回繰り返し、 72 °C (10分） で終わった。 反応の後、 反応液の 5 1を 1 %ァガロースゲ ル電気泳動したところ、 制限酵素 Nsp Vで消化したサンプルにのみ、 約 4. 5 k b pのバンドが確認された。 他のサンプルでは、 この反応では增幅は 確認されなかった。 次いで、 制限酵素 Nsp Vで消化したサンプルにおいて のみ 100倍希釈して、 他はそのままの反応液、 1 1を鏵型として、 セ ンスプライマーとしてブライマー I P45— 2 (配列番号 39) 、 アンチ センスプライマーとしてプライマー I P 45— 6 (配列番号 40) を用い て同様に PCRを行った。 反応後、 反応液 5 1を 1%ァガロースゲル電 気泳動により解析したところ、 制限酵素 Nsp Vで消化したサンブルにおい ては、 約 4. 5 k b pのバンドが非常に強く、 特異的に増幅されているこ とを確認した。 制限酵素 Hind IIIで消化したサンブルにおいては、 多数の 非特異的と思われる D N A断片が増幅しており目的断片の同定は困難であつ た。 また、 制限酵素 Xba Iで消化したサンプルにおいては、 約 4. 5 k b と約 3. δ k b pの 2本のメインバンドが確認された。
そこでまず、 制限酵素 Nsp Vで消化したサンプルにおいて、 1回目の P CRで得られた約 4. 5kbpDNA断片をゲルより回収した後、 DNA ブランティング ·キッ ト （宝酒造社製） を用いて末端の平滑化を行い、 さ らに 5' 末端標識キッ ト MEGARABELTM (宝酒造社製） を用いて P CR産物の 5' 末端のリン酸化を行い、 1)1；〇118の^1^ IIサイ トに 導入し、 このブラスミ ドをィ一 · コリー J Ml 09に形質転換した。 得られたコロニーのうち、 コロニー 46個をプライマー I P45— 2 (配列番号 39) と Ml 3ブライマー M 4 (宝酒造社製） の PC Rでスク リーニングしたところ、 3個がポジティブであった。 それぞれの菌からブ ラスミ ドを抽出して、 それぞれ p VX3 P 206、 p VX3 P 234 PVX3P 237と名付けた。
pVX3P206、 pVX3P 234. pVX3P237を、 M13プ ライマー M4 (宝酒造社製） と Ml 3ブライマー RV (宝酒造社製） を用 いて、 サンガーの方法に従って、 それぞれの挿入断片の両端部分の塩基配 列を解読した。 その結果、 これらの配列は、 PCRで用いたブライマーを 含み、 基になったァズキ E XT 3 c DNAの配列 （配列番号 12) と比較 するとオーバーラップ部分はまったく同じであった。 また、 3種のクロ一 ンとも、 解析した範囲では全く同じ配列であった。
この挿入断片を制限酵素 Nsp Vで完全消化すると、 約 4. Ok bpのバ ンドは、 約 0. 5kbpと約 3. 5 k b pの 2本に分かれた。 次に、 約 0. 5kbpと約 3. 5 k b pの 2本のどちらにプロモーター領域が含まれる かを、 PCR法で確認した。 この結果、 約 0. 5kbpがプロモーター領 域を含む DN A断片と判明した。
そこで、 さらにこのプロモーター領域の 5' 上流側をクローニングする ために、 制限酵素 Xba Iで消化したサンブルの 2回目の PCRにおける約 4. 5kbpと約 3. 5 k b pの 2本のメインバンドが用いることにした。 これらの DNA断片を制限酵索 Nsp Vで完全消化することにより、 約 4. 4 k b pのバンドは、 約 0. 5kbpと約 3. 9 k b pの 2本に分かれた。 しかしながら、 約 3. 5kbpのバンドは、 制限酵素 Nsp Vで消化されな かった。 したがって、 約 4. 5 k b pのほうにプロモーター領域が含まれ ると考えられた。 次に、 約 4. 5 k b pの DNA断片を制限酵素 Nsp V、 Xba Iでの消化、 Nsp V— Xba Iでの 2重消化により、 この約 4. 5 k b pの D N A断片の制 限酵素地図を作成した。
プライマー I P45— 3と I P 45— 5により増幅した約 4. 5 k b p の制限酵素地図を、 図 12に示す。 図中、 制限酵素地図の上部はブライマ 一 I P 45— 5の塩基配列に相当し、 下部はブライマ一 I P45— 3の塩 基配列に相当する。
この結果、 Nsp V— Xba Iの約 3. 0 k b pの D N A断片がプロモーター 領域の 5' 上流側であることが判明した。
そこで、 約 4. 4 k b pの DNA断片を制限酵素 Nsp V— Xba Iで 2重消 化することにより生じる約 3. 0 k b pの DNA断片をゲルより回収した 後、 p B 1 u e s c r i p t I I SK (—） （ストラタジーン社製） の Xba I-Acc Iサイ 卜に導入し、 このブラスミ ドをィ一 ' コリー J M 10 9に形質転換した。
得られたコロニーのうち、 7個を Ml 3ブライマー M4 (宝酒造社製） と Ml 3ブライマー RV (宝酒造社製） の PC Rでスクリーニングしたと ころ、 6個が約 3. Ok bpの挿入断片を含むことが分かった。 この 6個 について、 ブラスミ ドを抽出して、 それぞれ p VX3 P 101、 pVX3 P103、 pVX3P104、 pVX3P105、 pVX3P106、 pVX3P106、 p VX3 P 107と名付けた。
このうち p VX 3 P 101、 pVX3P103、 p VX3 P 104 PVX3P107を、 Ml 3ブライマー M 4 (宝酒造社製） と Ml 3ブラ イマ一 RV (宝酒造社製） を用いて、 サンガーの方法に従って、 それぞれ の挿入断片部分の塩基配列を一部解読した結果、 4種のクローンとも、 全 く同じ配列であった。 次に、 約 3. 0 k b pの挿入断片の全領域をシーク エンスするために、 p VX3 P 107を制限酵素 Kpn I (宝酒造社製） 、 Xho I (宝酒造社製） で完全消化した後、 キローシークェンス用デレーショ ン .キッ ト （宝酒造社製） を用いて、 Xho Iサイ 卜から挿入断片側へのデ リーションのクローンを得た。 これらのうち適当な長さのデリ一ションの 起こったものをいくつか選び、 Ml 3プライマー M 4 (宝酒造社製） と M 13ブライマー RV (宝酒造社製） を用いて、 サンガーの方法に従って、 それぞれの挿入断片部分の塩基配列を解読したうえ、 これらの結果を総合 して PVX3P107に含まれる挿入断片の塩基配列を決定した。 P VX 3P206、 pVX3P234> p V X 3 P 237の挿入 D N A断片の塩 基配列と p VX3 P 107に含まれる挿入断片の塩基配列がゲノム上で連 続していることは、 この境界領域の P CRならびにダイレク トシークェン スにより確認された。 こうして得られたァズキ EXT 3の N末端ァミノ酸 配列より上流のプロモーター領域の約 3. 4k bpの塩基配列を、 配列表 の配列番号 4に示す。 実施例 15
ァズキゲノム DN Aの Hind III、 Nsp V、 Xba I断片を铸型とするインバ ース P CRによるァズキ XRP 1遺伝子のプロモーターの単離
実施例 13と同様にして、 ァズキゲノム DN Aを制限酵素 Hind III、 Nsp V、 Xba Iを用いて完全消化し、 セルフライゲーシヨンを行い、 得られ た環状ゲノム DNAO. l gを鋅型にして、 センスブライマーとしてブ ライマー I PM6— 3 (配列番号 41) 、 アンチセンスブライマーとして プライマー I PM6— 4 (配列番号 42) を使用して、 TaKaRa L A PCR キッ ト （宝酒造社製） により PCRを行った。
反応は 94。C (1分） 、 98。C (20秒） 、 67。C (10分） のサイク ルを 30回繰り返し、 72°C (10分） で終わった。 反応の後、 反応液の 5 1を 1%ァガロースゲル電気泳動したところ、 增幅は確認されなかつ た。
次いで、 反応液 1 !1 】を铸型として、 センスプライマーとしてブライマ
- I ΡΜ6-2 (配列番号 43) 、 アンチセンスプライマーとしてプライ マー I ΡΜ6— 5 (配列番号 44) を用いて同様に PC Rを行った。 反応 後、 反応液 5 1を 1%ァガロースゲル電気泳動により解析したところ、 制限酵素 Hind III、 Nsp Vで消化したサンプルにおいては、 多数の非特異 的と思われる DN A断片が増幅してきており目的断片の同定は困難であつ た。 また、 制限酵素 Xba Iで消化したサンプルにおいては、 約 2. 5 k b Pと約 0. 6 k b pの 2本のメインバンドが確認された。
そこで、 制限酵素 Xba Iで消化したサンプルにおいて、 2回目の PCR で得られた約 2. 5kbpと約 0. 6 k b pの 2本の DNA断片をゲルよ り回収した後、 それぞれ、 DNAブランティング 'キッ ト （宝酒造社製） を用いて末端の平滑化を行った。 さらに 5' 末端標識キッ ト MEGAL A BEL™ (宝酒造社製） を用いて PCR産物の 5' 末端のリン酸化を行い、 pUC 118の Hinc IIサイ 卜に導入し、 このプラスミ ドをィ一， コリー JM109に形質転換した。
得られたコロニーのうち、 それぞれコロニー 6個を Ml 3プライマー M 4 (宝酒造社製） と Ml 3ブライマー RV (宝酒造社製） の PCRでスク リーニングしたところ、 約 2. 5kbpの方は、 5個がポジティブ、 約 0. 6kbpの方は、 3個がポジティブであった。 それぞれの菌からプラスミ ドを抽出して、 約 2. 5 k b pの方は、 それぞれ、 pXRG301、 pX RG302、 pXRG303、 pXRG304、 pXRG305と名付け た。 また、 約 0. 6kbpの方は、 それぞれ、 pXRG403、 pXRG 404、 pXRG 406と名付けた。
pXRG301、 pXRG302、 pXRG 303、 pXRG 304、 PXRG305を、 制限酵素 EcoR I、 Sph I (宝酒造社製） の両方で完全 消化したところ、 pXRG302、 pXRG303、 pXRG304の 3 つのみが、 約 2. 5 k b pの挿入断片を持っていることが判明した。 また, PXRG30 I pXRG 302、 pXRG 303、 pXRG304、 pXRG305、 pXRG403、 pXRG404、 pXRG406を制 限酵素 Xba Iで完全消化したところ、 pXRG301、 pXRG302、 pXRG 303、 pXRG 304、 p XRG 305はベクターの 1力所と は別に挿入断片中で 1力所切断され、 約 1. I k b pのバンドを生じた。 また、 pXRG403、 pXRG 404、 p X R G 406はベクターに存 在する 1力所でのみ切断された。 このことから、 pXRG301、 pXR G 302、 pXRG 303、 pXRG 304、 pXRG 305が目的のァ ズキ XRP 1のプロモーター領域を含むと考えられた。
PXRG30 pXRG 302 pXRG303、 pXRG 304を、 Ml 3ブライマー M4 (宝酒造社製） と Ml 3ブライマー RV (宝酒造社 製） を用いて、 サンガーの方法に従って、 それぞれの挿入断片の両端部分 の塩基配列を解読した。 その結果、 pXRG302、 pXRG303の配 列は、 P CRで用いたブライマーを含み、 もとになつたァズキ XRP 1 cDNAの配列 （配列番号 14) と比較するとオーバーラップ部分はまつ たく同じであった。 また、 2種のクローンとも、 全く同じ配列であった。 ブライマー I PM6— 2と I PM6— 5により増幅した約 2. 5 k b p の挿入断片の制限酵素地図を、 図 13に示す。 図中、 制限酵素地図の上部 はブライマー I PM6— 5の塩基配列に相当し、 下部はブライマー I PM 6— 2の塩基配列に相当する。 Ml 3プライマー M4 (宝酒造社製） と Ml 3プライマー RV (宝酒造 社製） を用いて、 サンガーの方法に従って、 この挿入断片部分の塩基配列 を解読し、 さらに、 挿入断片中の配列をもとに合成したプライマーで解析 したたうえ、 これらの結果を総合して pXRG 302に含まれる挿入断片 中のァズキ XRP 1のプロモーター領域約 1. 1 kb pの塩基配列を決定 した。 このァズキ XRP 1の N末端ァミノ酸配列の上流のプロモーター領 域約 1. 1 k b pの配列を、 配列表の配列番号 5に示す。 実施例 16
トマトゲノム DNAの EcoR I、 Hind III、 Nsp V、 Xba I断片を铸型とす るインバース PC Rによる トマト E XT遺伝子のプロモーターの単離
ポンテロ一ザ卜マ 卜 (Lycopersicon esculentum) の種子 (タキイ種苗 社製） を発芽させ、 約 1ヶ月栽培し、 葉および茎約 10 gを得た。 そのう ち約 2. 5 gの葉および茎を乳鉢にとり、 液体窒素中で白い粉末になるま で粉砕した。 粉砕した葉を、 直ちに 5 Om 1容量のポリスチレンチューブ に入れて、 1 Om 1の尿素ーフヱノール DNA抽出緩衝液 [0. 05M卜 リス一 HC I (pH 7. 6) 、 0. 02MEDTA, 5%フエノール、 8 M尿素、 0. 35MNaC l、 2 %N—ラウロイルザルコシンナトリウム] および 25%SD Sを加え、 65eC、 1時間で抽出した。 抽出液に 2倍容 量のフエノール： クロロホルム ： イソアミルアルコール （25 : 24 : 1) を加え、 緩やかに約 15分間、 混合した後、 2000 rpm、 15分間遠 心分離した。 遠心分離後の上清を新しいチューブに移し、 これに再度 2倍 容量のフヱノール： クロ口ホルム ： イソァミルアルコール （25 ： 24 ： 1) を加え、 緩やかに約 15分間、 混合した後、 2000 rpm、 15分 間遠心分離した。 この遠心分離後の上清を新しいチューブに移し、 2倍容 9
量のエタノールを加えて、 緩やかに混合した後、 析出した白い糸状のゲノ ム DN Aをパスツールピぺッ トを用いて卷き取り、 新しいチューブに取り 出した。 このチューブに 1. 5m】の TE緩衝液 [10mMトリス一 HC 1 (pH 8. 0) 、 lmMEDTA] を加えて 55°Cで一晚かけて、 溶解させた。 この DNA溶液の 10倍希釈のサンプル 1 〗を、 0. 4% ァガロースゲル電気泳動に供し解析したところ、 高分子の DN Aで、 濃度 が約 100 n gZ^ 1であることが確認された。 つまり、 植物体約 2. 5 g力、ら、 約 150 gのゲノム DN Aが得られた。
このゲノム DNA 1 μ gをそれぞれ別々のチューブにとり、 制限酵素 EcoR I、 Hind III、 Nsp V、 Xba Iを用いて完全消化し、 実施例 13と同様 にしてセルフライゲーションした。 こうしてできた環状ゲノム DN A 0. 1 ii gを铸型にして、 センスブライマーとしてプライマ一 I P L E— 3 (配列番号 45) 、 アンチセンスプライマーとしてブライマー I PLE— 4 (配列番号 46) を使用して、 T a K a R a LA PCRキッ ト （宝 酒造社製） により PCRを行った。 反応は 94eC (1分） 、 98°C (20 秒） 、 67°C (10分） のサイクルを 30回繰り返し、 72°C (10分） で終わった。 反応の後、 反応液の 5 1を 1 %ァガロースゲル電気泳動し たところ、 制限酵素 Hind IIIならびに Xba Iで消化したサンブルに、 それ ぞれ、 約 6. 6 k b pのバンドが確認された。 他のサンプルでは、 この反 応では增幅は確認されなかった。 そこで、 制限酵素 Xba Iで消化したサン ブルにおいて、 上記反応液 1 ;u 1を铸型にして、 センスブライマーとして ブライマー I PLE— 2 (配列番号 47) 、 アンチセンスブライマーとし てブライマー I PLE— 5 (配列番号 48) を使用して、 TaKaRa LA PCRキッ ト （宝酒造社製） により 2回目の PCRを行った。 反応 は上記と同じ条件で行い、 サイクルを 10回繰り返した。 反応後、 得られ た DN A断片をゲルより回収した後、 pT7B l u e T— Ve c t o r [ノバジヱン （Novagen) 社製] に導入し、 このプラスミ ドをィ一 ' コリ J Ml 09に形質転換した。
得られたコロニーのうち、 コロニー 12個をブライマー I PLE— 1 (配列番号 49) とプライマー I PLE— 6 (配列番号 50) を用いた TaKaRa LA PCRキッ ト （宝酒造社製） により PCRでスクリ 一二ングしたところ、 6個がポジティブであった。 これらの 6コロニーに ついて、 プラスミ ドを抽出して、 それぞれ p LXG 101、 ρ LXG 10 2、 pLXG103、 p LXG 106s pLXG109、 p LXG 110 と名付けた。
p LXG 101 p LXG 102 pLXG106を、 M13プライマ -M4 (宝酒造社製） と Ml 3ブライマー RV (宝酒造社製） を用いて、 サンガーの方法に従って、 それぞれの挿入断片部分の塩基配列を解読した。 これらの配列は、 もとになつたトマト E XT cDN Aの配列 [欧州特許 公開第 0562836号 A 1公報 （1993) ] と比較するとオーバ一ラッ プ部分はまったく同じであった。 しかしながら、 塩基配列を解析した範囲 では、 2〜 3個の塩基置換があることが分かった。 これは、 Ne s t e d
PCRをしているため、 ポリメラーゼ反応の際、 間違いが起きると考え られた。 そこで、 まず、 6つのブラスミ ドのうち一つで、 プロモーター領 域のシークェンスをした後、 ブライマーを合成して、 他のクローンもシー クエンスして比較することにより、 実際のゲノム上の配列を推察した。 ブライマー I PLE— 2と I PLE— 5により増幅した約 6. 6 k b p の挿入断片の制限酵素地図を、 図 14に示す。 図中、 制限酵素地図の上部 はブライマー I PLE— 5の塩基配列に相当し、 下部はブライマー I PL E— 2の塩基配列に相当する。 また、 pLXG101、 p LXG 102. p LXG 103. pLXGl 06、 pLXGl 09、 p LXG 110を制限酵素 Xba Iで完全消化し、 ァガロースゲル電気泳動をすると、 pLXG101、 LXG 102> p LXG 103 pLXGl l Oで約 4. 9 k b p付近に 2本のバンド、 pLXG106、 pLXG109で約 8. I kbpと約 1. 7kbpの 2 本のバンドが確認できた。 このことから、 pLXG101、 p LXG 10
2、 p LXG 103 p LXG 110の 3つと p LXG 106、 p LXG 109の 2つとでは、 逆向きに PCR増幅 DNA断片が挿入されているこ とが判明した。 また、 これらのプラスミ ドを銬型に Ml 3プライマー M 4
(宝酒造社製） とブライマー I P LE— 1 (配列番号 49) を用いて、 TaKaRa LA PCRキッ ト （宝酒造社製） により PCRを行った 結果より、 挿入断片を制限酵素 Xba Iで完全消化した時に分かれる約 4. 9kbpと約 1. 7 k b pの DNA断片のうち、 約 4. 9kbpの DNA 断片がトマト E XT¾伝子のプロモーター領域を含むことが判明した。 そこで、 pLXGl 06を制限酵素 Xba Iで完全消化し、 エタノール沈 殿した。 エタノール沈殿した DN Aに 268 1の蒸留水、 30 1の 1 Oxライゲーシヨン緩衝液、 3 1の T4DNAライゲース （宝酒造社製） を加え、 16 °Cで 1晚反応することによりセルフライゲーシヨンし、 この ブラスミ ドをィ一 · コリ JM109に形質転換した。
得られたコロニーのうち、 4コロニーについて、 プラスミ ドを抽出して、 それぞれ pLXG601、 pLXG602 p LXG 603. ρ LXG 6 04と名付けた。 これらの pLXG601、 pLXG 602、 pLXG6
03、 pLXG604を、 制限酵素 EcoR I-Pst Iでの 2重消化しァガロ ースゲル電気泳動を行ったところ、 すべてのブラスミ ドに約 4. 9 k bp の挿入断片があることを確認した。 また、 上述の制限酵素地図 （図 14) より、 約 4. 9 k b pの挿入断片 中に 1力所の Hind IIIサイ 卜があることが分かっていたので、 pLXGl 06を制限酵素 Hind IIIで完全消化し、 エタノール沈殿した D N Aに 26 8 1の蒸留水、 30 1の l Oxライゲ一ション緩衝液、 3〃 1の T 4 DN Aリガーゼ （宝酒造社製） を加え、 16°Cで 1晚反応することにより セルフライゲーションし、 このプラスミ ドをィ一♦ コリ JM109に形質 転換した。
得られたコロニーのうち、 6コロニーについて、 プラスミ ドを抽出して、 それぞれ pLXP 101、 pLXP102、 pLXP103、 pLXP l 06、 p LXP 109. p LXP 111と名付けた。 これらの pLXPl 01、 pLXP102、 pLXP103、 p LXP 106> p LXP 10 9、 p LXP 111を、 制限酵素 EcoR I-Pst Iで 2重消化しァガロース ゲル電気泳動をすることにより、 すべてのプラスミ ドに約 1. 4kbpの 挿入断片があることを確認した。
PLXP101を、 Ml 3プライマー M 4 (宝酒造社製） と Ml 3ブラ イマ一 RV (宝酒造社製） を用いて、 サンガーの方法に従って、 それぞれ の挿入断片部分の塩基配列を解読した。
次に、 ？101の約1. 4 kbpの挿入断片の全領域をシークェ ンスするために、 p L X P 101を制限酵素 Kpn I、 BamH Iで完全消化し た後、 キローシークェンス用デレーシヨン 'キッ ト （宝酒造社製） を用い て、 BamH Iサイ トから挿入断片側へのデリーシヨ ンのクローンを得た。 こ れらのうち適当な長さのデリ一ションの起こったものをいくつか選び、 M 13プライマー M 4 (宝酒造社製） と Ml 3プライマー RV (宝酒造社製） を用いて、 サンガーの方法に従って、 それぞれの挿入断片部分の塩基配列 を解読したうえ、 これらの結果を総合して P LXP 101に含まれる挿入 断片の塩基配列を決定した。 さらに、 p LX P 101の挿入断片の塩基配 列を基にして合成した P LXG 102、 P LXG 103の約 1. 4 k b p のプロモータ一領域をシークェンスし比較することにより、 このトマト E XT遗伝子の N末端ァミノ酸配列の上流のプロモーター領域約 1. 4 k b Pの配列を推察した。 この配列は、 配列表の配列番号 6に示す。 実施例 1 Ί
タバコゲノム DNAの EcoR I、 Hind III、 Nsp V、 Xba I断片を铸型とす るインバース P CRによるタバコ EXT遺伝子のプロモーターの単離 タバコ BY2培養細胞 （カルス） 約 15 Omgを乳鉢中でパウダー状に なるまで粉砕した後、 抽出液 [しょ糖 15%、 50mMトリスー HC 1 (pH8. 0) . 5 OmM EDTA] 0. 5 m 1を加え、 エツペンドル フチューブに移して 500 r pm、 1分間遠心分離した。 沈殿物を 300 / 1の 2T— I E [20mMトリスー HC 1 (pH 8. 0) 、 1 OmM EDTA] に溶解し、 40 1の 10%SDSを加えゆつく り振盪後、 7 0。C、 15分処理した。 225 1の 5M酢酸アンモニゥムを加えて、 撹 拌後、 氷上で 30分おき、 15000 r pm、 15分間遠心分離した。 遠 心分離後の上清を新しいチューブに移し、 0. 7m Iのイソブロパノール を加え、 搜拌し、 室温で 15分間置いた後、 15000 r pm、 15分間 遠心分離した。 上清を取り除いた後、 80%氷冷エタノールを加え、 15 000 r pm、 15分間遠心分離し、 沈殿し、 乾燥後、 100 1の TE 緩衝液 [10mMトリスー HC 1 (pH8. 0) 、 1 mM EDTA] を 加えて 4。Cで一晩かけて、 溶解させた。 この0 八溶液の5 】を、 0. 4 %ァガロースゲル電気泳動に供し解析したところ、 高分子の D N Aで、 濃度が約 1 O On gZ 1であることが確認された。 つまり、 カルス約 1 50mgから、 約 10 /i gのゲノ厶 DN Aが得られた。
このゲノム DN A 1 gをそれぞれ別々のチューブにとり、 制限酵素 EcoR I、 Hind III、 Nsp V、 Xba Iを用いて完全消化し、 実施例 13と同様 にしてセルフライゲーシヨンした。 得られた環状ゲノム DNA◦. 1 を铸型にして、 センスプライマーとしてプライマー I PTE— 3 (配列番 号 51) 、 アンチセンスブライマーとしてブライマー I PTE— 4 (配列 番号 52) を使用して、 TaK aRa LA PCRキッ ト （宝酒造社製） により PCRを行った。 反応は 94°C (1分） 、 98°C (20秒） 、 67 °C (10分） のサイクルを 30回繰り返し、 72。C (10分） で終わった。 反応の後、 反応液の 5 1を 1%ァガロースゲル電気泳動したところ、 制 限酵素 Xba Iで消化したサンプルに、 約 1. 2 k b pのバンドが確認され た。 他のサンプルでは、 この反応では増幅は確認されなかった。 そこで、 制限酵素 Xba Iで消化したサンプルにおいて、 上記反応液 1 1を铸型に して、 センスブライマーとしてブライマー I PTE— 2 (配列番号 53) 、 アンチセンスブライマーとしてブライマー I PTE— 5 (配列番号 54) を使用して、 TaKaR a LA PCRキッ ト （宝酒造社製） により 2 回目の PC Rを行った。 反応は上記と同じ条件で行った。 その結果、 約 1. 1 k b pの DNA断片が増幅された。 この 2回目の P CRで得られた DN A断片をゲルより回収した後、 pT7B 1 u e T-V e c t o r (ノノく' ジェン社製） 導入し、 このブラスミ ドを N o v a B l u eコンビテント セル （ノバジユン社製） に形質転換した。
得られたコロニーのうち、 12コロニーをブライマー I PTE— 1 (配 列番号 55) とブライマー I PTE— 6 (配列番号 56) を用いた PCR でスクリーニングしたところ、 12個すべてがポジティブであった。 これ らのうち 6コロニーについて、 プラスミ ドを抽出して、 それぞれ pNXG 101、 pNXG102、 pNXG 103 p XG 104, pNXG 1 04、 p N X G 105 > pNXG 106と名付けた。
pNXG102、 p N X G 103 pI\'XG104を、 M13プライマ -M4 (宝酒造社製） と Ml 3プライマー RV (宝酒造社製） を用いて、 サンガーの方法に従って、 それぞれの挿入断片部分の塩基配列を解読した これらの配列は、 もとになつたタバコ EXT c DNAの配列 （特開平 7— 79778号） と比較するとォ一バーラップ部分はまったく同じであった c ブライマー I PTE— 2と I PTE— 5により増幅した約 1. 1 kbp の挿入断片の制限酵素地図を、 図 15に示す。 図中、 制限酵素地図の上部 はブライマー I PTE— 5の塩基配列に相当し、 下部はプライマー I PT E— 2の塩基配列に相当する。
また、 pNXG101、 pNXG102、 pNXG 103 pNXG 1 04、 pNXG104、 pNXG105、 pNXG106を制限酵素 Xba Iで完全消化し、 ァガロースゲル電気泳動をすると、 pNXGl 01 で約 3. 1 と約0. 9kbpの 2本のバンド、 PNXG102、 p NXG103、 pNXG104、 p XG 104. pNXG105、 pN XG 106で約 3. 8k bpと約 0. 2 k b pの 2本のバンドが確認でき た。 このことから、 pNXGl O lと pNXG102、 pNXG103、 pNXG 104 pNXG104、 p NXG 105. pNXG106の 5 つでは、 逆向きに EXTが挿入されていることが判明した。 また、 これら のプラスミ ドを铸型に Ml 3プライマー M4 (宝酒造社製） とプライマー I PTE- 1 (配列番号 55) あるいはプライマー I PTE— 6 (配列番 号 56) を用いて、 PCRを行った結果より、 挿入断片を制限酵素 Xba I で完全消化した時に分かれる約 0. 9k bpと約 0. 2k bpの DN A断 片のうち、 約 0. 9 kbpの DNA断片がタバコ EXT遺伝子のプロモー ター領域を含むことが判明した。
そこで、 pNXG 103を制限酵素 Hind IIIで完全消化し、 エタノール 沈殿した。 エタノール沈殿した DN Aに 268 1の蒸留水、 30〃 1の 10 Xライゲーション緩衝液、 の T4DNAライケース （宝酒造社 製） を加え、 16 °Cで 1晩反応することによりセルフライゲーシヨンし、 このブラスミ ドをィ一 · コリ J Ml 09に形質転換した。 3コロニーにつ いて、 ブラスミ ドを抽出して、 それぞれ p T— EXT— 4、 pT-EXT 一 5、 pT— EXT— 6と名付けた。 これらの ρΤ— ΕΧΤ— 4、 ρΤ— ΕΧΤ— 5、 ρ Τ— E XT— 6を制限酵衆 Hind III-EcoR Iで 2重消化し ァガロースゲル電気泳動をすることにより、 すべてのプラスミ ドに約 0. 4 k bpの挿入断片があることを確認した。 pT— EXT— 4、 ρΤ-Ε XT— 5、 pT— EXT— 6を、 Ml 3プライマー M4 (宝酒造社製） と T 7プロモーター 'ブライマー （ノバジェン社製） を用いて、 サンガーの 方法に従って、 それぞれの挿入断片部分の塩基配列を解読した。
さらに、 pNXG 102を制限酵素 Hind III、 Xba Iで完全消化し、 約 0. 5 k b pのバンドをァガロースゲル電気泳動により切り出し、 精製し た。
次に、 pUCl 8 (宝酒造社製） を制限酵素 Hind III— Xba Iでの 2重 消化したものに、 この DNA断片をライゲーシヨンして、 ィー ' コリ JM 109に形質転換した。
得られたコロニーのうち、 3コロニーについて、 ブラスミ ドを抽出して、 それぞれ pT— EXT— 1、 pT— ΕΧΤ— 2、 pT— ΕΧΤ— 3と名付 けた。 これらの pT— ΕΧΤ— 1、 pT— ΕΧΤ— 2、 pT-EXT- 3 を、 制限酵素 Hind III-EcoR Iで 2重消化しァガロースゲル電気泳動をす ることにより、 すべてのブラスミ ドに約 0. 5 k b pの挿入断片があるこ とを確認した。 pT— EXT— 1、 pT— EXT— 2、 pT— EXT— 3 を、 Ml 3ブライマー M4 (宝酒造社製） と Ml 3ブライマー RV (宝酒 造社製） を用いて、 サンガーの方法に従って、 それぞれの挿入断片部分の 塩基配列を解読した。
これらの結果を総合して、 タバコ EXTの N末端ァミノ酸配列の上流の プロモーター領域の全塩基配列を決定した。 この配列は、 配列表の配列番 号 7に示す。 実施例 18
小麦ゲノム DN Aの EcoR I、 Hind III、 Nsp V、 Xba I断片を鏵型とする インバース P C Rによる小麦 E X T遗伝子のプ口モーターの単離
小麦ゲノム DN A (クロンテック社製） 1 gをそれぞれ別々のチュー ブにとり、 制限酵素 EcoR I、 Hind III、 Nsp V、 Xba Iを用いて完全消化し、 実施例 13と同様にしてセルフライゲーシヨンした。 得られた環状ゲノム DNA 0. li gを铸型にして、 センスブライマーとしてブライマー KO M— 1 (配列番号 57) 、 アンチセンスブライマーとしてブライマー KO M-4 (配列番号 58) を使用して、 TaKaRa LA PCRキッ ト (宝酒造社製） により全量 50 1の反応系で PCRを行った。 反応は 9 4°C (1分） の後、 98。C (20秒） 、 6 IV (10分） のサイクルを 3 0回繰り返し、 72°C (10分） で終わった。 反応の後、 反応液の 5 1 を 1%ァガロースゲル霍気泳動したところ、 制限酵素 Hind IIIで消化した サンブルに、 約 4. 3k bpと約 3. 5 k b pのバンドが確認された。 ま た、 制限酵素 sp Vで消化したサンブルに、 約 5. Ok bpのバンドが確 認された。 他のサンブルでは、 この反応では增幅は確認されなかった。 そこで、 制限酵素 Hind IIIで消化したサンブルにおいて、 1回目の PC R反応液を 1 1用いて、 センスプライマ一としてプライマー KOM— 2 (配列番号 59) 、 アンチセンスプライマーとしてブライマー KOM— 5 (配列番号 60) で、 TaKaRa LA PCRキッ ト （宝酒造社製） により全量 50/ 1の反応系で Ne s t e d PCRを行った。 反応は 9 4°C (1分） 、 98°C (20秒） 、 67°C (10分） のサイクルを 30回 繰り返し、 72°C (10分） で終わった。 反応の後、 反応液の 5 1を 1 %ァガロースゲル電気泳動したところ、 約 3. 3k bpのバンドのみが確 認された。 そこで、 得られた DNA断片をゲルより回収した後、 DNAブ ランティング ·キッ ト （宝酒造社製） を用いて末端の平滑化を行い、 さら に 5' 末端標識キッ ト MEGARABELTM (宝酒造社製） を用いて PC R産物の 5' 末端のリン酸化を行った。 この DNA断片を pUC 19 (宝 酒造社製） の Hinc IIサイ トに導入し、 このブラスミ ドをィ一 · コリ J M 109に形質転換した。
得られたコロニーのうち、 15コロニーを Ml 3ブライマー M4 (宝酒 造社製） と Ml 3プライマー RV (宝酒造社製） を用いて、 コロニーピッ キング P CRで適当な長さの挿入断片のはいったプラスミ ドをスクリ一二 ングしたところ、 15コロニー中 8コロニーがポジティブクローンであつ た。 このうち 6コロニーについて、 プラスミ ドを抽出して、 それぞれ pK OM- 1, pKOM - 2、 pKOM - 3、 pKOM— 4、 pKOM - 5、 pKOM— 6と名付けた。
pKOM - 1、 pKOM - 2、 pKOM - 3、 pKOM - 4、 pKOM 一 5、 pKOM— 6を、 Ml 3プライマー M4 (宝酒造社製） と Ml 3ブ ライマー RV (宝酒造社製） を用いて、 サンガーの方法に従って、 それぞ れの挿入断片部分の両端の塩基配列を解読した。 これらの配列は、 もとに なった小麦 EXT cDNAの配列 [欧州特許公開第 0562836号 A 1 公報 （1993) ] と比較するとオーバーラップ部分はまったく同じであつ た。 しかしながら、 塩基配列を解析した範囲では、 2〜3個の塩基置換が あることが分かった。 これは、 トマトの場合と同様に N e s t e d PC Rをしているため、 ボリメラーゼ反応の際、 間違いが起きると考えられた。 ブライマー KOM— 2と KOM— 5により增幅した約 3. 3 k b pの挿 入断片の制限酵素地図を、 図 16に示す。 図中、 制限酵素地図の上部はブ ライマー KOM— 5の塩基配列に相当し、 下部はプライマー KOM— 2の 塩基配列に相当する。
pKOM - 1、 pKOM— 2、 pKOM - 3、 pKOM - 4、 p KOM 一 5、 pKOM— 6を制限酵素 Hind ΙΠで完全消化し、 ァガロースゲル電 気泳動をすると、 pKOM— 1、 pKOM— 3、 pKOM— 5で約 4. 2 kbpと約 2. Okbpの 2本のバンド、 pKOM— 2、 pKOM— 4、 pKOM— 6で約 4. 9k bpと約 1. 3 k b pの 2本のバンドが確認で きた。 このことから、 pKOM— 1、 pKOM— 3、 pKOM— 5の 3つ と pKOM— 2、 pKOM— 4、 pKOM— 6の 3つでは、 逆向きに EX Tが挿入されていることが判明した。 また、 これらのブラスミ ドを铸型に ブライマー KOM— 2 (配列番号 59) と Ml 3ブライマー M4 (宝酒造 社製） あるいは Ml 3プライマー RV (宝酒造社製） を用いて、 PCRを 行った結果、 挿入断片を制限酵素 Hind IIIで完全消化した時に分かれる約 2. Okbpと約 1. 3kbpの DNA断片のうち、 約 1. 3kbpの D N A断片が小麦 E XTプロモーター領域を含むことが判明した。
そこで、 pKOM— 1を制限酵素 Hind IIIで完全消化し、 約 1. 3kb pの DNA断片、 つまり小麦 EXT遗伝子のプロモーター領域を含む DN A断片を、 ァガロースゲル電気泳動により精製し、 TaKaRa DNA ライゲーシヨン ·キッ ト （宝酒造社製） によりセルフライゲーションした。 このプラスミ ドをィ一 · コリ J Ml 09に形質転換した。
得られたコロニーのうち、 6コロニーについて、 挿入断片の大きさを P CRで調べたところ、 いずれも、 約 1. 3 k b pの DNA断片が検出され た。 そこで、 このうち 3コロニーからプラスミ ドを抽出して、 それぞれ p KEP— 1、 pKEP— 2、 pKEP— 3と名付けた。 これらの pKEP 一 1、 pKEP— 2、 pKEP— 3を、 制限酵素 EcoR I、 Sac I、 Kpn I、 Sma I、 BaoH I、 Xba I、 Pst I、 Hind IIIで完全消化しァガロースゲル電 気泳動を行い、 そこから制限酵素地図を作成した。 このうち、 pKEP— 1の制限酵素地図を図 1 Ίに示す。
次に、 pKEP— 1、 pKEP— 2、 pKEP— 3をそれぞれ制限酵素 Sac Iで完全消化し、 約 3. 8 k b pのバンドをァガロースゲル電気泳動 によつて精製した。 これを、 TaKaRa DNAライゲーシヨン 'キッ ト （宝酒造社製） にてセルフライゲーシヨンした。 こうして得られたブラ スミ ドを、 pKEPS— 1、 pKEPS— 2、 p K E P S— 3と名付けた。 さらに、 pKEP— 1、 pKEP— 2、 pKEP— 3をそれぞれ制限酵 素 EcoE I— Pst Iで 2重消化し、 約 1. 1 k b pのバンドをァガロースゲ ル電気泳動によって精製した。 次に、 PUC 19 (宝酒造社製） を制限酵 素 EcoB I— Pst Iで 2重消化したものに、 この DNA断片をライゲーショ ンして、 ィー · コリ JM109に形質転換した。
得られたコロニーのうち、 5コロニーを用いて Ml 3ブライマー M4 (宝酒造社製） と Ml 3ブライマー RV (宝酒造社製） を用いた PCRを 行い、 挿入断片の大きさが約 1. l kb pのものをスクリーニングした。 ポジティブコロニーより、 ブラスミ ドを抽出して、 それぞれ pKE PEP 一 1、 pKEPEP— 2、 pKEPEP— 3と名付けた。
pKEP— 1、 pKEP— 2、 pKEP— 3、 pKEPS— 1、 pKE PS - 2、 pKEPS— 3、 pKEPEP— 1、 pKEPEP - 2、 pK EPEP— 3を Ml 3プライマー M4 (宝酒造社製） と M13ブライマー R V (宝酒造社製） を用いて、 サンガーの方法に従って、 それぞれの挿入 断片部分の塩基配列を解読した。
これらの結果を総合して、 pKE P— 1に含まれる小麦 E XTの N末端 アミノ酸配列の上流のプロモーター領域の全塩基配列を決定した。 この配 列は、 配列表の配列番号 8に示す。 実施例 19
卜マト EXT遺伝子のプロモーターの発現様式の解析
(1) totalRNAの調製
トマトのアリサ · クレイグ （Arisa craig) の植物体より、 葉、 茎 （伸 長中、 伸長後） 、 果実 [緑の果実 （mature green. 果実の表面は緑色、 内 部にはゼリー状の物質が形成されてる） および赤い果実 （mature red) ] の各組織を 5 gずつ、 採取し、 凍結させた後、 それぞれ乳鉢を用いて液体 窒素中で破碎した。 破碎した組織に 5m 1の抽出液 [0. 2M卜リス一 HC 1 (pH9. 0) 、 0. lMNaC I、 10mMEDTA、 0. 5% SDS、 14mM2—メルカプトエタノールと 5m 1のフエノール： クロ 口ホルム：イソアミルアルコール （50 : 49 : 1) ] を加え、 良く攩拌 し、 この懸濁液を遠心して水層を分離し、 これを 2回繰り返した。 この水 層に 1ノ10量の 3 M酢酸ナトリウムを加え、 20分間氷冷した後、 遠心 して上清を回収し、 エタノールを加えて遠心して沈殿を得た。 この沈殿を 2mlの TEZHPR I溶液 [10mMトリスー HC 1、 ImMEDTA, 5U/m l RNa s e i nh i b i t t o r (宝酒造社製） 、 ImMジ チォトレイ トール （DTT) ] に溶かし、 1Z4容積の 10M塩化リチウ 厶を加えた後、 2時間氷冷した。 氷冷後、 遠心分離し、 得られた沈殿を 0. 5mlの TE/HPR I溶液に溶かし 3 M酢酸ナトリウムとエタノールを 加えて遠心分離することにより R N Aの沈殿を得た。
(2) ノーザンハイブリダィゼーシヨン
ノ一サンハイブリダイゼーション用のプローブは卜マト EXTの cDN A断片 [欧州特許公開第 0562836号 A 1公報 （1993) ] および トマ卜のポリガラクチュロナーゼ （トマト PG) の c DNA断片 [モレキュ ラー 'アンド ' ジェネラル ' ジヱネテイクス （Molecular & General Genetics) 、 第 208卷、 第 30〜36頁 （1987) ] を、 B c aBE STTMラベリング ·キッ ト （宝酒造社製） を用いて （な一32 P) d CTP で標識し、 作製した。 ノーザンハイブリダィゼーシヨンは、 モレキュラー ' クローニング ·ァ ·ラボラ トリ一·マニュアル、 第 2版、 第 7章、 第 39 〜52頁 （T. マニアテイスら編、 コールド ·スプリング ·ハーバー · ラ ボラ トリー社、 1989発行） に記載の方法を改変し、 以下の方法で行つ た。 すなわち、 抽出した RNA 2 gをホルムアルデヒ ド *ランニングァガ ロースゲル （1%) で電気泳動した後、 ナイ口ンメンブレン （ハイボンド -N+) に一晚ノーザンプロッ トした。 紫外線トランスイルミネーター
(254 nm)で 3分間照射させ、 RNAを固定した。 このメンブレンを ブレハイブリダィゼ一シヨン緩衝液 （6xSSC、 0. 1%SDS、 5 デンハルツ液、 100 g/m 1サケ精子 DNA) 251111中で65 、 2時間ブレハイブリダイゼーシヨンを行った。
上記の方法で作製した32 P標識プローブをハイプリダイゼ一シヨン緩衝 液 （6xSSC、 0. 1%SDS、 5 xデンハルツ液） 25mlに加え、 このブローブ溶液にブレハイブリダイゼーションを行ったメンブレンを移 し、 65 °Cで一晚ハイプリダイゼーションを行った。
ハイブリダィゼ一シヨンの後、 メンブランを 2xSSC、 0. 1 %S D Sを含む洗浄液で 65て、 20分間 3回洗浄した。 メンブランは乾燥させ た後、 X線フィルム （コダック社製） を入れたカセッ ト内で一 80てで一 晚感光させ、 オートラジオグラフィーをとつた。
その結果を図 18に示す。 すなわち図 18は、 トマ卜の組織を用いたノ ーザンハイプリダイゼーションを示す図であり、 図中、 上段は卜マト EX 丁の mRNAの発現量、 中段はトマト PGの mRNAの発現量、 下段は rRNAの量を示す。 また、 図中、 レーン 1は赤い果実 （mature red) 、 レーン 2は綠の果実 （mature green, 果実の表面は綠色、 内部はゼリー状 の物質が形成されている） 、 レーン 3は伸長中の茎、 レーン 4は伸長後の 茎、 レーン 5は葉を示す。
図 18から分かるように、 トマト EXTの mRNAの発現量を各植物組 織で比較すると、 特に綠の果実および伸長中の茎において強い発現が見ら れることが確認できた。 また、 コン トロールとして用いたトマト PGの mRNAの発現量は、 各植物組織で比較すると、 赤い果実で強く発現して いることが確認できた。
(3) トマト果実を用いた RT— PCR
トマトのアリサ♦ クレイグ （Arisa craig) の未成熟の綠の果実
(immature green.果実の表面は綠色であるが、 内部にゼリー状の物質が 形成されていない） から成熟の赤い果実 （nature red) までの成熟段階の 異なる 10種類の果実より、 実施例 19 (1) に示した方法により total RNAを調製した。 これらの total RNAl〃gを用いて、 TaKaRa RNA PCR K i t wi t h AMV Ve r. 2 (宝酒造社製） を使用して、 以下のように RT— P CRによってトマト EXTmRNAお よびトマト PGの mRNAの発現の解析を行った。
逆転写反応はキッ 卜に添付のランダムプライマー （9me r) を用いて、 30。C (1分） 、 55 °C (15分） 、 99。C (5分） 、 5 °C (5分） で行つ た。 その後、 全反応液を铸型とし、
1) トマト EXTの cDNA断片 [欧州特許公開第 0562836号 A 1 公報 （1993) ] の塩基配列をもとに合成した、 プライマー TOM— 1
(配列番号 61) 、 ブライマー TOM— 2 (配列番号 62) 、
2) トマト P Gの c D N A断片 [モレキュラー 'アンド ' ジェネラル ' ジェ ネテイ クス、 第 208巻、 第 30〜 36頁 （1987) 〕 の塩基配列をも とに合成した、 ブライマー PG— SP3 (配列番号 63) 、 ブライマー P G-AP2 (配列番号 64) 、
の組合わせを用いて、 PCR反応を行った。 反応は 94°C (0. 5分） 、 δ 5°C (1分） 、 72°C (1分） のサイクルを 25回繰り返した。 反応後、 反応液の 1部を 1%ァガロースゲル電気泳動を行った。 その結果を図 19 に示す。 すなわち図 19は、 トマトの組織を用いた RT— PCRを示す図 であり、 図中、 上段は上記 1) に記載のプライマーで増幅した各成熟段階 における トマト EXTの発現、 下段は上記 2) に記載のブライマーで増幅 した各成熟段階における トマト PGの発現 （増幅産物） を示す。 また、 図 中、 各レーンは、 番号の大きいほど果実の成熟が進んでいる段階であり、 1、 2は未成熟の緑の果実 （immature green、 果実表面は緑色、 内部にゼ リー状の物質が形成されていない） 、 3、 4は綠の果実 （mature green. 果実表面は緑色、 内部にゼリー状の物質が形成されている） 、 5、 6は turning (果実表面の 10〜 30 %が赤くなる） 、 7、 8は pink (果実表 面の 30〜60%が赤くなる。 ） 、 9、 10は赤い果実 （mature red、 果 実表面が 100%赤色） に相当する。
図 19で分かるように、 各成熟段階でのトマト E XTの発現を比較する と、 未成熟の緑の果実 (immature green) から綠の果実 (mature green) に相当するレーン 1からレーン 4において増幅産物 （約 913 b p) が検 出され、 トマト EXTはこの段階で強く発現していることが確認できた。 —方、 コントロールとして用いたトマト P Gの発現は、 turningあるいは pinkに相当するレーン 5からレーン 9において増幅産物 （約 561 b p) が検出され、 トマト P Gはこの段階で強く発現していることが確認できた。 これらの結果より、 トマ卜 EXTプロモーターは、 特に成長中の茎や肥 大成長中の果実 (immature greenから mature green) で強く遺伝子発現を 引き起こすプロモーターであることがわかった。 つまり、 いずれも植物細 胞壁の Xyloglucan再構成の必要な部位、 植物細胞壁の Xyloglucan再構成の 時期での遗伝子発現を引き起こすことが分かった。 実施例 20
タバコ培養細胞を用いたトランジヱントアツセィ
(1) 導入用のブラスミ ドの構築
プロモーター領域を含む DN A断片と G US遺伝子とのキメラ遺伝子を 含むプラスミ ドを、 エレク トロポレーション法を用いてタバコ BY2培養 細胞のプロトプラストに導入するために、 まず、 導入用のブラスミ ドの構 築を行った。
1. ァズキ E XT 2遺伝子のプロモーター領域を含む DN A断片と GU S遺伝子とのキメラ遺伝子を含むプラスミ ドの作製 （トランスクリブショ ナル ·フュージョン） ァズキ EXT 2遺伝子のプロモーター領域を含む DN A断片と GU S遺 伝子とのキメラ遺伝子を含むプラスミ ドは、 図 20に示すように構築した c つまり、 カリフラワーモザイクウィルスの 35Sプロモーター、 ィ一' コ リ由来の G US遺伝子、 ノパリンシンテターゼに由来する転写終止配列力 セッ トを持つ pB 1221 (クロンテック社製） を用いて行った。
まず、 pB I 221の力リフラワーモザイクウイルスの 35Sプロモー ター領域を除くために、 このプラスミ ドを制限酵素 Hind III、 Sma I (宝 酒造社製） で消化した後、 ァガロースゲル電気泳動により 35 Sプロモー ター領域以外の目的のフラグメントを切り出し精製した。 次に、 実施例 1 3で作製した PVX2P501を制限酵素 EcoE I、 Hinc IIで完全消化し、 約 0. 5 k b pの挿入断片をァガロースゲル電気泳動によりを切り出し精 製した。 また、 実施例 13で作製した pEXT2p r 0 (F) f 3を制限 酵素 Hind III、 EcoR Iで完全分解し、 約 2. 55 k b pの挿入断片をァガ ロースゲル電気泳動によりを切り出し精製した。 これらの DN A断片をラ ィゲーシヨンした後、 ィ一 ' コリ： ί M 109に形質転換した。 このブラス ミ ドは、 p VAEXT2 GUSと命名し、 ρ V A Ε X Τ 2 G U Sで形質転 換されたィ一' コリ J Ml 09は、 Escherichia coli JM109/pVAEXT2GUS と命名した。 この pVAEXT2GUSは、 制限酵素 Hind III、 SnaB Iで 消化後、 ァガロースゲル電気泳動により約 3. 4 kbpのバンドを生じる ことにより、 約 3. Ok b pのァズキ EXT2遺伝子のプロモーター領域 全長を含むことがわかった。
2. ァズキ E XT 3遺伝子のプロモーター領域を含む DN A断片と GU S遺伝子とのキメラ遺伝子を含むブラスミ ドの作製 （トランスクリプショ ナル ·フュージョン） · ァズキ EXT 3遺伝子のプロモータ—領域を含む DN A断片と G US遺 伝子とのキメラ遺伝子を含むベクターは、 図 21に示すように構築した。 つまり、 カリフラワーモザィクウィルスの 35 Sプロモータ一、 ィ一 ' コ リ由来の GUS遗伝子、 ノパリンシンテターゼに由来する転写終止配列力 セッ 卜を持つ pB 1221 (クロンテック社製） を用いて行った。
まず、 pB I 221の力リフラワーモザイクウィルスの 35 Sプロモー ター領域を除くために、 このプラスミ ドを制限酵素 Hind III、 Xba Iで消 化した後、 ァガロースゲル電気泳動により 35 Sプロモーター領域以外の 目的の DN A断片を切り出し精製した。 次に、 実施例 14で作製した pV X3P 206約 0. を縴型にして、 PVX3P 206中のァズキ
E XT 3遗伝子のプロモーター領域の内の Nsp Vから下流の領域に位置す るブライマー VX3UH (配列番号 65) と翻訳開始点の直前の配列のプ ライマー VX3LX (配列番号 66) を用いて PCRを行った。 これらの ブライマー VX3UH (配列番号 65) とブライマー VX3LX (配列番 号 66) には、 それぞれ、 Xba Iサイ 卜と Hind IIIサイ トとが PCR産物 の両端に導入されるように合成した。 反応は 94°C (1分） 、 55て （1 分） 、 72°C (2分） のサイクルを 10回繰り返した。 反応後、 反応液の 5 1を 1%ァガロースゲル電気泳動したところ、 铸型プラスミ ドのバン ドの他に、 約 0. 4 k b ρのバンドが確認された。 プライマー VX3UH (配列番号 65) とブライマー VX3LX (配列番号 66) には、 それぞ れ、 Xba Iサイトと Hind IIIサイ 卜が導入されているので、 この約 0. 4 k b pの DNA断片をァガロースゲル電気泳動によりを切り出し精製した 後、 制限酵素 Hind III、 Xba Iで消化し、 先に精製した pB I 221の Hind ΙΙΙ-Xba I DN A断片にライゲーションした後、 ィー ' コリ J Ml 09に形質転換した。 このブラスミ ドは、 p VAEXT3GUSと命名し、 ¥八£ 丁30115で形質転換されたィー ' コリ J Ml 09は、
Escherichia coli JM109 pVAEXT3GUSと命名した。
この PVAEXT3GUSは、 制限酵素 Hind III、 Xba Iで消化後、 ァ ガロースゲル電気泳動により約 0. 4 k b pのバンドを生じることにより 約 0. 4 k b pのァズキ EXT 3遺伝子のプロモーター領域全長を含むこ とが分かった。
3. ァズキ XRP 1遺伝子のプロモーター領域を含む DNA断片と GU S遗伝子とのキメラ遺伝子を含むプラスミ ドの作製 （トランスレーショナ ル ' フュージョン）
ァズキ XRP 1の N末端ァミノ酸配列をコードする遗伝子 （配列番号 6 7) およびァズキ XRP 1遺伝子のプロモーター領域を含む DNA断片と G US遺伝子との卜ランスレ一ショナル ' フュージョンキメラ遺伝子を含 むベクターは、 図 22に示すように構築した。 つまり、 カリフラワーモザ イクウィルスの 35 Sプロモーター、 ィー · コリ由来の GU S遺伝子、 ノ パリンシンテターゼに由来する転写終止配列カセッ 卜を持つ pB 1221 (クロンテック社製） を用いて行った。
まず、 pB I 221を制限酵素 Xba I、 Sma Iで消化後、 ァガロースゲル 電気泳動によりこの DN A断片を切り出し精製した。 次に、 実施例 15で 作製した PXRG302を制限酵素 Xba I-Hinc IIで 2重消化した後、 ァ ガロースゲル電気泳動により、 約 1. l k b pの DNA断片を切り出し精 製した。 先に精製した P B I 221の DN A断片にライゲーシヨンした後、 ィー · コリ J M 109に形質転換した。
得られたコロニーより、 ブラスミ ドを調製し、 次に、 このブラスミ ドの 力リフラワーモザイクウイルスの 35 Sプロモーター領域を除くために、 制限酵素 Hind III、 Xba Iで消化し、 セルフライゲーシヨンした後、 ィ一' コリ JM109に形質転換した。 得られたコロニーより、 プラスミ ドを精 製した。 このブラスミ ドは、 p VAXRP 1 t 1 GUSと命名し、 p VA XRP 1 t 1 GUSで形質転換されたィー ' コリ J Ml 09は、
Escherichia coli JM109/pVAXRPltlGUSと命名した。 この pVAXRPl t 1 GUSを铸型にして、 Ml 3ブライマー M 4 (宝酒造社製） と Ml 3 プライマー RV (宝酒造社製） を用いて、 PCR後、 ァガロースゲル電気 泳動により約 3. Okbpのバンドを生じることにより、 約 1. l kbp のァズキ XRP 1遗伝子のプロモーター領域を含むことが分かった。
また、 pVAXRPl t 1 GUS中の GUS遺伝子上流側、 プロモータ 一領域までの塩基配列を決定したろころ、 この pVAXRPl t l GUS によりァズキ XRP 1遺伝子の N末端アミノ酸配列を持つ GUSとのトラ ンスレーショナル · フュージョンタンパク質が形成されるように、 ァズキ XRP 1の N末端ァミノ酸配列をコードする遺伝子の後に p B I 221由 来の遗伝子 （配列番号 68) を GUSが発現するように組込まれているこ とを確認した。
4. トマト EXT遺伝子のプロモーター領域を含む DNA断片と GUS 遺伝子とのキメラ遺伝子を含むプラスミ ドの作製 （'トランスクリブショナ ノレ . フュージョン） トマト EXT遺伝子のプロモーター領域 （約 1. 4kbp) を含む DN A断片と G US遗伝子とのキメラ遺伝子を含むベクターは、 図 23に示す ように橫築した。 つまり、 カリフラワーモザイクウィルスの 35 Sプロモ 一ター、 ィー ·コリ由来の G US遺伝子、 ノパリンシンテターゼに由来す る転写終止配列カセッ トを持つ pB 1221 (クロンテック社製） を用い て行った。
まず、 p B I 221のカリフラヮーモザィクウィルスの 35Sプロモー ター領域を除くために、 制限酵素 Hind III— Xba Iで 2重消化した後、 ァ ガロースゲル電気泳動により 35 Sプロモータ一領域以外の目的の DNA 断片を切り出し精製した。 次に、 PLXG103約 0. 3 t/gを鍀型にし て、 実施例 16で作製した pLXGl 03中のトマト E XT遗伝子のプロ モーター領域の Hind IIIサイ 卜から下流の領域に位置するプライマー; LX UH 1 (配列番号 69) と翻訳開始点の直前の配列のプライマー LXLX (配列番号 70) を用いて PCRを行った。 これらのプライマー LXUH 1 (配列番号 69) とブライマー LXLX (配列番号 70) には、 それぞ れ、 Hind IIIサイ トと Xba Iサイ トを付加し、 PCR産物の両端にこれら のサイ 卜が導入されるように合成した。 反応は 94°C (1分）、 55°C (1 分）、 72°C (2分） のサイクルを 10回繰り返した。 反応の後、 反応液 の 5 1を 1%ァガロースゲル電気泳動したところ、 铸型プラスミ ドのバ ンドの他に、 約 1. 4 k b pのバンドが確認された。 プライマー LXUH 1 (配列番号 69) とプライマー LXLX (配列番号 70) には、 それぞ れ、 Hind IIIサイ 卜と Xba Iサイ 卜が導入されているので、 この約 1. 4 k b pの DNA断片をァガロースゲル電気泳動によりを切り出し精製した 後、 制限酵素 Hind III、 Xba Iで消化し、 先に精製した pB I 221の D N A断片にライゲーションした後、 ィー ' コリ J Ml 09に形質転換した。 このプラスミ ドは、 pLEEXTl. 4GUSと命名し、 pLEEXTl. 4 GU Sで形質転換されたィー ' コリ J Ml 09は、 Escherichia coli J 109/pLEEXTl.4GUSと命名した。
この pLEEXTl. 4GUSは、 制限酵素 Hind III、 Xba Iで消化し た後、 ァガロースゲル電気泳動により約 1. 4 k b pのバンドを生じるこ とにより、 約 1. 4 k b pのトマト EXT遺伝子のプロモーター領域を含 むことが分かった。 また、 図 24に示すように、 タバコ EXT遺伝子のプロモーター領域と ホモロジ一のある領域のみを用いた、 GUS遺伝子との融合遺伝子 （トラ ンスクリブショナル · フュージョン） を有するブラスミ ドを作製した。 実施例 16で作製した p LXG 103約 0. 3〃 gを铸型にして、 p L XG 103中のトマト E XT遺伝子のプロモーター領域のうち、 タバコ E XT遺伝子のプロモーター領域とホモロ ジ一のある領域の 5' 上流に位置 するプライマー LXUH2 (配列番号 71) と翻訳開始点の直前の配列の プライマー LXLX (配列番号 70) を用いて PCRを行った。 これらの ブライマー; LXUH2 (配列番号 71) とプライマー LXLX (配列番号 70) には、 それぞれ Hind IIIサイ 卜と Xba Iサイ 卜を付加し、 PCR産 物の両端にこれらのサイ 卜が導入されるように合成した。 反応は 94°C (1分） 、 55。C (1分） 、 72。C (2分） のサイクルを 10回繰り返し た。 反応の後、 反応液の 5 ^ 1を 1%ァガロースゲル電気泳動したところ、 铸型ブラスミ ドのバンドの他に、 約 0. 7 k b pのバンドが確認された。 ブライマー LXUH2 (配列番号 71) とブライマー LXLX (配列番号 70) には、 それぞれ、 Hind ΠΙサイ 卜と Xba Iサイ 卜が導入されている ので、 この約 0. 7 k b pの DNA断片をァガロースゲル電気泳動により を切り出し精製した後、 制限酵素 Hind III、 Xba Iで消化し、 先に精製し た pB I 221の DN A断片にライゲーシヨンした後、 ィー · コリ JM1 09に形質転換した。 このブラスミ ドは、 pLEEXTO. 7GUSと命 名し、 pLEEXTO. 7 GUSで形質転換されたィー ' コリ J M109 は、 Escherichia coli 109/pLEEXT0.7GUSと命名した。 この pLEEXTO. 7GUSは、 制限酵素 Hind III、 Xba Iで消化し た後、 ァガロースゲル電気泳動により約 0. 7 k b pのバン ドを生じるこ とにより、 約 0. 7kbpのトマト E XT遺伝子のプロモーター領域を含 むことが分かった。
5. トマト E XTのプロモーター領域を含む DN A断片と G US遺伝子 とのキメラ遺伝子を含むブラスミ ドの作製 （トランスレーショナル ' フユ 一ジョン）
トマト EXTの N末端ァミノ酸配列をコードする遠伝子 （配列番号 72) およびプロモーター領域を含む約 4. 9 k b pDNA断片と GUS遺伝子 とのトランスレーショナル*フュージョンを含むベクターは、 図 25に示 すように構築した。 つまり、 カリフラワーモザイクウィルスの 35 Sプロ モーター、 ィー ' コリ由来の G US遗伝子、 ノパリンシンテターゼに由来 する転写終止配列カセッ トを持つ pB 1221 (クロンテック社製） を用 いて行った。
まず、 pB I 221の力リフラワーモザイクウィルスの 35 Sプロモー ター領域を除くために、 このブラスミ ドを制限酵素 Pst I、 BamH Iで消化 した後、 ァガロースゲル電気泳動により 35 Sプロモーター領域以外の目 的の DNA断片を切り出し精製した。 次に、 実施例 16で作製した pLX G601を制限酵素 Pst I、 BamH Iで完全に消化した後、 ァガロースゲル 電気泳動により、 約 4. 9kbpの DNA断片を切り出し精製した。 先に 精製した pB I 221の DNA断片にライゲーションした後、 ィー ' コリ J 109に形質転換した。 このプラスミ ドは、 p L E E X T t 14. 9 GUSと命名し、 p L EEXT t 14. 9 G U Sで形質転換されたィ一 · コリ J M 109は、 Escherichia coli JM109/pLEEXTtl4.9GUSと命名した。 この pLEEXTt l 4. 9GUSを、 制限酵素 Pst I、 BamH Iで完全 に消化した後、 ァガロースゲル電気泳動により、 約 4. 9kbpの DNA 断片を生じることにより、 約 4. 9 k b pのトマト EXT遺伝子のプロモ 一ター領域を含むことが分かった。
また、 pLEEXTt l 4. 9GUS中の GUS遺伝子上流側、 プロモ —ター領域までの塩基配列を決定したところ、 この pLEEXTt 14. 9GUSにより トマト E XTの N末端アミノ酸配列を持つ G USとのトラ ンスレ一ショナル · フュージョンタンパク質が形成されるように、 トマト E XTの N末端ァミノ酸をコードする遺伝子の後に p B 1221由来の遺 伝子 （配列番号 73) が GUSが発現するように組込まれていることを確 認した。
次に、 トマト E XTの N末端アミノ酸配列をコードする遺伝子 （配列番 号 72) およびプロモーター領域を含む約 1. 4kbpDNA断片と GU S遺伝子とのトランスレーショナル · フュージョンを含むベクターを、 図 26に示すように構築した。 つまり、 カリフラワーモザイクウィルスの 3 5 Sプロモーター、 ィー ' コリ由来の GU S遺伝子、 ノパリンシンテタ一 ゼに由来する転写終止配列カセッ トを持つ pB 1221 (クロンテック社 製） を用いて行った。
まず、 pB I 221の力リフラワーモザイクウィルスの 35 Sプロモー ター領域を除くために、 このプラスミ ドを制限酵素 Hind III、 BamH Iで消 化した後、 ァガロースゲル電気泳動により 35 Sプロモーター領域以外の 目的の DN A断片を切り出し精製した。 次に、 実施例 16で作製した pL X P 101を制限酵素 Hind III、 BamH Iで完全に消化した後、 ァガロース ゲル電気泳動により、 約 1. 4 k b pの DNA断片を切り出し精製した。 先に精製した pB I 221の DNA断片にライゲーシヨンした後、 ィー · コリ J Ml 09に形質転換した。 このプラスミ ドは、 p L E EXT t 1 1. 4GUSと命名し、 pLEEXTt 1 1. 4 G U Sで形質転換されたィー · コリ J M 109は、 Escherichia coli J 109/pLEEXTtll.4GUSと命名した。 この pLEEXTt l l. 4GUSを、 制限酵素 Hind III、 BamH Iで完 全に消化した後、 ァガロースゲル電気泳動により、 約 1. 4kbpの DN A断片を生じることにより、 約 1. 4 k b pのトマト EXT遺伝子のプロ モーター領域を含むことが分かった。
また、 pLEEXTt 1 1. 4GUS中の GUS遺伝子上流側、 プロモ 一ター領域までの塩基配列を決定したところ、 この pLEEXTt 1 1. 4GUSにより トマ卜 E XTの N末端アミノ酸配列を持つ GUSの卜ラン スレーンョナルフュージョンタンパク質が形成されるように、 トマト EX Tの N末端アミノ酸をコードする遗伝子の後に pB I 221由来の遺伝子 (配列番号 73) が GUSが発現するように組込まれていることを確認し た。
6. タバコ E XT遺伝子のプロモーター領域を含む DN A断片と GUS 遗伝子とのキメラ遗伝子を含むブラスミ ドの作製 （トランスクリブショナ ル · フュージョン）
タバコ E XT遗伝子のプロモーター領域を含む DN A断片と G US遗伝 子とのキメラ遺伝子を含むベクターは、 図 27に示すように樣築した。 つ まり、 力リフラワーモザイクウィルスの 35 Sプロモーター、 ィ一 · コリ 由来の GUS¾伝子、 ノパリンシンテターゼに由来する転写終止配列カセッ トを持つ pB 1221 (クロンテック社製） を用いて行った。
まず、 p B I 221のカリフラワーモザィクウイルスの 35 Sプロモー ター領域を除くために、 このブラスミ ドを制限酵素 Pst I、 Xba Iで消化し た後、 ァガロースゲル電気泳動により 3 δ Sプロモーター領域以外の目的 の DNA断片を切り出し精製した。 次に、 実施例 17で作製した pNXG
102約 0. 3 gを铸型にして、 pNXG 102中のタバコ EXT遺伝 子のブロモータ一領域の Hind IIIサイ 卜より下流の領域に位置するプライ マー NXUP (配列番号 74) と翻訳開始点の直前の配列のプライマー N XLX (配列番号 75) を用いて PCRを行った。 これらのプライマ一 N XUP (配列番号 74) とプライマー NXLX (配列番号 75) には、 そ れぞれ、 Pst Iサイ 卜と Xba Iサイ トを付加し、 PCR産物の両端にこれら のサイ 卜が導入されるように合成した。 反応は 94°C (1分） 、 55°C
(1分） 、 72°C (2分） のサイクルを 10回繰り返した。 反応の後、 反 応液の 5 / 】を 1%ァガロースゲル電気泳動したところ、 铸型ブラスミ ド のバンドの他に、 約 0. 8 k b pのバンドが確認された。 ブライマー NX UP (配列番号 74) とプライマー NXLX (配列番号 75) には、 それ ぞれ、 Pst Iサイ 卜と Xba Iサイ 卜が導入されているので、 この約 0. 8k bpの DNA断片をァガロースゲル電気泳動によりを切り出し精製した後、 制限酵素 Pst I、 Xba Iで消化し、 先に精製した p B 1221の DNA断片 にライゲーシヨンした後、 ィー · コリ JM109に形質転換した。 このブ ラスミ ドは、 pNTEXTO. 8GUSと命名し、 pNTEXTO. 8G USで形質転換されたィー ' コリ JM109は、 Escherichia coli JM109 /pNTEXTO.8GUSと命名した。
この pNTEXTO. 8GUSは、 制限酵窠 Pst I、 Xba I消化後、 ァガ ロースゲル電気泳動により約 0. 8 k b pのバンドを生じることにより、 約 0. 8 k b pのタバコ EXT遠伝子のプロモーター領域を含むことが分 力、つた。 7. 小麦 EXT遺伝子のプロモーター領域を含む DNA断片と GU S遺 伝子とのキメラ遗伝子を含むブラスミ ドの作製 （卜ランスクリプショナル フュージョン）
小麦 E XT遺伝子のプロモーター領域を含む DN A断片と G US遺伝子 とのキメラ遺伝子を含むベクターは、 図 28に示すように構築した。 つま り、 力.リフラワーモザィクウィルスの 35Sプロモーター、 ィ一 ' コリ由 来の G US遗伝子、 ノパリンシンテターゼに由来する転写終止配列カセッ トを持つ pB 1221 (クロンテツク社製） を用いて行った。
まず、 pB I 221の力リフラワーモザィクウィルスの 35 Sプロモー ター領域を除くために、 このプラスミ ドを制限酵素 Hind III、 Sma Iで消 化後、 ァガロースゲル電気泳動により 35 Sプロモーター領域以外の目的 の DN A断片を切り出し精製した。 次に、 実施例 18で作製した pKEP 一 1約 2 gを制限酵素 Hind III、 Nae Iで完全消化した後、 ァガロース ゲル電気泳動により約 0. 61^ と約0. 5 k b pの DNA断片を切り 出し精製した。
先に精製した pB I 221の DNA断片に、 約 0. 6kbpと約 0. 5 k b pの DNA断片両方をライゲーションし、 ィー · コリ J Ml 09に形 質転換した。 これらのブラスミ ドは、 pTAEXTl. 1GUSと命名し、 これらで形質転換されたィー ' コリ J Ml 09は、 Escherichia coli JM1 09/pTAEXTl.1GUSと命名した。
この pTAEXTl. 1GUSは、 制限酵素 Hind III、 EcoR I消化後、 ァガロースゲル電気泳動により、 約 3. 3 k b pのバンドを生じることに より、 約 1. lkbpの小麦 EXT遺伝子のプロモーター領域を含むこと が分かった。 (2) エレク 卜口ポレーショ ンによる遺伝子導入
エレク トロボレーシヨン法を用いて上記実施例 20の 1. 〜7. におい て作製したブラスミ ドをそれぞれタバコ BY 2培養細胞に導入するために、 タバコ BY 2培養細胞を、 1 %セルラーゼ 'オノズカ R S (ヤクルト本社 製） 、 0. 1%ぺク トリアーゼ Y 23 (盛進製薬社製） 、 0. 4Mマンニ トールを含む酵素液 （pH5. 5) を用いて 30てで 2時間処理すること により、 細胞壁の除いたプロトブラストにした。 2x 106個のタバコ B Y 2培養細胞プロ 卜プラストを、 エレク トロボレ一ション緩衝液 （70 m MKC 5mMMES、 0. 3Mマンニトール、 pH5. 8) に懸濁し、 上記 1. 〜7. において作製したプラスミ ド DNA 3 pmo 1と 10%P EG6000ノエレク トロボレーション緩衝液を加えて混合し、 ジーンパ ルザ一 I I (バイオ ·ラッ ド社製） を用いて、 電気パルス （300 V、 1 25^F) を与え、 植物細胞内に DNAを導入した。
導入後、 26°C、 オーキシンとして 0. 2mg/l 2. 4一 D、 1%シュ 一クロース、 0. 4Mマンニトールを含むリ ンスマイヤー 'スクーグ培地 [フィジォロジァ♦ブランタルム、 第 18卷、 第 100頁 （1965) ] で 40時間培養し、 その後細胞を回収し、 回収した細胞に抽出緩衝液 [5 OmMリン酸緩衝液 （pH7. 0) 、 10mMEDTA、 0. 1%トリ ト ン X— 100、 0. 1%サルコシル、 10mM2—メルカプトエタノール） 200 1を加えて、 エツペンチューブに移し氷上で超音波破碎機 W— 2 25 (ヒートシステムズ一ウルトラソニックス社製） を用い、 アウトブッ ト . コントロールを 1. 5、 デューティサイクルを 50%として 30秒間 超音波破砕した。 その後、 遠心分離し、 その上清を GUS活性測定および タンパク量の測定に用いた。 (3) プロモーター活性の測定
上記の抽出液 30 u 1を蛍光用の 96穴マイクロタイタープレートにと り、 これに抽出緩衝液 4 δ 1と基質 4 mM 4— MUG 25 u 1を加えて 反応させた。 5、 35、 95分後に、 反応停止液 （1MN a 2C03) 50 1を加えて反応を停止した。 そして、 蛍光プレートリーダー 〔フルォロ スキャン I I (ラボシステムズ社製） ] で励起波長 365 nm、 蛍光波長 455 nmの条件で反応産物 4一 MUの発する特異的な蛍光を測定した。 また、 タンパク量の測定は、 例えば、 抽出液の 1 5希釈液および 80 0 g/m 1 B S A標準液 [抽出緩衝液 20 a 1に lmgZm 1 B S A 80^ 1を加える] の 2、 5、 10、 15、 20、 30 1を 96穴マイ クロタイタープレートにとり、 それぞれ全量 200 1になるように蒸留 水 158、 155、 150、 145、 140、 130 1とバイオラッ ド プロテイン ·アツセィ ·キッ ト定量試薬 （バイオ · ラッ ド社製） 40 1 を加え静かに撹拌した。 次に室温で 20分間放置し、 その後 60分以内に プレー卜リーダー （波長 590 nm) で測定することにより、 タンパク量 を定量した。
GUS活性は、 上記測定の際に、 同時に 4一 MU標準液の蛍光強度を測 定し、 その結果を、 横軸に 4一 MUS (pmo 1) 、 縦軸に蛍光強度とし てグラフにプロッ 卜した後、 その傾きを求めることにより 1蛍光強度当た りの 4一 MU量を求め、 さらに、 試料で行った結果を、 横軸に時間 （分） 、 縦軸に蛍光強度としてグラフにブロッ 卜し、 蛍光強度の增加速度を求める ことにより、 4一 MUGの分解速度 =GUS活性としてを求めた。 さらに、 タンパク量より GUSの比活性を求めた。 これらの結果を、 図 29に示す。 すなわち図 29は、 形質転換タバコ BY 2培養細胞の G USの比活性を比 較した図である。 但し、 図 29は、 合計 7回行った導入実験を比較するた めに、 pLEEXTl. 4GUSを導入の際の比活性を値を 100とし、 各ブラスミ ドの導入の際の GU Sの比活性を求め、 各プロモータ一活性の 強さの比較のグラフとして表示した。
図中、 縦軸は pLEEXTl. 4GUSを導入の際の GUSの比活性を 値を 100とした場合の他のブラスミ ドを導入した際の比活性の値を示し、 横軸は導入実験に用いたプラスミ ドを示す。 また、 n数は、 2〜7である c これにより、 これらの E XT遺伝子のプロモーター領域を含む DN A断 片は、 植物内で強い発現を示すと言われる力リフラヮーモザィクウィルス の 35 Sプロモーターより強い活性を示すことが確認できた。 この図から 分かるように、 特にァズキ XRP1、 トマト EXTのプロモーターの活性 は著しく高く、 トマト EXTのプロモーターでの比較から、 トランスレ一 ショナル *フュージョンの方が効率のよいことが確認できた。 以上のように本発明により、 植物細胞の Xyloglucan再構成の必要な部位、 時期に特異的に発現するエンド型キシログルカン転移酵素 （EXT) をコ 一ドする遺伝子およびそのファミ リ一遺伝子のプロモーターが提供される。 また E XT遺伝子およびそのファミ リー遺伝子のプロモーターのクロー二 ング方法、 EXT遗伝子およびそのファミ リー遺伝子のプロモーターを含 む植物形質転換用のべクターおよびその作製方法、 E X T遺伝子およびそ のファミ リー遗伝子のプロモーター発現の調節方法、 E XT遺伝子および そのファミリー遺伝子のプロモーターを用いた植物体の形態制御方法およ び植物体が提供される。 図面の簡単な説明
図 1は、 p VXP 101の挿入断片の制限酵素地図である。 図 2は、 pVXP— H 3の挿入断片の制限酵素地図である。
図 3は、 実施例 10における培養細胞のノーザンハイプリダイゼーショ ンの泳動パターンを示す図面代用写真である。
図 4は、 実施例 10における培養細胞の増殖状態を示すグラフである。 図 5は、 実施例 11のトランジェントアツセィの結果を示すグラフであ る。
図 6は、 p B VEG 101の構築図である。
図 7は、 pBVEGl 21の搆築図である。
図 8は、 pB I— H— 101の構築図である。
図 9は、 pB I— H— 121の構築図である。
図 10は、 実施例 12における形質転換シロイヌナズナの G US染色の 結果を示す図面代用写真である。
図 11は、 実施例 13における PCRにより増幅した約 6. Okbpの D N A断片の制限酵素地図である。
図 12は、 実施例 14における P CRにより增幅した約 4. 5k bpの D N A断片の制限酵素地図である。
図 13は、 pXRG 302の挿入断片の制限酵素地図である。
図 14は、 pLXGl 01の挿入断片の制限酵素地図である。
図 15は、 pN'XG 102の挿入断片の制限酵素地図である。
図 16は、 pKOM— 1の挿入断片の制限酵素地図である。
図 17は、 pKEP— 1の制限酵素地図である。
図 18は、 実施例 19における植物のノーザンハイプリダイゼーション の泳動パターンを示す電気泳動図である。
図 19は、 実施例 19における植物の RT— PC R後の泳動パターンを 示す電気泳動図である。 図 20は、 ¥八£ 丁20115の構築図でぁる。
図 21は、 p VAEXT3GUSの構築図である。
図 22は、 pVAXRPl t 1 G USの構築図である。
図 23は、 pLEEXTl. 4GUSの構築図である。
図 24は、 pLEEXTO. 7GUSの構築図である。
図 25は、 pLEEXTt l 4. 9GUSの構築図である。
図 26は、 pLEEXT t 1 1. 4GUSの構築図である。
図 27は、 pNTEXTO. 8の構築図である。
図 28は、 pTAEXTl. 1GUSの構築図である。
図 29は、 実施例 11および実施例 20における形質転換タバコ培養細 胞の G U Sの比活性を比較した図である。
配列表 配列番号： 1
配列の長さ ： 1875
配列の型：核酸
鎖の数：二本鎖
トポロジー：直鎖状
配列の種類： Genomic DNA
起源
生物名： ビグナ ·ァンギュラリス (Vigna angularis)
配列：
AAGCTTTHG CACATATTTG CAGCAGTAGA CAATGCCACT CGCTGAAAAA TATGATCTCC 60 CAGAATTTTG GCACAAAAAA TATATCCTAA CTAATATTTG ACTCTATCTA AGATACCACC 120 TGACATCAAA TGTTTCAATT TTATAGTCTT TAGCACGAGA AGATGTATAT TAGATATAAA 180 CCTTATCTTA TTTAATTAAT TTAGTAAGAT TGAATTAGAG GTAAATTTTA TTACTTAATA 240 TAATTAGACT ACTCATAAAT ATATAAATTT AAATTTTAAG TGTTCATTCC AATATATGAA 300 ATCTATTGAA AATATCACGT CAACTAATAA TATAACAAAA CTATAATATA AAAATAAGTA 360 TAAATTTTAT ATTTATAAAC AATTTTGACA TTAAATTAAA CTTAAATTTA TCTCTATTAA 420 TAATAATATT ATAAGACAAA TTACTCTGCT AAAATACAGA AAACAATATA TTTTTTTGAA 480 ACTTTGAAAT ATTATAHGT TGGATGATGT TGGATAATTA GAAAGGACAT ATTATATATA 540 TGTCACGTTG AGATGAGTGG CCCATTGCAC TGAAAATGAC TGACAAATGG TACTCTCAAT 600 CCCATC丽 TCTCTGTTCA ATTTTTTTCA CTTGAAAACT CTTTTTCCCT ATGGAAAATA 660 GCAATAACTA CAATATCCTC GTTTCTTCTT GTTAGCTCTT GGCTACAACT GTGTTCATCT 720 TCTCCACTTT CATCAATACA ATTCCAAACA GAATATACTT AGACCCTTCT GCTATTTCAA 780 GAAAGTAGCT TGCAAATTTG CTTTGTTTCC GACATACACT TCAATATGAA AAAAAAAAAA 840 AAAACACTTT GAGAACTTTT TAAAAAGTAT TAAGTAGGAT TTGACGGCAG AATTTTGTTT 900 CCATATTTAG TTGAAAATAC ATACAAAACG TATTTGAAAG TTATATTCGA TTGAATTTGG 960 TTTTAACATA GAAAAAATTC AACCAAATTA AGTCCATACT TAAGCATTAA TATAAATATT 1020 TCAGTTATTC GACTTCGGTT TCACGTCTTG CCATTGTTTT ACATGTGTAA TACTTCAATT 1080 AATTTTTTAT GTTTTCATGT CTCTTTATCC ACTCCCTTTA TTTTTACATT ATAATACCAC 1140 ATTCCTCCAA TACTATAATT CTTAAGATAT ATGTGAACAT TAATATCTAA TGATACATAA 1200 GGTAAGTTGT AAATATTCAT AGAAAAAATA AAATGACTTT TCAAGAAAAC CAACAACTAA 1260 ATATAAAATA TAGAAAAGTT ATTTACAATT TTGTCCGTTA ACATGTCCAG ATATTACACT 1320 CTCAAAAGAA AAAGTGTTAG AAAAATCATA TAAAATAGAG TTCAAATTCT TTGTTAGATT 1380 TTTTTTACTG AACATTTAAA ATATATAHG ATATTGATTA TTCATTTTTA TAAATATATT 1440 TTAAAATTAA CATTCAATAT ATATATTTTA AAATTAACAT TCAATATATA TATTTTAAAG 1500 ACACAGAAGA AACAACAAAT TCCATAAAAT TGTGAGATAA TATTTAACCC TAACTTTCTT 1560 ATGAACTGAG AGATTTTACA TTTATGAGAA ATGATTGTCC TGTGTTAATT ATCCATGTCA 1620 GCTACCTAAT CACTAGAAAA GCTAATCAGA ATTCTGTGAT CTAGTCCTAC TATTCAAACA 1680 CTTTTAGGCC AAAGAAAATT GAAACACAAA ATACCAGTTC TCAAATACAA TGAACATTAT 1740 TAATTATAAT TCAGTTAAAA GTCATTGATC AGAACAGCAG TGAAGGTTAG CTATAAGCGC 1800 GTTATAGGTG CAGGCAGAGT GTCGTGCCTA TATATACCCT TTGGAATGCA CAAGTTGAAA 1860 CACAAAAGAA AAATG 1875 配列番号： 2
配列の長さ ： 1965
配列の型：核酸
鎖の数：二本鎖
トポロジー：直鎖状
配列の種類： Genomic DNA 起源
生物名： ビグナ ·ァンギュラリス
配列：
AAGCTTCAAG TAAGTCTCTG TGATATGTAT GCAAGGGTTC GAAATGAGAA GAAGGCCCTT 60
CAAATTCTAG GTGTACTGGA ATCTAGGAAG GATGAATTAG GAAAAGCTGA TTTTGAGAGA 120
ATTATAAGTG GCCTTATTGA TGGTGGGTTT CGGCAAGATG CCCAACGAAT ATGTGGGATC 180
ATGGAGGCGC AGGATTTCGA TGCATCAAAG GTTAAGGTCA ACCTTATGAA GCCTGTCTCT 240
AGAGGACCTC GTATGAGATA GTTTAGTGGT CATGAATTGG GACATTTTAG TCTTTCTCTG 300
CAAGTGAGTT ACAAATGTAT TACCTTATAT AGGAAGCAAT GTCTGCATGA TTTATCATAC 360
CATGTAACAA ATAAGAATGA ATTTGTTTAT GGATTTTTCC ATTGCTCAGA TTCTGAATTT 420
ACGCAATTTT TTTTTTCTTT TGAACTTTAG TTGTTTGTAT ATACAAATGT CTTCTGTGGC 480
ATGTTCATGG AATTTTCATT TCCAATTATT CAATATTCTT GTGGTGTGAT CATCACTTTT 540
GTTAGGCAAA TCTGACAGCA CTGATGCCCC CTATCAGGAT TTTTAAACTT GTATGCGGTA 600
TACTATACTG ATCACAAGAT ACAAACTAAT ATAAATGGAT AGGAAATGCA GATGGGATGG 660
TTCAAGCTAG TCTTTAATAT TGAGATAGTA CAGAAAATGC AATGCCCAAA GTAAACAACG 720
CTGATATTTC AAAATCACAT ATTAAAGCTA AAGTTGGTAG CAACTAGCGT GAGAGCATCC 780
TAGTCTAGAC TGTGAATGCA GTATTTATAC ACTACAATGA TCTAAATAAG ATGCTACTAA 840
TGCAATCATG CTTAATGTAA TATGAAHGA TCTAAAGTAG CTTGCAAATT TGCTTTGTTT 900
CCGACATACA CTTCAATATG AAAAAAAAAA AAAACACHT GAGAACTTTT TAAAAAGTAT 960
TAAGTAGGAT TTGACGGCAG AATTTTGTTT CCATATTTAG TTGAAAATAC ATACAAAACG 1020
TATTTGAAAG TTATATCCGA TTGAATTTGG TTTTAACATA GAAAAAATTC AACCAAATTA 1080
AGTCCATACT TAAGCATTAA TATAAATATT TCAGTTATTC GACTTCGGTT TCACGTCTTG 1140
CCATTGTTTT ACATGTGTAA TACTTCAATT ΑΑΤΠΤΤΤΑΤ GTTTTCATGT CTCTTTATCC 1200
ACTCCCTTTA TTTTTACATT ATAATACCAC ATTCCTCCAA TACTATAATT CTTAAGATAT 1260
ATGTGAACAT TAATATCTAA TGATACATAA GGTAAGTTGT AAATATTCAT AGAAAAAATA 1320 09 P /
AAATGACTTT TCAAGAAAAC CAACAACTAA ATATAAAATA TAGAAAAGTT ATTTACAATT 1380 TTGTCCGTTA ACATGTCCAG ATATTACACT CTCAAAAGAA AAAGTGTTAG AAAAATCATA 1440 TAAAATAGAG TTCAAATTCT TTGTTAGATT TTTTTTACTG AACATTTAAA ATATATATTG 1500 ATATTGATTA TTCATTTTTA TAAATATATT TTAAAATTAA CATTCAATAT ATATATTTTA 1560 AAATTAACAT TCAATATATA TATTTTAAAG ACACAGAAGA AACAACAAAT TCCATAAAAT 1620 TGTGAGATAA TATTTAACCC TAACTTTCTT ATGAACTGAG AGATTTTACA TTTATGAGAA 1680 ATGATTGTCC TGTGTTAATT ATCCATGTCA GCTACCTAAT CACTAGAAAA GCTAATCAGA 1740 ATTCTGTGAT CTAGTCCTAC TATTCAAACA CTTTTAGGCC AAAGAAAATT GAAACACAAA 1800 ATACCAGTTC TCAAATACAA TGAACATTAT TAATTATAAT TCAGTTAAAA GTCATTGATC 1860 AGAACAGCAG TGAAGGTTAG CTATAAGCGC GTTATAGGTG CAGGCAGAGT GTCGTGCCTA 1920 TATATACCCT TTGGAATGCA CAAGTTGAAA CACAAAAGAA AAATG 1965
配列番号： 3
列の長さ ： 2960
配列の型：核酸
鎖の数：二本鎖
トポロジー ：直鎖状
配列の種類： Genomic DNA 生物名： ビグナ 'アンギュラリス
配列：
AAGCTTGATA GATACAATTT GTATGTACCA ACTTGAGAGG AGTGmAAT ATATTATTTT 60 TATTTTATAT TTATCTTHA TTTTTAGTTA GTTTGTTAH ATTTATTATT TGTATTHGG 120 GCTTAGTACA TATTTCTTCT ATTATAAATA AAAGACTCTA CGTGTATATT CAACATAAAG 180
GAGATTAATC TTATACATAA TTTTCACTAT ATTCAACAAC TATCATAAAA AACATGTAAA 240 AAGAGGCAAT TACCATTGCA TCTTTAACAA CAATTGTGAC TTTAAACTAT CGTTATTACT 300 AGTAACAAAA TCCTATTTTT ATACATGTAA ATATTTAGGA TGAAAATTAT CTCTTTCCAT 360 TGAATAATAA TAAACTTTGG ATAAATAAAA TTTGATCCTG TATTATTAAT TTTATTTTTG 420 AAAAGAATGA AAATTTTAAT TTAATTTTTC ATTACATACA AATTTTCAAA TTCATTAGTA 480 ATTATAAAAT AGTTTCATGT TTTTGTTAAA TTAGTTGTCA AAACATATTT TTAATAAAAT 540 ATCTCGAAAA AAATGTTAAC AATAAAAAAT AGGACCTTTT GACACTCCAT AAAAAAACAT 600 GTTTTTTTAA TCAGAAAAAC ATGTTATAAT AATCGATAAT ACTATTCTTC ATATATCAAT 660 GTATACATGT TAGAAATACT ATATATGTTA CTCAAACTAA TATAATATAT ACTTATATTT 720 CAAAAATAAA AGAAGATAAA ATTATCCTAC ATATTGTTTC TTTAAATTTA CATATAAAGT 780 CATATTATCG TTTTGAGTAC TCACTTAAAT AATCAAACAT GGTATATCAT ACAACATATA 840 CATATATTAG TTTACAGATA AAATTATAAC AAAATCTATC TAATTCACTT TTTAAGAACA 900 CAAATATTTA ATTACATTTC AATATTCAAA GTAATTTGTT ATTGATATAT TTAGAGGATT 960 CATATTAAAC ACATGTAACA AGGAAAATAT ATAGAAAATA TCGTCTTATT TCAAAGTTAG 1020 ATAATTCATT TAACATAAGT CTTTTCTATT CTTGTCACCT AATATCTTAA TGCTTATAAT 1080 CTATAACCCC CCCAACAATA TATCATATTT ACATAATGAT TTATACTATC AATAATATCA 1140 TGACTCTTGA GACATAATAT CATCTCTCAC CATACACTCC CAAAATAACA ATATCATATA 1200 TAACATCATA AAAGTATCCA CATGAAATAT ACATCATCAT AATACCACAC ATTTTCATCA 1260 TAAACATACA CATATTACAT ACATGAATAC TAATCTTTCA ACACAATACC GTCACATGGG 1320 AGAACTTAAT TTGCCTCTCG TCCCAAAGGA GAAAACCTAA AATAACAAAC ΑΑΑΤΤΤΠΠ 1380 TTTTGTGTTA GTAAACATAC ACACTTTTTT AACACTCATA CAATTCACAT ATCTAAAATA 1440 ATATTTAATG AAATAAATGT AAGTTAATTA AGTGCCAGTT ATCTAAAAGT GATATGCCTA 1500 CTAGTCAATG GATTTAGAAC ACCAAATATC CCAAHAAGT TATTAAAACA CCTTAGHTA 1560 AACCTTTATA TCATTAGCAC CATTATAATA AGAAAATTTG AATAACAGGA AATTAAACAA 1620 TTACATTTGA TCAATAATAT ATTTAAACTG CCTTGATATT TTTACCTGCT ATCTCTTTGC 1680 ATAAAATATA TATTTGAHG TAATTTTAGA TTTTATATAT TATAAAAAAA nAGTTTTAG 1740
Figure imgf000133_0001
Figure imgf000133_0002
AA CCTAAATGAG GACTACAAAAAATAGGACAAAGAAAA CTAAT TTAAAAT
鎖の数：二本鎖
トポロジー：直鎖状
配列の種類： Genomic DNA
起源
生物名： ビグナ ·ァンギュラリス
配列：
CCACCGCGGT GGCGGCCGCT CTAGACATAA TGATCTCTTT CAATGATCAC CATTAAATAT 60 AGACACAAAA TAGATTTGAA CTTAAGATTT ATCAAATTAA GTTTAACAAC TAAAATCCAA 120 CCAGAGAACC ATGATCTCTA TCCACAAGTT ATTTTAGAAT GATTTGAGAA TGAAATTCTA 180
CTAATTAAGT CATAAAAGTA TAACAAAAAA CATGAACATA TAGAAATGAT AATGAAATGC 240
ATTTTTTTAA CTATTCTTGC AGGATAGAAA ACATACTGCA AAGATTCCAG AGAAAGTTTT 300
TCTCTTTACT CTTCAACCTT TTAGCTCATA TTCTTCCATG TCTAGGTATC GTTCCAAGCG 360
AGAAGAAGTG TGTTTGTAAA AGACACTATG ACGCTCAAGT AAGGAGTGTG CCTTTGATGA 420
TAATAAATAT TTTAATAATG AACACATAAT TAATTACCTC GTGAACAAGA CTATTTATAT 480
TAGGTHATG GGTCCTTACC TGTTGGGCTT GGATTACATA GATAATCATC ATGGTTAATT 540
TGTTTAGTGA TCTTGCTAAT ACTTTTAACT CTTAACCTTT ACTGATCCTT ACTATTACAA 600
TGTGATCTTA AACATTACAA AATGAAATAA TGTTAGGTAG GTGTTCATGA ATATTTAAAA 660
TGATTCTTGA TCGGTATGAG CCAAAATCAT CTCTGGTACA TATAAATAGA GATGAGTTTA 720
GTCATTACAT ACCCACATAA TGTTAAGTAG ATGTTTACAT ATGATTGATA AGATAACCTC 780
TCGTATATAG GTTGAAATGG TCTTTGATAC ATGTAATAAC ATTAGATGH AATAGTTAAA 840
AATTGAHAA AATAAAATTA CATATAATAA TTTATTTTGA TACATATTGC CAGACCTCAT 900
HAAAACGCA CCCAAAAACC TTCTGAACGG ACGTCAGGTG TCAAGCGAAG AGGATCCGGA 960
AATCAGATAG TGGAAGGCAG GTGTCGGCAG ATGAGCGGAC GCTCGTTTTG ACGTGGGAAG 1020
CAAAACTTGA TTTTTCAGAA AATTCACGTC ACACTCTCTG CATGCACCTT CTTCCCCAAA 1080
CTCTGAAAAT TTTATTTCTC CTCCTTCTCA CTAAAAACTC TCCCTTCTCT CTATAAAATA 1140 -εει -
OWZ II3VV913V0 VIV3V11DVV YVVVV3V3V1 VIVIIVDUV V0VV9VVVVV 1VVV9VVV1V
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配列の長さ ： 1127
配列の型：核酸
鎖の数：二本鎖
トポロジー：直鎖状
配列の種類： Genomic DNA
起源
生物名： ビグナ ·アンギュラリス
配列：
TCTAGATGGT TTCACCCAAC TACATGTTTT GTTCTGTTTT GCTTTGGTTT CAAACTTGTG 60 ATAAAAGCAA CGCGTTGAGT CTGTTTGTCA ATTTTGTTCG ATTTCAGATT CTCTGTGGAT 120 GGAACTCCAA TAAGGGAGTT CAAGAACATG GAGTCAAAGG GTGTTCCATT CCCCAAAAAC 180 CAAGGCAATG AGGATATACT CAAGCCTTTG GAATGCAGAT GAHGGGCCA CAAGGGGAGG 240 GCTTGTTAAA ACCGATTGGA GCCAAGCTCC ATTCACGGCT TCATACAGAA ACTTCAATGC 300 CAATGCTTGC ACTGTGTCCT CTGGAACTTC TTCTTGTTCA AACTCTGTCT CTTCTCCCAA 360 TGCTTGGCTC TCGGAAGAAT TGGACTCTAC TAACCAGGAG AGACTGAAGT GGGTACAGAA 420 GAATTACAAT GATCTACAAC TATTGCACCG ACGCCAAAAG ATTTCCACAG GGCCTTCCTA 480 CAGAGTGCAA CACTGCCTAA TTTTTCTTAT CAATCCTTTC CATGCTCCAC TTTCTTTTTT 540 ATTTCTTCTG TTGTACTTTC CATCATGATC AATTCTTTTA TTCATTGTAA AACATTGCTA 600 TCATGATAAG TTTTCTTAAA TATTTGCATA AGAAACTTGC CGTATAAATC GTCTATAAGC 660 AGGAAACTAA AATAGTCCAG GAAATCGAGA ATCGAGAAAC GAGAATTTCC AGGTCACCAA 720 CCTGTGAAAA TTGTHTTGA TCTTCGATAA AAGTATTAGT TAATTAAAAA AACACAAGAT 780 TGTTGAAAAT ATTAAATAAT AGAAACCATG TACTGTGTAT GGCGGTGTCT CCTTATATAA 840 ATTTCATGCA GAAACGCGTG AAATGATTGG TGTGGGCGTC CATTTACAAC AACAAAACTT 900 ACTACTTTTT CATTCTTCAC CAGCTGTCTA CAACTAATTC AAAAGTTCAC AACCTACCTT 960 TTTCTCACTT TCCTCTTATC TACCAATCTC TCTTTTTTTC TCCTATAAAT ACCATCCTTT 1020 GCAGTATCAA CCAACATTCT CACAAATAAC CAAAAACAAT TTCACTCAGT TTCACACAAA 1080 ACAATTCTGC ATGGCATTTT CAAGACTTTT ACTGTTAACA TGCATTG 1127
配列番号： 6
配列の長さ ： 1406
配列の型：核酸
鎖の数：二本鎖
トポロジー：直鎖状
配列の種類： Genomic DNA
起源
生物名： 卜マ卜 (Lycopersicon esculentum;
配列：
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配列の長さ ： 800
配列の型：核酸
鎖の数：二本鎖
トポロジー：直鎖状
配列の種類： Genomic DNA
起源
生物名 = タノ、コ (Nicotiana tabacum)
配列：
TCTAGAGTTA GATCCCGAAT AATTATCTTA CACCTATCCT ATCAAAACTC TATTTTCTCT 60 CATTGATAAC CTTCTTTGCT TATTCCTTGT TTCGATAATC ACTAGTCAAT AGATTTAGAT 120 TCGTAGTTAA TTTTAGTATT AATCATATAA ATCTCAACTG TTGATCCTCT TGGATAGCAA 180 TCAAGGTAGA AACTACGAGA ATACTGTTTA AATCCAATCC TTGTGGATAC GATATTATAC 240 TATATTATCT TTGATTATTG AGCATAATTA AGTGTGTGTT TTGCGTTCGT TACAAAAGTC 300 AAGTTTTCTT GAAAATAAAA ATTTCAAATT ATGTTATACT ATTTTATAAT AGTACTTTAC 360 TATAGCAGTC AAAAAATATT TGGAACAAAA TGAAATTGTT ATAGAGGGGT TTAGACATTT 420 TAAGCGATAA TTAAAAGTGA AAAGCACGCG CTATTAGGTC GAGTGAAATG AATGGGGTCA 480 TATAACTTTC CTCCTCGGTC TGAGAGTGAC AAAGCTTTTC TCTGACGCGG GCATGTGCAT 540 GTCTCCGTTA ATTGCTCCCT CAACGTGTAT TACCCAATAG ACACCTCCCA ATTATTTAAA 600 AGGCCAAACA CAACCACCGA AAATCTCACT TTGTTTCAAC CCTGTGTTGA CGACCACAAG 660 TGATTCCTGT TCCTGCCCCT HACACCTAT AAATAATCAG CCATTTCCCT TCCATTTTCC 720 TCACCCCCAT TGGGCCATAA TCCATTCCCA AACAAAGATA CATAGTTG TCTGAHGGC 780 HAGCTTTAG AACTTTCACC 800 配列番号： 8
配列の長さ ： 1138
配列の型：核酸
鎖の数：二本鎖
トポロジー：直鎖状
配列の種類： Genomic DNA
起源
生物名：小麦 (Triticum aestivum)
配列：
GCTTGACTTT AATCAAACCG GTATATATAA ACTAAAAAAA CGAAGGGAGT ACTACATACT 60
AGCTTTATAA TACTAGTACT GGATAAAATC TGCCACAGAA AGATTTTAGC GGGGAGAAGG 120
AGCATCATAG ACTGACTGAA TGATAGAAGT GTTTTCACCG GCGGTGCATT GCTTTCAATC 180
AATCCATTGA AATGGAGTCC AGCTGCTTAC CCTAATCTAA TCACAGGATG AGCCCATGGA 240
TCTAGCTGCA GTACCTCGAC TCCACCGGAA AGGAGCGGGC CCGTGTCGGT AGCGTTGCTC 300
CGGCTGGGTC CAGCACGACC CGACCGCGGC ACGCGTGGCG TTGGATTTGG AGATTCGGGC 360
TCCTGATTGT GATGCGAGTC TGCAACATGC ACAGCCATGT GACCTGCATT GATTCCTGCC 420
AGCCACTGTG CTGTGTGTGA GACCTGACCT GCACAAGAAC GGATCAAAGC TGGGGCCGGC 480
CCTTCGCGGC ATCATCAACC TCTCAAAAAC TCGTGTAAAA ACAGGTTCAC AAAATAACTC 540
ATCTGAAACA ACTCCTCAAA ATCTGACGCA GAAATGAGCC TTCTATAGAG TAGAAGAAAC 600
AGCAAATGCT GCAAAAGGCG AAAAGGCTGG TCCGTCGAAT GAAATTCTGA TACTATTGCC 660
TCGATTCAAC ATATATATAC TTATAATCCA AACAAGAAAT CGTACTGTAC TCCGATCCGA 720
TGGCAAATAA ATCAGTGGCA ATGGCAGCAA GTTGCGAGGT GTGCATGATC CGTGGATCAA 780
TCAACAATGC TTGATTTGCT CGCACTGGGC CAACCTGACA CGCACAAGAC AAGCATTGCA 840
CCTCGCAAGC ACCTCACTCC ACAGCGTCCC CATGCACTGG ATGCAGCTGG CTCACTCATC 900
ACTCGATTGC CATCGCTCGA TCCATCATGT TCATTTAGTG CCACGTCAAA ACAGATTATT 960 TTTATTTCGC CAAGCAACCA ATAATGTACT CCAAGAACCT ACGTACAGTG AGCTCACACT 1020 AGCTATAAAT ACACACAGGC TTCTTCGTCT TCGCATCCAC CACTCGCCCA TTGTTTGTAG 1080 TACCAACCAG CCAAGCCAAG AAGTAACAGA GAAGGAGGAA GAGAGGCCGG CCGGCGAA 1138 配列番号： 9
配列の長さ ： 173
配列の型：核酸
鎖の数：二本鎖
卜ポロジ一：直鎖状
配列の種類： Genomic DNA
起源
生物名：ィネ (Oryza sativa)
配列：
CTTCAGCATG CACATCAAGC TCGTCGCCGG CGACTCCGCC GGCACCGTCA CCGCCTTCTA 60 CCTGTCGTCG CAGAACTCGG AGCACGACGA GATCGACTTC GAGTTCCTGG GGAACAGGAC 120 GGGGGAGCCG TACATCCTGC AGACGAACGT CTTCTCCGGC GGGAAGGGGG ACC 173 配列番号： 10
配列の長さ ： 98
配列の型：核酸
鎖の数：二本鎖
トポロジー：直鎖状
配列の種類： Genomic DNA
起源
生物名： トウモロコシ （Zea mays) 配列：
TGAAGCTCGT CGGCGGCGAC TCCGCGGGCA CCGTCACGGC CTTCTACCTG TCGTCGCAGA 60 ACTCGGAGCA CGACGAGATC GACTTCGAGT TCCTGGCA 98 配列番号： 11
配列の長さ ： 1130
配列の型：核酸
鎖の数：一本鎖
トポロジー：直鎖状
配列の種類： c画 to mRNA
起源
生物名： ビグナ ·ァンギュラリス
配列：
GGTTTCCCTT GTTAACATGG CTTCTCCTTT GTTGATTTTG TGTCTTGTTC TGGTTTCGCT 60
AGCCTCTGCT GCACTCTGTG CGGCCCCACG GAGACCAGTG GATGTTCCAT TTGGCAGAAA 120
CTACATTCCC ACATGGGCTT TCGATCACAT CAAATACTTC AATGGGGGTT CTGAGATTCA 180
ACTTCATCTT GACAAGTACA CTGGCACTGG TTTCCAAACA AAAGGGTCCT ATCTGTTTGG 240
TCACTTCAGC ATGAACATAA AGATGGTTCC TGGTGATTCA GCTGGCACAG TCACTGCTTT 300
TTATTTATCA TCTCAAAACG CGGAGCACGA TGAGATAGAC TTTGATTTCT TGGGGAACAG 360
AACAGGACAA CCTTACATTT TACAGACAAA TGTGTTCACT GGAGGGAAGG GTGACAGAGA 420
GCAAAGAATC TATCTHGGT TTGATCCCAC AAAAGCGTAT CACAGATATT CTGTACTATG 480
GAACATGTAT CAAATTGTAT TCCTAGTGGA TAACATCCCA ATCAGGGTGT TCAAGAACCT 540
GAAGGAGTTG GGAGTGAAGT TTCCCTTTAA CCAACCGATG AAGGTTTACA ACAGTTTATG 600
GAATGCTGAT GATTGGGCCA CAAGGGGTGG TTTGGAGAAA ACAGATTGGT CAAAAGCTCC 660
ATTCGTAGCA GAGTACAAGG GGTTTCATGT TGATGGGTGT GAGGCTTCAG TGAATTCAAG 720 GTTCTGTGCC ACACAGGGTA AGAGATGGTG GGATCAAACA GAGTTTCGTG ATCTTGATTC 780
CTTTCAGTGG CGAAGACTCA AATGGGTGCG TCAGAAATTC ACCATCTACA ACTACTGCAC 840
TGACAGAACC CGCTACCCTC AACTTCCACC AGAATGCAGA AGAAACCGTG ACATTTAAAT 900
TTTCATCTGC TGTTTTTATC ACTTATTTCT GTGTTCTACA ACAACTTTCT CACTGCATTC 960
ATCATTTACC AGTTACCATA CTTTATTCCT ACCATTATTT ATTACCATTG TATTGTTTGG 1020
AATGTGTAAT TAAGGCCTTG GGGTCTGAAT ACAGAGGAAA CTCTATAATA AAACTACGTA 1080
TGTTATGTAA TTCTATTCTT ATACTTGGGC ACCACCAATA ATGTAATATT 1130 配列番号： 12
配列の長さ ： 1068
配列の型：核酸
鎖の数：一本鎖
トポロジー：直鎖状
配列の種類： cDNA to mENA
起源
生物名： ビグナ ·アンギユラリス
配列：
CAGAAAATGG TTTCTTCTTT GTGGACCGTG TCTCTGATAT TGGCATCGCT GGCCTCTGCA 60 GCAGTTTGTG CCAACCCGAG GAGGCCAGTG GATGTACAAT TCGGTAGAAA CTACGTTCCT 120 ACATGGGCTT TTGATCACAT CAAATACTTC AATGGTGGTT CTGAGATTCA ACTTCATCTT 180 GACAAGTACA CTGGTACTGG CTTTCAGTCC AAAGGGTCAT ACTTGTTTGG CCATTTCAGC 240 ATGTACATAA AGATGGTTCC TGGAGATTCA GCTGGCACAG TCACTGCCTT CTATTTATCT 300 TCTCAAAACG CGGAGCACGA TGAGATAGAC TTTGAGTTCT TGGGGAACAG AACAGGACAA 360 CCTTACATTT TGCAAACAAA TGTGTTCACC GGAGGAAAGG GTGACAGAGA GCAAAGAATC 420 TATCTCTGGT HGACCCCAC CAAAGCATAT CACAGATACT CTATTCTCTG GAACTTGTAT 480 P /JP96/00 77
CAGATTGTGT TCTTTGTTGA CGATGTGCCG ATCAGAGTGT TCAAGAACAG CAAGGACTTG 540 AGAGTGAAGT TTCCATTCGA CCAACCTATG AAGCTATACA ACAGTTTGTG GAATGCTGAT 600 GACTGGGCAA CAAGGGGTGG TTTGGAGAAA ACAGATTGGT CGAAAGCTCC TTTCGTAGCA 660 GGGTACAAGG GGTTCCACAT CGATGGGTGC GAGGCCTCTG TGACCGCTAA GTTCTGCGAC 720 ACACAGGGCA AGAGATGGTG GGACCAACCA GAGTTTCGTG ACCTTGACGC CGCTCAATGG 780 CAAAGACTCA AATGGGTGCG TCAGAAATTC ACCATCTACA ACTACTGCAC TGACAGAAAA 840 CGCTACCCTC AACTTTCCCC TGAATGCAGT AGAGACCGCG ACATTTAAAT TTTCACATAC 900 TTCTGTTACC ATTTACTTTT ACCAGATTGT TGTCACTTTC ATGTACAATT TTATATCACG 960 TCAAATCTAT CCATTGCCAC TTTATTTATG AATTGAAATT TGCTTCAGAT AAAAAAATTA 1020 TAAATAAACA CAGTTTTTCT TAGAAAAAAA AAAAAAAAAA AAAAAAAA 1068 配列番号： 13
配列の長さ ： 27
配列の型：核酸
鎖の数：一本鎖
トポロジー：直鎖状
配列の種類：他の核酸 （合成 D N A)
配列：
GATGAGATAG ACHYGAGTT CTTGGGR 27 配列番号： 14
配列の長さ ： 1017
配列の型：核酸
鎖の数：一本鎖
トポロジー：直鎖状 配列の種類： cDNA to mRNA
起源
生物名： ビグナ ·ァンギュラリス
配列：
GAAACAATTT CACTCAGTTT CACACAAAAC AATTCTGCAT GGCATTTTCA AGACTTTTAC 60 TGTTAACATG CATTGTTGGG TATTTTCTGA TTGCCTCTGC ATCCAATTTC TATCAAGATT 120 TTGAAATAAC CTGGGGAGAT GGTCGTGCCA AGACACTAAA CAATGGCGAC CTTCTTACTT 180
TGTCTCTTGA CAAAGCCTCT GGCTCCGGCT TTCAGTCAAA 6AATGAATAC CTTTTTGGCA 240
AAATTGACAT GCAACTCAAA CTAGTCCCCG GCAACTCTGC TGGCACCGTC ACTGCCTACT 300
ATCTGTCTTC AAAAGGAGCA ACGTGGGATG AGATTGACTT TGAATTCTTG GGGAATTTGA 360
GCGGTGATCC TTACATTCTC CACACCAACG TGTTTAGCCA AGGCAAGGGT AATAGGGAGC 420
AACAATTCTA CCTCTGGTTT GACCCAACTG CTGATTTTCA CACCTATTCC ATCCTCTGGA 480
ACCCTCAACG TATTGTATTC TCTGTGGATG GAACTCCAAT AAGGGAGTTC AAGAACATGG 540
AGTCAAAGGG TGTTCCATTC CCCAAAAACC AAGCAATGAG GATATACTCA AGCCTTTGGA 600
ATGCAGATGA TTGGGCCACA AGGGGAGGGC TTGTTAAAAC CGATTGGAGC CAAGCTCCAT 660
TCACGGCTTC ATACAGAAAC TTCAATGCCA ATGCTTGCAC TGTGTCCTCT GGAACTTCTT 720
CTTGTTCAAA CTCTGTCTCT TCTCCCAATG CTTGGCTCTC GGAAGAATTG GACTCTACTA 780
ACCAGGAGAG ACTGAAGTGG GTACAGAAGA ATTACATGAT CTACAACTAT TGCACCGACG 840
CCAAAAGATT TCCACAGGGC CTTCCTACAG AGTGCAACAC TGCCTAATTT TTCTTATCAA 900
TCCTTTCCAT GCTCCACTTT CTTTTTTATT TCTTCTGTTG TACTTTCCAT CATGATCAAT 960 TCTTTTATTC ATTGTAAAAC ATTGCTATCA TGATAAGTTT TCTTAAATAT TTCATAA 1017 配列番号： 15
配列の長さ ： 588
配列の型：核酸 鎖の数：一本鎖
トポロジー：直鎮状
配列の種類： cDNA to mRNA
起源
生物名： ビグナ · アンギユラリス
配列：
GATGAGATTG ATTTTGAGTT CTTGGGGAAC CGTAGTGGTC AGCCTTACAC AGTTCAGACA 60 AATATCTACG CTCATGGAAA AGGGGATAGA GAGCAAAGGG TGAACCTCTG GTTTGATCCT 120 TCCGCGGATT TTCACACCTA CACTATCATG TGGAATCATC ACCATATTGT GTTCTACGTT 180
GATGATTTTC CCATTAGAGT GTACAAGAAC AATGAAGCGA AGGGAATCGC ATACCCAAAG 240
ATGCAGGCTA TGGGAGTGTA TTCGACGTTG TGGGAAGCTG ATAACTGGGC AACAAGAGGG 300
GGATTGGAGA AAATCGATTG GAGTAAGGCA CCATTTTATG CATATTACAA GGACTTTGAC 360
ATTGAAGGGT GCCCAAGTCC AGGACCTGCT AACTGTGCCT CTAATCAAAG TAATTGGTGG 420
GAAGGAGCTA CATACCAAGC TCHAATGCC ATGGAAGCTC GAAGGTACAG GTGGGCTCGT 480
CTTAACCATA TGATCTATGA TTACTGCCAA GATAAGCCAA GGTACACGGT CATCCCACCA 540
GAGTGCCTTG CCGCCATTTA AACCCAAGAA CTCAAAATCA ATCTCATC 588 配列番号： 16
配列の長さ ： 854
配列の型：核酸
鎖の数：一本鎖
トポロジー：直鎖状
配列の種類： cDNA to mRNA
起源
生物名：タバコ 配列：
CTGTCTTTGG ACAAAGTTTC TGGCTCTGGT TTTCAATCTA AGAAAGAGTA TCTCTTTGGG 60 AGAATTGATA TGCAAATCAA ACTTGTTGCT GGAAATTCTG CTGGAACTGT CACTACATAC 120 TATTTATCTT CTCAGGGACC CACACATGAT GAAATTGACT TTGAATTCTT GGGAAATGTT 180
ACTGGTGAAC CTTATATTCT CCACACAAAC ATTTATGCCC AAGGCAAAGG AAACAAAGAG 240
CAGCAATTTT ACCTTTGGTT TGATCCTACC AAGAACTTCC ACACCTACTC AATCATATGG 300
AAACCCCAAC ATATCATTTT TTTGGTCGAC AACACACCAA TAAGAGTTTA CAAGAATGCT 360
GAATCCATTG GTGTGCCATT TCCCAAGAAC CAGCCCATGA GAATTTACTC TAGCCTTTGG 420
AATGCTGATG ATTGGGCAAC AAGAGGAGGC CTAGTGAAAA CTGATTGGTC TAAAGCACCA 480
TTTACAGCCT ACTATAGAAA TTTCAATTCT CAAACTTTTA GCAGTTCACA ATTTTCAAAT 540
GAAAAATGGC AAAATCAAGA ACTTGATGCC AATGGCAGAA GAAGACTCAG ATGGGTGCAG 600
AGGAATTTCA TGATTTATAA TTATTGTACT GATTTTAAGA GGTTTCCTCA GGGTTTTCCT 660
CCAGAATGCA AAAGATTTTG AGTGATATTA GTTGGTTTTT GTGTAATTCT TTGATGTGTT 720
TGTGGTTTTA TTTTGTTAGA TTATAGCAAC CAAAATAAAT GTATTTTTCT CGTTTTATTT 780
TGTATCTTTT TCGAAGCTTG TAGTTCATCT TGTATCTAAT TTGTTTGATA TCCTTTATGA 840
TAAAAAAAAA AAAA 854 配列番号： 17
配列の長さ ： 20
配列の型：核酸
鎖の数：一本鎖
トポロジー：直鎖状
配列の種類：他の核酸 （合成 D N A)
配列：
ACACAAAATA CCAGHCTCA 20 配列番号： 18
配列の長さ ： 227
配列の型：核酸
鎖の数：二本鎖
トポロジー：直鎖状
配列の種類： Genomic DNA
起源
生物名： ビグナ ·アンギユラリス
配列：
GAATTCTGTG ATCTAGTCCT ACTATTCAAA CACTTTTAGG CCAAAGAAAA TTGAAACACA 60 AAATACCAGT TCTCAAATAC AATGAACATT ATTAATTATA ATTCAGTTAA AAGTCATTGA 120 TCAGAACAGC AGTGAAGGTT AGCTATAAGC GCGTTATAGG TGCAGGCAGA GTGTCGTGCC 180 TATATATACC CTTTGGAATG CACAAGTTGA AACACAAAAG AAAAATG 227 配列番号： 19
配列の長さ ： 290
配列の型：核酸
鎖の数：二本鎖
トポロジー：直鎖状
配列の種類： Genomic DNA
源
生物名： ビグナ ·ァンギュラリス
配列：
ACTCTTTGTA AHTTATCGA AGAGTTAGTG TGCAATAGAA ATTTAACATT GAGTATTTAC 60 AATTGTTAAA ACTATACAH CACTTCATTT TCATGCATTT ATAAACATTT CAATTTCAAT 120 TTCATGTTAA AATCAACTCA AAGTAATACT CAAATCTTAT TCCTAGTGAC TTTAATATAT 180 TGTTAACTTA TCAAGTTTCA ATTCCTTCAA TCATCAACAA GCAATCAAGA ATTAAGTTCA 240 AGAGTCTTAA GATTACTAAT AAATCATGTT CTATCCCTAG ATATAAGCTT 290 配列番号： 20
配列の長さ ： 1654
配列の型：核酸
鎖の数：二本鎖
トポロジー：直鎖状
配列の種類： Genomic DNA
起源
生物名： ビグナ ·アンギュラリス
配列：
AAGCTTTTTG CACATATTTG CAGCAGTAGA CAATGCCACT CGCTGAAAAA TATGATCTCC 60 CAGAATTTTG GCACAAAAAA TATATCCTAA CTAATATTTG ACTCTATCTA AGATACCACC 120 TGACATCAAA TGTTTCAATT TTATAGTCTT TAGCACGAGA AGATGTATAT TAGATATAAA 180 CCTTATCTTA TTTAATTAAT TTAGTAAGAT TGAATTAGAG GTAAATTTTA TTACTTAATA 240 TAATTAGACT ACTCATAAAT ATATAAATTT AAATTTTAAG TGTTCATTCC AATATATGAA 300 ATCTATTGAA AATATCACGT CAACTAATAA TATAACAAAA CTATAATATA AAAATAAGTA 360 TAAATTTTAT ATTTATAAAC AATTTTGACA TTAAATTAAA CHAAATTTA TCTCTATTAA 420 TAATAATATT ATAAGACAAA HACTCTGCT AAAATACAGA AAACAATATA TTTTTTTGAA 480 ACTHGAAAT ATTATATTGT TGGATGATGT TGGATAATTA GAAAGGACAT ATTATATATA 540 TGTCACGTTG AGATGAGTGG CCCATTGCAC TGAAAATGAC TGACAAATGG TACTCTCAAT 600 CCCATCTTAT TCTCTGTTCA ATTTTTTTCA CTTGAAAACT CTTTTTCCCT ATGGAAAATA 660 GCAATAACTA CAATATCCTC GTTTCTTCTT GTTAGCTCTT GGCTACAACT GTGHCATCT 720 TCTCCACTTT CATCAATACA ATTCCAAACA GAATATACTT AGACCCTTCT GCTATTTCAA 780 GAAAGTAGCT TGCAAATTTG CTTTGTTTCC GACATACACT TCAATATGAA AAAAAAAAAA 840 AAAACACTTT GAGAACTTTT TAAAAAGTAT TAAGTAGGAT TTGACGGCAG AATTTTGTTT 900 CCATATTTAG TTGAAAATAC ATACAAAACG TATTTGAAAG TTATATTCGA TTGAATTTGG 960 TTTTAACATA GAAAAAATTC AACCAAATTA AGTCCATACT TAAGCATTAA TATAAATATT 1020 TCAGTTATTC GACTTCGGTT TCACGTCTTG CCATTGTTTT ACATGTGTAA TACTTCAATT 1080 AATTTTTTAT GTTTTCATCT CTCTTTATCC ACTCCCTTTA TTTTTACATT ATAATACCAC 1140 ATTCCTCCAA TACTATAATT CTTAAGATAT ATGTGAACAT TAATATCTAA TGATACATAA 1200 GGTAAGTTGT AAATATTCAT AGAAAAAATA AAATGACTTT TCAAGAAAAC CAACAACTAA 1260 ATATAAAATA TAGAAAAGTT ATTTACAATT TTGTCCGTTA ACATGTCCAG ATATTACACT 1320 CTCAAAAGAA AAAGTGTTAG AAAAATCATA TAAAATAGAG TTCAAATTCT TTGTTAGATT 1380 TTTTTTACTG AACATTTAAA ATATATATTG ATATTGATTA TTCATTTTTA TAAATATATT 1440 TTAAAATTAA CATTCAATAT ATATATTTTA AAATTAACAT TCAATATATA TATTTTAAAG 1500 ACACAGAAGA AACAACAAAT TCCATAAAAT TGTGAGATAA TATTTAACCC TAACTTTCTT 1560 ATGAACTGAG AGATTTTACA TTTATGAGAA ATGATTGTCC TGTGTTAATT ATCCATGTCA 1620 GCTACCTAAT CACTAGAAAA GCTAATCAGA ATTC 1654 配列番号： 21
配列の長さ ： 29
列の型：核酸
鎖の数：一本鎖
トポロジー：直鎖状
配列の種類：他の核酸 （合成 D N A)
配列：
GAAGTAATAC TCAAATCTTA TTCCTAGTG 29 配列番号： 22
配列の長さ ： 30
配列の型：核酸
鎖の数：一本鎖
トポロジー：直鎖状
配列の種類：他の核酸 （合成 D NA) 配列：
CCCATTTTTC TTTTGTGTTT CAACTTGTGC 30 配列番号： 23
配列の長さ ： 30
配列の型：核酸
鎖の数：一本鎖
トポロジー：直鎖状
配列の種類：他の核酸 （合成 D N A) 配列：
ACAAGCAATC AAGAATTAAG TTCAAGAGTC 30 配列番号： 24
配列の長さ ： 30
配列の型：核酸
鎖の数：一本鎖
トポロジー：直鎖状
配列の種類：他の核酸 （合成 D N A) 配列： TAATAATGTT CATTGTATTT GAGAACTGGT 30 配列番号： 25
配列の長さ ： 30
配列の型：核酸
鎖の数：一本鎖
トポロジー：直鎖状
配列の種類：他の核酸 （合成 D N A) 配列：
GATTACTAAT AAATCATGTT CTATCCCTAG 30 配列番号： 26
配列の長さ ： 30
配列の型：核酸
鎖の数：一本鎖
トポロジー：直鎖状
配列の種類：他の核酸 （合成 D N A) 配列：
AAAGTGTTTG AATAGTAGGA CTAGATCACA 30 配列番号： 27
配列の長さ ： 1744
配列の型：核酸
鎖の数：二本鎖
トポロジー：直鎖状 /
配列の種類： Genomic DNA
起源
生物名： ビグナ♦アンギュラリス
配列：
AAGCTTCAAG TAAGTCTCTG TGATATGTAT GCAAGGGTTC GAAATGAGAA GAAGGCCCTT 60 CAAATTCTAG GTGTACTGGA ATCTAGGAAG GATGAATTAG GAAAAGCTGA TTTTGAGAGA 120 ATTATAAGTG GCCTTATTGA TGGTGGGTH CGGCAAGATG CCCAACGAAT ATGTGGGATC 180 ATGGAGGCGC AGGATTTCGA TGCATCAAAG GTTAAGGTCA ACCTTATGAA GCCTGTCTCT 240 AGAGGACCTC GTATGAGATA GTTTAGTGGT CATGAATTGG GACATTTTAG TCTTTCTCTG 300 CAAGTGAGTT ACAAATGTAT TACCTTATAT AGGAAGCAAT GTCTGCATGA TTTATCATAC 360 CATGTAACAA ATAAGAATGA ATTTGTTTAT GGATTTTTCC ATTGCTCAGA TTCTGAATTT 420 ACGCAATTTT TTTTTTCTTT TGAACTTTAG TTGTTTGTAT ATACAAATGT CTTCTGTGGC 480 ATGTTCATGG AATTTTCATT TCCAATTATT CAATATTCTT GTGGTGTGAT CATCACTTTT 540 GHAGGCAAA TCTGACAGCA CTGATGCCCC CTATCAGGAT TTTTAAACTT GTATGCGGTA 600 TACTATACTG ATCACAAGAT ACAAACTAAT ATAAATGGAT AGGAAATGCA GATGGGATGG 660 TTCAAGCTAG TCTTTAATAT TGAGATAGTA CAGAAAATGC AATGCCCAAA GTAAACAACG 720 CTGATATTTC AAAATCACAT ATTAAAGCTA AAGTTGGTAG CAACTAGCGT GAGAGCATCC 780 TAGTCTAGAC TGTGAATGCA GTATTTATAC ACTACAATGA TCTAAATAAG ATGCTACTAA 840 TGCAATCATG CTTAATGTAA TATGAATTGA TCTAAAGTAG CHGCAAAH TGCTTTGTTT 900 CCGACATACA CTTCAATATG AAAAAAAAAA AAAACACTTT GAGAACTTTT TAAAAAGTAT 960 TAAGTAGGAT TTGACGGCAG AATTTTGTTT CCATATTTAG TTGAAAATAC ATACAAAACG 1020 TATTTGAAAG TTATATCCGA TTGAATTTGG HTTAACATA GAAAAAATTC AACCAAATTA 1080 AGTCCATACT TAAGCATTAA TATAAATATT TCAGTTATTC GACTTCGGTT TCACGTCTTG 1140 CCATTGTTTT ACATGTGTAA TACTTCAATT ΑΑΤΤΤΠΤΑΤ GTTTTCATGT CTCTTTATCC 1200 ACTCCCHTA TTTTTACATT ATAATACCAC ATTCCTCCAA TACTATAAH CHAAGATAT 1260 ATGTGAACAT TAATATCTAA TGATACATAA GGTAAGTTGT AAATATTCAT AGAAAAAATA 1320 AAATGACTTT TCAAGAAAAC CAACAACTAA ATATAAAATA TAGAAAAGTT ATTTACAATT 1380
TTGTCCGTTA ACATGTCCAG ATATTACACT CTCAAAAGAA AAAGTGTTAG AAAAATCATA 1440
TAAAATAGAG TTCAAATTCT TTGTTAGATT TTTTTTACTG AACATTTAAA ATATATATTG 1500
ATATTGATTA TTCATTTTTA TAAATATATT TTAAAATTAA CATTCAATAT ATATATTTTA 1560
AAATTAACAT TCAATATATA TATTTTAAAG ACACAGAAGA AACAACAAAT TCCATAAAAT 1620
TGTGAGATAA TATTTAACCC TAACTTTCTT ATGAACTGAG AGATTTTACA TTTATGAGAA 1680
ATGATTGTCC TGTGTTAATT ATCCATGTCA GCTACCTAAT CACTAGAAAA GCTAATCAGA 1740
ATTC 1744 配列番号： 28
配列の長さ ： 8
配列の型：アミノ酸
鎖の数：一本鎖
トポロジー：直鎖状
配列の種類：ぺプチド
配列：
Asp Glu lie Asp Phe Glu Leu Gly
1 5 配列番号： 29
配列の長さ ： 29
配列の型：核酸
鎖の数：一本鎖
トポロジー：直鎖状 配列の種類：他の核酸 （合成 D N A) 配列：
GGAAGCTTGA ATTCTGTGAT CTAGTCCTA 29 配列番号： 30
配列の長さ ： 29
配列の型：核酸
鎖の数：一本鎖
トホロジー： a鎖状
配列の種類：他の核酸 （合成 D N A) 配列：
GGTCTAGATC CAAAGGGTAT ATATAGGCA 29
配列番号： 31
配列の長さ ： 30
配列の型：核酸
鎖の数：一本鎖
トポロジー：直鎖状
配列の種類：他の核酸 （合成 D N A) 配列：
ATCCACTGGT CTCCGTGGGG CNGCACAGAG 30
配列番号： 32
配列の長さ ： 30
配列の型：核酸 鎖の数：一本鎖
トポロジー：直鎖状
配列の種類：他の核酸 （合成 DNA) 配列：
AACTTTCTCA CTGCATTCAT CATTTACCAG 30
配列番号： 33
配列の長さ ： 30
配列の型：核酸
鎖の数：一本鎖
トポロジー：直鎖状
配列の種類：他の核酸 （合成 DNA) 配列：
AGGCTAGCGA AACCAGAACA AGACACAAAA 30 配列番号： 34
配列の長さ ： 30
配列の型：核酸
鎖の数：一本鎖
トポロジー：直鎖状
配列の種類：他の核酸 （合成 DNA) 配列：
CATACTTTAT TCCTACCATT ATITATTACC 30
配列番号： 35 配列の長さ ： 31
配列の型：核酸
鎖の数：一本鎖
トポロジー：直鎖状
配列の種類：他の核酸 （合成 D NA) 配列：
AATTTGGTCT CAACTGCAGT TCGTCAACCC G 31
配列番号： 36
配列の長さ ： 31
配列の型：核酸
鎖の数：一本鎖
トポロジー：直鎖状
配列の種類：他の核酸 （合成 D N A) 配列：
AATTCGGGTT GACGAACTGC AGTTGAGACC A 31
配列番号： 37
配列の長さ ： 30
配列の型：核酸
鎖の数：一本鎖
トポロジー：直鎖状
配列の種類：他の核酸 （合成 D N A) 配列：
ATCCACTGGC CTCCTCGGGT TGGCACAAAC 30 配列番号： 38
配列の長さ ： 30
配列の型：核酸
鎖の数：一本鎖
トポロジー：直鎖状
配列の種類：他の核酸 （合成 DNA) 配列：
CTTTTACCAG ATTGTTGTCA CTTTCATGTA 30 配列番号： 39
配列の長さ ： 30
配列の型：核酸
鎖の数：一本鑌
トポロジー：直鎖状
配列の種類：他の核酸 （合成 DNA) 配列：
CTGCAGAGGC CAGCGATGCC AATATCAGAG 30 配列番号： 40
配列の長さ ： 30
配列の型：核酸
鎖の数：一本鎖
トポロジー：直鎖状
E列の種類：他の核酸 （合成 DNA) 配列： TCTATCCATT GCCACTTTAT TTATGAATTG 30 配列番号： 41
配列の長さ ： 30
配列の型：核酸
鎖の数：一本鎖
トポロジー：直鎖状
配列の種類：他の核酸 （合成 D N A ) 配列：
ATTGGATGCA GAGGCAATCA GAAAATACCC 30 配列番号： 42
配列の長さ ： 30
配列の型：核酸
鎖の数：一本鎖
トポロジー：直鎖状
配列の種類：他の核酸 （合成 D N A) 配列：
CTACAGAGTG CAACACTGCC TAATTTTTCT 30 配列番号： 43
配列の長さ ： 30
配列の型：核酸
鎖の数：一本鎖
トポロジー：直鎖状 配列の種類：他の核酸 （合成 DNA) 配列：
CAATGCATGT TAACAGTAAA AGTCTTGAAA 30 配列番号： 44
配列の長さ ： 30
配列の型：核酸
鎖の数：一本鎖
トポロジー：直鎖状
配列の種類：他の核酸 （合成 DNA) 配列：
CTCCACTTTC TTTTTTATTT CTTCTGTTGT 30 配列番号： 45
配列の長さ ： 30
配列の型：核酸
鎖の数：一本鎖
トポロジー：直鎖状
配列の種類：他の核酸 （合成 DNA) 配列：
GGATACCCAC AAAATACAAC AAGTGACAAA 30
配列番号： 46
配列の長さ ： 30
配列の型：核酸 鎖の数：一本鎖
トポロジー：直鎖状
配列の種類：他の核酸 （合成 DNA) 配列：
CAAAGTGCTT TTAATTGAGC TGTATTTCCC 30 配列番号： 7
配列の長さ ： 30
配列の型：核酸
鎖の数：一本鎖
トポロジー：直鎖状
配列の種類：他の核酸 （合成 DNA) 配列：
AAAACTCCTT TTATGATACC CATGGTGAGA 30 配列番号： 48
配列の長さ ： 30
配列の型：核酸
鎖の数：一本鎖
トポロジー：直鎖状
配列の種類：他の核酸 （合成 DNA) 配列：
TTTTTGAGTG TATCATTATT GGTGGAGTCA 30 配列番号： 9 配列の長さ ： 30
配列の型：核酸
鎖の数：一本鎖
トポロジー：直鎖状
配列の種類：他の核酸 （合成 DNA) 配列：
ATCAGAGACC AGTGTTTGTG TATTTTTCGC 30 配列番号： 50
配列の長さ ： 30
配列の型：核酸
鎖の数：一本鎖
トポロジー：直鎖状
配列の種類：他の核酸 （合成 DNA) 配列：
GATATTATGT ATCTCATGCC AGGCCTTTCA 30 配列番号： 51
配列の長さ ： 30
配列の型：核酸
鎖の数：一本鎖
トポロジー：直鎖状
配列の種類：他の核酸 （合成 DNA) 配列：
AGGTACTTGA TGTGGTGACT AGCCCAACTG 30 配列番号： 52
配列の長さ ： 30
配列の型：核酸
鎖の数：一本鎖
トポロジー：直鎖状
配列の種類：他の核酸 （合成 DNA) 配列：
GGTCTTCATG ACTCAGCGTG TAACGAGTGA 30 配列番号： 53
配列の長さ ： 30
配列の型：核酸
鎖の数：一本鎖
トポロジー：直鎖状
配列の種類：他の核酸 （合成 DNA) 配列：
CTCATAGTTT TTCCAAAAGG GTACATCCAC 30 配列番号： 54
配列の長さ ： 35
配列の型：核酸
鎖の数：一本鎖
トポロジー：直鎖状
配列の種類：他の核酸 （合成 DNA) 配列： TATTGTAATT TATTGCACTA TTTGTTTTCT CTGAA 35 配列番号： 55
配列の長さ ： 30
配列の型：核酸
鎖の数：一本鎖
トポロジー：直鎖状
配列の種類：他の核酸 （合成 D N A )
配列：
GGGATACCCA CAAAGTCCTA GTAATGACAA 30 配列番号： 56
配列の長さ ： 35
配列の型：核酸
鎖の数：一本鎖
トポロジー：直鎖状
配列の種類：他の核酸 （合成 D N A)
配列：
AACCAATACT TATGAGTGTA GCACTATTGA ACAAC 35 配列番号： 57
配列の長さ ： 30
配列の型：核酸
鎖の数：一本鎖
トポロジー：直鎖状 配列の種類：他の核酸 （合成 DNA) 配列：
ATGTGCATGC TGAAGTGGCC GAAGAGGTAG 30
配列番号： 58
配列の長さ ： 30
配列の型：核酸
鎖の数：一本鎖
トポロジー：直鎖状
配列の種類：他の核酸 （合成 DNA) 配列：
ACTACCACTA GTTGTTGTTG TGCCGCTGGT 30 配列番号： 59
配列の長さ ： 30
配列の型：核酸
鎖の数：一本鎖
トポロジー：直鎖状
配列の種類：他の核酸 （合成 DNA) 配列：
ACGTAGTTCT TGTCGAACGG CACGTCCACC 30 配列番号： 60
配列の長さ ： 30
配列の型：核酸 鎖の数：一本鎖
トポロジー：直鎖状
配列の種類：他の核酸 （合成 D N A) 配列：
CGCTGAGACC TAGTAGTACG AGGAATTTGT 30 配列番号： 61
配列の長さ ： 30
配列の型：核酸
鎖の数：一本鎖
トポロジー：直鎖状
配列の種類：他の核酸 （合成 D N A) 配列：
TTTTCTAGAC CATGGGTATC ATAAAAGGAG 30 配列番号： 62
配列の長さ ： 30
配列の型：核酸
鎖の数：一本鎖
トポロジー：直鎖状
配列の種類：他の核酸 （合成 D N A) 配列：
TTGGAGCTCA TTTTAAATAT CTCTGTCCTT 30 配列番号： 63 配列の長さ ： 20
配列の型：核酸
鎖の数：一本鎖
トポロジー：直鎖状
配列の種類：他の核酸 （合成 D N A) 配列：
CCTGTTCAAT TTGTGGTTCC 20 配列番号： 64
配列の長さ ： 20
配列の型：核酸
鎖の数：一本鎖
トポロジー：直鎖状
配列の種類：他の核酸 （合成 D N A) 配列：
TTGTGGTCCA GGTCATGGTA 20 配列番号： 65
配列の長さ ： 30
配列の型：核酸
鎖の数：一本鎖
トポロジー：直鎖状
配列の種類：他の核酸 （合成 D N A) 配列：
GGAAGCHTT CGAAAATTTA TCATTATTGC 30 配列番号： 66
配列の長さ ： 31
配列の型：核酸
鎖の数：一本鎖
トポロジー：直鎖状
配列の種類：他の核酸 （合成 D N A) 配列：
GGTCTAGATT TCTGTGTTTA TCTGTTTGTG G 31 配列番号： 67
配列の長さ ： 26
配列の型：核酸
鎖の数：二本鎖
トポロジー：直鎖状
配列の種類： Genomic DNA
配列：
ATGGCATTTT CAAGACTTTT ACTGTT 26 配列番号： 68
配列の長さ ： 16
配列の型：核酸
鎖の数：二本鎖
トポロジー：直鎖状
配列の種類： Genomic DNA
配列： GGGTGGTCAG TCCCTT 16
配列番号： 69
配列の長さ ： 26
配列の型：核酸
鎖の数：一本鎖
トポロジー：直鎖状
配列の種類：他の核酸 （合成 D N A) 配列：
GGAAGCTTGT TAAACTGATT TAAAAG 26
配列番号： 70
配列の長さ ： 29
配列の型：核酸
鎖の数：一本鎖
ト ロジー： a鎖状
配列の種類：他の核酸 （合成 D N A) 配列：
GGTCTAGAGG TGAGAAAAAC AAATCCAAT 29
配列番号： 71
配列の長さ ： 30
配列の型：核酸
鎖の数：一本鎖
トポロジー：直鎖状 配列の種類：他の核酸 （合成 D N A) 配列：
GGAAGCTTTA TTAGGTCGAG TGAGATGGAT 30 配列番号： 72
配列の長さ ： 23
配列の型：核酸
鎖の数：二本鎖
トポロジー：直鎖状
配列の種類： Genomic DNA
配列：
ATGGGTATCA TAAAAGGAGT TTT 23 配列番号： 73
配列の長さ ： 28
配列の型：核酸
鎖の数：二本鎖
トポロジー：直鎖状
配列の種類： Genomic DNA
配列：
AATCGGATCC CCGGGTGGTC AGTCCCTT 28 配列番号： 74
配列の長さ ： 33
配列の型：核酸 鎖の数：一本鎖
トポロジー：直鎖状
配列の種類：他の核酸 （合成 D N A)
配列：
GGCTGCAGGT TAGATCCCGA ATAATTATCT TAC 33 配列番号： 75
配列の長さ ： 30
配列の型：核酸
鎖の数：一本鎖
トポロジー：直鎖状
配列の種類：他の核酸 （合成 D N A)
配列：
GGTCTAGAGG TGAAAGTTCT AAAGCTAAGC 30

Claims

請求の範囲
1 . 植物細胞壁のキシログルカン （Xyloglucan) 再構成を行う機能を有 する酵素をコードする遺伝子の発現を制御する植物プロモーター。
2 . 植物細胞壁の Xyloglucan再構成の必要な部位でプロモーター活性を 有することを特徴とする請求項 1記載の植物プロモーター。
3 . 植物細胞壁の Xyloglucan再構成の時期にプロモーター活性を有する ことを特徴とする請求項 1記載の植物プロモータ一。
4 . 請求項 1記載の植物細胞壁の Xyloglucan再構成を行う機能を有する 酵素をコードする遺伝子がェンド型キンログルカン転移酵素またはその機 能的同等物をコードする遗伝子であることを特徴とする植物プロモーター。
5 . 請求項 4記載のエンド型キシログルカン転移酵素またはその機能的 同等物をコードする遠伝子がァズキ （Vigna angularis) 由来であること を特徴とする植物プロモータ一。
6 . 請求項 4記載のェンド型キシログルカン転移酵素またはその機能的 同等物をコードする遗伝子がトマト （Lycopersicon esculentum) 由来で あることを特徴とする植物プロモーター。
7 . 請求項 4記載のェンド型キシログルカン転移酵素またはその機能的 同等物をコードする遗伝子がタバコ （Nicotiana tabacum) 由来であるこ とを特徴とする植物プロモーター。
8 . 請求項 4記載のェンド型キシログルカン転移酵素またはその機能的 同等物をコードする遺伝子が小麦 （Triticum aestivura) 由来であること を特徴とする植物プロモーター。
9 . 配列表の配列番号 1、 2、 3、 4、 5、 6、 7および 8から選択さ れる t、ずれかの塩基配列に含有されることを特徴とする請求項 1記戴の植 物プロモータ一。
10. 請求項 9に記載のいずれかの塩基配列にハイブリダィズ可能で、 かつ植物、 植物細胞、 または該植物細胞より再生されたトランスジ ニッ ク植物の少なくともいずれか 1つにおいてプロモーター活性を有する請求 項 1記載の植物プロモータ一。
11. 有用遺伝子を発現可能な状態で連結された請求項 1~10のいず れか 1項に記載の植物プロモーターを含む DN A断片。
12. 請求項 11記載の有用遺伝子がタンパク質をコードする遺伝子で あることを特徴とする DN A断片。
13. 請求項 11記載の有用遺伝子がアンチセンス RNAをコードする *伝子であることを特徵とする DN A断片。
14. 請求項 11記載の有用遗伝子がデコイをコードする遺伝子である ことを特徴とする DNA断片。
15. 請求項 11記載の有用遺伝子がリボザィムであることを特徴とす る DNA断片。
16. 請求項 11〜15のいずれか 1項に記載の DN A断片を導入した 植物。
17. 請求項 11~15のいずれか 1項に記載の DN A断片を導入した 植物細胞。
18. 請求項 11〜15のいずれか 1項に記戴の DNA断片を導入した 植物細胞から再生されたトランスジュニック植物。
19. 請求項 1〜10のいずれか 1項に記載の植物プロモーターを含有 するベクター。
20. 請求項 11〜15のいずれか 1項に記載の DNA断片を含有する ベクター。
2 1 . プラスミ ドベクターであることを特徴とする請求項 1 9または請 求項 2 0記載のベクター。
2 2. ウィルスベクターであることを特徴とする請求項 1 9または請求 項 2 0記載のベクタ一。
2 3. 請求項 1 9〜2 2のいずれか 1項に記載のベクターで形質転換さ れた植物。
2 4 . 請求項 1 9〜 2 2のいずれか 1項に記載のベクターで形質転換さ れた植物細胞。
2 5. 請求項 2 4記載の植物細胞から再生されたトランスジュニック植 物。
2 6. 請求項 1 6、 請求項 1 8、 請求項 2 3または請求項 2 5のいずれ か 1項に記載の植物から得られた種子。
2 7 . 請求項 1 2に記載の D N A断片を含有するベクターで形質転換さ れた植物からベクターにより発現されたタンパク質を採取することを特徵 とする植物によるタンパク質の製造方法。
2 8. 請求項 1 2に記載の D N A断片を含有するベクターで形質転換さ れた植物細胞を培養し、 該培養物からベクターにより発現されたタンパク 質を採取することを特徴とする植物細胞によるタンパク質の製造方法。
2 9. 請求項 1 2に記載の D N A断片を含有するベクターで形質転換さ れた植物細胞からトランスジェニック植物を再生し、 該トランスジ ニッ ク植物からベクターにより発現されたタンパク質を採取することを特徴と する トランスジヱニック植物によるタンパク質の製造方法。
3 0. 請求項 1 1〜1 5のいずれか 1項に記載の D N A断片を植物に導 入することを特徴とする植物の形態の制御方法。
3 1 . 請求項 1 1〜1 5のいずれか 1項に記載の D N A断片を植物細胞 に導入し、 トランスジュニック植物を再生することを特徴とする トランス ジ ニック植物の形態の制御方法。
3 2. 請求項 1 1〜 1 5のいずれか 1項に記載の D N A断片を含有する ベクターで植物を形質転換することを特徴とする植物の形態の制御方法。
3 3 . 請求項 1 1 ~ 1 5のいずれか 1項に記載の D N A断片を含有する ベクタ一で形質転換された植物細胞からトランスジュニック植物を再生す ることを特徴とする トランスジエニック植物の形態の制御方法。
3 4 . 植物細胞壁の Xyloglucan再構成を行う機能を有する酵素をコード する遺伝子を用いることを特徴とする植物プロモーターのクローニング方
3 5. 植物細胞壁の Xyloglucan再構成を行う機能を有する酵素をコード する遺伝子がェンド型キシログルカン転移酵素またはその機能的同等物を コードする遺伝子であることを特徴とする請求項 3 4記載の植物プロモー ターのクローニング方法。
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