JPH0698766A - 高活性のスーパーオキシドジスムターゼ高分子誘導体の製造方法 - Google Patents
高活性のスーパーオキシドジスムターゼ高分子誘導体の製造方法Info
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- JPH0698766A JPH0698766A JP3155575A JP15557591A JPH0698766A JP H0698766 A JPH0698766 A JP H0698766A JP 3155575 A JP3155575 A JP 3155575A JP 15557591 A JP15557591 A JP 15557591A JP H0698766 A JPH0698766 A JP H0698766A
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Abstract
(57)【要約】
【目的】高活性でかつ抗炎症作用に優れたスーパーオキ
シドジスムターゼ（ＳＯＤ）高分子誘導体の製造方法。 【構成】一般式（１） 【化１】 （ただし式中のiは1から22までの整数であり、Polymer
とは一般式（２） 【化２】 （式中のmは20から500までの整数であり、Xの位置でＳ
ＯＤのアミノ基とアミド結合している）あるいは一般式
（３） 【化３】 （式中のnは10から700までの整数であり、Yの位置でＳ
ＯＤのアミノ基と結合している）等の高分子である）で
表される高活性スーパーオキシドジスムターゼ（ＳＯ
Ｄ）高分子誘導体の製造方法。
シドジスムターゼ（ＳＯＤ）高分子誘導体の製造方法。 【構成】一般式（１） 【化１】 （ただし式中のiは1から22までの整数であり、Polymer
とは一般式（２） 【化２】 （式中のmは20から500までの整数であり、Xの位置でＳ
ＯＤのアミノ基とアミド結合している）あるいは一般式
（３） 【化３】 （式中のnは10から700までの整数であり、Yの位置でＳ
ＯＤのアミノ基と結合している）等の高分子である）で
表される高活性スーパーオキシドジスムターゼ（ＳＯ
Ｄ）高分子誘導体の製造方法。
Description
【０００１】
【産業上の利用分野】本発明は、高活性で低抗癌性ので
表されるスーパーオキシドジスムターゼ（ＳＯＤ）高分
子誘導体の製造方法に関するものであり、抗炎症薬とし
ての応用が期待される。
表されるスーパーオキシドジスムターゼ（ＳＯＤ）高分
子誘導体の製造方法に関するものであり、抗炎症薬とし
ての応用が期待される。
【０００２】
【従来の技術】スーパーオキシドジスムターゼ（ＳＯ
Ｄ）は生体内の炎症障害の原因となる活性酵素（スーパ
ーオキシド）を分解する分子量約3.2万の酵素である。
そのため炎症に起因する多くの難治性疾患に対して有効
性が期待されている。例えば、腎臓や心臓の移植・心筋
梗塞や脳梗塞の治療後血液の循環を開始した時に起こる
再還流障害、ベーチェット病、悪性リウマチ、クローン
病、潰瘍性大腸炎などの炎症性疾患及び放射線障害防御
などにＳＯＤは有効と考えられている。しかし、ＳＯＤ
を静脈内注射で生体内に投与した時の半減期は約5分と
短く、期待されたような抗炎症作用は生体内でほとんど
発揮されなかった。ＳＯＤの生体内での半減期を延長す
るために皮下あるいは筋肉内注射などの投与経路の変更
あるいは、脂質小包体のリポソーム中への包理などが試
みられているが、有用性を確立できていない。ＳＯＤの
生体内半減期を延長する有効な方法として合成高分子を
結合する方法があり、既にポリエチレングリコール（Ｐ
ＥＧ）やスチレン−無水マレイン酸共重合体（ＳＭＡ）
との結合体が知られている。（ＰＥＧに関してはChem.P
athol.Pharmacol,29,113(1980)）、ＳＭＡに関しては
（Bioindust,4,302(1987)）しかしこの両結合体につい
て現在まで生体内での抗炎症作用発現の報告はない。最
近ジビニルエーテルと無水マレイン酸共重合体（ＤＩＶ
ＥＭＡ）とＳＯＤの結合体に関して、インフルエンザウ
ィルス感染症に起因するマウスの炎症に有効との初めて
の報告があった。（Science,244,974(1989)）
Ｄ）は生体内の炎症障害の原因となる活性酵素（スーパ
ーオキシド）を分解する分子量約3.2万の酵素である。
そのため炎症に起因する多くの難治性疾患に対して有効
性が期待されている。例えば、腎臓や心臓の移植・心筋
梗塞や脳梗塞の治療後血液の循環を開始した時に起こる
再還流障害、ベーチェット病、悪性リウマチ、クローン
病、潰瘍性大腸炎などの炎症性疾患及び放射線障害防御
などにＳＯＤは有効と考えられている。しかし、ＳＯＤ
を静脈内注射で生体内に投与した時の半減期は約5分と
短く、期待されたような抗炎症作用は生体内でほとんど
発揮されなかった。ＳＯＤの生体内での半減期を延長す
るために皮下あるいは筋肉内注射などの投与経路の変更
あるいは、脂質小包体のリポソーム中への包理などが試
みられているが、有用性を確立できていない。ＳＯＤの
生体内半減期を延長する有効な方法として合成高分子を
結合する方法があり、既にポリエチレングリコール（Ｐ
ＥＧ）やスチレン−無水マレイン酸共重合体（ＳＭＡ）
との結合体が知られている。（ＰＥＧに関してはChem.P
athol.Pharmacol,29,113(1980)）、ＳＭＡに関しては
（Bioindust,4,302(1987)）しかしこの両結合体につい
て現在まで生体内での抗炎症作用発現の報告はない。最
近ジビニルエーテルと無水マレイン酸共重合体（ＤＩＶ
ＥＭＡ）とＳＯＤの結合体に関して、インフルエンザウ
ィルス感染症に起因するマウスの炎症に有効との初めて
の報告があった。（Science,244,974(1989)）
【０００３】
【発明が解決しようとする課題】このようにスーパーオ
キシドジスムターゼ（ＳＯＤ）を高分子と結合すること
により生体内半減期を延長し、生体内で抗炎症作用を発
現する例のあることも見いだされた。しかし、一般的に
ＳＯＤのような酵素を高分子と化学的に結合すると酵素
活性は50%以下へと著しく低下することが知られてい
る。ＳＯＤを薬剤として検討する実用的見地からは、Ｓ
ＯＤの酵素活性をできる限り保持して高分子との結合体
を作成する一般的合成法の開発が不可欠である。
キシドジスムターゼ（ＳＯＤ）を高分子と結合すること
により生体内半減期を延長し、生体内で抗炎症作用を発
現する例のあることも見いだされた。しかし、一般的に
ＳＯＤのような酵素を高分子と化学的に結合すると酵素
活性は50%以下へと著しく低下することが知られてい
る。ＳＯＤを薬剤として検討する実用的見地からは、Ｓ
ＯＤの酵素活性をできる限り保持して高分子との結合体
を作成する一般的合成法の開発が不可欠である。
【０００４】
【課題を解決するための手段】スーパーオキシドジスム
ターゼ（ＳＯＤ）の三次元的構造についてはＸ線による
解析が進み、活性中心周辺について考察することが可能
である。それによればアミノ酸配列の134番目にあるリ
ジンの正電荷を帯びたアミノ基が負の電荷を帯びた活性
酵素（スーパーオキシドアニオンラジカル）を静電的相
互作用で引きつけ、活性中心の溝に導くことが重要とさ
れている。したがってこのアミノ基が高分子との結合に
用いられれば、酵素活性は著しく低下するはずである。
もしこのアミノ基を保護して高分子との結合反応を行
い、その後に保護基をはずすことができれば、活性を行
ったＳＯＤ高分子誘導体の合成が可能なはずである。た
だ現在の技術で134番目のリジン残基のアミノ基のみを
保護することはほとんど不可能である。しかし一般的に
ＳＯＤのアミノ基をまず低分子で保護し、高分子と反応
させ、その後低分子の保護基をはずすことは可能である
と考えられている。この考えに基づき、ＳＯＤをpH8の
弱塩基性緩衝液中で保護剤のジメチル無水マレイン酸と
反応させ、次に水と相容性の高い有機溶媒に溶解した高
分子（例えばジビニルエーテルと無水マレイン酸共重合
体(ＤＩＶＥＭＡ)あるいはポリエチレングリコール(Ｐ
ＥＧ2)等の高分子）と均一系で反応を行った。高分子と
の反応後溶液のpHを6として保護基のジメチルマレイン
酸を速やかに離脱させ、限外ろ過膜で除去・精製した。
このようにpHによって容易に除去可能な保護剤を用いる
手法の導入により、90%以上ＳＯＤとしての酵素活性を
保持したＳＯＤ高分子誘導体を合成できることを見いだ
し。この知見に基づいた本発明を完成するに至った。す
なわち、本発明はスーパーオキシドジスムターゼ（ＳＯ
Ｄ）を弱塩基性無機溶媒緩衝液中に溶解し、式（１）
ターゼ（ＳＯＤ）の三次元的構造についてはＸ線による
解析が進み、活性中心周辺について考察することが可能
である。それによればアミノ酸配列の134番目にあるリ
ジンの正電荷を帯びたアミノ基が負の電荷を帯びた活性
酵素（スーパーオキシドアニオンラジカル）を静電的相
互作用で引きつけ、活性中心の溝に導くことが重要とさ
れている。したがってこのアミノ基が高分子との結合に
用いられれば、酵素活性は著しく低下するはずである。
もしこのアミノ基を保護して高分子との結合反応を行
い、その後に保護基をはずすことができれば、活性を行
ったＳＯＤ高分子誘導体の合成が可能なはずである。た
だ現在の技術で134番目のリジン残基のアミノ基のみを
保護することはほとんど不可能である。しかし一般的に
ＳＯＤのアミノ基をまず低分子で保護し、高分子と反応
させ、その後低分子の保護基をはずすことは可能である
と考えられている。この考えに基づき、ＳＯＤをpH8の
弱塩基性緩衝液中で保護剤のジメチル無水マレイン酸と
反応させ、次に水と相容性の高い有機溶媒に溶解した高
分子（例えばジビニルエーテルと無水マレイン酸共重合
体(ＤＩＶＥＭＡ)あるいはポリエチレングリコール(Ｐ
ＥＧ2)等の高分子）と均一系で反応を行った。高分子と
の反応後溶液のpHを6として保護基のジメチルマレイン
酸を速やかに離脱させ、限外ろ過膜で除去・精製した。
このようにpHによって容易に除去可能な保護剤を用いる
手法の導入により、90%以上ＳＯＤとしての酵素活性を
保持したＳＯＤ高分子誘導体を合成できることを見いだ
し。この知見に基づいた本発明を完成するに至った。す
なわち、本発明はスーパーオキシドジスムターゼ（ＳＯ
Ｄ）を弱塩基性無機溶媒緩衝液中に溶解し、式（１）
【化７】 で表されるジメチル無水マレイン酸の有機溶媒を滴下し
て反応させた後、一般式（２）
て反応させた後、一般式（２）
【化８】 （式中のmは20から500までの整数である）で示されるジ
ビニルエーテルと無水マレイン酸の共重合体（ＤＩＶＥ
ＭＡ）あるいは、一般式（３）
ビニルエーテルと無水マレイン酸の共重合体（ＤＩＶＥ
ＭＡ）あるいは、一般式（３）
【化９】 （式中のnは10から700までの整数である）で示されるポ
リエチレングリコール（ＰＥＧ2）等の高分子の有機溶
媒を加えて結合反応をおこなわせた後、反応溶液を弱酸
性としてジメチルマレイン酸を遊離せしめ、続いて精製
を行うことを特徴とする、一般式（４）
リエチレングリコール（ＰＥＧ2）等の高分子の有機溶
媒を加えて結合反応をおこなわせた後、反応溶液を弱酸
性としてジメチルマレイン酸を遊離せしめ、続いて精製
を行うことを特徴とする、一般式（４）
【化１０】 （ただし、式中のiは1から22までの整数であり、Polyme
rとは一般式（５）
rとは一般式（５）
【化１１】 （式中のmは20から500までの整数であり、Xの位置でＳ
ＯＤのアミノ基とアミド結合している）あるいは一般式
（３）
ＯＤのアミノ基とアミド結合している）あるいは一般式
（３）
【化１２】 （式中のnは10から700までの整数であり、Yの位置でＳ
ＯＤのアミノ基と共有結合している）等の高分子であ
る）で表される高活性スーパーオキシドジスムターゼ
（ＳＯＤ）高分子誘導体の製造方法を提供するものであ
る。ＳＯＤと高分子の結合比率はＳＯＤがアミノ基を22
個有することから1分子のＳＯＤに対し結合できる高分
子は1から22分子（一般式（４）中のi）に限定される。
ＳＯＤ高分子誘導体中のＳＯＤ含有量は誘導体を加水分
解しアミノ酸分析を行うことにより定量的に決定した。
本発明に用いた一般式（２）のジビニルエーテル無水マ
レイン酸共重合体は、原料のジビニルエーテルと無水マ
レイン酸を公知の方法（MacromolecularSynthesis,8,89
(1982)）に従って共重合させる事によって得られる。Ｄ
ＩＶＥＭＡの分子量が5千以下ではＳＯＤとの結合で高
分子としての効果が得にくいこと、また10万以上では溶
血作用などの副作用が起こるから、一般式（２）中の重
合度mは20から500までの整数が適当である。また一般式
（３）に用いたポリエチレングリコール（ＰＥＧ2）は
典型的なポリエチレングリコール化試薬として知られる
（Trends in Biotech ,4,68,(1986)）ポリエチレングリ
コールの分子量は500以下では効果を得にくいこと、３
万以上では有効性に変化のないことから、一般式（３）
中のnは10から700までの整数が適当である。ＳＯＤのよ
うなタンパク質が生体内半減期が短い原因の一つは、体
内のタンパク質分解酵素により速やかに加水分解される
ことにある。本発明により作成されたＳＯＤ高分子誘導
体のタンパク質分解酵素に対する安定性をヒト血漿中で
検討した。未修飾のＳＯＤが３時間で酵素活性が２分の
１以下に低下するのに対し、ＳＯＤ高分子誘導体は６日
間経過後も活性はほとんど低下しなかった。この事は高
分子誘導体とすることによりＳＯＤは血漿中のタンパク
質分解酵素に対し抵抗性となったことを示すものであ
る。また、生体内の活性については、本発明により作成
されたＳＯＤ高分子誘導体は再還流障害及び炎症疾患の
動物実験モデルにおいて有効性が示された。以上のよう
に、本発明により作成されたＳＯＤ高分子誘導体はアミ
ノ基保護剤の作用によりＳＯＤの酵素活性が90%以上保
持され、血漿中タンパク質分解酵素に対して抵抗性で、
生体内での抗炎症作用も発現するという優れた効果を示
した。
ＯＤのアミノ基と共有結合している）等の高分子であ
る）で表される高活性スーパーオキシドジスムターゼ
（ＳＯＤ）高分子誘導体の製造方法を提供するものであ
る。ＳＯＤと高分子の結合比率はＳＯＤがアミノ基を22
個有することから1分子のＳＯＤに対し結合できる高分
子は1から22分子（一般式（４）中のi）に限定される。
ＳＯＤ高分子誘導体中のＳＯＤ含有量は誘導体を加水分
解しアミノ酸分析を行うことにより定量的に決定した。
本発明に用いた一般式（２）のジビニルエーテル無水マ
レイン酸共重合体は、原料のジビニルエーテルと無水マ
レイン酸を公知の方法（MacromolecularSynthesis,8,89
(1982)）に従って共重合させる事によって得られる。Ｄ
ＩＶＥＭＡの分子量が5千以下ではＳＯＤとの結合で高
分子としての効果が得にくいこと、また10万以上では溶
血作用などの副作用が起こるから、一般式（２）中の重
合度mは20から500までの整数が適当である。また一般式
（３）に用いたポリエチレングリコール（ＰＥＧ2）は
典型的なポリエチレングリコール化試薬として知られる
（Trends in Biotech ,4,68,(1986)）ポリエチレングリ
コールの分子量は500以下では効果を得にくいこと、３
万以上では有効性に変化のないことから、一般式（３）
中のnは10から700までの整数が適当である。ＳＯＤのよ
うなタンパク質が生体内半減期が短い原因の一つは、体
内のタンパク質分解酵素により速やかに加水分解される
ことにある。本発明により作成されたＳＯＤ高分子誘導
体のタンパク質分解酵素に対する安定性をヒト血漿中で
検討した。未修飾のＳＯＤが３時間で酵素活性が２分の
１以下に低下するのに対し、ＳＯＤ高分子誘導体は６日
間経過後も活性はほとんど低下しなかった。この事は高
分子誘導体とすることによりＳＯＤは血漿中のタンパク
質分解酵素に対し抵抗性となったことを示すものであ
る。また、生体内の活性については、本発明により作成
されたＳＯＤ高分子誘導体は再還流障害及び炎症疾患の
動物実験モデルにおいて有効性が示された。以上のよう
に、本発明により作成されたＳＯＤ高分子誘導体はアミ
ノ基保護剤の作用によりＳＯＤの酵素活性が90%以上保
持され、血漿中タンパク質分解酵素に対して抵抗性で、
生体内での抗炎症作用も発現するという優れた効果を示
した。
【０００５】
【実施例】次に実施例によって本発明をさらに詳細に説
明する。なおスーパーオキシドジスムターゼを「ＳＯ
Ｄ」、一般式（２）のジビニルエーテル−無水マレイン
酸共重合体を「ＤＩＶＥＭＡ」、一般式（３）のポリエ
チレングリコールを「ＰＥＧ2」と省略して記す。 実施例１ ＳＯＤ200mgを25mlの0.2molホウ酸緩衝液に溶解し0。Cに
冷却する。ジメチル無水マレイン酸1.8gを6mlのＮ−メ
チルピロリドン（ＮＭＰ）に溶解し、0。CでＳＯＤ溶液
に滴下する。反応液のpHを１mol水酸化ナトリウム水溶
液で8.0に調整し、滴下後１時間反応させる。ＤＩＶＥ
ＭＡ（平均分子量3.0万）1.0gを5mlのＮＭＰに溶解し、
0。C攪拌下にＳＯＤ反応溶液に加える。溶液のpHを１mol
水酸化ナトリウム水溶液で8.0とし、pHが一定になるま
で反応を続ける。溶液を蒸留水で10倍に希釈し、0。Cで
１mol塩酸でpHを6.0に調整し、室温で１時間攪拌する。
未反応物・ジメチルマレイン酸・塩類をミリホ゜ア社PTHK限
外ろ過膜（分画分子量10万）により除去し、ＧＰＣによ
りフリーのＳＯＤを含まない913mgのＳＯＤ−ＤＩＶＥ
ＭＡ結合体を淡青色綿状の凍結乾燥固体として得た。Ｓ
ＯＤ−ＤＩＶＥＭＡ結合中のＳＯＤ含有量は結合体を加
水分解してＳＯＤのアミノ酸を定量する事によって決定
された（8.7重量%）。この結果は１分子のＳＯＤに対し
約11個のＤＩＶＥＭＡが結合していることを示す。ＳＯ
Ｄ−ＤＩＶＥＭＡ結合体の酵素活性は、ニトロブルー・
テトラゾニウム（ＮＢＴ）法によって測定し（Anal.Bio
chem.,44,276(1971)）、ＳＯＤ当たり92.4%の活性を保
持していることが示された。 実施例２ 実施例１と同様にしてＳＯＤ200mgとＤＩＶＥＭＡ（平
均分子量3.0万）500mgを反応させ、ＳＯＤ−ＤＩＶＥＭ
Ａ結合体560mgを得た。この結合体中のＳＯＤ含有率は1
4.3重量%であり、1分子のＳＯＤに対し約6個のＤＩＶＥ
ＭＡが結合していた。結合体のＳＯＤ当たりの酵素活性
は91.5%保持されていた。 実施例３ 実施例１と同様にして、ＳＯＤ200mgとＤＩＶＥＭＡ
（平均分子量5千）200mgを反応させ、限外ろ過膜として
アミコン社PM30（分画分子量3万）で精製し、ＧＰＣにより
分取後凍結乾燥して淡青色粉末状固体208mgを得た。結
合体中のＳＯＤ含有率は30.2重量%であり、１分子のＳ
ＯＤに対し約14個のＤＩＶＥＭＡが結合していた。この
結合体のＳＯＤ当たりの酵素活性は92.1%保持されてい
た。 実施例４ ＳＯＤ50mgを10mlの0.2molホウ酸緩衝液に溶解し0。Cに
冷却する。450mgのジメチルマレイン酸を2mlのＮＭＰに
溶解し、0。CでＳＯＤ溶液に滴下する。反応液のpHを１m
ol水酸化ナトリウム水溶液で8.0に調整し、滴下後１時
間反応させる。粉末状のＰＥＧ2（平均分子量1万）500m
gをＳＯＤ溶液に加え、0。Cで１時間室温で反応させる。
反応後溶液を蒸留水で10倍に希釈し、0。Cで１mol塩酸に
よりpHを6.0とし、室温で１時間攪拌する。反応精製物
をアミコンPM30限外ろ過膜（分画分子量3万）で精製し、Ｇ
ＰＣでフリーのＳＯＤを除去した後凍結乾燥し、淡青色
綿状固体340mgを得た。ＳＯＤ−ＰＥＧ2結合体中のＳＯ
Ｄ含有量は実施例１と同様にしてアミノ酸分析により決
定した。結合体は19.4重量%のＳＯＤを含み、１分子の
ＳＯＤにＰＥＧ2が約13個結合していることが示され
た。この結合体のＳＯＤ当たりの酵素活性は90.7%保持
されていた。 参考例１ ヒト血漿500ml中にＳＯＤ3.4mgあるいは実施例１で得た
ＳＯＤ−ＤＩＶＥＭＡ結合体42.3mgを溶解し、37。Cで保
温した。一定時間経過後100μlを取り、ニトロブルー・
テトラゾニウム法によりＳＯＤとしての酵素活性を測定
した。ＳＯＤは図１に示すように３時間で酵素活性が２
分の１以下に低下するのに対し、ＳＯＤ−ＤＩＶＥＭＡ
結合体は６日間経過後も活性はほとんど低下しなかっ
た。 参考例２ ラットの腹部を開腹し盲腸を絹糸で結さつし、18Ｇの注
射針で１回刺して穴をあけた後閉腹する。穴から糞便が
腹腔内にもれるため、ラットは腹膜炎を起こし72時間で
86%のラットが死亡する。しかし、表１に示すようにＳ
ＯＤで治療を行うと35%のラットが72時間生存し、さら
にＳＯＤ−ＤＩＶＥＭＡ結合体では86%生存した。
明する。なおスーパーオキシドジスムターゼを「ＳＯ
Ｄ」、一般式（２）のジビニルエーテル−無水マレイン
酸共重合体を「ＤＩＶＥＭＡ」、一般式（３）のポリエ
チレングリコールを「ＰＥＧ2」と省略して記す。 実施例１ ＳＯＤ200mgを25mlの0.2molホウ酸緩衝液に溶解し0。Cに
冷却する。ジメチル無水マレイン酸1.8gを6mlのＮ−メ
チルピロリドン（ＮＭＰ）に溶解し、0。CでＳＯＤ溶液
に滴下する。反応液のpHを１mol水酸化ナトリウム水溶
液で8.0に調整し、滴下後１時間反応させる。ＤＩＶＥ
ＭＡ（平均分子量3.0万）1.0gを5mlのＮＭＰに溶解し、
0。C攪拌下にＳＯＤ反応溶液に加える。溶液のpHを１mol
水酸化ナトリウム水溶液で8.0とし、pHが一定になるま
で反応を続ける。溶液を蒸留水で10倍に希釈し、0。Cで
１mol塩酸でpHを6.0に調整し、室温で１時間攪拌する。
未反応物・ジメチルマレイン酸・塩類をミリホ゜ア社PTHK限
外ろ過膜（分画分子量10万）により除去し、ＧＰＣによ
りフリーのＳＯＤを含まない913mgのＳＯＤ−ＤＩＶＥ
ＭＡ結合体を淡青色綿状の凍結乾燥固体として得た。Ｓ
ＯＤ−ＤＩＶＥＭＡ結合中のＳＯＤ含有量は結合体を加
水分解してＳＯＤのアミノ酸を定量する事によって決定
された（8.7重量%）。この結果は１分子のＳＯＤに対し
約11個のＤＩＶＥＭＡが結合していることを示す。ＳＯ
Ｄ−ＤＩＶＥＭＡ結合体の酵素活性は、ニトロブルー・
テトラゾニウム（ＮＢＴ）法によって測定し（Anal.Bio
chem.,44,276(1971)）、ＳＯＤ当たり92.4%の活性を保
持していることが示された。 実施例２ 実施例１と同様にしてＳＯＤ200mgとＤＩＶＥＭＡ（平
均分子量3.0万）500mgを反応させ、ＳＯＤ−ＤＩＶＥＭ
Ａ結合体560mgを得た。この結合体中のＳＯＤ含有率は1
4.3重量%であり、1分子のＳＯＤに対し約6個のＤＩＶＥ
ＭＡが結合していた。結合体のＳＯＤ当たりの酵素活性
は91.5%保持されていた。 実施例３ 実施例１と同様にして、ＳＯＤ200mgとＤＩＶＥＭＡ
（平均分子量5千）200mgを反応させ、限外ろ過膜として
アミコン社PM30（分画分子量3万）で精製し、ＧＰＣにより
分取後凍結乾燥して淡青色粉末状固体208mgを得た。結
合体中のＳＯＤ含有率は30.2重量%であり、１分子のＳ
ＯＤに対し約14個のＤＩＶＥＭＡが結合していた。この
結合体のＳＯＤ当たりの酵素活性は92.1%保持されてい
た。 実施例４ ＳＯＤ50mgを10mlの0.2molホウ酸緩衝液に溶解し0。Cに
冷却する。450mgのジメチルマレイン酸を2mlのＮＭＰに
溶解し、0。CでＳＯＤ溶液に滴下する。反応液のpHを１m
ol水酸化ナトリウム水溶液で8.0に調整し、滴下後１時
間反応させる。粉末状のＰＥＧ2（平均分子量1万）500m
gをＳＯＤ溶液に加え、0。Cで１時間室温で反応させる。
反応後溶液を蒸留水で10倍に希釈し、0。Cで１mol塩酸に
よりpHを6.0とし、室温で１時間攪拌する。反応精製物
をアミコンPM30限外ろ過膜（分画分子量3万）で精製し、Ｇ
ＰＣでフリーのＳＯＤを除去した後凍結乾燥し、淡青色
綿状固体340mgを得た。ＳＯＤ−ＰＥＧ2結合体中のＳＯ
Ｄ含有量は実施例１と同様にしてアミノ酸分析により決
定した。結合体は19.4重量%のＳＯＤを含み、１分子の
ＳＯＤにＰＥＧ2が約13個結合していることが示され
た。この結合体のＳＯＤ当たりの酵素活性は90.7%保持
されていた。 参考例１ ヒト血漿500ml中にＳＯＤ3.4mgあるいは実施例１で得た
ＳＯＤ−ＤＩＶＥＭＡ結合体42.3mgを溶解し、37。Cで保
温した。一定時間経過後100μlを取り、ニトロブルー・
テトラゾニウム法によりＳＯＤとしての酵素活性を測定
した。ＳＯＤは図１に示すように３時間で酵素活性が２
分の１以下に低下するのに対し、ＳＯＤ−ＤＩＶＥＭＡ
結合体は６日間経過後も活性はほとんど低下しなかっ
た。 参考例２ ラットの腹部を開腹し盲腸を絹糸で結さつし、18Ｇの注
射針で１回刺して穴をあけた後閉腹する。穴から糞便が
腹腔内にもれるため、ラットは腹膜炎を起こし72時間で
86%のラットが死亡する。しかし、表１に示すようにＳ
ＯＤで治療を行うと35%のラットが72時間生存し、さら
にＳＯＤ−ＤＩＶＥＭＡ結合体では86%生存した。
【表１】
【００６】
【発明の効果】本発明のＳＯＤ高分子誘導体の製造方法
は、脱離可能なアミノ基保護剤を用いることにより、高
分子との結合後ＳＯＤの酵素活性を90%以上保持できる
という製造方法であり、生体内での抗炎症作用もＳＯＤ
に比較して著しく高活性なＳＯＤ高分子誘導体を可能と
するものである。
は、脱離可能なアミノ基保護剤を用いることにより、高
分子との結合後ＳＯＤの酵素活性を90%以上保持できる
という製造方法であり、生体内での抗炎症作用もＳＯＤ
に比較して著しく高活性なＳＯＤ高分子誘導体を可能と
するものである。
【００７】
【図１】実施例１のＳＯＤ−ＤＩＶＥＭＡ結合体のヒト
血漿中の酵素活性の安定持続性を示すグラフ。
血漿中の酵素活性の安定持続性を示すグラフ。
Claims (1)
- 【請求項１】スーパーオキシドジスムターゼ（ＳＯＤ）
を弱塩基性無機緩衝液中に溶解し、式（１） 【化１】 で示されるジメチル無水マレイン酸の有機溶媒溶液を摘
下して反応させた後、１般式（２） 【化２】 （式中のmは20から500までの整数である）で示されるジ
ビニルエチルエーテル無水マレイン酸の共重合体（ＤＩ
ＶＥＭＡ）あるいは一般式（３） 【化３】 （式中のnは10から700までの整数である）で示されるポ
リエチレングリコール（ＰＥＧ2）等の高分子の有機溶
媒を加えて結合反応を行わせた後、反応溶液を弱酸性と
してジメチルマレイン酸を遊離せしめ、続いて精製を行
うことを特徴とする、一般式（４） 【化４】 （ただし式中のiは1から22までの整数であり、Polymer
とは一般式（５） 【化５】 （式中のmは20から500までの整数であり、Xの位置でＳ
ＯＤのアミノ基とアミド結合している）あるいは、一般
式（６） 【化６】 （式中のnは10から700までの整数であり、Yの位置でＳ
ＯＤのアミノ基と結合している）等の高分子である）で
表される高活性スーパーオキシドジスムターゼ（ＳＯ
Ｄ）高分子誘導体の製造方法。
Priority Applications (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| JP3155575A JPH0785717B2 (ja) | 1991-05-30 | 1991-05-30 | 高活性のスーパーオキシドジスムターゼ高分子誘導体の製造方法 |
Applications Claiming Priority (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| JP3155575A JPH0785717B2 (ja) | 1991-05-30 | 1991-05-30 | 高活性のスーパーオキシドジスムターゼ高分子誘導体の製造方法 |
Publications (2)
| Publication Number | Publication Date |
|---|---|
| JPH0698766A true JPH0698766A (ja) | 1994-04-12 |
| JPH0785717B2 JPH0785717B2 (ja) | 1995-09-20 |
Family
ID=15609050
Family Applications (1)
| Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
|---|---|---|---|
| JP3155575A Expired - Lifetime JPH0785717B2 (ja) | 1991-05-30 | 1991-05-30 | 高活性のスーパーオキシドジスムターゼ高分子誘導体の製造方法 |
Country Status (1)
| Country | Link |
|---|---|
| JP (1) | JPH0785717B2 (ja) |
Cited By (1)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| WO1995032219A1 (fr) * | 1994-05-20 | 1995-11-30 | Hisamitsu Pharmaceutical Co., Inc. | Proteine ou polypeptide, procede et intermediaires permettant leur preparation |
-
1991
- 1991-05-30 JP JP3155575A patent/JPH0785717B2/ja not_active Expired - Lifetime
Cited By (1)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| WO1995032219A1 (fr) * | 1994-05-20 | 1995-11-30 | Hisamitsu Pharmaceutical Co., Inc. | Proteine ou polypeptide, procede et intermediaires permettant leur preparation |
Also Published As
| Publication number | Publication date |
|---|---|
| JPH0785717B2 (ja) | 1995-09-20 |
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Legal Events
| Date | Code | Title | Description |
|---|---|---|---|
| EXPY | Cancellation because of completion of term |