WO1995032219A1

WO1995032219A1 - Proteine ou polypeptide, procede et intermediaires permettant leur preparation

Info

Publication number: WO1995032219A1
Application number: PCT/JP1995/000968
Authority: WO
Inventors: Yosuke Suzuki; Syuji Sato
Original assignee: Hisamitsu Pharmaceutical Co., Inc.
Priority date: 1994-05-20
Filing date: 1995-05-19
Publication date: 1995-11-30
Also published as: DE69533987T2; AU2455295A; EP0761683B1; US5889153A; EP0761683A4; EP0761683A1; DE69533987D1; JP3173794B2

Description

明細書

タンパク質またはポリベプチド類とその製造法および中間化合物技術分野

この発明は、生理活性物質として、またはその中間体化合物として有用な新規なポリエチレングリコール誘導体との結合において修飾されたタンパク質またはボリべプチド類、並びにその製造法と、中間化合物である反応性ポリエチレングリコール誘導体に関するものである。背景技術

近年生理活性を持つタンパク質、ポリアミノ酸、ペプチド類が数多く見出され、それらの医薬品への応用が期待されている。しかしながら、これらのタンパク質またはペプチド類物質は、生体内に投与された際の血中半減期が短く、十分な薬理効果が得られる例は極めて少ない。そのため、これらの物質を医薬品として利用するためには、何らかの方法により生体内挙動を改善することが必要不可欠であると考えられている。

生体内、特に血流中に投与された生理活性物質の多くは、腎臓における糸球体濾過により体内から消失することが知られている。この糸球体濾過過程は、原理的に分子篩の一種であると考えることができ、生体内に不可欠な血漿夕ンパク質であるアルブミンの分子量

(約 6万）よりも小さな分子量の物質は原則として排泄されることになる。このため、本来糸球体濾過により生体内より消失するタンパク質またはべプチド性薬物の生体内挙動を改善するためには、各種化学修飾により薬物そのものの分子量を増大させることが必要であると考えられてきた。

このような夕ンパク質またはべプチド性薬物の生体内举動を改善する方法としては、従来、ポリエチレングリコール（以下 P E Gと記載することがある）に代表される水溶性高分子による化学修飾が多く試みられてきた。この P E Gの歴史は古く、 1 8 5 9年に合成されて以来、各分野において幅広く利用、研究されてきた物質であつて、生化学および医薬品の分野においても、この P E Gはタンパク質に対して物理的な立体障害以外の相互作用を与えず、高濃度 P E G水溶液中でも夕ンパク質の C Dスぺクトルに変化は認められないことが確認されている。このことは、 P E Gで修飾することにより夕ンパク質の高次構造は破壊されないことを示している。また、たとえばィヌの静脈に分子量 4 0 0 0の P E Gを 9 0 m g/k g/ d a yで 1年間投与しても、体重、病理学的あるいは血液学的検査で異常は認められていない。さらにモルモッ卜に P E Gを投与してもアレルギー症状を起こさないことから、その安全性が確認されている。このため、以上の通りの特徴のある性質を有する P E Gで夕ンパク質を修飾することにより、免疫系の認識はもちろんのこと、細網内皮系にも認識されにくく、生体内寿命の長いタンパク質またはべプチド性薬物の開発が可能になるものと期待されている。

また、夕ンパク質またはべプチド性薬物を P E Gで修飾する利点としては、次のことを挙げることができる。すなわち、未変性の夕ンパク質が生理学的 P H条件で不溶であるか、あるいは部分的にのみ可溶な場合、タンパク質を P E Gで修飾することにより生理学的 P H条件での溶解性を大きく改善することが可能となる。そして、未変性夕ンパク質が示す免疫応答を低下させることも可能である。このため、これまでにも、医薬品等への利用のために数多くの種類の夕ンパク質またはべプチド性薬物が P E Gで修飾されてきた〔総論に閣しては、 Inada.Y, Yoshimoto, T. Matsushima, A and Sai to. Y. (1986) Trends Biotec no. 1 , 4 : 6 8 - 7 3参照〕。

たとえば、従来、タンパク質またはペプチド性薬物を修飾するために利用されてきた P E G誘導体としては、 2— （アルコキシポリエチレングリコキン）一 4， 6—ジクロロトリアジン〔Abuchowski. に , Van Es. T. , Ρ alczuk. Ν. C and Davis, F. F. (1977) J. Biol. Chem. 2 5 2、 3 5 7 8 - 3 5 8 1 ) ; 6— (アルコキシボリエチレングリコキン）一 S—カルボキサミドメチルジチォカーボネート〔King, T. P. and Weiner. C. (1980) Int. J. Peptide Protein Res. 1 6. 1 4 7 - 1 5 5〕； 2 - (アルコキシポリエチレングリコキシ）一 N ースクシ二ミジルスクシネート CAbuchowski, A. , Kazo. G. M.. Verh oest, C. , Van Es.T., Kafkewitz. D. , Viau. A. and Davis, F. (1984) Cancer Biochem. Biophys. 7 , 1 7 5— 1 8 6〕； 2 - （アルコキシポリエチレングリコキシ）カルボキシィミダゾ一ル〔Beauchamp, CO., Gonias.S.し， Menapace. D. P. and Pizzo, S. V. (1983) Anal. Biochem. 1 3 1 , 2 5— 3 3〕； 2—アルコキシポリエチレングリコキシ）ー 2, 4, 5— トリクロ口ベンゼン〔Versonese, F. M. , La rgajol I i. R.. Boccu. E.. Benassi, C. A. and Schiavon.0. (1985) Applied Biochem. Biotech. 1 1 , 1 4 1 — 1 5 2〕； 2 - (アルコキシポリエチレングリコキシ）一 4—ニトロベンゼン CVersonese, F. M.. し argajoll i, R. , Boccu. E. , Benassi, C. A, and Schiavon.0. ( 1985) Applied Biochem. Biotech. 1 1 , 1 4 1 - 1 5 2) ； 2 - ( アルコキシボリエチレングリコキシ）一 2 , 2 , 2— トリフルォロェタン〔Delgado, ， Patel, J.N. , Francis, G. B. and Fisher. D. (1 990) Biotech. Applied Biochem. 1 2, 1 1 9— 1 2 8〕 ; 2 - ( アルコキシポリエチレンアルデヒド（Andrews, Β· A.. Head. D. M.. Dunt rone. P. and Asen jo, J. A. (1990) Biotech. Tech.4. 4 9 - 5 4〕； 2—アルコキシポリエチレングリコキシメチルエポキシド〔 Andrews. B. A. , Head, D. M. , Dunthrone, P. and Asenjo, J. A. (1990) Biotech. Tech. 4. 4 9一 5 4〕などがある。

さらにこの P E G誘導体による修飾に閧しては、これまでにも数多くの特許出願がなされている。その例としては、たとえば特開昭 6 1 — 1 7 8 9 2 6号；特開昭 6 1 - 2 4 9 3 8 8号：特開平 1 一 3 1 6 4 0 0号；特開平 2 - 1 1 7 9 2 0号；特開平 3 — 8 8 8 2 2号；特開平 5 - 1 1 7 3 0 0号；特開平 5 — 1 3 2 4 3 1号；特開平 5 - 2 1 4 0 9 2号；特開平 5 - 5 0 3 0 9 2号などがあり、これらはいずれも P E Gの高い水溶性に着目したものであって、そのために、末端の構造は短鎖脂肪族であることを特徴としている。

レかしながら、一方で、 P E G修飾によりタンパク質またはぺプチド性薬物の分子量を増大させて生体内挙動を改善する方法は、利用できる薬物に制限があるものと考えられる。例を挙げると、従来の P E G修飾により生体内挙動の改善および薬理効果の増大が確認されているタンパク質またはべプチド性薬物のほとんどが酵素に限られている点である。そして、この原因としては酵素独特の薬理効果発現機序のためと考えられる。

生理活性を有する酵素は、生体に有害な物質もしくは腫瘍等の疾病部位において特異的に必要とされる物質を代謝等の化学反応により特異的に消失させることにより効果を発現する。このため酵素の P E G修飾の場合は、血中に酵素分子を長時間存在させるだけで薬理効果の増大が可能となる。しかし、このような P E G修飾により薬物の分子量を増大させる方法は、酵素以外の全てのタンパク質またはべプチド性薬物に対して普遍的に適用できる方法論ではないことも明らかである。

すなわち、生体内挙動の改善を必要とする夕ンパク質またはぺプチド性薬物が、薬理効果を発揮するためにレセプ夕一等との結合を必要とする場合には、 P E G修飾による薬理効果の増大は期待できず、むしろ修飾に用いた高分子 P E Gの立体的障害でレセプター結合が阻害されることにより、薬理効果が低下する場合が多い。たとえば Ehra t . M. and Lu i s i . P . L. ( 1 9 8 3 ) B i opo l ymer 2 2 . 5 6 9 — 5 7 3においては、薬理効果を発揮するためにレセプター等と結合するインスリンを P E G修飾した場合、 i n v i vo における薬理効果は未修飾ィンスリンの 5 0 %まで低下することが報告されている。

このため、近年医薬品への応用が期待されているタンパク質、ポリァミノ酸およびべプチド類の多くは、薬理効果発現においてレセプ夕一等との結合を必要条件としていることから、今後は、レセブター等の薬理効果発現部位との結合を阻害しない新規な薬物の生体内挙動改善の方法、つまり新規な化学修飾のための手段と、この手段により修飾された薬理活性物質からなる薬剤を実現することが望まれていた。発明の開示

この発明は、レセプ夕一等との結合を阻害することのない、新しく化学修飾された生理活性物質とその薬剤、並びにそのための新しい修飾手段を提供することを目的としている。

この発明は、以下を提供する：

( a ) 分子中の少なくとも 1個のァミノ基に、次式

R , 一（O C H , C H , ) n - 0 -

〔式中、 R , は置換基を有してもよいコレステリル基、 nは任意に変'わりうる正の整数をそれぞれ示す）で表されるポリエチレングリコールォキシ基を結合してなるタンパク質またはボリペプチド類

(b) タンパク質またはポリペプチド類と次式

R , - （O C H , C H : ) n - 0— R ,

〔式中、 R , は置換基を有してもよいコレステリル基、 R₂ は次式（ a ) 、（ b ) および（ c )

〇

(式中、 R₃ は 0H、アルコキシ基、ァシルォキシ基、ハロゲン原子または R , - （〇 C H₂ C H₂ ) n— 0—を示す）のいずれかを示し、 nは任意に変わりうる正の整数を示す）〕で表される反応性ボリエチレングリコールとを反応させることからなる分子中の少なくとも 1 個のァミノ基に、次式

R，一（O C H, C H , ) π - 0 - で表されるボリェチレングリコールォキシ基を結合してなるタンパク質またはボリべプチド類の製造法；

並びに

( c ) 次式

R . 一（O C H : C H t ) π - 0 - R ,

(a) 一 co

CI

(式中、 R₃ は〇H、アルコキシ基、ァシルォキシ基、ハロゲン原子または R , — (0 C H₂ C H₂ ) n— 0 - nは任意に変わりうる正の整数を示す）〕のいずれかで表されるポリエチレングリコ一ル誘導体。すなわち、この発明は、生理活性を持つタンパク質、ポリアミノ酸およびポリベプチド類の生体内挙動を改善するための新規 P E G 誘導体についての検討から導かれたものであって、末端にコレステロール構造を有する新規 P E G誘導体を用いる場合には、血中の高分子成分との相互作用が実現されて薬物の生体内挙動が改善されるとの知見に基づいて完成されたものであり、従来用いられてきた夕ンパク質またはべプチド性薬物の P E G修飾における問題点である薬物とレセプター等との結合阻害を解消し、高い薬理活性を示す製剤の開発を可能としている。図面の簡単な説明

図 1 は、 P E G誘導体修飾ィンスリンの血中成分と相互作用ィンビトロ試験結果を示す。

図 2は、 P E G誘導体修飾の S 0 Dの血中成分と相互作用ィンビトロ試験結果を示す。

図 3は、 P E G誘導体修飾ィンスリンの生体内挙動ィンビボ試験結果を示す。

図 4は、 P E G誘導体修飾 S O Dの生体内挙動インビボ試験結果を示す。

図 5は、 P E G誘導体修飾 S 0 Dの薬理作用ィンビボ試験結果を示す。発明を実施するための最良の形態

この発明の夕ンパク質またはポリベプチド類は、末端に前記の通りのコレステロール構造を有する反応性 P E G誘導体およびその生理活性物質修飾体を結合したものである。

ポリエチレングリコールォキシ基における R , は、化学修飾作用を阻害しない限り任意の置換基を有していてもよいコレステリル基を示しており、たとえば、その置換基としては、アルキル基、アルケニル基、ヒドロキシル基、アルコキシル基等の適宜なものとしてもよい。

このボリェチレングリコ一ルォキシ基に結合する R 2 については、前記の通りの R ₃ のいずれかの部分構造とすることができ、この R 3 におけるハロゲン原子とは、塩素、臭素、沃素等を意味してもいる。また、 R ₃ は、 O H、アルコキシ基、ァシルォキシ基等であつてもよい。そして、 nは、任意に変わりうる正の整数として、約 5 0 0以下とすること、好ましくは 2 0 0以下、さらには 1 0〜 1 0 0程度とするのが好ましい。

この発明における前記の P E G誘導体より修飾されたタンパク質またはボリべプチド類の製造法について説明すると、タンパク質またはポリぺプチド類の使用割合 1 m 0 1 に対して次式の反応性 P E G誘導体を 1 m 0 1 もしくはそれ以上の使用割合において反応させればよい。

R , - （O C H , C H : ) n - 0 - R ,

反応溶媒としては、反応に関与しない溶媒であれば特に制限されないが、たとえばリン酸緩衝液、ホウ酸緩衝液、トリス酸緩衝液、酢酸緩衝液などの緩衝液が好ましい溶媒として挙げられる。また夕ンパク質またはボリぺプチド類を失活させることなく、反応に関与しないァセトニトリル、ジメチルスルホキシド、ジメチルホル厶ァミド等の有機溶媒を添加してもよい。また、前記の反応性 P E G誘導体と夕ンパク質またはポリベプチド類を反応溶媒に加える順序はどちらが先になつてもよく、また同時であってもよい。

もちろん、反応溶媒は使用しなくてもよい。

反応温度は夕ンパク質またはポリぺプチド類が変性しない温度であれば、いずれでもよいが、約 0 ° 〜4 0 °Cの範囲が好ましい。反応時間は約 0 . 5〜7 2時間で充分であり、通常は約 1〜2 4 時間程度で反応は充分に進行する。

反応後は、透析、塩析、限外ろ過、イオン交換クロマトグラフィ ―、電気泳動などの通常のタンパク質またはポリべプチド類の精製法で精製し、目的とする化学修飾された夕ンパク質またはボリぺプチド類を得ることができる。また、ァミノ基の修飾の程度は、たとえば酸分解のあと、ァミノ酸分析によって確認することができる。前記の反応性 P E G誘導体については、コレステリン（別名コレステロール）に存在する 3位の水酸基に対し、ポリエチレンォキシドを反応させて得られたポリェチレングリコールモノコレステロ一ルエーテル（以下、 C― P E G誘導体と略記する）を出発原料として製造することができる。

この、 C一 P E Gについては市販品（たとえば日本ェマルジヨン株式会社製）、もしくはこれを合成して使用することができる。すなわち、まず最初に、 C一 P E G誘導体を、反応に関与しない溶媒であれば特に制限されないが、たとえばァセトニトリル、トルェン、キシレン、ベンゼン、テトラヒドロフラン、ジォキサン、ジメチルスルホキシド、ジメチルホルムアミドなどの有機溶媒中に溶解もしくは懸濁させたのち、下記一般式（ a ) 、（b ) および（ c ) で表される化合物のいずれかを、 C一 P E G誘導体の使用割合 1 m 0 1 に対し、 1 m 0 1 もしくはそれ以上の割合で使用して反応させることができる。

( _χ N

^A ~^ N ³

CI

[ Xは塩素、臭素、沃素等のハロゲン原子を示す。 ]

トリメチルァミン、卜リェチルアミン等の有機塩基触媒を C P E G誘導体の使用割合 1 モルに対し、 1 モルもしくはそれ以上の割合で使用することができる。

水素化ナトリウム、水酸化ナトリゥ厶、水酸化力リゥム、無水炭酸ナトリウム等の無機塩基を使用してもよく、この場合には、先に C一 P E G誘導体とともに前記の溶媒中において、 C一 P E G誘導体の水酸基の水素をナトリゥムにより置換させたのち、前記般式 ( a ) 、 ( b ) および（ c ) の化合物を添加して反応させるのが好ましい。

反応温度としては、約 0 ° 〜 3 0 0ての範囲が望ましく、特に約 1 0 ° 〜 1 5 0 °Cの範囲が好ましい。

また、反応時間は数分〜 2 4時間程度でよい。

生成した化合物は、抽出、濃縮、再結晶、再沈殿、カラムクロマトグラフィー、蒸留などの通常の化学的処理によって精製され、前記の反応性 P E G誘導体を得ることができる。

また、この発明に使用する水溶性の P E G誘導体はその構造上水酸基を有しているポリェチレングリコール、ボリェチレングリコールのホモポリマー類、さらに好ましくは、水溶性高分子である、ポリエチレングリコールおよびそれらの誘導体から選択されることが好ましい。

この発明に使用する水溶性の P E G誘導体の分子量は特に限定されないが、 1 0 0〜 1 0 0 , 0 0 0であることが好ましい。さらには、 5 0 0〜 1 0， 0 0 0であることが好ましい。

そして、この発明で、末端にコレステロール構造を有する P E G 誘導体により修飾されるタンパク質またはべプチド類の修飾部位は, アミノ基、特に 1級ァミノ基であることが好ましい。

末端にコレステロール構造を有する P E G誘導体により修飾される生理活性物質は、この発明において特にその種類に限定はないが- 特に夕ンパク質またはべプチド性薬物である場合は、サブス夕ンス P (視床下部ホルモン）；コルチコト o ピン、リポトロピン、メラノトロピン、くソプレツシン（神経下垂体ホルモン）；パラチロイドホルモン（甲状腺ホルモン）；サイモポェチン（胸腺ホルモン）；インスリン、グルカゴン（脾臓ホルモン）；神経成長因子、上皮成長因子、インスリン様成長因子、ヒト形質転換発育因子、成長ホルモン放出因子すなわち C R F、織維芽細胞増殖因子（成長因子）；セクレチン、コレシストキニン、バソアクティブインスチナルぺプチド、モチリン（胃腸管ホルモン）；ゴナトロピン（絨毛腺ホルモン）；性腺刺激ホルモン放出ホルモン（性腺刺激ホルモン）；レラキシン（卵巣ホルモン）；血液凝固因子ィ因子およびゥ因子（血友病因子）；ストレブトキナーゼ、フエブリノリシン、デォキシリボヌクレア一ゼ、スーパ一ォキシドジスムタ一ゼ（以下、 S 0 Dと略記）、ピリルビンォキシダ一ゼ、エラスターゼ、ァスパラギナ一ゼ（酵素）；組織プラスミノ一ゲン活性化因子即ち t - P A、ゥロキナーゼ（線溶因子）；リンホカイン（たとえばインターロイキン ) 、インターフェロン、顆粒球 · コロニー刺激因子即ち G— C S F、マクロファージ ' コロニー刺激因子即ち M— C S F、顆粒球マク口ファージ · コロニー刺激因子即ち G M— C S F (刺激因子）；エリスロポェチン（増血因子）、カルシトニン、カルシトニン遺伝子関連ペプチド（ C a調節ホルモン）；心房性ナトリウム利尿ペプチド (利尿ホルモン）；モノクロ一ナルおよびポリクロ一ナル抗体；免疫原；酵素阻害因子；ボリ — L - リジン、ポリ一 D—リジンを含む各種ポリアミノ酸類；ウイルス由来の細胞膜融合性べプチド類；スヒストン、プロ夕ミン（遺伝子結合性夕ンパク質）および上記夕ンパク質またはべプチド性薬物と同様の生理活性を有する類似構造物質が好ましい。これらのタンパク質またはペプチド性薬物は、それらの天然源または遺伝子工学的処理を受けた細胞から単離されるか、あるいは種々の i n v i t ro合成方法を経て作り出されてもよい。なお, 上記例示における（）内はタンパク質またはペプチド性薬物の主たる用途を示すものである。また、この発明のタンパク質またはべプチド類にはポリァミノ酸と総称される各種のァミノ酸が包含されることは言うまでもない。

そして、この発明で、末端にコレステロール構造を有する P E G 誘導体により修飾される生理活性物質中の修飾箇所の数は特に限定されないが、 1〜 1 0 0箇所であることが好ましい。さらに望ましくは 1〜 1 0箇所であることが好ましい。

この発明においては、上記の通りの特有の化学構造を有する反応性 P E G誘導体により夕ンパク質またはべプチド類を修飾するため、高い生理活性を有する薬剤物質を、レセプ夕一等との結合阻害を生じさせることなく、これら物質の生体内挙動を効果的に改善する。実施例

以下、実施例を示し、さらに詳しくこの発明の構成および効果について説明する。

実施例 1

〔末端にコレステロール構造を有する新規 P E G誘導体（活性化ポリェチレングリコールモノコレステロ一ルエーテル）の合成〕

( 1 )

ボリエチレングリコールモノコレステロールエーテル（ n = l 0、平均分子量 8 0 0、 9 . 5 g ) とクロロギ酸 p—二トロフヱニル（ 0 . 6 g ) をトルエン（ 5 0 m 1 ) に溶解させた後、トリェチルァミン（ 0 . 3 g ) を加え室温で 1 8時間攪拌し、析出した不純物を濾別して濾液を減圧濃縮した。得られた残渣をシリカゲルカラムで精製し、ギ酸 p—二トロフヱニル活性化ポリエチレングリコールモノコレステロールエーテル（化合物： A ) 7 . 1 gを得た（収率 7 5 % ) 。

融点 2 3 °C

元素分析： C H in N Q 表 1

(.2)

ポリエチレングリコールモノコレステロールエーテル（ n = 2 0、平均分子量 1 2 0 0、 6. 0 g) と無水コハク酸（ 0. 6 g) 、ピリジン（ 0. 5m l ) をジクロロメタン（ 3 0m l ) に溶解させ 3 日間還流した。その後析出した不純物を濾別して濾液をエバボレートした。得られた残澄.を蒸留水（ 5 0 m l ) に溶解した後、クロ口ホルム（ 5 0 m l ) で抽出を行ない、得られた有機層をエバボレー卜することによりポリエチレングリコールモノコレステロールエーテルコハク酸エステルを得た。次に、得られたポリエチレングリコールモノコレステロールエーテルコハク酸エステルおよび N—コハク酸イミド（ 0. 6 g) をジメチルホルムアミド（ 1 0 0m l ) に溶解した。反応系を 0 °Cに冷却した後、ジメチルホルムアミド（ 5 m l ) に溶解したジクロロへキシルカルポジイミド（ 0. 7 g ) を滴下して室温で 2 4時間攪拌を続けた。析出した不純物を濾別して濾液を减圧濃縮した後、得られた残渣をシリカゲルカラムで精製し. N—コハク酸ィミド活性化ボリエチレングリコールモノコレステロ —ルエーテル（化合物： B) 4. 8 gを得た（収率 7 8 %) 。

融点 3 3 °C

元素分析： C₇₅H₁₃₅ N0₂₆

表 2

C H N 計測値 61.41 9.28 0.95 寒測値 61.29 9.69 0.88 ( 3 )

ポリエチレングリコールモノコレステロールエーテル（n = 3 0、平均分子量 1 7 0 0、 4. 5 g) とクロロギ酸 p—二トロフエニル

( 0. 6 g ) をトルエン（ 5 0 m 1 ) に溶解させた後、トリェチルァミン（ 0. 3 g) を加え室温で 1 8時間攪拌し、析出した不純物を濾別して濾液を減圧濃縮した。得られた残渣をシリカゲルカラムで精製し、ギ酸 p—二トロフヱニル活性化ポリエチレングリコールモノコレステロールエーテル（化合物： C) 3. 8 gを得た（収率

8 1 %) 。

融点 3 6 ^eC

元素分析： C ₉₄H,₇₁ N0₃₉

表 3

( 4 )

無水べンゼン（ 1 0 0 m 1 ) に無水炭酸ナトリウム（ 2. 5 g) とシァヌルク口ライド（ 1. 3 g) を溶解させた後、ポリエチレングリコールモノコレステロールエーテル（n = 3 0、平均分子量 1 7 0 0、 4. 5 g) を加えて室温で 2 4時間攪拌した。トリェチルァミン（ 0. 3 g) を加え室温で 1 8時間攪拌した。析出した不純物を濾別して濾液を減圧濃縮した。得られた残渣をシリカゲルカラ厶で精製し、シァヌルクロライド活性化ポリエチレングリコールモノコレステロールエーテル（化合物： D) 3. 4 gを得た（収率 7

6 %) 。

融点 3 8 °C

元素分折： C H 1 6 N ₃ 0₃₁ C 1 表 4

( 5 )

無水ベンゼン（ 1 0 0 m l ) に無水炭酸ナトリウム（ 2. 5 g) とシァヌルクロライド（ 1. 3 g) を溶解させた後、ポリエチレングリコールモノコレステロールエーテル（n = 3 0、平均分子量 1 7 0 0、 9. 0 g) を加えて室温で 2 4時間攪拌した。トリェチルァミン（ 0. 3 g) を加え室温で 1 8時間攪拌した。析出した不純物を濾別して濾液を減圧濃縮した。得られた残渣をシリ力ゲルカラ厶で精製し、 2本型シァヌルクロライド活性化ポリエチレングリコールモノコレステロールエーテル（化合物： E) 5. 8 gを得た（収率 6 3 %) 。

融点 3 7で

元素分析： C ₁₇₇ H₃₃₄ N₃ 〇 ₆₂C 1

表 5

( 6 )

ポリエチレングリコールモノコレステロールエーテル（n = l 0 0、平均分子量 4 7 0 0、 1 2. 5 g) とクロロギ酸 p—ニトロフェニル（ 0. 6 g) をトルエン（ 5 0 m 1 ) に溶解させた後、トリェチルァミン（ 0. 3 g) を加え室温で 1 8時間攪拌し、析出した不純物を濾別して濾液を減圧濃縮した。得られた残渣をシリ力ゲルカラムで精製し、ギ酸 p—二トロフニ二ル活性化ポリエチレングリコールモノコレステロールエーテル（化合物： F) 9. 8 gを得た (収率 7 8 %) 。

融点 4 5 °C

元素分析： C ₂₃₄ H₄₅， NO , 05

表 6

実施例 2

〔新規 P E G誘導体によるィンスリンの修飾〕

ゥシ由来インスリン（ 6. O mg) を 0. 0 2 5 mM N a ₂ B 4 θ ₇ · 1 0 Η₂ Ο (ρ Η 9. 2 ) 2 0 0 m l に溶解させた後、実施例 1で得たギ酸 p—二トロフヱニル活性化ポリエチレングリコ —ルモノコレステロールエーテル（化合物： A) 、 N—コハク酸ィミド活性化ボリェチレングリコールモノコレステロールエーテル（化合物： B ) 、ギ酸 p—二トロフヱニル活性化ポリエチレングリコ —ルモノコレステロールエーテル（化合物： C ) 、シァヌルクロラィド活性化ポリエチレングリコールモノコレステロールエーテル（化合物： D) 、 2本型シァヌルクロライド活性化ボリエチレングリコールモノコレステロールエーテル（化合物： E) 、ギ酸 p—二ト口フェニル活性化ボリエチレングリコールモノコレステロールエーテル（化合物： F) 2. 0 n m 0 1 をそれぞれ加えて室温で 5時間攪拌した。セフアデックス G— 7 5 (フアルマシア社製）を用いてゲル濾過精製した。目的とする分画を限外濾過（フアルマシア社製 ) により脱塩 · 濃縮して目的物の水溶液（ 1. 8 m g/m 1 ) を得た。ギ酸 p—二トロフエ二ル活性化ボリエチレングリコールモノコレステロールエーテル（化合物： A) の場合は目的とする修飾が充分でなかった。これは水溶性が低いためであると考えられる。またギ酸 p—二トロフヱニル活性化ポリェチレングリコールモノコレステロールエーテル（化合物： F) での化学修飾の場合も充分ではなかった。これは立体障害のためであると考えられる。その他の P E G誘導体修飾ィンスリンは、インスリン 1 分子あたり 1〜2箇所の修飾をうけた場合の分子量に相当する分画に溶出が観察された'。実施例 3

〔新規 P E G誘導体による S ODの修飾〕

ゥシ由来 C u, Z n— S 0 D ( 3 0 m g ) を 0. 0 2 5 mM N a ₂ B₄ 0₇ · 1 0 Η₂ Ο (ρ Η 9. 2 ) 3 0 m l に溶解させた後、実施例 1 ( 3 ) で得たギ酸 p—ニトロフヱニル活性化ポリェチレングリコールモノコレステロールエーテル（化合物： C) 3. 9 m gを加え室温で 5時間攪拌した。セフアデックス G— 7 5 (ファルマシア社製）を用いてゲル濾過精製した。目的とする分画を限外濾過（ファルマシア社製）により脱塩 · 濃縮して目的物の水溶液（

2 0. 2 m g/m 1 ) を得た。実施例 4

〔新規 P E G誘導体修飾ィンスリンの血中成分と相互作用 in vitro 実験〕

ウィスター系雄性ラットょり採取した血清あるいは 4 %ラットァルブミン水溶液 4 5 0 1 に、実施例 2で得られたギ酸 p—二トロフェニル活性化ボリエチレングリコールモノコレステロールエーテル（化合物： C) 修飾ィンスリン水溶液 5 0 1 を加えて 3 7。Cで

3 0分間攪拌後、セファロース 4 B (フアルマシア社製）を用いてゲル濾過分離を行なった。その結果を図 1 に示す。新規 P E G誘導体修飾ィンスリンの分子量は、ラット血清と混合した場合にのみその増加が確認され、アルブミン以外の血清中成分との間に相互作用が存在することが確認された。実施例 5

〔新規 P E G誘導体修飾 S O Dの血中成分と相互作用 in v i tro実験〕ラットより採取した血清あるいは 4 %ラットアルブミン水溶液 4 5 0 1 に、実施例 3で得られたギ酸 p—ニトロフヱニル活性化ポリエチレングリコールモノコレステロールエーテル（化合物： C ) 修飾 S O D水溶液 5 0 1 を加えて 3 7 °C 3 0分間攪拌後、セファロース 4 B (フアルマシア社製）を用いてゲル濾過分離を行なった。その結果を図 2に示す。新規 P E G誘導体修飾 S 0 Dの分子量は、ラット血清と混合した場合にのみその増加が確認され、アルブミン以外の血清中成分との間に相互作用が存在することが確認された。実施例 6

〔新規 P E G誘導体修飾ィンスリンの生体内挙動 in v i vo 実験〕ウレタン麻酔したラットもしくはウレタン麻酔後に腎動脈のみを結紮したラットに、約 0 . 5 Uのギ酸 p —ニトロフヱニル活性化ポリエチレングリコールモノコレステロールエーテル（化合物： C ) 修飾ィンスリンまたは未修飾ィンスリンを静脈投与後、所定時間に静脈血を採取し、各時間における血中ィンスリン濃度および血糖値を測定した。その結果を図 3に示す。正常ラットにおける修飾ィンスリンおよび未修飾ィンスリンの生体内挙動は、腎動脈を結紮したラットにおける未修飾ィンスリンの生体内挙動と同様であつた。この結果から、修飾インスリンでは、生体内からの消失に関与するクリアランスレセプターとの間の相互作用は修飾により阻害されていないことが示された。また、正常ラットにおける修飾ィンスリンぉよび未修飾ィンスリンの薬理効果は同等であったことから、新規 P E G誘導体修飾ィンスリンでは、生体内からの消失に関与する薬理作用に関連するィンスリンレセプ夕ーとの間の相互作用も修飾によ一〖 8 一り阻害されていないことが確認された。実施例 Ί

〔新規 P E G誘導体修飾 S ODの生体内挙動 in vivo 実験〕

ウレタン麻酔したラットもしくはウレタン麻酔後に腎動脈のみを結紮したラットに、約 5 0 0 0 Uのギ酸 p—ニトロフエニル活性化ボリエチレングリコールモノコレステロールエーテル（化合物： C ) 修飾 S ODまたは未修飾 SODを静脈投与後、所定時間に静脈血を採取し、各時間における血中 S 0D濃度を測定した。その結果を図 4に示す。正常ラットにおける未修飾 S 0Dの生体內挙動は明らかに改善されており、未修飾 S 0Dの生体からの消失において糸球体濾過の関与が大きいことが示された。一方、修飾 SODの生体内挙動は大きく改善されて血中半減期が延長されており、修飾によつて生じる血中成分との相互作用により修飾 S 0Dは糸球体濾過を免れていることが確認された。実施例 8

〔新規 P E G誘導体修飾 S 0Dの薬理効果 in vivo 実験〕

ラッ卜に対して、 1 0 0 0 0 Uのギ酸 p—ニトロフヱニル活性化ボリエチレングリコールモノコレステロールエーテル（化合物： C ) 修飾 S 0 Dもしくは未修飾 S 0 Dを投与後、水浸ストレス潰瘍モデルの作製方法にしたがって急性胃潰瘍を発生させ、その際の潰瘍発生阻害効果について検討を行なった。その結果を図 5に示す。修飾 S 0 Dを投与した場合は、未修飾 S 0 Dを投与した場合に比較して潰瘍の発生が抑制されており、修飾による in vivo 薬理効果の増強が確認された。産業上の利用可能性

この発明による P E G誘導体を用いることにより、生理活性物質、特に夕ンパク質、ポリアミノ酸およびボリぺプチド類の生体内挙動が改善され、高い薬理効果を示す製剤の開発が可能となると同時に、上記薬物の水溶性の改善、貯蔵安定性の増大、免疫原性の減少、酵素分解耐性の向上が可能となる。

そして、この発明の P E G誘導体修飾タンパク質またはボリぺプチド類は、公知の担体、稀釈剤等を用いることにより、錠剤、' カブセル剤、注射剤等の医薬品組成物として経口または非経口による投与形態において哺乳動物（たとえば、ィヌ、ブ夕、ゥシ、ゥマ、ヒト）に投与することができる。

または、たとえば、この発明の P E G誘導体修飾インスリンは血糖降下作用を有し、糖尿病に対する治療薬または予防薬として、 1 日当たりの投与量 4〜 1 0 0単位を注射剤として投与することができる。

P E G誘導体修飾 S O Dは抗潰瘍作用を有するため胃または十二腸に対する抗潰瘍剤、あるいは抗炎症作用を有するため抗炎症剤としての適用ができ、 1 日当たりの投与量 1 〜 5 m g Z k gを錠剤、注射剤などの形態において投与することができる。

Claims

請求の範囲

1 . 分子中の少なくとも 1個のァミノ基に次式

R , - （OCH, CH, ) n - 0 - 〔式中、 R, は置換基を有してもよいコレステリル基、 nは任意に変わりうる正の整数をそれぞれ示す〕で表されるポリエチレングリコールォキシ基を結合してなる夕ンパク質またはボリべプチド類。

2. インスリンである請求項 1 の夕ンパク質またはポリべプチド類。

3. スーパーォキシドジスムターである請求項 1 のタンパク質またはボリべプチド類。

4. タンパク質またはボリペプチド類と次式

R , 一（OCH, CH, ) n - 0 - R,

〔式中、 R, は置換基を有してもよいコレステリル基、 R₂ は次式（ a ) 、（b) および（ c )

^(b) 一 COCH₂CH₂-COO—N、

R₃

(c) N=r<

— N

A CI

(式中、 R₃ は OH、アルコキシ基、ァシルォキシ基、ハロゲン原子または R, - (0 C H₂ CH₂ ) n— 0—を示す）のいずれかを示し、 nは任意に変わりうる正の整数を示す）〕で表される反応性ボリェチレングリコ一ルとを反応させることからなる分子中の少なくとも 1個のァミノ基に、次式

R, - (OCH: CH_? ) n -0- 〔式中、 R , は置換基を有してもよいコレステリル基、 nは任意に変わりうる正の整数をそれぞれ示す〕で表されるポリエチレングリコールォキシ基を結合してなる夕ンパク質またはポリべプチド類の製造法。

5. タンパク質またはポリペプチド類が、インスリンまたはス —パーォキシドジスムターである請求項 3の製造法。

6. 次式

R , - （O C H : C H t ) n - 0 - R ,

〔式中、 R , は置換基を有してもよいコレステリル基、 R₂ は次式（ a ) 、（b) および（ c )

R₃

(C) N=<

~~ (、 N

CI

(式中、 R₃ は OH、アルコキシ基、ァシルォキシ基、ハロゲン原子または R , - (O CH₂ CH₂ ) n— 0 -を示す）のいずれかを示し、 nは任意に変わりうる正の整数を示す）〕で表される反応性ボリエチレングリコ一ル誘導体。

7. 請求項 2記載のタンパク質またはボリべプチド類からなる糖尿病治療剤または糖尿病予防剤。

8. 請求項 3記載のタンパク質またはポリべプチド類からなる抗潰瘍剤または抗潰瘍予防剤。