JPH0372826A - 塊茎を形成する植物の形質転換法 - Google Patents

Abstract

(57)【要約】本公報は電子出願前の出願データであるた
め要約のデータは記録されません。

Description

【発明の詳細な説明】 〔産業上の利用分野〕 本発明は、スボラミン・プロモーターを含む組換えプラ
スミドで塊茎または塊根を形成する植物を形質転換する
方法に関するものである。

〔従来の技術〕

サツマイモ（Ｉｍ咳鉦ｂａｔａｔａｓ）の塊根には、他
の器官にほとんど存在しない蛋白質が多量に含まれ、そ
の全可溶性蛋白質の約８０％を分子量２０Ｋｄの蛋白質
スポラよンが占めている（Ｍａｅｓｈｉｒａａ　Ｍ、ｅ
ｔａｌ、、　Ｐｈｙｔｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ、　２４．
１８９９−１９０２　（１９８５））。

スボラミンは５ＤＳ−ＰＡＧＩＩ！の解析から、スポラ
逅ンＡとスボラミンＢが存在することが知られている。

スボラミンＡとＢに対するｃＤＮＡは、すでに全塩基配
列が明らかにされ（Ｈａｔｔｏｒｔ　Ｔ、　ｅｔ　ａｌ
、。

Ｐｌａｎｔ　Ｍｏｌ、Ｂｉｏｌ、　５．３１３−３２０
　（１９８５）、ＭｕｒａｋａｍｉＳ、　ｅｔ　ａｌ、
、　Ｐｌａｎｔ　Ｍｏ１．Ｂｉｏｌ、　７．３４３−３
５５　（１９８６））、これをもとにして、それぞれに
対応するスポラξン核遺伝子の構造も明らかにされてい
る（Ｈａ　ｔ　ｔｏｒ　ｉＴ、、　Ｎａｋａｍｕｒａ　
Ｋ、、　Ｐｌａｎｔ　Ｍｏ１．Ｂｉｏｌ、　ＩＬ　４１
７−４２６（１９８８））。

また、一般に植物由来の遺伝子のタンパク質を遺伝子工
学的手法を使い、他の植物で発現させる方法については
、エレクトロポレーションにより行なう方法（Ｆｒｏａ
ｕ＋　Ｍ、　ｅｔ　ａｌ、＋　Ｐｒｏｃ　Ｎａｔｌ。

Ａｃａｄ、Ｓｃｉ、　ＩＪＳＡ　８２．５Ｂ２４−５８
２８　（１９８５））　、アグロバクテリウムを介した
方法（Ｈｏｒｓｃｈ　Ｒ，Ｂ、　ｅｔ　ａｌｌＳｃｉｅ
ｎｃｅ、　２２７．１２２９−１２３１　（１９８５）
）等の報告がある。

しかしながら、これらの方法を使って、スボラミンプロ
モーターに所望の外来遺伝子を連結したプラスミドを塊
茎又は塊根のみで外来遺伝子を特異的に発現した例はな
く、目的の部位でのみ発現するかどうか予測できなかっ
た。

〔発明が解決しようとする課題〕

本発明の目的は、スボラミンプロモーター及び外来遺伝
子を含む組換えプラスミドで塊茎または塊根を形成する
植物の細胞を形質転換し、生育した塊茎または塊根を形
成する植物形質転換体の塊茎又は塊根のみで外来遺伝子
を特異的に発現させる方法を提供することにある。

〔課題を解決するための手段〕

本発明は、サツマイモの貯蔵タンパク質であるスボラミ
ンをコードする遺伝子のプロモーターに所望の遺伝子お
よび所望のターミネータ−を連結したものを植物用発現
ベクターに組み込み組換え体プラスミドを得、該組換え
プラスミドで塊茎または塊根を形成する植物を形質転換
することを特徴とする塊茎または塊根を形成する植物の
形質転換方法に関する。

上記組換え体プラスミドは、スポラξンプロモーターの
下流に所望の外来遺伝子、さらにその下流に所望のター
逅ネーターを連結して構成され、この組換え体プラスミ
ドによる植物、例えば、バレイショの形質転換は該プラ
スミドのアグロバクテリウム属に属する微生物への導入
を介して行われる。本発明の形質転換されたバレイショ
はその塊茎のみにおいて所望の外来遺伝子が発現される
。

更に本発明はバレイショでの特異的な発現が確認された
ことにより、他の塊茎植物（キクイモ、サトイモなど）
、他の塊根植物（ダリア、サツマイモなど）にも適用で
きる。また、それらの植物の塊茎または塊根のみに特異
的に所望の外来遺伝子を発現させる細胞を創製すること
ができ、更にそれらの形質転換された植物細胞から植物
体を分化せしめることにより塊茎または塊根特異的発現
植物体を育種することができる。

以下に本発明の詳細な説明する。

サツマイモ塊根からスポラξン核遺伝子の取得はＨａｔ
ｔｏｒｉ及びＮａｋａｍｕｒａ（Ｈａｔｔｏｒｉ　ａｎ
ｄ　ＮａｋａｍｕｒａｔＰｌａｎｔ　Ｍｏ１．Ｂｉｏｌ
、４１？（１９８Ｂ））の方法により行われる。

具体的には、サツマイモ塊根から調製したＤＮＡを５ａ
ｕ３Ａで部分分解後、平均長１７ｋｂの断片とλＥＭＢ
Ｌ３ベクターを用いて、約２Ｘ１０’個の独立した組換
え体ファージからなる遺伝子ライブラリーを作成する。

ｃＤＮＡをプローブとしたプラークハイブリダイゼーシ
ョンによって、スポラごン遺伝子断片を含む組換え体フ
ァージＤＮＡを単離する。スポラミンゲノくツククロー
ンについてスポラ藁ン遺伝子を含む領域の塩基配列を決
定する。

前記の同定されたスポラξンゲノミッククローンをＳｌ
マツピングにより転写開始点を決定し、転写開始点から
２２塩基上流に典型的なＴＡＴＡ　ｂｏｘを含み、転写
開始点を÷ｌとして、＋４０〜−９７０の＾ｌｕｌ切断
断片をプロモーターとして用いる（第１図参照）。即ち
、スポラξンのプロモーターは、スボラミンをコードす
る遺伝子の５′非翻訳領域のうち少なくとも転写開始点
（＋１）の上流側の隣接塩基対（−■）、ＴＡＴＡ　Ｂ
ｏｘ配列を含む所望の長さのＤＮＡ鎖である。一方、サ
ツマイモの塊根の中で発現しているタイプのゲノミック
クローンの５′非翻訳領域においてクローンｇｓＰＯ−
ＡＩの−９０から−１１７とクローンｇｓＰｏ−Ｂｌ　
（第２図参照）の−２３１から−２５９の間に２８ｂｐ
の相同配列（これをＰ配列という）が存在する。また、
クローンｇｓＰｏ−ＡＩの−２３１から−２５４の間に
２回（１９ｂｐ）、クローンｇｓＰＯ−Ｂｌの一６９０
付近に３回（２２ｂｐ）の５’　−ＡＡＡＴＣＡ　（Ｎ
）　＆ＴＴ＾−３′を含む相同な繰り返し配列（これを
Ｑ配列という）が存在する。

更に、５′非翻訳領域のこれらのＰ配列及びＱ配列をも
たないゲノミッククローンｇｓＰｏ−ＸＩはサツマイモ
の塊根中で発現していなかったのでこれらの領域は塊根
の中で特異的に働くのに関与していることが推測されて
おり、本発明でいうスボラミンをコードする遺伝子のプ
ロモーターは、Ｐ配列及びＱ配列を必須とするものであ
る。

従って、スポラξンＢ１のプロモーターを用いる場合は
上記必須配列を含む５′非翻訳領域中のＥｃｏＲＩ部位
からスボラミンＡ１プロモーター相当領域を利用するこ
とができる。（Ｈａｔｔｏｒｉ　Ｔ、＋Ｍａｋａｍｕｒ
ａ　Ｋ、、　Ｐｌａｎｔ　Ｍｏ１．Ｂｉｏｌ、＋　ＩＬ
　４１７−４２６（１９８８））。

本発明の組換えプラスミドは次の通り調製される。

下記に示す植物用発現ベクターを適当な制限酵素で切断
し、必要により適当なリンカ−または、アニーリング可
能な組合せの塩基を複数個重合させる。このように加工
した植物用発現ベクターと両端を適当に加工した前記プ
ロモーターとベクターＤＮＡを混合し、リガーゼを用い
て連結する。

植物発現ベクターとしては、ｐＬＧＶｎｅｏｌ１０３　
（Ｈａｉｎｅｔ　ａｌ、　　ＨＭｏｌ、Ｇｅｎ、Ｇｅｎ
ｅｔ、１９９．１６１−１６８．（１９８５））、ＢＩ
Ｎ　（Ｂｅｖａｎ、　Ｍ　（１９８４）　：　Ｎｕｕｃ
ｌｅｉｃ　Ａｃ１ｄｓ　Ｒｅｓ、１２゜８７１１−８７
２１．）、ｐＧＡ４９２　（Ｇ、＾ｎ　；　Ｍｅｔｈ、
Ｅｎｚｙｍｏｌ、１５３＋２９２−３０５．　（１９８
７））、ｐＭＯＮ５０５（Ｈｏｒｓｃｈ、　Ｒ，ａｎｄ
　Ｋｌｅｅ。

Ｈ，；Ｐｒｏｃ、　Ｎａｔｌ、Ａｃａｄ、Ｓｃｉ、　Ｕ
ＳＡ　８３．４４２８−４４３２゜（１９８６））等を
利用することができる。更に、エレクトロポレーション
等の直接導入法の場合には、植物用発現ベクターとして
、ｐＵｃ１８（宝酒造■）、ｐＵｃｌｌＢ　（宝酒造■
）などのｐＵＣ系ベクター等も使用することができる。

本発明で使用できる外来遺伝子は、これまでに単離され
ているあらゆる遺伝子を使うことができる。具体的には
、グリシニン遺伝子（Ｍｏｍｍａ、　Ｔ、ｅｔ　ａｌ、
　　；　ＦＥＢＳ　Ｌｅｔｔ、１８Ｂ＋　１７７−１２
２、　（１９８５））、チャルコン合或酵素遺伝子（Ｓ
ｏｍｍｅｒ。

Ｈ，ａｎｄ　５ａｅｄｌｅｒ、　Ｈ，；Ｍｏ１．Ｇｅｎ
、Ｇｅｎｅｔ、２０２＋　４２９−４３４、　（１９８
６））、グリシニン遺伝子（Ｈｉｇｕｃｈｉ、　Ｗ、　
ａｎｄＦｕｋａｚａｗａ、　Ｃ，ＨＧｅｎｅ　５５．２
４５−２５３．（１９８７））、パタチン遺伝子（Ｍｉ
ｇｎｅｒｙ、　Ｇ、Ａ、ｅｔ　ａｌ、　；　Ｎｕｃｌ、
Ａｃ１ｄｓＲｅｓ、１２．７９８７−８０００．（１９
８４））等があげられる。

本発明で使用できるターミネータ−は、これまでに単離
されているいずれの植物用のターミネータ−も使用する
ことができるが具体的には、ノバリン合或酵素のターミ
ネータ−（Ｄｅｐｉｃｋｅｎ　Ａ、　ｅｔａｌ、、　Ｊ
、Ｍｏ１．Ａｐｐｌ、Ｇｅｎ、　１．５６１−５７３（
１９８２））　、オクトビン合成酵素のターミネータ−
（Ｇｔｅｌｅｎ　Ｊ、。

ｅｔ　ａｌ、、　ＥＭＢＯＪ、　３．８３５−８４６（
１９８４））等を利用することができる。

上記、外来遺伝子を塊茎又は塊根で発現させるためには
、スボラミンプロモーターを外来遺伝子の上流に連結す
ることが必要である。

前記組換えプラスミドを塊茎または塊根を形成する植物
植物体に導入し、塊茎又は塊根のみに所望の外来遺伝子
を特異的に発現させることができる。

前記組換えプラスミドを所望の植物細胞に導入する方法
としては、エレクトロポレーションにより行なう方法（
Ｆｒｏｍｍ　Ｍ、　ｅｔ　ａｔ、、　Ｐｒｏｃ、Ｎａｔ
ｌ、Ａｃａｄ。

Ｓｃｉ、　８２．５８２４−５８２８）　、アグロバク
テリウムを介した方法（Ｈｏｒｓｃｈ　Ｒ，Ｂ、　ｅｔ
　ａｌ、、　５ｃｉｅｎｃｅ＋　２２７＋１２２９−１
２３１　（１９８５）　）、マイクロインジェクション
による方法（Ｇｒｏｓｓｖａｙ　Ａ、　ｅｔ　ａｌ、、
　Ｍｏ１．Ｇｅｎ、Ｇｅｎｅｔ。

２０２、１７９−１８５（１９８６））等があげられる
。

植物細胞を植物体に再分化させる方法については、一般
に知られている。例えば、バレイシラの場合、リーフデ
ィスク（Ｍ、Ｄｅ　Ｂｌｏｃｋ、　Ｔｈｅｏｒ、Ａｐｐ
ｌ。

Ｇｅｎｅｔ、　７６、７６７−７７４（１９８Ｂ））、
　チューパーディスク（Ｓｈｅｅｒｍａｎ　Ｓ、、　ｅ
ｔ　ａｌ、＋　Ｐｌａｎｔ　Ｃｅ１ｌ　Ｒｅｐｏｒｔｓ
７、１３−１６（１９８８））等からの再分化が可能で
ある。

スボラミンプロモーターを植物用発現ベクターに組み込
んだ植物発現組換えプラスミドは次の通り調製される。

スボラミンゲノミッククローンｇｓＰｏ−ＡＩについて
は皿部ら（Ｈａｔｔｏｒｉ　Ｔ、、Ｎａｋａｍｕｒａ　
Ｋ、、　Ｐｌａｎｔ　Ｍｏｌ。

Ｂｉｏｌ、　１１．４１７−４２６（１９８８）によっ
て既にその塩基配列が明らかにされている。植物用発現
組換えプラスミドを作成するためには、第３図に示す通
りｇｓＰＯ−ＡＩクローンの５′非翻訳領域のうち転写
開始点を＋１とし、＋４０と−９７０の位置にある制限
酵素切断部位Ａｌｕｌで切断し、この断片（１０１０ｂ
ｐ）をクローニングベクターのブルースクリプトＫＳ（
−）（ストラタジーン社製）のＥｃｏＲＶの位置にクロ
ーニングし、このプラスミドからＸｂａｌ−ＣＩａＩ断
片を得た。この断片を植物用発現ベクターＤＮＡ４９２
　（Ｇ。

＾ｎｔ　Ｍｅｔｈ　Ｅｎｚｙｍｏｌ、　１５３，２９２
−３０５（１９８７））のＸｂａ　Ｉ　。

ＣＩａＩで切断したものと連結し、これを植物用発現プ
ラスミド５ｐｐ−ＣＡＴ−００と命名した。

以下、実施例として、バレイシラをあげるが本発明は、
これらに限定されるものでなく、芋を形成するキクイモ
、サトイモ、ダリア、ヤマイモ等の植物体で同様に適用
できる。

実施例 サツマイモ塊根貯蔵タンパク質スポラ藁ンをコードする
ｇｓＰＯ−ＡＩのプロモーター領域のバレイショの塊茎
での発現の確認を次の通り行った。

１　核酸の分離 サツマイモ塊根組成からの高分子量のＤＮＡとポリＧ６
１）”ＲＮＡは、版部ら（ｔｌａｔｔｏｒｉ　Ｔ、ｅｔ
　ａｌ。

（１９８５）；Ｐｌａｎｔ　Ｍｏ１．Ｂｉｏｌ、　５．
３１３−３２０．）　、村上ら（Ｍｕｒａｋａａａｉ　
Ｓ、ｅｔ　ａｌ、（１９８６）；Ｐｌａｎｔ　Ｍｏ１．
Ｂｉｏｌ、　Ｌ３４３−３５５．）によって報告されて
いるようにサツマイモ塊根（Ｄｍ蜆並ｂａｔａｔａｓ　
Ｌａ１ＩＩｃｖ、Ｋｏｋｅｉ　ｋ１４）から分離した。

２　サツマイモゲノミックライブラリーの構築１で得た
サツマイモ塊根組成からの高分子量ＤＮＡを５ａｕ３Ａ
で部分的に消化し、アガロースゲル電気泳動で分画した
。０．８μＮ　（０，４μｇ）　１７−２０ｋｂのＤＮ
Ａ断片、１０ｕ　ｌ　（１，０μｇ）　ＥＭＢＬ３アー
ム、０．５ｕｉ　１０ｘライゲーシヨンバツフｙ　　（
５００ｍＭトリス塩酸（ｐ　Ｈ８，０）、７０−塩化マ
グネシウム、１０ｍＭジチオスレイトール）、０．５　
ｔｔ　ｊ！　１０ｍＭ　ＡＴＰ（ｐＨ７，５）、０．５
ｔｔ　ｌ　（３ｕｎｉｔｓ）　Ｔ　４リガーゼ（東洋紡
）を混合し、滅菌蒸留水を加えて、全量を５μｌとし、
室温で１時間、４°Ｃで一晩保温した。ゲルから１７−
２０ｋｂのＤＮＡ断片を回収し、Ｂｉｏ−Ｒａｄ社製の
ＲＤＰξニカラムによって精製し、Ｂａｌ１１旧で消化
したλＥＭＢＬ　３アーム（プロメガ社製）に連結した
。

その後、連結されたＤＮＡは、ｉｎ　ｖｉｔｒｏでパッ
ケージしくＭａｎｉａｔｉｓ　Ｔ、　ｅｔ　ａｌ、（１
９８２）；Ｍｏｌｅ−ｃｕｌａｒＣｌｏｎｉｎｇ、Ｃｏ
１ｄ　Ｓｐｒｉｎｇ　Ｈａｒｂｏｒ　Ｌａｂｏｒａｔｏ
ｒｙ、）　、組換えファージをＥ、ｃｏｌｔ系統ＮＭ５
３９を使って増殖した。もう一つのライブラリーはＥｃ
ｏＲＩで消化し、脱リンしたλｇｔｌｏと高分子量ＤＮ
ＡをＥｃｏＲＩで完全に消化し、電気泳動で分画した４
−６ｋｂの断片を連結し、ｉｎ　ｖｉｔｒｏでパッケー
ジし、組換えファージをＥ、ｃｏｌｉ系統Ｃ６００で増
殖した。

３　ライブラリーの選択 ファージライブラリーからｐ１ＭＯ２３（Ｈａｔｔｏｒ
ｉ　Ｔ。

ｅｔ　ａｌ、、ＨＰｌａｎｔ　Ｍｏ１．Ｂｉｏｌ、５．
３１３−３２０．（１９８５））とｐ１ＭＯ３３６（Ｍ
ｕｒａｋａｍｆ　　Ｓ、ｅｔ　ａｌ、＋　；Ｐｌａｎｔ
　Ｍｏ１．Ｂｉｏｌ、７＋３４３−３５５．　（１９８
６））のｃＤＮＡ挿入部分をｓｚｐ標識したものでプラ
ークハイブリダイゼーション法（Ｍａｎｉａｔｉｓ　Ｔ
、ｅｔ　ａｌ、（１９８２）　：　Ｍｏ１ｅｃｕｌａｒ
　Ｃｌｏｎｉｎｇ。

Ｃｏ１ｄ　Ｓｐｒｉｎｇ　Ｈａｒｂｏｒ　Ｌａｂｏｒａ
ｔｏｒｙ、）によってスボラミンＡとスボラミンＢゲノ
ミッククローンを選択した。５０％ホルムアミド、５Ｘ
ＳＳＣ，５Ｘデンハルト溶液（０，１％牛血清アルブミ
ン、０．１％フィコール、０．１％ポリビニルピロリド
ン）、１％ＳＤＳ、５０ｍＭりん酸ナトリウム（ｐＨ６
，５）、２５０　ｕｇ／ｌｌ１１変性牛胸腺ＤＮＡ、　
１ｍＭ　ＥＤＴ＾の前処理溶液中でｓｚｐ標識したプロ
ーブ（ｐ１ＭＯ２３，ｐＩＭＯ３３６）と４２℃で２〜
４時間保温した。

その後、５０％ホルムア５ド、５ＸＳＳＣ，５Ｘデンハ
ルト溶液１％ＳＯ５，５０１１Ｍ　　りん酸ナトリウム
（ｐＨ６，５）、１００　ｕ　ｇｏｄ変性牛胸腺ＤＮＡ
、１＋ｓＭＥＤＴ＾のハイブリダイゼーシッン溶液に１
００℃で５分間熱変性し、急冷した。

プローブに入れた溶液中で４２°Ｃで１６時間以上保温
した。反応が終わったら、液をとり出し、２×５ＳＣ１
０，１％ＳＯＳ溶液で室温で２回洗った。さらに、２　
Ｘ５ＳＣ、０，１％ＳＤＳ溶液で４２°Ｃで１５分間３
回洗浄した。０．Ｉ　Ｘ　５ＳＣ１０，１％ＳＯＳでさ
らに１５分間２回洗浄した後、−７０″Ｃでオートラジ
オグラフィーを行った。陽クローンを精製し、分離した
ＤＮＡの最終的な同定をする前にｃＤＮＡプローブを使
ってサザンブロットハイプリダイゼーション（Ｍａｎｉ
−ａｔｉｓ　Ｔ、ｅｔ　ａｌ、　（１９８２）；Ｍｏ１
ｅｃｕｌａｒ　Ｃｌｏｎｉｎｇ、ＣｏｌｄＳｐｒｉｎｇ
　Ｈａｒｂｏｒ　Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ、）によって制
限酵素切断地図を解析した。

４　　ＤＮＡシークエンス解析 ＤＮＡシークエンスはジデオキシヌクレオチド法（Ｍｅ
ｓｓｉｎｇ　Ｊ、　（１９８３）　；Ｍｅｔｈ、ｌ：ｎ
ｚｙｍｏｌ、１０１．２０−７８．）にしたがって行っ
た。挿入部分の制限酵素切断地図断片をｐＵｃ１１９（
Ｖｉｅｉｒａ　Ｊ、ａｎｄ　Ｍｅｓｓｉｎｇ　Ｊ、（１
９８７）；　Ｍｅｔｈ、Ｅｎｚｙｍｏｌ、１５３．３−
１１．）あるいはブルースクリプトＫＳ　（−）（スト
ラタジーン社製）にナブクローニングした。欠失クロー
ンのオーバーラッピングは、非対称的に切断されたプラ
スξドＤＮＡのエクソヌクレアーゼ■処理によって得た
。シーフェンス反応のための一本ｔｊ［Ｄ　Ｎ　Ａはカ
ナマイシン（２５ｔｔ　ｇ／ｄ）の存在下でＭ１３ＫＯ
７フアージ（ＶｉｅｉｒａＪ、ａｎｄ　Ｍｅｓｓｉｎｇ
　Ｊ、（１９８７）　：　Ｍｅｔｈ、Ｅｎｚｙ＋＊ｏ１
．１５３＋　３−１１、）を感染し、所望のプラスミド
を含むＥ、ｃｏｌｉ細胞を救済することによって得た。

５　　Ｓｌヌクレアーゼマツピング Ｓｌヌクレアーゼマツピング解析は基本的にＭａｎｔａ
ｔｉｓらの方法（Ｍａｎｉａｔｉｓ　Ｔ、ｅｔ　ａｌ、
（１９８２）　；Ｍｏ１ｅｃｕｌａｒ　ＣＩｏｎｉｎｇ
、Ｃｏ１ｄ　Ｓｐｒｉｎｇ　ｌ’１ａｒｂｏｒ　Ｌａｂ
ｏｒａ−ｔｏｒｙ、）にしたがった、塊根のポリ（Ａ）
”　ＲＮＡ２μｇを８０％ホルムアミドの存在下で４５
℃、４時間、３２Ｐ　Ｉ識した一本鎖ＤＮＡとハイブリ
ダイゼーションし、Ｓ１ヌクレアーゼ（ＢＲＬ社製）で
消化し、８％ポリアクリルアミドシークエンシングゲル
によって分離した。これによって転写開始点を求めた。

６　スボラミンプロモーターの分離とこれを植物発現ベ
クターに組み込んだ組換えプラスミドの構築 前記１−５において、同定し、転写開始点（＋１）を決
定したｇｓＰｏ−ＡＩ　クローンを制限酵素ＡｌｕＩで
切断シタ断片（＋４０〜−９７０．１０１０ｂｐ）をブ
）Ｌｉ−：）、り’ＪブトＫＳ（−）（ストラタジーン
社製）のＥｃｏＲＶの部位にサブクローニングした。こ
のプラスミドをＸｂａＩ（５’）、Ｃ１ａｌ　（３’）
で切断し、スボラミンプロモーターを含む断片を得た。

この断片を植物用発現ベクターｐＧＡ４９２（Ａｎ、Ｇ
、　（１９８７）　；Ｍｅｔｈ、Ｅｎｚｙｍｏｌ、１５
３゜２９２−３０５．）のポリリンカーのＸｂａｌとＣ
１ａｌの間に挿入した。これを組換えプラス毒ド５ｐｐ
−ＣＡＴ−００と命名した。この組換えプラスミドは、
Ｅ、ｃｏｌｉに導入し、工業技術院微生物工業技術研究
所に５ｐｐ−ＣＡＴ−００として寄託されている。そし
て、その寄託番号は微工研条寄第２５４６号（ＦＥＲＭ
　ＢＰ−２５４６）である。

７　組換えプラスミド５ｐｐ−ＣＡＴ−００のアグロバ
クテリウムへの導入 組換えプラス泉ド５ｐｐ−ＣＡＴ−００をヘルパープラ
スミドｐＲＫ２０１３をもつＥ、ｃｏｌｔ　ＨＢＩＯＩ
　（クローンチク社製）の存在下でトリペアレンタル接
合によってＡ　ｒｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ　ｔｕｓ＋ｅｆ
ａｃＬｅｎｓ　ＬＢＡ　４４０４　（クローンチク社製
〉に導入した０組換えプラスミド５ｐｐ−ＣＡＴ−００
を持つＢ、ｃｏｌｉ　ＨＢＩＯＩ、ヘルパープラスξド
ｐＲＫ２０１３を持つＥ、ｃｏｌｉ　ＨＢＩＯＩと腫瘍
形成遺伝子が除去された改変非組換えプラスミドｐＡＬ
４４０４を持つＡ、　ｔｕｍｅｆａｃｉｅｎｓ　ＬＢＡ
　４４０４の培養液をそれぞれ等量ずつ混合し、抗生物
質の入っていない培地上で２８℃に一晩静置した後、リ
フアンピシリン（シグマ社製）　（１００μｇ／−）と
テトラサイクリン（１２，５μｇ／ｄ）とを含む培地上
にまき、５ｐｐ−ＣＡＴ−００を持つＡ、　ｔｕｍｅｆ
ａｃｉｅｎｓを選択した。

８　バレイシボ細胞への導入及び再分化スボラミンプロ
モーターを植物用発現ベクターに組み込んだ組換えプラ
スミドのバレイショへの導入は、チューパーディスク法
（Ｆｏｒｄｓ　Ｂ、Ｇ、ｅｔ　ａｌ。

（１９８５）　；　Ｎｕｃｌ、Ａｃ１ｄｓ　Ｒｅｓ、１
３．７３２７−７３３９．）を用いた。バレイシ！Ｆ　
（品種　農林−号）の塊茎の皮をむき、数滴のツウィー
ン２０を含む１％次亜鉛素酸ソーダ溶液で５分間殺菌し
、殺菌蒸留水で３〜４回洗った。この塊茎あるいは無菌
的に培養した植物体のマイクロチューバーから殺菌した
コルクポーラ−で約１ｃ１１の円柱を打ち抜き、２−３
ｅａの厚さのディスクに切り、７で作成した５ｐｐ−Ｃ
ＡＴ−００を持つΔ、　ｔｕａ＋ｅｆａｃｉｅｎｓの培
養液中に浸した。数十秒浸した後、バレイシラカルスか
ら誘導した懸濁培養液１１Ｉ１１をフィーダーとして用
いたＭＳ修正培地（２％シ！ＦＩ！、インドール酢酸０
．１μｇ７ｍｌ、ゼアチン１μｇ／ｄ）上に４８時間置
床した後、カナマイシン（１００μｇ／ｄ）とタラフォ
ラン（５００μｓ／ｍ）（ヘキスト社製）を含むＭＳ修
正培地（ホルモンは上と同じ）上に置いて、２５℃（１
６時間明朗、８時間時期）で培養した。３〜４週間後、
ディスク表面からカルスが形成され、シュートが誘導さ
れた。

また、しばしばカルスを経ないで直接シュートを形成す
るものもあった。このシュートを切り取り、ホルモンを
含まないＭＳ培地（抗生物質は上と同じ）で培養した。

ｌ〜２週間後に発根してきた植物体をピートモス：パー
ライト：パーξキエライ）（４：３：２）混合土のはい
ったビニールポット（直径１０　Ｃ１）に移植して人工
気象室で育成した。

９　上記８の工程で得た植物体への遺伝子の導入とスボ
ラミンプロモーターの塊茎特異的な発現の確認 （１）ＤＮＡの解析 ポットに移植１〜２力月後の形質転換バレイシｇ（Ｔｌ
〜Ｔ５）の頂葉から４〜５番目の葉を採取し、Ｄｅｌｌ
ａｐｏｒｔａらの方法（Ｄｅｌｌａｐｏｒｔａ　Ｓ、Ｌ
、ｅｔ　ａｌ、＜１９８３）　；　Ｐｌａｎｔ　Ｍｏ１
．Ｂｉｏｌ、１．１９−２１．）に従ってＴｏ　ｔａ　
ｌＤＮＡを抽出した。１０μｇのＤＮＡを旧ｎｄｕｌで
完全に消化し、サザンプロットハイブリダイゼーシ３ン
を行った。ハイブリダイゼーションには、″′Ｐ標識し
たスボラミンＡＩプロモーター（ＥｃｏＲＩ−Ｓｐｈ　
１回片、９９０ｂｐ）をプローブとして行った。この結
果、第４図に示す通り、スポラ嵩ンＡｔプロモーターが
ｌコピー−１０コピー核ＤＮＡに組み込まれていること
を確認した。

（２）　　ＣＡＴ検定 クロラムフェニコールアセチルトランスフェラーゼ（Ｃ
ＡＴ）活性は、基本的にＧｏｒｍａｎら（にｏｒｇａｎ
Ｃ，Ｍ、ｅｔ　ａｌ、（１９８２）　；　Ｍｏ１．Ｃｅ
１１．Ｂｉｏｌ、２．１０４４−１０５１．）によって
述べられたように測定した。形質転換バレイシ＝ｌ　（
Ｔｌ、　Ｔ３．７５）の植物組！（約５ＧＯｍｇ）に１
．５倍容の抽出バッファー（０，２５Ｍ　）リス塩酸（
ｐＨ７，５）、１７％ショ糖、１０ｍＭ　ＥＤＴＡ　、
１％システィン塩酸、１％アスコルビン酸）を加え乳棒
と乳鉢を用いて磨砕した。以上の操作は低温（４°Ｃ）
で行った。磨砕液を４°Ｃで１６．００Ｏｒｐｍで７分
間遠心して得られた上清（粗抽出液）の一部を用いてタ
ンパク質含量とネオマイシンホスフォトランスフェラー
ゼの活性を定量した。タンパク質定量は５％ＴＣＡで沈
澱させた後、Ｌｏｗｒｙらの方法（Ｌｏｗｒｙ　Ｏ。

Ｈ，ｅｔ　ａｌ、（１９５１）：Ｊ、Ｂｉｏｆ、Ｃｈｅ
ｍ、１９３．２６５−２７５．）に従って行った。ＣＡ
Ｔ活性の測定には、ＣＡＴ阻害物質を不活性化するため
に、粗抽出液を６５°Ｃで３分間加熱処理し、再度１６
．　ＯＯＯｒｐｍで７分間遠心して得た上清（ＣＡＴ抽
出液）をもちいた、　ＣＡＴ活性の測定は、４０μｇタ
ンパク質に相当するＣＡＴ抽出液にアセチルＣｏＡ　（
終濃度２　ｍＭ）と０．０２５μＣｉの１４ｃクロラム
フエニコール（５４ｍＣｉ／ｎ＋ｍｏｌ）を加えて全量
を４５μｌとし、３７℃で４５分間反応させた。水冷後
０．２　ｄの酢酸エチルで２回抽出し、酢酸エチル層を
乾燥後１０μｌの酢酸エチルに再度溶解しＴＬＣプレー
トにスポットし、クロロホルム：メタノール（９４：６
）で展開した後、プレートを乾燥させオートラジオグラ
フィーを行った。この結果、第５図に示すようにバレイ
ショ塊茎（Ｔ）のみでＣＡＴ活性が検出され、葉（Ｌ）
、葉柄（Ｐ）、茎（Ｓ）、根（Ｒ）、ストロン基部（Ｓ
ｔ）では検出されなかった。

（３）ＮＰＴＩ［検定 ネオマイシンフォスフオドランスフェラーゼ■（ＮＰＴ
　ＩＩ　）活性は、ＭｃＤｏｎｎｅｌｌ　ら（ＭｃＤｏ
ｎｎｅｌｌ　Ｒ，Ｅ。

ｅｔ　ａｌ、（１９８７）　：　Ｐｌａｎｔ　Ｍｏ１．
Ｂｉｏｌ、Ｒｅｐ、５，３８０−３８６．）によって述
べられたように測定した。１５μｌのアッセイ混合液（
５×反応液（３３５ｍＭ　）リス、２１０　ｓＭ塩化マ
グネシウム、２Ｍ塩化アンモニウム；１Ｍマレイン酸で
ｐ）（Ｔ、１に調製する）２２０μｊ！、１０ｄＡＴＰ
　１μｊ！、２２＋＋＋Ｍネオマイシン１．４μｍ、１
Ｍフッカナトリウム１０μ１１γ−［”　Ｐ　］−ＡＴ
Ｐを３μＣｉ加えて全量をＩＩｄとする）と１５μｇタ
ンパク質を含む粗抽出液を水中で混合し、３７°Ｃで３
０分間インキュベーシッンした。１００ｍＭりん酸バッ
ファー（ｐＨ７，５）　、２０ｎ＋Ｍ　ＡＴＰを前処理
したＰ８１ペーパー上に２０μｌスポツトした。乾燥し
た後、１０ｎ＋Ｍりん酸パンファー（ｐｉ（７，５）中
、８０°Ｃで３分間（１回）、室温で１５分間（３回）
フィルターを洗い、オートラジオグラフィーを行った。

この結果、第５図に示すように形質転換バレイショの葉
（Ｌ）、葉柄（Ｐ）、茎（Ｓ）、根（Ｒ）、ストロン基
部（Ｓｔ）、塊茎（Ｔ）のいずれにおいてもＮＰＴ　ｎ
活性が検出された。これらの結果からスポラξンブロモ
ーターはバレイショの塊茎のみで特異的に働くものと考
えた。

〔発明の効果〕

本発明の方法により、バレイショの塊茎において、のみ
所望の外来遺伝子を発現させることができる。この方法
により、バレイショの品質、栄養価を高めることができ
、バレイショの農産物資源としてしの付価の値を高める
ことができる。

【図面の簡単な説明】

第１図は、ｇｓＰｏ−ＡＩ遺伝子の全塩基配列とアミノ
酸配列、第２図は、ｇｓＰＯ−Ｂｌ遺伝子の全塩基配列
とアミノ酸配列、第３図は、スプラミンプロモーターを
植物用発現ベクターに組み込んだ組換えプラスミドの構
築図、第４図は、バレイショ形質転換体のサザンプロッ
ト解析を示す図、第５図は、バレイショ形質転換体のＣ
ＡＴ検定（ａ）とＮＰＴ　Ｉｆ検定（ロ）を示す図であ
る。 Ｇニゲリシン、Ａ：アラニン、Ｖ：バリン、Ｌ：イソロ
イシン、Ｓ：セリン、Ｔ；スレオニン、Ｄ＝アスパラギ
ン酸、Ｅ：グルタミン酸、Ｎ：アスパラギン、Ｑ：グル
タミン、Ｋ：リジン、Ｒ：アルギニン、Ｃニジスティン
、Ｍ：メチオニン、Ｆ：フェニルアラニン、Ｙ：チロシ
ン、Ｗニトリブトファン、Ｈ：ヒスチジン、Ｐニブロリ
ン

Claims (1)

【特許請求の範囲】
1. 　サツマイモのスポラミンをコードする遺伝子のプロモ
   ーターに所望の遺伝子および所望のターミネーターを連
   結したものを植物用発現ベクターに組み込み組換え体プ
   ラスミドを得、該組換え体プラスミドで塊茎または塊根
   を形成する植物を形質転換することを特徴とする塊茎ま
   たは塊根を形成する植物の形質転換方法。