WO1996028547A1 - Dermatomyositis-spezifisches autoantigen - Google Patents

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WO1996028547A1
WO1996028547A1 PCT/DE1996/000444 DE9600444W WO9628547A1 WO 1996028547 A1 WO1996028547 A1 WO 1996028547A1 DE 9600444 W DE9600444 W DE 9600444W WO 9628547 A1 WO9628547 A1 WO 9628547A1
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serum
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Hans Peter Seelig
Manfred Renz
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Privates Institut Für Immunologie Und Molekulargenetik Gmbh
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    • C07K14/00—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof
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    • C07K14/4713—Autoimmune diseases, e.g. Insulin-dependent diabetes mellitus, multiple sclerosis, rheumathoid arthritis, systemic lupus erythematosus; Autoantigens
    • A—HUMAN NECESSITIES
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    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N9/00—Enzymes; Proenzymes; Compositions thereof; Processes for preparing, activating, inhibiting, separating or purifying enzymes
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K38/00—Medicinal preparations containing peptides

Definitions

  • the present invention relates to a dermatomyositis-specific autoantigen, such a DNA coding and a method for producing such and its use.
  • Autoimmune diseases are characterized by the emergence of autoantibodies, i.e. Antibodies that are directed against components of your own organism. Autoantibodies can induce damage to the organism, an organ or an organ component and thereby trigger serious life-threatening diseases. Such a disease arises through various pathomechanisms, such as through neutralization of antigens, e.g. Hormones, by blocking or stimulating a receptor for biologically active substances, e.g. by autoantibodies against the receptor of the thyroid stimulating hormone in hyperthyroidism, by binding to certain cell or tissue structures with induction of a complement-mediated inflammation, e.g. Anti-car body glomerulonephritis against glomerular basement membranes. Tissue damage can also be induced by cell-mediated mechanisms (autoantibody-dependent cellular cytotoxicity) or by localized and systemic immune complex deposits after the autoantibodies have bound to soluble antigens.
  • pathomechanisms such as through neutralization of antigens, e.g. Hormone
  • rheumatic diseases especially inflammatory ones Rheumatic diseases, to which collagen diseases are attributed
  • Rheumatic diseases are characterized by the appearance of numerous autoantibodies.
  • antigens of the cell nucleus such as with double-stranded DNA, single-stranded DNA, RNA, histones, non-histone proteins, ribonucleoproteins, chromosome-associated antigens, for example centromeres or spindle apparatus, or with antigens which are only present in certain Phases of the cell cycle, for example cyclin, are expressed.
  • the above autoantibodies are found in diseases such as lupus erythematosus, Sjögren's syndrome, mixed collagenosis, polymyositis, scleroderma, CREST syndrome, Wegener's granulomatosis and dermatomyositis. They are mostly detected by reacting with nuclear extracts from calf or rabbit thymocytes. However, a differential diagnosis of these diseases, especially dermatomyositis, is not possible. However, this is a prerequisite for the choice of therapy.
  • the present invention is therefore based on the object of providing a means by which dermatomyositis can be detected by differential diagnosis.
  • the invention thus relates to a dermatomyositis-specific autoantigen which comprises the amino acid sequence of FIG. 2 or a functional derivative or fragment thereof.
  • the expression "functional derivative or fragment” encompasses any derivative or fragment of the amino acid sequence of FIG. 2 against which an autoantibody can be formed.
  • the expression relates to epitopes in the amino acid sequence which can act as antigens.
  • the amino acid sequence of FIG. 2 can have additions, substitutions and / or deletions of one or more amino acids, which also applies to the functional ones Derivatives or fragments thereof apply.
  • Another object of the invention is a nucleic acid coding for the above autoantigen.
  • This can be an RNA or a DNA.
  • the latter can e.g. be a genomic DNA or a cDNA.
  • a DNA is preferred which comprises the following:
  • hybridizing DNA indicates a DNA which hybridizes with a DNA of (a) under customary conditions, in particular at 20 ° C. below the melting point of the DNA.
  • the DNA of FIG. 2 was deposited with the DSM (German Collection of Microorganisms and Cell Cultures) as E. coli Hi-fl-213 under DSM 9800 on March 13, 1995.
  • DSM German Collection of Microorganisms and Cell Cultures
  • Mi-2 DNA a DNA according to the invention or an autoantigen encoded by it is referred to as "Mi-2 DNA” (“Mi-2 cDNA”) or "Mi-2 antigen”.
  • Mi-2 cDNA a DNA according to the invention or an autoantigen encoded by it
  • anti-Mi-2 positive a DNA according to the invention or an autoantigen encoded by it
  • Mi-2 indicates the patient's serum that reacted for the first time with nuclear extracts from calf or rabbit thymocytes.
  • Mi-2 cDNA it is expedient to screen a lambda phage expression library with the above patient sera. Positive clones can then be sequenced and used for further screening if necessary.
  • the production of a Mi-2 cDNA according to the invention is described in Examples 1-2. Their structural elucidation and that of the Mi-2 anti- gens are described in Examples 3-5.
  • a Mi-2 cDNA can be present in a vector or expression vector.
  • examples of such are known to the person skilled in the art.
  • these are e.g. pGEMEX, pUC derivatives, pGEX-2T and pET3b, the latter being preferred.
  • yeast e.g. to call pY100 and Ycpadl
  • animal cells e.g. pKCR, pEFBOS, cDM8 and pCEV4 must be specified.
  • suitable cells for expressing a Mi-2 cDNA present in an expression vector include the E. coli strains HB101, DH1, x1776, JM101, JM 109, and BL21, the latter being preferred, the yeast strain Saccharomyces cerevisiae and the animal cells L, 3T3, FM3A, CHO, COS, Vero and HeLa.
  • Mi-2 cDNA has to be inserted into an expression vector. He is also aware that this DNA can be inserted in conjunction with a DNA coding for another protein or peptide, so that the Mi-2 cDNA can be expressed in the form of a fusion protein.
  • rMi-2 antigen recombinantly produced Mi-2 antigen (hereinafter referred to as rMi-2 antigen), which may also be a fusion protein, is therefore also a subject of the invention.
  • Autoantigens according to the invention are distinguished by the fact that they recognize dermatomyositis-specific autoantibodies. They are therefore suitable for the differential diagnosis of collagen diseases, in particular dermatomyositis. Such a diagnosis can be made in conventional detection methods, in particular in a Western blot, an ELISA, an immunoprecipitation or an immunofluorescence.
  • the autoantigens according to the invention if appropriate , be labeled or be used in combination with labeled antibodies directed against them.
  • autoantigens according to the invention can be present in a kit.
  • This can contain the autoantigens, as stated in the above form, together with conventional additives, such as buffers and carrier material.
  • conventional additives such as buffers and carrier material.
  • autoantigens according to the invention are also suitable for therapeutic purposes.
  • they can be used to remove autoantibodies from the circulation of dermatomyositis patients by affinity chromatography. Removal of dermatomyositis-specific autoantibody-producing lymphocytes by coupling the autoantigens according to the invention to cell toxins is also contemplated.
  • nucleic acids according to the invention are suitable for diagnostic purposes of all kinds.
  • Figure 1 shows the cloning and composition of the 218 kD Mi-2 cDNA.
  • the upper part of the figure shows a restriction map with a scale in kb.
  • the horizontal lines represent isolated clones; the clones sequenced in both mixtures are indicated by dots.
  • the two small clones in the lower left corner were obtained according to the RACE protocol (cf. Froh ⁇ mann, MA et al., Proc. Natl. Acad. Sei. USA 85 (1 988), 8998-9002).
  • nt 738-4980 1: nt 738-4980; 2: nt 89-1047; 3: nt 242-4991; 4: nt 2020-4970; 5: nt 2293-4977; 6: nt 3313-4977; 7: nt 3709-4977; 8: nt 3755-6244; 9: nt 3932-6328; 10: nt 4056-6244; 1 1: nt -89 - -38; 1 2: nt -79 - -38,
  • Fig. 2 shows the nucleotide sequence and coding amino acid sequence of the
  • the framed sequences show the seven helicase-specific motifs (I, IA, II, IM, IV, V, and VI).
  • the four underlined regions contain eleven potential core target sequences, ten of which are located in three N-terminal regions (region a contains 3 motifs; region b 4 motifs and region C 3 motifs).
  • the dotted line (nt 490-520) shows a collection of glutamic acid and aspartic acid residues, which may interact electrostatically with chromatin (histones),
  • FIG. 3 shows a Northern blot analysis of the 218 kD Mi-2 gene expression in FIG.
  • HEp-2 cells RNA samples were separated using formaldehyde agarose gel electrophoresis according to their size and hybridized with 3 P-labeled Mi-2 cDNA with high stringency. Lane A: 5 ⁇ total RNA from HEp-2 cells; Lane B: 0.3 ⁇ g of HEp-2 cells poly (A) + RNA. The size of the band in the autoradiogram is approximately 6.8 kb,
  • NT potential core target sequences
  • CB potential chromatin binding region
  • I - VI Helicase-specific domains.
  • the thick horizontal line in the lower part of the figure shows a recombinant protein (rMi-2), which was used for immunological studies. A scale with the positions of the amino acids is shown at the top,
  • Figure 5 shows the localization of the 218 kD Mi-2 gene with fluorescence in situ
  • Hybridization on the short arm of human chromosome 12 (12p 13) (arrows), 6 shows immunoblots of SDS-PAGE separated (A) recombinant mi
  • 2-polypeptide (rMi-2) and (B) core proteins of HEp-2 cells which reacted with human and rabbit sera and affinity-purified anti-rMi-2-lg.
  • Lanes AI, B1 Human non-reactive control serum.
  • Lanes A2, B2 Human anti-Mi-2 positive serum No. 1 (Table 1) recognizes the rMi-2 with 55 kD (lane A2) as well as the natural 235 kD protein (lane B2) and an additional second natural nucleus ⁇ 80 kD protein.
  • Lanes A3, B3 Affinity-purified antibodies of serum No. 1 (human anti-rMi-2-Ig) react both with the rMi-2 used for affinity purification and with the natural 235 kD nuclear protein.
  • Lane A4, B4 Non-reactive rabbit preimmune serum.
  • Lanes A5 and B5 After immunization with rMi-2, the rabbit serum recognizes the recombinant antigen (rMi-2) and the natural 235 kD protein.
  • Lanes A6 and B6 Affinity-purified rabbit antibodies (rabbit anti-rMi-2-Ig) also react with both proteins, the recombinant antigen and the natural 235 kD protein.
  • Lane C (control) nuclear proteins of HEp-2 cells react with a variety of human autoantibodies,
  • FIG. 7 shows immunoblots of nuclear (N), mitochondrial (Mt), microsomal (Ms) and cytoplasmic (S-100, S) fractions (80 ⁇ g protein / cm) from HEp-2 cells which are associated with affinity purified rabbit anti-rMi-2 antibody reacted.
  • FIG. 8b shows an immunoprecipitation of proteins of a HEp-2 cell lysate with the DM patient serum No. 1 (P1), with rMi-2 protein affinity-purified antibody of serum No. 1 (P1 alg), affinity-purified ⁇ tem rabbit antibody (Ra alg), rabbit IgG (Ra Ig), rabbit immune serum (Ra IS) and rabbit pre-immune serum (Ra pIS).
  • P1 alg affinity-purified ⁇ tem rabbit antibody
  • Ra Ig rabbit IgG
  • Ra IS rabbit immune serum
  • Ra pIS rabbit pre-immune serum
  • Rabbit anti-Mi-2 serum This immunofluorescence shows a MACHINES SHOW ⁇ che nuclear fluorescence.
  • A1 Human anti-Mi-2 positive serum (No. 3, Table 1 ).
  • A2 Serum from patient No. 9, to whom anti-mitochondrial antibodies have been added, shows nuclear and mitochondrial fluorescence.
  • A3 The mixed serum shown in A2 was affinity-cleaned with rMi-2, which led to an exclusive nuclear fluorescence.
  • B1 Rabbit preimmune serum.
  • B2 A rabbit serum after the second booster with rMi-2 antigen showed intense nuclear fluorescence.
  • B3 The affinity-purified rabbit anti-M2 antibodies stained the nucleus,
  • Mi-2 antibodies Wells of microtiter plates were coated with 0.8 ⁇ g rMi-2 antigen and blocked with BSA. ODs of serial dilutions of anti-Mi-2 positive sera and a control serum are shown. Dilutions of 1: 200 were chosen for testing human sera, and
  • Fig. 1 1 shows the detection of anti-Mi-2 antibodies with the recombinant protein ELISA. Dashed line: border region (OD 0.5-0.6). The circled numbers indicate the number of negative sera tested with ODs between 0.05 and 0.5.
  • DM dermatomyositis
  • SLE systemic lupus erythematosus
  • RA rheumatoid arthritis
  • ANA positive sera Sera that were sent in for ANA analysis and reacted positively with HEp-2 cells (titer 1: ⁇ 160). Controls: sera from healthy individuals.
  • the IgG fraction of a human anti-Mi-2 positive serum was isolated by DEAE-Sepharose chromatography and used to screen approximately 400,000 PIaques of an oligo (dT) -primed HeLa cDNA expression library ( ⁇ UNIZAPXR, Stratagene, Heidelberg) used. After repeated purification, a positive clone was obtained and sequenced. Two 40 m ⁇ f ⁇ oligonucleotides, which were complementary to the two ends of the inert of this clone (4.3 kb), were used after radioactive labeling to screen the same library again in order to obtain further cDNAs in the 5 'and 3' direction.
  • AAATAAA sequence motif very similar to the polyadenylation consensus signal (AATAAA).
  • RNA and poly (A) + RNA were isolated from a human Zeil line, separated by size electrophoretically in a formaldehyde agarose gel and hybridized with radioactively labeled Mi-2 cDNA after transfer to a membrane.
  • the autoradiogram (Fig. 3) shows a signal at about 6.8 kb. This experiment demonstrates that the Mi-2 mRNA is large enough to contain the 5.7 kb Mi-2 cDNA.
  • Example 5 Example 5:
  • a fragment of the Mi-2 cDNA (nt 242-4991) was labeled with biotin-dUTP and used for in situ hybridization on human metaphase chromosomes.
  • Hybridized DNA was detected with avidin (Jackson Immuno Research Laboratories, West Grove, PA USA) labeled with fluorescein isothiocyanate and an Axiophot photo microscope (Zeiss, Oberkochen). Images were digitized with a CCD camera (Photometrics, Tuscon, AZ, USA) and processed with an Apple computer system. Specific fluorescence signals were observed on the distal side of the short arm of chromosome 12 (12p13). Twelve out of eight checked metaphase chromosomes showed specific signals in both homologues).
  • a segment in the central part of the Mi-2 cDNA (nt 151 1 -2998) (FIGS. 1 and 2) was terminated at the 5 'end with a Ndel interface and at the 3' end with six histidine codons and a BamHI Provide the interface and after ligation into the bacterial expression vector pET3b in E. coli BL21 (DE3) pLysS (see Studier, FW et al., Methods Enzymol. 185 (1990), 60-89). After the culture had been grown to an OD ⁇ oo of 0.5, it was induced with 1 mM isopropyl-yff-D-thiogalactopyranoside, cultivated for a further 8 hours and harvested.
  • the cell pellet was suspended in 10 mM Tris-HCl (pH 8.0), 0.1 M sodium phosphate and 8 M urea and the insoluble material, which contained the recombinant protein, was obtained by centrifugation, and in 8 M urea, 6 M Guanidinium-HCI dissolved and obtained using Ni + chelate affinity chromatography (Quiagen).
  • the yield was about 200 mg of recombinant protein (rMi-2) per one liter of culture.
  • the size of the Mi-2 antigen as estimated in the SDS-PAGE corresponded to the derived molecular weight of 55 kD.
  • Microtiter plates (Immunolon, Dynatech, Denkendorf) were incubated with 100 ⁇ l per well with a solution consisting of 8 ⁇ g / ml rMi-2 antigen and 0.1 M sodium carbonate (pH 9.6) for 16 hours at 4 ° C. and then with 300 / I blocked per well with a solution consisting of PBS and 0.1% BSA for 16 hours at 4 ° C.
  • Antibody screening was carried out with 200 / I serum per well (serum dilutions: 1: 300 in PBS, 0.01% Tween and 0.1% BSA) performed during a 30 minute incubation at 37 ° C. After a washing step (5 ⁇ PBS, 0.01% Tween, 30 min.
  • the wells were each treated with 20O; l of a 1: 20000 diluted peroxidase-labeled rabbit anti-human-IgG F (ab ') 2 in PBS, 0.01% Tween and 0.5% BSA and incubated for 30 min at 37 ° C. Bound antibodies were visualized with OPD and the enzyme reaction was carried out with 50 / I 4 MH 2 SO 4 depending stopped well. The absorbance was measured at 492/620 nm bichromatic. this assay 1 368 human sera were tested (Fig. 10).
  • the average OD value was a Kon ⁇ troll group of 189 healthy persons ⁇ 0.25 _ 0.08: ODs between 0.5 and 0.6 were evaluated as borderline, ODs> 0.6 as positive
  • the antibody concentrations (ODs) of the twelve anti-Mi-2 positive dermatomyositis patients are shown in FIG 1. With the exception of one serum, which was negative in the ELISA but positive in the immunoblot assay, all patient sera showed OD values that were significantly above the limit.

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Abstract

Die vorliegende Erfindung betrifft ein Dermatomyositis-spezifisches Autoantigen, eine ein solches kodierende DNA und ein Verfahren zur Herstellung eines solchen sowie dessen Verwendung.

Description

Dermatomyositis-spezifisches Autoantigen
Die vorliegende Erfindung betrifft ein Dermatomyositis-spezifisches Autoantigen, eine ein solches kodierende DNA und ein Verfahren zur Herstellung eines solchen sowie dessen Verwendung.
Autoimmunerkrankungen kennzeichnen sich durch das Autreten von Autoanti¬ körpern, d.h. Antikörpern, die sich gegen Bestandteile des eigenen Organismus richten. Autoantikörper können eine Schädigung des Organismus, eines Organs oder eines Organbestandteils induzieren und hierdurch teils schwerwiegende lebensbedrohliche Erkrankungen auslösen. Die Entstehung einer solchen Erkran¬ kung erfolgt durch verschiedenartige Pathomechanismen, wie durch Neutralisie¬ rung von Antigenen, z.B. Hormonen, durch Blockierung oder Stimulierung eines Rezeptors für biologische aktive Substanzen, z.B. durch Autoantikörper gegen den Rezeptor des Thyreoidea-stimulierenden Hormons bei Hyperthyreose, durch Bin¬ dung an bestimmte Zeil- oder Gewebestrukturen mit Induktion einer Komplement¬ vermittelten Entzündung, z.B. Glomerulonephritis durch Antiautokörper gegen Glomerulus-Basalmembranen. Gewebeschädigungen können ferner durch Zell- vermittelte Mechanismen (Autoantikörper-abhängige zelluläre Zytotoxizität) oder durch lokalisierte und systemische Immunkomplexablagerungen nach Bindung der Autoantikörper an lösliche Antigene induziert werden.
Neben solchen offensichtlich direkt schädigenden Autoantikörpern treten beim Menschen eine Vielzahl von Autoantikörpern gegen Blut-, Zeil- oder Gewebebe¬ standteile auf, denen bisher eine gewebeschädigende Rolle noch nicht eindeutig zugesprochen werden kann.
Der Formenkreis der rheumatischen Erkrankungen, besonders der entzündlichen rheumatischen Erkrankungen, denen die Kollagenerkrankungen zugerechnet wer¬ den, ist durch das Auftreten zahlreicher Autoantikörper gekennzeichnet. Diese reagieren z.B. mit Antigenen des Zellkerns, wie mit Doppelstrang-DNA, Einzel¬ strang-DNA, RNA, Histonen, Non-Histonproteinen, Ribonukleoproteinen, Chromo- somen-assoziierten Antigenen, z.B. Zentromeren oder Spindelapparat, oder mit Antigenen, die nur in bestimmten Phasen des Zelizyklus, z.B. Cyclin, exprimiert werden.
Bei Erkrankungen, wie Lupus erythematodes, Sjögren-Syndrom, Mischkollagenose, Polymyositis, Sklerodermie, CREST-Syndrom, Wegener'sche Granulomatose und Dermatomyositis, werden vorstehende Autoantikörper gefunden. Ihr Nachweis erfolgt zumeist durch Umsetzung mit Kernextrakten aus Kalbs- oder Kaninchen- Thymozyten. Damit ist allerdings eine Differentialdiagnose dieser Erkrankungen, insbesondere von Dermatomyositis, nicht möglich. Eine solche ist aber Voraus¬ setzung für die Wahl der Therapie.
Der vorliegende Erfindung liegt somit die Aufgabe zugrunde, ein Mittel bereitzu¬ stellen, mit dem Dermatomyositis differentialdiagnostisch erfaßt werden kann.
Erfindungsgemäß wird dies durch die Bereitstellung der Gegenstände in den Patentansprüchen erreicht.
Gegenstand der Erfindung ist somit ein Dermatomyositis-spezifisches Autoantigen, das die Aminosäuresequenz von Fig. 2 oder ein funktionelles Derivat oder Frag¬ ment davon umfaßt.
Der Ausdruck "funktionelles Derivat oder Fragment" umfaßt jegliches Derivat oder Fragment der Aminosäuresequenz von Fig. 2, gegen die ein Autoantikörper gebil¬ det werden kann. Insbesondere betrifft der Ausdruck Epitope in der Aminosäurese¬ quenz, die als Antigene wirken können. Auch ist es selbstverständlich, daß die Aminosäuresequenz von Fig. 2 Additionen, Substitutionen und/oder Deletionen von ein oder mehreren Aminosäuren aufweisen kann, was auch für die funktionellen Derivate oder Fragmente davon gilt.
Ein weiterer Gegenstand der Erfindung ist eine für ein vorstehendes Autoantigen kodierende Nukleinsaure. Dies kann eine RNA oder eine DNA sein. Letztere kann z.B. eine genomische DNA oder eine cDNA sein. Bevorzugt ist eine DNA, die folgendes umfaßt:
(a) die DNA von Fig. 2 oder einen Teil davon,
(b) eine mit der DNA von (a) hybridisierende DNA, oder
(c) eine mit der DNA von (a) oder (b) über den degenerierten genetischen Code verwandte DNA.
Der Ausdruck "hybridisierende DNA" weist auf eine DNA hin, die unter üblichen Bedingungen, insbesondere bei 20°C unter dem Schmelzpunkt der DNA, mit einer DNA von (a) hybridisiert.
Die DNA von Fig. 2 wurde bei der DSM (Deutsche Sammlung von Mikroorganis¬ men und Zellkulturen) als E.coli Hi-fl-213 unter DSM 9800 am 13. März 1995 hinterlegt.
Nachstehend werden eine erfindungsgemäße DNA bzw. ein durch sie kodiertes Autoantigen mit "Mi-2-DNA" ("Mi-2-cDNA") bzw. "Mi-2-Antigen" bezeichnet. Dies rührt daher, daß zur Herstellung einer solchen DNA Seren von Dermatomyositis- Patienten verwendet werden können, die mit "anti-Mi-2 positiv" bezeichnet sind. "Mi-2" weist dabei auf das Serum des Patienten hin, das erstmalig mit Kernextrak¬ ten aus Kalbs- oder Kaninchen-Thymozyten reagierte.
Zur Herstellung einer Mi-2-cDNA ist es günstig, eine Lambda-Phagen-Expressions- bibliothek mit vorstehenden Patientenseren zu screenen. Positive Klone können dann sequenziert und ggfs. für ein weiteres Screening verwendet werden. Die erfindungsgemäße Herstellung einer Mi-2-cDNA wird in den Beispielen 1-2 be¬ schrieben. Ihre Strukturaufklärung sowie jene des durch sie kodierten Mi-2-Anti- gens werden in den Beispielen 3-5 beschrieben.
Erfindungsgemäß kann eine Mi-2-cDNA in einem Vektor bzw. Expressionsvektor vorliegen. Beispiele solcher sind dem Fachmann bekannt. Im Falle eines Expres¬ sionsvektors für E. coli sind dies z.B. pGEMEX, pUC-Derivate, pGEX-2T und pET3b, wobei letzterer bevorzugt ist. Für die Expression in Hefe sind z.B. pY100 und Ycpadl zu nennen, während für die Expression in tierischen Zellen z.B. pKCR, pEFBOS, cDM8 und pCEV4, anzugeben sind.
Der Fachmann kennt geeignete Zellen, um eine, in einem Expressionsvektor vorliegende Mi-2-cDNA zu exprimieren. Beispiele solcher Zellen umfassen die E.coli-Stämme HB101 , DH1 , x1776, JM101 , JM 109, und BL21 , wobei letzterer bevorzugt ist, den Hefe-Stamm Saccharomyces cerevisiae und die tierischen Zellen L, 3T3, FM3A, CHO, COS, Vero und HeLa.
Der Fachmann weiß, in welcher Weise eine Mi-2-cDNA in einen Expressionsvektor inseriert werden muß. Ihm ist auch bekannt, daß diese DNA in Verbindung mit einer für ein anderes Protein bzw. Peptid kodierenden DNA inseriert werden kann, so daß die Mi-2-cDNA in Form eines Fusionsproteins exprimiert werden kann.
Des weiteren kennt der Fachmann Bedingungen, transformierte bzw. transfizierte Zellen zu kultivieren. Auch sind ihm Verfahren bekannt, das exprimierte Mi-2- Antigen zu isolieren und zu reinigen. Ein vorstehendes, rekombinant hergestelltes Mi-2-Antigen (nachstehend mit rMi-2-Antigen bezeichnet), wobei dieses auch ein Fusionsprotein sein kann, ist somit ebenfalls Gegenstand der Erfindung.
Erfindungsgemäße Autoantigene zeichnen sich dadurch aus, daß sie Dermato- myositis-spezifische Autoantikörper erkennen. Sie eignen sich daher zur Diffe¬ rentialdiagnose von Kollagenerkrankungen, insbesondere von Dermatomyositis. Eine solche Diagnose kann in üblichen Nachweisverfahren, insbesondere in einem Western Blot, einem ELISA, einer Immunpräzipitation oder einer Immunfluoreszenz, erfolgen. Hierzu können die erfindungsgemäßen Autoantigene, wenn es angebracht ist, markiert sein oder in Kombination mit markierten gegen sie gerichteten Antikör¬ pern eingesetzt werden.
Desweiteren können erfindungsgemäße Autoantigene in einem Kit vorliegen. Dieser kann die Autoantigene, wie in vorstehender Form angegeben, zusammen mit üblichen Zusatzstoffen, wie Puffer und Trägermaterial, enthalten. Ein solcher Kit ist ebenfalls Gegenstand der Erfindung.
Darüber hinaus eignen sich erfindungsgemäße Autoantigene auch für therapeu¬ tische Zwecke. Beispielsweise können durch sie Autoantikörper affinitäts-chro- matographisch aus dem Kreislauf von Dermatomyositis-Patienten entfernt werden. Auch ist an eine Entfernung von Dermatomyositis-spezifischen Autoantikörper- produzierenden Lymphozyten durch Kopplung der erfindungsgemäßen Autoantige¬ ne an Zell-Toxine zu denken.
Des weiteren eignen sich erfindungsgemäße Nukleinsäuren, insbesondere DNAs für diagnostische Zwecke aller Art.
Kurze Beschreibung der Zeichnungen:
Fig.1 zeigt die Klonierung und Zusammensetzung der 218 kD Mi-2 cDNA.
Der obere Teil der Abbildung zeigt eine Restriktionskarte mit einer Skala in kb. Die dicke Linie entspricht dem offenen Leseraster mit durch Pfeile angedeuteten Restriktions-Schnittstellen (H = Hind III; B = BamHI; E = EcoRI; C = Clal; S = SpHI) . Die horizontalen Linien stellen isolierte Klone dar; die in beiden Mischungen sequenzierten Klone sind durch Punkte gekennzeichnet. Die beiden kleinen Klone in der linken unteren Ecke wurden nach dem RACE-Protokoll (vgl. Froh¬ mann, M.A. et al., Proc. Natl. Acad. Sei. USA 85 ( 1 988), 8998- 9002) gewonnen. 1 : nt 738-4980; 2: nt 89-1047; 3: nt 242-4991 ; 4: nt 2020-4970; 5: nt 2293-4977; 6: nt 3313-4977; 7: nt 3709- 4977; 8: nt 3755-6244; 9: nt 3932-6328; 10: nt 4056-6244; 1 1 : nt -89 - -38; 1 2: nt -79 - -38,
Fig. 2 zeigt die Nukleotid-Sequenz und kodierende Aminosäure-Sequenz der
218 kD Mi-2 cDNA. Die eingerahmten Sequenzen zeigen die sieben Helicase-spezifischen Motive (I, IA, II, IM, IV, V, und VI). Die vier unterstrichenen Regionen enthalten elf potentielle Kern-Target-Se¬ quenzen, von denen zehn in drei N-terminalen Regionen lokalisiert sind (Region a enthält 3 Motive; Region b 4 Motive und Region C 3 Motive). Die punktierte Linie (nt 490-520) zeigt eine Ansammlung von Glutaminsäure- und Asparaginsäure-Resten, die möglicherweise elektrostatisch mit Chromatin (Histonen) interagieren,
Fig. 3 zeigt eine Northernblot-Analyse der 218 kD Mi-2 Gen-Expression in
HEp-2-Zellen. RNA-Proben wurden mit Hilfe von Formaldehyd-Agaro- segel-Elektrophorese entsprechend ihrer Größe aufgetrennt und mit 3 P-markierter Mi-2 cDNA unter hoher Stringenz hybridisiert. Spur A: 5 μ_ Gesamt-RNA von HEp-2 Zellen; Spur B: 0,3 μg HEp-2-Zellen poly(A)+ RNA. Die Größe der Bande im Autoradiogramm entspricht ungefähr 6,8 kb,
Fig. 4 zeigt eine Computer-assistierte Analyse funktioneller Domänen des
218 kD Mi-2 Proteins. NT: potentielle Kern-Target-Sequenzen; CB: potentielle Chromatin-bindende Region; I - VI: Helicase-spezifische Domänen. Die dicke horizontale Linie im unteren Teil der Abbildung weist ein rekombinantes Protein (rMi-2) aus, welches für immunologi¬ sche Studien verwendet wurde. Oben ist eine Skala mit den Positio¬ nen der Aminosäuren eingezeichnet,
Fig. 5 zeigt die Lokalisierung des 218 kD Mi-2 Gens mit Fluoreszenz-in situ
Hybridisierung (FISH) am kurzen Arm des humanen Chromosoms 12 ( 12p 13) (Pfeile), Fig. 6 zeigt Immunoblots von SDS-PAGE getrennten (A) rekombinantem Mi-
2-Polypeptid (rMi-2) und (B) Kernproteinen von HEp-2-Zellen, die mit Human- und Kaninchenseren und Affinitäts-gereinigtem anti-rMi-2-lg reagierten. Spuren AI , B1 : Humanes nicht-reaktives Kontrollserum. Spuren A2, B2: Humanes anti-Mi-2-positives Serum Nr. 1 (Tabelle 1 ) erkennt das rMi-2 mit 55 kD (Spur A2) als auch das natürliche 235 kD Protein (Spur B2) und ein zusätzliches zweites natürliches Kern¬ protein mit 80 kD. Spuren A3, B3: Affinitäts-gereinigte Antikörper von Serum Nr. 1 (humanes anti-rMi-2-lg) reagieren sowohl mit dem für die Affinitätsreinigung benutzten rMi-2 als auch mit dem natürli¬ chen 235 kD nuklearen Protein. Die Spezifität der Antikörper-Präpara¬ tion ist exemplarisch durch die ausbleibende Reaktion mit dem 80 kD Protein demonstriert. Spur A4, B4: Nicht-reaktives Kaninchen Preim- mun-Serum. Spuren A5 und B5: Das Kaninchen-Serum erkennt nach Immunisierung mit rMi-2 das rekombinante Antigen (rMi-2) und das natürliche 235 kD Protein. Spuren A6 und B6: Affinitäts-gereinigte Kaninchen-Antikörper (Kaninchen anti-rMi-2-lg) reagieren auch mit beiden Proteinen, dem rekombinanten Antigen und dem natürlichen 235 kD Protein. Spur C (Kontrolle): Kernproteine von HEp-2-Zellen reagieren mit einer Vielzahl von humanen Autoantikörpern,
Fig. 7 zeigt Immunoblots von nuklearen (N), mitochondrialen (Mt), mikro- somalen (Ms) und zytoplasmatischen (S-100, S) Fraktionen (80 μg Protein/cm) von HEp-2-Zellen, die mit Affinitäts-gereinigtem Kanin- chen-anti-rMi-2-Antikörper reagierten. Das 218 kD Mi-2-Protein wurde fast ausschließlich in der Kernfraktion bei Mr = 235 kD gefun¬ den. Ein sehr geringer Anteil an immunoreaktivem Protein ist im S- 100-Überstand zu erkennen. Die Auswertung der Blot-Scans ergab folgende Verteilung des 218 kD Mi-2-Proteins: 97,5% im Kern, jeweils 0% in den mitochondrialen und mikrosomalen Fraktionen und 2,5% in der S-100-Fraktion, Fig. 8a zeigt Immunprazipitationen 35S-Methionin-markierter Proteine von durch SDS-PAGE aufgetrennten HEp-2-Zell-Lysaten mit anti-Mi-2- Seren (P2-P12) von DM Patienten und gesunden Kontroll-Personen (C1 , C2). bl = Protein A-Sepharose allein. Alle Patienten-Seren präzi¬ pitierten ein 235 kD Protein und außerdem zusätzliche durch Aste- risks an der rechten Seite gekennzeichnete Proteine mit individuell verschiedenen Mustern; außerdem sind die Molekulargewichte ange¬ geben,
Fig. 8b zeigt eine Immunpräzipitation von Proteinen eines HEp-2-Zell-Lysates mit dem DM Patientenserum Nr. 1 (P1 ), mit rMi-2-Protein Affinitäts- gereinigtem Antikörper des Serums Nr. 1 (P1 alg), Affinitäts-gereinig¬ tem Kaninchen-Antikörper (Ra alg), Kaninchen-IgG (Ra Ig), Kaninchen- Immunserum (Ra IS) und Kaninchen-Präimmunserum (Ra pIS). Affini- tätsgereinigte aπti-rMi-2-Antikörper präzipitierten das gleiche 235 kD Protein wie das Patienten-anti-Mi-2-positive Serum,
Fig. 8c zeigt Immunprazipitationen 35S-Methion-markierter Proteine von HEp-
2 Zellkernen und zytoplasmatischer Fraktionen von HEp-2-Zellen mit humanem und Kaninchen-Serum, bl = Protein A-Sepharose allein; C = Serum einer gesunden Person; P2 = Patient Nr. 2; P2 alg = Affinitäts-gereinigtes anti-rMi-2 spezifisches IgG des Patienten Nr. 2; Ra alg = Affinitäts-gereinigtes anti-rMi-2 Ig des Kaninchens; Ra IS = Kaninchen-Immunserum; Ra pIS = Präimmunserum. Sowohl das Patienten- als auch das Kaninchen-Serum präzipitierten das 235 kD- Protein vom Kernextrakt aber nicht von zytoplasmatischen Fraktio¬ nen. Die Muster, die mit Affinitäts-gereinigten Human- und Kanin¬ chen-Antikörper erhalten wurden, sind fast identisch.
Fig. 9: zeigt eine Immunfluoreszenz von HEp-2-Zellen mit humanem und
Kaninchen-anti-Mi-2-Serum. Diese Immunfluoreszenz zeigt eine deutli¬ che Kernfluoreszenz. A1 : Humanes anti-Mi-2-positives Serum (Nr. 3, Tabelle 1 ). A2: Serum des Patienten Nr. 9, welches mit anti-mito- chondrialen Antikörpern versetzt wurde, zeigt nukleare und mito- chondriale Fluoreszenz. A3: Das in A2 gezeigte Mischserum wurde mit rMi-2 Affinitäts-gereinigt, was zu einer ausschließlichen Kern¬ fluoreszenz führte. B1 : Kaninchen-Präimmunserum. B2: Ein Kanin¬ chenserum nach dem zweiten Booster mit rMi-2-Antigen zeigte inten¬ sive Kern-Fluoreszenz. B3: Die affinitätsgereinigten Kaninchen-anti- M2-Antikörper färbten den Kern,
Fig. 10 zeigt einen ELISA mit rMi-2-Antigen zum Nachweis von anti-218 kD
Mi-2- Antikörpern. Vertiefungen von Mikrotiterplatten wurden mit 0,8 μg rMi-2-Antigen beschichtet und mit BSA abgeblockt. ODs von Se¬ rien-Verdünnungen anti-Mi-2-positiver Seren und ein Kontrollserum sind gezeigt. Zum Testen von Human-Seren wurden Verdünnungen von 1 :200 gewählt, und
Fig. 1 1 zeigt den Nachweis von anti-Mi-2-Antikörpern mit dem rekombinan- ten Protein-ELISA. Gestrichelte Linie: Grenz-Region (OD 0,5-0,6). Die eingekreisten Zahlen bedeuten die Anzahl von getesteten negativen Seren mit ODs zwischen 0,05 und 0,5. DM: Dermatomyositis; SLE: Systemischer Lupus erythematodes; RA: Rheumatoide Arthritis; ANA positive Seren: Seren, die zur Analyse auf ANA eingesandt wurden und mit HEp-2-Zellen positiv reagierten (Titer 1 : ≥ 160). Kontrollen: Seren von gesunden Personen.
Die folgenden Beispiele erläutern die Erfindung.
Beispiel 1 :
Screening und Isolierung von rekombinanten lambda Phagen
Die IgG-Fraktion eines humanen anti-Mi-2-positiven Serums wurde durch DEAE- Sepharose Chromatographie isoliert und zum Screenen von ungefähr 400 000 PIaques einer oligo(dT)-geprimten HeLa cDNA Expressionsbibliothek (λ UNIZAPXR, Stratagene, Heidelberg) benutzt. Nach wiederholter Reinigung wurde ein positiver Klon erhalten und sequenziert. Zwei 40mβfβ Oligonukleotide, die zu den beiden Enden des Inerts dieses Klons (4.3 kb) komplementär waren, wurden nach radio¬ aktiver Markierung zum nochmaligen Screenen der gleichen Bibliothek benutzt, um weitere cDNAs in 5'- und 3'-Richtung zu gewinnen. Außerdem wurden zusätzlich noch kürzere 5'-Klone mit einem Amplifinder RACE Kit (Clontech, Palo Alto, CA, USA) und Klonierung in das Plasmid Bluescript KS (Stratagene) gewonnen. Ins¬ gesamt wurden 15 Klone isoliert.
Beispiel 2:
Sequenzierung der Klone und Aufbau der gesamten Mi-2 cDNA Bluescript KS Plasmide wurden aus den Λ-Klonen mit Helfer-Phagen nach Angaben des Herstellers (Stratagene) ausgeschnitten und die DNAs wurden nach Charak¬ terisierung durch Hybridisierung und Reinigung mit Quiagen-Säulen (Quiagen GmbH, Düsseldorf) mit Hilfe einer Sequenzierungsmaschine (ALF, Pharmacia, Freiburg) nach der Dideoxy-Methode mit Fluoreszenz-ATP (Boehringer Mannheim) sequenziert. Alle Sequenzen der Klone wurden nach einer walking primer Strategie erstellt, wobei die Klone in beiden Richtungen sequenziert wurden. Die Sequenz¬ daten wurden mit Hilfe der Assemgel Software von PC-GEne (IntelliGenetics Inc. Brüssel, Belgien) zusammengefügt.
Beispiel 3:
Nukleotid-Sequenz und abgeleitete Aminosäure-Sequenz der Mi-2 cDNA
Computer-unterstützte Sequenz-Analysen wurden mit Hilfe der GCG Software (Genetics Computer Group Madison, Wisconsin, USA) ausgeführt. Die EMBL Nukleinsaure und die SWISS-PROT Protein Sequenz Datenbanken wurden mit den BLASTN und BLASTP Algorithmen (vgl. Altschul, S.F. et al., J. Mol. Biol. 21 5 (1990), 403-410) auf Anwesenheit lokaler Ähnlichkeiten mit individuellen Sequen¬ zen in der Mi-2 Nukleinsäure/Aminosäure-Sequenz gescannt. Die Suche nach funktioneilen Motiven wurde mit dem PROSITE Algorithmus (vgl. Bairoch, A., Nucleic Acids Res. 19 (1991 ), 2241 -2245, Ergänzung) durchgeführt. Die Klonie- rungs- und Sequenzierungsstrategie ergab die in Fig. 2 aufgezeigte Nukleinsäurese- quenz und die daraus abgeleitete Aminosäuresequenz. Das erste ATG (nt 90) liegt in einer für Translokationsinitiation favorisierten Umgebung und startet ein offenes Leseraster von 5736 bp, welches für ein Protein mit 1912 Aminosäuren (217989 Dalton) kodiert (218 kD Mi-2 Protein).
In der 3' nicht-translatierten Region von nt 6234-6240 befindet sich ein dem Polyadenylierungs-Konsensus-Signal (AATAAA) sehr ähnliches Sequenz-Motiv (AAATAAA). Das 218 kD Mi-2-Antigen ist ein hydrophiles, saures Protein (pl = 5,48) mit einer fast gleichmäßigen Verteilung von geladenen oder polaren und hydrophoben Aminosäuren, die in N-Glycosylierungs- und N-Myrostoylierungs- Motive eingebettet sind. Außerdem gibt es viele potentielle Phosphorylierungs- stellen.
Die Suche nach Sequenz-Ähnlichkeiten zwischen dem 218 kD Mi-2-Antigen und anderen Proteinen ergab keine ausgeprägte Homologie zu den in den Datenbanken deponierten Sequenzen. Es konnten jedoch mehrere funktioneile Domänen im 21 8 kD Mi-2 Protein eindeutig identifiziert werden. Die herausragensten Regionen sind charakteristisch für Helicasen und liegen im zentralen Teil des Proteins. Die grö߬ ten Ähnlichkeiten zeigten 20 Proteine, die alle einer Superfamilie von Helicasen, definiert durch die SNF2 und RAD54 Hefehelicasen (vgl. Bairoch, A., vorstehend angegeben), angehören.
Beispiel 4:
Größe der Mi-2 mRNA
Es wurde Gesamt-RNA und poly(A)+ RNA aus einer humanen Zeil-Linie isoliert, elektrophoretisch in einem Formaldehyd-Agarose-Gel nach Größe aufgetrennt und nach Transfer auf eine Membran mit radioaktiv markierter Mi-2 cDNA hybridisiert. Das Autoradiogramm (Fig. 3) zeigt ein Signal bei etwa 6,8 kb. Dieses Experiment demonstriert, daß die Mi-2 mRNA groß genug ist, um die 5,7 kb große Mi-2 cDNA zu beinhalten. Beispiel 5:
Chromosomale Lokalisation des 218 kD Mi-2 Gens
Ein Fragment der Mi-2 cDNA (nt 242-4991 ) wurde mit Biotin-dUTP markiert und für in situ Hybridisierung an humanen Metaphase-Chromosomen verwendet. Hybridisierte DNA wurde mit Fluoresceinisothiocyanat markiertem Avidin (Jackson Immuno Research Laboratories, West Grove, PA USA) und einem Axiophot Photo¬ mikroskop (Zeiss, Oberkochen) nachgewiesen. Bilder wurden mit einer CCD- Kamera (Photometrics, Tuscon, AZ, USA) digitalisiert und mit einem Apple-Compu¬ ter-System prozessiert. Spezifische Fluoreszenz-Signale wurden an der distalen Seite des kurzen Arms von Chromosom 12 (12p13) beobachtet. Zwölf von acht¬ zehn überprüften Metaphasen Chromosomen zeigten spezifische Signale bei beiden Homologen).
Beispiel 6:
Synthese eines Teils der kodierenden Region der Mi-2 cDNA in einem bakteriellen
Expressionssystem
Ein Segment im zentralen Teil der Mi-2 cDNA (nt 151 1 -2998) (Fig. 1 und 2) wurde am 5'-Ende mit einer Ndel-Schnittstelle und am 3'-Ende mit sechs Histidin-Codons sowie einer BamHI-Schnittstelle versehen und nach Ligation in den bakteriellen Expressionsvektor pET3b in E.coli BL21 (DE3) pLysS (vgl. Studier, F.W. et al., Methods Enzymol. 185 (1990), 60-89) transformiert. Nach Anzucht der Kultur bis zu einer ODβoo von 0,5 wurde sie mit I mM Isopropyl-yff-D-thiogalactopyranosid induziert, 8 Std. lang weitergezüchtet und geerntet. Das Zellpellet wurde in 10 mM Tris-HCI (pH 8,0), 0,1 M Natriumphosphat und 8 M Harnstoff suspendiert und das unlösliche Material, welches das rekombinante Protein enthielt, durch Zentrifuga- tion gewonnen, und in 8 M Harnstoff, 6 M Guanidinium-HCI aufgelöst und mit Hilfe der Ni +-Chelat-Affinitätschromatographie (Quiagen) gewonnen. Die Ausbeute betrug etwa 200 mg rekombinantes Protein (rMi-2) pro ein Liter Kultur. Die Größe des Mi-2-Antigens nach Abschätzung in der SDS-PAGE entsprach dem abgeleite¬ ten Molekulargewicht von 55 kD. Alle zwölf anti-Mi-2-positiven Seren von Derma- tomyositis-Patienten reagierten in Immunoblots mit dem rMi-2-Antigen (Fig. 6, Spur A2, Tabelle 1 ). Beispiel 7: rMi-2-spezifische humane und Kaninchen-Seren und anti-Mi-2 Seren reagieren mit dem gleichen natürlichen Kernprotein
Humane anti-Mi-2-positive Seren (Nr. 1 , 2, 9 in Tabelle 1 ) und Kaninchen anti-rMi- 2 Seren wurden mit an Nitrozellulose-Membranen immobilisierten rMi-2- Antigen Affinitäts-gereinigt. Beide Antikörper reagierten nicht nur mit dem rMi-2- Antigen sondern auch mit Epitopen eines natürlichen HEp-2 Zellkernproteins mit einem M, - 235 kD (Fig. 6). Das 235 kD HEp-2 Zellkernprotein reagierte im Immunoblot auch mit den allermeisten anti-Mi-2-positiven Patientenseren. Da sowohl die humanen als auch die Kaninchen anti-rMi-2-lmmunoglobuline das gleiche Kern¬ protein wie die Patientenseren erkannten, stellt das 218 kD Mi-2 Protein das Hauptantigen von Mi-2 dar. Unterschiede zwischen dem von der DNA-Sequenz berechneten Molekulargewicht (M) und dem mit Hilfe der SDS-PAGE gemessenen Molekulargewicht (Mr), wie beim Mi-2-Antigen, werden häufig beobachtet.
Beispiel 8:
Indirekte Immunfluoreszenz-Mikroskopie
Alle humanen anti-Mi-2 Seren erzeugten mit HEp-2-Zellen eine charakteristische, feingranuläre Kernfluoreszenz, in manchen Fällen ohne den Nucleoli zu färben. Die Antikörpertiter bewegten sich zwischen 1 : 160 und 1 :5120 (Fig. 9, A1 , Tabelle 1 ). Ein identisches nukleuläres Immunfluoreszenzmuster wurde mit einem humanen anti-Mi-2-positiven Serum nach Affinitätsreinigung mit rMi-2 Protein und mit dem Kaninchen anti-rMi-2-lmmunglobulin beobachtet.
Beispiel 9:
ELISA für die Bestimmung von anti-218 kD Mi-2 Antikörpern in Patientenseren
Mikrotiterplatten (Immunolon, Dynatech, Denkendorf) wurden mit je 100μl pro Vertiefung mit einer Lösung bestehend aus 8μg/ml rMi-2-Antigen und 0.1 M Natriumcarbonat (pH 9.6) 16 Std. lang bei 4°C inkubiert und anschließend mit 300 /I pro Vertiefung mit einer Lösung bestehend aus PBS und 0, 1 % BSA, 16 Std. bei 4°C abgeblockt. Antikörper-Screening wurde mit 200 /I Serum pro Ver¬ tiefung (Serum-Verdünnungen: 1 :300 in PBS, 0,01 % Tween und 0.1 % BSA) während einer 30-minütigen Inkubation bei 37°C durchgeführt. Nach einem Waschschritt (5 x PBS, 0,01 % Tween, 30 Min. bei 37°C wurden die Vertiefun¬ gen mit je 20O ;l eines 1 :20000 verdünnten Peroxidase-markierten Kaninchen anti- human-IgG F(ab')2 in PBS, 0,01 % Tween und 0,5 % BSA 30 Min. bei 37°C inkubiert und wieder gewaschen. Gebundene Antikörper wurden mit OPD visuali- siert, und die Enzym-Reaktion wurde mit 50 /I 4 M H2SO4 je Vertiefung gestoppt. Die Absorption wurde bichromatisch bei 492/620 nm gemessen. Mit diesem Assay wurden 1368 humane Seren getestet (Fig. 10). Der mittlere OD-Wert einer Kon¬ troll-Gruppe von 189 gesunden Personen betrug 0,25 ±_ 0,08: ODs zwischen 0,5 und 0,6 wurden als grenzwertig bewertet, ODs > 0,6 als positiv. Die Antikörper¬ konzentrationen (ODs) der zwölf anti-Mi-2 positiven Dermatomyositis-Patienten sind in Fig. 1 1 aufgelistet. Mit Ausnahme eines Serums, was im ELISA negativ aber im Immunblot-Assay positiv war, zeigten alle Patienten-Seren OD-Werte, die deutlich über dem Grenzwert lagen.

Claims

Patentansprüche
1. Dermatomyositis-spezifisches Autoantigen, umfassend die Aminosäurese¬ quenz von Fig. 2 oder ein funktionelles Derivat oder Fragment davon.
2. DNA, kodierend für das Autoantigen nach Anspruch 1.
3. DNA nach Anspruch 2, wobei die DNA umfaßt:
(a) die DNA von Fig. 2 oder einen Teil davon,
(b) eine mit der DNA von (a) hybridisierende DNA oder
(c) eine mit der DNA von (a) oder (b) über den degenerierten genetischen Code verwandte DNA.
4. Expressionsplasmid, umfassend die DNA nach Anspruch 2 oder 3.
5. Transformante, enthaltend das Expressionsplasmid nach Anspruch 4.
6. Verfahren zur Herstellung des Autoantigens nach Anspruch 1 , umfassend die Kultivierung der Transformante nach Anspruch 5 unter geeigneten Bedingungen.
7. Verwendung des Autoantigens nach Anspruch 1 als Reagens zur Diagnose und/oder Therapie.
8. Kit, umfassend das Autoantigen nach Anspruch 1 und übliche Zusatzstoffe.
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Families Citing this family (2)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
JP5191544B2 (ja) * 2008-09-01 2013-05-08 学校法人慶應義塾 皮膚筋炎の検出方法および診断キット
CN111849930B (zh) * 2020-08-18 2022-01-25 珠海丽珠试剂股份有限公司 Mi-2重组抗原及其制备方法和应用

Citations (1)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
WO1992004472A1 (en) * 1990-09-07 1992-03-19 Oklahoma Medical Research Foundation Antigens associated with polymyositis and with dermatomyositis

Patent Citations (1)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
WO1992004472A1 (en) * 1990-09-07 1992-03-19 Oklahoma Medical Research Foundation Antigens associated with polymyositis and with dermatomyositis

Non-Patent Citations (5)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Title
EMBL Datenbank Zugang HSMI2218 Zugriffsnummer X86691; 6 Dezember 1995 SEELIG H.P. ET AL.: 'The major *
GE Q ET AL: "The major antigenic component of the Mi - 2 autoantigen of dermatomyositis.", 58TH NATIONAL SCIENTIFIC MEETING OF THE AMERICAN COLLEGE OF RHEUMATOLOGY AND THE 29TH NATIONAL SCIENTIFIC MEETING OF THE ASSOCIATION OF RHEUMATOLOGY HEALTH PROFESSIONALS, MINNEAPOLIS, MINNESOTA, USA, OCTOBER 23-27, 1994. ARTHRITIS & RHEUMATISM 37 (9, XP000574651 *
GE, QUN ET AL: "Molecular analysis of a major antigenic region of the 240-kD protein of Mi-2 autoantigen", J. CLIN. INVEST. (1995), 96(4), 1730-7 CODEN: JCINAO;ISSN: 0021-9738, 1995, XP000574380 *
NILASENA D S ET AL: "Analysis of the Mi - 2 autoantigen of dermatomyositis.", ARTHRITIS & RHEUMATISM 38 (1). 1995. 123-128. ISSN: 0004-3591, XP000574650 *
NILASENA D S ET AL: "MOLECULAR CLONING OF THE DERMATOMYOSITIS DM-ASSOCIATED MI - 2 ANTIGEN.", 54TH ANNUAL MEETING OF THE AMERICAN COLLEGE OF RHEUMATOLOGY, SEATTLE, WASHINGTON, USA, OCTOBER 27-NOVEMBER 1, 1990. ARTHRITIS RHEUM 33 (9 SUPPL.). 1990. S22. CODEN: ARHEAW ISSN: 0004-3591, XP000574649 *

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