JP2013022000A - ゼニゴケ目生物細胞において外来遺伝子を安定に高発現させるｄｎａ断片及びその利用 - Google Patents
ゼニゴケ目生物細胞において外来遺伝子を安定に高発現させるｄｎａ断片及びその利用 Download PDFInfo
- Publication number
- JP2013022000A JP2013022000A JP2011162620A JP2011162620A JP2013022000A JP 2013022000 A JP2013022000 A JP 2013022000A JP 2011162620 A JP2011162620 A JP 2011162620A JP 2011162620 A JP2011162620 A JP 2011162620A JP 2013022000 A JP2013022000 A JP 2013022000A
- Authority
- JP
- Japan
- Prior art keywords
- dna
- genus
- base sequence
- seq
- gene
- Prior art date
- Legal status (The legal status is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the status listed.)
- Withdrawn
Links
- 239000012634 fragment Substances 0.000 title claims abstract description 137
- 108090000623 proteins and genes Proteins 0.000 title claims abstract description 136
- 241001138499 Marchantiales Species 0.000 title abstract description 7
- 108020004414 DNA Proteins 0.000 claims abstract description 231
- 230000000694 effects Effects 0.000 claims abstract description 78
- 108020003589 5' Untranslated Regions Proteins 0.000 claims abstract description 42
- 230000014509 gene expression Effects 0.000 claims abstract description 42
- 230000000295 complement effect Effects 0.000 claims abstract description 27
- 238000000034 method Methods 0.000 claims description 61
- 241000134916 Amanita Species 0.000 claims description 51
- 239000013604 expression vector Substances 0.000 claims description 46
- 241000254173 Coleoptera Species 0.000 claims description 43
- 238000003259 recombinant expression Methods 0.000 claims description 33
- FWMNVWWHGCHHJJ-SKKKGAJSSA-N 4-amino-1-[(2r)-6-amino-2-[[(2r)-2-[[(2r)-2-[[(2r)-2-amino-3-phenylpropanoyl]amino]-3-phenylpropanoyl]amino]-4-methylpentanoyl]amino]hexanoyl]piperidine-4-carboxylic acid Chemical compound C([C@H](C(=O)N[C@H](CC(C)C)C(=O)N[C@H](CCCCN)C(=O)N1CCC(N)(CC1)C(O)=O)NC(=O)[C@H](N)CC=1C=CC=CC=1)C1=CC=CC=C1 FWMNVWWHGCHHJJ-SKKKGAJSSA-N 0.000 claims description 29
- 241000222350 Pleurotus Species 0.000 claims description 21
- 239000000523 sample Substances 0.000 claims description 21
- 238000001514 detection method Methods 0.000 claims description 11
- 230000002708 enhancing effect Effects 0.000 claims description 10
- 239000002773 nucleotide Substances 0.000 claims description 9
- 125000003729 nucleotide group Chemical group 0.000 claims description 9
- 238000012258 culturing Methods 0.000 claims description 6
- 241000255777 Lepidoptera Species 0.000 claims description 5
- 210000004027 cell Anatomy 0.000 description 46
- 241000196324 Embryophyta Species 0.000 description 28
- 239000000126 substance Substances 0.000 description 21
- 239000013612 plasmid Substances 0.000 description 18
- 239000013598 vector Substances 0.000 description 16
- 241000269370 Xenopus <genus> Species 0.000 description 14
- 238000004519 manufacturing process Methods 0.000 description 13
- 238000010586 diagram Methods 0.000 description 11
- 108010054269 Uridine Diphosphate Glucose Dehydrogenase Proteins 0.000 description 10
- 108091026898 Leader sequence (mRNA) Proteins 0.000 description 9
- 210000004748 cultured cell Anatomy 0.000 description 9
- 102000004169 proteins and genes Human genes 0.000 description 9
- 238000000018 DNA microarray Methods 0.000 description 8
- 101150007759 FT1 gene Proteins 0.000 description 8
- 241000196329 Marchantia polymorpha Species 0.000 description 8
- 102000057144 Uridine Diphosphate Glucose Dehydrogenase Human genes 0.000 description 8
- 108091034117 Oligonucleotide Proteins 0.000 description 7
- 101150016042 udp gene Proteins 0.000 description 7
- 125000003275 alpha amino acid group Chemical group 0.000 description 6
- 238000009396 hybridization Methods 0.000 description 6
- 239000000047 product Substances 0.000 description 6
- 238000011144 upstream manufacturing Methods 0.000 description 6
- 235000001674 Agaricus brunnescens Nutrition 0.000 description 5
- 108090000331 Firefly luciferases Proteins 0.000 description 5
- 241000736285 Sphagnum Species 0.000 description 5
- 238000006243 chemical reaction Methods 0.000 description 5
- 239000002299 complementary DNA Substances 0.000 description 5
- 239000002245 particle Substances 0.000 description 5
- 238000013519 translation Methods 0.000 description 5
- 108091060211 Expressed sequence tag Proteins 0.000 description 4
- 108700007698 Genetic Terminator Regions Proteins 0.000 description 4
- 108060001084 Luciferase Proteins 0.000 description 4
- 102000010292 Peptide Elongation Factor 1 Human genes 0.000 description 4
- 108010077524 Peptide Elongation Factor 1 Proteins 0.000 description 4
- 108700008625 Reporter Genes Proteins 0.000 description 4
- 239000002609 medium Substances 0.000 description 4
- 239000000758 substrate Substances 0.000 description 4
- 108010021809 Alcohol dehydrogenase Proteins 0.000 description 3
- 241000219194 Arabidopsis Species 0.000 description 3
- 241000228245 Aspergillus niger Species 0.000 description 3
- 102000004190 Enzymes Human genes 0.000 description 3
- 108090000790 Enzymes Proteins 0.000 description 3
- 241000208125 Nicotiana Species 0.000 description 3
- 235000002637 Nicotiana tabacum Nutrition 0.000 description 3
- 108010052090 Renilla Luciferases Proteins 0.000 description 3
- 230000000692 anti-sense effect Effects 0.000 description 3
- PCHJSUWPFVWCPO-UHFFFAOYSA-N gold Chemical compound [Au] PCHJSUWPFVWCPO-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 3
- 239000010931 gold Substances 0.000 description 3
- 229910052737 gold Inorganic materials 0.000 description 3
- 238000005259 measurement Methods 0.000 description 3
- 210000000056 organ Anatomy 0.000 description 3
- 230000037361 pathway Effects 0.000 description 3
- 238000002360 preparation method Methods 0.000 description 3
- 150000003180 prostaglandins Chemical class 0.000 description 3
- 238000012216 screening Methods 0.000 description 3
- 108020005345 3' Untranslated Regions Proteins 0.000 description 2
- 229920001817 Agar Polymers 0.000 description 2
- 102000007698 Alcohol dehydrogenase Human genes 0.000 description 2
- 102000053602 DNA Human genes 0.000 description 2
- SHIBSTMRCDJXLN-UHFFFAOYSA-N Digoxigenin Natural products C1CC(C2C(C3(C)CCC(O)CC3CC2)CC2O)(O)C2(C)C1C1=CC(=O)OC1 SHIBSTMRCDJXLN-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 206010059866 Drug resistance Diseases 0.000 description 2
- 239000005089 Luciferase Substances 0.000 description 2
- 241001465754 Metazoa Species 0.000 description 2
- 108091028043 Nucleic acid sequence Proteins 0.000 description 2
- 240000007594 Oryza sativa Species 0.000 description 2
- 235000007164 Oryza sativa Nutrition 0.000 description 2
- 241000723873 Tobacco mosaic virus Species 0.000 description 2
- 101150067366 adh gene Proteins 0.000 description 2
- 239000008272 agar Substances 0.000 description 2
- 230000011681 asexual reproduction Effects 0.000 description 2
- 238000013465 asexual reproduction Methods 0.000 description 2
- 238000003556 assay Methods 0.000 description 2
- 230000015572 biosynthetic process Effects 0.000 description 2
- 239000003153 chemical reaction reagent Substances 0.000 description 2
- 238000012136 culture method Methods 0.000 description 2
- QONQRTHLHBTMGP-UHFFFAOYSA-N digitoxigenin Natural products CC12CCC(C3(CCC(O)CC3CC3)C)C3C11OC1CC2C1=CC(=O)OC1 QONQRTHLHBTMGP-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- SHIBSTMRCDJXLN-KCZCNTNESA-N digoxigenin Chemical compound C1([C@@H]2[C@@]3([C@@](CC2)(O)[C@H]2[C@@H]([C@@]4(C)CC[C@H](O)C[C@H]4CC2)C[C@H]3O)C)=CC(=O)OC1 SHIBSTMRCDJXLN-KCZCNTNESA-N 0.000 description 2
- 239000003623 enhancer Substances 0.000 description 2
- 238000010195 expression analysis Methods 0.000 description 2
- 238000010353 genetic engineering Methods 0.000 description 2
- 239000001963 growth medium Substances 0.000 description 2
- 108020004999 messenger RNA Proteins 0.000 description 2
- 244000005700 microbiome Species 0.000 description 2
- 238000010369 molecular cloning Methods 0.000 description 2
- 230000035772 mutation Effects 0.000 description 2
- 229940094443 oxytocics prostaglandins Drugs 0.000 description 2
- 238000000746 purification Methods 0.000 description 2
- 238000003757 reverse transcription PCR Methods 0.000 description 2
- 235000009566 rice Nutrition 0.000 description 2
- 238000012163 sequencing technique Methods 0.000 description 2
- 239000006228 supernatant Substances 0.000 description 2
- 238000003786 synthesis reaction Methods 0.000 description 2
- 210000001519 tissue Anatomy 0.000 description 2
- 238000013518 transcription Methods 0.000 description 2
- 230000035897 transcription Effects 0.000 description 2
- 230000009466 transformation Effects 0.000 description 2
- 230000001052 transient effect Effects 0.000 description 2
- 230000010474 transient expression Effects 0.000 description 2
- 150000004670 unsaturated fatty acids Chemical class 0.000 description 2
- 235000021122 unsaturated fatty acids Nutrition 0.000 description 2
- 230000009417 vegetative reproduction Effects 0.000 description 2
- 238000013466 vegetative reproduction Methods 0.000 description 2
- 230000017260 vegetative to reproductive phase transition of meristem Effects 0.000 description 2
- 108091032973 (ribonucleotides)n+m Proteins 0.000 description 1
- 241001533303 Acarinae Species 0.000 description 1
- 241000589158 Agrobacterium Species 0.000 description 1
- 241000979158 Amanita sp. Species 0.000 description 1
- 241000134901 Amanitaceae Species 0.000 description 1
- 241000219195 Arabidopsis thaliana Species 0.000 description 1
- 241000701489 Cauliflower mosaic virus Species 0.000 description 1
- 241000276616 Cichlidae Species 0.000 description 1
- 230000006820 DNA synthesis Effects 0.000 description 1
- 241000255925 Diptera Species 0.000 description 1
- 241000255581 Drosophila <fruit fly, genus> Species 0.000 description 1
- 238000003718 Dual-Luciferase Reporter Assay System Methods 0.000 description 1
- YQYJSBFKSSDGFO-UHFFFAOYSA-N Epihygromycin Natural products OC1C(O)C(C(=O)C)OC1OC(C(=C1)O)=CC=C1C=C(C)C(=O)NC1C(O)C(O)C2OCOC2C1O YQYJSBFKSSDGFO-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 108091006027 G proteins Proteins 0.000 description 1
- 102000030782 GTP binding Human genes 0.000 description 1
- 108091000058 GTP-Binding Proteins 0.000 description 1
- 108700039691 Genetic Promoter Regions Proteins 0.000 description 1
- 241001634830 Geometridae Species 0.000 description 1
- 241000227166 Harrimanella hypnoides Species 0.000 description 1
- 206010020649 Hyperkeratosis Diseases 0.000 description 1
- 241000721662 Juniperus Species 0.000 description 1
- 102000003820 Lipoxygenases Human genes 0.000 description 1
- 108090000128 Lipoxygenases Proteins 0.000 description 1
- 241000289692 Myrmecophagidae Species 0.000 description 1
- 102000015439 Phospholipases Human genes 0.000 description 1
- 108010064785 Phospholipases Proteins 0.000 description 1
- 102000009097 Phosphorylases Human genes 0.000 description 1
- 108010073135 Phosphorylases Proteins 0.000 description 1
- 102000004005 Prostaglandin-endoperoxide synthases Human genes 0.000 description 1
- 108090000459 Prostaglandin-endoperoxide synthases Proteins 0.000 description 1
- 101150041925 RBCS gene Proteins 0.000 description 1
- 241000607142 Salmonella Species 0.000 description 1
- 108091081021 Sense strand Proteins 0.000 description 1
- 108020004682 Single-Stranded DNA Proteins 0.000 description 1
- 108700019146 Transgenes Proteins 0.000 description 1
- JLCPHMBAVCMARE-UHFFFAOYSA-N [3-[[3-[[3-[[3-[[3-[[3-[[3-[[3-[[3-[[3-[[3-[[5-(2-amino-6-oxo-1H-purin-9-yl)-3-[[3-[[3-[[3-[[3-[[3-[[5-(2-amino-6-oxo-1H-purin-9-yl)-3-[[5-(2-amino-6-oxo-1H-purin-9-yl)-3-hydroxyoxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxyoxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(5-methyl-2,4-dioxopyrimidin-1-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(6-aminopurin-9-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(6-aminopurin-9-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(6-aminopurin-9-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(6-aminopurin-9-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxyoxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(5-methyl-2,4-dioxopyrimidin-1-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(4-amino-2-oxopyrimidin-1-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(5-methyl-2,4-dioxopyrimidin-1-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(5-methyl-2,4-dioxopyrimidin-1-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(6-aminopurin-9-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(6-aminopurin-9-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(4-amino-2-oxopyrimidin-1-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(4-amino-2-oxopyrimidin-1-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(4-amino-2-oxopyrimidin-1-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(6-aminopurin-9-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(4-amino-2-oxopyrimidin-1-yl)oxolan-2-yl]methyl [5-(6-aminopurin-9-yl)-2-(hydroxymethyl)oxolan-3-yl] hydrogen phosphate Polymers Cc1cn(C2CC(OP(O)(=O)OCC3OC(CC3OP(O)(=O)OCC3OC(CC3O)n3cnc4c3nc(N)[nH]c4=O)n3cnc4c3nc(N)[nH]c4=O)C(COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3CO)n3cnc4c(N)ncnc34)n3ccc(N)nc3=O)n3cnc4c(N)ncnc34)n3ccc(N)nc3=O)n3ccc(N)nc3=O)n3ccc(N)nc3=O)n3cnc4c(N)ncnc34)n3cnc4c(N)ncnc34)n3cc(C)c(=O)[nH]c3=O)n3cc(C)c(=O)[nH]c3=O)n3ccc(N)nc3=O)n3cc(C)c(=O)[nH]c3=O)n3cnc4c3nc(N)[nH]c4=O)n3cnc4c(N)ncnc34)n3cnc4c(N)ncnc34)n3cnc4c(N)ncnc34)n3cnc4c(N)ncnc34)O2)c(=O)[nH]c1=O JLCPHMBAVCMARE-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 239000002253 acid Substances 0.000 description 1
- 101150099105 alien gene Proteins 0.000 description 1
- 230000003321 amplification Effects 0.000 description 1
- 230000037429 base substitution Effects 0.000 description 1
- 229920000704 biodegradable plastic Polymers 0.000 description 1
- 230000005540 biological transmission Effects 0.000 description 1
- 230000001851 biosynthetic effect Effects 0.000 description 1
- 238000009395 breeding Methods 0.000 description 1
- 230000001488 breeding effect Effects 0.000 description 1
- 239000000872 buffer Substances 0.000 description 1
- 239000001506 calcium phosphate Substances 0.000 description 1
- 229910000389 calcium phosphate Inorganic materials 0.000 description 1
- 210000003763 chloroplast Anatomy 0.000 description 1
- 210000000349 chromosome Anatomy 0.000 description 1
- 238000010367 cloning Methods 0.000 description 1
- 238000004891 communication Methods 0.000 description 1
- 150000001875 compounds Chemical class 0.000 description 1
- 238000007796 conventional method Methods 0.000 description 1
- 238000012364 cultivation method Methods 0.000 description 1
- 239000012228 culture supernatant Substances 0.000 description 1
- 235000014113 dietary fatty acids Nutrition 0.000 description 1
- 238000004520 electroporation Methods 0.000 description 1
- 238000005516 engineering process Methods 0.000 description 1
- 239000000194 fatty acid Substances 0.000 description 1
- 229930195729 fatty acid Natural products 0.000 description 1
- 230000004136 fatty acid synthesis Effects 0.000 description 1
- 150000004665 fatty acids Chemical class 0.000 description 1
- 239000012467 final product Substances 0.000 description 1
- 230000002068 genetic effect Effects 0.000 description 1
- 239000011521 glass Substances 0.000 description 1
- 238000000227 grinding Methods 0.000 description 1
- HNDVDQJCIGZPNO-UHFFFAOYSA-N histidine Natural products OC(=O)C(N)CC1=CN=CN1 HNDVDQJCIGZPNO-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 238000000338 in vitro Methods 0.000 description 1
- 208000015181 infectious disease Diseases 0.000 description 1
- 230000000749 insecticidal effect Effects 0.000 description 1
- 239000000543 intermediate Substances 0.000 description 1
- 239000013067 intermediate product Substances 0.000 description 1
- 210000005061 intracellular organelle Anatomy 0.000 description 1
- 229930027917 kanamycin Natural products 0.000 description 1
- SBUJHOSQTJFQJX-NOAMYHISSA-N kanamycin Chemical compound O[C@@H]1[C@@H](O)[C@H](O)[C@@H](CN)O[C@@H]1O[C@H]1[C@H](O)[C@@H](O[C@@H]2[C@@H]([C@@H](N)[C@H](O)[C@@H](CO)O2)O)[C@H](N)C[C@@H]1N SBUJHOSQTJFQJX-NOAMYHISSA-N 0.000 description 1
- 229960000318 kanamycin Drugs 0.000 description 1
- 229930182823 kanamycin A Natural products 0.000 description 1
- 238000009630 liquid culture Methods 0.000 description 1
- 239000012139 lysis buffer Substances 0.000 description 1
- 230000007246 mechanism Effects 0.000 description 1
- 230000037353 metabolic pathway Effects 0.000 description 1
- 239000000203 mixture Substances 0.000 description 1
- 238000012986 modification Methods 0.000 description 1
- 230000004048 modification Effects 0.000 description 1
- 238000002703 mutagenesis Methods 0.000 description 1
- 231100000350 mutagenesis Toxicity 0.000 description 1
- 238000003199 nucleic acid amplification method Methods 0.000 description 1
- 150000007523 nucleic acids Chemical group 0.000 description 1
- 210000004940 nucleus Anatomy 0.000 description 1
- 238000000206 photolithography Methods 0.000 description 1
- 230000000644 propagated effect Effects 0.000 description 1
- 239000002994 raw material Substances 0.000 description 1
- 230000001105 regulatory effect Effects 0.000 description 1
- 238000011160 research Methods 0.000 description 1
- 235000002020 sage Nutrition 0.000 description 1
- 150000003839 salts Chemical class 0.000 description 1
- 238000003196 serial analysis of gene expression Methods 0.000 description 1
- 239000007787 solid Substances 0.000 description 1
- 239000007790 solid phase Substances 0.000 description 1
- 125000006850 spacer group Chemical group 0.000 description 1
- 241000894007 species Species 0.000 description 1
- 230000010473 stable expression Effects 0.000 description 1
- 238000000967 suction filtration Methods 0.000 description 1
- 230000002103 transcriptional effect Effects 0.000 description 1
- 238000011426 transformation method Methods 0.000 description 1
- 230000009261 transgenic effect Effects 0.000 description 1
- 108700026220 vif Genes Proteins 0.000 description 1
Landscapes
- Apparatus Associated With Microorganisms And Enzymes (AREA)
- Measuring Or Testing Involving Enzymes Or Micro-Organisms (AREA)
- Micro-Organisms Or Cultivation Processes Thereof (AREA)
Abstract
【課題】ゼニゴケ目生物細胞において目的の外来遺伝子を高発現させることができるプロモーター、５’ＵＴＲ、ターミネーター等のＤＮＡ断片、及びその利用法を提供する。
【解決手段】下記の（ａ）〜（ｄ）のいずれかのＤＮＡを含むＤＮＡ断片。（ａ）特定の塩基配列からなるＤＮＡ。（ｂ）特定の塩基配列において、１〜複数個の塩基が欠失、置換、又は付加された配列からなり、かつゼニゴケ目生物細胞において５’−ＵＴＲ活性を有するＤＮＡ。（ｃ）特定の塩基配列の一部からなり、かつゼニゴケ目生物細胞において５’−ＵＴＲ活性を有するＤＮＡ。（ｄ）特定の塩基配列と相補的な塩基配列からなるＤＮＡ又はその一部とストリンジェントな条件下でハイブリダイズし、かつゼニゴケ目生物細胞において５’−ＵＴＲ活性を有するＤＮＡ。
【選択図】なし
【解決手段】下記の（ａ）〜（ｄ）のいずれかのＤＮＡを含むＤＮＡ断片。（ａ）特定の塩基配列からなるＤＮＡ。（ｂ）特定の塩基配列において、１〜複数個の塩基が欠失、置換、又は付加された配列からなり、かつゼニゴケ目生物細胞において５’−ＵＴＲ活性を有するＤＮＡ。（ｃ）特定の塩基配列の一部からなり、かつゼニゴケ目生物細胞において５’−ＵＴＲ活性を有するＤＮＡ。（ｄ）特定の塩基配列と相補的な塩基配列からなるＤＮＡ又はその一部とストリンジェントな条件下でハイブリダイズし、かつゼニゴケ目生物細胞において５’−ＵＴＲ活性を有するＤＮＡ。
【選択図】なし
Description
本発明は、ゼニゴケ目生物細胞において外来遺伝子を安定に高発現させることができるＤＮＡ断片、該ＤＮＡ断片を含むベクター、該ＤＮＡ断片又はベクターが導入された形質転換体、ゼニゴケ目生物細胞内で外来遺伝子の発現を増強する方法等に関するものである。
植物に外来遺伝子を導入し、有用物質を生産する試みは、盛んに行われるようになってきている。例えば、生分解性プラスティックの原料であるポリヒドロキシ酪酸（ＰＨＢ）（非特許文献１)、殺虫タンパク質（非特許文献２）などの物質が、形質転換植物を用いて生産されている。
植物に外来遺伝子を導入する際には、強い転写活性を持つカリフラワーモザイクウィルスの３５Ｓプロモーター（ＣａＭＶ３５Ｓプロモーター）（非特許文献３）が通常利用されている。この他にも、外来遺伝子を高発現させるための、プロモーターやエンハンサーが開発されている。しかしながら、植物種によってプロモーターやエンハンサーの効果が異なり、必ずしも汎用性が高いとは言えない。
コケ植物であるゼニゴケ(Marchantia polymorpha)は、高等植物とは異なる代謝経路を有しており、従来植物では生産できなかった有用物質を生産できる可能性を持つ。これまでに、ＣａＭＶ３５Ｓプロモーターを用いてゼニゴケに外来遺伝子を導入し、ゼニゴケ細胞の脂肪酸組成を改変することが可能となっている（非特許文献４）。しかしながら、ＣａＭＶ３５Ｓプロモーターは、ゼニゴケにおいて高等植物と同等の高発現性を示さず、ゼニゴケに適したプロモーター配列が必要であると考えられている。
５’ＵＴＲ（５’非翻訳領域）は、遺伝子の安定した転写及び翻訳にとって重要であることが知られており、翻訳レベルを上昇させる効果を持つタバコモザイクウィルス（ＴＭＶ）のΩ配列（非特許文献５）、タバコアルコールデヒドロゲナーゼ遺伝子の５’ＵＴＲ配列（非特許文献６）などが報告されている。しかしながら、これらの配列は、ゼニゴケでは外来遺伝子の高発現に有効ではない。
ターミネーターは、転写終結及びｍＲＮＡの３’末端修飾を行い、安定した遺伝子発現に必要であることが知られている。これまでに高等植物への外来遺伝子導入においては、ＮＯＳターミネーター（非特許文献７）が広く用いられており、ゼニゴケにおいても同様にＮＯＳターミネーターを用いることが可能である。しかしながら、ゼニゴケにおいてＮＯＳターミネーターは遺伝子の高発現活性を有していない。また、ＨＳＰターミネーターは、シロイヌナズナやイネでＮＯＳターミネーターよりも高い遺伝子発現を実現することが報告されている（非特許文献８）。しかしながら、ゼニゴケにおいてＨＳＰターミネーターは有効ではなく、外来遺伝子発現を上昇させることができない。
従って、ゼニゴケにおいて外来遺伝子を高発現させるための技術は、未だ開発されていない。
従って、ゼニゴケにおいて外来遺伝子を高発現させるための技術は、未だ開発されていない。
ゼニゴケ生物細胞において外来遺伝子の高発現能を有するプロモーター、５’ＵＴＲ及び／又はターミネーターがゼニゴケ目生物細胞に発現可能に導入されてなる、形質発現の検出及び形質発現体は報告されていない。
Houmiel KL et al., Planta, 209, 547-550 (1999)
Kota M et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 96, 1840-1845 (1999)
Odell JT et al., Nature, 313, 810-812 (1985)
Kajikawa M et al., Biosci. Biotech. Biochem., 72, 435-444 (2008)
Gallie DR et al., Plant Cell, 1, 301-311 (1989)
Nagaya S et al., J. Biosci. Bioeng., 89, 231-235 (2000)
Herrera-Estrella L et al., EMBO J., 2, 987-995 (1983)
Nagaya S et al., Plant Cell Physiol., 51, 328-332 (2010)
本発明は上記従来の問題点に鑑みなされたものであって、その目的は、ゼニゴケ目生物細胞において目的の外来遺伝子を高発現させることができるプロモーター、５’ＵＴＲ、ターミネーター等のＤＮＡ断片、及びその利用法を提供することである。
本発明者らは、上記の課題を解決するため鋭意検討し、ゼニゴケ由来の伸長因子1α (EF1α)遺伝子のプロモーター（配列番号１）、ADH様UDP-グルコース脱水素酵素 (UDP) 遺伝子の5’UTR（配列番号２）及びFT1(Flowering Locus T 1)遺伝子のターミネーター（配列番号３）を単離し、該配列を用いて、ゼニゴケ培養細胞を用いたレポーター遺伝子の一過性発現解析を行った。その結果、これらの配列がゼニゴケ目生物細胞において外来遺伝子の発現を増大させる機能を有することを見出し、本発明を完成するに至った。
すなわち、本発明は、以下の〔１〕〜〔９〕の発明を包含する。
すなわち、本発明は、以下の〔１〕〜〔９〕の発明を包含する。
〔１〕下記の（ａ）〜（ｄ）のいずれかのＤＮＡを含むＤＮＡ断片。
（ａ）配列番号２に示される塩基配列からなるＤＮＡ
（ｂ）配列番号２に示される塩基配列において、１〜複数個の塩基が欠失、置換、又は付加された配列からなり、かつゼニゴケ目生物細胞において５’−ＵＴＲ活性を有するＤＮＡ
（ｃ）配列番号２に示される塩基配列の一部からなり、かつゼニゴケ目生物細胞において５’−ＵＴＲ活性を有するＤＮＡ
（ｄ）配列番号２に示される塩基配列と相補的な塩基配列からなるＤＮＡ又はその一部とストリンジェントな条件下でハイブリダイズし、かつゼニゴケ目生物細胞において５’−ＵＴＲ活性を有するＤＮＡ
〔２〕下記の（ａ）〜（ｄ）のいずれかのＤＮＡを含むＤＮＡ断片。
（ａ）配列番号１に示される塩基配列からなるＤＮＡ
（ｂ）配列番号１に示される塩基配列において、１〜複数個の塩基が欠失、置換、又は付加された配列からなり、かつゼニゴケ目生物細胞においてプロモーター活性を有するＤＮＡ
（ｃ）配列番号１に示される塩基配列の一部からなり、かつゼニゴケ目生物細胞においてプロモーター活性を有するＤＮＡ
（ｄ）配列番号１に示される塩基配列と相補的な塩基配列からなるＤＮＡ又はその一部とストリンジェントな条件下でハイブリダイズし、かつゼニゴケ目生物細胞においてプロモーター活性を有するＤＮＡ
〔３〕下記の（ａ）〜（ｄ）のいずれかのＤＮＡを含むＤＮＡ断片。
（ａ）配列番号３に示される塩基配列からなるＤＮＡ
（ｂ）配列番号３に示される塩基配列において、１〜複数個の塩基が欠失、置換、又は付加された配列からなり、かつゼニゴケ目生物細胞においてターミネーター活性を有するＤＮＡ
（ｃ）配列番号３に示される塩基配列の一部からなり、かつゼニゴケ目生物細胞においてターミネーター活性を有するＤＮＡ
（ｄ）配列番号３に示される塩基配列と相補的な塩基配列からなるＤＮＡ又はその一部とストリンジェントな条件下でハイブリダイズし、かつゼニゴケ目生物細胞においてターミネーター活性を有するＤＮＡ
〔４〕前記〔１〕〜〔３〕の何れか１項に記載のＤＮＡ断片を含む組換え形質発現ベクター。
〔５〕さらに、導入すべき外来遺伝子を含む前記〔４〕に記載の組換え形質発現ベクター。
〔６〕前記〔５〕に記載の組換え形質発現ベクターがゼニゴケ目生物細胞に発現可能に導入されてなる、ゼニゴケ目生物形質発現体。
〔７〕前記〔６〕に記載の形質発現体を培養又は栽培する工程を含む、ゼニゴケ目生物細胞内で外来遺伝子の発現を増強する方法。
〔８〕前記〔５〕に記載の組換え形質発現ベクターをゼニゴケ目生物細胞に導入する工程を含む、ゼニゴケ目生物細胞内で外来遺伝子の発現を増強する方法。
〔９〕前記〔１〕〜〔３〕の何れか１項に記載のＤＮＡ断片又はその相補配列をプローブ又はプライマーとして用いる遺伝子検出器具。
（ａ）配列番号２に示される塩基配列からなるＤＮＡ
（ｂ）配列番号２に示される塩基配列において、１〜複数個の塩基が欠失、置換、又は付加された配列からなり、かつゼニゴケ目生物細胞において５’−ＵＴＲ活性を有するＤＮＡ
（ｃ）配列番号２に示される塩基配列の一部からなり、かつゼニゴケ目生物細胞において５’−ＵＴＲ活性を有するＤＮＡ
（ｄ）配列番号２に示される塩基配列と相補的な塩基配列からなるＤＮＡ又はその一部とストリンジェントな条件下でハイブリダイズし、かつゼニゴケ目生物細胞において５’−ＵＴＲ活性を有するＤＮＡ
〔２〕下記の（ａ）〜（ｄ）のいずれかのＤＮＡを含むＤＮＡ断片。
（ａ）配列番号１に示される塩基配列からなるＤＮＡ
（ｂ）配列番号１に示される塩基配列において、１〜複数個の塩基が欠失、置換、又は付加された配列からなり、かつゼニゴケ目生物細胞においてプロモーター活性を有するＤＮＡ
（ｃ）配列番号１に示される塩基配列の一部からなり、かつゼニゴケ目生物細胞においてプロモーター活性を有するＤＮＡ
（ｄ）配列番号１に示される塩基配列と相補的な塩基配列からなるＤＮＡ又はその一部とストリンジェントな条件下でハイブリダイズし、かつゼニゴケ目生物細胞においてプロモーター活性を有するＤＮＡ
〔３〕下記の（ａ）〜（ｄ）のいずれかのＤＮＡを含むＤＮＡ断片。
（ａ）配列番号３に示される塩基配列からなるＤＮＡ
（ｂ）配列番号３に示される塩基配列において、１〜複数個の塩基が欠失、置換、又は付加された配列からなり、かつゼニゴケ目生物細胞においてターミネーター活性を有するＤＮＡ
（ｃ）配列番号３に示される塩基配列の一部からなり、かつゼニゴケ目生物細胞においてターミネーター活性を有するＤＮＡ
（ｄ）配列番号３に示される塩基配列と相補的な塩基配列からなるＤＮＡ又はその一部とストリンジェントな条件下でハイブリダイズし、かつゼニゴケ目生物細胞においてターミネーター活性を有するＤＮＡ
〔４〕前記〔１〕〜〔３〕の何れか１項に記載のＤＮＡ断片を含む組換え形質発現ベクター。
〔５〕さらに、導入すべき外来遺伝子を含む前記〔４〕に記載の組換え形質発現ベクター。
〔６〕前記〔５〕に記載の組換え形質発現ベクターがゼニゴケ目生物細胞に発現可能に導入されてなる、ゼニゴケ目生物形質発現体。
〔７〕前記〔６〕に記載の形質発現体を培養又は栽培する工程を含む、ゼニゴケ目生物細胞内で外来遺伝子の発現を増強する方法。
〔８〕前記〔５〕に記載の組換え形質発現ベクターをゼニゴケ目生物細胞に導入する工程を含む、ゼニゴケ目生物細胞内で外来遺伝子の発現を増強する方法。
〔９〕前記〔１〕〜〔３〕の何れか１項に記載のＤＮＡ断片又はその相補配列をプローブ又はプライマーとして用いる遺伝子検出器具。
本発明のＤＮＡ断片は、ゼニゴケ目生物細胞においてタンパク質をコードする遺伝子などの目的の外来遺伝子を高発現させることができるものである。
ゼニゴケ目生物細胞に従来の方法により外来遺伝子を導入し、発現させる方法は、遺伝子が高発現しないという問題点があるが、本発明においては、ゼニゴケ目生物細胞において外来遺伝子の高発現能を有するプロモーター、５’ＵＴＲ及び／又はターミネーター等を用いることにより、ゼニゴケ目生物細胞において外来遺伝子の発現を高めることができる。
ゼニゴケ目生物細胞に従来の方法により外来遺伝子を導入し、発現させる方法は、遺伝子が高発現しないという問題点があるが、本発明においては、ゼニゴケ目生物細胞において外来遺伝子の高発現能を有するプロモーター、５’ＵＴＲ及び／又はターミネーター等を用いることにより、ゼニゴケ目生物細胞において外来遺伝子の発現を高めることができる。
本発明によれば、ゼニゴケ目生物細胞において外来遺伝子の高発現能を有するプロモーター、５’ＵＴＲ及び／又はターミネーターを使うことにより、有用物質を生産するために必要な遺伝子を、ゼニゴケ目生物細胞において高発現させることができ、有用物質生産能を増大できるという効果を奏する。
本発明の実施の一形態について説明すれば、以下の通りである。なお、本発明は、これに限定されるものではない。
本発明のＤＮＡ断片は、ゼニゴケ目生物細胞内で所望の外来遺伝子を高発現させる機能を有するＤＮＡである。外来遺伝子を高発現させる機能（高発現能）とは、本発明のＤＮＡ断片が該外来遺伝子の発現系に共存した際に、この外来遺伝子にコードされた情報が、転写、翻訳されてタンパク質が形成される際、この翻訳により形成されたタンパク質量を増大させる機能を意味する。
本発明のＤＮＡ断片として、例えば、ゼニゴケ目生物細胞でプロモーター活性を有する（プロモーターとして機能する）ＤＮＡ断片、ゼニゴケ目生物細胞で５’ＵＲＴ活性を有する（５’ＵＲＴとして機能する）ＤＮＡ断片、ゼニゴケ目生物細胞でターミネーター活性を有する（ターミネーターとして機能する）ＤＮＡ断片等が挙げられる。本発明のＤＮＡ断片は、好ましくはゼニゴケ目生物由来のＤＮＡ断片である。
例えば、本発明のＤＮＡ断片として、下記（ａ）〜（ｄ）のいずれかのＤＮＡを含むＤＮＡ断片が挙げられる。
（ａ）配列番号１に示される塩基配列からなるＤＮＡ
（ｂ）配列番号１に示される塩基配列において、１〜複数個の塩基が欠失、置換、又は付加された配列からなり、かつゼニゴケ目生物細胞においてプロモーター活性を有するＤＮＡ
（ｃ）配列番号１に示される塩基配列の一部からなり、かつゼニゴケ目生物細胞においてプロモーター活性を有するＤＮＡ
（ｄ）配列番号１に示される塩基配列と相補的な塩基配列からなるＤＮＡ又はその一部とストリンジェントな条件下でハイブリダイズし、かつゼニゴケ目生物細胞においてプロモーター活性を有するＤＮＡ
配列番号１に示される塩基配列からなるＤＮＡは、ゼニゴケ(Marchantia polymorpha)の伸長因子1α (EF1α)遺伝子のプロモーターである。上記（ｄ）のＤＮＡは、好ましくは配列番号１に示される塩基配列と相補的な塩基配列からなるＤＮＡとストリンジェントな条件下でハイブリダイズし、かつゼニゴケ目生物細胞においてプロモーター活性を有するゼニゴケ目生物由来のＤＮＡである。
（ａ）配列番号１に示される塩基配列からなるＤＮＡ
（ｂ）配列番号１に示される塩基配列において、１〜複数個の塩基が欠失、置換、又は付加された配列からなり、かつゼニゴケ目生物細胞においてプロモーター活性を有するＤＮＡ
（ｃ）配列番号１に示される塩基配列の一部からなり、かつゼニゴケ目生物細胞においてプロモーター活性を有するＤＮＡ
（ｄ）配列番号１に示される塩基配列と相補的な塩基配列からなるＤＮＡ又はその一部とストリンジェントな条件下でハイブリダイズし、かつゼニゴケ目生物細胞においてプロモーター活性を有するＤＮＡ
配列番号１に示される塩基配列からなるＤＮＡは、ゼニゴケ(Marchantia polymorpha)の伸長因子1α (EF1α)遺伝子のプロモーターである。上記（ｄ）のＤＮＡは、好ましくは配列番号１に示される塩基配列と相補的な塩基配列からなるＤＮＡとストリンジェントな条件下でハイブリダイズし、かつゼニゴケ目生物細胞においてプロモーター活性を有するゼニゴケ目生物由来のＤＮＡである。
上記（ａ）〜（ｄ）のＤＮＡは、ゼニゴケ目生物細胞でプロモーター活性を有するものである。このような上記（ａ）〜（ｄ）のいずれかのＤＮＡを含むＤＮＡ断片を、本発明１のＤＮＡ断片ともいう。
本発明１のＤＮＡ断片として、（ａ’）配列番号１に示される塩基配列からなるＤＮＡ断片；（ｂ’）配列番号１に示される塩基配列において、１〜複数個の塩基が欠失、置換、又は付加された配列からなり、かつゼニゴケ目生物細胞においてプロモーター活性を有するＤＮＡ断片；（ｃ’）配列番号１に示される塩基配列の一部からなり、かつゼニゴケ目生物細胞においてプロモーター活性を有するＤＮＡ断片；（ｄ’）配列番号１に示される塩基配列と相補的な塩基配列からなるＤＮＡ又はその一部（好ましくは配列番号１と相補的な塩基配列からなるＤＮＡ）とストリンジェントな条件下でハイブリダイズし、かつゼニゴケ目生物細胞においてプロモーター活性を有するＤＮＡ断片等が好ましい。また、本発明１のＤＮＡ断片は、ゼニゴケ目生物由来のものであることがより好ましい。さらに好ましくは、配列番号１に示される塩基配列からなるＤＮＡを含むＤＮＡ断片であり、特に好ましくは、配列番号１に示される塩基配列からなるＤＮＡ断片である。
本発明１のＤＮＡ断片は、外来遺伝子をゼニゴケ生物細胞内で高発現させる機能を有するプロモーターとして好適に用いられる。
本発明１のＤＮＡ断片は、外来遺伝子をゼニゴケ生物細胞内で高発現させる機能を有するプロモーターとして好適に用いられる。
本発明は、下記（ａ）〜（ｄ）のいずれかのＤＮＡを含むＤＮＡ断片も包含する。
下記（ａ）〜（ｄ）のＤＮＡは、ゼニゴケ目生物細胞で５’−ＵＴＲ活性を有するものである。下記（ａ）〜（ｄ）のいずれかのＤＮＡを含むＤＮＡ断片を、本発明２のＤＮＡ断片ともいう。
（ａ）配列番号２に示される塩基配列からなるＤＮＡ
（ｂ）配列番号２に示される塩基配列において、１〜複数個の塩基が欠失、置換、又は付加された配列からなり、かつゼニゴケ目生物細胞において５’−ＵＴＲ活性を有するＤＮＡ
（ｃ）配列番号２に示される塩基配列の一部からなり、かつゼニゴケ目生物細胞において５’−ＵＴＲ活性を有するＤＮＡ
（ｄ）配列番号２に示される塩基配列と相補的な塩基配列からなるＤＮＡ又はその一部とストリンジェントな条件下でハイブリダイズし、かつゼニゴケ目生物細胞において５’−ＵＴＲ活性を有するＤＮＡ
配列番号２に示される塩基配列からなるＤＮＡは、ゼニゴケ(Marchantia polymorpha)のADH様UDP-グルコース脱水素酵素 (UDP) 遺伝子の5’UTRである。上記（ｄ）のＤＮＡは、好ましくは配列番号２に示される塩基配列と相補的な塩基配列からなるＤＮＡとストリンジェントな条件下でハイブリダイズし、かつゼニゴケ目生物細胞において５’ＵＴＲ活性を有するゼニゴケ目生物由来のＤＮＡである。
下記（ａ）〜（ｄ）のＤＮＡは、ゼニゴケ目生物細胞で５’−ＵＴＲ活性を有するものである。下記（ａ）〜（ｄ）のいずれかのＤＮＡを含むＤＮＡ断片を、本発明２のＤＮＡ断片ともいう。
（ａ）配列番号２に示される塩基配列からなるＤＮＡ
（ｂ）配列番号２に示される塩基配列において、１〜複数個の塩基が欠失、置換、又は付加された配列からなり、かつゼニゴケ目生物細胞において５’−ＵＴＲ活性を有するＤＮＡ
（ｃ）配列番号２に示される塩基配列の一部からなり、かつゼニゴケ目生物細胞において５’−ＵＴＲ活性を有するＤＮＡ
（ｄ）配列番号２に示される塩基配列と相補的な塩基配列からなるＤＮＡ又はその一部とストリンジェントな条件下でハイブリダイズし、かつゼニゴケ目生物細胞において５’−ＵＴＲ活性を有するＤＮＡ
配列番号２に示される塩基配列からなるＤＮＡは、ゼニゴケ(Marchantia polymorpha)のADH様UDP-グルコース脱水素酵素 (UDP) 遺伝子の5’UTRである。上記（ｄ）のＤＮＡは、好ましくは配列番号２に示される塩基配列と相補的な塩基配列からなるＤＮＡとストリンジェントな条件下でハイブリダイズし、かつゼニゴケ目生物細胞において５’ＵＴＲ活性を有するゼニゴケ目生物由来のＤＮＡである。
５’ＵＴＲ活性を有するとは、外来遺伝子の上流側（５’側）に位置する場合に、転写されたｍＲＮＡの翻訳効率を上昇させ、外来遺伝子を高発現させる機能を有することを意味する。
本発明２のＤＮＡ断片として、（ａ’）配列番号２に示される塩基配列からなるＤＮＡ断片；（ｂ’）配列番号２に示される塩基配列において、１〜複数個の塩基が欠失、置換、又は付加された配列からなり、かつゼニゴケ目生物細胞において５’−ＵＴＲ活性を有するＤＮＡ断片；（ｃ’）配列番号２に示される塩基配列の一部からなり、かつゼニゴケ目生物細胞において５’−ＵＴＲ活性を有するＤＮＡ断片；（ｄ’）配列番号２に示される塩基配列と相補的な塩基配列からなるＤＮＡ又はその一部（好ましくは配列番号２と相補的な塩基配列からなるＤＮＡ）とストリンジェントな条件下でハイブリダイズし、かつゼニゴケ目生物細胞において５’−ＵＴＲ活性を有するＤＮＡ断片等が好ましい。また、本発明２のＤＮＡ断片は、ゼニゴケ目生物由来のものであることがより好ましい。さらに好ましくは、配列番号２に示される塩基配列からなるＤＮＡを含むＤＮＡ断片であり、特に好ましくは、配列番号２に示される塩基配列からなるＤＮＡ断片である。
本発明２のＤＮＡ断片は、外来遺伝子をゼニゴケ生物細胞内で高発現させる機能を有する５’−ＵＴＲとして好適に用いられる。
本発明２のＤＮＡ断片は、外来遺伝子をゼニゴケ生物細胞内で高発現させる機能を有する５’−ＵＴＲとして好適に用いられる。
本発明はさらに、下記（ａ）〜（ｄ）のいずれかのＤＮＡを含むＤＮＡ断片も包含する。
下記（ａ）〜（ｄ）のＤＮＡは、ゼニゴケ目生物細胞でターミネーター活性を有するものである。下記（ａ）〜（ｄ）のいずれかのＤＮＡを含むＤＮＡ断片を、本発明３のＤＮＡ断片ともいう。
（ａ）配列番号３に示される塩基配列からなるＤＮＡ
（ｂ）配列番号３に示される塩基配列において、１〜複数個の塩基が欠失、置換、又は付加された配列からなり、かつゼニゴケ目生物細胞においてターミネーター活性を有するＤＮＡ
（ｃ）配列番号３に示される塩基配列の一部からなり、かつゼニゴケ目生物細胞においてターミネーター活性を有するＤＮＡ
（ｄ）配列番号３に示される塩基配列と相補的な塩基配列からなるＤＮＡ又はその一部とストリンジェントな条件下でハイブリダイズし、かつゼニゴケ目生物細胞においてターミネーター活性を有するＤＮＡ
配列番号３に示される塩基配列からなるＤＮＡは、ゼニゴケ(Marchantia polymorpha)のFT1(Flowering Locus T 1)遺伝子のターミネーターである。上記（ｄ）のＤＮＡは、好ましくは配列番号３に示される塩基配列と相補的な塩基配列からなるＤＮＡとストリンジェントな条件下でハイブリダイズし、かつゼニゴケ目生物細胞においてターミネーター活性を有するゼニゴケ目生物由来のＤＮＡである。
下記（ａ）〜（ｄ）のＤＮＡは、ゼニゴケ目生物細胞でターミネーター活性を有するものである。下記（ａ）〜（ｄ）のいずれかのＤＮＡを含むＤＮＡ断片を、本発明３のＤＮＡ断片ともいう。
（ａ）配列番号３に示される塩基配列からなるＤＮＡ
（ｂ）配列番号３に示される塩基配列において、１〜複数個の塩基が欠失、置換、又は付加された配列からなり、かつゼニゴケ目生物細胞においてターミネーター活性を有するＤＮＡ
（ｃ）配列番号３に示される塩基配列の一部からなり、かつゼニゴケ目生物細胞においてターミネーター活性を有するＤＮＡ
（ｄ）配列番号３に示される塩基配列と相補的な塩基配列からなるＤＮＡ又はその一部とストリンジェントな条件下でハイブリダイズし、かつゼニゴケ目生物細胞においてターミネーター活性を有するＤＮＡ
配列番号３に示される塩基配列からなるＤＮＡは、ゼニゴケ(Marchantia polymorpha)のFT1(Flowering Locus T 1)遺伝子のターミネーターである。上記（ｄ）のＤＮＡは、好ましくは配列番号３に示される塩基配列と相補的な塩基配列からなるＤＮＡとストリンジェントな条件下でハイブリダイズし、かつゼニゴケ目生物細胞においてターミネーター活性を有するゼニゴケ目生物由来のＤＮＡである。
本発明３のＤＮＡ断片として、（ａ’）配列番号３に示される塩基配列からなるＤＮＡ断片；（ｂ’）配列番号３に示される塩基配列において、１〜複数個の塩基が欠失、置換、又は付加された配列からなり、かつゼニゴケ目生物細胞においてターミネーター活性を有するＤＮＡ断片；（ｃ’）配列番号３に示される塩基配列の一部からなり、かつゼニゴケ目生物細胞においてターミネーター活性を有するＤＮＡ断片；（ｄ’）配列番号３に示される塩基配列と相補的な塩基配列からなるＤＮＡ又はその一部（好ましくは配列番号３と相補的な塩基配列からなるＤＮＡ）とストリンジェントな条件下でハイブリダイズし、かつゼニゴケ目生物細胞においてターミネーター活性を有するＤＮＡ断片等が好ましい。また、本発明３のＤＮＡ断片は、ゼニゴケ目生物由来のものであることがより好ましい。さらに好ましくは、配列番号３に示される塩基配列からなるＤＮＡを含むＤＮＡ断片であり、特に好ましくは、配列番号３に示される塩基配列からなるＤＮＡ断片である。
本発明３のＤＮＡ断片は、外来遺伝子をゼニゴケ生物細胞内で高発現させる機能を有するターミネーターとして好適に用いられる。
本発明３のＤＮＡ断片は、外来遺伝子をゼニゴケ生物細胞内で高発現させる機能を有するターミネーターとして好適に用いられる。
本明細書中、「１〜複数個」における「複数個」とは、通常２〜３０個程度、好ましくは２〜１５個程度、より好ましくは２〜１０個程度、さらに好ましくは２〜６個程度、最も好ましくは２個である。
なお、本明細書中に記載する「ストリンジェントな条件」とは、少なくとも約９０％の同一性、好ましくは少なくとも約９５％の同一性、より好ましくは少なくとも約９７％の同一性、最も好ましくは少なくとも約９８％の同一性が配列間に存在するときのみハイブリダイゼーションが起こることを意味する。
上記ハイブリダイゼーションは、J. Sambrook et al. Molecular Cloning, A Laboratory Manual. 3rd Ed., Cold Spring Harbor Laboratory (2001)に記載されている方法等、従来公知の方法で行うことができる。通常、温度が高いほど、塩濃度が低いほどストリンジェンシーは高くなり（ハイブリダイズし難くなる）、より相同な遺伝子を取得することができる。ハイブリダイゼーションの条件としては、従来公知の条件を好適に用いることができ、特に限定しないが、例えば、４２℃、市販のＤＩＧ（ジゴキシゲニン）ハイブリダイゼーションバッファー（ロシュ・ダイアグノスティックス社製）を用いて行うことなどが挙げられる。
上記「ゼニゴケ目生物」とは、ゼニゴケ(Marchantia polymorpha)に限定されるものでなく、ゼニゴケ亜綱ゼニゴケ目（Marchantiales）に属する生物が含まれる。ゼニゴケ亜綱ゼニゴケ目（Marchantiales）に属する生物としては、例えば、ハマグリゼニゴケ科、ミカズキゼニゴケ科、ジャゴケ科、アズマゼニゴケ科、ジンガサゴケ科、ジンチョウゴケ科、ヤワラゼニゴケ科、ウキゴケ科、ゼニゴケ科等の植物が挙げられる。ゼニゴケ目生物は、好ましくは、ゼニゴケ(Marchantia polymorpha)である。
以下、本発明のＤＮＡ断片の取得方法、並びに本発明に係るＤＮＡ断片の利用方法（有用性）の順で本発明をさらに詳細に説明する。
〔１〕本発明のＤＮＡ断片の取得方法
本発明のＤＮＡ断片は、例えば、ゼニゴケ目生物等の植物、動物、微生物等から取得することができる。好ましくは、ゼニゴケ目生物から取得する。本発明１のプロモーター活性を有するＤＮＡ断片、本発明２の５’−ＵＴＲ活性を有するＤＮＡ断片、及び本発明３のターミネーター活性を有するＤＮＡ断片の取得方法（生産方法）は特に限定されるものではないが、例えば、ゼニゴケ目生物から本発明のＤＮＡ断片を取得する方法として、代表的な方法として次に示す各方法を挙げることができる。なお、本発明のＤＮＡ断片は、例えば下記方法においてゼニゴケ目生物以外の植物、動物、微生物等のESTライブラリー等を使用して、ゼニゴケ目生物以外の生物から取得することもできる。
本発明のＤＮＡ断片は、例えば、ゼニゴケ目生物等の植物、動物、微生物等から取得することができる。好ましくは、ゼニゴケ目生物から取得する。本発明１のプロモーター活性を有するＤＮＡ断片、本発明２の５’−ＵＴＲ活性を有するＤＮＡ断片、及び本発明３のターミネーター活性を有するＤＮＡ断片の取得方法（生産方法）は特に限定されるものではないが、例えば、ゼニゴケ目生物から本発明のＤＮＡ断片を取得する方法として、代表的な方法として次に示す各方法を挙げることができる。なお、本発明のＤＮＡ断片は、例えば下記方法においてゼニゴケ目生物以外の植物、動物、微生物等のESTライブラリー等を使用して、ゼニゴケ目生物以外の生物から取得することもできる。
（１）ゼニゴケ目生物由来のプロモーター活性を有するＤＮＡ断片
例えば、配列番号１に示される塩基配列からなるＤＮＡは、ゼニゴケ(Marchantia polymorpha)の伸長因子1α (EF1α)遺伝子のプロモーターであり、ゼニゴケから以下の方法等により単離することができる。
伸長因子1α (EF1α)遺伝子は、真核生物の翻訳に関わるタンパク質をコードする遺伝子であり、生物一般に高発現することが知られている (Nagaya S et al., J. Biosci. Bioeng., 89, 231-235 (2000)、及びCurie C et al., Mol. Gene. Genet., 238, 428-436 (1993))。そこで、既知のEF1α遺伝子のアミノ酸配列と相同性を示すクローンを、ゼニゴケのESTライブラリーより探索する。次に、得られたESTクローンの配列を含むゲノムクローンを、本発明１のＤＮＡ断片の塩基配列（例えば、配列番号１の塩基配列）の一部と特異的にハイブリダイズするプローブを調製し、ゼニゴケのゲノムライブラリーよりスクリーニングする。このようなプローブとしては、本発明のゼニゴケ由来のプロモーターの塩基配列（例えば、配列番号１の塩基配列）又はその相補配列の少なくとも一部に特異的にハイブリダイズするプローブであれば、いずれの配列及び長さのものを用いてもよい。このような方法を用いて、ゼニゴケEF1α遺伝子のプロモーター配列（配列番号１）等を単離することができる。
例えば、配列番号１に示される塩基配列からなるＤＮＡは、ゼニゴケ(Marchantia polymorpha)の伸長因子1α (EF1α)遺伝子のプロモーターであり、ゼニゴケから以下の方法等により単離することができる。
伸長因子1α (EF1α)遺伝子は、真核生物の翻訳に関わるタンパク質をコードする遺伝子であり、生物一般に高発現することが知られている (Nagaya S et al., J. Biosci. Bioeng., 89, 231-235 (2000)、及びCurie C et al., Mol. Gene. Genet., 238, 428-436 (1993))。そこで、既知のEF1α遺伝子のアミノ酸配列と相同性を示すクローンを、ゼニゴケのESTライブラリーより探索する。次に、得られたESTクローンの配列を含むゲノムクローンを、本発明１のＤＮＡ断片の塩基配列（例えば、配列番号１の塩基配列）の一部と特異的にハイブリダイズするプローブを調製し、ゼニゴケのゲノムライブラリーよりスクリーニングする。このようなプローブとしては、本発明のゼニゴケ由来のプロモーターの塩基配列（例えば、配列番号１の塩基配列）又はその相補配列の少なくとも一部に特異的にハイブリダイズするプローブであれば、いずれの配列及び長さのものを用いてもよい。このような方法を用いて、ゼニゴケEF1α遺伝子のプロモーター配列（配列番号１）等を単離することができる。
（２）ゼニゴケ目生物由来の５’ＵＴＲ活性を有するＤＮＡ断片
例えば、配列番号２に示される塩基配列からなるＤＮＡは、ゼニゴケ(Marchantia polymorpha)のADH様UDP-グルコース脱水素酵素 (UDP)遺伝子の5’ UTRであり、ゼニゴケから以下の方法等により単離することができる。
タバコにおいて、アルコールデヒドロゲナーゼ(ADH)遺伝子の5’ UTR配列が、外来遺伝子の安定な発現に有効であることが知られている (Nagaya S et al., J. Biosci. Bioeng., 89, 231-235 (2000))。そこで、既知のADH遺伝子のアミノ酸配列と相同性を示すクローンを、ゼニゴケのESTライブラリーより探索する。次に、得られたESTクローンの配列を含むゲノムクローンを、本発明２のＤＮＡ断片の塩基配列（例えば、配列番号２の塩基配列）の一部と特異的にハイブリダイズするプローブを調製し、ゼニゴケのゲノムライブラリーよりスクリーニングする。このようなプローブとしては、本発明のゼニゴケ由来の5’ UTRの塩基配列（例えば、配列番号２の塩基配列）又はその相補配列の少なくとも一部に特異的にハイブリダイズするプローブであれば、いずれの配列及び長さのものを用いてもよい。このような方法を用いて、ゼニゴケADH様UDP-グルコース脱水素酵素 (UDP)遺伝子の5’ UTR（配列番号２）等を単離することができる。
例えば、配列番号２に示される塩基配列からなるＤＮＡは、ゼニゴケ(Marchantia polymorpha)のADH様UDP-グルコース脱水素酵素 (UDP)遺伝子の5’ UTRであり、ゼニゴケから以下の方法等により単離することができる。
タバコにおいて、アルコールデヒドロゲナーゼ(ADH)遺伝子の5’ UTR配列が、外来遺伝子の安定な発現に有効であることが知られている (Nagaya S et al., J. Biosci. Bioeng., 89, 231-235 (2000))。そこで、既知のADH遺伝子のアミノ酸配列と相同性を示すクローンを、ゼニゴケのESTライブラリーより探索する。次に、得られたESTクローンの配列を含むゲノムクローンを、本発明２のＤＮＡ断片の塩基配列（例えば、配列番号２の塩基配列）の一部と特異的にハイブリダイズするプローブを調製し、ゼニゴケのゲノムライブラリーよりスクリーニングする。このようなプローブとしては、本発明のゼニゴケ由来の5’ UTRの塩基配列（例えば、配列番号２の塩基配列）又はその相補配列の少なくとも一部に特異的にハイブリダイズするプローブであれば、いずれの配列及び長さのものを用いてもよい。このような方法を用いて、ゼニゴケADH様UDP-グルコース脱水素酵素 (UDP)遺伝子の5’ UTR（配列番号２）等を単離することができる。
（３）ゼニゴケ目生物由来のターミネーター活性を有するＤＮＡ断片
例えば、配列番号３に示される塩基配列からなるＤＮＡは、ゼニゴケ(Marchantia polymorpha)のFT1遺伝子のターミネーターであり、ゼニゴケから以下の方法等により単離することができる。
シロイヌナズナとイネにおいて、内在性遺伝子のターミネーターを用いると、NOSターミネーターよりも遺伝子発現が上昇する場合が多いことが知られている（Nagaya S et al., Plant Cell Physiol., 51, 328-332 (2010))。そこで、既知のFT1遺伝子のアミノ酸配列と相同性を示すクローンを、ゼニゴケのESTライブラリーより探索する。次に、得られたESTクローンの配列を含むゲノムクローンを、本発明のＤＮＡ断片の塩基配列（例えば、配列番号３の塩基配列）の一部と特異的にハイブリダイズするプローブを調製し、ゼニゴケのゲノムライブラリーよりスクリーニングする。このようなプローブとしては、本発明のゼニゴケ由来のターミネーターの塩基配列（例えば、配列番号３の塩基配列）又はその相補配列の少なくとも一部に特異的にハイブリダイズするプローブであれば、いずれの配列及び長さのものを用いてもよい。このような方法を用いて、ゼニゴケFT1遺伝子のターミネーター（配列番号３）等を単離することができる。
例えば、配列番号３に示される塩基配列からなるＤＮＡは、ゼニゴケ(Marchantia polymorpha)のFT1遺伝子のターミネーターであり、ゼニゴケから以下の方法等により単離することができる。
シロイヌナズナとイネにおいて、内在性遺伝子のターミネーターを用いると、NOSターミネーターよりも遺伝子発現が上昇する場合が多いことが知られている（Nagaya S et al., Plant Cell Physiol., 51, 328-332 (2010))。そこで、既知のFT1遺伝子のアミノ酸配列と相同性を示すクローンを、ゼニゴケのESTライブラリーより探索する。次に、得られたESTクローンの配列を含むゲノムクローンを、本発明のＤＮＡ断片の塩基配列（例えば、配列番号３の塩基配列）の一部と特異的にハイブリダイズするプローブを調製し、ゼニゴケのゲノムライブラリーよりスクリーニングする。このようなプローブとしては、本発明のゼニゴケ由来のターミネーターの塩基配列（例えば、配列番号３の塩基配列）又はその相補配列の少なくとも一部に特異的にハイブリダイズするプローブであれば、いずれの配列及び長さのものを用いてもよい。このような方法を用いて、ゼニゴケFT1遺伝子のターミネーター（配列番号３）等を単離することができる。
得られたＤＮＡ断片の塩基配列の決定は、通常、マキサム−ギルバート法、ジデオキシ法等の公知手法により、又はBigDye（登録商標）ターミネーターサイクルシークエンシングキット（Applied Biosystems社）、BcaBEST（登録商標）ジデオキシシークエンシングキット(Takara社)等を用いた自動塩基配列決定装置により行うことができる。なお、変異の導入は、公知の手法により(Ito, W.(1991) Gene 102: 67-70)、又は市販のキット（Takara社のLA PCR in vitro Mutagenesis シリーズキット）を用いて行うことができる。
一旦外来遺伝子の高発現能を有する本発明のＤＮＡ断片の塩基配列が確定されると、その後はＰＣＲ等の増幅手段を用いて本発明のＤＮＡ断片を取得することができる。例えば、本発明のＤＮＡ断片のＤＮＡ配列のうち、５’側及び３’側の配列（又はその相補配列）の中からそれぞれプライマーを調製し、これらプライマーを用いてゲノムＤＮＡ等を鋳型にしてＰＣＲ等を行い、両プライマー間に挟まれるＤＮＡ領域を増幅することで、本発明のＤＮＡ断片を含むＤＮＡ断片を大量に取得できる。ＰＣＲ、プライマーの調製等の操作は、公知の遺伝子工学的手法（遺伝子操作技術）により、行うことができる。また、該ＤＮＡ断片が適当なベクターにクローニングされている場合には、インサートとしてマルチクローニングサイトに挿入されている該ＤＮＡ断片の５’及び３’方向外側の、ベクター起源の塩基配列を含むプライマーを用いたＰＣＲによって、又は本発明のＤＮＡ断片の塩基配列を含むＤＮＡ断片をプローブとしてハイブリダイズさせることによって、本発明のＤＮＡ断片を得ることができる。また、ＤＮＡ合成機による化学合成によって本発明のＤＮＡ断片を得ることもできる。
得られたＤＮＡ断片が目的とする外来遺伝子の高発現能を有するか否かは、例えばゼニゴケ培養細胞においてルシフェラーゼ遺伝子等をレポーター遺伝子としたトランジェントアッセイ、染色体に組込ませた形質転換細胞でのアッセイ等により確認することができる。
なお、このように本発明のゼニゴケ目生物由来のプロモーター活性を有するＤＮＡ断片、５’ＵＴＲ活性を有するＤＮＡ断片又はターミネーター活性を有するＤＮＡ断片を取得する目的で、用いる宿主細胞には様々なものが存在するが、目的に応じたものを選択すればよい。また、外来遺伝子の発現を確認又は検出するために用いるレポーター遺伝子は、様々な検出方法が存在するので、目的に応じたものを選択すればよい。宿主細胞内で産生されたタンパク質を検出又は精製する方法は、用いた宿主、タンパク質の性質によって異なるが、該宿主細胞又はその培養上清から、公知の方法により検出又は精製することが可能である。例えば、ルシフェラーゼ遺伝子の利用又はヒスチジンタグの利用等によって比較的容易に目的のタンパク質を検出又は精製することが可能である。
上記の方法等により、ゼニゴケ目生物細胞で外来遺伝子の発現を高める又は増強させる機能を有する本発明のＤＮＡ断片を得ることができる。
本発明のＤＮＡ断片は、２本鎖ＤＮＡのみならず、それを構成するセンス鎖及びアンチセンス鎖と言った各１本鎖ＤＮＡやＲＮＡを包含する。アンチセンス鎖は、プローブとして又はアンチセンス化合物として利用できる。ＤＮＡには、例えばクローニング若しくは化学合成技術又はそれらの組み合わせで得られるようなｃＤＮＡやゲノムＤＮＡ等が含まれる。さらに、本発明のＤＮＡ断片は、プロモーター領域、５’ＵＴＲ配列、及びターミネーター配列を含む形質発現ベクター配列などの配列を含むものであってもよい。
〔２〕本発明に係るＤＮＡ断片の利用方法（有用性）
（１）組換え形質発現ベクター
上述した本発明のいずれかのＤＮＡ断片を含む組換え形質発現ベクターも、本発明に包含される。
本発明の組換え形質発現ベクターは、例えば、外来遺伝子をゼニゴケ目生物細胞に導入したトランジェント形質発現体等のゼニゴケ目生物形質発現体の作出のため等に使用され得るものである。
（１）組換え形質発現ベクター
上述した本発明のいずれかのＤＮＡ断片を含む組換え形質発現ベクターも、本発明に包含される。
本発明の組換え形質発現ベクターは、例えば、外来遺伝子をゼニゴケ目生物細胞に導入したトランジェント形質発現体等のゼニゴケ目生物形質発現体の作出のため等に使用され得るものである。
本発明の組換え形質発現ベクターは、（Ａ）本発明１のＤＮＡ断片、（Ｂ）本発明２のＤＮＡ断片、及び（Ｃ）本発明３のＤＮＡ断片のうちの少なくとも１つを含むものであれば、特に限定されるものではなく、本発明の効果を奏することになる限り、これらの２以上のＤＮＡ断片を含んでいてもよい。本発明の組換え形質発現ベクターは、さらに、導入すべき外来遺伝子を含むことができる。組換え形質発現ベクターの作製方法は、遺伝子工学の分野で公知の方法を用いて行えばよい。
本発明に係る遺伝子を含む組換え形質発現ベクターは、通常、基礎となるベクター（以下の説明では、便宜上、基礎ベクターと称する）のマルチクローニングサイトに、本発明のＤＮＡ断片の１又は２以上等を組み込んで構築すればよい。
基礎ベクターの具体的な種類は特に限定されるものではなく、ゼニゴケ目生物細胞中で形質発現可能なベクターを適宜選択すればよい。ここで、上記基礎ベクターとしては、プラスミド、ファージ、又はコスミドなどを用いることができるが特に限定されるものではない。すなわち、細胞の種類に応じて、確実に遺伝子を発現させるために適宜プロモーター配列等を選択し、これと機能が未知又は既知の遺伝子を各種プラスミド等の基礎ベクターに組み込んだものを組換え形質発現ベクターとして用いればよい。
組換え形質発現ベクターが本発明１のＤＮＡ断片を含む場合、該組換え形質発現ベクターには、通常、本発明１のＤＮＡ断片、及びゼニゴケ目生物細胞内で機能するターミネーターが含まれる。通常、上流側から、本発明１のＤＮＡ断片、及びゼニゴケ目生物細胞内で機能するターミネーターがこの順で組換え形質発現ベクター内に含まれる。組換え形質発現ベクターが、さらに、導入すべき外来遺伝子を含む場合、該外来遺伝子は、通常、本発明１のＤＮＡ断片と、ゼニゴケ目生物細胞内で機能するターミネーターとの間に配置される。
ゼニゴケ目生物細胞内で機能するターミネーターは特に限定されず、ゼニゴケ目生物由来のものであってもよく、他の生物由来のものであってもよい。例えば、ＮＯＳターミネーター、ＯＣＳターミネーター等が挙げられる。また、ゼニゴケ目生物細胞内で機能するターミネーターとして、本発明３のＤＮＡ断片を用いることも好ましい。
組換え形質発現ベクターが本発明２のＤＮＡ断片を含む場合、該組換え形質発現ベクターには、通常、本発明２のＤＮＡ断片、及びゼニゴケ目生物細胞内で機能するターミネーターが含まれる。通常、上流側から、本発明２のＤＮＡ断片、及びゼニゴケ目生物細胞内で機能するターミネーターがこの順で組換え形質発現ベクター内に含まれる。本発明２のＤＮＡ断片を含む組換え形質発現ベクターは、さらに、ゼニゴケ目生物細胞内で機能するプロモーターを含むことが好ましい。本発明２のＤＮＡ断片と、前記プロモーターとを併用すると、ゼニゴケ目生物細胞において目的の外来遺伝子を、より高発現させることができる。ゼニゴケ目生物細胞内で機能するプロモーターを含む場合には、通常、上流から、ゼニゴケ目生物細胞内で機能するプロモーター、本発明２のＤＮＡ断片、及びゼニゴケ目生物細胞内で機能するターミネーターがこの順で組換え形質発現ベクター内に含まれる。
組換え形質発現ベクターが、さらに、導入すべき外来遺伝子を含む場合、該外来遺伝子は、通常、本発明２のＤＮＡ断片と、ゼニゴケ目生物細胞内で機能するターミネーターとの間に配置される。
組換え形質発現ベクターが、さらに、導入すべき外来遺伝子を含む場合、該外来遺伝子は、通常、本発明２のＤＮＡ断片と、ゼニゴケ目生物細胞内で機能するターミネーターとの間に配置される。
ゼニゴケ目生物細胞内で機能するプロモーターとしては特に限定されず、ゼニゴケ目生物由来のものであってもよく、他の生物由来のものであってもよい。例えば、CaMV35Sプロモーター、植物由来rbcS遺伝子プロモーター等が挙げられる。また、ゼニゴケ目生物細胞内で機能するプロモーターとして、本発明１のＤＮＡ断片を用いることもできる。ゼニゴケ目生物細胞内で機能するターミネーターとしては、上述したもの等を好適に用いることができる。
組換え形質発現ベクターが本発明３のＤＮＡ断片を含む場合、該組換え形質発現ベクターには、通常、本発明３のＤＮＡ断片、及びゼニゴケ目生物細胞内で機能するプロモーターが含まれる。通常、上流側から、ゼニゴケ目生物細胞内で機能するプロモーター、及び本発明３のＤＮＡ断片がこの順で組換え形質発現ベクター内に含まれる。組換え形質発現ベクターが、さらに、導入すべき外来遺伝子を含む場合、該外来遺伝子は、通常、ゼニゴケ目生物細胞内で機能するプロモーターと、本発明３のＤＮＡ断片との間に配置される。
ゼニゴケ目生物細胞内で機能するプロモーターとして、上述したもの等を好適に用いることができる。中でも、本発明１のＤＮＡ断片を好適に用いることができる。
本発明３のＤＮＡ断片を含む組換え形質発現ベクターは、さらに、本発明２のＤＮＡ断片等のゼニゴケ目生物細胞内で５’ＵＴＲ活性を有する配列を含んでもよい。この場合、上流からプロモーター、ゼニゴケ目生物細胞内で５’ＵＴＲ活性を有する配列、外来遺伝子を含む場合は外来遺伝子、及び本発明３のＤＮＡ断片の順に配置することが好ましい。
本発明３のＤＮＡ断片を含む組換え形質発現ベクターは、さらに、本発明２のＤＮＡ断片等のゼニゴケ目生物細胞内で５’ＵＴＲ活性を有する配列を含んでもよい。この場合、上流からプロモーター、ゼニゴケ目生物細胞内で５’ＵＴＲ活性を有する配列、外来遺伝子を含む場合は外来遺伝子、及び本発明３のＤＮＡ断片の順に配置することが好ましい。
外来遺伝子は、外来の導入したい核酸配列を広く指すものであり、例えば、遺伝子の全長配列（ｃＤＮＡ配列、ゲノム配列）だけでなく、部分配列、調節領域、スペーサー領域、変異を加えた配列なども含まれる。外来遺伝子は、ゼニゴケ目生物由来の遺伝子であってもよく、ゼニゴケ目生物以外の生物由来の遺伝子であってもよい。
外来遺伝子としては、代表的にはタンパク質をコードする遺伝子が挙げられる。例えば、プロスタグランジン類、不飽和脂肪酸、等の有用物質の生産に関与する酵素をコードする遺伝子等が好ましい。
外来遺伝子としては、代表的にはタンパク質をコードする遺伝子が挙げられる。例えば、プロスタグランジン類、不飽和脂肪酸、等の有用物質の生産に関与する酵素をコードする遺伝子等が好ましい。
本発明の組換え形質発現ベクターは、本発明のＤＮＡ断片、所望により含まれる外来遺伝子、ゼニゴケ目生物細胞内で機能するプロモーター、ターミネーター、及び５’ＵＴＲ以外の配列を含んでもよい。例えば、薬剤耐性遺伝子等が組み込まれていてもよい。薬剤耐性遺伝子として、カナマイシン耐性遺伝子、ハイグロマイシン耐性遺伝子等が挙げられる。
（２）ゼニゴケ目生物形質発現体
本発明の組換え形質発現ベクターがゼニゴケ目生物細胞に発現可能に導入されてなる、ゼニゴケ目生物形質発現体も、本発明に包含される。ゼニゴケ目生物細胞は、好ましくは、ゼニゴケ細胞である。
ここで「ゼニゴケ目生物形質発現体」とは、ゼニゴケ目生物の細胞、組織、器官のみならず、植物個体（植物体）を含む意味である。
本発明の組換え形質発現ベクターがゼニゴケ目生物細胞に発現可能に導入されてなる、ゼニゴケ目生物形質発現体も、本発明に包含される。ゼニゴケ目生物細胞は、好ましくは、ゼニゴケ細胞である。
ここで「ゼニゴケ目生物形質発現体」とは、ゼニゴケ目生物の細胞、組織、器官のみならず、植物個体（植物体）を含む意味である。
上記組換え形質発現ベクターをゼニゴケ目生物細胞に導入する方法、すなわち形質転換方法も特に限定されるものではなく、細胞の種類に応じて適宜選択すればよい。例えば、アグロバクテリウム感染法、電気穿孔法、ＰＥＧ−リン酸カルシウム法、パーティクルガン法等の従来公知の方法を好適に用いることができる。このようなゼニゴケ目生物の形質転換体を作製する技術については、例えば、Plant Cell Physiol., 49, p1048 (2008)等に記載されている。
ゼニゴケ目生物細胞の形質転換に用いられる組換え形質発現ベクターは、該ゼニゴケ目生物細胞内で目的とする外来遺伝子を形質発現させることが可能なものであれば特に限定されない。なお、組換え形質発現ベクターが導入されるゼニゴケ目生物細胞には、種々の形態の植物組織、葉状体の切片、カルス、培養細胞などが含まれる。外来遺伝子は、形質発現組換えベクターにより、ゼニゴケ目生物細胞の葉緑体等の核以外の細胞内小器官に導入されてもよい。
（３）ゼニゴケ目生物形質発現体による有用物質の生産
本発明のゼニゴケ形質発現体は、有用物質の生産に好適に用いることができるものである。上記のようにして得られた、組換え形質発現ベクターがゼニゴケ目生物細胞に発現可能に導入されてなるゼニゴケ形質発現体を、培養又は栽培することにより、導入した外来遺伝子の発現産物を有用物質として生産することができる。ここで、外来遺伝子の発現産物が酵素である場合には、その酵素によって触媒される反応の産物、又は該反応に続く一連の生合成反応経路上の中間体及び／又は最終生産物をも有用物質として生産することができる。さらに、目的遺伝子が、タンパク質リン酸化酵素やＧ−タンパク質などの情報伝達機構において、生合成等の反応経路全体の機能調節を司る制御遺伝子（マスター遺伝子などとも呼ばれる）である場合には、該制御遺伝子の情報伝達下流に存在する反応経路上の中間体及び／又は最終生産物をも有用物質として生産することができる。
本発明のゼニゴケ形質発現体は、有用物質の生産に好適に用いることができるものである。上記のようにして得られた、組換え形質発現ベクターがゼニゴケ目生物細胞に発現可能に導入されてなるゼニゴケ形質発現体を、培養又は栽培することにより、導入した外来遺伝子の発現産物を有用物質として生産することができる。ここで、外来遺伝子の発現産物が酵素である場合には、その酵素によって触媒される反応の産物、又は該反応に続く一連の生合成反応経路上の中間体及び／又は最終生産物をも有用物質として生産することができる。さらに、目的遺伝子が、タンパク質リン酸化酵素やＧ−タンパク質などの情報伝達機構において、生合成等の反応経路全体の機能調節を司る制御遺伝子（マスター遺伝子などとも呼ばれる）である場合には、該制御遺伝子の情報伝達下流に存在する反応経路上の中間体及び／又は最終生産物をも有用物質として生産することができる。
例えば、有用物質の生産にかかわる遺伝子として、国際公開第ＷＯ２０１１／０１０４８５号等に記載されているプロスタグランジンの生合成に関与するホスホリパーゼ、リポキシゲナーゼ及びシクロオキシゲナーゼをコードする遺伝子、特開２０１１−１２３号公報等に記載されている不飽和脂肪酸合成系遺伝子等が好ましい。
ゼニゴケ目生物形質発現体がゼニゴケ培養細胞又はゼニゴケ組織である場合、培養は、通常の植物培養培地、例えばＭ５１Ｃ培地（Takenaka et al., Transgenic Research, 9, 179−185（2000））等を用いることにより行うことができる。培養方法は、通常の固体培養法でもよいが、液体培養法を採用することが好ましい。ゼニゴケ目生物形質発現体が植物体である場合は、ガラスハウス等で栽培又は水耕培養することができる。また、例えば、ゼニゴケ目生物の繁殖形態として無性生殖（栄養生殖）によることが好ましい。つまりゼニゴケ目生物については、その形質発現体を、無性生殖（栄養生殖）により増殖又は生育させると、生長速度が早く植物工場システムとしても大量生産が可能であるため好ましい。植物用栽培床及び植物栽培方法については、公知の方法を使用できる。また、例えば、特開２０１０−０８８３１４号公報に記載の方法（縦型多段式栽培棚を用いマット方式による栽培装置）等も使用することができる。
ゼニゴケ目生物形質発現体を培養又は栽培する条件及び時間は、適宜選択すればよい。ゼニゴケ目生物の場合、培養又は栽培温度は、通常約２０〜３０℃、好ましくは約２５〜３０℃である。
培養又は栽培終了後、培養物、植物器官又は植物体より有用物質を採取する。有用物質の採取方法は、各物質の通常の精製手段を用いることができる。培養物、植物器官又は植物体から有用物質を採取するには、通常、磨砕処理等を行って上記有用物質の抽出液を調製し、その後は公知の精製手法により有用物質を精製する。
上記のように有用物質生産に関わる遺伝子をゼニゴケ目生物細胞に導入してなる形質発現体により、高効率で、しかも低コストかつ環境にやさしい生産プロセスでプロスタグランジン等の有用物質を生産することができる。
（４）ゼニゴケ目生物細胞内で外来遺伝子の発現を増強する方法
上記ゼニゴケ目生物形質発現体を増殖又は生育させることにより、ゼニゴケ目生物細胞内で導入した外来遺伝子の発現を高発現させることができる。
本発明は、上記ゼニゴケ目生物形質発現体を培養又は栽培する工程を含む、ゼニゴケ目生物細胞内で外来遺伝子の発現を増強する方法も包含する。
上記ゼニゴケ目生物形質発現体を増殖又は生育させることにより、ゼニゴケ目生物細胞内で導入した外来遺伝子の発現を高発現させることができる。
本発明は、上記ゼニゴケ目生物形質発現体を培養又は栽培する工程を含む、ゼニゴケ目生物細胞内で外来遺伝子の発現を増強する方法も包含する。
ゼニゴケ目生物形質発現体を培養又は栽培する方法は特に限定されず、ゼニゴケ目生物形質発現体を上述したように適宜培養又は栽培すればよい。
上記組換え形質発現ベクターをゼニゴケ目生物細胞に導入する工程を含む、ゼニゴケ目生物細胞内で外来遺伝子の発現を増強する方法も、本発明に包含される。本発明の方法は、さらに、組換え形質発現ベクターが導入されたゼニゴケ目生物細胞（ゼニゴケ目生物形質発現体）を培養又は栽培する工程を含むことが好ましい。
（５）ゼニゴケ形質発現体における導入遺伝子発現検出方法
ゼニゴケ目形質転換体において、導入した外来遺伝子の発現を検出する方法は特に限定されるものではなく、目的に応じて適宜選択すればよい。例えば、外来遺伝子の配列を含むプローブを用いたノザンハイブリダイゼーション法、あるいはまた外来遺伝子の配列の５’及び３’側のプライマーを用いたRT-PCR（Reverse Transcription-PCR）によって検出することができる。
ゼニゴケ目形質転換体において、導入した外来遺伝子の発現を検出する方法は特に限定されるものではなく、目的に応じて適宜選択すればよい。例えば、外来遺伝子の配列を含むプローブを用いたノザンハイブリダイゼーション法、あるいはまた外来遺伝子の配列の５’及び３’側のプライマーを用いたRT-PCR（Reverse Transcription-PCR）によって検出することができる。
（６）遺伝子検出器具
本発明のいずれかのＤＮＡ断片又はその相補配列をプローブ又はプライマーとして用いる遺伝子検出器具も、本発明に包含される。
このような遺伝子検出器具は、種々の条件下において、本発明のＤＮＡ断片の発現パタ−ンの検出及び／又は測定などに利用することができる。
本発明のいずれかのＤＮＡ断片又はその相補配列をプローブ又はプライマーとして用いる遺伝子検出器具も、本発明に包含される。
このような遺伝子検出器具は、種々の条件下において、本発明のＤＮＡ断片の発現パタ−ンの検出及び／又は測定などに利用することができる。
本発明の遺伝子検出器具としては、例えば、本発明の遺伝子と特異的にハイブリダイズする上記プローブを基盤（担体）上に固定化したＤＮＡチップが挙げられる。ここで「ＤＮＡチップ」とは、主として、合成したオリゴヌクレオチドをプローブに用いる合成型ＤＮＡチップを意味するが、ＰＣＲ産物などのｃＤＮＡをプローブに用いる貼り付け型ＤＮＡマイクロアレイをも包含するものとする。
プローブとして用いる配列は、ｃＤＮＡ配列の中から特徴的な配列を特定する従来公知の方法によって決定することができる。具体的には、例えば、ＳＡＧＥ：Ｓｅｒｉａｌ Ａｎａｌｙｓｉｓ ｏｆ Ｇｅｎｅ Ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ法（Science 276：1268,1997；Cell 88：243,1997；Science 270：484,1995；Nature 389：300,1997；米国特許第５，６９５，９３７号）等を挙げることができる。
なお、ＤＮＡチップの製造には、公知の方法を採用すればよい。例えば、オリゴヌクレオチドとして合成オリゴヌクレオチドを使用する場合には、フォトリソグラフィ−技術と固相法ＤＮＡ合成技術との組み合わせにより、基盤上で該オリゴヌクレオチドを合成すればよい。一方、オリゴヌクレオチドとしてｃＤＮＡを用いる場合には、アレイ機を用いて基盤上に貼り付ければよい。
また、一般的なＤＮＡチップと同様、パーフェクトマッチプローブ（オリゴヌクレオチド）と、該パーフェクトマッチプローブにおいて一塩基置換されたミスマッチプローブとを配置して遺伝子の検出精度をより向上させてもよい。さらに、異なる遺伝子を並行して検出するために、複数種のオリゴヌクレオチドを同一の基盤上に固定してＤＮＡチップを構成してもよい。
本発明に係る遺伝子検出器具は、上記例示したＤＮＡチップに限定されるものではなく、本発明に係る遺伝子の少なくとも一部の塩基配列又はその相補配列をプローブ又はプライマーとして用いたものであればよい。
以下、実施例を示し、本発明をさらに詳しく説明する。ただし、本発明はこれら実施例にその技術的範囲が限定されるものではなく、細部については様々な態様が可能であることは言うまでもない。さらに本発明は技術的実施形態に限定されるものではなく、上記に示した種々の変更が可能であり、それぞれ開示された技術的手段を組み合わせて得られる実施形態についても本発明の技術的範囲に含まれる。
本実施例において実験手法は、特に断らない限り、Molecular Cloning 3rd Ed.（J. Sambrook et al., Cold Spring Harbor Laboratory (2001)）に記載されている方法に従った。得られたゲノムクローンの塩基配列は、3130xlジェネティックアナライザ（Applied Biosystems社）により決定した。
＜実施例１＞ゼニゴケ培養細胞を用いた一過性発現解析
KpnI及びHindIIIサイトを付加したゼニゴケ由来EF1αプロモーター断片の作製方法
シロイヌナズナEF1α遺伝子のアミノ酸配列（Accession No. X16431）と相同性を示すクローンを、ゼニゴケの部分ゲノムデータより探索した。その結果得られたゲノムクローンの塩基配列から、ゼニゴケEF1α遺伝子のプロモーター配列を同定した。ゼニゴケEF1α遺伝子のプロモーター配列を、配列番号1に示す。プロモーター配列の５’及び３’側の配列にそれぞれKpnI、HindIIIサイトを付加したプライマー（ggggtaccCAAATGAGTCACACACATT（配列番号４）及びccaagcttCAACCTTTCTGCAGGCACA（配列番号５））を用いてPCRを行い（95℃ 30秒、55℃ 30秒、72℃ 2分を25サイクル）、KpnI及びHindIIIサイトを付加したゼニゴケ由来EF1αプロモーター断片を増幅した。
KpnI及びHindIIIサイトを付加したゼニゴケ由来EF1αプロモーター断片の作製方法
シロイヌナズナEF1α遺伝子のアミノ酸配列（Accession No. X16431）と相同性を示すクローンを、ゼニゴケの部分ゲノムデータより探索した。その結果得られたゲノムクローンの塩基配列から、ゼニゴケEF1α遺伝子のプロモーター配列を同定した。ゼニゴケEF1α遺伝子のプロモーター配列を、配列番号1に示す。プロモーター配列の５’及び３’側の配列にそれぞれKpnI、HindIIIサイトを付加したプライマー（ggggtaccCAAATGAGTCACACACATT（配列番号４）及びccaagcttCAACCTTTCTGCAGGCACA（配列番号５））を用いてPCRを行い（95℃ 30秒、55℃ 30秒、72℃ 2分を25サイクル）、KpnI及びHindIIIサイトを付加したゼニゴケ由来EF1αプロモーター断片を増幅した。
HindIII及びNcoIサイトを付加したゼニゴケ由来UDP遺伝子の5’-UTR断片の作製方法
タバコADH遺伝子のアミノ酸配列（Accession No. 2121462A）と相同性を示すクローンを、ゼニゴケのESTライブラリーより探索した。その結果得られたESTクローンの塩基配列から、ゼニゴケUDP遺伝子（ADH様UDP-グルコース脱水素酵素遺伝子と相同性のある遺伝子）の5’-UTR配列を同定した。このゼニゴケUDP遺伝子の5’-UTR配列を、配列番号２に示す。この5’-UTR配列の５’及び３’側の配列にそれぞれHindIII、NcoIサイトを付加したプライマー（ccaagcttGGGCGACCGTCAGGGTTTCTC（配列番号６）及びaaccatggTTCGCAGAATGGCAACA（配列番号７））を用いてPCRを行い（95℃ 30秒、55℃ 30秒、72℃ 30秒を25サイクル）、HindIII及びNcoIサイトを付加したゼニゴケ由来UDP遺伝子の5’-UTR断片を増幅した。
タバコADH遺伝子のアミノ酸配列（Accession No. 2121462A）と相同性を示すクローンを、ゼニゴケのESTライブラリーより探索した。その結果得られたESTクローンの塩基配列から、ゼニゴケUDP遺伝子（ADH様UDP-グルコース脱水素酵素遺伝子と相同性のある遺伝子）の5’-UTR配列を同定した。このゼニゴケUDP遺伝子の5’-UTR配列を、配列番号２に示す。この5’-UTR配列の５’及び３’側の配列にそれぞれHindIII、NcoIサイトを付加したプライマー（ccaagcttGGGCGACCGTCAGGGTTTCTC（配列番号６）及びaaccatggTTCGCAGAATGGCAACA（配列番号７））を用いてPCRを行い（95℃ 30秒、55℃ 30秒、72℃ 30秒を25サイクル）、HindIII及びNcoIサイトを付加したゼニゴケ由来UDP遺伝子の5’-UTR断片を増幅した。
XbaI及びBamHIサイトを付加したゼニゴケ由来FT1遺伝子のターミネーター断片の作製方法
シロイヌナズナFT1遺伝子のアミノ酸配列（Accession No. AB027504）と相同性を示すクローンを、ゼニゴケの部分ゲノムデータより探索した。その結果得られたゲノムクローンの塩基配列から、ゼニゴケFT1遺伝子のターミネーター配列を同定した。ゼニゴケFT1遺伝子のターミネーター配列を、配列番号３に示す。このターミネーター配列の５’及び３’側の配列にそれぞれXbaI、BamHIサイトを付加したプライマー（cctctagaTAATACTTCTGACTTCC（配列番号８）及びccggatccATGGTTCATATCATGCCGAT（配列番号９））を用いてPCRを行い（95℃ 30秒、55℃ 30秒、72℃ １分を25サイクル）、XbaI及びBamHIサイトを付加したゼニゴケ由来FT1遺伝子のターミネーター断片を増幅した。
シロイヌナズナFT1遺伝子のアミノ酸配列（Accession No. AB027504）と相同性を示すクローンを、ゼニゴケの部分ゲノムデータより探索した。その結果得られたゲノムクローンの塩基配列から、ゼニゴケFT1遺伝子のターミネーター配列を同定した。ゼニゴケFT1遺伝子のターミネーター配列を、配列番号３に示す。このターミネーター配列の５’及び３’側の配列にそれぞれXbaI、BamHIサイトを付加したプライマー（cctctagaTAATACTTCTGACTTCC（配列番号８）及びccggatccATGGTTCATATCATGCCGAT（配列番号９））を用いてPCRを行い（95℃ 30秒、55℃ 30秒、72℃ １分を25サイクル）、XbaI及びBamHIサイトを付加したゼニゴケ由来FT1遺伝子のターミネーター断片を増幅した。
図１の（Ａ）〜（Ｃ）に、ホタルルシフェラーゼ遺伝子（Synthetic Firefly luciferase: Fluc遺伝子）をゼニゴケ目生物細胞で発現させるための、基礎ベクター ｐｈＲＧ−Ｂからの組換え形質発現ベクターの作製方法の概要を示す。図１の（Ａ）〜（Ｃ）及び図２の（Ａ）〜（Ｃ）中、「ｐ３５Ｓ」は、ＣａＭＶ３５Ｓプロモーターであり、「ｔＮＯＳ」は、ＮＯＳターミネーターであり、「Ｆｌｕｃ」はホタルルシフェラーゼ（Ｆｌｕｃ）遺伝子である。「ｐＭｐＥＦ１α」は、ゼニゴケ由来ＥＦ１αプロモーター（配列番号１）である。「５’ＵＴＲ」はゼニゴケ由来ＵＤＰ遺伝子（ＡＤＨ様 ＵＤＰ−グルコース脱水素酵素遺伝子と相同性のある遺伝子）の５’ＵＴＲ（配列番号２）である。「ｔＭｐＦＴ１」は、３’ＵＴＲを含むゼニゴケ由来ＦＴ１ターミネーター（配列番号３）である。
図１の（Ａ）に示すように、ホタルルシフェラーゼ遺伝子（Synthetic Firefly luciferase: Fluc遺伝子）を持つ基本ベクターphRG-B（プロメガ社製）にCaMV35Sプロモーター及びNOSターミネーターを導入したプラスミドCaMV35S-Fluc-tNOS-phRG-Bをもとに作製した。まずこのプラスミドCaMV35S-Fluc-tNOS-phRG-BをKpnI及びHindIIIで消化し、これに、上記で作製したKpnI及びHindIIIサイトを付加したゼニゴケ由来EF1αプロモーター断片（約1.7 kb）を導入し、プラスミド（形質発現ベクター）pMpEF1α-Fluc-tNOSを作製した（図１の（Ａ））。
図１の（Ｂ）に示すように、プラスミドCaMV35S-Fluc-tNOS-phRG-BをHindIII及びNcoIで消化し、上記で作製したHindIII及びNcoIサイトを付加したゼニゴケ由来UDP遺伝子の5’UTR断片(331 bp)を導入し、プラスミド（形質発現ベクター）CaMV35S-5’UTR-Fluc-tNOSを作製した（図１の（Ｂ））。
図１の（Ｃ）に示すように、プラスミドCaMV35S-Fluc-tNOS-phRG-BをXbaI及びBamHIで消化し、上記で作製したXbaI及びBamHIサイトを付加した3’UTRを含むゼニゴケ由来FT1ターミネーター断片(300bp)を導入し、プラスミド（形質発現ベクター）CaMV35S-Fluc-tMpFT1を作製した（図１の（Ｃ））。
図２の（Ａ）〜（Ｃ）に模式図に示す上記の形質発現ベクターのDNAをPlasmid Midi Kit (QIAGEN)を用いて調製した。図２の（Ａ）は、プラスミドpMpEF1α-Fluc-tNOSの構造を示す模式図である。図２の（Ｂ）は、プラスミドCaMV35S-5’UTR-Fluc-tNOSの構造を示す模式図である。図２の（Ｃ）は、プラスミドCaMV35S-Fluc-tMpFT1の構造を示す模式図である。
コントロールDNAとして、プラスミドCaMV35S-Fluc-tNOS-phRG-BのFlucをウミシイタケルシフェラーゼ(Rluc; Renilla luciferase)に置換したプラスミドCaMV35S-Rluc-tNOS-phRG-Bを使用した。
図２の（Ａ）〜（Ｃ）に模式図に示す各ベクターDNAと形質転換効率を評価するためのウミシイタケルシフェラーゼ(Rluc)遺伝子を持つコントロールDNAを１．０μｍの金粒子にコーティングし、マクロキャリアー（BioRad社）の上に広げた。４日間22℃で、M51C培地中で液体培養したゼニゴケ培養細胞から吸引濾過によって培地を取り除き、培養細胞をM51C寒天培地上に広げた。パーティクルガンの装置（BIOLISTIC PDS-1000/He delivering System, BioRad社）にマクロキャリーをセットし、寒天培地に広げた培養細胞を下から１段目にセットした。28mmHg下、1,100psiの圧力で、DNAをコーティングした金粒子を培養細胞に打ち込んだ。金粒子を打ち込んだ培養細胞を、２２℃の暗所下に２日間置いた。
DNAを打ち込んだ培養細胞のルシフェラーゼ活性は、Dual-Luciferase Reporter Assay System (Promega社)及びルミノメーター (Lumat LB 9501, Berthold Technologies社)を用いて測定した。培養細胞にLysis buffer 200μlを加え、細胞をすりつぶし、遠心して、上清をとった。この上清にFluc活性測定試薬を加えて、Fluc活性を測定し、次にRluc活性測定試薬を加えて、Rluc活性を測定した（ｎ＝3）。結果は、Rluc活性を１とした場合のFluc活性の相対的な活性の大きさ（Fluc活性／Rluc活性）で評価した。結果を、図３及び図４に示す。図３及び図４に示される結果は、平均値である。
上記のような、レポーターとしてルシフェラーゼを用いた一過的発現解析の結果、ゼニゴケEF1αプロモーター（配列番号１）をプロモーターとして用いると、CaMV35Sプロモーターと比較して約70倍高いFluc活性が得られた（図３）。つまりゼニゴケEF1αプロモーター（配列番号１）をプロモーターとして用いると、CaMV35Sプロモーターを用いた場合と比較して、約７０倍外来遺伝子を高発現させることができた。また、CaMV35SプロモーターにゼニゴケのUDP遺伝子の5’UTR配列（配列番号２）を付加することにより、CaMV35Sプロモーターのみの場合と比較して、約15倍のFluc活性上昇が確認された（図３）。さらに、ゼニゴケFT1ターミネーター（配列番号３）をターミネーターとして用いると、NOSターミネーターを用いた場合と比較して約3倍高いFluc活性が得られた（図４）。このため、ゼニゴケFT1ターミネーター（配列番号３）をターミネーターとして用いると、外来遺伝子の発現を安定化させることができ、該遺伝子を高発現させることができた。
Claims (9)
- 下記の（ａ）〜（ｄ）のいずれかのＤＮＡを含むＤＮＡ断片。
（ａ）配列番号２に示される塩基配列からなるＤＮＡ
（ｂ）配列番号２に示される塩基配列において、１〜複数個の塩基が欠失、置換、又は付加された配列からなり、かつゼニゴケ目生物細胞において５’−ＵＴＲ活性を有するＤＮＡ
（ｃ）配列番号２に示される塩基配列の一部からなり、かつゼニゴケ目生物細胞において５’−ＵＴＲ活性を有するＤＮＡ
（ｄ）配列番号２に示される塩基配列と相補的な塩基配列からなるＤＮＡ又はその一部とストリンジェントな条件下でハイブリダイズし、かつゼニゴケ目生物細胞において５’−ＵＴＲ活性を有するＤＮＡ - 下記の（ａ）〜（ｄ）のいずれかのＤＮＡを含むＤＮＡ断片。
（ａ）配列番号１に示される塩基配列からなるＤＮＡ
（ｂ）配列番号１に示される塩基配列において、１〜複数個の塩基が欠失、置換、又は付加された配列からなり、かつゼニゴケ目生物細胞においてプロモーター活性を有するＤＮＡ
（ｃ）配列番号１に示される塩基配列の一部からなり、かつゼニゴケ目生物細胞においてプロモーター活性を有するＤＮＡ
（ｄ）配列番号１に示される塩基配列と相補的な塩基配列からなるＤＮＡ又はその一部とストリンジェントな条件下でハイブリダイズし、かつゼニゴケ目生物細胞においてプロモーター活性を有するＤＮＡ - 下記の（ａ）〜（ｄ）のいずれかのＤＮＡを含むＤＮＡ断片。
（ａ）配列番号３に示される塩基配列からなるＤＮＡ
（ｂ）配列番号３に示される塩基配列において、１〜複数個の塩基が欠失、置換、又は付加された配列からなり、かつゼニゴケ目生物細胞においてターミネーター活性を有するＤＮＡ
（ｃ）配列番号３に示される塩基配列の一部からなり、かつゼニゴケ目生物細胞においてターミネーター活性を有するＤＮＡ
（ｄ）配列番号３に示される塩基配列と相補的な塩基配列からなるＤＮＡ又はその一部とストリンジェントな条件下でハイブリダイズし、かつゼニゴケ目生物細胞においてターミネーター活性を有するＤＮＡ - 請求項１〜３の何れか１項に記載のＤＮＡ断片を含む組換え形質発現ベクター。
- さらに、導入すべき外来遺伝子を含む請求項４に記載の組換え形質発現ベクター。
- 請求項５に記載の組換え形質発現ベクターがゼニゴケ目生物細胞に発現可能に導入されてなる、ゼニゴケ目生物形質発現体。
- 請求項６に記載の形質発現体を培養又は栽培する工程を含む、ゼニゴケ目生物細胞内で外来遺伝子の発現を増強する方法。
- 請求項５に記載の組換え形質発現ベクターをゼニゴケ目生物細胞に導入する工程を含む、ゼニゴケ目生物細胞内で外来遺伝子の発現を増強する方法。
- 請求項１〜３の何れか１項に記載のＤＮＡ断片又はその相補配列をプローブ又はプライマーとして用いる遺伝子検出器具。
Priority Applications (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| JP2011162620A JP2013022000A (ja) | 2011-07-25 | 2011-07-25 | ゼニゴケ目生物細胞において外来遺伝子を安定に高発現させるｄｎａ断片及びその利用 |
Applications Claiming Priority (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| JP2011162620A JP2013022000A (ja) | 2011-07-25 | 2011-07-25 | ゼニゴケ目生物細胞において外来遺伝子を安定に高発現させるｄｎａ断片及びその利用 |
Publications (1)
| Publication Number | Publication Date |
|---|---|
| JP2013022000A true JP2013022000A (ja) | 2013-02-04 |
Family
ID=47781044
Family Applications (1)
| Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
|---|---|---|---|
| JP2011162620A Withdrawn JP2013022000A (ja) | 2011-07-25 | 2011-07-25 | ゼニゴケ目生物細胞において外来遺伝子を安定に高発現させるｄｎａ断片及びその利用 |
Country Status (1)
| Country | Link |
|---|---|
| JP (1) | JP2013022000A (ja) |
Cited By (1)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| JP2015170278A (ja) * | 2014-03-10 | 2015-09-28 | 井上 文彦 | 情報処理装置、情報処理システム及び情報処理方法 |
-
2011
- 2011-07-25 JP JP2011162620A patent/JP2013022000A/ja not_active Withdrawn
Cited By (1)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| JP2015170278A (ja) * | 2014-03-10 | 2015-09-28 | 井上 文彦 | 情報処理装置、情報処理システム及び情報処理方法 |
Similar Documents
| Publication | Publication Date | Title |
|---|---|---|
| WO2018113702A1 (en) | Plant grain trait-related protein, gene, promoter and snps and haplotypes | |
| CN103443280B (zh) | 棉花中的种子特异性启动子 | |
| BRPI0712201A2 (pt) | composições para silenciar a expressão de gibberellin 2-oxidase e usos das mesmas | |
| CN115612695B (zh) | GhGPX5和GhGPX13基因在提高植物盐胁迫耐受性中的应用 | |
| CN113462689B (zh) | 大豆基因启动子pEIF1和pEIF1-I在大豆、拟南芥及烟草中的应用 | |
| CN111087457A (zh) | 提高氮素利用率和作物产量的蛋白ngr5及其编码基因与应用 | |
| CN112011547B (zh) | 一种控制油菜叶形的主效基因及其应用 | |
| CN113462690A (zh) | 大豆基因启动子pRPS28和pRPS28-I在大豆、拟南芥及烟草中的应用 | |
| CN110204600B (zh) | BnSPL14基因、蛋白及其在控制甘蓝型油菜株型中的应用 | |
| WO1996030509A1 (fr) | Promoteur vegetal et expression genetique l'utilisant | |
| CN113924367A (zh) | 提高水稻籽粒产量的方法 | |
| CN114958867B (zh) | 玉米穗粒重和产量调控基因kwe2、其编码蛋白、功能标记、表达载体及应用 | |
| JP2018536400A (ja) | ドリメノールシンターゼｉｉｉ | |
| CN111979233A (zh) | 一种增大水稻粒型的方法及其应用 | |
| CN116103290A (zh) | 番茄根特异性表达启动子pSlROOT2及其应用 | |
| CN113136398B (zh) | GsHA24蛋白及其相关生物材料在调控植物耐逆性中的应用 | |
| CN112646820B (zh) | 改变玉米开花期的基因及方法 | |
| JP2013022000A (ja) | ゼニゴケ目生物細胞において外来遺伝子を安定に高発現させるｄｎａ断片及びその利用 | |
| WO2011010485A1 (ja) | エイコサノイド生産方法、並びにゼニゴケ由来のエイコサノイド生合成系遺伝子及びその利用 | |
| CN110129322B (zh) | Bna-miR393在调控甘蓝型油菜生殖器官发育过程中的应用 | |
| CN107653246B (zh) | 玉米pilncr1及其在调控和检测玉米耐低磷胁迫中的应用 | |
| CN113416747B (zh) | 一种创建温度敏感型雄性不育植物的方法 | |
| US10100321B2 (en) | Methods for increasing cotton fiber length | |
| JP3782013B2 (ja) | 改良されたプロモーターおよびその使用 | |
| CN113462661B (zh) | 从玉米中分离的siz1蛋白及其编码基因和在品种改良中的应用 |
Legal Events
| Date | Code | Title | Description |
|---|---|---|---|
| A300 | Withdrawal of application because of no request for examination |
Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: A300 Effective date: 20141007 |