KR19980703306A - 식물 프로모터 및 이 프로모터를 사용한 유전자 발현 방법 - Google Patents

식물 프로모터 및 이 프로모터를 사용한 유전자 발현 방법 Download PDF

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KR19980703306A
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Abstract

본 발명은 식물 세포벽 자일로글루칸의 재구성이 필요한 부위 및 단계에서 특별히 발현을 유도할 수 있는 식물 프로모터, 즉 엔도-자일로글루칸 트랜스퍼라제를 코드화하는 유전자 또는 그와 동등한 기능을 갖는 물질을 코드화하는 유전자 유래의 식물 프로모터에 관한 것이며, 또한 본 발명은 식물 프로모터를 사용하여 식물의 기능을 변형시키는 방법 및 식물 프로모터를 클로닝하는 방법에 관한 것이다.

Description

식물 프로모터 및 이 프로모터를 사용한 유전자 발현 방법
본 발명은 유전자 재조합 기술 및 기능적 변형 등과 같은 식물 공학을 이용하여 신규한 식물 품종을 개발하는데 유용할 뿐만 아니라 유용한 대사물질을 생산하는 식물 배양 세포의 기능적 변형과 같은 식물 세포 공학에 유용한 식물 프로모터, 유용한 유전자가 그 유용한 유전자를 발현시킬 수 있는 상태로 프로모터와 연결되어 있는 DNA 단편 및 그 DNA 단편을 함유하는 벡터에 관한 것이다. 또한, 본 발명은 그 DNA 단편이나 그 DNA 단편을 포함한 벡터로 형질 전환된 식물 또는 식물 세포, 또는 식물 세포로부터 재생된 트랜스제닉 식물에 관한 것이다. 더 나아가, 본 발명은 식물 프로모터를 클로닝하기 위한 방법에 관한 것이다.
[선행 기술]
유전 공학 기술을 이용하는 식물의 개량은 최근에 실직적으로 이용되어 왔다[Science, 244, 1293-1299(1989)]. 특히, 토양 박테리아인 아그로박테리움 투메페션스(Agrobacterium trumefaciens) 및 아그로박테리움 리조제네스(Agrobacterium rhizogenes)내에 함유된 Ti 플라스미드 및 Ri 플라스미드를 이용하는 형질 전환 시스템에서 현저한 진보가 이루어졌으며, 이에 따라 그 시스템은 지금까지 형질 전환되어온 담배, 아라비돕시스(Arabidopsis), 및 페튜니아(petunia) 뿐만 아니라, 아즈키 콩(azuki bean)과 같은 쌍자엽성 식물[니혼 소쿠부투 소스히키바이유 가카이 (NIHON SHOKUBUTU SOSHIKIBAIYOU GAKKAI; 식물 조직 배양을 위한 일본국 연합회) 회의에 제출된 초록, p. 124 (1990) 참조] 및 벼와 같은 단자엽성 식물[The Plant Journal, 6, 271-282 (1994)] 에도 적용할 수 있다. 더구나, 벼를 대표적인 예로 하는 단자엽성 식물의 경우에, 원형질을 제조한 다음 일렉트로포레이션에 의해 유전자를 전달하는 방법이 실제 사용되어 왔다[문헌 Nature, 338, 274-276 (1989) 참조]. 또한, 파티클 건(particle gun) 방법을 사용하여 유전자를 식물내로 직접 전달한 많은 예가 보고되어 있다.
[The Plant Journal, 2, 275-281 (1992)].
유용한 물질 또는 효소의 조직-특이성 발현을 유도하는 프로모터로서 지금까지는 종자의 각 조직[소쿠부투 사이보우 코우가쿠 (SHOKUBUTU SAIBOU KOUGAKU] (Plant Cell Technology), 3, 568-576 (1991)], 잎 및 꽃의 각 조직[문헌 Science, 250, 931-936 (1990) 참조], 괴경 [소쿠부투 사이보우 코우가쿠 (Plant Cell Technology), 3, 577-587 (1991)], 괴경의 뿌리 및 뿌리 결절 [문헌 Science, 250, 948-954 (1990)]에서 특이적으로 발현되는 유전자가 분리되었으며, 이들 프로모터에 의한 발현은 트랜스제닉 식물에서 분석되었다.
그러나, 종래 이러한 벡터 시스템에 이용된 대부분이 프로모터는 아그로박테리움 투메페션스에 포함된 Ti 플라스미드에서 유래된 프로모터 및 꽃양배추 모자익 바이러스(cauliflower mosaic virus; CaMV) 유전자 유래의 프로모터이다. 이러한 프로모터는 성장 단계 및 트랜스제닉 식물 조직에 관계없이 구조적으로 (constitutively) 발현되며 조절되지 않는다. 또한, 발현 정도도 낮다. 더구나, 조직-특이성 발현을 유도하는 발현 조절 부위를 포함한 프로모터 가운데, 식물 세포벽 자일로글루칸의 재구성에 필요한 부위 및 단계에서 특정하게 발현을 유도하는 프로모터는 없다.
또한, 식물 세포 공학 분야에서는, 식물 조직 배양에 사용되는 식물 세포에서 유용한 이차 대사물질을 생산하려는 경우에서 조차, 그 대사물질의 생합성 시스템에서 효소 유전자의 발현이 세포 성장에 필수적인 식물 호르몬의 존재 때문에 억제되며, 그것에 의해 대사물질의 생산이 억제되 경우가 많이 보고 되었다.
[Physiologia Plantarum, 80, 379-387 (1990)]. 따라서, 세포 성장에 필요한 식물 호르몬의 존재하에서 세포에 의한 이차 대사물질의 생합성을 최적화하는 것은 대단히 어렵다. 따라서, 세포 성장 및 이차 대사물질의 생합성이 분리된 조건하에 수행되는 관점에서 두-단계 배양 방법을 적용하는 것이 필요하다[일본국 노우게이카가쿠 카이시 (NOUGEIKAGAKU KAISHI) (Journal of Agriucultural Chemistry Society of Japan), 60, 849-854 (1986) 참조].
그러한 억제 현상은 발현을 억제하기 위한 식물 호르몬 등으로부터의 시그날에 의하여 생합성 시스템 내의 효소 유전자의 프로모터가 조절되기 때문이라고 생각될 수 잇다.
따라서, 이차 대사물질의 생합성은 세포 성장 시기 동안 유용한 물질이나 효소의 발현을 강력히 유도하는 프로모터로 상기 프로모터를 대체시킨 키메라 유전자를 세포로 전달함으로써 세포 성장 조건하에 촉진될 수 있다고 생각된다. 그럼에도 불구하고, 특별히 세포 성장 기간 동안에 유용한 물질 또는 효소의 발현을 강력히 유도하는 어떤한 흔한 프로모터도 본 기술 분야에서 공지되어 있지 않다. 따라서, 특별히 세포 성장 기간 동안에 유용한 물질 또는 효소의 발현을 강력히 유도하는 그러한 프로모터가 사용될 수 있다. 세포가 성장함에 따라 이차 대사물질의 생합성이 효과적으로 이루어지고, 유용한 이차 대사물질의 생산성이 크게 향상될 수 있을 것이다.
따라서, 조직-특이성 발현을 유도할 수 있거나 식물 호르몬 등의 존재하에 발현을 조절할 수 있는 프로모터가 식물 공학 및 식물 세포 공학분야에서 요망되어 왔다.
[발명의 목적]
본 발명의 목적은 특별히 식물 세포벽 자일로글루칸의 재구성에 필요한 부위 및 단계에서 조직-특이성 발현을 유도할 수 있을 뿐만 아니라, 식물 호르몬 등의 존재하에 발현을 조절할 수 있는 식물 프로모터, 그 프로모터를 함유하는 DNA 단편, 그 DNA 단편을 함유하는 벡터, 그 DNA 단편이나 벡터로 형질 전환된 식물 또는 식물 세포, 또는 식물 세포로부터 재생된 트랜스제닉 식물, 및 그 식물 프로모터를 클로닝하는 방법을 제공하는 것이다.
[발명의 요약]
본 발명자들은 식물에서 기원한 엔도-자일로글루칸 트랜스퍼라제(EXT) 유전자 및 그의 패밀리 유전자의 발현이 조직-특이성을 지니고 있음에 유의하였으며, 발현을 조절할 수 있는 프로모터 및 그의 벡터가 유용할 것이라고 기대하였다.
본 발명자들은 더 나아가 그러한 프로모터가 식물 세포 및 식물의 개량에 유용하리라고 기대하였다. 따라서, 본 발명자들은 식물 EXT 유전자의 상류에 위치하리라 예상되는 프로모터를 포함한 영역의 클로닝을 시도하였다. 그러나, 위유전자(pseudogenes)를 포함하는 많은 패밀리 유전자의 존재, 및 EXT 유전자 및 그의 패밀리 유전자의 상류에 위치한 영역을 포함한 단편을 가진 파아지를 제조하고 이를 숙주에 감염시켜 얻은 플라크의 플라크-형성 능력의 감소 때문에 공지의 플라크 혼성화(plaque hybridization) 방법에 의한 EXT 유전자의 프로모터를 클로닝하기는 어려웠다.
그래서, 본 발명자들은 집중적으로 연구하였다. 그 결과, 본 발명가들은 EXT 유전자의 프로모터의 클로닝에 성공하였으며 프로모터 부위를 분석하여 그것의 뉴클레오타이드 서열을 결정하였다. 이 프로모터 부위를 절단하여 대장균에서 기원한 베타-글루쿠로니다제 (β-glucuronidase; GUS)에 연결하였으며 생성된 키메라 유전자를 식물 세포에 전달하였다.
그 유전자가 전달된 세포에서 GUS 유전자가 강하게 발현됨을 확인하였다. 같은 방법으로 EXT 유전자의 패밀리 유전자의 프로모터 부위의 뉴클레오타이드 서열을 결정하였으며 대장균에서 기원한 GUS 유전자에 연결하여 만든 키메라 유전자를 식물 세포에 전달하였을때, GUS 유전자의 강한 발현을 또한 확인하였다.
또한, 프로모터를 포함한 EXT 유전자가 특별히 식물 세포벽 자일로글루칸의 재구성에 필요한 부위 및 단계에서 조직-특이성 방식으로 발현되며 배양 세포의 대수기 또는 정지기 동안에 발현되는 프로모터를 포함한 EXT 유전자 및 그의 패밀리 유전자가 각각 존재함을 노던 혼성화(northern hybridization)에 의해 확인하였다. 그리하여, 본 발명은 완성되었다.
즉, 간단히, 본 발명의 첫번째 측면은, 식물 세포벽 자일로글루칸의 재구성을 수행하는 기능을 가진 효소들 코드화하는 유전자의 발현을 조절할 수 있으며 특히 식물 세포벽 자일로글루칸의 재구성에 필요한 부위 또는 식물 세포벽 자일로글로칸의 재구성에 필요한 단계에서 프로모터 활성을 가지는 것을 특징으로하는, 조직-특이성 발현을 유도하는 식물 프로모터에 관한 것이다.
본 발명의 두번째 측면은 서열 목록 SEQ ID No. 1,2,3,4,5,6,7 및 8에서 선택된 어떠한 뉴클레오타이드 서열중에 포함되어 있음을 특징으로 하는, 본 발명의 첫번째 측면의 식물 프로모터에 관한 것이다.
본 발명의 세번째 측면은 두번째 측면의 뉴클레오타이드 서열과 혼성화 할 수 있고, 식물 또는 식물 세포 또는 식물 세포로부터 재생된 트랜스제닉 식물에서 프로모터 활성을 가지는 것을 특징으로 하는, 본 발명의 첫번째 측면의 식물 프로모터에 관한 것이다.
본 발명의 네번째 측면은 유용한 유전자를 발현시킬 수 있는 상태로 식물 프로모터에 연결하는 것을 특징으로 하는, 첫번째, 두번째 또는 세번째 측면의 식물 프로모터를 포함한 DNA 단편에 관한 것이다.
본 발명의 다섯번째 측면은 첫번째, 두번째 또는 세번째 측면의 식물 프로모터 또는 네번째 측면의 DNA 단편을 포함하는 것을 특징으로 하는 벡터에 관한 것이다.
본 발명의 여섯번째 측면은 네번째 측면의 DNA 단편 또는 다섯번째 측면의 벡터로 형질 전환된 식물 또는 식물 세포, 또는 식물 세포로부터 재생된 트랜스제닉 식물에 관한 것이다.
본 발명의 일곱번째 측면은 여섯번째 측면의 형질 전환된 식물, 식물 세포 및 식물 세포로부터 재생된 트랜스제닉 식물 중 적어도 하나가 사용됨을 특징으로 하여 단백질을 생산하는 방법에 관한 것이다.
본 발명의 여덞번째 측면은 네번째 측면의 DNA 단편 또는 다섯번째 측면의 벡터가 사용됨을 특징으로 하여 식물 형태를 조절하는 방법에 관한 것이다.
본 발명의 아홉번째 측면은 식물 세포벽 자일로글루칸의 재구성을 수행하는 기능을 가진 효소를 코드화하는 유전자, 특히 엔도-자일로글로칸 트랜스퍼라제 또는 그의 기능적 등가물을 코드화하는 유전자를 사용함을 특징으로 하는 식물프로모터를 클로닝하는 방법에 관한 것이다.
제1도는 pVXP101내로 삽입된 단편의 제한 지도를 나타낸다.
제2도는 pVXP-H3내로 삽입된 단편의 제한 지도를 나타낸다.
제3도는 실시예 10에서 배양 세포의 노던 혼성화의 이동 패턴을 나타내는 사진이다.
제4도는 실시예 10에서 배양 세포의 성장을 설명하는 그래프이다.
제5도는 실시예 11에서 일과성 에세이 결과를 설명하는 그래프이다.
제6도는 pBVEG101의 작제 과정을 나타낸 것이다.
제7도는 pBVEG121의 작제 과정을 나타낸 것이다.
제8도는 pBI-H-101의 작제 과정을 나타낸 것이다,
제9도는 pBI-H-121의 작제 과정을 나타낸 것이다,
제10도는 실시예 12에서 트랜스제닉 Arabidopsis 식물을 GUS-염색한 결과를 설명하는 사진이다.
제11도는 실시예 13에서 PCR에 의해 증폭된 약 6.0kbp DNA 단편의 제한 지도를 나타낸다.
제12도는 실시예 14에서 PCR에 의해 증폭된 약 4.5kbp DNA 단편의 제한 지도를 나타낸다.
제13도는 pXRG302에 삽입된 단편의 제한 지도를 나타낸다.
제14도는 pLXG101에 삽입된 단편의 제한 지도를 나타낸다.
제15도는 pLXG102에 삽입된 단편의 제한 지도를 나타낸다.
제16도는 pKOM-1에 삽입된 단편의 제한 지도를 나타낸다.
제17도는 pKEP-1의 제한 지도를 나타낸다.
제18도는 실시예 19에서 식물의 노던 혼성화의 전기영동 이동 패턴을 나타낸 것이다.
제19도는 실시예 19에서 식물의 PT-PCR 후 전기영동 이동 패턴을 나타낸 것이다.
제20도는 pVAEXT2GUS의 작제 과정을 나타낸 것이다.
제21도는 pVAEXT3GUS의 작제 과정을 나타낸 것이다.
제22도는 pVAXRP1t1GUS의 작제 과정을 나타낸 것이다.
제23도는 pLEEXT1.4GUS의 작제 과정을 나타낸 것이다.
제24도는 pLEEXT0.7GUS의 작제 과정을 나타낸 것이다.
제25도는 pLEEXTt14.9GUS의 작제 과정을 나타낸 것이다.
제26도는 pLEEXTt11.4GUS의 작제 과정을 나타낸 것이다.
제27도는 pNTEXT0.8GUS의 작제 과정을 나타낸 것이다.
제28도는 pTAEXT1.1GUS의 작제 과정을 나타낸 것이다.
제29도는 실시예 11 및 실시예 20에서 형질 전환된 담배 배양 세포의 GUS 특이활성을 비교한 결과에 대한 그래프이다.
서열 목록
SEQ ID NO:1
서열 길이:1875
서열 유형:핵산
가닥성:이중
위상:선형
분자 유형:게놈 DNA
원 공급원:
균주:Vigna angularis
서열 기술:
SEQ ID NO:2
서열 길이:1965
서열 유형:핵산
가닥성:이중
위상:선형
분자 유형:게놈 DNA
원 공급원:
균주:Vigna angularis
서열 기술:
SEQ ID NO:3
서열 길이:2960
서열 유형:핵산
가닥성:이중
위상:선형
분자 유형:게놈 DNA
원 공급원:
균주:Vigna angularis
서열 기술:
SEQ ID NO:4
서열 길이:3300
서열 유형:핵산
가닥성:이중
위상:선형
분자 유형:게놈 DNA
원 공급원:
균주:Vigna angularis
서열 기술:
SEQ ID NO:5
서열 길이:1127
서열 유형:핵산
가닥성:이중
위상:선형
분자 유형:게놈 DNA
원 공급원:
균주:Vigna angularis
서열 기술:
SEQ ID NO:6
서열 길이:1406
서열 유형:핵산
가닥성:이중
위상:선형
분자 유형:게놈 DNA
원 공급원:
균주:Lycopersicon esculentum
서열 기술:
SEQ ID NO:7
서열 길이:800
서열 유형:핵산
가닥성:이중
위상:선형
분자 유형:게놈 DNA
원 공급원:
균주:Nicotiana tabacum
서열 기술:
SEQ ID NO:8
서열 길이:1138
서열 유형:핵산
가닥성:이중
위상:선형
분자 유형:게놈 DNA
원 공급원:
균주:Triticum aestivum
서열 기술:
SEQ ID NO:9
서열 길이:173
서열 유형:핵산
가닥성:이중
위상:선형
분자 유형:게놈 DNA
원 공급원:
균주:Oryza sativa
서열 기술:
SEQ ID NO:10
서열 길이:98
서열 유형:핵산
가닥성:이중
위상:선형
분자 유형:게놈 DNA
원 공급원:
균주:Zea mays
서열 기술:
SEQ ID NO:11
서열 길이:1130
서열 유형:핵산
가닥성:단일
위상:선형
분자 유형:mRNA에 대한 cDNA
원 공급원:
균주:Vigna angularis
서열 기술:
SEQ ID NO:12
서열 길이:1068
서열 유형:핵산
가닥성:단일
위상:선형
분자 유형:mRNA에 대한 cDNA
원 공급원:
균주:Vigna angularis
서열 기술:
SEQ ID NO:13
서열 길이:27
서열 유형:핵산
가닥성:단일
위상:선형
분자 유형:다른 핵산(합성 DNA)
서열 기술:
SEQ ID NO:14
서열 길이:1017
서열 유형:핵산
가닥성:단일
위상:선형
분자 유형:mRNA에 대한 cDNA
원 공급원:
균주:Vigna angularis
서열 기술:
SEQ ID NO:15
서열 길이:588
서열 유형:핵산
가닥성:단일
위상:선형
분자 유형:mRNA에 대한 cDNA
원 공급원:
균주:Vigna angularis
서열 기술:
SEQ ID NO:16
서열 길이:854
서열 유형:핵산
가닥성:단일
위상:선형
분자 유형:mRNA에 대한 cDNA
원 공급원:
균주:Nicotiana tabacum
서열 기술:
SEQ ID NO:17
서열 길이:20
서열 유형:핵산
가닥성:단일
위상:선형
분자 유형:다른 핵산 (합성 DNA)
서열 기술:
SEQ ID NO:18
서열 길이:227
서열 유형:핵산
가닥성:이중
위상:선형
분자 유형:게놈 DNA
원 공급원:
균주:Vigna angularis
서열 기술:
SEQ ID NO:19
서열 길이:290
서열 유형:핵산
가닥성:이중
위상:선형
분자 유형:게놈 DNA
원 공급원:
균주:Vigna angularis
서열 기술:
SEQ ID NO:20
서열 길이:1654
서열 유형:핵산
가닥성:이중
위상:선형
분자 유형:게놈 DNA
원 공급원:
균주:Vigna angularis
서열 기술:
SEQ ID NO:21
서열 길이:29
서열 유형:핵산
가닥성:단일
위상:선형
분자 유형:다른 핵산 (합성 DNA)
서열 기술:
SEQ ID NO:22
서열 길이:30
서열 유형:핵산
가닥성:단일
위상:선형
분자 유형:다른 핵산 (합성 DNA)
서열 기술:
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서열 길이:30
서열 유형:핵산
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위상:선형
분자 유형:다른 핵산 (합성 DNA)
서열 기술:
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서열 길이:30
서열 유형:핵산
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위상:선형
분자 유형:다른 핵산 (합성 DNA)
서열 기술:
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서열 길이:30
서열 유형:핵산
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분자 유형:다른 핵산 (합성 DNA)
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서열 기술:
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서열 유형:핵산
가닥성:이중
위상:선형
분자 유형:게놈 DNA
원 공급원:
균주:Vigna angularis
서열 기술:
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서열 길이:8
서열 유형:아미노산
가닥성:단일
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분자 유형:펩티드
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서열 길이:29
서열 유형:핵산
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위상:선형
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서열 기술:
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서열 기술:
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위상:선형
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서열 길이:31
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위상:선형
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서열 기술:
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서열 기술:
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서열 기술:
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서열 기술:
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서열 길이:30
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서열 기술:
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서열 기술:
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서열 기술:
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서열 유형:핵산
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서열 기술:
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서열 유형:핵산
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위상:선형
분자 유형:다른 핵산 (합성 DNA)
서열 기술:
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서열 유형:핵산
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위상:선형
분자 유형:다른 핵산 (합성 DNA)
서열 기술:
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서열 길이:20
서열 유형:핵산
가닥성:단일
위상:선형
분자 유형:다른 핵산 (합성 DNA)
서열 기술:
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서열 길이:30
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위상:선형
분자 유형:다른 핵산 (합성 DNA)
서열 기술:
SEQ ID NO:66
서열 길이:31
서열 유형:핵산
가닥성:단일
위상:선형
분자 유형:다른 핵산 (합성 DNA)
서열 기술:
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서열 길이:26
서열 유형:핵산
가닥성:이중
위상:선형
분자 유형:게놈 DNA
서열 기술:
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서열 길이:16
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분자 유형:게놈 DNA
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서열 기술:
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서열 길이:29
서열 유형:핵산
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서열 기술:
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서열 길이:30
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서열 기술:
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서열 길이:23
서열 유형:핵산
가닥성:이중
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서열 기술:
SEQ ID NO:73
서열 길이:28
서열 유형:핵산
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서열 길이:33
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서열 기술:
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서열 길이:30
서열 유형:핵산
가닥성:단일
위상:선형
분자 유형:다른 핵산(합성 DNA)
서열 기술:
본 명세서에서 사용된 프로모터는 전사 개시 부위(+1)로부터 20 내지 30 염기싸 상류에 위치하며 정확한 위치에서 RNA 중합효소에 의한 전사의 개시를 담당하는 TATA box 영역 또는 TATA box의 유사 영역을 포함한다. 그러나, 이는 이러한 영역의 전후에 제한되는 것은 아니며, 상기 영역에 부가하여 RNA 중합효소이외에 발현 조절을 위한 다른 단백질의 결합에 필요한 어떠한 다른 부위를 포함할 수 있다.
그리고, 때때로, 용어 프로모터 영역이 본 명세서에서 사용되며 이것은 본 명세서에서 설명된 프로모터를 포함하는 영역을 의미한다.
본 명세서에서 사용된 프로모터 활성은 유전자를 발현시키기 위해서 유용한 유전자를 프로모터의 하류 부위에 연결한 다음, 생성된 유전자를 숙주(식물, 식물 세포 또는 식물 세포로부터 재생된 트랜스제닉 식물)로 전달할 때, 숙주의 안 또는 밖에서 유용한 유전자의 유전자 산물을 생성하는 능력 및 기능을 의미한다.
일반적으로 프로모터 활성은, 유전자를 발현시키기 위하여 쉽게 분석이 가능한 단백질을 코드화하는 유전자 (리포터 유전자)를 프로모터의 하류 부위에 연결하여 숙주로 전달한 후, 단백질의 발현 정도를 측정하여 양성 또는 음성, 강 또는 약으로 표시한다. 따라서, 유용한 유전자를 발현시키기 위하여 그 유전자를 프로모터의 하류에 연결하여 숙주로 전달하였을 때, 숙주의 안 또는 밖에서 유용한 유전자의 유전자 산물이 발현됨을 확인한다는 것을 전달된 숙주에서 그 프로모터가 프로모터 활성을 가짐을 나타낸다.
본 명세서에서 사용된 식물 세포벽 자일로글루칸을 재구성하는 기능을 가진 효소를 코드화하는 유전자는 식물 세포벽 자일로글루칸의 재구성시 특이적으로 발현되는 효소를 코드화하는 유전자를 의미하며, 특히 엔도-자일로글루칸 트랜스퍼라제 (EXT)를 코드화하는 유전자 및 EXT 유전자의 패밀리 유전자를 의미한다. EXT 유전자의 패밀리 유전자의 예는 BRU1 유전자 [문헌 Plant Physiology, 104, 161-170 (1994) 참조], meri-5 유전자 [문헌 The Plant Cell, 3, 359-370 (1991) 참조 및 본 발명에서 수득된 XRP 유전자를 포함한다.
본 명세서에서 사용된 식물 세포벽 자일로글루칸의 재구성에 필요한 부위는 식물 세포벽 자일로글루칸을 재구성하는 기능을 가진 효소를 코드화하는 유전자가 특이적으로 발현되는 부위를 의미하며, 식물 세포벽 자일로글루칸을 재구성하는 기능을 가진 효소를 코드화하는 유전자가 특이적으로 발현되는 한, 발현이 일어나는 부위는 본 명세서에서 언급한 바와 같이 식물 세포벽 자일로글루칸의 재구성에 필요한 부위에 포함된다.
예를 들면, 때때로, 식물 세포벽 자일로글루칸을 재구성하기 위한 기능을 가지 효소를 코드화하는 유전자중 하나인 EXT 유전자의 특성 발현 부위는 동일한 식물에서 조차 EXT 유전자의 패밀리 유전자의 발현 부위와는 다르다. 그러나, 그들 모두 본 명세서에 언급된 바처럼 식물 세포벽 자일로글루칸의 재구성에 필요한 부위내에 포함된다.
본 명세서에서 사용된 식물 세포벽 자일로글루칸을 재구성하는 식물 성장 단계는 식물 세포벽 자일로글루칸을 재구성하는 기능을 가진 효소를 코드화하는 유전자가 특이적으로 발현되는 단계를 의미하며, 식물 세포벽 자일로글루칸을 재구성하는 기능을 가진 효소를 코드화하는 유전자가 특이적으로 발현되는 한, 발현이 일어나는 단계는 본 명세서에서 언급한 식물 세포벽 자일로글루칸의 재구성에 필요한 단계에 포함된다.
예를 들면, 때때로, 식물 세포벽 자일로글루칸을 재구성하는 기능을 가진 효소를 코드화하는 유전자중 하나인 EXT 유전자의 특이적 발현 단계는 같은 식물에서 조차 EXT 유전자의 패밀리 유전자의 발현 단계와 다르다. 그러나, 그들 단계 모두 본 명세서에 언급된 식물 세포벽 자일로글루칸의 재구성에 필요한 단계에 포함된다.
예를 들어, 배양 세포에서, 대수기에는 체세포 분열이 왕성하고 세포벽의 합성 및 재구성이 활발하게 진행된다. 정지기에는, 세포가 활발하게 신장하므로 세포벽의 재구성이 요구된다. 그러므로, 양 기간동안에 세포벽 재구성이 요구된다. 이후 실시예 10에서 언급하겠지만, 배양 세포중에서 담배에서 기원한 EXT 유전자의 발현 단계는 담배에서 기원한 EXT 유전자의 패밀리 유전자인 XRT 유전자의 것과는 다르다. 즉, 담배에서 기원한 EXT 유전자는 대수기에 특이적으로 강하게 발현되는 반면, 정지기에는 발현이 약 1/20로 감소된다. 반대로, 담배에서 기원한 EXT 유전자의 패밀리 유전자인 XRT 유전자는 정지기에 특이적으로 강하게 발현된다. 그러므로, 같은 효소 활성을 나타내는 효소의 특이적 발현 단계는 효소 코드화하는 유전자의 프로모터에 의해 조절된다. 또한, 그러한 경우에 본 명세서에서 언급된 식물 세포벽 자일로글루칸의 재구성 단계의 예로는 대수기 및 정지기를 들 수 있다.
본 명세서에서 사용된 용어 기능적 등가물은 하기를 의미한다.
자연적으로 발생하는 단백질은 형성된 단백질의 생체 내 정제과정중의 변형에 의해서 결손, 삽입, 첨가, 치환과 같은 아미노산 서열내의 다양한 돌연변이가 일어나며, 더불어 단백질을 코드화하는 유전자의 다형화 및 돌연 변이도 일어난다. 그럼에도 불구하고, 돌연 변이없이 단백질과 실질적으로 동일한 물리적 및 생물학적 활성을 나타내는 분자의 존재가 공지되어 있다. 다른 구조를 가지나 실질적으로 동일한 기능을 가지는 그런 분자를 기능적 등가물로 정의한다.
상기 언급된 돌연 변이가 인위적으로 단백질의 아미노산 서열내에 도입된 경우도 동일하다. 그런 경우에 만들어진 다양한 돌연변이체는 그들의 돌연변이가 일어나지 않은 단백질과 실질적으로 동일한 생물학적 활성을 나타내게 하는 기능적 등가물로서 설명될 수 있다.
예를 들면, 대장균에서 발현되는 단백질의 N-말단에 존재하는 메티오닌 잔기는 많은 경우에 메티오닌 아미노펩티다아제의 작용에 의해서 제거된다고 한다. 그러나 때때로, 단백질의 특정한 타입에 따라서 메티오닌 잔기를 갖거나 갖지 않은 단백질이 모두 형성된다. 그럼에도 불구하고, 메티오닌 잔기의 존재 또는 부존재는 많은 경우에 단백질의 활성에 영향을 주지는 않는다. 또한, 인터루킨-2(IL-2)의 특정 시스테인 잔기를 세린 잔기로 대체하여 얻어진 폴리펩타이드는 인터루킨-2의 활성을 유지한다고 알려져 있다 [문헌 Science, 224, 1431-1433 참조].
또한, 유전 공학에 의한 단백질의 생산에 있어서, 단백질은 종종 융합 단백질로서 발현된다. 예를 들면, 목적 단백질의 발현 수준을 높이기 위해서 목적 단백질의 N-말단에 다른 단백질에서 유래한 N-말단 펩티드 사슬을 첨가한다. 그리고, 첨가된 펩티드 사슬에 친화력을 가진 담체를 담체를 사용하여 유전자 발현 후 목적 단백질의 정제를 용이하게 하기 위해서, 목적 단백질의 N-말단이나 C-말단에 적당한 펩티드 사슬을 첨가한다.
더구나, 유전자에는 아미노산 각각에 대해 특정한 하나의 아미노산을 지정하는 1 내지 6 코돈(3 염기 세트)이 존재한다고 알려져 있다. 따라서, 비록 유전자의 수가 아미노산 서열에 따라 다르기는 해도 특정한 아미노산 서열을 코드화하는 많은 유전자가 있을 수 있다. 자연 상태에서 유전자가 항상 안정하게 존재하지는 않으며 종종 핵산에 돌연 변이가 일어난다. 코드화된 아미노산 서열에 어떠한 변화도 유도하지 않는 유전자상의 돌연변이 (사일런트(silent) 돌연변이라 함)가 생길 수 있으며, 그런 경우, 동일한 아미노산 서열을 코드화하는 다른 유전자가 형성되었다고 말할 수 있다. 따라서, 어떤 한정턴 아미노산 서열을 코드화하는 유전자 분리되었을 때 조차, 동일한 아미노산 서열을 코드화하는 다수의 유전자 타입이 그 유전자를 포함한 생명체의 변천 동안에 형성될 수 있다는 가능성을 부인할 수는 없다.
더 나아가, 다양한 유전 공학 기술을 적용하여 동일한 아미노산 서열을 코드화하는 많은 타입의 유전자를 인위적으로 제조하는 것이 그렇게 어렵지만은 않다.
예를 들면, 유전 공학에 의한 단백질의 생산에서, 목적 단백질을 코드화하는 본래의 유전자에 사용된 특정 코돈이 사용된 숙주내에서 자주 이용되지 않는 것일 때에는, 때때로 발현이 잘 되지 않는 것을 경험할 수 있다. 그런 경우, 코드화된 아미노산 서열에 영향을 주지 않으면서 숙주에는 더 친숙한 다른 코돈으로 당해 코돈을 인위적으로 대체함으로서 목적한 단백질의 발현을 증가시키는 시도를 하여 왔다. 말할 필요없이, 이러한 방법으로 특정 아미노산 서열을 코드화된 다양한 유전자를 인위적으로 제조하는 것이 가능하다. 따라서, 인위적으로 제조된 상이한 유전자도 그들이 본 발명에 개시된 뉴클레오타이드 서열로부터 추론되는 아미노산 서열을 코드화하고 있는 한은, 본 발명에 포함된다.
또한, 목적 단백질의 아미노산 서열상에서 결손, 삽입, 첨가 및 치환에 의한 하나 이상의 아미노산의 변형을 적어도 함유하는 많은 펩타이드는 목적 단백질과 기능적인 면에서 동일한 활성을 가지고 있다. 자연에서 분리되었거나 인위적으로 제조되었거나 관계 없이, 그런 폴리펩타이드를 코드화하는 유전자도 본 발명의 기능적 등가물에 포함된다.
일반적으로, 많은 경우에, 기능적 등가물을 코드화한 유전자는 상동성을 가지고 있다. 따라서, 본 발명에서 이용된 EXT 유전자에 혼성화할 수 있는 유전자 및 동일한 기능을 가진 폴리펩타이드를 코드화한 유전자도 또한 본 발명의 기능적 등가물에 포함된다.
본 명세서에 언급된 유용한 유전자의 예로는 식물이나 식물 세포 또는 식물 세포로부터 재생된 트랜스제닉 식물에서 발현될 수 있는 단백질을 코드화한 유전자, 식물이나 식물 세포 또는 식물 세포로부터 재생된 트랜스제닉 식물에서 기원한 유전자의 안티센스 RNA, 식물이나 식물 세포 또는 식물 세포로부터 재생된 트랜스제닉 식물에서 기원한 전자 인자의 결합 단백질을 코드화한 유전자, 또는 전사 인자에 대한 결합 부위의 서열이나 유사 서열을 가진 데코이(decoy) 및 식물이나 식물 세포 또는 식물 세포로부터 재생된 트랜스제닉 식물에서 기원한 mRNA를 절단하는 리보자임을 들 수 있다.
식물이나 식물 또는 식물 세포로부터 재생된 트랜스제닉 식물에서 발현될 수 있는 단백질을 코드화한 유전자로 식물에서 기원한 유전자를 언급할 수 있다. 그러나, 본 발명에서는 이에 한정하지 않고 식물이나 식물 세포 또는 식물 세포로부터 재생된 트랜스제닉 식물에서 발현될 수 있는 한, 박테리아, 이스트, 악티노마이세트(actinomycetes), 곰팡이, 아스코마아티나(ascomycotina), 바시디오마이코티나(basidiomycotina) 등의 미생물에서 기원한 유전자 및 동물 등의 생체 에서 기원한 유전자를 포함한다.
본 명세서에서 언급된 데코이(Decoy)는 식물이나 식물 세포 또는 식물 세포로부터 재생된 트랜스제닉 식물에서 기원한 전사 인자의 결합 단백질을 코드화한 DNA 유전자, 또는 데코이로서 세포로 전달되어 전사 인자의 작용을 억제하는, 전사 인자에 대한 결합 부위의 서열이나 유사 서열을 가진 DNA를 말한다.
본 명세서에서 언급된 리보자임은 정의된 단백질에 대한 mRNA를 절단하여 이들 정의된 단백질의 번역을 저해하는 분자를 말한다. 리보자임은 정의된 단백질을 코드화한 유전자 서열에서 설계될 수 있다. 본 명세서에서 언급된 리보자임의 예는 햄머-머리 타입의 리보자임, 헤어핀-타입의 리보자임, 델타-타입의 리보자임 등과 같은 타입에 관계없이 정의된 단백질에 대한 mRNA를 절단하여 이들 정의된 단백질의 번역을 저해할 수 있는 모든 리보자임을 포함한다.
식물 세포벽 자일로글로칸을 재구성하는 기능을 가지는 효소를 갖는 모든 식물이 본 발명에 사용될 수 있다. 이러한 식물의 예로는 아즈키 콩(azuki bean), 대두(soybean), 아라비돕시스(Arabidopsis), 토마토, 감자, 브라시카(Brassica), 해바라기, 목화, 담배 등의 쌍자엽성 식물 및 밀, 벼, 옥수수, 사탕수수 등의 단자엽성 식물을 들 수 있으며, 이들 중 특히 조직-특이성 방식으로 발현되는 EXT 효소 및 EXT-유사 효소를 가지는 식물을 사용하였다.
EXT 유전자는 식물의 하우스킵핑(housekeeping) 유전자이며 따라서 많은 패밀리 유전자가 존재한다. 이러한 패밀리 유전자의 프로모터 영역을 포함한 DNA 단편에 있어서는, 통상적인 플라크 혼성화 방법에 의해서 EXT 유전자의 프로모터를 클로닝하기가 쉽지 않다. 왜냐하면 위유전자를 포함한 많은 패밀리 유전자가 존재하며, EXT 유전자 또는 그의 패밀리 유전자의 상류 부위 단편을 가진 파아지가 제조되어 숙주를 감염될 때 얻어진 플라크의 플라크 형성 능력이 감소하기 때문에다. 그러나, 탐침으로서 EXST 유전자 및 그의 패밀리 유전자의 cDNA를 사용하고 목적물로서 게놈 DNA를 사용함으로써 이런 두가지 문제를 극복하여, 쌍자엽성 식물 및 단자엽성 식물을 포함한 어떠한 식물에도 혼성화를 적용할 수 있으며, 또한 PCR 방법을 세밀히 연구함으로써 분리가 가능하게 되었다.
탐침으로는, 대상 종과는 다른 식물의 EXT 유전자 및 그의 패밀리 유전자의 cDNA를 사용할 수 있다. 그러나, 표적물과 동일한 종의 식물로부터 cDNA를 선택하여 탐침으로 사용하는 것이 좀 더 효과적인 혼성화에 바람직하다, 본 발명자들은 아즈키 콩(Vigna angularis), 대두(Glycine max), 아라비돕시스(Arabidopsis thaliana), 토마토(Lycopersicon esculentum), 밀(Triticum aestivum), 담배(Nicotiana tabacum), 벼(Oryza sativa), 옥수수(Zea mays)에서 EXT 유전자의 cDNA를 분리하였다. 이들 cDNA 분자중에서, 아즈키 콩, 대두, 아라비돕시스, 토마토, 및 밑의 전(full) 길이 또는 일부 뉴클레오타이드 서열 및 벼의 제한 지도 및 옥수수의 제한 지도가 문헌 EP-0562836 Al (1993)에 언급되어 있고, 담배의 뉴클레오타이드 서열 일부는 JP 7-79778 A에 언급되어 있다. 또한, 벼 및 옥수수의 뉴클레오타이드 서열 일부는 서열 목록 SEQ ID NO 9 및 SEQ IN NO 10에 나타내었다.
패밀리 유전자의 cDNA는 EXT 유전자의 전길이 또는 일부 cDNA를 탐침으로 사용하여 분리할 수 있다. 예를 들면, 상기 언급된 모든 EXT 유전자의 cDNA 및 트로파에오롬 마주스(Tropaeolum majus)의 자일로글루카나제 유전자 사이에 보존된 서열을 탐침으로 이용하여, 다양한 식물종으로부터 패밀리 유전자의 cDNA를 분리할 수 있다[The Plant Journal, 3,701-711 (1193)]. 또한, 보존된 영역을 기초로 프라이머를 합성한 다음 PCR을 수행함으로써 식물의 다양한 종으로부터 패밀리 유전자의 cDNA를 분리할 수 있다 [Consensus PCR; Molecular and Cellular Biology, 13, 4745-4752 (1993)].
이하에서는, 아즈키 콩을 예로 들어 본 발명을 자세히 설명한다.
EP-0562836 Al (1993)에 기술된 방법에 따라 아즈키 콩 종자를 사용하여 제조된 cDNA 라이브러리(WATANABE SHUSHI Co., Ltd.)는 EXT 유전자의 패밀리 유전자로 형질 전환된 클론을 찾는데 사용될 수 있다. 예를 들면, cDNA 라이브러리는 아즈키 콩으로부터 RNA를 제조한 후, Oligotex-dT30 (NIHON Roche Co., Ltd.)을 이용하여 폴리(A)+RNA를 정제한 다음, 예를 들면, 폴리(A)+RNA 및 Oilgo-dT 프라이머에 역전사효소를 처리하여 cDNA 제조하는 과정에 의해 제조된다. cDNA 라이브러리는 cDNA synthesis Kit System Plus (Amersham)를 이용하여 cDNA로부터 제조된다. 이 cDNA 라이브러리를 EXT 유전자의 cDNA를 탐침으로 사용한 플라크 혼성화에 이용함으로써 5×104플라크로부터 예를 들어 96개의 양성 플라그를 선별하였다. 이들 플라크를 플레이트 라이세이트 방법(plate lysate method)에 의해 증폭시킨 후(T. Maniatis et al., Molecular Cloning, A laboratory Manual, Second Edition, Chapter 2,pp. 60-66 참조, 1989년에 Cold Spring Harbor Laboratory Press에서 발행), 시그날 강도에 기초하여 플라크를 분류하기 위해 도트(dot) 혼성화를 수행하였다.
아즈키 콩의 EXT 유전자와는 다른 시그날 강도를 나타내는 두개의 플라크로부터 파아지를 분리하고 그 내부에 삽입된 DNA를 추출하였다. 이 DNA를 제한 효소 EocR I (다카라 슈조 (주)에서 제조)으로 절단한 후, DNA 단편의 길이를 아가로우즈 겔 전기영동으로 확인하였다. 약 730 bp, 430 bp 및 1090 bp의 확인된 DNA 단편을 정제하여 pUC18(다카라 슈조 (주)에서 제조)에서 EcoR I 부위에 서브클로닝하였다. 생성된 플라스미드를 pVX44-1, pVX44-2 및 pVX45-1로 각각 명명하였다. 이 플라스미드는 BcaBESTTMDideoxy Sequencing Kit (다카라 슈조 (주)에서 제조)을 이용하여 생거(Sanger) 방법에 따라서 DNA 단편의 뉴클레오타이드 서열을 결정하는데에 사용되었으며, 이에따라 EXT 유전자(아즈키 콩 EXT) 높은 상동성을 가진 두개의 유전자가 클로닝되었다. 그들의 뉴클레오타이드 서열의 일부를 서열 목록 SEQ ID NO 11 및 SEQ IN NO 12에 나타내었다(아즈키 콩 EXT 2 및 아즈키 콩 EXT 3).
상기 언급된 cDNA 라이브러리를 상기 언급된 보존 서열중의 하나(SEQ IN NO 13)를 탐침으로 사용한 플라크 혼성화에 이용함으로써, 8×103플라크로부터 예를 들어 8개의 양성 플라크를 선별하였다. 플라크의 파아지 벡터에 삽입된 DNA를 추출하였으며, EXT 유전자 및 그의 패밀리 유전자와 높은 상동성을 가진 DNA 단편 (약 1.2 kbp), 예를 들면, BRU1 유전자[문헌 Plant Physiology, 104, 161-170 (1994) 참조] 및 meri-5 유전자 [The Plant Cell, 3, 359-370 (1991)]를 수득할 수 있다. 이 DNA 뉴클레오타이드 서열의 일부는 서열 목록 SEQ ID NO 14에 나타내었다 (아즈키 콩 XRP 1).
또한, 상기 언급된 cDNA 라이브러리는, 예를 들면, 상기 언급된 보존 서열 및 올리고-dT 프라이머를 사용한 PCR에 이용될 수 있다. 그 결과로서, 예를 들면, 아즈키 콩 EXT, 아즈키 콩 EXT 2, 아즈키 콩 EXT 3 및 아즈키 콩 XRP 1과는 다른 패밀리 유전자의 DNA 단편을 얻을 수 있다. 이 DNA 뉴클레오타이드 서열의 일부를 서열 목록 SEQ ID NO 15에 나타내었다(아즈키 콩 XRP 2).
아즈키 콩과는 다른 식물에서는, 탐침으로서 상기 보존 서열 중 하나 (SEQ ID NO 13)를 사용한 플라크 혼성화를 수행하여 패밀리 유전자의 cDNA를 수득할 수 있다. 예를 들면, 상기 언급된 보존 서열중 하나 (SEQ ID NO 13)를 탐침으로 이용한 플라크 혼성화를 수행하는데 상업적으로 이용할 수 있는 담배의 cDNA 라이브러리를 이용하여 3×104플라크로부터 30개의 양성 플라크를 수득하였다. 상기 플라크의 파이저 벡터에 삽입된 DNA를 추출하여, 예를 들면, EXT 유전자 및 BRU1 유전자 [Plant Physiology, 104, 161-170 (1994)] 및 meri-5 유전자 [The Plant Cell, 3, 359-370 (1991)]와 높은 상동성을 가진 DNA 단편 (약 1.2 kbp)를 수득할 수 있다. 이 DNA 뉴클레오타이드 사열의 일부를 서열 목록 SEQ ID NO 16에 나타내었다 (담배 XRP 1).
다음, 예를 들면, 아즈키 콩의 게놈 DNA 라이브러리는 통상적인 방법으로 아즈키 콩 잎으로부터 게놈 DNA를 제조한 후, 이를 제한 효소 Sau3A I으로 부분적 분해하여 생성된 부분 분해 생성물을 예를 들면, λGEM-11 Xho I Half-Site Arms Cloning System (Promega Biotec)을 이용하여 벡터 λGEM-11에 연결한 후, 시험관내 팩키징 키트 (Stratagene)를 이용하여 팩키징을 한 다음, 생성된 단편으로 숙주를 감염시켜 수득할 수 있다. 이 라이브러리는, 예를 들면, EP-0562836 Al (1993)에 언급된 EXT 이 유전자의 프로모터 영역을 함유한 DNA 단편을 가진 파아지를 찾기 위한 탐침으로서 이 유전자의 cDNA를 이용한 혼성화에서 사용될 수 있다. 예를 들면, 10개의 양성 플라크가 1×105플라크로부터 수득되며, 플라크의 파아지 벡터에 삽입된 DNA를 추출하여 약 15 kbp의 평균 길이를 가진 DNA 단편을 수득하였다. 이 DNA 단편을 EXT 유전자의 cDNA를 포함한 DNA 단편을 탐침으로 이용하는 서던 혼성화(Southern Hybridazation)에 이용한 다음, 플라스미드 벡터에 목적한 단편을 서브클로닝하여 뉴클레오타이드 서열 일부를 분석하였다. 그 결과로써, 예를 들면, 모든 플라크의 파이지 벡터에 삽입된 DNA 단편이 EXT 유전자와 유사한 서열을 가지고 있음을 확인할 수 있었다.
이러한 연구에 의해 EXT 유전자 및 그의 패밀리 유전자의 프로모터를 포함한 영역의 클로닝이 쉽게 수행될 수 있다고 인식될 수도 있다. 그러나, 사실상, 다음의 두 문제점이 원인이 되어 통상의 플라크 혼성화에 의한 EXT 유전자의 프로모터의 클로닝이 모두 실패하였다.
첫번째 문제는 통상의 혼성화에 의해 쉽게 식별되지 않는 위유전자를 포함한 많은 패밀리 유전자의 존재이다. 따라서, 목적 cDNA 클론의 진정한 상대방인 게놈 DNA 클론을 클로닝하기 위해서, 상대방일 수 있는 게놈 DNA 클론을 대충 선별한 후에 각각의 게놈 DNA의 뉴클레오타이드 서열 모두를 분석하고 결정하는 것이 필요하다. 대안으로, cDNA로부터 많은 패밀리 유전자를 분석하여 패밀리 유전자내의 각각의 유전자를 구별할 수 있는 뉴클레오타이드 서열을 발견한 다음, 게놈 DNA 클론을 한정하기 위해서 그것의 뉴클레오타이드 서열에 특이적인 올리고 탐침(SSOP)을 사용하여 혼성화를 수행하는 것이 필요하다.
두번째 문제는 EXT 유전자 및 그의 패밀리 유전자의 프로모터 영역을 포함한 DNA 단편을 전달함에 따라 유도되는 강한 억제 작용 및 숙주 박테리아(대장균)에 파이저를 감염하여 형성되는 플라크 형성 능력의 감소이다. 사실상, 정상적인 파아지와 비교할 때 형성된 플라크는 극단적으로 작기 때문에 EXT 유전자의 프로모터 영역을 포함한 상기 정의된 파이즈를 찾는 것은 어렵다. 그러나 문제점은 목적한 프로모터 영역을 분리하려는 반복된 시행 착오 중에 밝혀졌으며, 클로닝을 실제적으로 수행할 때가지 예상할 수 없었다.
따라서, 본 발명자들은 상기 문제점을 해결하기 위해서 집중적으로 연구하였으며, 그 결과 처음으로 EXT 유전자의 프로모터를 함유한 영역을 성공적으로 클로닝하였으며, 개선된 PCR 방법을 포함한 다양한 유전 공학적 기술을 이용하여 단계적으로 그 문제들을 해결하였다.
하기에서는, EXT 유전자 및 그의 패밀리 유전자를 EXT-패밀리 유전자로 언급한다.
[프로모터의 클로닝]
상기 언급된 플라크 형성 능력의 억제에 의한 영향이 존재하는 경우에는, 완전한 게놈 DNA 라이브러리로부터 반복하여 선별작업을 수행하여도 EXT 유전자의 프로모터 영역을 클로닝하는 것이 불가능하다. 따라서, 상기 억제에 영향받지 않는 짧은 게놈 단편을 제조한 다음, 억제에 의한 영향을 최소화하여 클로닝을 수행하는 것을 생각할 수 있다. 이러한 목적으로, 먼저 게놈 DNA를 다양한 제한효소로 완전히 분해하고 게놈믹(genomic) 써던 혼성화를 수행한 다음, 말단에 제한 효소 부위를 가진 어떤 크기의 DNA 단편이 EXT 유전자의 목적 프로모터 영역을 함유하고 있는지 추론하는 것이 필요하다.
그렇게 정의된 DNA 크기를 갖는 일부의 게놈 DNA 라이브러리는 그렇게 정의된 제한 효소로 게놈 DNA를 완전히 분해하여 아가로즈 겔에서 평균적으로 정의된 크기의 DNA 단편을 가진 주위에서 DNA 단편을 회수함으로써 제조될 수 있다.
그 결과, 최초의 완전한 게놈 DNA 라이브러리와 비교할 때 약 10배 이상 압축된 일부위 게놈 DNA 라이브러리를 얻을 수 있다. 예를 들면, 통상의 방법에 의해 아즈키 콩 잎으로부터 제조된 게놈 DNA를, 예를 들면, 제한효소 BamH I, EcoR I 및 Hind Ⅲ (모두 다카라 슈조 (주)에서 제조)로 분해한 후, 게놈믹 써던 혼성화를 수행하면 2 또는 3개의 밴드가 형성되었으며, 여기에서 가장 강한 밴드가 BamH I 분해에 의해서는 15 kbp 이상에서, EcoR I 분해에 의해서는 약 8.5 kbp에서, Hind Ⅲ 분해에 의해서는 약 8.5kbp에서, EcoR I-Hind Ⅲ이중 분해에 의해서는 약 5.5 kbp에서 확인되었다.
이러한 밴드중에서 EcoR I-Hind Ⅲ 이중 분해에 의해 형성된 약 5.5 kbp의 밴드를 아가로즈 겔로부터 회수하고, 예를 들면, λEXlox (노바겐(Novagen))의 EcoR I의 Hind Ⅲ 부위에 연결한 후, 시험관내에서 팩키징 키트(Stratagene)에 의해 팩키징 하여 숙주 박테리아에 감염시킴으로써 양쪽 말단에 EcoR I-Hind Ⅲ 부위를 가진 평균 약 5.5kbp 크기의 DNA 단편을 가지며, 완전한 게놈 DNA 라이브러리와 비교할 때 더 압축된 일부의 게놈 DNA 라이브러리를 수득할 수 있었다. 이 압축된 라이브러리를 탐침으로서 상기 언급된 EXT 유전자의 cDNA를 사용하는 혼성화에 적용하여 EXT 유전자의 프로모터 영역을 함유한 DNA 단편을 가진 파아지를 선별하였다. 예를 들면, 1.3×105플라크로부터 찾은 8개의 양성 플라크에 대하여 탐침으로서 EXT 유전자와는 다른 패밀리 유전자의 cDNA와 더 낮은 상동성을 가진 5'-비정보 영역에 기초하여 합성된 올리고뉴클레오타이드 VAN-U7 (SEQ ID NO 17)을 사용하여 혼성화를 수행한 결과, 예를 들면, 8개의 플라크 중 4개가 EXT 유전자의 cDNA를 포함한 DNA 단편임을 확인하였다. P1Cre 유전자를 가진 숙주 박테리아에 λEXlox DNA 단편을 감염시키면 숙주에서 자동으로 서브클로닝된 영역을 자동적인 서브클로닝에 의해 pUC-타입의 플라스미드로 전환시키기 때문에 λEXlox은 자동적으로 서브클로닝될 수 있다.
DNA 단편이 삽입된 플라스미드를 사용하여 DNA 서열을 분석한 후, DNA 단편을 EXT 유전자의 cDNA 서열과 비교하여 DNA 단편이 EXT 유전자의 프로모터를 포함하는지 여부를 확인하였다.
확인된 단편의 DNA 뉴클레오타이드 서열의 일부를 서열 목록의 SEQ ID NO 18(EXT를 코드화한 부위로부터 상류) 및 SEQ ID NO 19(DNA 단편의 하류)에 나타내었다.
이후에서는, 편의상 EcoR I 부위의 5'-상류를 프로모터-상류 영역으로 명명하고, 3'-하류를 프로모터-하류 영역으로 명명한다.
단편이 통합된 플라스미드는 pVXG303으로 명명하고, pVXG303으로 현질 전환된 대장균 JM109 균주를 대장균 JM109/pVXG303으로 명명하였으며, 부다페스트 조약에 의거하여 1995년 3월 15일 (원기탁일)자로 Natiinal Institutue of Bioscience and Human-Technology, Agency of Industrial Science and Technology, Ministry of Industrial Trade and Industry (일본국, 305, 이바라기-켄, 쭈쿠바-시, 히가시 1-초메, 1-3)에 수탁 번호 FERM BP-5390으로 기탁하였다.
프로모터-상류 영역은 상기 언급된 바와 같이 확인된 약 8.5kbp의 Hind Ⅲ 단편을 클로닝하여 수득할 수 있다. 이 목적을 위해서, 아즈키 콩의 게놈 DNA를, 상기 언급된 방식과 같이, 제한 효소 Hind Ⅲ로 완전히 분해한 후, DNA 단편을 0.7% 아가로오즈 젤 상에서 전기 영동으로 분리하여 회수하였다. 또한, 제한효소 Spe I (다카라 슈조 (주)에서 제조)으로 λZAP Ⅱ(Stratagene)으로 완전히 분해한 후, dCTP 및 dTTP의 존재하에서 채우기 (fill-in) 반응을 수행하여 반-채워진 부위(half-filled-in site)를 형성한다. 상기 언급한 바와 같이 dATP 및 dGTP의 존재하에서 Hind Ⅲ 단편(평균: 약 8.5kbp)의 채우기 반응을 수행한 후, λZAP Ⅱ의 반-채워진 부위에 연결하면 게놈 DNA 라이브러리의 제조를 시도할 수 있다.
그러나, 이 λ DNA의 크기는 팩키징을 위한 한계 크기이고 이에 따라 이 라이브러리의 역가는 그리 높지 않으리나 예상되었다. 사실상, 이 라이브러리의 역가는 매우 낮아셔 효과적으로 선별할 수 없었다. 또한, 이 크기는 너무 작아서 λ DASH Ⅱ(Stratagene)와 같은 대체형 파이지 벡터를 사용할 수 없었다. 사실상, 회수된 Hind Ⅲ 단편(평균: 약 8,.5kbp)을 λDASH Ⅱ의 Hind Ⅲ 부위로 연결하여 수득된 라이브러리의 역가는 매우 낮아서 효과적으로 선별할 수 없었다.
또한, 탐침으로서 EXT 유전자의 cDNA를 이용하여 λGEM11 (Promega Biotec)을 이용한 완전한 게놈 DNA 라이브러리로부터 선별을 수행하는 것이 유일한 방법일 것이다. 그러나, 상기 언급된 플라크 형성 억제에 의한 영향 및 많은 패밀리 유전자의 존재로 인하여 EXT 유전자의 목적 프로모터를 포함한 어떠한 단편도 얻을 수 없다고 예상된다.
따라서, 탐침으로서 새로이 클로닝된 게놈 단편을 사용하면 cDNA를 사용한 경우보다 목적한 프로모터를 포함한 단편에 의해서 더 강한 혼성화를 나타내리라 기대된다. 따라서, 탐침으로서 그러한 게놈 DNA 단편을 사용하여 플라크 혼성화를 수행한 다음, 가능한한 많은 플라크를 선별하는 것이 바람직하다.
이러한 선별 결과, 예를 들면, 20개의 양성 시그날이 2×105플라크에서 수득되었으며 추가의 선별에 의해 양성 클론의 분리가 가능하였다. 그러나, 목적한 프로모터를 함유한 단편이 삽입된 파아지 벡터에 기초하여 얻어진 플라크의 크기는 매우 작아서 소량의 다른 플라크로 오염되게 되면 파아지 DNA의 추출시에는, 플레이트 라이세이트 방법(plate lysate method)이나 액체 배양법(culture broth method)에서 더 빠른 증식율을 가진 오염 파아지의 증식이 우선함에 따라 오염 파아지에서 기원한 DNA가 독점적으로 형성될 것이다.
사실상, 이러한 문제는 선별 과정이 수행될 때까지 전혀 예상되지 않았다. 그러므로, 시그날에 상응하는 플라크는 파아지의 희석 용액을 얇게 분무하여 반복된 이차 선별과정을 수행하거나, 추가로 삼차 선별과정을 수행하여 수득할 수 있다. 놀랍게도, 삼차 선별과정 중에 플레이트를 주의깊게 관찰한 결과, 첫 눈에 확인될 수 없는 시그날에 해당하는 위치에서 다른 음성 플라크보다 훨씬 작은 플라크를 감지할 수 있었다. 그렇게 수득된 매우 작은 플라크를 조심스럽게 플라크로부터 기원한 파아지만이 증식되도록 다루어 다른 플라크의 오염을 차단하였다. 파아지 벡터에 삽입된 DNA 단편을 추출함으로써, 예를 들면, 약 11 kbp 길이의 DNA 단편을 얻을 수 있었다.
또한, 목적한 EXT 유전자를 함유한 클론은 EXT 유전자이외의 패밀리 유전자의 cDNA와 더 낮은 상동성을 가진 5'-비유전 정보 영역에 기초하여 합성된 올리고뉴클레오타이드 VAN-U7(SEQ ID NO 17)를 탐침으로 사용하여 동시에 혼성화를 수행함으로써, 두번째 선별 과정 중에 효과적으로 선별될 수 있었다.
예를 들면, 제한 효소 Hind Ⅲ (다카라 슈조 (주)에서 제조)로 DNA 단편을 분해한 후, 탐침으로서, 상기 언급된 아즈키 콩의 EXT 유전자의 게놈 DNA를 사용하여 게놈믹 서던 혼성화를 수행하면 이 유전자의 프로모터 영역을 포함한 더 짧은 DNA 단편을 한정할 수 있다. 이 단편을 플라스미드의 제한 부위로 삽입시킨 후, 이 단편으로 삽입된 플라스미드를 적당한 숙주로 전달하였다. 또한, 상기 DNA 단편이 삽입된 플라스미드를 사용하여 DNA 서열을 분석하고, 그 DNA 단편을 EXT 유전자의 cDNA 서열과 비교함으로써 그 DNA 단편이 EXT 유전자의 프로모터를 포함하는지 판단할 수 있다. 또한, 그 단편은 목적 프로모터-상류 영역을 포함한 단편으로서 서브클로닝에 사용될 수 있다. 수득된, 서브클로닝된 DNA 단편은 양 말단에 Hind Ⅲ 및 EcoR I을 가지고 있으므로, 이 단편의 뉴클레오타이드 서열을 결정하기 위해서 pUC118(다카라 슈조 (주)에서 제조)의 Hind Ⅲ 및 EcoR I 부위에 혼입하였다. 제1도는 이 단편의 제한 지도를 나타낸다. 이 뉴클레오타이드 서열은 서열 목록 SEQ ID NO 20에 나타내었다.
pUC118의 Hind Ⅲ 및 EcoR I 부위에 목적 프로모터-상류 영역을 함유한 단편을 혼합한 플라스미드는 pVXP101로 명명하였고, pVXP101로 형질 전환된 대장균 JM109는 대장균 JM109/pVXP101로 명명하였으며, 이를 부다페스트 조약에 의거하여 1995년 2월 23일(원기탁일)자로 National Institute of Bioscience and Human-Technology, Agency of Industrial Science and Technology, Ministry of Industrial Trade and Industry (일본국, 305, 이바라기-켄, 쭈쿠바-시, 히가시 1-초메, 1-3)에 수탁 번호 FERM BP-5389으로 기탁하였다.
상기 언급된 과정은 목적 프로모터 영역을 함유한 DNA 단편의 클로닝에 항상 적용될 수 있는 것은 아니다. 예를 들면, 유전자 단편이 숙주 박테리아에 대하여 치명적이거나 생장 억제 작용을 하는 경우에는 적용할 수 없다. 실제로, EXT 유전자의 프로모터를 포함하는 상기 언급된 파아지는 찾아서 선별하기에는 너무 작은 플라크를 형성한다.
따라서, EXT 유전자의 프로모터 영역을 함유한 DNA 단편을 클로닝하기 위한 또 다른 방법으로서 PCR 방법을 고려할 수 있다.
이와 같이 미지의 서열을 증폭하기 위한 PCR방법으로는 역 PCR [문헌 The Plant Journal, 7, 157-164 (1995) 참조] 및 카세트를 사용한 PCR [TANPAKUSHITU KAKUSAN KOUSO (Proteins, Nucleic Acids, and enzymes), 35, 3157-3163 (1990) 참조]을 언급할 수 있다.
그러나, 통상의 역 PCR을 고등 동물이나 식물의 게놈 DNA를 주형으로 사용할 때 길이 약 1kbp까지의 DNA 사슬의 증폭에만 효과적이다. 또한, 카세트를 사용한 PCR은 마찬가지로 길이 약 1kbp까지의 단편의 증폭에만 효과적이다.
또한, 역 PCR에서는 자가 연결(self-ligation)을 위한 제한 효소의 선택이 제한되며, 이 경우 증폭된 단편을 수득하기 위해서는 4bp를 인지하는 제한 효소를 사용하는 것이 매우 중요하다. 카세트를 사용한 PCR에서는, 6 bp를 인지하는 다양한 제한 효소 부위를 가지는 많은 카세트를 시험하는 것이 필요하므로 많은 노동력이 요구된다. 더구나, 6bp를 인지하는 제한효소 부위는 말할것도 없고, 4 bp를 인지하는 제한 효소 부위조차 프로모터 영역과 같이 AT-rich의 편향된 서열을 포함한 DNA 단편에 존재할 가능성은 낮으며, 이에 따라 긴 표적 DNA의 증폭은 역 PCR 및 카세트를 이용한 PCR 모두에서 필요하다. 따라서, 본 발명자들은 자가 연결 상태를 최적화하고 TaKaRa LA PCR Kit(다카라 슈조 (주)에서 제조)를 사용함으로써 짧은 DNA 사슬만을 증폭할 수 있는 통상적인 방법이 개선되어 약 2 kbp 길이이상의 큰 DNA를 효과적으로 증폭할 수 있다는 것을 알게 되었다.
또한, 본 발명자들은 두 단계 PCR 방법을 발견하였는데, 이 경우 일차 PCR의 반응 용액은 목적 DNA 단편을 효과적으로 증폭하기 위해서 희석되어 이차 PCR 주형으로 사용되며, 이에 따라 상기 언급한 문제들을 해결할 수 있었다.
예를 들면, 아즈키 콩 잎으로부터 제조된 게놈 DNA를 제한효소 Hind Ⅲ로 완전히 분해한 후, T4 DNA 리가아제 (다카라 슈조 (주)에서 제조)로 자가 연결하였다. 자가 연결 반응 효율은 반응 시스템의 부피에 따라 크게 달라질 수 있으므로, DNA 농도를 4㎍/㎖ 미만으로 만들기 위하여 반응 시스템의 부피를 조정하는 것이 바람직하다.
수득된 사이클릭 게놈 DNA를 주형으로 사용하여 PCR을 수행한다. 사용되는 프라이머의 예로는 프라이머 VAN-UH1 (SEQ ID NO 21), VAN-L (SEQ ID NO 22), VAN-UH2 (SEQ ID NO 23), VAN-L16 (SEQ ID NO 24), VAN-UH3(SEQ ID NO 25) 및 VAN-L3(SEQ ID NO 26)과 같은 서열을 들 수 있으며, 이들은 상기 언급된 pVXG303의 EXT 유전자 게놈 DNA 서열 (SEQ ID NO 18 및 SEQ ID NO 19)에 기초하여 합성된다.
두 단계 PCR 방법은 목적 DNA 단편을 효과적으로 증폭하는데 효과적이다. 예를 들면, 프라이머로서 상기 언급된 프라이머 VAN-UH1 (SEQ ID NO 21) 및 VAN-L (SEQ ID NO 22)을 사용하여 일차 PCR을 수행한 다음, 생성딘 반응 산물을 주형으로 사용하고 프라이머 VAN-UH2 (SEQ ID NO 23) 및 VAN-L2(SEQ ID NO 26)을 사용하여 이차 PCR을 수행함으로써 약 1.8 kbp의 DNA 단편을 증폭할 수 있다.
그러나, 만약, 일차 PCR이 상기 언급된 바와 같은 방식으로 수행된 후, 이차 PCR이 프라이머로서, 프라이머 VAN-UH2 (SEQ ID NO 23), VAN-L16 (SEQ ID NO 24), VAN-UH3 (SEQ ID NO 25), VAN-L3 (SEQ ID NO 26)을 사용하여 수행된다면, 증폭은 비효율적이다. 즉, 증폭 효율은 프라이머의 선택에 따라 달라질 수 있다. 따라서, 몇가지 조합에서 가장 적합한 프라이머 조합을 찾아 내는 것이 바람직하다.
PCR 반응은 반응 온도 및 사이클 조건을 제외하고는, TaKaRa LA PCR Kit (다카라 슈조 (주)에서 제조)의 프로토콜 (protocol)에 의해 수행된다. 그러므로, 일차 PCR에서는 50㎕의 반응 용액을 사용하여 94℃(0.5분), 55℃(1.0분) 및 72℃(2분)에서 30 사이클을 수행한 다음, 이차 PCR을 동일한 조건하에서 수행한다. 이때, 이차 PCR에 첨가되는 최적의 양을 찾아 내기 위해서 일차 PCR 반응 용액의 몇가지 희석 용액을 제조하는 것이 바람직하다.
약 1.8kbp의 증폭된 산물은, 예를 들면, pUC119(다카라 슈조 (주)에서 제조)의 Hind Ⅱ부위로 서브클로닝할 수 있다. 그 단편의 양 말단의 뉴클레오타이드 서열을 미리 일부 클로닝된 상기 EXT 유전자 게놈 DNA 서열 (SEQ ID NO 18 및 SEQ ID NO 19)과 비교하여 당해 단편이 선행 서열에서 계속된 EXT 유전자의 프로모터를 함유하는 DNA 단편인지 여부를 밝혀내었다. 제2는 그 단편의 제한 지도를 나타낸다. 그 단편의 뉴클레오타이드 서열은 서열 목록 SEQ ID NO 27에 나타내었다. 이 PCR 생성물이 혼입된 플라스미드를 pVXP-H3명명하고, pVXP-H3로 형질 전환된 대장균 JM109 균주를 대장균 JM109/pVXP-H3로 명명하였으며, 부다페스트 조약에 의거하여 1995년 2월 17일 (원기탁일)자로, National Institute of Bioscience and Human-Technology, Agency of Industrial Science and Technology, Ministry of Industrial Trade and Industry (일본국, 305, 이바라기-켄, 쭈쿠바-시, 히가시 1-초메, 1-3)에 수탁 번호 FERM BP-5388으로 기탁하였다.
서열 목록중의 SEQ ID NO 1 및 SEQ ID NO 2는 서열 목록에 있는 SEQ ID NO 27과 함께 SEQ ID NO 19로 구성된 EXT의 N-말단 아미노산 서열을 코드화하는 유전자 상류의 뉴클레오타이드 서열을 나타낸다.
뉴클레오타이드 서열을 분석하고 서열 목록에 있는 SEQ ID NO 1과 SEQ ID NO 2을 비교한 결과, SEQ ID NO 1의 782번 잔기 A의 하류 및 SEQ ID NO 2의 잔기 A의 하류 모든 부분에서 단지 두가지 차이점만을 제외하고는 양 서열이 완전히 동일함을 알아내었다. 첫번째 차이점은 SEQ ID NO 1의 829번 잔기 A의 하류 및 SEQ ID NO 2의 921번 잔기 A의 하류에 계속된 A 잔기 수가 다른 것이고(SEQ ID NO 1에서는 16개의 염기이고 SEQ ID NO 2에서는 14개의 염기 임), 두 번째 차이점은 SEQ ID NO 1의 947번 잔기가 T인 반면 SEQ ID NO 2의 1037번 잔기가 C라는 것이다. 이와 같은 관찰 결과, 이 공통적인 부위가 식물 세포벽 자일로글루칸의 재구성에 필요한 부위 및 단계에서 특정 발현을 조절하는 영역을 함유하는 것으로 밝혀 졌다.
패밀리 유전자의 프로모터 영역을 포함한 DNA 단편도 EXT 유전자의 프로모터 영역을 포함한 DNA 단편을 클로닝하는 방법에서와 같은 방식으로 문제를 해결함으로써 클로닝할 수 있다. 또한, 생성되어 클로닝된 단편과 식물 세포벽 자일로글로칸의 재구성에 필요한 부위 및 단계에서 특이적으로 발현됨이 확실한 일부 패밀리 유전자의 단편을 비교함으로써 식물에서 조직-특이성 발현에 필요한 영역을 확할 수 있었다. 또한, 동일한 방식으로 배양 세포의 대수기에 특히 강하게 발현시키기 위해서 필요한 영역을 확인할 수 있었다.
[발현 부위 및 발현 단계의 측정-노던(Northern) 혼성화]
프로모터에 의한 발현을 분석하기 위해서, 예를 들면, 아즈키 콩 식물에서의 발현 부위 및 발현 단계는 탐침으로서 아즈키 콩의 EXT 유전지 cDNA를 사용하여 노던 혼성화를 수행함으로써 측정할 수 있다. 또한, 예를 들면, 담배 배양 세포에서의 발현 단계는 탐침으로서 담배 EXT 유전자 cDNA를 사용하여 노던 혼성화를 수행함으로써 측정할 수 있다.
아즈키 콩의 EXT 유전자 cDNA 및 담배의 EXT 유전자 cDNA는, 예를 들면, EP-0562836 Al (1993) 및 JP 7-79778 A에 언급된 방법에 따라 클로닝할 수 있다.
아즈키 콩 식물 및 담배 배양 세포와 같은 식물 조직으로부터의 DNA 추출은, 예를 들면, 구아니딘 티오시아네이트 방법 또는 페놀-SDS 방법에 의해 수행될 수 있다. 추출된 총 RNA는, 예를 들면, 아가로즈 겔 전기영동을 수행하여 분석한 후 막에 옮긴 다음, 이 막을 사용하여 혼성화를 수행할 수 있다. 예를 들면, 아가로즈 겔 전기영동하여 rRNA 수준을 비교함으로써 총 RNA 수준을 같은 수준으로, 제조할 수 있으며, 이에 따라 발현된 EXT 유전자 mRNA의 수준을 정확히 비교하는 것이 가능해졌다.
예를 들면, 파종후 40일동안 자란 아즈키 콩 식물의 줄기, 싹 및 잎으로부터 구아니딘 티오시아네이트 방법에 의해 총 RNA를 추출하여 아가로즈 겔 전기영동을 한 후, 탐침으로서 다른 패밀리 유전자 cDNA와는 상이한 EXT 유전자 cDNA에 특이적인 뉴클레오타이드 서열을 가진 DNA를 사용하여 노던 혼성화를 수행하였다. 이 경우, 혼성화 후에 얻어진 여과지를 EXT 유전자 cDNA에 특이적이 뉴클레오타이드 서열을 가진 상기 언급된 탐침이 다른 패밀리 유전자 mRNA와 쌍을 이루지 아니하고 표적 EXT 유전자의 mRNA와만 쌍을 이룰 수 있는 강도의 조건하에 세척함으로써, 목적 EXT 유전자의 발현만을 감지할 수 있었다. 또한 그러한 발현은 mRNA의 크기에 의해 확인할 수 있었다. 각 식물 조직에서의 EXT 유전자 mRNA의 수준을 비교한 결과, EXT 유전자의 mRNA는 모든 부위에서 발현되며, 특히 식물 세포벽 자일로글루칸의 재구성이 활발한 줄기에서 강하게 발현되는 것으로 밝혀졌다. 또한, 아즈키 콩 새싹의 총 RNA를 1-cm길이로 자른 상배축에서 추출하여 아가로즈 겔 전기영동으로 분석한 후, 탐침으로서 EXT 유전자 cDNA를 사용하여 노던 혼성화를 수행하였다. 이 방법으로, 상배축의 성장이 왕성한 부위, 즉 식물 세포벽 자일로글루칸의 재구성이 활발한 부위에서 가장 강하게 발현됨을 밝힐 수 있었다.
상기 언급된 바와 동일한 방식으로, 각각의 패밀리 유전자에 대한 발현부위는 각 패밀이 유전자에 특이적인 탐침을 사용하여 노던 혼성화를 수행함으로써 명백히 한정될 수 있다.
각각의 담패 BY2 배양 세포[Fermentation Technology Today, p. 689 참조, 1972년 NIHON HAKKOU KOUGAKUKAI (Japan Fermentation Technology Society)에서 발행]를 1,4,6,8 및 10일 동안 배양하고 흡입 여과(suction filteration)에 의해 회수한 후, 즉시 액체 질소를 이용하여 급냉동한 다음, RNA 추출을 수행할 때까지 -80℃를 유지하였다. 페놀-SDS 방법에 의해 이러한 세포로부터 추출된 총 RNA를 아가로즈 겔 전기 영동으로 분석한 후, 탐침으로서 담배 EXT 유전자 cDNA에 특이적인 서열을 가진 DNA를 사용하여 노던 혼성화를 수행하였다. 발현을 비교함으로써 언제나 발현되며, 특히 대수기 (4일)에 강하게 발현됨을 알 수 있었다. 또한, 반대로, 패밀리 유전자인 담패 XRP1 유전자는 정지기에 강하게 발현되며 대수기에는 그리 강하게 발현되지는 않는다는 것을 알 수 있었다.
[RT-PCR에 의한 발현 부위 및 발현 단계의 확인]
또한, RT(역전사 효소)-PCR 방법은 이러한 EXT 유전자의 패밀리 유전자 프로모터에 의해 조절되는 발현을 단순히 분석하는데 사용될 수 있다.
예를 들면, 파종 후 40일 동안 자란 아즈키 콩 식물의 줄기, 싹 및 잎을 각각 회수하고, 즉시 액체 질소로 급냉동시킨 다음 RNA 추출을 수행할 때까지 -80℃에서 보관하였다. 이들 조직으로부터, 예를 들면, 구아니딘 티오시아네이트 방법에 의해 총 RNA를 추출하였다. 각각의 총 RNA는 발현 부위를 확인하기 위하여 TaKaRa RNA PCR Kit (TAKARA SHUZO Co., Ltd.)를 이용한 RT-PCR에서 주형으로서 사용될 수 있다. 이 경우, 각 패밀리 유전자 프로모터에 의해서 조절되는 발현 부위 특이성은 프라이머로서 각각의 패밀리 유전자에 특이적인 서열을 사용하여 확인할 수 있다.
예를 들면, 파종 후, 5일 동안 암실에서 자란 아즈키 콩식물의 상배축을 1cm 길이 절편으로 분리 회수한 후, 즉시 액체 질소로 급냉동하여 RNA 추출을 수행할 때가지 -80℃에서 유지하였다. 이들 조직으로부터, 예를 들면, 구아니딘 티오시아네이트 방법에 의해 추출한 각각의 총 RNA는 발현 부위 및 단계의 특이성을 좀 더 자세히 확인하기 위하여 TaKaRa RNA PCR Kit (TAKARA SHUZO Co., Ltd.)를 이용한 RT-PCR에 주형으로서 사용될 수 있다.
예를 들면, 0,1,2,4,6,8 및 10일 동안 배양된 BY2 배양 세포를 흡입 여과에 의해 회수하고, 즉시 액체 질소를 이용하여 급냉동한 후, RNA 추출을 수행할 때까지 -80℃를 유지하였다. 페놀-SDS 방법에 의해서 이러한 세포들로부터 추출된 각각의 총 RNA는 발현 단계를 확인하기 위하여 TaKaRa RNA PCR Kit (TAKARA SHUZO Co., Ltd.)를 이용한 RT-PCR에 주형으로서 사용될 수 있다. 이 경우, 각 패밀리 유전자 프로모터에 의해서 조절되는 발현-단계 특이성은 프라이머로서 각각의 담패 EXT 유전자 및 그의 패밀리 유전자에 특이적인 서열을 사용하여 확인될 수 있다.
[유전자의 직접적인 전달 및 GUS-활성 측정-일과성 에세이 (Transient Assay)]
상기 언급된 프로모터를 포함한 전(full) 길이 또는 일부의 서열을 절단하여 다양한 리포터 유전자에 연결함으로써 키메라 유전자를 제조하였다. 프로모터 활성은 그러한 키메라 유전자를 식물 세포로 직접 전달하여 측정되었다.
리포터 유전자는 유전자의 프로모터 활성 또는 다른 시스-성분의 작용을 조사하기 위하여 목적 유전자의 프로모터 영역의 하류에 연결시킨 유전자를 의미한다. 키메라 유전자로 형질 전환된 세포는 대장균과 동일하거나 유사한 효소 활성을 가지지 않기 때문에, 원칙적으로 대장균에서 유래한 효소 유전자의 코드화 영역을 리포터로 이용하였다.
식물의 경웨 있어서 리포터 유전자의 예로 대장균 유래의 GUS 유전자, 클로르암페니콜 아세틸트랜스퍼라아제 (CAT), β-갈락토시다제 (lacZ), 네오마이신 포스포트랜스퍼라제 (NPT Ⅱ), 루시퍼라제 등을 들 수 있으며, 이 중에서도 대장균에서 유래한 GUS 유전자가 최근에 특히 많이 이용되고 있다.
GUS 활성은 4-메틸언벨리페릴글로쿠로니드 (4-MUG, WAKO Pure Chemicals Industries. Ltd.)를 기질로 이용하고 그의 생성물인 4-메틸언벨리페론 (4-MU, nacalai tesque)으로부터 방출되는 특이적 형광을 측정하여 에세히 하였다. 4-MU는 상당히 안정하고 배경 형광이 적기 때문에 4-MU의 측정은 쉽게 수행될 수 있다. 또한, 5-브로모-5-클로로-3-인돌릴-β-D-글로쿠루니드 (X-Gluc, Molecular Probes)가 기질로 사용될 때, 그 생성물은 인디고틴이라 불리는 불용성 인디고-블루 색소이므로, 이러한 성질을 이용하여 세포 또는 조직에서의 GUS 활성위치를 쉽게 조사할 수 있다.
프로모터 활성은 예를 들면, pBI121 (Clontech) 및 pBI221(Clontech)에 포함된 꽃양배추 모자익(cauliflower mosaic) 바이러스 35S 프로모터를 사용하여 비교할 수 있다.
리포터 유전자의 하류에 전사-종결 서열이 연결되어 있어서 전자는 효율적으로 종결될 수 있다. 전사-종결 서열은 EXT 유전자 또는 다른 유전자에서 기원할 수 있다. 또한, 전사 효율은 삽입 서열의 하류에 폴리-A 첨가 서열을 연결하여 증가시킬 수 있다. 폴리-A 첨가 서열은 EXT 유전자나 아그로박테리움 옥토핀 합성효소 [The EMBO Journal, 3, 835-846 (1984)] 및 아그로박테리움 노팔린 합성효소[The Journal of Molecular and Applied Genetics, 1, 561-573 (1982)]와 같은 다른 유전자에서 기원할 수도 있다. 그러한 키메라 유전자 카세트는 적당한 벡터에 삽입될 수 있으며 생체로 직접 전달하기 위하여 플라스미드로서 대장균에서 증폭될 수 있다.
이러한 키메라 유전자를 포함한 벡터를 생체에 도입하기 위한 방법으로는 미세주입(microinjection)법 [Molecular General Genetics, 202, 179-185 (1986)참조], 폴리에틸렌 글리콜 방법 [Nature, 296, 72-74 (1982) 참조], 파티클 건(particle gun) 방법[Nature, 327, 70-73 (1987) 참조], 카세트 DNA 또는 RNA를 포함한 작은 세포, 세포, 라이소좀 등과 원형질을 융합하는 방법 [Proceedings of the National Academy of Sciences of the USA, 79, 1859-1863 (1982)], 일렉트로포레이션 방법[Proceedings of the National Academy of Sciences of the USA, 82, 5824-5828 (1985)] 등이 있다.
세포로 전달된 유전자의 처음 수 일 동안의 일과성 전사 발현에 대해 일과정 에세이를 수행함으로써 도입후 1 내지 2일 동안 배양된 세포의 추출물에서 발현 생성물을 분석할 수 있다.
대장균에서 증폭될 수 있는 플라스미드 벡터는 꽃양배추 모자익 바이러스 35S 프로모터, 대장균 유래의 GUS 유전자 및 노팔린 합성효소에서 기원한 전사 종결 서열을 가진 pBI121 (Clontech)에 의해서 예시될 수 있다. 플라스미드내의 꽃양배추 모자익 바이러스 35S 프로모터 영역을 제거하기 위하여, 이 플라스미드를 제한효소 Hind Ⅲ 및 Xba I (다카라 슈조 (주))으로 분해하고 아가로즈 겔 전기영동을 수행한 후, 35S 프로모터가 제거된 목적 단편을 절단한다. EXT 유전자의 프로모터 영역을 포함한 DNA 단편을 이 정제된 부위로 도입시킬 수 있다.
이렇게하여 EXT 유전자의 프로모터 영역을 포함하도록 제조된 DNA 단편 및 GUS 유전자의 키메라 유전자를 포함한 벡터는, 예를 들면 일렉트로포레이션 방법에 의해 담배 BY2 배양 세포로 전달될 수 있다.
일렉트로포레이션 방법을 이용하여 담배 BY2 배양 세포로 도입시키기 위하여, 담배 BY2 배양 세포를, 예를 들면 1% 셀룰라제-오노즈카(ONOZUKA) (Yakult Honsha Co., Ltd), 0.1% 펙톨리아제 (pectolyase) Y23 (SELSHIN Corporation) 및 0.4M 만니톨을 포함한 효소 용액 (pH: 5.5)으로 30℃에서 2시간 동안 처리하여 세포벽이 제거된 원형질 세포로 전환시킬 수 있다. 일렉트로포레이션 완충 용액 (70mM KCl, 1.5mM MES 및 0.3M 만니톨)내에 상기 수득된 담배 BY2 배양 세포의 원형질 2×106을 현탁시킨 현탁액을 3 pmol의 벡터 DNA 및 10% PEG6000/일렉트로포레이션 완충 용액과 혼합한다. 생성된 혼합물에 예를 들면, 유전자 펄서(Pulser) Ⅱ(Bio-Rad Laboratories)를 사용하여 전기 펄스(300V, 125μ/F)를 가함으로써 식물 세포로 DNA를 전달한다. 유전자 도입 후, 0.2㎎/ℓ 옥신으로서 2.4-D, 1% 수크로오스 및 0.4M 만니톨을 함유한 린스마이에르스쿡(Linsmaier-Skoog) 배양배지[Physiologia Plantarum, 18, 100 (1965)]에서 세포를 26℃에서 1 내지 2일 동안 배양한다. 세포를 추출하여 추출물내의 GUS 발현 산물을 형광 분석에 의해 측정할 수 있다. 다시 말하면, GUS의 특히 활성을 결정하기 위하여, 200㎕의 추출물 완충액[50mM 포스페이트 완충액 (pH 7.0), 10mM EDTA, 0.1% 트리톤 X-100, 0.1% 사르코실 및 10mM 2- 머캅토에탄올]에서 내의 회수된 세포 혼합액을 에펜돌프 튜브에 넣어 초음파처리하고 원심 분리하여 분리된 상등액에 대해 GUS 활성을 에세이하고 그 단백질량을 정량한다.
GUS 활성은, 예를 들면, 4-MUG가 기질로 사용되는 경우 생성되는, 4-MU에 의해 방출되는 특이 형광(여기 파장: 365nm; 형광 파장; 455nm)을 측정하여 에세이한다. 즉, 45㎕의 추출물 완충액 및 25㎕의 4mM 4-MUG를 96-웰 마이크로타이터 플레이트에 넣은 각 30㎕의 추출물에 첨가하여 반응시킨다. 5, 35 및 95분 후, 50㎕의 반응-종결 용액 (1M Na2CO3)을 가하여 반응을 종료시킨다. 다음, 4-MU에 의해 방출된 특정 형광(여기 파장: 365nm; 형광 파장: 455nm)을 형광 플레이트 리더로 측정하여 4-MUG가 기질로 사용할 때의 산물인 4-MU를 에세이한다.
또한, 단백질은 하기에 예시된 과정에 따라 정량한다. 즉, 2,5,10,15,20 및 30㎕의 1/5로 희석된 추출물 용액이나 800㎍/㎖의 BSA 표준 용액(추출물 완충액 20㎕를 1mg/ml의 BSA 80㎕ 와 혼합한 것)을 96-웰 마이크로타이터 플레이트에 넣고 여기에 각각 158, 155, 150, 145, 140 및 130㎕의 증류수 및 바이오-라드 단백질 에세이 키트 (Bio-Rad Laboratories)에 에세이 시약 40㎕를 가하여 각종 총 부피 200㎕로 만든다. 천천히 교반한 후, 20분 동안 실온에 방치한 다음, 단백질을 정량하기 위하여 그 혼합액을 플레이트 리터 (파장: 590nm)로 60분안에 측정한다. 상기 에세이를 수행함과 동시에, 4-MU 표준 용액의 형광 강도를 측정하고 그 결과를 x-축에는 4-MU 의양(pmol)을 표시하고 y-축에는 형광 강도를 표시한 그래프에 도시한다. 기울기로부터 형광 단위 유니트 당 4-MU 양을 구한다. 또한, 형광 강도의 증가율 및 GUS 활성과 동일한 4-MUG의 해리율을 구하기 위해, 시료에 대한 결과를 x-축에는 시간(분) 결과를 표시하고 y-축에는 형광강도를 표시한 그래프에 도시한다. 또한, GUS의 특이 활성은 단백질의 양으로부터 구할 수 있다.
이 방법으로, EXT 유전자 프로모터 영역을 포함한 DNA 단편이 식물에서 높게 발현된다고 알려져 있는 꽃양배추 모자익 바이러스 35S 프로모터 보다 더 강한 활성을 나타냄을 확인할 수 있다.
[형질 전환된 식물]
형질 전환체를 제조하기 위하여, 상기 수득된 EXT 유전자 프로모터 영역을 포함한 DNA 단편 및 GUS 유전자의 키메라 유전자가 삽입된 벡터를 식물이나 식물 세포에 전달한다.
키메라 유전자가 삽입된 벡터로 형질 전환된 식물이나 식물 세포의 선별을 촉진하기 위하여 선택적인 마커(marker) 유전자를 함유하는 것이 바람직하다. 예를 들면, 항생제에 대한 내성을 제공하는 유전자(항생제-내성 유전자)를 선택적인 마커 유전자로 사용할 수 있다. 그러한 유전자로는 G418, 하이그로마이신(hygromycin), 블레오마이신(bleomycin), 카나마이신(kanamycin), 젠타미신(gentamincin), 및 클로르암페니콜(chloramphenicol) 등이 있다. 항생제-내성 유전자가 벡터에 혼입된 경우, 형질 전환된 식물이나 식물 세포, 즉, 그런 카세트가 전달된 식물이나 식물 세포는 항생제를 함유한 배양액에서 자라는 식물이나 식물 세포를 채집함으로써 쉽게 선별할 수 있다.
키메라 유전자가 삽입된 벡터를 직접 식물에 도입시키는 방법으로는 미세주입법, 폴리에틸렌 글리콜 방법, 파티클 건 방법, 벡터를 포함한 작은 세포, 세포, 라이소좀 등과 원형질을 융합하는 방법, 일렉트로포레이션 방법 등이 있다.
또한, 벡터로서 식물 바이러스를 사용하여서도 키메라 유전자를 식물로 전달할 수 있다. 예를 들면, 꽃양배추 모자익 바이러스를 식물 바이러스로로 이용할 수 있다. 즉, 먼저 바이러스 게놈을 대장균에서 유래한 벡터에 삽입시켜 재조합체를 제조한 후, 그러한 카세트를 바이러스 게놈에 삽입시킨다. 제한 효소를 사용하여 상기 재조합체로부터 변형된 바이러스 게놈을 절단해 낸 다음 식물에 게놈을 접종함으로써 이 카세트를 식물에 삽입시킬 수 있다(1932년 아카데믹 프레스에서 발행된 Molecular Biology of Plant Tumors, pp. 549-560 및 미합중국 특허 제 4,407,956호 참조).
또한, 그러한 카세트는 아그로박테리움(Agrobacterium) 속 박테리아의 성질, 즉, 식물에 감염시키는 경우 그 플라스미드 DNA의 일부가 식물 게놈내로 절단되는 성질을 이용하여 식물에 전달될 수 있다.
아그로박테리움 속의 아그로박테리움 튜메페션스(Agrobacterium tumefaciens)를 식물에 감염시키면 왕관형의 상처가 생기며, 아그로박테리움 리조게네스(Agrobacterium rhizorgenes)를 식물에 감염시키면 털모양의 뿌리가 유도되는데, 이는 박테리아가 식물을 감염시킬 때 Ti 플라스미드나 Ri 플라스미드로 불리는 박테리아 플라스미드내의 전달된 DNA 영역으로 일컬어지는 영역이 식물내로 전달되어 식물 게놈에 통합되었기 때문이다. 또한, Ti 플라스미드 또는 Ri 플라스미드내에는 vir-영역이라 불리는 다른 영역이 있는데, 이는 T-DNA 영역이 식물로 전달된 다음, 식물에 통합되기 위해 필요하다. vir-영역 자체는 식물로 전달되지 않으며, 또한 vir-영역은 T-DNA 영역이 포함되지 않은 플라스미드에서도 작용할 수 있다 [Nature, 303, 179-189 (1993) 참조].
식물 게놈에 통합시키고자 하는 목적 DNA가 Ti 플라스미드나 Ri 플라스미드의 T-DNA 영역에 삽입되어 있다면, 아그로박테리움 속의 박테리아가 식물을 감염시킬 때 목적 DNA는 식물 게놈에 통합될 수 있다. 따라서, Ti 플라스미드 또는 Ri 플라스미드내의 T-DNA 영역에서 왕관형 상처를 털 모양의 뿌리를 유도하는 부분이 목적하는 전달 기능에 대한 손상없이 제거된다면, 생성된 플라스미드를 벡터로 이용할 수 있다. 그러한 다양한 벡터가 본 발명에 이용될 수 있다. 예를 들면, 식물로 하기 키메라 유전자를 전달하기 위하여, 이원(binary) 벡터로 불리는 pBI121 (clontech)에서 pB121의 꽃양배추 모자익 바이러스 35S 프로모터에 연결된 GUS 유전자 부위를 EXT 유전자 프로모터 영역 및 GUS 유전자를 가진 키메라 유전자를 포함한 DNA 단편으로 대체한다. 이 경우, 음성 대조군으로서 프로모터가 없는 GUS 유전자를 가진 벡터(PBI101, clontech), pBI121 (clontech) 등을 동시에 사용하면, 꽃양배추 모자익 바이러스 35S 프로모터의 발현 양상과 비교할 수 있다. 그러한 벡터는 vir-영역을 가지고 있지 않기 때문에, 아그로박테리움속의 박테리아는 vir-영역을 가진 또 다른 플라스미드를 포함하는 것이 필요하다.
더구나, 이 벡터는 아그로박테리움 속의 박테리아 뿐만 아니라, 대장균에서 도 증폭될 수 있다. 따라서, Ti 플라스미드의 재조합 작업은 대장균에서도 수행될 수 있다. 또한, 이 벡터는 항생제-내성 유전자를 포함하고 있으므로, 대장균, 아그로박테리움 속의 박테리아 및 식물이 형질 전환될 때, 형질 전환체를 쉽게 선별할 수 있다.
식물이 아그로 박테리움 속의 박테리아에 의해 감염될 수 있고 재생시스템을 확립할 수 있다면, 어떠한 종의 식물에도 형질 전환시킬 수 있다. 대부분의 쌍자엽성 식물은 아그로박테리움 속의 박테리아를 이용하여 형질 전환될 수 있고, 특히, 자연 상태에서 아그로박테리움 속의 박테리아의 숙주인 모든 식물은 시험관에서 형질 전환될 수 있다. 비록 자연 상태에서 곡류를 포함한 단자엽성 식물은 아그로박테리움 속의 박테리아의 숙주가 아니지만 예를 들면, 호밀 [Nature, 325, 274-276 (1987) 참조], 옥수수 [Science, 240, 204-207 (1988)], 벼[Nature, 338, 274-276 (1989)] 등은 시험관내에서 형질 전환될 수 있다.
형질 전환은 (1) 원형질을 사용하고 (2) 조직 절편이나 무처리된 세포를 사용하여 수행할 수 있다. 방법(1)을 이용하는 경우, 형질 전환된 원형질로부터 식물을 재생하는 시스템을 먼저 확립하는 것이 필요하다. 방법(2)를 이용하는 경우 아그로박테리움 속의 박테리아로 조직 절편이나 무처리된 세포를 형질 전환시킨 다음, 식물에서 그들을 재생시키는 시스템을 확립하는 것이 필요하다. 형질전환된 식물은 상기 언급된 형질 전환용 마커를 함유한 배양 배지에서 성장시킴으로써 선별될 수 있다.
식물 종의 차이와 무관하게, 식물 세포로부터 식물을 재생하는 방법은 일반적으로 (1)의 경우에 형질 전환된 원형질의 현탁액으로부터, (2)의 경우에 플레이트에서 형질 전환된 조직 절편 또는 무처리된 세포로부터 찰흔을 유도한 다음 새순을 형성시키는 것이다. 또한, 재생시 사용된 배양액은 다양한 아미노산 이외에도, 오옥신이나 사이토키닌 같은 호르몬을 포함할 수 있다.
목적 카세트가 형질 전환된 식물의 게놈이나 삽입 되었는지를 서던 혼성화 등에 의해 확인할 수 있는 반면에, 리포터 유전자 mRNA가 식물에서 형성되었는지는 노던 혼성화 등에 의해 확인할 수 있다.
상기 언급된 바에 따라 제조된 키메라 유전자가 삽입된 식물을 이용함으로써, 키메라 유전자는 접합에 의해 식물의 다음 세대에 전달될 수 있다.
예를 들면, EXT 유전자 프로모터 영역을 포함한 DNA 단편과 본 발명에 의해 얻어진 GUS 유전자와의 키메라 유전자를 포함한 플라스미드는 pBI121(clontech)로 작제될 수 있다. 다음, 적제된 플라스미드를 이용하여 아그로박테리움 투메페션스 LBA4404 균주 [Nature, 303, 179-180 (1983) available from clontech]와 같은 아그로박테리움 속의 적당한 균주를 형질 전환시킨 다음 식물을 형질 전환시키기 위하여 목적 식물을 형질 전환체로 감염시킨다.
예를 들면, 통상적인 과정에 따라서 아라비돕시스(Arabidopsis) 종자(노틀링햄 아라비돕시스 스톡 센터(Notlingham Arabidopsis Stock Center : NASC)를 MSO 프레이트 [MURASHIGE-skoog 무기염 혼합물(WAKO Pure Chemicals Industries., Ltd.)을 2% 수크로오스, 3㎎/ℓ 티아민 염산염, 5㎎/ℓ 니코틴산 및 0.5㎎/ℓ 피리독신 염산과 혼합하여 pH 6.3으로 맞춘 후, 0.2% 겔란 검(gellan gum)과 혼합하여 멸균한 다음, 플레이트를 만든다]상에서 무균 상태로 배양한 다음, 뿌리의 절편을 절단하여 CIM 플레이트(0.5㎎/1의 2, 4-디클로로페녹시아세트산 및 0.05㎎/ℓ 키네틴을 MSO 플레이트에 첨가한다)상에서 찰흔 배양한다.
앞서 말한 키메라 유전자를 포함한 플라스미드에 의해 형질 전환된 아그로박테리움 및 pBI121과 pBI101에 의해 형질 전환된 아그로박테리움을 각각 배양하고 희석된 혼합액을 튜브에 분배하였다. 다음, 찰흔을 형성한 뿌리의 절편을 여기에 담그고 며칠 동안 CIM 플레이트상에서 함께 공 배양한다. 각각의 박테리아 균주가 가시적으로 충분히 자랐을 때, 그들을 박테라이에 특이적인 항생제로 죽이고 뿌리절편은 며칠 더 SIMC 플레이트 [MSO 프레이트에 2-ip [N6-(2-이소펜테닐)아데닌 (WAKO Pure Chemicals Industries., Ltd.)의 최종 농도가 5㎕/㎖, IAA(3-인돌아세트산, WAKO Pure Chemicals., Ltd.)의 최종 농도 가 0.15㎍/㎖, 및 클라포란(Claforan, Hoechst)의 최종 농도가 500㎍/㎖로 되도록 가한다]상에서 배양한다. 생성된 절편은 마지막으로 SIMCS 플레이트(카나마이신을 함유한 SIMC 플레이트)에서 배양면서 계속하여 매주 새로운 플레이트에 옮긴다. 형질 전환된 절편은 팽창된 덩어리를 형성하면서 성장하고 반면에 형질 전환 되지 않은 절편은 갈색으로 된다. 그 형질 전환체는 장미 매듭형 잎이 형성될 때까지 배양하고 형질 전환체의 기부는 찰흔 부분이 포함되지 않도록 외과용 칼로 절단하여 RIM 플레이트(MSO 플레이트에 IAA를 최종 농도가 0.5㎍/㎖ 되도록 가한다)로 옮긴다. 8 내지 10일 후, 무기염 배양 배지[하이포넥(Hyponecks)(Hyponecks Japan)을 물로 1000배 희석한다]에 잠긴 락-파이버 미니-박스(rock-fiber mini-box)(NITTO BOUSEKI Co., Ltd.)에서 계속 배양한다. 개화하고 깍지를 맺은 후, 종자를 얻기 위하여 식물을 무기염 배양 배지에 잠긴 토양으로 옮긴다. 이 종자를 멸균하여 MSK 플레이트(MSO 플레이트에 카나마이신을 최종 농도가 500㎎/ℓ이 되도록 가한다)에 파종하고 발아시킨다.
형질 전환의 발생 여부는 통상적인 방법으로 형질 전환체에서 DNA를 추출하고, 제한효소 Hind Ⅲ 및 EcoR I으로 DNA를 분해하고, 제한효소 Hind Ⅲ 및 EcoR I으로 pVXP-H3을 분해하여 제조된 프로모터 영역을 탐침으로 사용하여 서던 혼성화를 수행함으로써 확인할 수 있다. 즉, 상기 과정이 (1) 형질 전환되지 않은 WS 균주 (2) 키메라 유전자가 도입된 형질 전환체 (3) 벡터 pBI121만이 도입된 형질 전환체에서 수행되었을 때, (1) 내지 (3)에서 공통으로 나타나는 내재적인 시그날 외에 약 1.8kbp의 특정 시그날이 제한효소 Hind Ⅲ 및 EcoR I으로 분해된 샘플 (2)에서 관찰되었으며, 이에 의해 EXT 유전자 프로모터를 포함한 DNA가 (2)에 통합되었음을 확인하였다.
그렇게 얻어진 형질 전환체에 대해 기질 X-Gluc를 사용하여 GUS 활성을 에세이하면 불용성 인디고-블루 색소인 인디고틴이라 불리는 생성물의 성질을 이용하여 세포나 조직내의 GUS 활성의 위치를 쉽게 조사할 수 있다. 즉, 멸균된 종자를 MSK 플레이트(MSO 플레이트에 카나마이신의 최종 농도가 50㎎/ℓ가 되도록 가한다)에 파종하고 발아하여 얻어진 어린 식물을 2mM DTT를 포함한 물에 가하고, 감압하에 공기를 뺀 후 GUS 반응 용액[1mM X-Gluc, 50mM 포스페이트 완충액(pH 7.0), 및 20% 메탄올]에 옮겨 37℃에서 0.5 내지 4시간 동안 반응시킨다.
반응이 완성되면, 에탄올을 가하여 반응을 종료시키고 클로로필같은 색소를 제거하고, 식물을 에탄올로 두세번 세척하여 3시간 내지 밤새도록 방치한 다음, 물이 충진된 페트리 디쉬에 옮긴다. 그 식물을 슬라이드 글래스에 놓고 자리를 잡도록 70% 하이드로스 글리세롤을 1 내지 2방울 가한 다음, 커버글래스로 누른 후 현미경으로 관찰한다. 상기 과정을 (1) 0형질 전환되지 않은 WS 균주 (2) 키메라 유전자가 도입된 형질 전환체 (3) 벡터 pBI121만이 도입된 형질 전환체에 대해 수행하면, 한결같지는 않을지라도, (2)에서 길게 성장한 조직 부분이 파란색으로 염색되는 반면에 (1)의 조직은 전혀 염색되지 않으며, (3)의 모든 조직이 염색되는 것으로 관찰된다.
하기에 예시된 과정은 본 발명의 식물 프로모터와 혼성화 할 수 있으며, 또한 식물, 식물 세포 및 식물 세포로 부터 재생된 트랜스제닉 식물중 적어도 하나에서 프로모터 활성을 가지는 프로모터를 수득하는 과정에 적용될 수 있다.
먼저, 통상적인 방법에 따라 목적 유전자 원료에서 얻은 크로모좀 DNA를 플라스미드나 파아지 벡터에 연결하여 숙주에 전달함으로써 라이브러리를 제조한다. 이 라이브러리를 플레이트에서 배양하여 자란 콜로니 또는 파아지를 니트로셀루로오스나 나일론 막에 붙여 DNA를 변성시켜 고정시킨다. 미리32P 등으로 표지한 다음 탐침(서열 목록에 있는 SEQ ID NO 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7 및 8에 나타낸 뉴클레오타이드 서열 또는 그의 일부 유전자에 의해 예시된 탐침)을 포함한 용액에서 막을 가온시켜 막위의 DNA를 탐침과 혼성화시킨다. 예를 들면, 막에 고정된 DNA를 65℃에서 20시간 동안 6×SSC, 1% 소디움 라우릴 설페이트, 100㎍/㎖의 연어 정자 DNA 및 5×덴하트 용액(소 혈청 알부민, 폴리비닐 피롤리돈 및 피콜을 각각 1% 농도로 함유)을 함유한 용액에서 탐침과 혼성화시킨다. 혼성화 후, 비특이적인 흡착을 세척하여 제거하고 탐침과 혼성화된 클론을 자가방사사진 등에 의해 확인한다. 이 과정을 한 개의 혼성화된 클론을 얻을 때까지 반복한다. 목적 식물 프로모터를 얻어진 클론에 삽입시킨다.
이 유전자가 목적 식물 프로모터임을 확인하기 위하여 생성된 유전자의 뉴클레오타이드 서열을 예를 들면, 하기 방법으로 결정한다.
혼성화에 의해 얻어진 클론의 뉴클레오타이드 서열을 결정하는 경우, 재조합체로서 사용된 대장균을 시험관 등에서 배양하고 플라스미드를 통상적인 방법에 의해서 추출한다. 제한 효소로 분해한 후, 삽입된 단편을 M13 파아지 벡터에 서브클로닝한 다음, 디데옥시 방법에 의해 뉴클레오타이드 서열을 결정한다. 재조합체가 파아지인 경우, 뉴클레오타이드 서열은 기본적으로 동일한 방법에 따라 결정할 수 있다. 배양에서 뉴클레오타이드 서열 분석까지의 기본적인 실험 방법은 Molecular Cloning, A Laboratory Manual(T. Maniatis et al., Cold Spring Harbor Laboratory Press에서 1989년에 발행) 등에 언급되어 있다.
수득된 유전자가 목적 식물 프로모터임을 확인하기 위하여, 결정된 뉴클레오타이드 서열을 본 발명의 식물 프로모터 서열 및 서열 목록 SEQ ID NO 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7 및 8에 나타낸 뉴클레오타이드 서열과 비교하고 유전자의 구조를 추론하였다.
수득된 유전자가 식물 프로모터 영역을 전부 포함하고 있을 경우, 수득된 유전자에 기초하여 합성 DNA 프라이머를 제조한 다음, PCR에 의해 결손된 영역을 증폭하고, 수득된 유전자 단편을 탐침으로 이용하여 DNA 라이브러리를 추가로 선별함으로써 본 발명의 프로모터와 혼성화하는, 전체 식물 프로모터 영역 뉴클레오타이드 서열을 결정할 수 있다.
또한, 본 발명의 식물 프로모터의 뉴클레오타이드 서열에 기초하여, 그 뉴클레오타이드 서열을 포함한 유전자의 싸이트-디렉티드 돌연변이(site-directed mutagenesis)에 의해 유도된 치환, 삽입 및 결손 중 적어도 하나에 의해 일부 뉴클레오타이드 서열을 변형시키면 본 발명의 식물 프로모터의 기능을 변화시킬 수 있으며, 이에따라 본 발명의 식물 프로모터에 유사한 식물 프로모터를 얻을 수 있다. 그러나 싸이트-디렉티드 돌연변이를 수행하는 대한 공지된 방법으로는 갭트 듀플렉스(gapped duplex)방법 [Methods in Enzymology, 154, 350-367(1987) 참조], 우라실을 함유하는 DNA 방법[Methods in Enzymology, 154, 367-387 참조], 아질산염 방법[Proceedings of the National Academy of Sciences of the USA, 79, 7258-7262(1982)참조] 및 카세트 돌연변이 방법[Gene, 34, 315-323(1985)]이 있다.
또한, 본 발명의 식물 프로모터의 뉴클레오타이드 서열에 기초하여, 그 유전자의 뉴클레오타이드 서열 일부를 포함한 유전자를 공지의 식물 프로모터 등의 유전자 또는 이 유전자의 일부와 연결 또는 치환하여 키메라 프로모터[Proceedings of the National Academy of Sciences of the USA, 88, 7266-7270(1991)]을 작게하며, 이에 따라 본 발명의 프로모터와 같이 식물 세포벽 자일로글루칸의 재구성에 필요한 부위 및 단계에서 프로모터 활성을 가지는 식물 프로모터를 수득된한다.
작동할 수 있는 상태에 있는 유용한 유전자의 하류에 식물 프로모터를 연결하고 본 발명의 프로모터에 대해서는 같은 방법으로 프로모터 활성을 에세이함으로써, 그 식물 프로모터가 식물, 식물 세포 및 식물 세포로부터 재생된 트랜스제닉 식물 중 적어도 하나에서 기능하는지 여부를 확인할 수 있다. 또한, 식물 프로모터에 의해 조절되는 발현 부위 특이성을 확인할 수 있다.
본 발명에서 얻은 식물 프로모터가 식물, 식물 세포 및 식물 세포로부터 재생된 트랜스제닉 식물 중 어느 하나로 도입되는 경우, 그 프로모터는 염색체 밖에 보유되는 벡터 또는 염색체내로 통합되는 벡터의 형태로 도입될 수 있다. 염색체에 보유되는 벡터 및 염색체내에 통합되는 벡터는 당해 기술 분야에 공지되어있으며, 예를 들면, 마이크로인젝션 방법, 폴리에틸렌 글리콜 방법, 파티클 건 방법, 벡터를 함유한 작은 세포, 세포, 리소좀 등과 원형질을 융합시키는 방법, 일렉트로포레이션 방법 등에 의해 식물 및 세포로부터 재생된 트랜스제닉 식물로 도입시킬 수 있다. 또한, 벡터는 식물 프로모터의 하류에 위치한 식물 세포벽 자일로글루칸을 재구성하는 기능을 가지는 효소의 N-말단에서 몇개의 아미노산을 코드화하는 유전자가 작동할 수 있는 상태에 있는 유용한 유전자의 상류에서 연결되어 있는 키메라 유전자로 전환될 수 있다.
본 발명에서 얻어진 EXT 유전자 또는 EXT 패밀리 유전자의 프로모터, 또는 프로모터와 혼성화할 수 있는 서열이나 그의 일부 서열을 가진 폴리뉴클레오타이드를 이용하여 작동할 수 있는 상태에 있는 유용한 유전자의 하류에서 연결한 다음, 식물이나 식물 세포로 도입함으로써 본 발명의 프로모터처럼 식물 세포벽 자일로글루칸의 재구성에 필요한 부위 및 단계에서, 식물 형태를 조절하는 특이적 방식으로 유전자 발현을 유도할 수 있다. 예를 들면, 본 발명의 프로모터의 하류에서 기능할 수 있도록 안티센스 RNA, 데코이 등 또는 리보자임을 코드화하는 유전자를 연결시킨 다음, 식물, 식물 세포 및 식물 세포로부터 재생된 트랜스제닉 식물로 도입함으로써 조절이 이루어질 수 있다. 난장이 식물들은 식물 형태를 조절하여 재생될 수 있는, 반면에 수(male)-불임성 식물은 화분관의 길이 생장을 제조될 수 있다. 또한, 신장성/성장성 물기, 식물 세포벽 자일로글루칸의 재구성에 필요한 부위가 식량으로 이용되는 식물에 있어서 식량 또는 사료의 품질이 개선될 수 있다. 더구나, 배양 세포의 대수기나 정지기에 특정 유전자의 발현을 유도함으로써, 예를 들면, 세포 증식의 조절 및 유용한 이차 대사물질의 생산성의 향상을 꾀할 수 한다.
또한, 본 발명에 따르면, 식물 세포벽 자일로글루칸을 재구성하는 위한 기능을 가진 효소를 코드화하는 유전자, 특히 EXT 유전자 또는 그의 기능적 등가물을 코드화하는 유전자를 사용하여 식물 세포벽 자일로글루칸을 재구성하는데 필요한 부위 및 단계에서 프로모터 활성을 가지는 식물 프로모터를 클로닝할 수 있다.
하기 실시예는 본 발명을 더욱 구체적으로 설명하기 위한 것으로서, 본 발명의 범위가 이를 실시예로 한정되는 것은 아니다.
[실시예 1]
엔도-자일로글루칸 트랜스퍼라제(EXT)의 패밀리 유전자(아즈키 콩 EXT 2 및 아즈키 콩 EXT 3)의 분리
(1) 폴리(A)+RNA
비그나 안굴라리스 오위 에 오하쉬, 씨브이. 다카라(Vigna angularis ohwi et Ohashi, cv. Takara)(WATANABE SHUSHI Co., Ltd.)의 종자를 문헌[Phsiologia Plantarum, 82, 490-497(1991) 참조]에 언급된 방법에 따라서 발아되었다.
발아후 1주일 후, 토양 부분의 줄기 및 잎을 절단하여 약 2g의 식물 조직을 얻었다. 이것을 즉시 액체 질소에서 냉동시키고 액체 질소의 존재하에 모터로 갈아서 분말을 제조하여 20㎖의 변성화(denaturation) 용액[7M 구아니딘 티오시아네이트, 25mM 소디움 시트레이트(pH : 7.0), 0.1M 머캅토에탄올 및 2% 소디움 라우로일사르코시네이트]에 현탁시켰다. 그 현탁액을 폴리트론으로 눌러 짠후 10㎖의 변성화(denaturation) 용액 및 30㎖의 페놀/클로로포름 용액 [수 포화된 산성의 페놀 및 클로로포름/이소아밀알콜(49 : 1)의 1 : 1로 혼합물]과 혼합하여 완전히 교반하고, 원심 분리하여 수 층을 분리하였다. 수층을 이소프로필 알콜, 1/10 부피의 3M 소디움 아세테이트 및 1/300 부피의 아세트산과 혼합한 다음, 원심 분리하여 4㎎의 RNA를 침전상태로 얻었다.
이 침전물을 2㎖의 흡착 완충액[20mM 트리스-염산(pH : 7.5), 2mM EDTA, 1M 염화나트륨 및 0.5% SDS]에 용해시키고 올리고(dT)-셀룰로오즈 타입-7 컬럼(Pharmacia)에 흡착시킨 다음, 이를 용리 완충액[10mM 트리스-염산(pH : 7.5) 및 1mM EDTA]으로 용리하여 약 25㎍의 폴리(A)+RNA를 회수하였다.
(2) cDNA 라이브러리의 제작 및 선별
cDNA 합성 키트 시스템-플러스(Amersham)을 사용하고 벡터로서 λgt10 (Stratagene)를 사용하여 문헌(Gene, 25, 263-269(1983) 참조)에 설명된 방법에 따라 실시예 1-(1)에서 수득한 폴리(A)+RNA로부터 cDNA 라이브러리를 제작하였다. 아즈키 콩 EXT 유전자 cDNA [EP-0562836 Al(1993)]를 랜덤 프라이머 표지 키트(Random Primer Labeling Kit)(다카라 슈조즈(주))를 이용하여 [α-32P]dCTP로 표시하여 혼성화를 위한 탐침을 만들었다. 이 탐침의 특이 활성은 7.5×108cpm/㎍이었다. 이 탐침을 이용한 플라크 혼성화 방법을 상기 제작된 cDNA 라이브러리에 적용하였다. 즉, 플라크는 플레이트당 1×104플라크가 형성되었으며 이를 막에 옮겼다. 변성화, 중성화 및 고정화를 수행한 후, 막을 50℃의 전-혼성화 완충액(6×SSC, 0.1% SDS, 5× 덴하트 용액 및 10㎍/㎖의 연어-정자 DNA)에서 2시간 동안 전-혼성화시켰다. 다음, 2×105내지 106/㎖ 농도로 되도록 혼성화 완충액을 탐침이 가하여 50℃에서 15시간 동안 혼성화를 수행하였다. 혼성화 완결된 후, 막을 6×SSC 및 0.1% SDS를 함유한 세척 용액으로 실온에서 20분 동안 두번 세척하였다. 막을 감각된 X-선 필름 페이퍼(Kodak)가 들어있는 -80℃의 카세트에서 밤동안 노출시켜 자가방사선 사진을 얻었다. 그 결과 5×104플라크로부터 96개의 양성 플라크를 선별하였다. 이 플라크 각각을 이차 선별하여 하기 실험에 사용했다.
(3) 플라크의 분류 및 아즈키 콩 EXP2, cDNA, 아즈키 콩 EXT3 cDNA 및 EXT 유전자의 패밀리 유전자의 분리
플레이트 라이세이트(plate lysate) 방법(T. Maniatis et al., Molecular Cloning, A laboratory Manual, 2판, 2과, pp. 60-66, Cold Spring Harbor Laboratory Press에서 1989년 발행)을 상기에서 수득한 플라크에 적용하여 많은 양의 파아지 파티클을 제조하고, 이에 대해 실시예 1-(2)에서 사용된 아즈키 콩 EXT 유전자 cDNA를 탐침으로 하는 닷(dot) 혼성화를 수행하였다. 상기 언급된 바와 같은 방식으로 수행된 혼성화 단계 후, 여과지를 점진적으로 강화된 조건하에, 즉, 50℃에서 6×SSC, 4×SSC, 2×SSC 및 0.1×SSC로 세척한 다음, 65℃에서 0.1×SSC로 세척하여 시그날 강도에 기초하여 분류하였다. 그 결과, 플라크를 6개의 타입 그룹으로 분류하였다. 이러한 그룹 중, 50℃에서 0.1×SSC로 세척한 후에는 감지되었으나, 65℃에서 0.1×SSC로 세척한 후에는 감지되진 않는 시그날을 나타내는 그룹으로부터 아즈키 콩 EXT 유전자와는 다른 시그날 강도를 나타내 2개의 타입의 플라크를 수득하였다. 이러한 플라크에서 파아지를 분리하고 삽입된 DNA를 추출하였다. 이 DNA를 제한 효소 EcoR I으로 절단한 다음 아가로즈겔 전기 영동을 수행함으로써 DNA 단편의 길이를 확인하였다. 그 결과, 약 730bp 및 약 430bp가 플라크의 한 타입에서 감지되었고, 플라크의 또 다른 타입에서는 약 1090bp가 감지되었다. 이러한 DNA 단편 각각을 정제하여 pUC18(다카라 슈조 (주))의 EcoR I 부위에 서브클로닝하였고, 생성된 플라스미드를 각각 pVX-44-1, pVX-44-2 및 pVX-45-1로 명명하였다. 이들 플라스미드의 DNA 단편의 뉴클레오타이드 서열을 BcaBESTTM디데옥시 서열분석 키트(다카라 슈조(주))를 이용하는 상기할 생거(Sanger) 방법 [Science, 214, 1205-1210(1981)]에 따라 결정한 결과, 아즈키 콩 EXT 유전자와 상당한 상동성을 가진 유전자(아즈키 콩 EXT2)를 pVX-44-1 및 pVX-44-2로부터 클로닝하였으며, 또한, 아즈키 콩 EXT 유전자와 상당한 상동성을 가진 또다른 타입의 유전자(아즈키 콩 EXT3)를 pVX-45-1로부터 클로닝하였다. 그것의 일부 뉴클레오타이드 서열을 서열 목록 SEQ ID NO 11 및 SEQ ID NO 12에 나타내었다.
[실시예 2]
아즈키 콩 XPR1 cDNA 및 EXT 유전자의 패밀리 유전자의 분리
cDNA 합성 키트(TAKARA SHUZO Co,. Ltd.)을 사용하고 벡터로서 λ ZAPⅡ(Stratagene)를 사용하여 문헌[Gene, 25, 263-269(1983)참조]에 설명된 방법에 따라 실시함으로써 실시예 1-(1)에서 수득한 폴리(A)+RNA로부터 cDNA 라디브러리를 제작하였다. 자일로글루칸에 작용하는 단백질에서 종종 보존되는 서열중 하나로서 DEIDFEFLG의 아미노산 서열(SEQ ID NO 28)에 상응하는 혼합된 합성 올리고뉴클레오타이드(27mer, SEQ ID NO 13)를 5'-말단-표지 키트 MEGALABELTM(다카라 슈조 (주))를 사용하여 [γ-32P]APT로 표지함으로써 탐침을 제조하였다. 이 탐침의 특히 활성은 약 1×108cpm/㎍이었다. 이 탐침을 이용한 플라크 혼성화법을 실시예 1에서와 같은 방식으로 상기 제작된 cDNA라이브러리에 대해 수행하였으며, 이 경우 혼성화는 50℃에서 15시간 동안 수행되었다. 다음, 막을 50℃의 2×SSC로 20분 동안 두번 세척한 후 자가방사선사진을 만들었다. 플레이트당 약 2만개의 플라크가 형성되는 비율로 10×14㎝ 플레이트에 플라크가 형성되었다. 약 십만 플라크에 대해 선별을 수행한 결과, 양성 시그날은 감지되지 않았다. 아즈키 콩 EXT cDNA로 통합된 파아지 파티클 사각 플레이트당 약 50개의 플라크가 형성되는 양성대조군을 동시에 사용하여 같은 조건하에서 혼성화시키면 각각의 플라크에 상응하는 뚜렷한 양성 시그날이 감지된다.
반대로, cDNA 라이브러리의 파아지 용액(만개의 플라크 함유)을 양성대조군의 파아지 용액과 혼합하여 결과 사각 플레이트당 약 50개의 플라크를 형성하도록 한 경우, 양성 시그날이 감지되지 았았다는 것은 이상하였다. 100bp 이상의 cDNA 단편을 사용하여 플라크 혼성화를 수행하는 경우에는 그런 일이 발생하지 않았다. 따라서, 이 문제는 명백히 약 20 내지 30개 염기 길이의 올리고머가 탐침으로 사용되어 발생한 것이다. 양성 클론이 존재할 때조차, 많은 다른 공존하는 파아지를 기원한 플라크와의 어떤 상호 작용에 의해 양성 시그날이 형성되지 않는 것으로 생각된다.
그 문제를 피하기 위해 너무 고밀도가 되지 않게 플레이트당 500 내지 1000개의 플라크의 형성시킨 다음 약 8×103개 플라크에 대해 선별한 결과, 8개의 양성 플라크를 수득하였다. M13 헬퍼(helper) 파아지 및 F' 균주의 숙주 박테리아로 이중 감염시키면, 숙주내에서 클로닝된 영역이 pBluescript SK(-)(Stratagene)로 자동 전환됨으로써 λZAPⅡ가 자동적으로 자가 서브클로닝될 수 있다.
이러한 방식으로 상기 언급된 8개의 플라크에서 제작된 플라스미드를 제한 효소 EcoR I(다카라 슈조(주))으로 절단하고 아가로즈 겔 전기 영동을 수행하여 DNA단편의 길이를 확인하였다. 이들 단편 중 임의로 선택된 약 1.2kbp의 DNA 단편을 pVM104, pVM106 및 pVM109로 각각 명명된 3타입의 플라스미드로 통합시켰다.
BcaBESTTM디데옥시 서열분석 키트(다카라 슈조(주))를 이용하여 상기 생거 방법에 따라서 이러한 플라스미드에 의해 DNA 단편의 뉴클레오타이드 서열을 분석한 결과, 아즈키 콩의 EXT 유전자 및 BRU1 유전자 [Plant Physiology, 104, 161-170(1994) 참조] 및 메리-5 유전자[the Plant Cell, 3, 359-370(1991) 참조]와 상당한 상동성을 가진 2 타입의 유전자가 클로닝된 것을 확인하였다(pVM106 및 pVM109는 동일한 유전자이다). 이러한 유전자의 하나인 pVM106(아즈키 콩 XRP1)의 일부 뉴클레오타이드 서열을 서열 목록 SEQ ID NO 14에 나타내었다.
[실시예 3]
PCR에 대한 아즈키 콩 XRP2 cDNA 및 EXT 유전자의 패밀리 유전자의 분리
실시예 2와 같은 방식으로 아즈키 콩의 지상부로부터 제조된 약 10000 pfu(플라크 형성 단위)의 λ파아지 용액(33㎕)을 페놀/클로로포름 용액으로 두번 추출한 후 에탄올로 침전시켜 조정제된 λ파아지 DNA를 수득하였다. 이 총 DNA를 주형으로 혼합된 합성 올리고뉴클레오타이드(SEQ ID NO 13)를 센스 프라이머로, dTTP가 18개의 염기와 결합되어있는 올리고(dT)18 프라이머를 안티센스 프라이머로 사용하여 PCR 증폭 키트(다카라 슈조(주))를 이용한 PCR을 수행하였다. 그 반응을 94℃(1분), 55℃(1분) 및 72℃(1분)에서 25싸이클을 반복하여 수행하였으며, 생성된 반응 용액을 72℃에서 7분 동안 방치하였다. 다음, 이 반응 용액 1㎕를 주형으로 하고 센스 프라이머로서 혼합된 합성 올리고뉴클레오타이드(SEQ ID NO 13)를 사용하고 안티센스 프라이머로서 올리고(dT)18 프라이머를 사용하여 상기 언급된 25싸이클을 반복함으로써 이차 PCR을 수행하였다. 반응 완성후, 그 반응 혼합물을 3% 아가로즈 겔 전기 영동으로 분석하여 약 260bp, 350bp, 450bp, 500bp, 600bp, 750bp, 800bp 및 1300bp의 DNA 단편이 특이적으로 증폭됨을 확인하였다. 이 단편들을 회수하여 DNA 블런팅(Blunting) 키트(다카라 슈조(주))를 사용하여 평활 말단화하였다. 또한, PCR 산물의 5' 말단을 MEGALABVELTM(다카라 슈조(주))을 이용하여 인산화하였으며 그 생성물을 pUC119(다카라 슈조(주))의 Hinc Ⅱ부위에 서브클로닝하였다. 이들 플라스미드에 대해서 BcaBESTTM디데옥시 서열분석 키트(다카라 슈조(주))를 이용하여 생거 방법에 따라서 DNA 단편의 뉴클레오타이드 서열을 분석하였으며, 아즈키 콩 EXT 유전자와 상동성을 가진 2타입의 유전자를 클로닝하였다. 그들 중 하나는 실시예 2의 pVM106 및 pVM109와 동일하였다. 또 다른 유전자(아즈키 콩 XRP2)의 뉴클레오타이드 서열 일부를 서열 목록 SEQ ID NO 15에 나타내었다.
[실시예 4]
담배 XRP1 cDNA, 및 EXT 유전자의 패밀리 유전자의 분리
λZAP를 벡터로하는 cDNA 라이브러리(Stratagene)를 이용하였으며, 탐침을 만들기 위하여, 자일로글루칸에 작용하는 단백질에서 보존된 DEIDFEFLG의 아미노산 서열(SEQ ID NO 28)에 상응하는 혼합된 합성 올리고뉴클레오타이드(27mer, SEQ ID NO 13)를 5'-말단-표지 키트 MEGALABELTM(다카라 슈조(주))를 사용하여 [γ-32P]ATP로 표시하였다. 상기 언급된 cDNA 라이브러리에 대하여 실시예 2와 같은 방식으로 이 탐침을 사용한 플라크 혼성화 수행하였다. 다음, 약 3×104플라크로부터 30개의 양성 플라크를 선별해내었다.
M13 도우미 파아지 및 F' 균주의 숙주 박테리아로 이중 감염시키면, 숙주내에서 클로닝된 영역이 pBluescript SK(-)(Stratagene)로 자동적으로 전환되는 λZAP(Stratagene)가 자동적으로 서브클로닝될 수 있다. 상기 언급된 30개의 플라크에서 이러한 방식으로 제작된 플라스미드를 제한 효소 EcoR I(다카라 슈조(주))으로 절단후 아가로즈 겔 전기 영동하여 DNA 단편의 길이를 확인하였다. 이 단편 중 약 1.5kbp 및 약 0.9kbp의 DNA 단편을 포함한 2 타입의 플라스미드를 각각 pTM3D 및 pTM11D로 명명하였다.
BcaBESTTM디데옥시 서열분석 키트(다카라 슈조(주))를 이용하여 생거 방법에 따라서 이러한 플라스미드의 DNA 단편의 뉴클레오타이드 서열을 분석한 결과, 아즈키 콩의 EXT 유전자 및 상기 언급된 BRU1 유전자 및 메리-5 유전자와 상동성을 가진 2 타입의 유전자가 클로닝된 것을 확인하였다. 그러한 타입의 하나(담배 XRP1)인 pTM11D의 뉴클레오타이드 서열 일부를 서열 목록 SEQ ID NO 16에 나타내었다.
[실시예 5]
EXT 유전자 패밀리 유전자의 게놈 DNA 클론의 분리
(1) 아즈키 콩 잎에서 게놈 DNA의 제조
비그나 안굴라리스 오위 에 오하쉬, 씨브이. 다카라(WATANAVBE SHUSHI, Co., Ltd.)의 종자를 문헌[Physiologia Plantarumm, 82, 490-497(1991)참조]에 언급된 방법에 따라서 발아시켜 약 10g의 잎을 수득하였다. 이 잎(약 10g)을 액체 질소의 존재하에 모터로 분쇄하여 흰색 분말로 만들었다. 약 2.5g의 잎분말을 즉시 50㎖의 폴리스티렌 튜브에 넣어 65℃에서 1시간 동안 25% SDS와 혼합된 10㎖의 우레아-페놀 DNA 추출 완충액[0.05M 트리스-염산(pH : 7.6), 0.02M EDTA, 5% 패놀, 8M 우레아, 0.35M 염화나트륨 및 2% 소디움 라우로일사르코시네이트]으로 추출하였다. 그 추출물을 2배 부피의 페놀-클로로포름-이소아밀알콜(25 : 24 : 1) 혼합물과 혼합하여 약 15분 동안 천천히 교반한 다음, 2000rpm에서 15분 동안 원심분리하였다. 원심분리후, 상등액을 새튜브로 옮긴후, 다시 2배 부피의 페놀-클로로포름-이소아밀알콜(25 : 24 : 1) 혼합물과 혼합하여 약 15분 동안 천천히 교반한 다음, 2000rpm에서 15분 동안 원심분리하였다. 원심분리후 상등액을 새 튜브로 옮기고 2배부피의 에탄올과 혼합한 다음 천천히 교반하였다. 다음, 침전된 백색 게놈 DNA를 파스퇴로으로 코일화하여 새 튜브로 옮겼다. 이 튜브에 1.5㎖의 TE 완충액[10mM 트리스-염산(pH L 8.0) 및 1mM EDTA]를 가하여 생성된 혼합액을 55℃에서 밤동안 방치하여 DNA를 용해시켰다. 이 DNA 용액을 10배로 희석하여 제조된 샘플 1㎕를 0.4% 아가로즈 겔 전기 영동으로 분석한 결과, 이 용액 약 100ng/㎕ 농도의 고 분자 DNA를 함유하는 것으로 밝혀졌다. 즉, 150㎍의 게놈 DNA를 약 2.5g의 잎에서 수득하였다.
(2) 게놈 DNA 라이브러리의 제작
상기 수득된 게놈 DNA에 제한효소 Sau3A I을 적용하여 부분적으로 부해하기 위한 조건을 조사하였다. 즉, 10U/㎕의 Sau3A I(다카라 슈조(주))을 희석 완충액으로 희석하여 그 농도가 50㎕의 반응 용액(1㎍ DNA)에서 1 내지 0.035U/㎍ DNA로 되도록 하여 37℃에서 30분 동안 반응시킨 후, 0.5M EDTA 1㎕와 혼합하여 반응을 종결시켰다. 반응후, 샘플 20㎕를 0.4% 아가로즈 겔 전기 영동으로 분석한 결과, 0.1U/㎍ DNA의 조건하에서는 크기 15 내지 20kbp의 분자가 가장 많이 형성되었음을 알아내었다. 이 조건하에서 반응스케일을 증가시켜 이 조건하에 부분적으로 분해된 10㎍의 DNA에 5㎕의 10×필-인(fill-in)완충액[0.5 트리스-염산(pH : 7.2), 0.1M 마그네슘 설페이트, 1mM DTT, 500㎍/㎖의 아세틸화된 BSA, 10mM, dATP 및 10mM dGTP]을 가하고, 클레노우(Klenow) 단편 10μ를 처리하였다. 증류수를 가하여 총 부피 50㎕가 되게 만든 후, 반응을 30℃에서 30분 동안 수행하였다. 반응 완성 후, 반응액을 50㎕의 페놀-클로로포름-이소아밀알콜 혼합물(25 : 24 : 1)과 혼합하여 천천히 교반한 다음, 12000rpm에서 5분동안 원심분리하였다. 상등액을 새 튜브로 옮긴 후, 에탄올을 침전시켰다. 그 침전물을 20㎕의 TE 완충액[10mM 트리스-염산(pH : 8.0) 및 1mM EDTA]에 용해시켰다. 다음, 일부 채워지고, 일부부분적으로 Sau3A I으로 분해된 게놈 DNA 0.5㎍ 및 1.5Mg 각각을 다카라 연결키트버전 1(TAKARA SHUZO Co., Ltd.)을 사용하여 1.0㎍의 λGEM11 Arm(Promega Biotech)과 연결시켰다발즉, 일부채워지고 일부 Sau3AI에 의해 부분적으로 분해된 게놈 DNA 0.5㎍ 및 1.5㎍ 각각을 1.0㎍의 λGEM Ⅱ Arm(Promega Bio tech)을 함유하는 용액과 혼합하고 증발하여 건조시킨 후, 그 혼합물을 5㎕의 연결 완충액에 용해시킨 다음 5㎕의 TaKaRa 연결 버전 1내의 용액 B와 혼합하고 26℃에서 10분 동안 연결하였다. 연결된 샘플을 페놀로 두번 추출하여 에탄올을 침전시켰다. 다음, 전체 양을 시험관내에서 팩키징 키트(Stratagene)를 사용하여 팩키징하여 숙주 박테리아인 대장균 LE392에 감염시켜 아즈키 콩의 게놈 DNA 라이브러리를 수득하였다. 이 라이브러리의 역가는 2.1×105pfu/㎖로 측정되었다.
(3) 라이브러리의 선별 및 유전자의 분리
이 라이브러리를 사용하여, 약 1.1kbp의 아즈키 콩 EXT 유전자 cDNA [EP-0562836 AL(993)]를 BcaBESTTM표지 키트(다카라 슈조(주))를 사용하여 [α-32P]dCTP로 표지함으로써 플라크 혼성화에 사용할 탐침을 만들었다. 즉, 25ng의 상기 언급된 DNA 단편 및 2㎕의 랜덤 프라이머를 튜브에 넣고 증류수로 희석하여 5㎕를 만들든 다음 95℃에서 3분 동안 열처리하여 아이스에서 급냉하였다. 여기서 10배농도의 완충액 2.5㎕, 2.5㎕의 dNTP 혼합액, 5㎕의 표지된 dCTP를 가하고, 증류수를 가하여 24㎕를 만든 후, 1㎕의 BcaBESTTMDNA 중합효소(다카라 슈조(주))를 넣어 생성된 용액을 52℃에서 10분 동안 배양하였다. 95℃에서 3분동안 열처리 열 변성화시킴으로써 효소를 비활성시킨 후 아이스에서 급냉시켰다. 총 양을 혼성화에 사용되었다. 이 탐침의 특이 활성은 7.2×108cpm/㎍이었다.
전-혼성화 및 혼성화를 65℃에서 수행한 것을 제외하고는 실시예 1과 같은 방식으로 혼성화를 수행하였다.
혼성화 후, 막을 실온에서 20분 동안 2×SSC 및 0.1% SDS를 함유한 세척 용액으로 한번 세척한 후, 50℃에서 20분 동안 0.1×SSC 및 1% SDS를 함유한 세척 용액으로 세척하였다. 10개의 사각 플레이트에파아지를 접종하여 플레이트당 1×104플라크가 형성되도록 하였다. 총 10개의 플레이트에서 수득된 1×105플라크를 선별한 결과, 10개의 양성 플라크를 수득하였다. 다음, 이 플라크 각각에 대해 이차 선별을 수행하였다. 플레이트 라이세이트 방법에 의해 이차 선별시에 수득된 각각의 플라크로부터 파아지 DNA를 추출하였다. 이 파아지 DNA를 제한효소 Sac I, EcoR I, Hind Ⅲ, BamH I 및 Pst I(모두 : 다카라 슈조(주))으로 분해한 후, 상기 언급된 것과 동일한 탐침을 이용하여 서던 혼성화를 수행하였다.
서던 혼성화를 문헌[참조 : Molecular Cloning, A Laboratory Manual, 2판, 9과, pp 9.31-9.58(T, Maniatis et al., 1989년 Cold Spring Harbor Laboratory Press에서 발행됨)]에 언급된 방법에 따라서 수행하였다.
다시 말하면, 각각의 DNA 샘플을 1% 아가로즈 겔 전기영동하고 염기성에서 변성화한 후, 밤동안 나일론 막(하이본드-N, 에멀샴)에서 서던 블럿팅을 하였다. 자외선 조사기(254nm)로 5분 동안 조사하여 DNA를 고정시킨 후, 65℃의 전-혼성화 완충액(5×덴하트 용액, 6×SSC, 0.1% SDS 및 10㎍/㎎ 연어 정자 DNA) 5㎖에서 2시간 동안 전-혼성화시켰다. 다음, 탐침을 가하고 혼성화를 65℃에서 밤동안 수행하였다. 혼성화 후, 막을 2×SSC 및 0.1% SDS를 함유한 세척 용액으로 실온에서 10분 동안 두번 세척한 후, 50℃에서 30분 동안 동일한 세척액으로 두번 세척하였다. 막을 건조시킨 후 X-선 필름(Kodak)으로 덮고 이를 카세트에 넣어 -80℃에서 노출시켜 자가방사선사진을 만들었다.
수득된 자가방사선사진의 패턴으로부터, 10개의 파아지를 3타입으로 분류하였다. 3 타입의 파아지 벡터로 삽입된 DNA 단편 중, 아즈키 콩 EXT 유전자가 탐침으로 사용될 때 감지되는 DNA 단편을 플라스미드 벡터로 서브클로닝하여 뉴클레오타이드 서열 일부를 분석하였다. 그 결과, 모든 플라크의 피아지 벡터로 삽입된 DNA 단편이 EXT 유전자에 유사한 유전자, 즉, 패밀리 유전자를 포함하는 것으로 밝혀졌다. 그러나, 여기에 EXT 유전자는 포함되어있지 않았다.
[실시예 6]
아즈키 콩의 일부 게놈 DNA 라이브러리로부터 아즈키 콩 EXT 유전자의 프로모터 하류 영역을 포함한 DNA 단편의 클로닝
실시예 5와 같은 방식으로 아즈키 콩 잎으로부터 추출된 게논 DNA를 제한효소 EcoR I 및 Hind Ⅲ로 분해하고 EcoR I-Hind Ⅲ로 이중 분해한 후, 0.7% 아가로즈 겔 전기영동하여 나일론 막에 옮긴 다음, 실시예 5-(3)과 같은 방식으로 제조된 아즈키 콩 EXT 유전자 cDNA를 탐침으로 사용하여 서던 혼성화를 수행하였다.
혼성화 후, 막을 2×SSC 및 0.1% SDS를 함유한 세척 용액으로 실온에서 20분 동안 세번 세척하고, 50℃에서 20분 동안 동일한 세척액으로 두번 세척한 후, 0.1×SSC 및 0.1% SDS를 함유한 세척 용액으로 50℃에서 20분 동안 두번 세척하는 것을 제외하고는 실시예 5-(3)에 언급된 방법에 따라서 서던 혼성화를 수행하였다.
그 결과, 약 3개의 밴드가 각 레인에서 감지되었고 가장 강한 밴드가 EcoR I 분해에서는 약 8.5kbp, Hind Ⅲ 분해에서는 약 8.5kbp, EcoR I-Hind Ⅲ의 이중 분해에서는 약 5.5kbp에 나타났다. 다음, EcoR I-Hind Ⅲ으로 완전히 이중 분해한 30㎍의 DNA를 0.7% 아가로즈 겔 전기영동하고 아가로즈 겔로부터 약 5.5kbp 주위의 밴드를 회수한 다음 λEXlox(Novagene)의 EcoR I-Hind Ⅲ 부위에 연결하였다. 이를 시험관내 팩키징 키트(Stratagene)에 의해 팩키징한 후, 숙주박테리아인 ER1647에 감염시켜 양 말단에 EcoR I-Hind Ⅲ 부위를 가진 평균 약 5.5kbp의 크기를 가진 DNA 단편으로 구성된 부분적인 아즈키 콩 게놈 DNA 라이브러리를 수득하였다. 이 라이브러리 역가는 1.9×106pfu/㎖이었다.
다음, 탐침으로 아즈키 콩 EXT 유전자 cDNA를 사용하여 실시예 5와 같은 방식으로 플라크 혼성화를 수행하였다. 10개의 양성 플라크를 1.3×105플라크로부터 수득하였다. 이 플라크를 SM 완충액에 현탁시킨 후 플라크에 대해 이차 선별을 수행하였다. 이차 선별에서는, 상기 언급된 아즈키 콩 EXT 유전자 cDNA 뿐만아니라 아즈키 콩 EXT 유전자 cDNA의 이소자임과 낮은 상동성을 가진 5'-비코드 영역에 기초하여 합성된 올리고뉴클레오타이 VAN-U7(Sequence ID NO 17)을 각각 탑침으로서 이용하였다. 탐침이 아즈키 콩 EXT 유전자 cDNA인 경우, 플라크 혼성화 및 세척을 상기 언급된 방식으로 수행하였다. 합성 올리고뉴클레오타이 VAN-U7이 이용되는 경우, 혼성화 탐침은 5'-말단-표지 키트MEGALABELTM(다카라 슈조(주))를 사용하여 5'-말단을 [γ-32P]ATP로 표지하여 만들어졌다. 이 탐침의 특이 활성은 약 2×108cpm/㎍이었다. 전-혼성화 및 혼성화를 47℃에서 수행하는 점을 제외하고는 실시예 2에서와 동일한 방식으로 이 탐침을 사용하여 혼성화를 수행하였다. 혼성화 후, 막을 6×SSC 및 0.1% SDS를 함유한 세척 용액으로 실온에서 두번 세척한 다음, 47℃에서 20분 동안 동일한 세척액으로 두번 세척하였다. 그 결과, 10개의 양성 플라크 중, 4개의 플라크가 EXT 유전자 cDNA를 포함한 DNA 단편인 것으로 밝혀졌다. 이 단편이 삽입된 파아지를 P1Cre 유전자를 가진 숙주 박테리아인 대장균 BM25.8에 감염시켜 자가 서브클로닝하였는데, 이때 숙주에서 자동적으로 서브클로닝된 영역이 pUC-타입 플라스미드로 전환되었다. 이렇게 제조된 플라스미드를 pVXG303으로 명명하였다.
pVXG303으로 형질 전환된 대장균 JM109균주(다카라 슈조(주))를 Escherichia coli JM109/pVXG303로 나타내고, 부다페스트 조약에 의거하여 1995년 3월 15일(원기탁일)자로, National Institute of Bioscience and Human-Technology, Agency of Industrial Science and Technology, Ministry of Industrial Trade and Industry(일본국, 305, 이바라기-켄, 쭈쿠바-시, 히가시 1-초메, 1-3)에 수탁번호 FERM BP-5390으로 기탁하였다. 이 플라스미드는중의 DNA단편의 뉴클레오타이드 서열을 BcaBESTTM디데옥시 서열분석 키트(다카라 슈조(주))를 이용하여 생거 방법에 따라서 결정하였다. 그의 뉴클레타이드 일부를 서열 목록 SEQ ID NO 18 및 SEQ ID NO 19에 나타내었다. 이 서열을 아즈키 콩 EXT 유전자 cDNA의 서열과 비교한 결과 상기 단편이 아즈키 콩 EXT 유전자의 프로모터를 포함하는 것으로 밝혀졌다.
[실시예 7]
역 PCR에 의한 아즈키 콩 EXT 유전자의 프로모터 영역을 포함한 DNA 단편의 역 PCR에 의한 클로닝
(1) 자가 연결(self-ligation) 효율의 조사
실시예 6의 pVXG303는 아즈키 콩 EXT 유전자의 프로모터 영역을 포함한 5.5kbp의 게놈 DNA에서 기원한 EcoR I/Hind Ⅲ 단편을 가진 약 9.5kbp의 플라스미드이다.
자가 연결 및 역 PCR에 대한 대조군으로서, 이 플라스미드를 제한효소 Hind Ⅲ로 분해한 다음, 각각 10ng/㎕, 30ng/㎕, 2ng/㎕ 및 1ng/㎕의 DNA 농도에서 자가 연결하였다. 연결 후, 각 샘플 5㎕로 대장균 JM109를 형질 전환시키고, 형성된 콜로니의 수로부터 자가-연결 효율을 구하였다. 그 결과, 자가-연결 효율이 DNA 농도를 희석함에 따라 증가되는 것으로 나타났다. 그러나, 이 연결 용액을 주형으로 하고 센스 프라이머로서 프라이머 VAN-UH1(SEQ ID NO 21), 안티센스 프라이머로서 프라이머 VAN-L(SEQ ID NO 22)을 사용하여 중합 효소 연결 반응 (PCRs)을 수행한 경우, 주형의 양을 증가시키기 위하여 반응 시스템에 큰 부피의 연결 용액을 가하면 자가 연결이 저해되었으며, 또한 반응 시스템내의 주형의 양을 감소시키기 위하여 에탄올 침전을 수행할 때 DNA 농도를 희석시킴에 따라 회수율이 감소되었다. 그 결과, 연결 반응시 DNA 농도 및 반응 부피를 각각 3.3ng/㎕ 및 300㎕로 조정하면 목적 싸이클 DNA를 효율적으로 회수할 수 있음을 알 수 있었다.
(3) 아즈키 콩 DNA를 주형으로 사용한 Hind Ⅲ 단편의 역 PCR
실시예 5와 동일한 방식으로 아즈키 콩 잎으로부터 제조된 게놈 DNA 1Mg을 제한효소 Hind Ⅲ로 완전히 분해하고 페놀/클로로포름 용액으로 한번 추출하여 효소를 비활성화시킨 다음, 에탄올로 침전시켰다. 에탄올로 침전된 DNA를 268㎕의 증류수, 30㎕의 10× 연결 완충액 및 2㎕의 T4 DNA 리가아제(다카라 슈조(주))와 혼합한 다음, 16℃에서 밤 동안 자가-연결 반응을 진행시켰다. 수득된 싸이릭클 게놈 DNA 0.1㎍을 주형으로 하고, 센스 프라이머로서 프라이머 VAN-UH1(SEQ ID NO 21), 안티센스 프라이머로서 프라이머 VAN-L(SEQ ID NO 22)을 사용하여 TaKaRa LA PCR 키트(다카라 슈조(주))를 이용한 PCR을 수행하였다. 94℃(0.5분), 55℃(1분), 72℃(2분)의 싸이클을 30번 반복하여 수행하였다. 그러나, 이 반응에서는 어떠한 증폭도 관찰되지 않았다. 따라서, 이 반응 용액 1㎕를 주형으로 하여 하기 열거된 프라이머를 사용하여 상기 언급된 30회 반복된 싸이클을 동일한 방법으로 30회 싸이클을 반복하여 PCR을 수행하였다.
1) 센스 프라이머로서 프라이머 VAN-UH2(SEQ ID ND 23) 및 안티센스 프라이머로서 프라이머 VAN-L16(SEQ ID ND 24),
2) 센스 프라이머로서 프라이머 VAN-UH3(SEQ ID ND 25) 및 안티센스 프라이머로서 프라이머 VAN-L3(SEQ ID ND 26),
3) 센스 프라이머로서 프라이머 VAN-UH2(SEQ ID ND 23) 및 안티센스 프라이머로서 프라이머 VAN-L3(SEQ ID ND 26),
4) 센스 프라이머로서 프라이머 VAN-UH3(SEQ ID ND 25) 및 안티센스 프라이머로서 프라이머 VAN-L16(SEQ ID ND 24).
반응 후, 반응액을 1% 아가로즈 겔 전기영동하여 분석한 결과, 약 1.8kbp의 DNA 단편이 3)의 조합에서 특이적으로 증폭됨을 할 수 있다. 많은 비특이성 DNA 단편의 증폭 때문에 다른 조합에서는 목적 단편을 확인하기 어려웠다.
3)의 프라이머 조합에서 수득한 DNA 단편을 겔에서 회수하여 DNA 블런팅 키트(다카라 슈조(주))를 사용하여 평활 말단을 만들었으며, 5'-말단-표지 키트MEGALABELTM(다카라 슈조(주))를 사용하여 PCR 산의 5'-말단을 인산화 한 다음 pUC119(다카라 슈조(주))의 Hinc Ⅱ부위에 서브클로닝 하였다. 그들로부터 3개의 플라스미드를 선별하여 그 DNA 단편의 뉴클레오타이드 서열을 BcaBESTTM디데옥시 서열분석 키트(다카라 슈조(주))를 이용한 생거 방법에 따라 결정하였다. 부분적인 뉴클레오타이드 분석결과, 그 뉴클레오타이드서열이 모든 플라스미드에서 동일한 것으로 나타났으므로, 전체 뉴클레오타이드 서열은 이러한 서열 중 하나를 사용하여 결정되었다.
그것의 뉴클레오타이드 서열 일부는 서열 목록 SEQ ID ND 27에 나타내었다. 또한, 당해 DNA 단편의 제한 지도는 그림 2에 나타내었다. 당해 DNA 단편을 함유한 플라스미드를 pVX-H3이라 명명하고, 한편 pVX-H3로 형질전환된 대장균 JM109 균주는 대장균 JM109/pVX-H3이라 명명하여, 부다페스트 조약에 따라 국제 기탁기관(Bioscience and Human-Technology, Agency of Industrial Science and Human-Technology, Ministry of Industrial Trade and Industry(1-3, Higashi 1-Chome, Tsukuba-shi, Ibaraki-ken, 305, Japan))에 1995년 2월 17일(원기탁일)자로 기탁 번호 FERM BP-5388로 기탁되었다.
[실시예 8]
아즈키 콩 게놈 DNA 라디브러리로부터 아즈키 콩의 프로모터 영역을 함유한 DNA 단편의 클로닝
(1) 게농 DNA 라이브러리의 제작
실시예 5에서 수득된 게놈 DNA을 10 제한효소 Sau3A I으로 부분 분해하기 위한 실헌 조건을 조사하였다. 즉, 10U/㎕의 Sau3A I(다카라 슈조(주))을 희석 완충액으로 희석하여 50㎕의 반응액(1㎕ DNA)중의 농도가 1 내지 0.035U/㎕ DNA로 되도록 조정하여 37℃에서 30분 동안 반응시킨 후, 1㎕의 0.5M EDTA와 혼합하여 반응을 종결시켰다. 반응 후, 20㎕의 샘플을 0.4% 아가로즈 겔 전기영동하여 분석한 결과, 0.1U/㎕ DNA 조건하에서 15 내지 20kbp크기의 분자가 가장 많이 형성됨을 알 수 있었다.
이 조건하에 반응스케일을 증가시켰다.
다음, 이러한 조건하에서 부분적으로 분해된 160㎍의 DNA에 대해 염화 나트륨-밀도 구배에 따른 원심분리를 수행하여 크기 15-20kbp의 분자를 분획하였다. 즉 HITACHI RPS40-T 로터에 적합한 원심분리 튜브에 1.25 내지 5M 염화나트륨 밀도 구배를 형성한 다음 각각의 DNA 200㎕(약 160㎍)을 천천히 가하고 HITACHI SCP70H초원심분리기를 이용하여 35000rpm에서 3시간 동안 초원심분리하였다.
원심분리 후, 샘플을 각각 250㎕씩 에펜돌프 튜브에 나누어 담았다. 매 3개의 튜브마다 20㎕씩 취하여 0.4%아가로즈겔 전기영동으로 분석한 결과, 18내지 21번째 분획이 외관상 적당한 크기의 DNA 분자를 포함하는 것으로 나타났다. 그러므로, 분획물 번호 20으로 부터 각각 0.3㎍, 0.6㎍, 및 1.2㎍의 DNA를 λGEM11 암(arm)(Promega Biotech)의 10㎍의 용액과 혼합하여 8㎕용액을 만들고, 여기서 다카라 리게이션 키트 버전 2(TaKaRa Ligation Kit Version 2)(TAKARA SHUZO Co. Ltd.)의 용액 Ⅱ 8㎕와 용액 I 16㎕를 첨가하여 26℃에서 10분 동안 연결을 시킨다. 연결후, 각 샘플을 페놀로 두 번 추출하고 에탄올 침전시킨다. 이어서, 총량을 시험관내 팩키징 키트(Stratagene)를 팩키징 시키고 숙주 박테리아인 대장균 Le392로 감염시켜 아즈키 콩 게놈 DNA 라이브러리를 수득했다. 이 라이브러리의 역가는 1.1×105pfu/㎖이었다.
(2) 라이브러리의 선별
실시예 6에서 수득된 게놈 DNA 단편을 BcaBESTTM표지화 키트(TAKARA SHUZO Co. Ltd.)를 사용하여 [α-32P]dCTL로 표지화시켜 혼성화용 탐침을 제조하였다. 상기 탐침을 사용한 플라크 혼성화은 실시예 5에서와 같은 방법으로 상기 제조된 게놈 DNA 라이브러리상에서 수행하였다. 혼성화후, 막을 2×SSC 및 0.1% SDS를 함유하는 세척 용액으로 실온에서 20분 동안 3회 세척하고, 추가로 1×SSC 및 0.1% SDS를 함유하는 세척 용액으로 50℃에서 20분 동안 1회 세척한다. 20개의 정사각형 플레이트상에 파아지를 접종하여 플레이트당 1×104플라크로 플라크를 형성시켰다. 총 20개의 플레이트로 부터 수득된 2×105파아지상에 선별한 결과로서 21개의 양성 플라크를 수득했다. 이어서, 이들 플라크의 각각을 2차 선별하여 그의 양성 클론을 각각 분리하였다.
상기 2차 선별은 사각 프레이트당 약 300개의 플라크를 형성하도록 가능한 한 얇게 1차 선별하여 얻은 21개의 양성 플라크의 각각으로 부터 취해진 파아지 용액으로 접종한 후, 플라크 혼성화를 수행하였다. 2차 선별에서, 1차 선별에서와 같은 방법으로 실시예 6에서 얻은 게놈 DNA 단편 및 아즈키 콩 EXT 유전자 cDNA 서열에서의 다른 이소자임(아즈키 콩 EXT2 및 아즈키 콩 EXT 3)과 같은 패밀리 유전자와 낮은 상동성을 가진 5'-비정보화 영역을 기초로 합성된 올리고뉴크레오타이드 VAN-U7(SEQ ID NO 17)을 각각 탐침로서 사용하였다. 게놈 DNA단편이 탐침로서 이용된 경우, 플라크 혼성화 및 세척은 1차 선별에서와 같은 방법으로 수행하였다. 합성 올리고뉴클레오타이드 VAN-U7을 이용한 경우, 실시예 6에서와 같은 과정이 적용되었다.
2차 선별에서 얻은 양성 시그날을 보이는 10개 플라크중, 강한 시그날을 갖는 한 개의 플라크를 3차 선별을 위해 선택하였다. 그러나, 이 플라크는 2차 선별에서 조차 약 1000개 플라크당 오직 1개 이었다. 더구나, 이 플라크는 매우 작았다. 이 플라크의 정제된 증식을 위해, 3차 선별이 플레이크당 100 내지 200 플라크를 형성하도록 6개의 원형 플레이크(90㎜Φ)에 접종시켜 수행하였다. 결과적으로, 바늘 끝 크기의 매우 작은 플라크가 1차 응시에서 시그날로서 인식되는 플라크와 상응하지 않고, 플레이트를 매우 주의깊게 관찰한 경우의 시그날에 상응하는 위치에서 검출되었다. 파아지 DNA를 상기 플라카를 이용하여 플레이트 라이세이트 방법의 주의깊은 적용에 의해 추출하였다. 상기 플라크의 파아지 벡터에 삽입된 DNA 단편을 추출하고, 이어서 약 11kbp 길이의 DNA 단편을 얻었다.
상기 DNA 단편을 EcoR-I-Hind Ⅲ로 이중 분해하여 탐침로서 상기 유전자의 프로모터 영역을 함유하는 보다 짧은 DNA 단편인 실시예 6에서 얻은 아즈키 콩 EXT 유전자 게놈 DNA 단편을 탐침로서 사용한 서던 혼성화이 규정될 수 있었다. 상기 DNA 단편이 삽입된 플라스미드를 사용한 뉴클레오타이드 서열화 및 상기 단편과 아즈키 콩 EXT 유전자 cDNA의 서열의 비교는 이 DNA 단편이 아즈키 콩 EXT 유전자의 프로모터를 함유하는지를 밝혔다. 제1도는 상기 단편의 제한 지도이다. 또한, 상기 단편의 부분적인 뉴클레오타이드 서열이 서열목록의 SEQ ID NO 20에 나타나 있다. pUC118(TAKARA SHUZO Co. Ltd.)의 EcoR I와 Hind Ⅲ 부위에 상기 단편인 통합된 플라스미드를 pVX101이라 명명하고, 한편 pVX101로 형질 전환된 대장균 JM109 균주는 대장균 JM109/pVX101이라 명명하여, 부다페스트 조약에 따라 국제 기탁기관(Bioscience and Human-Technology, Agency of Industrial Science and Human-Technology, Ministry of Industrial Trade and Industruy(1-3, Higashi 1-Chome, Tsukuba-shi, Ibharaki-ken, 305, Japan))에 1995년 2월 25일(원기탁일)자로 기탁 번호 FERM BP-5389로 기탁되었다.
[실시예 9]
아즈키 콩 어린 식물을 이용한 노던 혼성화
(1) 총 RNA의 제조
줄기, 싹, 떡잎, 및 파종후 5일 및 40일 되는 아즈키 콩 식물을 집합적으로 액체 질소중에 냉동시키고 RNA 추출시까지 -80℃에서 유지하였다. 총 RNA를 이들 냉동 조직의 각각으로 부터 구아니딘 티오시아네트/페놀 방법에 의해 추출했다. 즉 냉동 세포 1g을 구아니딘 티오시아네이트 용액[물에 구아니딘 티오시아네이트 100g 및 나트륨 시트레이트 이수화물 1.47g을 용해시켜 제조된 구아니딘 티오시아네이트 용액 200㎖을 4℃로 유지하고 사용하기 전에 1㎖당 머캅토에탄올 7㎕ 및 나트륨 라우로일사르코시네이트 5㎎을 첨가한다] 2.5㎖을 함유하는 튜브에 위치시키고, 추출하기위해 폴리트론으로 분쇄하며, 페놀-클로포름-이소아밀 알콜(25 : 24 : 1)혼합물 2.5㎖와 혼합하고, 천천히 교반하고, 3000rpm에서 10분 동안 원심분리하였다. 이어서, 분리된 수성층을 페놀-클로포름-이소아밀 알콜(25 : 24 : 1) 혼합물 2.5㎖와 격렬히 교반하면서 혼합하고, 결과적인 현탁액을 수성층을 분리하기 위하여 원심분리했다. 이 과정을 2회 반복했다. 다음, 결과적인 수성층을 페놀-클로포름-이소아밀 알콜(25 : 24 : 1) 혼합물 2.5㎖와 격렬히 교반하면서 혼합하고 결과적인 현탁액을 원심분리하여 수성층을 분리하고, 이를 3M 나트륨 아세테이트 및 에탄올을 혼합하고, 이어서, 원심분리하여 RNA 침전물을 얻었다. 이 침전물을 트리스-SDS 용액[50mM 트리스-HCl(pH : 9.0) 및 1% SDS] 2㎖에 완전히 용해시키고 잘 진탕된 물-푸화 페놀 2㎖를 함유하는 튜브에 위치시켰다. 결과적인 현탁액을 원심분리하여 수성층을 분리하고, 여기에 물-포화 페놀 2㎖와 클로로포름-이소아밀 알콜(49 : 1) 2㎖를 격렬히 교반하면서 연속적으로 첨가하고, 결과적인 현탁액을 원심분리하여 수성층을 분리하였다. 다음으로 결과적인 수성층을 격렬히 교반하면서 클로로포름-이소아밀 알콜(49 : 1) 2㎖와 혼합하고, 결과적인 현탁액을 원심분리하여 수성층을 분리하고, 이를 3M 나트륨 아세테이트 및 에탄올과 혼합하고, 이어서 원심분리하여 RNA 침전물을 얻었다. 이 침전물을 멸균수 0.5㎖에 완전히 용해시키고, 농도를 흡광도를 측정하여 1㎎/㎖로 조정했다. 결과적인 용액을 교반하면서 10M 염화 리튬 1/4의 부피와 혼합하고, 4℃에서 2시간 동안 방치시키고, 이어서 원심분리하여 침전물을 얻었다. 이 침전물을 멸균수 1㎖에 완전히 용해시키고 3M 나트륨 아세테이트 및 에탄올과 혼합하며, 이어서 원심분리하여 RNA 침전물을 약 0.6㎎을 얻었다.
(2) 노던 혼성화
아즈키 콩 EXT 유전자 cDNA [EP-0562836 A1 (1993)]의 단편을 BcaBEST 표지화 키트(TAKARA SHUZO Co. Ltd.)를 사용하여 [α-32P]dCTP로 표지화시켜 혼성화용 탐침을 제조하였다.
노던 혼성화은 문헌[Molecular Cloning, A laboratory Manual, Second Edition, Chapter 7, pp. 7.39-7.52(T.Maniatis et al., published by Cold Spring Harbor Laboratory Press in 1989)]에 기술된 방법에 따라 하기 방식으로 수행하였다. 즉, 추출된 총 RNA를 포름알데하이드-런닝(running) 아가로즈-겔(1%)에 의한 전기영동을 시키고, 암모니움 아세테이트 용액에서 중성화시키고 밤새 나일론막(Hybond-N) 상에서 노던 블로팅을 실시했다. RNA를 자외선 조사기(254nm)로 5분간 조사하여 고정시킨 후, 막을 전-혼성화 완충 용액[50% 포름알데하이드, 0.65M Nacl, 0.1M Na-PIPES(pH : 6.8), 5×덴하트(Denhardt)용액, 0.1% SDS, 5mM EDTA, 및 연어 정액 DNA] 20㎖ 중에서 42℃에서 3시간 동안 예비(pre)-혼성화시켰다. 이어서 상기 방법에 의해서 제조된32P-표지된 탐침를 전-혼성화 완충 용액[50% 포름알데하이드, 0.65M Nacl, 0.1M Na-PIPES(pH : 6.8), 5×덴하트(Denhardt) 용액, 0.1% SDS, 5mM EDTA, 및 10% 덱스트란 설페이트] 20㎖중에 첨가했다. 상기 탐침 용액에 전-혼성화에 의해 얻은 막을 첨가하고 혼성화을 42℃에서 밤새 수행했다.
혼성화 후, 막을 2×SSC 및 0.1% SDS를 함유하는 세척 용액으로 3회 세척했다. 건조시킨 후, 막을 방사선 사진을 얻기위하여 X-선 필름이 위치한 카세트 안에서 -80℃에서 밤새 노출시켰다.
결과는 EXT 유전자 발현이 특정하게 줄기에서 관찰되고, 그 유전자는 신장과 함께 성장하는 부분에서 특정하게 발현되었다.
[실시예 10]
담배(Tobacco) 배양된 세포를 이용한 노던 혼성화
(1) 총 DNA의 제조
각각 1, 4, 6, 8 및 10일 동안 배양된 담배 BY2 배양 세포를 흡입 여과에 의해 부흐너 필터 깔때기 상에서 수집하였다. 이때 액체 배양 배지를 완전히 제거하기 위하여 배양 배지를 깔때기상에서 여과하고 추가의 10 내지 30초 동안 흡입하였다. 배양 배지를 따라낸 후, 세포 약 1g을 무게를 달아 빠르게 회수하여, 즉각 액체 질소에서 냉동시키며, 이어서, RNA 추출시까지 -80℃에서 유지하였다. 냉동 세포를 추출 용액[200mM 트리스-HCl(pH : 9.0), 100mM NACl, 10mM EDTA, 0.5% SDS, 및 14mM 2-머캅토에탄올] 및 물-포화 페놀 2㎖를 함유하는 튜브에 위치시키고, 추출하기 위하여 폴리트론으로 5분간 분쇄하며, 클로로포름-이소아밀 알콜(49 : 1) 혼합물 2㎖와 혼합하며, 폴리트론과 함께 추가로 격렬히 교반했다. 결과적인 현탁액을 원심분리하여 수성층을 분리하였다. 다음으로, 결과적인 수성층을 격렬히 교반하면서 연속적으로 물-포화 페놀 2㎖ 및 클로로포름-이소아밀 알콜(49 : 1) 혼합물 2㎖와 혼합하며, 결과적인 현탁액을 원심분리하여 수성층을 분리하였다. 이 과정을 2회 반복하였다. 결과적인 수성층을 격렬히 교반하면서 클로로포름-이소아밀 알콜(49 : 1) 혼합물 2㎖와 혼합하며, 결과적인 현탁액을 원심분리하여 수성층을 분리하고, 이를 3M 나트륨 아세테이트 및 에탄올과 혼합하고, 이어서 원심분리하여 RNA 침전물 약 0.7㎎을 얻었다.
(2) 노던 혼성화
담배 EXT 유전자 cDNA(JP 7-79778 A) 및 실시예 4에 기술된 패밀리 유전자 담배 XRP1의 cDNA를 각각 BcaBEST 표지화 키트(TAKARA SXHUZO Co. Ltd.)를 사용하여 [α-32P]dCTP로 표지화시켜 노던 혼성화용 탐침을 제조하였다.
노던 혼성화은 실시예 9-(2)에 기술된 것과 같은 방법으로 수행하였다. 결과가 제3도에 나타나 있다. 즉, 제3도는 EXT 및 XRP의 발현을 예시하고, 여기에서, 담배 EXT mRNA의 발현이 상부 줄에 나타나고, 담배 XRP mRNA의 발현이 중간줄에 나타나며, rRNA 양이 하부 줄에 나타나 있다.
제3도에서 알 수 있는 바와 같이 담배 EXT 유전자의 발현이 베양 첫째날에 관찰되고, 4일 째 피크에 이르렀다. 역으로 실시예 4에 나타난 EXT 유전자의 패밀리 유전자인 담배 XRP1 유전자가 배양 첫째날 및 6일 후 강하게 발현되었다.
동시에, 담배 BY2 배양 세포에 대한 성장 곡선이 또한 세포의 수 및 팩키징된 세포 부피(PVC)를 측정하여 그려졌다. 세포수는 담배 BY2 배양 세포를 1% 셀룰라제-ONOZUKA(Yakult Honsa Co., Ltd.), 0.1% 펙토리아제 Y23(SEISHIN 코포레이션), 및 0.4M 만니톨을 함유하는 효소 용액(pH : 5.5)으로 30℃에서 2시간 동안 처리하여 세포 벽이 없는 원형질로 전환시키고 혈액 계수기로 원형질의 수를 계수하여 얻었다. 또한 PVC를 구배된 원심분리 튜브 15㎖에 취해진 담배 BY2 배양세포의 세포 현탁액을 스윙 로터를 사용하여 2000rpm에서 5분동안 원심분리하고, 세포 펠릿의 부피를 측정하여 얻었다. 여기에 따라 중간 값(n=5)을 제4도에 나타난 그래프상에 플로팅시켰다. 즉, 제4도는 담배 BY2 세포 배양물의 성장을 예시한다. 여기에서, 수직 축은 PCV(%) 및 세포수를 나타내고 수평축은 시간(일)을 나타낸다.
제3도 및 제4도에 예시돈 결과는 담배 EXT 유전자가 어느 시간에도 발현되고, 발현이 특히 로그 성장시기의 초기에 강하다는 것을 나타냈다.
제4도에 나타난 EXT 유전자의 패밀리 유전자인 담배 XRP1 유전자가 유도기 및 정지기에 강하게 발현된다는 것이 또한 나타났다.
[실시예 11]
담배 배양 세포를 이용한 일과성 분석
(1) 전달을 위한 플라스미드의 제작
꽃양배추 모자익 모자익이크 바이러스 35S 프로모터, 대장균 기원 GUS 유전자, 및 노팔린 합성 효소로부터 기원하는 전사 종결 서열 카세트를 갖는 pBI121(Clontech)를 사용하여, 상기 플라스미드의 EcoR 부위를 상기 플라스미드를 제한 효소 EcR I으로 완전 분해하고 자가 연결후 대장균 JM 109 균주로 형질 전환시킨후, DNA 블런팅 키트(다카라 슈조(주))를 사용하여 말단 평활화시켜 먼저 제거하였다. 얻어진 플라스미드를 pB1221EL이라 명명하고, pB1221EL로 형질 전환된 대장균 JM 109를 대장균 JM 109/pB1221EL이라 명명하였다. 플라스미드중의 꽃양배추 모자익 모자익이크 바이러스 35S 프로모터 영역을 제거하기 위하여, 상기 플라스미드를 제한 효소 Hind Ⅲ 및 Xba I로 분해하고, 이어서 아가로즈 겔 전기영동에 의해 35S 프로모터 영역외의 목적 단편을 정제하고 절단했다.
다음으로 주형으로서 사용된 실시예 6에서 제조된 pVXG303과 함께, 센스 프라이머로서 프라이머 VAN-UHE(SEQ ID NO 29) 및 안티센스 프라이머로서 프라이머 VAN-LX(SEQ ID NO 30)을 사용하여 PCR을 수행했다. 반응을 94℃(1분), 55℃(2분), 72℃(3분)의 한 사이클을 10회 반복하여 수행했다. 결과적인 단편을 2.5% 아가로즈 겔 전기영동하여 분리하고, 상기 언급된 pB1221EL의 Hind Ⅲ 및 Xba I 부위에 연결시키고, 대장균 JM 109 균주에 형질 전환시켰다. 이 플라스미드를 pEXT△EGUS라 명명하고, pEXT△EGUS로 형질 전환된 대장균 JM 109 균주를 대장균 JM 109/pEXT△EGUS라 명명했다.
다음으로, pEXT△EGUS를 제한 효소 Hind Ⅲ로 완전 분해하고 DNA 블런팅 키트(다카라 슈조(주))를 사용하여 말단 평활화시켰다. 결과적인 DNA 단편을 제한 효소 EcoR I로 완전히 분해시키고, BAT 처리에 의해 말단을 탈인산화시키며, 아가로즈 겔 전기영동에 의해 정제하였다.
한편, 실시예 7에서 제조된 pVZP-H3를 제한 효소 Xba I(다카라 슈조(주))로 완전히 분해한 후, 제한효소 EcoR I로 완전히 분해하여 말단을 평활화 시켰다.
아즈키 콩 EXT 유전자의, Xba I 부위 내지 EcoR I 부위의 프로모터 영역을 함유하는 960-bp DNA 단편을 아가로즈 겔 전기영동에 의해 정제하고, 상기 언급된 pEXT△EGUS DNA 단편에 연결시키며, 대장균 JM 109 균주에 형질 전환시켰다. 이 플라스미드를 pEXT△XGUS라 명명하고, pEXT△XGUS로 형질 전환된 대장균 JM 109 균주를 대장균 JM 109/pEXT△XGUS라 명명하였다.
pEXT△XGUS를 제한 효소 Hind Ⅲ 및 EcoR I로 완전히 분해하고, 실시예 7에서 제조된 pVXP-H3를 제한 효소 Hind Ⅲ 및 EcoR I로 완전히 분해하여 얻은 프로모터를 함유하는 DNA 단편과 연결시키고 이어서 대장균 JM 109 균주에 형질 전환시켰다. 이 플라스미드를 pEXTGUS라 명명하고, pEXTGUS로 형질 전환된 대장균 JM 109 균주를 대장균 JM 109/pEXTGUS라 명명하였다.
(2) 일렉트로포레이션에 의한 유전자 전달
상기 기술된 대로 제조된 pEXT△EGUS, pEXT△XGUS, 및 pEXTGUS의 각각 및 재조군으로서 사용된 오직 GUS 유전자를 갖는 프로모터가 없는 pBI101(Clontech : 제5도에 pGUS라고 표시됨) 및 꽃양배추 모자익 비루스 35S 프로모터 및 GUS 유전자를 갖는 pBI221(Clontech)의 각각에 의해 담배 BY2 배양세포에 전달되는 데에 일렉트로포레이션 방법을 적용하였다.
먼저, 담배 BY2 배양 세포를 1% 셀룰라제-ONOZUKA(Yakult Honsa Co., Ltd.), 0.1% 펙토리아제 Y23(SEISHIN 코포레이션), 및 0.4M 만니톨을 함유하는 효소 용액(pH : 5.5)으로 30℃에서 2시간 동안 처리하여 세포 벽이 없는 원형질로 전환시켰다. 일렉트로포레이션 완충 용액(70mM KCl, 5mM MES, 및 0.3M 만니톨, pH 5.8)주으이 담배 BY2 배양세포의 2×106원형질의 현탁액을 교반하면서 각 플라스미드 DNA의 3 피코몰 및 10% PEG 6000/일렉트로포레이션 완충 용액과 혼합했다. 유전자 펄서(Pulser) Ⅱ(Bio-Rad Laboratories)를 사용하여 전기 진동(300V, 125μF)을 DNA를 식물세포에 전달하기 위하여 결과적인 혼합물에 적용시켰다.
세포를 상기 전달후 옥시으로서 2, 4-D를 ℓ당 0.2㎎, 1% 수크로오스, 및ㄹ 0.4M 만니톨을 함유하는 린스마이어-스쿡(Linsmaier-Skoog) 배양 배지[Physiologia Plantarum, 18, 100 (1965)]중에서 26℃에서 40시간 동안 인큐베이션시켰다. 세포를 추출로 회수하고, 에펜돌프 튜브에 놓인 추출 완충 용액[50mM 인산염 완충제(pH 7.0), 10mM EDTA, 0.1% 트리톤 X-100, 0.1% 사르코실, 및 10mM 2-머캅토에탄올] 200㎕중의 회수에 세포의 혼합물을 출력 콘트롤을 1.5에 듀티(duty) 사이클을 50%에 고정시킨후 초음파기 W-225(Heatsystems-Ultrasonics)를 사용하여 얼음상에서 30초 동안 초음파 처리했다. 이어서 원분리에 의해 단리된 상등액을 GUS 활성의 분석 및 단백질 양의 분석을 위해 사용했다.
(3) 프로모터 활성의 측정
반응을 형광용 96웰-미세역가 플레이트중에 놓인 추출물 각 30㎕에 추출 완충 용액 45㎕ 및 25㎕의 4mM 4-MUG 기질을 첨가하여 수행했다. 5, 35, 및 95분후, 반응을 반응-종결 용액(1M Na2CO3) 50㎕를 첨가하여 종결시켰다. 이어서, 여기화 파장 365nm 및 형광 파장 455nm에서 반응 생성물 4-MU에 의해 발생되는 특정 형광을 형광 플레이트 판독기[Fluoroscan Ⅱ(Laborosystems)]를 사용하여 측정했다.
또한, 단백질 양을 다음과 같이 기술된 과정에 의해 분석했다. 추출물의 1/5-희석된 용액 2, 5, 10, 15, 20 및 30㎕ 또는 1㎖당 800㎕/㎖의 BSA ㅍ준 용액(추출완충 용액의 20㎕를 BSA 1㎖당 1㎎의 80㎕와 혼합했다) 800㎕/㎖를 96-웰 미세역가 플레이트에 위치시키고 그에 각각 희석수 158, 155, 150, 145, 140 및 130㎕ 및 Bio-Rad 단백질 분석 키트(Bio-Rad Laboratories)중의 분석 시약 40㎕를 첨가했다. 서서히 교반하고 실온에서 20분간 방치시킨후, 혼합물을 60분 내에 프레이트 판독기(파장 : 590nm)에 의해 측정하여 단백질 양을 측정했다.
GUS 활성을 다음 방법으로 측정했다. 상기 분석이 수행되는 것과 동시에, 4-MU 표준 용액의 형광 강도를 측정하고 x-축에 4-MU 양(pmol) 및 y-축에 형광 광도를 갖는 그래프상에 플로팅시켰다. 이어서, 1 형광 유니트당 4-MU 양을 기울기로부터 얻고, 추가로, 샘플상의 결과를 x-축에 시간(분) 및 y-축에 형광강도를 갖는 그래프상에 플로팅시켜 형광강도의 증가율을 얻고, 이어서 GUS 활성에 동등한 4-MUG의 분해율을 얻었다. 또한, GUS 특이 활성을 단백질 양으로부터 얻었다. 그 결과가 제5도에 나타나 있다. 달리 말하면, 제5도는 형질 전환된 담배 BY2 배양 세포를 이용하여 EXT 프로모터 활성의 측정을 예시한다. 여기에서, 도면의 막대 그래프는 각 플라스미드의 전달시 GUS-특히 활성(pmol 4MU/분/㎎ 단백질)을 나타내고, 각 플라스미드의 프로모터 영역의 제한 지도가 그아래 예시된다.
제5도에 나타난 바와 같이, EXT 유전자 프로모터 영역을 함유하는 DNA 단편은 식물에 의해서 강하게 발현되는 것으로 기술된 꽃양배추 모자익 모자익이크 바이러스 35S 프로모터의 것보다 강한 활성을 나타냄이 명백해질 수 있다.
[실시예 12]
형질 전환된 아라비도프시스(Arabidopsis)를 이용한 조직 특이성의 검출
(1) 전달용 플라스미드의 제작
제6도 및 제7도에 나타난 바와 같은 전달용 플라스미드를 얻기위하여, 노팔린 합성 효소로 부터 기원하는 전사 종결 서열 카세트 및, 마커 유전자로서 히그로마이신HPT) 및 카나마이신(NPTⅡ)에 내성인 유전자, 및 대장균에서 기원한 인트론 및 꽃양배추 모자익 바이러스 35S 프로모터를 GUS 유전자를 각각 갖는 이원 벡터pBI-HI-35SIG[Plant and Cell Physiology, 31, 805-813(1990)]를 제한효소 Hind Ⅲ 및 SnaB I(다카라 슈조(주))로 분해하고, 이어서 아가로즈 전기영동으로 35S 프로모터 외의 목적 단편을 절단하여 정제하였다. 이어서, 실시예 11에서 준비된 pEXTGUS 및 상기 언급된 pEXT△XGUS 각각을 제한 효소 Hind Ⅲ 및 SnaB I로 분해하고, 아가로즈 겔 전기영동에 의해 아즈키 콩 EXT 프로모터 영역을 함유하는 단편을 절단해내어 정제하였다. 이들 단편을 각각 상기 언급된 pBI-HI-35SIG의 Hind Ⅲ 및 SnaB I 부위에 연결시키고 대장균 JM 109 균주에 형질 전환시켰다. 이들 전달용 플라스미드를 각각 pBVEG101 및 pBVEG121이라 명명하였고, 이들 플라스미드로 형질 전환된 대장균 균주를 대장균 JM 109/pBVEG101 및 대장균 JM 109/pBVEG121이라 각각 명명하였다.
또한, 제8도 및 제9도에 나타난 바와 같이, 오직 GUS 유전자 카세트를 갖는 프로모터가 없는 pBI101(Clontech) 및 꽃양배추 모자익 바이러스 35S 프로모터를 갖는 pBI121(Clontech)의 Hind Ⅲ 및 SnaB I 단편을 대조용 실험용 플라스미드를 얻기 위하여 pBI-HI-35SIG의 Hind Ⅲ 및 SnaB I 쪽에 상기 기술된 바와 같은 방법으로 서브 클로닝하였다. 이렇게 얻어진 플라스미드를 각각 pBI-H-191 및 pBI-H-121이라 명명하고, 이들 플라스미드로 형질 전환된 대장균 JM 109 균주를 각각 대장균 JM 109/pBI-H-101 및 대장균 JM 109/pBI-H-121이라 명명하였다.
(2) 감영용 아그로박테리움의 형질 전환
상기 언급된 플라스미드의 각각을 아그로박테리움 투메페션스(Agrobacterium tumefaciens) EHA101 컴피던트 세포[SHOKUBUKU SAIBOU KOUGAKU(Plant Cell Technology) 4(3), 193-203(1992)]와 혼합하고, 유전자 펄서 Ⅱ(Bio-Rad laboratories)를 사용하여 전기 펄스(2.5kV, 25μF, 200Ω)을 방출시키며, 플라스미드를 아그로박테리움 균주에 플라스미드를 전달하기 위하여 30℃에서 2일간 배양했다. 이들 플라스미드로 형질 전환된 아그로박테리움 균주를 아그로박테리움 투멘페션스 EHA101/pBVE121, 아그로박테리움 투메페션스 EHA101/pBI-H-121, 아그로박테리움 투메페션스 EHA101/pBI-H-101 및 아그로박테리움 투메페션스 EHA101/pBI-H-121이라 명명하였다.
(3) 트랜스제닉 식물의 생성
아라비돕시스 탈리아나(Arabidopsis thaliana)(Notlingham Arabidopsis Stock Center : NASC)의 eco-형인 WS 종자의 표면을 20% 차아염소산염으로 살균시키고, MSO 플레이트[2% 수크로오스, 3㎎/ℓ, 티아민 염산염, 5㎎/ℓ 니코틴산, 및 0.5㎎/ℓ 피리독신 염산염과 혼합된 MURASHIGE-Skoog 무기염 혼합물(WAKO Pure Chemicals Industries, Ltd.)을 pH 6.3으로 조정하고, 추가로 0.2% 겔란 검과 혼합하며, 살균하고, 플레이트시킴]상에 파종하고, 4℃에서 2일 동안 저온 처리한 다음 3000-룩스의 빛의 연속적 조사하에 22℃에서 배양했다. 새로운 MSO 플레이트에의 이식은 각각 1주일째 및 2주일째 수행하고, 2주일째 이식 후 2일, 3내지 4개의 밑동 줄기를 다발로 묶어 절단하여 약 1㎝-길이의 뿌리 절편을 준비했다. 이들 뿌리 절편을 CIM 플레이트(0.5㎎/ℓ 2,4-디클로로페녹시아세트산 및 0.05㎎/ℓ 키네틴)에 나란히 놓고 3000룩스 빛의 연속적 조사하에 22℃에서 2시간 동안 배양했다. 그후, 2일 배양된 뿌리 절편을 30℃에서 2일 동안 (2)에서 얻은 아그로박테리움 균주의 각각을 배양하고 MS 용액으로 5배 희석시켜 제조된 요액에 30초간 침지하고, 과잉의 물을 제거하기 위해 물기를 빨아들이며, 새로운 CIM 플레이트에 나란히 위치시키고, 2일 동안 배양했다. 2일 후, 감염된 절편을 SIMC 플레이트[MSO 플레이트에 5㎎/ℓ N6-(2-이소펜테닐)아데닌, 0.15㎎/ℓ 인돌아세트산, 및 0.3g/ℓ 카르베니실린을 첨가 함]에 옮기고, 2일 동안 배양한 다음 이어서 SIMCS 플레이트(SIMC 플레이트에 카나마이신 50㎎/ℓ 및 하이그로마이신 20㎎/ℓ을 첨가함)에 이식하였다. 식물을 매 1주일당 1회 또는 2회 새로운 SIMCS 플레이트를 반복적으로 이식하였다.
새순의 재생이 관찰되고 재생된 식물이 약 5㎜의 완전한 장미매듭형 잎으로 되었을 때, 식물 부분을 찰혼으로 부터 절단해 내어 RIM 플레이트(0.5㎎/ℓ 인돌아세트산을 MSO 플레이트에 첨가 함)에 가볍게 삽입시켰다. 뿌리째 뽑아진 식물의 각각을 암면상에 최종 이식시키고, 액체[Hyponecks (Hyponecks Japan)가 물로 1000배 희석됨]중에서 배양시켜 T2 종자를 얻었다.
(4) 조직 특이성의 검출
(3)에서 얻은 종자를 MSKH 플레이트(50㎎/ℓ 카나마이신 및 20㎎/ℓ 하이그로마이신을 MSO 플레이트에 첨가함)에 파종하여 내성이 있는 줄기를 선택했다.
내성이 있는 줄기를 최종적으로 암면상에 이식하고 액체[하이포넥스(Hypone- cks ; Hyponecks Japan)는 물로 1000배 희석하였다]중에서 배양하였다.
파종한 지 약 30일후에, 개화하고 장각과의 형성이 시작된 식물의 지상부의 일부분을 절단하여 샘플을 채취하였다. 절단된 식물 절편을 실온에서 1시간 동안 고정용액(20% 파라포름알데히드, 0.1M 인산염 완충액, 1mM EDTA, pH 7.0)에 침지시키고, 0.1M 인산염 완충액으로 2회 세척한 후, 기질용액[2mM X-Gluc, 50mM 인산염 완충액(pH 7.0, 0.5% xmflxhs X-100 및 20% 메탄올]에 침지시켰다. 25분 동안 탈기시켜 기질용액의 침투를 촉진시킨 후, 37℃에서 1-3일동안 반응을 수행하였다. 반응이 종결된 후에 샘플을 70% 에탄올로 세척한 다음 40% 글리세롤에 침지시켜 관찰하고, 보관하였다.
반응의 결과는, GUS-특이 염색이 pBI-H-101로 형질 전환된 식물뿐 아니라 야생형 식물에서도 관찰되지 않은 반면에 pBI-H-121(꽃양배추 모자익 모자익이크 바이러스 35S 프로모터)로 형질 전환된 식물의 모든 조직에서는 염색이 검출되었음을 사시하였다.
한편, 아즈키 콩 EXT 유전자 프로모터를 함유하는 pBVEG101 및 pBVEG121로 형질 전환된 식물에서는 줄기의 신장부, 잎과 장각과의 말단 및 암술의 말단에서 GUS 염색이 관찰되었으며, 이는 이들 부위가 강력한 프로모터 활성을 가지고 있음을 시사하는 것이다. 이들 결과중에서 야생형, pBI-H-121 및 pBVEG101에 대한 결과는 제10도에 나타내었다.
[실시예 13]
주형으로 사용된 아즈키 콩 게놈 DNA의 Hind Ⅲ, NSP V 및 Xba I 단편을 사용한 역 PCRs에 의한 아즈키 콩 EXT2 유전자 프로모터의 분리
실시예 5에서와 동일한 방식에 의해 아즈키 콩 잎으로부터 제조한 게놈 DNA 1㎍을 별개의 튜브에 넣고 제한효소 Hind Ⅲ, Nsp V 및 Xba I 각각에 의해 완전히 분해시키고 페놀/클로로포름 용액으로 1회 추출하여 효소를 불활성화시킨 다음 에탄올로 침전시켰다. 에탄올-침전된 DNA를 증류수 268㎕, 10×연결 완충용액 30㎕ 및 T4 DNA 리가제(TAKARA SHUZO Co., Ltd) 2㎕와 혼합시키고 16℃에서 밤새 반응시켜 자가-연결반응을 수행하였다. 수득된 사이클릭 게놈 DNA 0.1㎍을 주형으로 사용하여, TaKaRa LA PCR 키트(TAKARA SHUZO Co., Ltd.)을 사용한 PCR을 센스 프라이머로서 프라이머 IP44-3(SEQ ID NO 31)을 사용하고 안티센스 프라이머로서 프라이머 IP44-5(SEQ ID NO 32)를 사용하여 수행하였다. 반응은 94℃(1분), 98℃(20초) 및 67℃(10분)의 사이클을 30회 반복하여 수행하고 최종적으로 72℃(10분)에서 수행하였다. 반응이 종결된 후에 반응용액 5㎕에 대해 1% 아가로즈겔 전기영동을 수행하였으며, 그 결과 약 6.0kbp 밴드가 제한효소 Hind Ⅲ에 의해 분해된 샘플에서만 관찰되는 것으로 나타났다. 다른 샘플의 경우에는 이 반응에서 어떠한 증폭도 관찰되지 않았다. 그 후에, 제한효소 Hind Ⅲ로 분해된 샘플의 100-배 희석액 및 희석하지 않은 다른 반응용액 각각의 1㎕씩을 PCR을 위한 주형으로 사용하여 센스 프라이머로서 프라이머 IP44-2(SEQ ID NO 33) 및 안티센스 프라이머로서 프라이머 IP44-5(SEQ ID NO 32)를 사용하여 동일한 방식으로 PCR을 수행하였다. 반응이 종결된 후에 반응 용액 5㎕에 대해 1% 아가로즈 겔 전기영동을 수행하여 약 6.0kbp 밴드가 매우 강력하며, 따라서, 제한 효소 Hind Ⅲ에 의해 분해된 샘플에서 특이적으로 증폭되었음을 확인하였다. 제한 효소 Nsp V에 의해 분해된 샘플에서는 외견상으로 비특이적인 다수의 DNA 단편이 증폭되었으며, 약 1.2-kbp 밴드가 주밴드인 것으로 보인다. 제한 효소 Xba I로 분해된 샘풀에서는 외견상으로 비특이적인 다수의 DNA 단편이 증폭되었으며 따라서 목적하는 단편의 확인이 어려웠다. 그후에, 제한효소 Hind III로 분해된 샘플로 부터 일차 PCR에서 수득된 DNA 단편을 겔로 부터 회수하여 DNA 블런팅 키트(Blunting Kit)(TAKARA SHUZO Co., Ltd.)를 사용하여 평활 말단화시키고, 5'-말단에서 5'-말단 표지 키트 메가라벨(5'-Terminal-Labelling Kit MEGALABELTM)(TAKARA SHUZO Co., Ltd.)을 사용하여 PCR 생성물을 인산화시킨 다음 pUC118의 Hinc II 부위에 이입시켰다. 생성된 플라스미드로 대장균 JM109를 형질 전환시켰으나, 콜로니는 수득되지 않았다.
그후에, 약 6.0-kbp PCR 단편의 제한지도를 작성하여 프로모터 영역을 규정한 다음 여러개의 단편을 분리하여 서브클론화시키도록 계획을 세웠다.
우선, 이 PCR 단편을 평활 말단화시키고 이어서 제한 효소 Hind III로 분해시켜 약 3.1 kbp 밴드 및 약 2.9 kbp 밴드를 분리하였다. 이들 DNA 단편을 함께 pUC118의 Hind II-Hinc II 부위에 연결시키고 대장균 JM109를 형질 전환시켰지만, 약 2.9 kbp DNA가 삽입된 단편을 함유하는 플라스미드만이 수득되었으며 약 3.1 kbp DNA를 갖는 플라스미드는 수득되지 않았다. 또한, 프라이머 IP44-2(SEQ ID NO 33) 및 M13 플라이머 M4(TAKARA SHUZO Co., Ltd.)를 사용한 PCR 및 프라이머 IP44-6(SEQ ID NO 34) 및 M13 프라이머 M4(TAKARA SHUZO Co., Ltd.)를 사용한 PCR의 결과에 의해, 프라이머 IP44-6(SEQ ID NO 34) 및 M13 프라이머 M4의 경우에만 증폭이 나타났으며 2.9kbp 삽입 단편은 아즈키 콩 EXT2 유전자의 3'-하부 영역을 함유하는 반면에 3.1kbp 단편은 프로모터 영역을 함유하는 것으로 밝혀졌다.
제11도는 프라이머 IP44-3 및 IP44-5에 의해 증폭된 약 6.0kbp PCR 단편의 제한지도를 나타낸 것이다. 도면에서 제한지도의 상부는 프라이머 IP44-5의 뉴클레오타이드 서열에 상응하는 것이고, 하부는 프라이머 IP44-3의 뉴클레오타이드 서열에 상응하는 것이다.
그 후, 약 6.0 kbp 단편상에 두개의 EcoR I 부위가 존재하기 때문에 PCR 단편을 평활 말단화시킨 다음 제한효소 Hind III 및 EcoR I로 분해시켜 약 0.4 kbp 밴드, 약 0.5 kbp 밴드 및 약 2.55kbp 밴드를 분리시켰다. 제한 지도(제11도)에서는 약 0.5 kpb 및 2.55 kbp에 프로모터 영역이 존재하는 것으로 나타났기 때문에 이들 밴드를 각각 pUC118의 EcoR I-Hinc II 부위 및 EcoR I-Hind III 부위에 연결시키고, 이어서 대장균 JM109를 형질 전환시켰다.
이렇게 해서 수득한 콜로니중에서 EcoR I-Hinc II 부위에서의 연결반응에 의해 수득된 16개의 콜로니를 플라이머 IP44-2(SEQ ID NO 33) 및 M13 프라이머 M4(TAKARA SHUZO Co., Ltd.)를 사용하는 PCR에 의해 선별하여 7개의 콜로니가 양성인 것을 확인하였다. 이들 양성 콜로니들중에서 3개의 콜로니로 부터 플라스미드를 추출하여 각각 pVX2P501, pVX2P503 및 pVX2P505로 명명하였다.
pVX2P501, pVX2P503 및 pVX2P505에 함유된 삽입 단편의 뉴클레오타이드 서열은, pVX2P501, pVX2P503 및 pVX2P505 각각을 M13 프라이머 M4(TAKARA SHUZO Co., Ltd.) 및 M13 프라이머 RV(TAKARA SHUZO Co., Ltd.)를 사용하여 생거(Sanger) 방법에 따르는 각각의 삽입 단편의 서열 분석에 적용시킨 다음 이들의 결과를 포괄적으로 해석하여 결정하였다. 이들 서열과 원품종 아즈키 콩 EXT2 cDNA의 서열(SEQ ID NO 11)을 비교한 결과 중복 부위는 동일하고, 또한 3가지 형태의 클론은 완전히 동일한 서열을 가지는 것으로 밝혀졌다.
EcoR I-Hind III 부위에서의 연결반응에 의한 46개의 콜로니를 프라이머 IP44-2(SEQ ID NO 33) 및 M13 프라이머 M4(TAKARA SHUZO Co., Ltd.)를 사용하는 PCR에 의해 선별하여 27개의 콜로니가 약 2.6 kbp 삽입 단편을 함유하는 것을 확인하였다.
그후에, 상기의 약 2.6 kbp 단편을 제한효소 Acc I(TAKARA SHUZO Co., Ltd.)로 분해하면 3개의 콜로니로 부터 약 600 bp 단편이 나타나고, 12개의 콜로니로 부터는 약 500 bp 단편이 나타났다. 전술한 제한지도(제11도)에서 약 600 bp 단편이 프로모터 영역을 함유하는 클론으로 부터 나타나는 것으로 확인되기 때문에 플라스미드로 부터 3개의 양성 콜로니를 추출하여 각각 pEXT2pro(F)f1, pEXT2pro(F)f2 및 pEXT2pro(F)f3으로 명명하였다.
M13 프라이머 M4(TAKARA SHUZO Co., Ltd.) 및 M13 프라이머 RV(TAKARA SHUZO Co., Ltd.)를 사용하는 생거 방법에 따른 pEXT2pro(F)f1, pEXT2pro(F)f2 및 pEXT2pro(F)f3 각부분의 서열 분석의 결과 3가지 형태의 클론은 완전히 동일한 서열을 가지는 것으로 밝혀졌다. 그 다음에 약 2.6 kbp 삽입 단편의 전체 부위의 서열을 결정하기 위하여 합성 올리고머 E/Psite (1) (SEQ ID NO 35) 및 합성 올리고머 E/Psite (2) (SEQ ID NO 36)를 사용하여 제조된 Pst I 부위 어댑터를 pEXT2pro(F)f3의 EcoR I 부위에 이입시켰다. 이러한 이입에 의해 pEXT2pro(F)f3의 EcoR I 부위의 반대편에 Pst I 부위 만이 이입되었다.
또한, 이 플라스미드를 제한효소 Pst I 및 EcoR I로 완전히 분해시킨 후에 킬로-시퀀스 딜리숀 키트(Kilo-Sequence Deletion Kit)(TAKARA SHUZO Co., Ltd.)를 이용하여 EcoR I 부위와 삽입 단편 부위와의 사이가 결실된 클론을 수득하였다.
pEXT2pro(F)f3에 함유된 삽입 단편의 뉴클레오타이드 서열은 적절한 길이를 갖는 선별되고 결실된 몇개의 클론을 M13 프라이머 M4(TAKARA SHUZO Co., Ltd) 및 M13 프라이머 RV(TAKARA SHUZO Co., Ltd.)를 사용하여 생거(Sanger) 방법에 따라 각각의 삽입 단편의 서열 분석에 적용시킨 다음 이들의 결과를 포괄적으로 해석함으로써 결정하였다.
pVX2P501, pVX2P503 및 pVX2P505에 함유된 삽입 단편의 뉴클레오타이드 서열이 게놈상에서 pEXT2pro(F)f3에 함유된 삽입 단편의 뉴클레오타이드 서열에 연속하여 존재한다는 사실은 PCRs 및 이들의 경계부분이 직접적인 서열분석에 의해 확인되었다. 서열목록중의 SEQ ID NO 3은 이 아즈키 콩 EXT2 N-말단 아미노산 서열 상류의 프로모터 영역에서의 약 3.0 kbp 서열을 나타낸 것이다.
[실시예 14]
주형으로 사용된 아즈키 콩 게놈 DNA의 Hind III, Nsp V 및 Xba I 단편을 사용한 역 PCRs에 의한 아즈키 콩 EXT3 유전자 프로모터의 분리
실시예 13에 기술된 것과 동일한 방식에 의해 아즈키 콩 게놈 DNA를 제한 효소 Hind III, Nsp V 및 Xba I에 의해 완전히 분해시킨 다음 자가-연결시켜 제조한 사이클릭 게놈 DNA 0.1㎍을 주형으로 사용하여, TaKaRa LA PCR 키트(TAKARA SHUZO Co., Ltd.)를 사용한 PCR을 센스 프라이머로서 프라이머 IP45-3(SEQ ID NO 37)을 사용하고 안티센스 프라이머로서 프라이머 IP45-5(SEQ ID NO 38)를 사용하여 수행하였다. 반응은 94℃(1분), 98℃(20초) 및 67℃(10분)의 사이클을 30회 반복하여 수행하고 최종적으로 72℃(10분)에서 수행하였다. 반응이 종결된 후에 반응용액 5㎕에 대해 1% 아가로즈겔 전기영동을 수행하였으며, 그 결과 약 4.5 kbp 밴드가 제한 효소 Nsp V에 의해 분해된 샘플에서만 관찰되는 것으로 나타났다. 다른 샘플의 경우에는 이 반응에서 어떠한 증폭도 관찰되지 않았다. 그후에, 제한 효소 Nsp V로 분해된 샘플의 100-배 희석액 및 희석하지 않은 다른 반응 용액 각각의 1㎕ 씩을 PCR을 위한 주형으로 사용하여 센스 프라이머로서 프라이머 IP45-2(SEQ ID NO 39) 및 안티센스 프라이머로서 프라이머 IP45-6(SEQ ID NO 40)을 이용하여 동일한 방식으로 PCR을 수행하였다. 반응이 종결된 후에 반응 용액 5㎕에 대해 1% 아가로즈겔 전기영동을 수행하여 약 4.5 kbp 밴드가 매우 강력하며, 따라서 제한 효소 Nsp V에 의해 분해된 샘플에서 특이적으로 증폭되었음을 확인하였다. 제한 효소 Hind III에 의해 분해된 샘플에서는 외견상으로 비특이적인 다수의 DNA 단편이 증폭되었으며, 따라서 목적하는 단편의 확인이 어려웠다. 또한, 제한 효소 Xba I로 분해된 샘플에서는 약 4.5 kbp 및 약 3.5 kbp의 두개의 주밴드가 확인되었다.
그후에 제한 효소 Nsp V로 분해된 샘플로 부터 일차 PCR에서 수득된 약 4.5kbp DNA 단편을 겔로 부터 회수하여 DNA 블런팅 키트(Blunting Kit)(TAKARA SHUZO Co., Ltd.)를 사용하여 평활 말단화시키고, 5'말단에서 5'-말단표지 키트 메카라벨(5'-Terminal-Labelling Kit MEGALABLETM)(TAKARA SHUZO Co., Ltd.)을 사용하여 PCR 생성물을 인산화시킨 다음 pUC118의 Hinc II 부위에 이입시켰다. 생성된 플라스미드로 대장균 JM109를 형질 전환시켰다.
수득된 콜로니들 중에서, 프라이머 IP45-2(SEQ ID NO 39) 및 M13 프라이머 M4(TAKARA SHUZO Co., Ltd.)를 사용하는 PCR에 의해 46개의 콜로니를 선별하였으며, 이중에서 3개의 콜로니가 양성인 것으로 확인되었다. 이들 양성 콜로니중에서 3개의 콜로니로 부터 플라스미드를 추출하여 각각 pVX3P206, pVX3P234 및 pVX3P237로 명명하였다.
pVX3P206, pVX3P234 및 pVX3P237 각각에 대하여 M13 프라이머 M4(TAKARA SHUZO Co., Ltd.) 및 M13 프라이머 RV(TAKARA SHUZO Co., Ltd.)를 사용하는 생거 방법에 따라 각각의 삽입 단편의 양 말단부분에 대한 서열분석을 수행하였다. 그 결과, 이들 서열은 PCR에서 사용된 프라이머를 함유하는 것으로 확인되었으며, 이들 서열과 원품종 아즈키 콩 EXT3 cDNA의 서열(SEQ ID NO 12)을 비교한 결과로 중복 부분은 동일한 것으로 밝혀졌다. 또한 3가지 타입의 클론은 분석된 범위에서 완전히 동일한 서열을 가지고 있었다.
이 단편을 제한 효소 Nsp V로 완전히 분해시키면 약 4.0kbp 밴드가 약 0.5 kbp 및 약 3.5 kbp의 두개의 밴드로 분리되었다. 그후에, PCR 방법을 사용하여 약 0.5 kbp 및 약 3.5 kbp의 두개의 밴드중의 어떤 것이 프로모터 영역을 함유하는지 확인하였다. 그 결과, 약 0.5 kbp 밴드가 프로모터 영역을 함유하는 DNA 단편인 것으로 밝혀졌다.
그 후에, 제한 효소 Xba I에 의해 분해된 샘플의 2차 PCR에 의해 수득된 약 4.5 kbp 및 약 3.5 kbp의 두개의 주밴드를 사용하여 상기 프로모터 영역의 5'-상류를 클론닝하고자 계획하였다.
이들 DNA 단편을 제한 효소 Nsp V로 완전히 분해시키면 약 4.5kbp 밴드가 약 0.5 kbp 및 약 4.0 kbp의 두개의 밴드로 분리되었다. 한편, 약 3.5 kbp 밴드는 제한 효소 Nsp V에 의해 분해되지 않았다. 따라서, 약 4.5 kbp 밴드가 프로모터 영역을 함유하는 것으로 판단되었다.
그 후에, 약 4.5 kbp DNA 단편을 제한 효소 Nsp V 및 Xba I로 분해시킨 다음 제한 효소 Nsp V-Xba I로 이중 분해시켜 약 4.5 kbp DNA 단편의 제한지도를 작성하였다.
제12도는 프라이머 IP45-3 및 IP45-5로 증폭된 약 4.5 kbp 단편의 제한 지도를 나타낸 것이다. 도면에서 제한 지도의 상부는 프라이머 IP45-5의 뉴클레오타이드 서열에 상응하며, 하부는 프라이머 IP45-3의 뉴클레오타이드 서열에 상응한다.
그 결과, Nsp V-Xba I의 약 3.0 kbp DNA 단편은 프로모터 영역의 5'-상류에 존재하는 것으로 밝혀졌다.
그후에 제한효소 Nsp V-Xba I에 의한 약 4.5 kbp DNA 단편의 이중분해에 의해 형성된 약 3.0 kbp DNA 단편을 겔로 부터 회수하여 pBluescript SK (-) (Stratagene)의 Xba I-Acc I 부위에 이입시켰다. 생성된 플라스미드로 대장균 JM109를 형질 전환시켰다.
수득된 콜로니들중에서 M13 프라이머 M4(TAKARA SHUZO Co., Ltd.) 및 M13 프라이머 RV(TAKARA SHUZO Co., Ltd.)를 사용하는 PCR에 의해 7개의 콜로니를 선별하였으며, 이중에서 6개의 콜로니가 약 3.0 kbp 삽입 단편을 함유하는 것으로 확인되었다. 이들 6개의 콜로니로 부터 플라스미드를 추출하여 각각 pVX3P101, pVX3P103, pVX3P104, pVX3P105, pVX3P106 및 pVX3P107로 명명하였다.
이들 플라스미드중에서 pVX3P101, pVX3P103, pVX3P104 및 pVX3P107 각각에 대하여 M13 프라이머 M4(TAKARA SHUZO Co., Ltd.) 및 M13 프라이머 RV(TAKARA SHUZO Co., Ltd.)를 사용하는 생거 방법에 따라 각각의 삽입 단편부분의 뉴클레오타이드 서열에 대한 부분을 서열 분석하였으며, 이에 의해 4가지 형태의 클론은 완전히 동일한 서열을 가지는 것으로 확인되었다. 그후, 약 3.0 kbp 삽입 단편의 전체 영역의 서열을 결정하기 위하여 pVX3P107을 제한 효소 Kpn I(TAKARA SHUZO Co., Ltd.) 및 Xho I(TAKARA SHUZO Co., Ltd.)로 완전히 분해시킨 후에 킬로-시퀀스 딜리숀 키트(Kilo-Sequence Deletion Kit)(TAKARA SHUZO Co., Ltd.)를 사용하여 Xho I 부위와 삽입 단편 부위와의 사이가 결실된 클론을 수득하였다. pVX3P107에 함유된 삽입 단편의 뉴클레오타이드 서열은, 적절한 길이를 갖는 몇개의 선별된 결실 클론에 대하여 M13 프라이머 M4(TAKARA SHUZO Co., Ltd.) 및 M13 프라이머 RV(TAKARA SHUZO Co., Ltd.)를 사용하여 생거 방법에 따라 개개의 삽입 단편 부분의 서열분석을 행하고 그 결과를 포괄적으로 해석함으로써 결정하였다. pVX3P206, pVX3P234 및 pVX3P237에 함유된 삽입 단편의 뉴클레오타이드 서열이 게놈상에서 pVX3P107에 함유된 삽입 단편의 뉴클레오타이드 서열과 연속하여 존재한다는 사실은 PCRs 및 그의 경계부분의 직접서열분석에 의해 확인하였다. 서열 목록의 SEQ ID NO 4는 이렇게 하여 수득된 아즈키 콩 EXT3 N-말단 아미노산 서열 상부의 프로모터 영역내의 약 3.4 kbp 서열을 나타낸 것이다.
[실시예 15]
아즈키 콩 게놈 DNA의 Hind III, Nsp V 및 Xba I 단편을 주형으로 사용한 역 PCRs에 의한 아즈키 콩 XRP1 유전자 프로모터의 분리
실시예 13에 기술된 것과 동일한 방식에 의해 아즈키 콩 게놈 DNA를 제한 효소 Hind III, Nsp V 및 Xba I에 의해 완전히 분해시킨 다음 자가-연결반응시켜 제조한 사이클릭 게놈 DNA 0.1㎍을 주형으로 이용하여, TaKaRa La PCR 키트(TAKARA SHUZO Co., Ltd.)를 사용한 PCR을 센스 프라이머로서 프라이머 IPM6-3(SEQ ID NO 41) 및 안티센스 프라이머로서 프라이머 IPM6-4(SEQ ID NO 42)를 사용하여 수행하였다.
반응은 94℃(1분), 98℃(20초) 및 67℃(10분)의 사이클을 30회 반복하여 수행하고 최종적으로 72℃(10분)에서 수행하였다. 반응이 종결된 후에 반응용액 5㎕에 대해 1% 아가로즈겔 전기영동을 수행하였으며, 그 결과 어떠한 증폭도 관찰되지 않는 것으로 확인되었다.
그후에, 반응 용액 1㎕를 PCR을 위한 주형으로 사용하여, 센스 프라이머로서 프라이머 IPM6-2(SEQ ID NO 43) 및 안티센스 프라이머로서 프라이머 IPM6-5(SEQ ID NO 44)를 사용하여 동일한 방식으로 PCR을 수행하였다. 반응이 종결된 후에 반응용액 5㎕에 대해 1% 아가로즈겔 전기영동을 수행하였으며, 그 결과 제한효소 Hind III 및 Nsp V로 분해된 샘플에서는 외견상 비특이적인 다수의 DNA 단편이 증폭되었으며, 따라서 목적하는 단편의 확인은 어려운 것으로 밝혀졌다. 또한, 제한효소 Xba I로 분해된 샘플에서는 약 2.5 kbp 및 약 0.6 kbp의 두개의 주밴드가 확인되었다.
그후에 제한효소 Xba I로 분해된 샘플로 부터 2차 PCR에서 수득된 약 2.5 kbp 및 약 0.6 kbp의 두개의 DNA 단편을 겔로 부터 회수하여 DNA 블런팅 키트(Blunting Kit)(TAKARA SHUZO Co., Ltd.)를 사용하여 평활 말단화시키고, 5'-말단에서 5'-말단 표지 키트 메가라벨(5'-Terminal-Labelling Kit MEGA-LABELTM)(TAKARA SHUZO Co., Ltd.)을 사용하여 PCR 생성물을 인산화시킨 다음 pUC118의 Hinc II 부위에 이입시켰다. 생성된 플라스미드로 대장균 JM109를 형질 전환시켰다.
수득된 콜로니들의 각각의 그룹중에서 M13 프라이머 M4(TAKARA SHUZO Co., Ltd.) 및 M13 프라이머 RV(TAKARA SHUZO Co., Ltd.)를 사용하는 PCR에 의해 6개의 콜로니를 각각 선별하였으며, 이중에서 약 2.5 kbp 밴드로 부터는 5개의 콜로니가 양성이었고 약 0.6 kbp 밴드로 부터는 3개의 콜로니가 양성인 것으로 확인되었다. 이들 양성 콜로니로 부터 플라스미드를 추출하였다. 약 2.5 kbp 밴드로부터 수득한 플라스미드는 각각 pXRG301, pXRG302, pXRG303, pXRG304 및 pXRG305로 명명하였다. 또한 약 0.6 kbp 밴드로부터 수득한 플라스미드는 각각 pXRG403, pXRG404 및 pXRG406으로 명명하였다.
pXRG301, pXRG302, pXRG304 및 pXRG305를 제한 효소 EcoR I 및 Sph I(TAKARA SHUZO Co., Ltd.) 둘다에 의해 완전히 분해시켜 pXRG302, pXRG303 및 pXRG304로 부터 수득한 3개의 플라스미드만이 약 2.5 kbp 삽입 단편을 갖는 것을 확인하였다. 또한 pXRG301, pXRG302, pXRG303, pXRG304, pXRG305, pXRG403, pXRG404 및 pXRG406을 제한 효소 Xba I로 완전히 분해시키면 벡터내의 한 부위가 아닌 삽입 단편내의 한 부위에서 분해가 일어나 약 1.1 kbp 밴드가 형성되었으며, 한편 pXRG403, pXRG404 및 pXRG406은 벡터내에 존재하는 부위에서만 분해가 일어났다. 이러한 결과는 pXRG301, pXRG302, pXRG303, pXRG304 및 pXRG305가 목적하는 아즈키 콩 XRP1 프로모터 영역을 함유하고 있음을 시사하는 것이다.
pXRG301, pXRG302, pXRG303 및 pXRG304 각각에 대하여 M13 프라이머 M4(TAKARA SHUZO Co., Ltd.) 및 M13 프라이머 RV(TAKARA SHUZO Co., Ltd.)를 사용하여 생거 방법에 따라 개개의 삽입 단편의 양 말단 부분의 서열 분석을 수행하였다. 그 결과, pXRG302 및 pXRG303의 서열이 PCR에 사용된 프라이머를 함유하고 있는 것으로 확인되었으며, 이들 서열을 원품종 아즈키 콩 XRP1 cDNA의 서열(SEQ ID NO 14)와 비교하면 중복부위가 동일한 것으로 밝혀졌다. 또한 2가지 형태의 클론은 완전히 동일한 서열을 가지고 있었다.
제13도는 프라이머 IPM6-2 및 IPM6-5로 증폭된 약 2.5 kbp 단편의 제한지도를 나타낸 것이다. 도면에서 제한 지도의 상부는 프라이머 IPM6-5의 뉴클레오타이드 서열에 상응하며, 하부는 프라이머 IPM6-2의 뉴클레오타이드 서열에 상응한다.
삽입 단편중의 약 1.1 kbp의 아즈키 콩 XRP1 프로모터 영역의 뉴클레오타이드 서열은, M13 프라이머 M4(TAKARA SHUZO Co., Ltd.) 및 M13 프라이머 RV(TAKARA SHUZO Co., Ltd.)를 사용하여 생거 방법에 따라 개개의 삽입 단편 부분의 서열분석을 수행하고, 이어서 삽입 단편내의 서열을 기초로 하여 합성된 프라이머를 추가로 분석하고 이들 결과를 포괄적으로 해석함으로써 결정하였다. 서열리스트중의 SEQ ID NO 5는 이 아즈키 콩 XRP1 N-말단 아미노산 서열 상부의 프로모터 영역내의 약 1.1 kbp 서열을 나타낸 것이다.
[실시예 16]
토마토 게놈 DNA의 EcoR I, Hind III, Nsp V 및 Xba I 단편을 주형으로 사용한 역 PCRs에 의한 토마토 유전자 프로모터의 분리
라이코페르시콘 에스쿨렌툼 컬티바 폰테로사(Lycopersicon esculentum cv. Ponterosa)의 종자(TAKII SEED Co., Ltd.)를 발아시킨 다음 약 한달동안 재배하여 약 10g의 잎과 줄기를 얻었다. 이들 잎과 줄기 약 2.5g을 액체 질소의 존재하에 모터(mortar)에서 분쇄하여 백색 분말을 제조하였다. 수득한 잎과 줄기 분말을 즉시 50㎖ 폴리스티렌 튜브에 넣고 25% SDS와 혼합한 우레아-페놀 DNA 추출 완충용액[0.05M 트리스-HCl (pH 7.6), 0.02M EDTA, 5% 페놀, 8M 우레아, 0.35M NaCl 및 2% 나트륨라우로일사르코시네이트] 10㎖로 65℃에서 1시간 동안 추출하였다. 추출물을 2배 부피의 페놀-클로로포름-이소아밀알콜(25:24:1) 혼합물과 혼합시키고 약 15분 동안 온화하게 교반한 다음 2000 rpm에서 15분 동안 원심분리시켰다. 원심분리후에 상등액을 새로운 튜브에 옮기고 다시 2배 부피의 페놀-클로로포름-이소아밀알콜(25:24:1) 혼합물과 혼합시켜 약 15분 동안 온화하게 교반한 다음 2000 rpm에서 15분 동안 원심분리시켰다. 이 원심분리가 끝난 후에 상등액을 새로운 튜브에 옮겨 2배 부피의 에탄올과 혼합시키고 온화하게 교반하였다. 그후, 침전된 백색 게놈 DNA를 파스퇴르 피펫(Pasteur pipet)를 사용하여 코일화하여 새로운 튜브에 옮겼다. 이 튜브에 TE 완충용액[10 mM 트리스-HCl (pH 8.0) 및 1 mM EDTA] 1.5㎖를 가하고, 생성된 혼합물을 55℃에서 밤새 유지시켜 DNA를 용해시켰다. 이 DNA 용액을 10배 희석하여 제조한 샘플 1㎕를 0.4% 아가로즈겔 전기영동에 의해 분석한 결과, 용액은 약 100ng/㎕의 농도로 고분자 DNA를 함유하는 것으로 밝혀졌다. 즉, 약 2.5g의 식물부분으로 부터 게놈 DNA 약 150㎍이 수득되었다.
이 게놈 DNA 1㎍을 별도로 튜브에 취하여 실시예 13에 기술된 바와 동일한 방식에 따라 제한 효소 EcoR I, Hind III, Nsp V 및 Xba I를 각각 사용하여 완전분해시킨 다음 자가-연결반응시켰다. 이렇게 하여 제조된 사이클릭 게놈 DNA 1㎍을 주형으로 사용하여, TaKaRa LA PCR 키트(TAKARA SHUZO Co., Ltd.)를 사용한 PCR을 센스 프라이머로서 프라이머 IPLE-3(SEQ ID NO 45) 및 안티센스 프라이머로서 프라이머 IPLE-4(SEQ ID NO 46)를 사용하여 수행하였다. 반응은 94℃(1분), 98℃(20초) 및 67℃(10분)의 사이클을 30회 반복하여 수행하고 최종적으로 72℃(10분)에서 수행하였다. 반응이 종결된 후에 반응용액 5㎕에 대해 1% 아가로즈 겔 전기영동을 수행하였으며, 그 결과 제한효소 Hind III 및 Xba I로 분해된 샘플에서 약 6.6-kbp 밴드가 관찰되는 것으로 확인되었다. 다른 샘플의 경우에는 이 반응에서 어떠한 증폭도 나타나지 않았다. 그후, 제한 효소 Xba I로 분해된 샘플로 부터 수득한 반응용액 1㎕를 주형으로 사용하여, TaKaRa LA PCR 키트(TAKARA SHUZO Co., Ltd.)를 사용한 2차 PCR을 센스 프라이머로서 프라이머 IPLE-2(SEQ ID NO 47) 및 안티센스 프라이머로서 프라이머 IPLE-5(SEQ ID NO 48)을 사용하여 수행하였다. 반응은 상술한 바와 동일한 조건하에서 사이클을 10회 반복하여 수행하였다. 반응이 종결된 후에 수득된 DNA 단편을 겔로 부터 회수하여 pT7Blue T-벡터(Novagen)내에 이입시켰다. 생성된 플라스미드로 대장균 JM109를 형질 전환시켰다.
수득된 콜로니들중에서, 프라이머 IPLE-1(SEQ ID NO 49) 및 프라이머 IPLE-6(SEQ ID NO 50)을 사용하여 TaKaRa LA PCR 키트(TAKARA SHUZO Co., Ltd.)를 이용한 PCR을 수행하여 12개의 콜로니를 선별하였으며, 이중 6개의 콜로니가 양성인 것으로 확인되었다. 이들 6개의 콜로니로 부터 플라스미드를 추출하여 각각 pLXG101, pLXG102, pLXG103, pLXG106, pLXG109 및 pLXG110으로 명명하였다.
pLXG101, pLXG102 및 pLXG106 각각에 대하여 M13 프라이머 M4(TAKARA SHUZO Co., Ltd.) 및 M13 프라이머 RV(TAKARA SHUZO Co., Ltd.)를 사용하여 생거 방법에 따라 개개의 삽입 단편의 서열분석을 수행하였다.
이들 서열을 원품종 토마토 EXT cDNA의 서열[EP-0562836 A1 (1993)]과 비교한 결과 중복부분은 동일한 것으로 밝혀졌다. 그러나, 서열 분석된 범위내에서 2 내지 3개의 염기치환이 검출되었다. 이러한 치환은 폴리머라제 반응에서 네스티드(nested) PCR에 의해 유도된 오류인 것으로 생각되었다. 따라서, 6개의 플라스미드중의 하나에서 프로모터 영역의 서열을 분석한 후에 프라이머를 합성하고 다른 클론을 또한 서열 분석함으로써 실질적인 게놈상의 서열을 추정하였다.
제14도는 프라이머 IPLE-2 및 IPLE-5로 증폭시킨 약 6.6 kbp 삽입 단편의 제한 지도를 나타낸 것이다. 도면에서 제한 지도의 상부는 프라이머 IPLE-5의 뉴클레오타이드 서열에 상응하며, 하부는 프라이머 IPLE-2의 뉴클레오타이드 서열에 상응한다.
또한 pLXG101, pLXG102, pLXG103, pLXG106, pLXG109 및 pLXG110을 제한 효소 Xba I로 완전히 분해시킨 다음 아가로즈 젤 전기영동한 결과 pLXG101, pLXG102, pLXG103 및 pLXG110의 경우에는 약 4.9 kbp 주변에 2개의 밴드가 형성되고, pLXG106 및 pLXG109의 경우에는 약 8.1 kbp 및 약 1.7 kbp에 2개의 밴드가 형성되는 것으로 밝혀졌다. 이러한 결과는 PCR-증폭된 DNA 단편이 pLXG101, pLXG102, pLXG103 및 pLXG110의 3개의 플라스미드의 경우 및 pLXG106 및 pLXG109의 2개의 플라스미드의 경우에는 역방향으로 삽입되었음을 시사하는 것이다. 또한, 이들 플라스미드를 주형으로 사용하고 M13 프라이머 M4(TAKARA SHUZO Co., Ltd.) 및 프라이머 IPLE-1(SEQ ID NO 49)를 사용하여 수행하는 TaKaRa LA PCR 키트(TAKARA SHUZO Co., Ltd.)를 이용한 PCR의 결과로 부터, 제한효소 Xba I에 의한 삽입 단편의 완전분해에 의해 분리된 약 4.9 kbp 및 약 1.7 kbp의 DNA 단편중에서 약 4.9 kbp DNA 단편이 토마토 EXT 유전자 프로모터 영역을 함유하는 것으로 밝혀졌다.
그후, pLXG106을 제한효소 Xba I로 완전히 분해시킨 다음 에탄올 침전시켰다. 에탄올-침전된 DNA를 증류수 268㎕, 10×연결 완충용액 30㎕ 및 T4 DNA 리가제(TAKARA SHUZO Co., Ltd.) 3㎕와 혼합시킨 다음 16℃에서 밤새 반응시켜 자가-연결반응을 수행하였다. 생성된 플라스미드로 대장균 JM109를 형질 전환시켰다.
수득된 콜로니들중에서 4개의 콜로니로 부터 플라스미드를 추출하여 각각 pLXG601, pLXG602, pLXG603 및 pLXG604로 명명하였다. 이들 pLXG601, pLXG602, pLXG603 및 pLXG604를 제한효소 EcoR I-Pst I로 이중 분해시킨 다음 아가로즈 겔 전기영동한 결과, 약 4.9 kbp 삽입 단편은 이들 플라스미드 모두에 존재하는 것으로 확인되었다.
또한, 상기 언급된 제한 지도(제14도)에서는 약 4.9 kbp 삽입 단편내에 하나의 Hind III 부위가 존재하는 것으로 나타나 있기 때문에, pLXG106을 제한효소 Hind III로 완전히 분해시키고 이어서 에탄올-침전된 DNA에 증류수 268㎕, 10×연결 완충용액 30㎕ 및 T4 DNA 리가아제(TAKARA SHUZO Co., Ltd.) 3㎕를 가한 다음 16℃에서 밤새 반응시켜 자가-연결반응을 수행하였다. 생성된 플라스미드로 대장균 JM109를 형질 전환시켰다.
수득된 콜로니중에서 6개의 콜로니로 부터 플라스미드를 추출하여 각각 pLXP101, pLXP102, pLXP103, pLXP106, pLXP109 및 pLXP111로 명명하였다. 이들 pLXP101, pLXP102, pLXP103, pLXP106, pLXP109 및 pLXP111을 제한 효소 EcoR I-Pst I으로 이중분해시키고 이어서 아가로즈 전기연동한 결과, 약 1.4-kbp 삽입 단편이 이들 플라스미드 모두에 존재하는 것으로 밝혀졌다.
pLXP101에 대하여 M13 프라이머 M4(TAKARA SHUZO Co., Ltd.) 및 M13 프라이머 RV(TAKARA SHUZO Co., Ltd.)를 사용하여 생거 방법에 따라 삽입 단편 부분의 뉴클레오타이드 서열의 서열 분석을 수행하였다.
그 다음에, pLXP101 내의 약 1.4-kbp 삽입 단편의 전체 영역의 서열을 결정하기 위하여 pLXP101을 제한 효소 Kpn I 및 BamH I로 완전히 분해시킨 후에 킬로-시퀀스 딜리숀 키트(Kilo-Sequence Deletion Kit)(TAKARA SHUZO Co., Ltd.)를 이용하여 BamH I 부위와 삽입 단편 부분과의 사이가 결실된 클론을 수득하였다. pLXP101내에 함유된 삽입 단편의 뉴클레오타이드 서열은, 적절한 길이를 갖는 몇개의 선별된 결손 클론에 대해 M13 프라이머 M4(TAKARA SHUZO Co., Ltd.) 및 M13 프라이머 RV(TAKARA SHUZO Co., Ltd.)를 사용하여 생거 방법에 따라 개개의 삽입 단편 부분의 서열을 분석하고 이들 결과를 포괄적으로 해석함으로써 결정되었다. 또한, pLXP101-삽입 단편의 뉴클레오타이드 서열을 기초로 하여 합성된 프라이머를 사용하여 pLXP102 및 pLXP103 내의 약 1.4 kbp 프로모터 영역의 서열을 분석하여 비교함으로써 토마토 EXT 유전자 N-말단 아미노산 서열의 상부에 있는 약 1.4 kbp 프로모터 영역에 대해 서열을 추정하였다. 이 서열은 서열 목록에서 SEQ ID NO 6으로 나타내었다.
[실시예 17]
담배 게놈 DNA의 EcoR I, Hind III, Nsp V 및 Xba I 단편을 주형으로 사용한 역 PCRs에 의한 담배 EXT 유전자 프로모터의 분리
담배 BY2 배양세포(유합조직) 약 150mg을 모터에서 분쇄하여 분말화시키고, 이것을 추출용액[15% 수크로오스, 50mM 트리스-HCl (pH 8.0) 및 50mM EDTA] 0.5㎖와 혼합시켜 에펜돌프(Eppendorf) 튜브에 옮기고 500rpm에서 1분 동안 원심분리하였다. 침전을 2T-1E [20mM 트리스-HCl (pH 8.0) 및 10mM EDTA] 300㎕에 용해시키고 10% SDS 40㎕와 혼합하여 서서히 진탕한 다음 70℃에서 15분 동안 처리하였다. 생성된 용액을 5M 암모늄아세테이트 225㎕와 혼합시키고 교반하고 얼음상에서 30분 동안 유지시킨 다음 15000 rpm에서 15분 동안 원심분리하였다. 원심분리 후에 상등액을 새로운 튜브에 옮기고 이소프로판을 0.7㎖와 혼합시키고 교반하여 실온에서 15분 동안 방치한 다음 15000 rpm에서 15분 동안 원심분리시켰다. 상등액을 제거한 다음, 잔사를 빙냉 80% 에탄올과 혼합하고 15000 rpm에서 15분 동안 원심분리시켰다. 침전을 건조시키고 TE 완충용액 [10mM 트리스-HCl (pH 8.0) 및 1 mM EDTA] 100㎕와 혼합시켜 생성된 혼합물을 4℃에서 밤새 유지시켜 DNA를 용해시켰다. DNA 용액 5㎕를 0.4% 아가로즈 겔 전기영동에 의해 분석한 결과, 용액은 약 10ng/㎕의 농도로 고분자 DNA를 함유하는 것으로 밝혀졌다. 즉, 찰흔 약 150mg으로 부터 게놈 DNA 약 10㎍이 수득되었다.
이 게놈 DNA 1㎍을 별개의 튜브에 취하여 실시예 13에 기술된 것과 동일한 방식으로 제한 효소 EcoR I, Hind III, Nsp V, Xba I로 각각 완전 분해시킨 다음 자가-연결반응시켰다. 이렇게 하여 제조된 사이클릭 게놈 DNA 0.1㎍을 주형으로 사용하여, TaKaRa LA PCR 키트(TAKARA SHUZO Co., Ltd.)를 이용한 PCR을 센스 프라이머로서 프라이머 IPLE-3(SEQ ID NO 51) 및 안티센스 프라이머로서 프라이머 IPLE-4(SEQ ID NO 52)를 사용하여 수행하였다. 반응은 94℃(1분), 98℃(20초) 및 67℃(10분)의 사이클을 30회 반복하여 수행하고 최종적으로 72℃(10분)에서 수행하였다. 반응이 종결된 후에 반응 용액 5㎕에 대해 1% 아가로즈 겔 전기영동을 수행하였으며, 그 결과 제한 효소 Xba I로 분해된 샘플에서 약 1.2 kbp 밴드가 관찰되는 것으로 확인되었다. 다른 샘플의 경우에는 이 반응에서 어떠한 증폭도 나타나지 않았다. 그후, 제한 효소 Xba I로 분해된 샘플로 부터 수득한 상기 반응용액 1㎕를 주형으로 사용하여, TaKaRa LA PCR 키트(TAKARA SHUZO Co., Ltd.)를 사용한 2차 PCR을 센스 프라이머로서 프라이머 IPLE-2(SEQ ID NO 53) 및 안티센스 프라이머로서 프라이머 IPLE-5(SEQ ID NO 54)를 사용하여 수행하였다. 반응은 상술한 바와 동일한 조건하에서 수행하였다. 그 결과, 약 1.1 kbp의 DNA 단편이 증폭되었다. 2차 PCR에 의해 수득된 DNA 단편을 겔로 부터 회수하여 pT7Blue T-벡터(Novagen)내에 이입시켰다. 생성된 플라스미드로 노바 블로 컴피턴트 세포(Nova Blue Competent Cells)(Novagen)를 형질 전환시켰다.
수득된 콜로니들중에서, 프라이머 IPLE-1(SEQ ID NO 55) 및 프라이머 IPLE-6(SEQ ID NO 56)을 사용하는 PCR에 의해 12개의 콜로니를 선별하였으며, 이들 12개의 콜로니 모두가 양성인 것으로 확인되었다. 이들 중에서 6개의 콜로니로 부터 플라스미드를 추출하여 각각 pNXG101, pNXG102, pNXG103, pNXG104, pNXG105 및 pNXG106으로 명명하였다.
pNXG102, pNXG103 및 pNXG104 각각에 대하여 M13 프라이머 M4(TAKARA SHUZO Co., Ltd.) 및 M13 프라이머 RV(TAKARA SHUZO Co., Ltd.)를 사용하여 생거 방법에 따라 개개의 삽입 단편의 서열분석을 수행하였다. 이들 서열을 원품종 담배 EXT cDNA의 서열(JP 7-79778 A)과 비교한 결과 중복부분은 완전히 동일한 것으로 밝혀졌다.
제15도는 프라이머 IPLE-2 및 IPLE-5로 증폭시킨 약 1.1 kbp 삽입 단편의 제한 지도를 나타낸 것이다. 도면에서 제한 지도의 상부는 프라이머 IPLE-5의 뉴클레오타이드 서열에 상응하며, 하부는 프라이머 IPLE-2의 뉴클레오타이드 서열에 상응한다.
또한 pNXG101, pNXG102, pNXG103, pNXG104, pNXG105 및 pNXG106을 제한 효소 Xba I로 완전히 분해시킨 다음 아가로즈 전기영동한 결과 pNXG101의 경우에는 약 3.1 kbp 및 약 0.9 kbp에 2개의 밴드가 형성되고 pNXG102, pNXG103, pNXG104, pNXG105 및 pNXG106의 경우에는 약 3.8 kbp 및 약 0.2 kbp에 2개의 밴드가 형성되는 것으로 밝혀졌다. 이러한 결과는 EXT가 pNXG101의 경우 및 pNXG102, pNXG103, pNXG104, pNXG105 및 pNXG106의 경우에 역방향으로 삽입되었음을 시사하는 것이다. 또한, 이들 플라스미드를 주형으로 사용하고 M13 프라이머 M4(TAKARA SHUZO Co., Ltd.) 및 프라이머 IPLE-1(SEQ ID NO 55) 또는 프라이머 IPLE-6(SEQ ID NO 56)을 사용하여 수행한 PCR의 결과로 부터, 제한 효소 Xba I에 의한 삽입 단편의 완전 분해에 의해 분리된 약 0.9 kbp 및 약 0.2 kbp의 DNA 단편 중에서 약 0.9 kbp DNA 단편이 담배 EXT 유전자 프로모터 영역을 함유하는 것으로 밝혀졌다.
그후, pNXG103을 제한 효소 Hind III로 완전히 분해시킨 다음 에탄올로 침전시켰다. 에탄올-침전된 DNA를 증류수 268㎕, 10×연결 완충용액 30㎕ 및 T4 DNA 리가제(TAKARA SHUZO Co., Ltd.) 3㎕와 혼합시킨 다음 16℃에서 밤새 반응시켜 자가-연결반응을 수행하였다. 생성된 플라스미드로 대장균 JM109를 형질 전환시켰다. 3개의 콜로니로 부터 플라스미드를 추출하여 각각 pT-EXT-4, pT-EXT-5 및 pT-EXT-6으로 명명하였다. 이들 pT-EXT-4, pT-EXT-5 및 pT-EXT-6을 제한 효소 Hind III-EcoR I로 이중 분해시킨 다음 아가로즈 겔 전기영동한 결과, 약 0.4 kbp 삽입 단편은 이들 플라스미드 모두에 존재하는 것으로 확인되었다. 이들 pT-EXT4, pT-EXT-5 및 pT-EXT-6에 대해 M13 프라이머 M4(TAKARA SHUZO Co., Ltd.) 및 T7 프로모터 프라이머(Novagen)를 사용하여 생거 방법에 따라 삽입 단편 부분의 뉴클레오타이드 서열의 서열 분석을 수행하였다.
또한, pNXG102를 제한효소 Hind III 및 Xba I로 완전히 분해시키고 정제용 아가로즈 겔 전기영동에 의해 약 0.5 kbp 밴드를 절단하였다.
그후, 이 DNA 단편을 제한 효소 Hind III-Xba I에 의한 pUC18(TAKARA SHUZO Co., Ltd.)의 이중 분해에 의해 수득된 분자에 연결시켰다. 생성된 플라스미드로 대장균 JM109를 형질 전환시켰다.
수득된 콜로니중에서, 3개의 콜로니로 부터 플라스미드를 추출하여 각각 pT-EXT-1, pT-EXT-2 및 pT-EXT-3으로 명명하였다. 이들 pT-EXT-1, pT-EXT-2 및 pT-EXT-3을 제한 효소 Hind III-EcoR I로 이중 분해시키고 이어서 아가로즈 겔 전기영동한 결과, 약 0.5 kbp 삽입 단편이 이들 플라스미드 모두에 존재하는 것으로 밝혀졌다.
이들 pT-EXT-1, pT-EXT-2 및 pT-EXT-3에 대하여 M13 프라이머 M4(TAKARA SHUZO Co., Ltd.) 및 M13 프라이머 RV(TAKARA SHUZO Co., Ltd.)를 사용하여 생거 방법에 따라 삽입 단편 부분의 뉴클레오타이드 서열의 서열 분석을 수행하였다.
이들 결과에 대한 포괄적인 해석을 기초로 하여, 담배 EXT N-말단 아미노산 서열 상류의 프로모터 영역에서의 전체 뉴클레오타이드 서열을 결정하였다. 이 서열은 서열목록에서 SEQ ID NO 7로 나타내었다.
[실시예 18]
밀 게놈 DNA의 EcoR I, Hind III, Nsp V 및 Xba I 단편을 주형으로 사용한 역 PCRs에 의한 밀 유전자 프로모터의 분리
밀 게놈 DNA(Clontech) 1㎍을 별개의 튜브에 취하여 실시예 13에 기술된 것과 동일한 방식으로 제한 효소 EcoR III, Nsp V, Xba I로 각각 완전분해시킨 다음 자가-연결 반응시켰다. 이렇게 하여 제조된 사이클릭 게놈 DNA 0.1㎍을 주형으로 사용하여, TaKaRa LA PCR 키트(TAKARA SHUZO Co., Ltd.)를 이용한 PCR을 총부피 50㎕의 반응계중에서 센스 프라이머로서 프라이머 KOM-1(SEQ ID NO 57) 및 안티센스 프라이머로서 프라이머 KOM-4(SEQ ID NO 58)를 사용하여 수행하였다. 반응은 94℃(1분), 98℃(20초) 및 67℃(10분)의 사이클을 30회 반복하여 수행하고 최종적으로 72℃(10분)에서 수행하였다. 반응이 종결된 후에 반응용액 5㎕에 대해 1% 아가로즈 겔 전기영동을 수행하였으며, 그 결과 제한 효소 Hind III로 분해된 샘플에서 약 4.3 kbp 밴드 및 약 3.5 kbp 밴드가 관찰되는 것으로 확인되었다. 또한, 제한 효소 Nsp V에 의해 분해된 샘플에서는 약 5.0 kbp 밴드가 관찰되었다. 다른 샘플의 경우에는 이 반응에서 어떠한 증폭도 나타나지 않았다.
그후, 제한효소 Hind III로 분해된 샘플로 부터 수득한 일차 PCR 반응용액 1㎕를 주형으로 사용하여, TaKaRa LA PCR 1.키트(TAKARA SHUZO Co., Ltd.)를 사용한 네스티드 PCR을 총 부피 50㎕의 반응계 중에서 센스 프라이머로서 프라이머 KPM-2(SEQ ID NO 59) 및 안티센스 프라이머로서 프라이머 KOM-5(SEQ ID NO 60)를 사용하여 수행하였다. 반응은 94℃(1분), 98℃(20초) 및 67℃(10분)의 사이클을 30회 반복하여 수행하고 최종적으로 72℃(10분)에서 수행하였다. 반응이 종결된 후에 반응용액 5㎕에 대해 1% 아가로즈겔 전기영동을 수행하여 약 3.3 kbp 밴드만이 관찰되는 것을 확인하였다. 그후 생성된 DNA 단편을 겔로부터 회수하여 DNA 블런팅 키트(TAKARA SHUZO Co., Ltd.)를 사용하여 평활 말단화시키고, 5'-말단에서 5'-말단 표지 키트 메가라벨(5'-Terminal-Lab eling Kit MEGALABLTM)(TAKARA SHUZO Co., Ltd.)을 사용하여 PCR 생성물을 인산화시킨 다음 pUC119(TAKARA SHUZO Co., Ltd.)의 Hinc II 부위에 이입시켰다. 생성된 플라스미드로 대장균 JM109를 형질 전환시켰다.
수득된 콜로니들 중에서, M13 프라이머 M4(TAKARA SHUZO Co., Ltd.) 및 M13 프라이머 RV(TAKARA SHUZO Co., Ltd.)를 사용하는 콜로니-피킹(colony-picking) PCR에 의해 적절한 길이의 삽입 단편을 함유하는 플라스미드에 대한 15개의 콜로니를 선별하였으며, 이 15개의 콜로니중에서 8개가 양성인 것으로 확인되었다. 이들중에서 6개의 콜로니로 부터 플라스미드를 추출하여 각각 pKOM-1, pKOM-2, pKOM-3, pKOM-4, pKOM-5 및 pKOM-6으로 명명하였다.
pKOM-1, pKOM-2, pKOM-3, pKOM-4, pKOM-5 및 pKOM-6 각각에 대하여 M13 프라이머 M4(TAKARA SHUZO Co., Ltd.) 및 M13 프라이머 RV(TAKARA SHUZO Co., Ltd.)를 사용하여 생거 방법에 따라 개개의 삽입 단편의 양말단에 대한 서열분석을 수행하였다.
이들 서열을 원품종 밀(original wheat)의 EXT cDNA 서열[참조:EP-0562836 A1 (1993)]과 비교한 결과, 겹치는 부분이 완전히 동일한 것으로 밝혀졌다. 그러나, 서열 분석된 범위내에서 2 내지 3개의 염기가 바뀌어 있는 것으로 확인되었는데, 토마토의 경우에서와 같이 이러한 치환은 중합효소 반응중에 네스티드(nested) PCR에 의해 잘못 야기된 것으로 생각되었다.
제16도는 프라이머 KOM-2 및 KOM-5에 의해 증폭된 약 3.3 kbp 삽입 단편의 제한 지도를 나타낸다. 여기에서, 제한 지도의 상부는 프라이머 KOM-5의 뉴클레오타이드 서열에 상응하며, 하부는 프라이머 KOM-2의 뉴클레오타이드 서열에 상응한다.
pKOM-1, pKOM-2, pKOM-3, pKOM-4, pKOM-5 및 pKOM-6을 제한 효소 Hind III로 완전히 분해한 다음 아가로즈 전기영동을 수행한 결과, pKOM-1, pKOM-3 및 pKOM-5의 경우에 약 4,2 kbp 및 약 2.0 kbp 위치에서 두 개의 밴드가 형성되었고, pKOM-2, pKOM-4 및 pKOM-6의 경우에 약 4.9 kbp 및 약 1.3 kbp 위치에서 두 개의 밴드가 형성되었다. 이로부터 pKOM-1, pKOM-3 및 pKOM-5의 세가지 밴드 및 pKOM-2, pKOM-4 및 pKOM-6의 세가지 밴드에 대해서 EXT가 역방향으로 삽입되었음을 알 수 있었다. 또한, 이들 플라스미드를 주형으로 사용하고 프라이머 KOM-2 (SEQ ID NO 59) 및 M13 프라이머 M4(TAKARA SHUZO Co., Ltd.) 또는 M13 프라이머 RV(TAKARA SHUZO Co., Ltd.)를 사용하여 수행된 PCR 결과, 삽입된 단편을 제한 효소 Hind III로 완전히 분해한 후 분리된 약 2.0 kbp 및 약 1.3 kbp DNA 단편중에서 약 1.3 kbp DNA 단편이 밀의 EXT 유전자 프로모터 영역을 포함하고 있는 것으로 밝혀졌다.
그 후, pKOM-1을 제한효소 Hind III로 완전히 분해하고 약 1.3 kbp DNA 단편, 즉 밀의 EXT 유전자 프로모터 영역을 포함하고 있는 DNA 단편을 아가로즈 겔 전기영동으로 정제한 다음, TaKaRa DNA 연결 키트 (TAKARA SHUZO Co., Ltd.)를 사용하여 자가-연결시켰다. 생성된 플라스미드로 대장균 JM109를 형질 전환시켰다.
약 1.3 kbp DNA 단편을 검출하기 위하여, 수득된 콜로니중에서 6개의 콜로니에 대해 삽입 단편의 크기를 PCR로 조사하였다. 그 후, 3개의 콜로니중에서 플라스미드를 추출해내고, 각각 pKEP-1, pKEP-2 및 pKEP-3로 명명하였다. 이들 pKEP-1, pKEP-2 및 pKEP-3를 제한효소 EcoR I, Sac I, Kpn I, Sma I, BamH I, Xba I, Pst I 및 Hind III를 사용하여 완전히 절단한 후 아가로즈 겔 전기영동을 수행하여 그들의 제한 지도를 만들었다. 그중에서 pKEP-1의 제한 지도를 제17도에 나타내었다.
다음에, KEP-1, KEP-2 및 KEP-3의 각각을 제한효소 Sac I으로 완전히 분해하고 약 3.8 kbp 밴드를 아가로즈 겔 전기영동으로 정제한 후, TaKaRa DNA 연결키트 (TAKARA SHUZO Co., Ltd.)를 사용하여 자가-연결시켰다. 생성된 플라스미드를 pKEPS-1, pKEPS-2 및 pKEPS-3으로 명명하였다.
또한, pKEPS-1, pKEPS-2 및 pKEPS-3 각각을 제한효소 EcoR I-Pst I으로 이중 분해하고 약 1.1 kbp 밴드를 아가로즈 겔 전기영동으로 정제하였다. 그후, 이 DNA 단편을 pUC19 (TAKARA SHUZO Co., Ltd.)를 제한 효소 EcoR I-Pst I으로 이중 분해하여 수득된 분자에 연결시켰다. 생성된 플라스미드로 대장균 JM 109를 형질 전환시켰다.
약 1.1 kbp의 삽입 단편 크기에 의거하여 M13 프라이머 M4 (TAKARA SHUZO Co., Ltd.) 및 M13 프라이머 RV (TAKARA SHUZO Co., Ltd.)를 사용한 PCR을 수행함으로써, 수득된 콜로니들중에서 5개의 콜로니를 선별하였다. 양성 콜로니들로부터 플라스미드를 추출해 내었으며, 각각 pKEPEP-1, KEPPEP-2 및 KEPPEP-3로 명명하였다.
이들 pKEP-1, pKEP-2, pKEP-3, pKEPS-1, pKEPS-2, pKEPS-3, pKEPEP-1, KEPPEP-2 및 KEPPEP-3에 대해서 각각의 삽입된 단편부분을 M13 프라이머 M4 (TAKARA SHUZO Co., Ltd.) 및 M13 프라이머 RV (TAKARA SHUZO Co., Ltd.)를 사용한 생거(Sanger) 방법에 따라 뉴클레오타이드 서열 분석하였다.
그 결과를 해석함으로써 pKEP-1에 포함되어 있는 밀의 EXT N-말단 아미노산 서열의 상류에 위치한 프로모터 영역의 전체 뉴클레오타이드 서열을 결정하였다. 이 서열은 서열목록중의 SEQ ID NO 8에 나타내었다.
[실시예 19]
토마토 EXT 유전자에 대한 발현 모드의 분석
(1) 총 RNA의 제조
토마토 식물인 Arisa Craig의 잎, 줄기(성장중 및 성장후) 및 열매 (성숙한 녹색 열매 (표면은 녹색이고 내부에 젤리타입 물질이 형성되어 있음) 및 성숙한 붉은색 열매)로부터 회수한 각각의 조직 5g씩을 동결시키고 액체 질소 중의 모터를 사용하여 분쇄하였다. 분쇄된 조직을 추출 용액 0.2M Tris-HCl (pH:9.0), 0.1M NaCl, 10mM EDTA, 0.5% SDS, 및 14mM 2-머캅토에탄올] 5㎖ 및 페놀-클로로포름-이소아밀알콜 (50:49:1) 혼합물 5㎖와 혼합하고 격렬하게 교반하였다. 생성된 현탁액을 원심분리하여 수용액층을 분리하였다. 이 과정을 2회 반복하였다. 분리된 수용액층을 3M 소듐아세테이트 1/10 부피와 혼합하고, 20분간 빙냉각시키고, 원심분리하였다. 상등액을 회수하고, 에탄올과 혼합한 다음 원심분리하여 침전물을 수득하였다. 침전물을 TE/HPRI 용액[10mM Tris-HCl, 1mM EDTA, 5U/㎖ Rnase 억제제 (TAKARA SHUZO Co., Ltd.) 및 1mM 디티오트레이톨(DTT)] 2㎖에 용해시키고, 10M 염화리튬 1/4 부피와 혼합하고, 2시간 동안 빙냉각시킨 다음, 원심분리하였다. 수득된 침전물을 TE/HPRI 용액 0.5㎖에 용해시키고, 3M 소듐아세테이트 및 에탄올과 혼합한 다음 원심분리하여 RNA 침전물을 수득하였다.
(2) 노던(Northern) 혼성화
토마토 EXT cDNA 단편[EP-0562836 A1 (1993)] 및 토마토 열매 폴리갈락투로나아제의 cDNA 단편(Tomato PG)[참조:Molecular General Genetics, 208, 30-36 (1987)]을 BcaBESTTM표지 키트 (TAKARA SHUZO Co., Ltd.)를 사용하여 [α-32P]dCTP로 표지함으로써 노던 혼성화를 위한 탐침을 각각 제조하였다. 노던 혼성화는 문헌[참조:Molecular Cloning, A Laboratory Manual, Second Edition, Chapter 7, pp. 7.39-7.52 (T. Maniatis et al., Published by Cold Spring Harbor Laboratory Press in 1989)]에 기재된 것을 변형시킨 하기 방법에 따라 수행하였다. 즉, 추출된 RNA 2㎍을 포름알데히드-전개 아가로즈 겔(1%)에서 전기영동하고, 나일론막(Hybond-N+)상에서 밤새 노던 블롯팅하였다. UV 투사기(254nm)로 3분간 조사함으로써 RNA를 고착시킨 후, 막을 전-혼성화 완충액(6×SSC, 0.1% SDS, 5×Denhardt's solution 및 연어 정자 DNA 100㎍/㎖) 25㎖에 담그고 65℃에서 2시간 동안 전-혼성화시켰다.
상기 언급한 방법에 의해 제조된32P-표지된 탐침을 25㎖의 전-혼성화 완충액(6×SSC, 0.1% SDS 및 5×Denhardt's solution)에 가하였다. 이 탐침용액에 전-혼성화시킨 막을 넣고 65℃에서 밤새도록 혼성화를 수행하였다.
혼성화시킨 후, 65℃에서 20분동안 2×SSC 및 0.1% SDS를 함유하는 세척액으로 막을 3회 세척하였다. 건조시킨 후, X-ray 필름(Kodak)이 놓여있는 -80℃의 카세트안에서 밤새도록 막을 노출시킴으로써 자동방사선사진을 찍었다.
결과는 제18도에 나타내었다. 즉, 제18도는 토마토 조직을 사용한 노던 혼성화 결과를 나타내고 있는데, 여기에서 토마토 EXT mRNA의 발현을 상단에 나타내었고, 토마토 PG mRNA의 발현을 가운데에 나타내었으며, rRNA 레벨을 하단에 나타내었다. 또한, 레인 1은 성숙 붉은색 열매, 레인 2는 성숙 녹색 열매(표면은 녹색이고 내부에 젤리타입 물질이 형성되어 있음), 레인 3은 성장중의 줄기, 레인 4는 성장된 줄기를 나타내고, 레인 5는 잎을 나타낸다.
제18도로부터 알 수 있듯이, 각 식물조직중의 토마토 EXT mRNA의 발현수준을 비교한 결과, 특히 성숙 녹색 열매 및 성장중의 줄기에서 발현이 잘되는 것으로 나타났다. 반면에, 각 식물조직사이의 발현수준을 비교한 결과, 대조군으로 사용된 토마토 PG mRNA는 성숙 붉은색 열매중에서 잘 발현되었다.
(3) 토마토 열매를 사용한 RT-PCR
실시예 19의 (1)에 나타낸 방법에 따라, 토마토 식물인 Arisa craig의 미성숙 녹색열매(표면은 녹색이지만 내부에 젤리타입 물질이 형성되지 않음)로부터 성숙 붉은색 열매까지를 성숙단계에 따라 구분한 10가지 종류의 열매로부터 총 RNA를 준비하였다. 이들 총 RNA 각 1㎍에 대해 하기 방법에 따라 TaKaRa RNA PCR 키트와 AMV Version 2 (TAKARA SHUZO Co., Ltd.)를 사용한 RT-PCR을 수행하여 토마토 EXT mRNA 및 토마토 PG mRNA의 발현을 분석하였다.
30℃(1분), 55℃(5분), 99℃(5분) 및 5℃(5분)에서 키트에 부착된 랜덤 프라이머(9mer)를 사용하여 역전사반응을 수행하였다. 그 후, 전체 반응용액을 주형으로 사용하여 하기 1) 및 2)를 조합하여 PCR 반응을 수행하였다: 1) 토마토 EXT cDNA 단편[EP-0562836 A1 (1993)]에 의거하여 합성된 프라이머 TOM-1 (SEQ ID NO 61) 및 프라이머 TOM-2 (SEQ ID NO 62), 및 2)에 토마토 PG cDNA 단편[Molecular General Genetics, 208, 30-36 (1987)]에 의거하여 합성된 프라이머 PG-SP3 (SEQ ID NO 63) 및 프라이머 PG-AP2 (SEQ ID NO 64). 94℃(0.5분), 55℃(1분) 및 72℃(1분) 사이클을 25회 반복하여 반응을 수행하였다. 반응후, 반응액 일정량을 취하여 1% 아가로즈 겔 전기영동을 수행하였다. 결과는 제19도에 나타낸 바와 같다. 즉, 제19도는 토마토 조직을 사용한 RT-PCR 결과를 나타내고 있는데, 여기에서 상기 1)에 기술된 프라이머에 의해 증폭된 각 성숙단게의 토마토 EXT의 발현정도를 상단에 나타내었고, 상기 2)에 기술된 프라이머에 의해 증폭된 각 성숙 단계의 토마토 PG (증폭 산물)의 발현 정도를 하단에 나타내었다. 또한, 도면에서 각 레인은 열매의 성숙 단계의 전진을 나타낸다. 즉, 레인 1 및 2는 미성숙 녹색 열매 (표면은 녹색이지만 내부에 젤리타입의 물질이 형성되지 않음), 레인 3 및 4는 성숙 녹색 열매 (표면은 녹색이고 내부에 젤리타입의 물질이 형성되어 있음), 레인 5 및 6은 전이 단계의 열매 (열매표면은 10 내지 30%가 붉은색으로 변한 것), 레인 7 및 8은 분홍색 열매 (열매표면의 30 내지 60%가 붉게 변한 것), 레인 9 및 10은 성숙 붉은색 열매 (열매표면의 100%가 붉게 변한 것)에 상응한다.
제19도로부터 알 수 있듯이, 각 성숙단계의 토마토 EXT의 발현정도를 비교해본 결과, 미성숙 녹색으로부터 성숙 녹색 단계로 변화해감에 따라 이들 단계에 해당하는 레인 1 내지 4의 증폭산물(약 913 bp)로부터 알 수 있듯이 토마토 EXT의 발현이 잘 되는 것으로 나타났다. 한편, 대조군으로 사용된 토마토 PG mRNA는 그의 증폭 산물(약 561 bp)이 검출되는 레인 5 내지 9에 해당하는 전이단계 및 분홍색 단계의 열매에서 잘 발현되는 것을 알 수 있었다.
이로부터 토마토 EXT 프로모터는 특히 성장중의 줄기 및 성숙중의 열매(미성숙 녹색에서 성숙 녹색으로)에서 유전자 발현을 강하게 유도함을 알 수 있다. 즉, 유전자 발현은 식물 세포벽 자일로글루칸의 재구성에 필요한 부위 및 식물 세포벽 자일로글로칸의 재구성에 필요한 단계의 각 경우에 유도되는 것을 알 수 있다.
[실시예 20]
담배 배양 세포를 사용한 일과성 에세이(transient assay)
(1) 형질 전환용 플라스미드의 작제
먼저, 프로모터 영역과 GUS 유전자의 카메라 유전자를 함유하는 플라스미드로 일렉트로포레이션(electroporation) 방법에 의해 담배 BY2 배양세포를 원형질을 형질 전환시키기 위하여 각각의 형질 전환용 플라스미드를 작제하였다.
1. 아즈키 콩 EXT2 유전자 프로모터 영역을 함유하는 DNA 단편과 GUS 유전자의 카메라 유전자를 함유하는 플라스미드의 제조 (전사적 융합; Transcriptional Fusion)
아즈키 콩 EXT2 유전자 프로모터 영역을 함유하는 DNA 단편과 GUS 유전자의 카메라 유전자를 함유하는 플라스미드를 제20도에 도시한 바와 같이 작제하였다. 즉, 꽃양배추 모자익 바이러스 35S 프로모터, 대장균에서 유래한 GUS 유전자, 노팔린 합성 효소로부터 유래하는 전사종결서열 카세트를 함유하는 pBI221(Clontech)를 사용하였다.
먼저, pBI221중의 꽃양배추 모자익 바이러스 35S 프로모터 영역을 제거하기 위하여, 이 플라스미드를 제한 효소 Hind III 및 Sma I (TAKARA SHUZO Co., Ltd.)로 분해하고, 35S 프로모터의 영역이 제거된 목적 단편을 아가로즈 겔 전기 영동으로 정제한 다음 절단하였다. 다음에, 실시예 13에서 제조한 pVX2P501를 제한효소 EcoR Ⅰ 및 Hinc Ⅱ로 완전히 분해하고, 약 0.5kbp의 삽입 단편을 아가로즈 겔 전기영동으로 정제한 다음 절단하였다. 또한, 실시예 13에서 제조한 pEXT2pro(F) f3를 제한효소 Hind Ⅲ 및 EcoR Ⅰ으로 완전히 분해한 다음, 약 2.55kbp의 삽입 단편을 아가로즈 겔 전기영동으로 정제하고 절단하였다. 이들 DNA 단편을 함게 연결한 다음 대장균 JM 109 균주를 형질 전환시켰다. 이 플라스미드를 pVAEXT2GUS라 명명하고 pVAEXT2GUS에 의해 형질 전환된 대장균 JM 109 균주를 Escherichia. coli JM 109/pVAEXT2GUS라 명명하였다. 이 pVAEXT2GUS를 제한 효소 Hind Ⅲ 및 SnaB Ⅰ로 분해하고 아가로즈 겔 전기영동하면 약 3.4kbp의 밴드가 형성되며, 이로부터 이 플라스미드가 약 3.0kbp의 아즈키 콩 EXT2 유전자 프로모터 영역의 전체 길이를 함유함을 알 수 있었다.
2. 아즈키 콩 EXT3 유전자 프로모터 영역을 함유하는 DNA 단편과 GUS 유전자의 키메라 유전자를 함유하는 플라스미드의 제조(전사적 융합)
아즈키 콩 EXT3 유전자 프로모터 영역을 함유하는 DNA 단편과 GUS 유전자의 키메라 유전자를 함유하는 벡터를 제21도에 도시된 바에 따라 작제하였다. 즉, 꽃양배추 모자익 바이러스 35S 프로모터, 대장균-유래의 GUS 유전자 및 노팔린 합성 효소로부터 유래된 전사종결서열 카세트를 함유하는 pBI221(Clontech)를 사용하였다.
먼저, pBI221중의 꽃양배추 모자익 바이러스 35S 프로모터 영역을 제거하기 위하여, 이 플라스미드를 제한 효소 Hind Ⅲ 및 Xba Ⅰ으로 분해하고, 35S 프로모터 영역이 제거된 목적 단편을 아가로즈 겔 전기영동으로 정제한 다음 절단하였다. 다음에, 실시예 14에서 제조한 pVX3P206 약 0.3㎍을 주형으로 사용하고, pVX3P206에서 아즈키 콩 EXT3 유전자프로모터 영역중의 Nsp V의 하류 영역에 위치한 프라이머 VX3UH (SEQ ID NO 65) 및 번역 개시점 바로 앞부분의 서열인 프라이머 VX3LX (SEQ ID NO 66)을 사용하여 PCR을 수행하였다. 이들 프라이머 VX3UH (SEQ ID NO 65) 및 프라이머 VX3LX (SEQ ID NO 66)은 PCR 산물의 양 말단에 각각 Xba Ⅰ부위 및 Hind Ⅲ 부위가 들어가도록 합성되었다. 반응은 94℃(1분), 55℃(1분) 및 72℃(2분) 사이클을 10회 반복하여 수행하였다. 반응후, 반응액 5㎕를 취하여 1% 아가로즈 겔 전기영동을 수행함으로써 주형인 플라스미드 밴드 이외에 약 0.4kbp 밴드를 확인하였다. 프라이머 VX3UH (SEQ ID NO 65) 및 프라이머 VX3LX (SEQ ID NO 66) 각각에 Xba Ⅰ부위 및 Hind Ⅲ 부위가 도입되었으므로 이 약 0.4kbp DNA 단편을 아가로즈 겔 전기영동으로 정제하고, 제한효소 Hind Ⅲ 및 Xba Ⅰ으로 분해하고, 미리 정제된 pBI221 Hind Ⅲ-Xba ⅠDNA 단편과 연결시킨 다음 대장균 JM 109 균주내로 형질 전환시켰다. 이 플라스미드를 pVAEXT3GUS라 명명하고 pVAEXT3GUS에 의해 형질 전환된 E. coli JM 109를 Escherichia. coli JM 109/pVAEXT3GUS라 명명하였다.
이 pVAEXT3GUS를 제한효소 Hind Ⅲ 및 Xba Ⅰ으로 분해하고 아가로즈 겔 전기영동을 수행하면 약 0.4kbp의 밴드가 형성되며, 이로부터 이 플라스미드가 약 0.4kbp의 아즈키 콩 EXT3 유전자 프로모터 영역의 전체 길이를 함유함을 알 수 있었다.
3. 아즈키 콩 XRP1 유전자 프로모터 영역을 함유하는 DNA 단편과 GUS 유전자의 카메라 유전자를 함유하는 플라스미드의 제조(번역적 융합; Translational Fusion)
아즈키 콩 XRP1 유전자 프로모터 영역을 함유하는 DNA 단편과 GUS 유전자의 번역적 융합 카메라 유전자를 함유하는 벡터를 제22도에 도시된 바에 따라 작제하였다. 즉, 꽃양배추 모자익 바이러스 35S 프로모터, 대장균-유래의 GUS 유전자 및 노팔린 합성효소로부터 유래된 전사종결서열 카세트를 함유하는 pBI221(Clontech)를 사용하였다.
먼저, pBI221을 제한 효소 Xba Ⅰ부위 및 Sma Ⅰ으로 분해하고, 목적 DNA 단편을 아가로즈 겔 전기영동으로 정제한 다음 절단하였다. 다음에, 실시예 15에서 제조한 pXRG302를 제한효소 Xba I-Hinc Ⅱ로 이중 분해하고, 약 1.1kbp의 삽입 단편을 아가로즈 겔 전기영동으로 정제한 다음 절단하였다. 이 DNA 단편을 미리 정제된 pBI221 DNA 단편과 연결한 다음 대장균 JM 109균주를 형질 전환시켰다.
수득된 콜로니들로부터 플라스미드를 준비하였다. 다음에, 이 플라스미드내의 꽃양배추 모자익 바이러스 35S 프로모터 영역을 제거하기 위하여, 플라스미드를 제한효소 Hind Ⅲ 및 Xba Ⅰ으로 분해하고 자가-연결시킨 다음 대장균 JM 109 균주를 형질 전환시켰다. 수득된 콜로니들로부터 플라스미드를 정제하였다. 이 플라스미드를 pVAXRP1t1GUS라 명명하고 pVAXRP1t1GUS에 의해 형질 전환된 대장균 JM 109 균주를 Escherichia. coli JM 109/pVAXRP1t1GUS라 명명하였다. 이 pVAXRP1t1GUS를 주형으로 사용하고, M13 프라이머 M4(TAKARA SHUZO Co., Ltd.) 및 M13 프라이머 RV(TAKARA SHUZO Co., Ltd.) 를 사용하여 PCR을 수행한 다음 아가로즈 겔 전기영동을 수행하면 약 3.0kbp 밴드가 형성되었으며, 이로 부터 이 플라스미드가 전체 길이 약 1.1kbp의 아즈키 콩 XRP1 유전자 프로모터 영역을 포함하는 것을 알 수 있었다.
또한, pVAXRP1t1GUS내의 GUS-유전자 상류로부터 프로모터 영역까지의 부분을 뉴클레오타이드 서열분석한 결과, 이 pVAXRP1t1GUS에 의해 GUS가 발현되어 아즈키 콩 XRP1 N-말단 아미노산 서열을 갖는 GUS의 번역-융합 단백질이 형성될 수 있도록, pBI221로부터 유래된 유전자(SEQ ID NO 68)가 아즈키 콩 XRPI N-말단 아미노산 서열을 코드화하는 유전자뒤에 통합되었음을 확인하였다.
4. 토마토 EXT 유전자 프로모터 영역을 함유하는 DAN 단편과 GUS 유전자의 키메라 유전자를 함유하는 플라스미드의 제조 (전사적 융합)
토마토 EXT 유전자 프로모터 영역을 함유하는 DNA 단편과 GUS 유전자의 키메라 유전자(약 1.4kbp)를 함유하는 벡터를 제23도에 도시된 바에 따라 작제하였다. 즉, 꽃양배추 모자익 바이러스 35S 프로모터, E.coli-유래의 GUS 유전자 및 노팔린 합성 효소로부터 유래된 전사종결서열 카세트를 함유하는 pBI221(Clontech)를 사용하였다.
먼저, pBI221중의 꽃양배추 모자익 바이러스 35S 프로모터 영역을 제거하기 위하여, 이 플라스미드를 제한 효소 Hind Ⅲ 및 Xba Ⅰ으로 이중분해하고, 35S 프로모터 영역이 제외된 목적 단편을 아가로즈 겔 전기영동으로 정제한 다음 절단하였다. 다음에, pLXG103 약 0.3㎍을 주형으로 사용하고, 실시예 16에서 제조된 pLXG103의 토마토 EXT 유전자 프로모터 영역중의 Hind Ⅲ 부위 하류 영역에 위치한 프라이머 LXUH1 (SEQ ID NO 69) 및 번역 개시점 바로 앞부분의 서열인 프라이머 LXLX (SEQ ID NO 70)을 사용하여 PCR을 수행하였다. 이들 프라이머 LXUH1 (SEQ ID NO 69) 및 프라이머 LXLX (SEQ ID NO 70)은 Hind Ⅲ 부위 및 Xba Ⅰ부위가 각각 PCR 산물의 양 말단에 들어가도록 합성되었다. 반응은 94℃(1분), 55℃(1분) 및 72℃(2분) 사이클을 10회 반복하여 수행하였다. 반응후, 반응액 5㎕를 취하여 1% 아가로즈 겔 전기영동을 수행함으로써 주형인 플라스미드 밴드이외에 약 1.4kbp 밴드를 확인하였다. 프라이머 LXUH1 (SEQ ID NO 69) 및 프라이머 LXLX (SEQ ID NO 70) 각각에 Hind Ⅲ 부위 및 Xba I 부위가 도입되었으므로 이 약 1.4kbp DNA 단편을 아가로즈 겔 전기영동으로 정제하고, 제한효소 Hind Ⅲ 및 Xba Ⅰ으로 분해하고, 미리 정제된 pBI221 DNA 단편과 연결시킨 다음 대장균 JM 109 균주를 형질 전환시켰다. 이 플라스미드를 pLEEXT1.4GUS 라 명명하고 pLEEXT1.4GUS에 의해 형질 전환된 대장균 JM 109를 Escherichia. coli JM 109/pLEEXT1.4GUS라 명명하였다.
이 pLEEXT1.4GUS를 제한효소 Hind Ⅲ 및 Xba Ⅰ으로 분해하고 아가로즈 겔 전기영동하면 약 1.4kbp의 밴드가 형성되며, 이로부터 이 플라스미드가 약 1.4kbp의 토마토 EXT3 유전자 프로모터 영역을 함유함을 알 수 있었다.
또한, 제24도로부터 알 수 있듯이, 담배 EXT 유전자 프로모터 영역과 상동성을 갖는 영역만을 사용한 GUS 유전자와의 융합 유전자(전사적 유합)가 함유된 플라스미드를 준비하였다.
실시예 16에서 제조된 pLXG103 약 0.3㎍을 주형으로 사용하고, pLXG103중의 담배 EXT 유전자 프로모터 영역 및 토마토 EXT 유전자 프로모터 영역과 상동성을 갖는 영역의 5'-하류에 위치한 프라이머 LXUH2 (SEQ ID NO 71) 및 번역 개시점 바로 앞부분의 서열인 프라이머 LXLX (SEQ ID NO 70)을 사용하여 PCR을 수행하였다. 이들 프라이머 LXUH2 (SEQ ID NO 71) 및 프라이머 LXLX (SEQ ID NO 70)은 Hind Ⅲ 부위 및 Xba Ⅰ부위가 각각 PCR 산물의 양 말단에 들어가도록 합성되었다. 반응은 94℃(1분), 55℃(1분) 및 72℃(2분) 사이클을 10회 반복하여 수행하였다. 반응후, 반응액 5㎕를 취하여 1% 아가로즈 겔 전기영동을 수행함으로써 주형인 플라스미드 밴드이외에 약 0.7kbp 밴드를 확인하였다. 프라이머 LXUH2 (SEQ ID NO 71) 및 프라이머 LXLX (SEQ ID NO 70) 각각에 Hind Ⅲ 부위 및 Xba I 부위가 도입되었으므로, 이 약 0.7kbp DNA 단편을 아가로즈 겔 전기영동으로 정제하고, 제한효소 Hind Ⅲ 및 Xba Ⅰ으로 분해하고, 미리 정제된 pBI221 DNA 단편과 연결시킨 다음 대장균 JM 109 균주를 형질 전환시켰다. 이 플라스미드를 pLEEXT0.7GUS 라 명명하고 pLEEXT0.7GUS에 의해 형질 전환된 대장균 JM 109를 Escherichia. coli JM 109/pLEEXT0.7GUS라 명명하였다.
이 pLEEXT0.7GUS를 제한효소 Hind Ⅲ 및 Xba Ⅰ으로 분해하고 아가로즈 겔 전기영동을 수행하면 약 0.7kbp의 밴드가 형성되며, 이로부터 이 플라스미드가 약 0.7kbp의 토마토 EXT 유전자 프로모터 영역을 함유함을 알 수 있었다.
5. 토마토 XRP 유전자 프로모터 영역을 함유하는 DNA 단편과 GUS 유전자의 키멜라 유전자를 함유하는 플라스미드의 제조 (번역적 융합)
토마토 EXT N-말단 아미노산 서열을 코드화하는 유전자 (SEQ ID NO 72) 및 약 4.9kbp의 DNA 단편과 GUS 유전자의 번역적-융합을 함유하는 벡터를 제25도에 도시한 바에 따라 작제하였다. 즉, 꽃양배추 모자익 바이러스 35S 프로모터, 대장균-유래의 GUS 유전자 및 노팔린 합성 효소로부터 유래된 전사종결서열 카세트를 함유하는 pBI221(Clontech)를 사용하였다.
먼저, pBI221중의 꽃양배추 모자익 바이러스 35S 프로모터 영역을 제거하기 위하여, 이 플라스미드를 제한 효소 Pst I 및 BamH I으로 분해하고, 35S 프로모터 영역이 제거된 목적 DNA 단편을 아가로즈 겔 전기영동으로 정제한 다음 절단하였다. 다음에, 실시예 16에서 제조한 pLXG601을 제한효소 Pst I 및 BamH I으로 분해하고, 약 4.9kbp의 삽입 단편을 아가로즈 겔 전기영동으로 정제한 다음 절단하였다. 이 DNA단편을 미리 정제된 pBI221 DNA 단편과 연결한 다음 E. coli JM 109균주를 형질 전환시켰다. 이 플라스미드를 pLEEXTt14.9GUS라 명명하고 pLEEXTt14.9GUS에 의해 전환된 E.coli JM 109를 Escherichia. coli JM 109/pLEEXTt14.9GUS라 명명하였다. 이 pLEEXTt14.9GUS를 제한효소 Pst I 및 BamH I으로 완전히 분해하고 아가로즈 겔 전기영동을 수행하면 약 4.9bps의 밴드가 형성되며, 이로부터 이 플라스미드가 약 4.9kbp의 토마토 EXT 유전자 프로모터 영역을 함유함을 알 수 있었다.
또한, pLEEXTt14.9GUS내의 GUS-유전자 상류로부터 프로모터 영역까지의 부분을 뉴클레오타이드 서열을 분석한 결과, 이 pLEEXTt14.9GUS에 의해 GUS가 발현되어 토마토 EXT N-말단 아미노산 서열을 갖는 GUS의 번역-융합 단백질이 형성될 수 있도록 pBI221로부터유래된 유전자(SEQ ID NO 73)가 토마토 EXT N-말단 아미노산 서열을 코드화하는 유전자뒤에 통합되었음을 확인하였다.
다음에, 토마토 EXT N-말단 아미노산 서열 및 프로모터 영역을 코드화하는 유전자(SEQ ID NO 72)를 함유하는 약 1.4kbp DNA 단편 및 GUS 유전자와의 번역적 융합을 함유하는 벡터를 제26도에 도시된 바에 따라 작제하였다. 즉, 꽃양배추 모자익바이러스 35S 프로모터, 대장균-유래의 GUS 유전자 및 노팔린 합성효소로부터 유래된 전자종결서열 카세트를 함유하는 pBI221(Clontech)를 사용하였다.
먼저, pBI221중의 꽃양배추 모자익 바이러스 35S 프로모터 영역을 제거하기 위하여, 이 플라스미드를 제한효소 Hind Ⅲ 및 BamH I으로 분해하고, 35S 프로모터 영역이 제거된 목적 DNA 단편을 아가로즈 겔 전기영동으로 정제한 다음 절단하였다. 다음에, 실시예 16에서 제조한 pLXP101을 제한 효소 Hind Ⅲ 및 BamH I으로 분해하고, 약 1.4kbp의 삽입 단편을 아가로즈 겔 전기영동으로 정제한 다음 절단하였다. 이 DNA 단편을 미리 정제된 pBI221 DNA 단편과 연결한 다음 대장균 JM 109 균주를 형질 전환시켰다. 이 플라스미드를 pLEEXTt11.4GUS라 명명하고 pLEEXTt11.4GUS에 의해 형질 전환된 대장균 JM 109를 Escherichia, coli JM 109/pLEEXTt11.4GUS라 명명하였다.
이 pLEEXTt11.4GUS를 제한효소 Hind Ⅲ 및 BamH Ⅰ으로 완전히 분해하고 아가로즈 겔 전기영동하면 약 1.4kbp의 밴드가 형성되며, 이로부터 이 플라스미드가 약 1.4kbp의 토마토 EXT 유전자 프로모터 영역을 함유함을 알 수 있었다.
또한, pLEEXTt11.4GUS내의 GUS-유전자 상류로부터 프로모터 영역까지의 부분을 뉴클레오타이드 서열을 분석한 결과, 이 pLEEXTt11.4GUS에 의해 GUS가 발현되어 토마토 EXT N-말단 아미노산 서열을 갖는 GUS의 번역-융합 단백질이 형성될 수 있도록 pBI221로부터 유래된 유전자(SEQ ID NO 73)가 토마토 EXT N-말단 아미노산 서열을 코드화하는 유전자뒤에 통합되었음을 확인하였다.
6. 담배 EXT 유전자 프로모터 영역을 함유하는 DNA 단편과 GUS 유전자의 키메라 유전자를 함유하는 플라스미드의 제조 (전사적 융합)
담배 EXT 유전자 프로머터 영역을 함유하는 DNA 단편과 GUS 유전자의 키메라 유전자를 함유하는 벡터를 제27도에 도시된 바에 따라 작제하였다. 즉, 꽃양배추 모자익 바이러스 35S 프로모터, 대장균-유래의 GUS 유전자 및 노팔린 합성 효소로부터 유래된 전사종결서열 카세트를 함유하는 pBI221(Clontech)를 사용하였다.
먼저, pBI221중의 꽃양배추 모자익 바이러스 35S 프로모터 영역을 제거하기 위하여, 이 플라스미드를 제한 효소 Pst I 및 Xba Ⅰ으로 분해하고, 35S 프로모터 영역이 제거된 목적 단편을 아가로즈 겔 전기영동으로 정제한 다음 절단하였다. 다음에, 실시예 17에서 제조된 pNXG102 약 0.3㎍을 주형으로 사용하고, pNXG102의 담배 EXT 유전자 프로모터 영역중의 Hind Ⅲ 부위 하류 영역에 위치한 프라이머 NXUP (SEQ ID NO 74) 및 번역 개시점 바로 앞부분의 서열인 프라이머 NXLX (SEQ ID NO 75)을 사용하여 PCR을 수행하였다. 이들 프라이머 NXUP (SEQ ID NO 74) 및 프라이머 NXLX (SEQ ID NO 75)은 PCR 산물의 양 말단에 각각 Pst I 및 Xba Ⅰ부위가 들어가도록 합성되었다. 반응은 94℃(1분), 55℃(1분) 및 72℃(2분) 사이클을 10회 반복하여 수행하였다. 반응후, 반응액 5㎕를 취하여 1% 아가로즈 겔 전기영동을 수행함으로써 주형인 플라스미드 밴드이외에 약 0.8kbp 밴드를 확인하였다. 프라이머 NXUP (SEQ ID NO 74) 및 프라이머 NXLX (SEQ ID NO 75) 각각에 Pst I 및 Xba Ⅰ부위가 도입되었으므로, 이 약 0.8kbp DNA 단편을 아가로즈 겔 전기영동으로 정제하고, 제한효소 Pst I 및 Xba I으로 분해하고, 미리 정제된 pBI221 DNA 단편과 연결시킨 다음 대장균 JM 109 균주를 형질 전환시켰다. 이 플라스미드를 pLEEXT0.8GUS 라 명명하고 pLEEXT0.8GUS에 의해 형질 전환된 대장균 JM 109를 Escherichia. coli JM 109/pLEEXT0.8GUS라 명명하였다.
이 pLEEXT0.8GUS를 제한효소 Pst I 및 Xba Ⅰ으로 분해하고 아가로즈 겔 전기영동하면 약 0.8kbp의 밴드가 형성되며, 이로부터 이 플라스미드가 약 0.8kbp의 담배 EXT 유전자 프로모터 영역을 함유함을 알 수 있었다.
7. 밀 EXT 유전자 프로모터 영역을 함유하는 DNA 단편과 GUS 유전자의 키메라 유전자를 함유하는 플라스미드의 제조 (전사적 융합)
밀 EXT 유전자 프로모터 영역을 함유하는 DNA 단편과 GUS 유전자의 키메라 유전자를 함유하는 벡터를 제28도에 도시된 바에 따라 작제하였다. 즉, 꽃양배추 모자익 바이러스 35S 프로모터, 대장균-유래의 GUS 유전자 및 노팔린 합성효소로부터 유래된 전사종결서열 카세트를 함유하는 pBI221(Clontech)를 사용하였다.
먼저, pBI221중의 꽃양배추 모자익 바이러스 35S 프로모터 영역을 제거하기 위하여, 이 플라스미드를 제한 효소 Hind Ⅲ 및 Sma I으로 분해하고, 35S 프로모터 영역이 제거된 목적 DNA 단편을 아가로즈 겔 전기영동으로 정제한 다음 절단하였다. 다음에, 실시예 18에서 제조된 pKEP-1 약 2㎍을 제한효소 Hind Ⅲ 및 Nae I으로 완전히 분해한 다음, 약 0.6kbp 및 약 0.5kbp DNA 단편들을 아가로즈 겔 전기영동으로 정제하고 절단하였다.
약 0.6kbp 및 약 0.5kbp 단편의 DNA를 둘다 미리 정제된 pBI221 DNA 단편과 연결시킨 다음 대장균 JM 109 균주를 형질 전환시켰다. 이 플라스미드를 pTAEXT1.1GUS 라 명명하고 이 플라스미드에 의해 형질 전환된 대장균 JM 109를 Escherichia. coli JM 109/pTAEXT1.1GUS라 명명하였다.
이 pTAEXT1.1GUS를 제한효소 Hind Ⅲ 및 EcoR I으로 분해하고 아가로즈 겔 전기영동을 수행하면 약 3.3kbp의 밴드가 형성되며, 이로부터 이 플라스미드가 약 1.1kbp의 담배 EXT 유전자 프로모터 영역을 함유함을 알 수 있었다.
(2) 일렉트로포레이션에 의한 유전자 형질 전환
상기 기술한 실시예 20-1 내지 20-7 에서 제조된 각 플라스미드로일렉트로포레이션 방법에 의해 담배 BY2 배양세포를 형질 전환시키기 위하여, 담배 BY2 배양세포를 1% 셀룰라아제-ONOZUKA (Yakult Honsha Co., Ltd.), 0.1% 펙톨리아 제Y23(SEISHIN Corporation) 및 0.4M 만니톨을 함유하는 효소용액 (pH 5.5)으로 30℃에서 2시간 동안 처리하여 세포벽이 제거된 원형질로 전환시켰다. 일렉트로포레이션 완충용액 (70mM KCl, 5mM MES 및 0.3M 만니톨, pH 5.8)중의 담배 BY2 배양세포의 2×106원형질 현탁액을 상기 단락 1 내지 7에서 제조된 각 플라스미드 3pmol 및 10% PEG6000/일렉트로포레이션 완충용액과 혼합하면서 교반하였다. 생성된 혼합물에 Gene Pulser Ⅱ (Bio-Rad Laboratories)를 사용한 전기충격(300V, 125μF)을 가하여 DNA로 식물세포를 형질 전환시켰다.
세포를 0.2mg/ℓ 오옥신으로서의 2,4-D, 1% 수크로오스 및 0.4M 만니톨을 함유하는 Linsmaier-Skoog 배양 배지 [Physiologia Plantarum, 18, 100 (1965)] 중에 26℃에서 40시간 동안 배양시켜 형질 전환을 수행하였다. 세포를 회수한 다음, 200㎕의 추출 완충용액 [50mM 포스페이트 완충액(pH 7.0), 10mM EDTA, 0.1% 트리톤 X-100, 0.1% 사르코실 및 10mM 2-머캅토에탄올]중의 회수된 세포혼합물을 에펜돌프 튜브에 넣고 초음파기 W-225 (Heatsystems-Ultrasonics)를 사용하여 출력 컨트롤 1.5 및 듀티 사이클 50% 조건에서 30초동안 얼음위에서 초음파 처리하였다. 그 후, 원심분리하여 수득된 상등액에 대해 GUS 활성 에세이 및 단백질량 에세이를 수행하였다.
(3) 프로모터 활성의 측정
형광용 96-웰 마이크로타이터 플레이트에 들어있는 상기 추출액 30㎕ 각각에 추출 완충용액 45㎕ 및 4mM 4-MUG 기질 25㎕를 첨가함으로써 반응을 수행하였다. 5, 35 및 95분 후에 반응 종결용액 (1M Na2CO3) 50㎕를 첨가하여 반응을 종결시켰다. 그 후, 365nm의 여기파장 및 455nm의 형광파장에서 반응산물인 4-MU에 의해 방출된 특이적 형광을 형광 플레이트 판독기 [Fluoroscan Ⅱ (Labosystems)]로 측정하였다.
또한, 단백질량을 하기 예시된 방법에 의해 에세이하였다. 즉, 2, 5, 10, 15, 20 및 30㎕의 1/5-희석된 추출용액 또는 800㎍/㎖의 BSA 표준용액 (추출 완충용액 20㎕를 1㎎/㎖ BSA 80㎕와 혼합한 것)을 96-웰 마이크로타이터 플레이트에 가하고 여기에 각각 158, 155, 150, 145, 140 및 130㎕의 증류수 및 Bio-Rad 단백질 에세이 키트(Bio-Rad Laboratories) 중의 에세이 시약 40㎕를 가하였다. 천천히 교반한 후 실온에 20분 동안 방치한 다음, 60분 이내에 플레이트 판독기(파장:590nm)로 측정하여 단백질을 정량하였다.
GUS 활성은 하기 방법으로 측정하였다. 상기 에세이를 수행하는 것과 동시에 4-MU 표준용액의 형광 강도를 측정하고 그 결과를 x-축은 4-MU의 양(pmol) 으로하고 y-축은 형광 강도로하는 그래프에 도시하였다. 그 후, 기울기로부터 형광 1단위당 4-MU의 양을 계산하고, 또한 시료에 대한 결과를 수평축에는 시간(분)을 표시하고 수직축에는 형광 강도를 표시한 그래프에 도시하여 형광 강도의 증가율을 구한 다음, GUS 활성과 동일한 4-MUG의 분해율을 구하였다. 또한, 단백질량으로부터 GUS 특이활성을 구하였다. 결과는 제29도에 나타내었다.
즉, 제29도는 형질 전환된 담배 BY2 배양세포의 GUS-특이 활성을 비교하여 나타낸 것으로서, pLEEXT1.4GUS에 의한 형질 전환에 따른 특이활성치를 100으로 잡고 각 플라스미드에 의한 형질 전환에 따른 GUS-특이활성을 구하였으며 그래프에각 프로모터 활성을 도시하였다. 이와 같이 함으로써 수행된 7회의 형질 전환 실험을 전체적으로 비교할 수 있다.
도면에서, pLEEXT1.4GUS에 의한 형질 전환에 따른 특이활성치를 100으로 잡고 각 플라스미드에 의한 형질 전환에 따른 GUS-특이활성치를 수평축에 나타내었으며, 각 실험에서 사용된 플라스미드는 수직축에 나타내었다. 여기서 n은 2 내지 7을 나타낸다.
이 결과들로부터, 이들 EXT 유전자 프로모터 영역을 함유하는 DNA 단편은 식물에서 잘 발현되는 것으로 알려진 꽃양배추 모자익 바이러스 35S 프로모터보다도 더 강한 활성을 나타내는 것으로 확인되었다. 도면으로부터 알 수 있듯이, 특히 아즈키 콩 XRP1 및 토마토 EXT 프로모터의 활성이 매우 높았으며, 토마토 EXT 프로모터와 비교할 때 번역적 융합에 의해 효율이 개선되는 것으로 밝혀졌다.
상기 언급한 바와 같이, 본 발명은 식물 세포벽 자일로글루칸의 재구성에 필요한 부위 및 단계에서 특정의 방법으로 발현되는 엔도-자일로글루칸 트랜스퍼라제(EXT)를 코드화하는 유전자 및 그의 패밀리(family) 유전자의 프로모터를 제공한다. 또한, 본 발명은 EXT 유전자 및 그의 패밀리 유전자의 프로모터를 클로닝하는 방법, EXT 유전자 및 그의 패밀리 유전자의 프로모터를 함유하는 식물 형질 전환용 벡터 및 그들을 제조하는 방법, EXT 유전자 및 그의 패밀리 유전자의 프로모터 발현을 조절하는 방법, 식물 형태를 조절하는 방법, 및 EXT 유전자 및 그의 패밀리 유전자의 프로모터를 사용하는 식물을 제공한다.

Claims (35)

  1. 식물 세포벽 자일로글루칸의 재구성을 수행하는 기능을 갖는 효소를 코드화하는 유전자의 발현을 조절하는 식물 프로모터.
  2. 제1항에 있어서, 프로모터가 식물 세포벽 자일로글루칸의 재구성에 필요한 부위에서 활성을 가짐을 특징으로 하는 식물 프로모터.
  3. 제1항에 있어서, 프로모터가 식물 세포벽 자일로글루칸의 재구성에 필요한 단계에서 활성을 가짐을 특징으로 하는 식물 프로모터.
  4. 제1항에 있어서, 식물 세포벽 자일로글루칸의 재구성을 수행하는 기능을 갖는 효소를 코드화하는 유전자가 엔도-자일로글루칸 트랜스퍼라제 또는 그의 기능적 등가물을 코드화하는 유전자임을 특징으로 하는 식물 프로모터.
  5. 제4항에 있어서, 엔도-자일로글루칸 트랜스퍼라제 또는 그의 기능적 등가물을 코드화하는 유전자가 아즈키 콩(Vigna angularis)으로부터 유래된 것임을 특징으로 하는 식물 프로모터.
  6. 제4항에 있어서, 엔도-자일로글루칸 트랜스퍼라제 또는 그의 기능적 등가물을 코드화하는 유전자가 토마토(Lycopersicon esculentum)로부터 유래된 것임을 특징으로 하는 식물 프로모터.
  7. 제4항에 있어서, 엔도-자일로글루칸 트랜스퍼라제 또는 그의 기능적 등가물을 코드화하는 유전자가 담배(Nicotiana tabacum)로부터 유래된 것임을 특징으로 하는 식물 프로모터.
  8. 제4항에 있어서, 엔도-자일로글루칸 트랜스퍼라제 또는 그의 기능적 등가물을 코드화하는 유전자가 밀(Triticum asestivum)로부터 유래된 것임을 특징으로 하는 식물 프로모터.
  9. 제1항에 있어서, 프로모터가 서열목록중의 SEQ ID NO 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7 및 8중에서 선택된 어느 하나의 뉴클레오타이드 서열에 함유되어 있음을 특징으로 하는 식물 프로모터.
  10. 제1항에 있어서, 제9항의 뉴클레오타이드 서열중의 어느 하나와 혼성화할 수 있으며 식물, 식물세포, 또는 식물세포로부터 재생된(regenerated) 트랜스제닉 식물중의 적어도 하나에서 프로모터 활성을 갖는 식물 프로모터.
  11. 제1항 내지 제10항에 따른 어느 하나의 식물 프로모터를 하유하며, 이 프로모터가 유용한 유전자를 발현시킬 수 있는 상태로 유용한 유전자에 연결되어 있음을 특징으로 하는 DNA 단편.
  12. 제11항에 있어서, 유용한 유전자가 단백질을 코드화하는 유전자임을 특징으로 하는 DNA 단편.
  13. 제11항에 있어서, 유용한 유전자가 안티센스 RNA를 코드화하는 유전자임을 특징으로 하는 DNA 단편.
  14. 제11항에 있어서, 유용한 유전자가 데코이(decoy)를 코드화하는 유전자임을 특징으로 하는 DNA 단편.
  15. 제11항에 있어서, 유용한 유전자가 리보자임(ribozym)임을 특징으로 하는 DNA 단편.
  16. 제11항 내지 15항에 따른 어느 하나의 DNA 단편에 의해 형질 전환된 식물.
  17. 제11항 내지 15항에 따른 어느 하나의 DNA 단편에 의해 형질 전환된 식물 세포.
  18. 제11항 내지 15항에 따른 어느 하나의 DNA 단편에 의해 형질 전환된 식물 세포로부터 재생된 트랜스제닉 식물.
  19. 제1항 내지 10항에 따른 어느 하나의 식물 프로모터를 함유하는 벡터.
  20. 제11항 내지 15항에 따른 어느 하나의 DNA 단편을 함유하는 벡터.
  21. 제19항 또는 20항에 있어서, 플라스미드 벡터인 벡터.
  22. 제19항 또는 20항에 있어서, 바이러스 벡터인 벡터.
  23. 제19항 내지 22항에 따른 어느 하나의 벡터에 의해 형질 전환된 식물.
  24. 제19항 내지 22항에 따른 어느 하나의 벡터에 의해 형질 전환된 식물세포.
  25. 제24항에 따른 식물세포로부터 재생된 트랜스제닉 식물.
  26. 제16항, 18항, 23항 또는 25항의 식물로부터 수득된 종자.
  27. 제12항에 따른 DNA 단편을 함유하는 벡터로 형질 전환된 식물에서 벡터에 의해 발현된 단백질을 회수함을 특징으로 하여 식물에서 단백질을 생산하는 방법.
  28. 제12항에 따른 DNA 단편을 함유하는 벡터로 형질 전환된 식물세포를 배양하고, 그 결과 생성된 배양물로부터 벡터에 의해 발현된 단백질을 회수함을 특징으로하여 식물세포에서 단백질을 생산하는 방법.
  29. 제12항에 따른 DNA 단편을 함유하는 벡터로 형질 전환된 식물세포로부터 트랜스제닉 식물을 재생해내고, 벡터에 의해 발현된 단백질을 트랜스제닉 식물로부터 회수함을 특징으로하여 트랜스제닉 식물에서 단백질을 생산하는 방법.
  30. 제11항 내지 15항에 따른 어느 하나의 DNA 단편으로 식물을 형질 전환시킴을 특징으로 하여 식물의 형태를 조절하는 방법.
  31. 제11항 내지 15항에 따른 어느 하나의 DNA 단편으로 식물세포를 형질 전환시킨 다음 트랜스제닉 식물을 재생시킴을 특징으로하여 트랜스제닉 식물의 형태를 조절하는 방법.
  32. 제11항 내지 15항에 따른 어느 하나의 DNA 단편을 함유하는 벡터로 식물을 형질 전환시킴을 특징으로 하여 식물의 형태를 조절하는 방법.
  33. 제11항 내지 15항에 따른 어느 하나의 DNA 단편을 함유하는 벡터에 의해 형질 전환된 식물세포로부터 트랜스제닉 식물을 재생시킴을 특징으로하여 트랜스제닉 식물의 형태를 조절하는 방법.
  34. 식물 세포벽 자일로글루칸의 재구성을 수행하는 기능을 갖는 효소를 코드화하는 유전자를 사용함을 특징으로하여 식물 프로모터를 클로닝하는 방법.
  35. 제34항에 있어서, 식물 세포벽 자일로글루칸의 재구성을 수행하는 기능을 갖는 효소를 코드화하는 유전자가 엔도-자일로글루칸 트랜스퍼라제 또는 그의 기능적 등가물임을 특징으로 하여 식물 프로모터를 클로닝하는 방법.
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