WO1995026738A1 - Utilisation des polymeres protegeant des facteurs de croissance pour le traitement de l'inflammation - Google Patents

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WO1995026738A1
WO1995026738A1 PCT/FR1995/000400 FR9500400W WO9526738A1 WO 1995026738 A1 WO1995026738 A1 WO 1995026738A1 FR 9500400 W FR9500400 W FR 9500400W WO 9526738 A1 WO9526738 A1 WO 9526738A1
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cmdbs
polysaccharide
fgf
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PCT/FR1995/000400
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Denis Barritault
Jean-Pierre Caruelle
William Hornebeck
Anne Meddahi
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Universite Paris Val De Marne
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    • A61K31/715—Polysaccharides, i.e. having more than five saccharide radicals attached to each other by glycosidic linkages; Derivatives thereof, e.g. ethers, esters
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    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P43/00—Drugs for specific purposes, not provided for in groups A61P1/00-A61P41/00

Definitions

  • the present invention relates to the use of polymers or biopolymers for the preparation of a medicament for the treatment of inflammation.
  • Inflammation is a particularly complex manifestation that develops after a spontaneous or traumatic tissue injury. Characterized by a change in capillary permeability, it is accompanied by an infiltration of blood, molecular and cellular components, which is generally manifested by erythemas and edemas. Numerous chemical mediators are released or activated during this process during which elements of the blood, in particular white blood cells accumulate and release different lytic activities. Many substances are used as anti-inflammatory agents. They can roughly be classified into steroid and non-steroid agents.
  • HBGF Heparin Binding Growth Factors
  • Sucrose sulfate ester and its aluminum salt sucralfate are products described and used as anti-inflammatory agents (US Patent No. 3,432,489) and in various combinations and pharmaceutical compositions described in a series of patents (US 4,975,281, 4,885 .281, US 5,013,557, US 5,164,379, US 5,196,405, US 5,240,710 and DK 102,488 and DK 505,588).
  • a composition containing a combination of heparin and sulodexide which is a mixture of polymers comprising glycosaminoglycans (GAG) has also been studied for its action in the treatment of mild trauma (Dragani et al., 1989, Minerva Medica, 80, n ° 4, 397-403). However, these two compounds have not been tested separately.
  • CMDBS Carboxy Methyl Dextran Benzylamine Sulfonate
  • Patent FR 2 644 066 describes the use of certain CMDBS associated with FGF for the healing of the skin and the cornea. Experiments were carried out by causing a cutaneous wound using a 6 mm diameter cookie cutter in rats. In this example, the CMDBS associated with FGF 2 provides a clear effect on the speed and quality of skin repair.
  • certain polymers defined as belonging to the class of HBGFPP and in particular CMDBS have an effect on the intensity of the inflammatory reaction which they very markedly decrease while by accelerating the repair, regeneration and restoration processes of damaged tissue.
  • skin tissues, bone tissues, HBGFPP combine anti-inflammatory effects.
  • the subject of the present invention is the use of at least one polymer or of a biopolymer, called HBGFPP, with the exclusion of mesoglycan, specifically protecting the growth factors of the families of FGF and TGF beta from tryptic degradation and n ' not significantly inhibiting coagulation, for the manufacture of a medicament for the treatment of inflammation of various tissues.
  • Such a polymer particularly exhibits an anticoagulant activity of less than 50 international units per mg of polymer measured according to Maillet et al (Mol. Immunol, 1988, 25, 915-923).
  • it potentiates the FGF in vitro.
  • it does not substantially activate the complement system, that is to say that it has an anti-complement activity greater than 0.5 ⁇ g for CH5O (according to Mauzac et al., Biomaterials, 6, 61 -63, 1985).
  • polymers is intended to mean any natural, chemically modified or totally synthetic natural substance corresponding to the definition given above.
  • said polymer or biopolymer is a polysaccharide which can be composed mainly of glucose residues.
  • It may also include glucosamine and / or uronic acid residues, particularly in the form of the glucosamine-uronic acid dimer.
  • Particularly preferred polysaccharides are substituted dextrans, glycosaminoglycans optionally associated with a lipid, a peptide or a protide or sulfates of these polymers.
  • Such a polymer advantageously has a molecular weight of at least 10 kDa and preferably around 40 kDa.
  • the present invention further relates to a pharmaceutical composition containing these polymers.
  • the polymers and / or biopolymers can be selected from natural substances which can then be optionally modified by additions of appropriate chemical groups, or else be obtained entirely by synthesis. These natural, semi-synthetic or fully synthetic polymers are then selected on the basis of their capacities to interact specifically with several growth factors, in particular those of the family of FGF and TGF beta. They can also be selected for their ability to protect this or these factors against proteolytic degradations, and to act as inhibitors of protein activities involved in the inflammatory process such as leukocyte elastase, and plasmin for example, and for their activity. anti-coagulant. These polymers are designated by the generic acronym HBGFPP (heparin binding growth factor protectors and promotors). Two prototypes of these polymers or biopolymers are given as examples as well as the methods and criteria for the selection of these polymers.
  • HBGFPP heparin binding growth factor protectors and promotors
  • HBGFPP belongs to the family of CMDBS which are known products, namely functionalized biospecific dextrans, substituted with carboxymethyl, benzylamide and benzylamine sulfonate residues. These polymers illustrate the production of HBGFPP from natural products (dextrans) subsequently chemically substituted.
  • the second example describes the selection of completely natural products such as glycosaminoglycans sulfates purified from tissue extracts.
  • treatment means any curative or preventive operation carried out for the prophylaxis or the resorption of inflammations involving in particular protein activities such as leukocyte elastase, plasmin, metalloproteinases in addition to stimulating effects. tissue regeneration and healing.
  • HBGFPP HBGFPP
  • CMDBS HBGFPP
  • the pharmaceutical composition can also be combined with agents such as, for example, antibacterials, antifungals, vitamins or the like, antiseptics, analgesics, agents protecting against solar radiation and other anti-inflammatory agents or all other types of compounds associated for their specific effects and administered in any pharmaceutical dosage form acceptable and compatible with the type of treatment envisaged.
  • agents such as, for example, antibacterials, antifungals, vitamins or the like, antiseptics, analgesics, agents protecting against solar radiation and other anti-inflammatory agents or all other types of compounds associated for their specific effects and administered in any pharmaceutical dosage form acceptable and compatible with the type of treatment envisaged.
  • such a composition is designed to be directly absorbed orally, deposited on the lesion or injected if the latter is directly accessible, in particular in subcutaneous, buccal or rectal lesions or even during surgical procedures by depositing or injecting the tissues.
  • the unit dose is 10 to 2500 ⁇ g CMDBS or HBGFPP per ml or cm2 of tissue to be treated in a volume adapted to the specificity of the pathology.
  • the dose of CMDBS or HBGFP product used corresponds, depending on the area of the wound, to a fraction of a starting solution of 10 to 2,500 ⁇ g per milliliter (which for local application on common wounds rarely involves a deposit greater than a few hundred of microliters of the solution) this dose being applied once or twice per 24 hours.
  • compositions used of sucralfate are from 0.01 to 5% (according to US Patent No. 5,196,405) are concentrations at least 10 times greater than those described in the present invention and the effects described in all the examples of this patent US Pat. 196405 are obtained from compositions of 50 milligrams per milliliter.
  • the vehicle can be physiological saline or buffers such as PBS containing 0.15 molar NaCl or any other kind of solution which is compatible and not irritating to the injured tissue.
  • physiological saline or buffers such as PBS containing 0.15 molar NaCl or any other kind of solution which is compatible and not irritating to the injured tissue.
  • the main pathologies associated with an elastase type activity cover the following main areas:
  • - skin lesions including the lips, oral cavity, gum (diseases periodontal), mucous membranes for example vaginal and anal surfaces for inflammatory, pruritic, erythematous rashes, acne or rosacea such as seborrhea or pustular inflammation, boils, abscesses;
  • otolaryngological and pulmonary sphere such as sinusitis or allergic rhinitis, acute or chronic, otitis, pulmonary inflammatory reactions, edema, emphysema, fibrosis, reactions secondary to bronchitis, asthma;
  • diseases linked to immunological or viral disorders such as arthritis and rheumatoid arthritis, synovitis, gout and various forms of arthritis inflammation, lupus erythematosus, anaphylaxis, bacterial septicemia, AIDS;
  • parasitic diseases such as toxoplasmosis, cytomegalovirus, malaria, polyomelyte, etc .;
  • the main pathologies associated with plasmin-type activities also cover the fields of tumor progression and induced complications.
  • Figure 1 shows the formula for CMDBS.
  • Figure 2 illustrates the potentiation of the biological activity of FGF1 (2a) and FGF2 (2b) by heparin, mesoglycan and sulodexide.
  • the measurement of the biological activity is carried out on CCL39 cells by measuring the increase in the incorporation of tritiated thymidine as a function of the dose of FGF1 and of FGF2 added alone or in the presence of 20 ⁇ g of heparin, 10 ⁇ g of mesoglycan, or
  • Figures 3 and 4 illustrate the protective effect of heparin, mesoglycan and sulodexide against thermal degradation of FGF1 (3) and FGF2 (4).
  • FGF samples are incubated alone or in the presence of 20 ⁇ g of heparin, 10 ⁇ g of mesoglycan or 10 ⁇ g of sulodexide at 20 ° C (a) and 37 ° C (b) for 1, 7, 15, 30 days.
  • the measure of the biological activity presented on the abscissa corresponds to the values of the stimulation units (ED50) for the incorporation of tritiated thymidine in CCL39 cells.
  • ED50 stimulation units
  • Figure 5a illustrates the protective effect of heparin, mesoglycan and sulodexide against proteolytic degradation of 125 I-FGF1.
  • Proteolytic digestion was carried out at 37 "C and the samples were separated by electrophoresis on 18% polyacrylamide gel. The gels are dried and autoradiographs.
  • the first lane contains 125 I-FGF1 alone, in the second (lane 2 ) 125 I-FGF1 is incubated in the presence of trypsin and heparin (lane 3), mesoglycan (lane 4) or sulodexide (lane 5).
  • Figure 5b illustrates the protective effect of heparin, mesoglycan and sulodexide against proteolytic degradation of 125 I-FGF2.
  • the layout of the tracks is identical to that presented for the 125 I-FGF1 in 5a.
  • FIGS. 6A and 6B are elution profiles on a DEAE-Trisacryl column respectively from the HSM (FIG. 6A) and HSS (FIG. 6B) fractions, in the presence of chondroitin sulphate (CSA) fractions for the calibration of the column.
  • CSA chondroitin sulphate
  • FIGS. 7A and 7B respectively represent bone tissues having an inflammation treated with a dressing of collagen soaked in physiological saline (7A), and the same dressing soaked in CMDBS (7B).
  • FIGS. 8A to 8C on the one hand and 8D to 8F on the other hand respectively represent sections of skin wounds treated with collagen soaked in CMDBS and collagen soaked in physiological solution.
  • CMDBS are dextrans substituted by carboxymethyl, benzylamide and benzylamide sulfonate groups.
  • the CMDBS synthesis method can be that described by M.MAUZAC and J.JOSEFONVICZ in
  • CMD is prepared from dextran by substitution of a few glycosylated units with carboxylic groups on the carbon in position 5 or
  • the benzylamide is coupled to the carboxylic groups to form the carboxymethyl-benzylamide dextran (or CMBD).
  • carboxymethyl-benzylamide dextran or CMBD
  • some aromatic rings of benzylamide are sulfonated to result in the carboxymethyl dextran benzylamide sulfonate or CMDBS.
  • the sodium salts of these derivatives are ultrafiltered, lyophilized and dissolved in the appropriate buffer before use.
  • CMDBS have a distribution statistics of the different substituents.
  • the percentages for each type of CMDBS are determined by conventional methods,
  • CMDBS During the synthesis of CMDBS it is possible to control the rate of substitution of each of the groups by modification of the conditions of the substitution reaction. Control of parameters such as temperature, reaction time, relative concentrations of the constituents and the number of substitution reactions, etc., make it possible to obtain a very large number of substituted polymers.
  • the substitution of hydroxyls by carboxymethyl on the carbons in position 5 and 6 makes it possible to obtain carboxymethylation rates ranging from 0 to 200% (100% for each of the carbons in position 5 and 6).
  • the carboxymethyl group can in turn be partially or totally used for fixing the benzylamide. Benzylamide groups can be partially or fully used for sulfonation.
  • the functionalized substituted dextrans used according to the invention are among those specially described in French patent No. 2,461,724.
  • the selected CMDBS In addition to the ability to stabilize and protect the growth factors of the FGF family as described in the publication by Tardieu et al J. Cell.Physio. 1992 150 p 194 to 203; and in French Patent No. 2,461,724; the selected CMDBS must be able to interact with at least one member of the growth factor family of the TGF beta family according to an evaluation method described below and protect the TGF beta against proteolysis.
  • ii Evaluation of the interaction capacities between CMDBS and growth factors of the TGF beta family.
  • a screening test was established. This test consists in measuring the capacity of the selected CMDBS to allow the TGF beta to keep its biological activity despite a protease treatment.
  • the CMDBS used is lot 26.2 defined by a substitution rate of 110% of carboxymethyl units, 3.6% of benzylamide units and 36.5% of sulfonate units and has an anti-coagulant activity of 4 IU / mg (International Units).
  • the anti-complement activity of this batch is 1.1 ⁇ g of
  • the heparin used as a control comes from Sanofi establishments. (Institut Choay) and has an anticoagulant activity of 175 IU / mg
  • TFG beta 1 is prepared from human blood platelets according to the protocol described in numerous publications and commonly used by those skilled in the art, for example in the publication Growth Factors and their Receptors 1992, vol. 1 PP 419-472 by A. Roberts and M.Sporn edited by A. Roberts and M.Sporn and published by Springer Verlag Berlin.
  • the test for biological activity of TGF beta used in this example is that of the inhibition of growth of CCL64 cells (from the Ame'ican Tissue Culture Collection).
  • TGF beta is used in two doses, one corresponding to the inhibition capacity of 50% of the incorporation of tritiated thymidine (defined as the unit of inhibitory activity) the other, corresponding to the inhibition capacity of 100%.
  • the values obtained are 250 ⁇ g of TGF beta to obtain the unit of inhibition activity on CCL64 cells cultured in 1 ml of culture medium. The 100% inhibition is obtained with 1 ng of TGF beta in 1 ml of culture medium.
  • a 50 ng sample of TGF beta in phosphate buffered saline containing 0.1% bovine serum albumin is incubated alone, or associated either with 5000 ⁇ g of CMDBS, or with 5000 ⁇ g of heparin , with or without 500 ⁇ g of trypsin.
  • the final volume of the incubated solution is adjusted to 1 ml and the incubation is carried out at 37 ° C for a variable time (10 minutes in the example described in Table 1).
  • CMDBS had no inhibitory power on the activity of trypsin (tableAU 2).
  • 10 ⁇ g of trypsin were incubated either with a substrate (S.87 supplied by the company Serbio, Paris and used according to the recommendations of this supplier) or either with this substrate and a trypsin inhibitor such as that obtained from soybeans ( like the Soyabean trypsin inhibitor or STI from Sigma) these incubations being carried out in the absence or in the presence of variable amounts of CMDBS (lot AM26).
  • the enzymatic activity of trypsin was measured by spectrophotometric absorption of the transformation product of S 87 as a function of the incubation time.
  • a commercial preparation of proteoglycosaminoglycan and glycosaminoglycans, sulodexide was selected according to its ability to interact with growth factors of the FGF family as well as with those of the beta TGF family.
  • Heparan sulfate preparations obtained by fractionation of mesoglycan and sulodexide were also tested.
  • the cells used in this example are CCL39 cells which come from the American Tissue Culture Collection.
  • the culture conditions and tests for measuring the biological activity of the FGFs are the same as those described in the publication Tardieu et al J. Cell.Physiol. 1992.
  • the FGF growth factors used are the recombinant forms FGF1 and FGF 2.
  • the FGFl or 2 is used at a dose corresponding to the effective dose (denoted ED50) to induce a stimulation of the biological activity by 50% of the dose inducing the maximum stimulation.
  • the biological activity is measured by the capacity to induce an increase in the incorporation of tritiated thymidine in the cells according to the protocols widely described in numerous publications including that of Tardieu et al mentioned previously and also in French patent N ° 2 644,066.
  • 1 ⁇ D50 is 5 ng / ml for FGFl and 3 ng / ml for FGF 2, values measured experimentally (Figs.2a and 2b).
  • the same stimulation experiment according to the dose of FGF is carried out in the presence of 10 ⁇ g / ml of Sulodexide or 20 ⁇ g / ml of Heparin.
  • Figure 2 shows that under these conditions 1 ⁇ D50 becomes 0.4 ng / ml and 0.2 ng / ml respectively for FGF1 and FGF2 in the presence of these doses of Sulodexide or Heparin.
  • HBGFPP protect the FGFs against thermal degradations as well as against the inactivation induced by the proteolytic action of trypsin. (Figs. 4 and 5). Likewise, these HBGFPPs protect FGF1 and 2 against inactivation induced by the proteolytic activity of trypsin (Figs. 5a and 5b).
  • dextran sulfate Sigma Chemical, of molecular weight 40,000, the dextran used for the synthesis of CMDBS (also from Sigma) of sucrase or sucrose octasulfate (supplied by D. Bar Shalom, Company BUKH MEDIC, in Denmark)
  • sucrase is given in US Patent No. 5202311 or dextran sulfate is given in Japanese Patent No. 138 907/88).
  • Dextran is the one used for the synthesis of CMDBS AM26.
  • the experiment for protecting the biological activity of TGFbeta was carried out in the same way as with the CMDBS as described in Example 1 ii.
  • the incubation mixture contains 50 ng of TGF beta (in 0.1% bovine serum albumin) and trypsin (500 ⁇ g).
  • Mesoglycan or Sulodexide or dextran sulfate or dextran or sucrase are used at a dose of 5000 ⁇ g.
  • TGFbeta The biological activity of TGFbeta is measured as described above after a dilution of 50 times and using CCL64 cells.
  • CMDBS capable of meeting the two selection criteria with respect to FGF and TGFbeta
  • sulodexide has significant protective activity for TGFbeta.
  • Sulodexide and Mesoglycan correspond to mixtures of several substances, most of which consist of different glycosaminoglycans (GAG).
  • This purification was obtained by subjecting these solubilized products to an ion exchange chromatography (DEAE - Trisacryl) to remove all the protein contaminants.
  • the total GAGs were then purified by eluting the DEAE gel with a sodium acetate solution, pH 4, containing 1.5 M NaCl.
  • each GAG product was digested with chondroitinase ABC overnight at 37 ° C (1 unit per mg of GAG). This enzyme degrades all GAGs except for heparan sulfates (HS).
  • the digestion products were subjected to chromatography on a molecular sieve (G50 Sephadex, column 1.8 ⁇ 95 cm). The elution is then carried out in ammonium bicarbonate buffer at a flow rate of 18 ml / h. Undigested material that corresponds to HS GAGs is collected in the dead elution volume of the column.
  • the GAG concentrations are calculated from their uronic acid content by the carbazole method (Bitter T. and Muir H.M., 1962, Anal. Biochem 4, 330-334).
  • HS fractions of each of these two products were chromatographed again on a DEAE Trisacryl gel.
  • 1 mg of each HS fraction, purified from mesoglycan (Fig. 6A) or sulodexide (Fig. 6B), in 3 ml was placed on a column equilibrated with 0.05 M NaCl, 0.05 M TMS buffer -Hel pH 7.5.
  • the material fixed to the column is desorbed by a salt gradient ranging from 0.05 M NaCI to 1.5 M NaCI in the same acetate buffer.
  • 1 ml of each fraction collected was assayed by the carbazole method.
  • the material corresponding to the HS constituents of each of the original products has approximately the same elution profile and therefore approximately the same apparent charge. This maximum of the elution peak is obtained for a salt concentration of 0.94 M NaCl.
  • a defined fraction of chondroitin sulfate (CSA) was subjected to the same protocol in order to calibrate the chromatography. This CSA fraction which contains only one sulfate group per disaccharide is eluted at an ionic strength of 0.72 M NaCI.
  • the HS fraction contains more sulfate groups than the reference CSAs.
  • the HS fraction has about two sulfate groups per dissacharidic unit.
  • the purified leukocyte elastase was obtained by Elastin Products Co (Owenville, MO, USA) and the plasmin at SIGMA.
  • the inhibition of enzymatic activities by these different compounds is carried out at 37oC in a thermostatically controlled bath.
  • the enzymes considered are dissolved in a 100 mM Tris-HCL buffer, pH8 for the elastase and pH 7.4 for plasmin, in the presence of 0.02% sodium azide and 0.01% Triton X100 for plasmin.
  • the concentrations of substrates and those of enzymes. are: 0.10 mM MeO-Suc-Ala-Ala-Pro-Val-pNA (paranitroanilide) for the 8.3 nM elastase and 0.20 mM dVal-Leu-dLys-pNA for the plasmin at 77 nM. For each condition is established the IC50.
  • Table 6 gives the results obtained in which the batch AM6 corresponds to a dextran T40 of 40,000 kD.
  • Lot EM5 corresponds to a T10 dextran of 10,000 kD.
  • the synthetic intermediates are listed according to the abbreviations designated above, indexed with a number which specifies the number of each of the substitution reactions.
  • the IC50 values demonstrate that the CMDBS have non-competitive hyperbolic-type inhibitory effects on the activity of leukocyte elastase comparable to those of heparin, one of the best inhibitors of this activity (Ki of the order of 1 nM). CMDBS also exerts, unlike heparin, inhibitory effects on plasmin.
  • the two cephalic regions have not been filled and therefore serve as a control while the left and right posterior sides are filled with collagen (microfilar hemostatic collagen (Pangen) from the laboratories of Fournier Dijon, France) or impregnated collagen overnight in a CMDBS solution at 100 ⁇ g / ml. Appropriate hemostasis was performed before suturing the wound. The wounds are closed with nylon suture thread and the operated side is covered with a sterile dressing. The animals were left in convalescence and no postoperative complications were noted. The animals were euthanized on days 3, 4, 8 and during the 12 weeks following the intervention. All animals received identical treatment and served for their own control. After examination macroscopic of the site of the operation, the skulls are decalcified and included in paraffin.
  • the operated side was studied under a microscope to be cultured. After the models are decalcified and placed in paraffin, sagittal sections (5 mm thick) of the zones corresponding to the defects thus created were cut out using a microtome and stained with hematoxylin and l eosin. These sections are studied under a microscope and the defects have been magnified 100 times, using a 2.5 ⁇ 2.5 mm grid normalized by 10 divisions of 0.25 mm on each side. These measurements were then reported on a graph to compare the results according to the different groups treated.
  • FIGS. 7A and 7B show the difference in the inflammatory reaction observed after 3 weeks in the granulation tissue corresponding to the filling of the bone defect produced experimentally.
  • FIG. 7A which corresponds to the dressing of collagen soaked only with physiological saline, the inflammatory reaction is very strong; granulation tissue contains a large number of inflammatory cells and few osteoblastic cells.
  • the stomach is removed, opened according to the large curvature and rinsed.
  • the mucosal involvement is rated according to the following scale.
  • the CMDBS was dissolved in distilled water, the
  • the treatments are carried out orally, 1 hour before ethanol and 45 minutes afterwards in a volume of 5ml / kg.
  • TLB trinitrobenzene sulfonic acid
  • mice Groups of 6 male Sprague Dawley rats, weighing approximately 200 g, are placed in a young water tank 24 hours before the test. On the day of the test, the animals are anesthetized with pentobarbital (30 mg / kg) intraperitoneally. 20 mg of TNB dissolved in 0.25 ml of 50% ethanol are instilled into the colon 6 cm from the anus. The animals are put back in their cage after waking up with unlimited food and drink.
  • the animals are sacrificed and the colon is removed. 30 minutes before the sacrifice, 1 ml of Evans Blue is administered by venous route to evaluate the edema accompanying colitis according to the following protocol: The colon is placed in a tube containing 9 ml of formamide. After centrifugation, the supernatant is removed and a spectrometric assay is carried out at 620nm wavelength.
  • CMDBS was dissolved in 0.5% carboxymethylcellulose.
  • the treatments were carried out intrarectally in a volume of 1 ml / kg, 4 hours before the TNB 1 time per day until the sacrifice of the animal.
  • the CMDBS has an anti-inflammatory effect as shown by the count of inflammatory cells revealed by Evans blue staining. 300 ⁇ g of CMDBS per kg halve this coloration (p ⁇ 0.05).
  • the rats are anesthetized by intraperitoneal injection of sodium pentobarbital (0.1 ml / 100 g for healthy rats and 0.05 ml / 100 g for diabetic rats).
  • sodium pentobarbital 0.1 ml / 100 g for healthy rats and 0.05 ml / 100 g for diabetic rats.
  • Three dermo-epidermal skin defects are practiced on either side of the spine using a 6 mm diameter cookie cutter.
  • PBS.ia.PBS for 2 hours at room temperature before being placed in each wound.
  • OPSITE occlusive dressing
  • Rats are placed in individual cages with unlimited food and water. Each experimental condition includes lots of 6 to 10 animals. The scarring process is considered at variable times expressed in days (Dx) after the date of the operation (D0).
  • the wounds of healthy rats are treated with collagen dressings soaked in a physiological solution containing or not CMDBS-AM6 at 50 ⁇ g / ml.
  • Tissue samples are placed for 24 to 48 hours in an excess of fixative (4% paraformaldehyde, 0.1% glutaraldehyde, 5% sucrose, 100 mM PBS, pH7) then gradually dehydrated before being included in Paraplast Plus (Prolabo). 5 mm sections are made with a paraffin microtome (Reichert-Yung) and stained with Masson trichrome (GABE, 1988).
  • fixative 4% paraformaldehyde, 0.1% glutaraldehyde, 5% sucrose, 100 mM PBS, pH7
  • Paraplast Plus Prolabo
  • 5 mm sections are made with a paraffin microtome (Reichert-Yung) and stained with Masson trichrome (GABE, 1988).
  • FIGS. 8A to 8F report this histological study of skin healing on D6 post-operatively (staining of sections with Masson's Trichrome).
  • Figures 8A to 8C show the wounds treated with CMDBS (50 ⁇ g / ml) and Figures 8D to 8F show the wounds treated with the vehicle alone. These figures show an inequality in the quality of the granulation tissue. There is a more mature aspect of the scar (Fig.8A, x4) compared to the control (Fig.8D, x4). An enlargement (x25) of the epidermal region shows a reconstitution of the latter in both cases (Fig. 8B and 8E x25).
  • the wound treated (Fig. 8C x25) with CMDBS shows the presence of fibroblasts (arrow) which begins to orient and which produce a matrix in a larger quantity than in the wound witness.
  • the inflammatory cells in the wounds treated with CMDBS are in a limited number compared to the control (Fig. 8F x25) which shows the persistence of important inflammatory phenomena.
  • EXAMPLE 8 Demonstration of the matrix metalloproteinase activities extracted from the skin tissues during healing.
  • Skin tissue samples are taken according to the same protocol and the same experimental conditions as those presented in the previous example.
  • the wounds of healthy rats are treated with collagen dressings soaked in a physiological solution containing or not CMDBS-AM6 at 50 ⁇ g / ml.
  • C The skin taken on D0 is called a control (C).
  • Dx The sample taken on day x (Dx) at the same location according to the original contours is called wound (P).
  • C and P are always treated at the same time and according to the same protocol.
  • Each sample is sprayed for one minute in a liquid nitrogen mill (Bioblock).
  • the powder is weighed and mixed in a 100 mM phosphate buffer pH 7.4, 1M NaCl (1 ml per 100 mg of powder).
  • the whole is homogenized with Ultra-turax for 30 seconds, left for 1 hour at 4oC then centrifuged at 43700g (Beckman J2-21) at 4 ° C for 30 minutes.
  • the volume of the supernatant is measured and then aliquoted before being stored at -80 ° C.
  • the pellet, weighed, is stored at -80 ° C.
  • the extracts obtained from shredded skin, scar tissue or not are deposited on 10% polyacrylamide gels containing 1 mg / ml of gelatin (Sigma, ref G2500). After migration in Laemmli buffer, the proteins deposited on gels are renated with a 100 mM Tris-HCl solution, pH 7.4 containing 2.5% of triton x100 (2 times 30 minutes). The Triton is removed by two washes in 100 mM Tris-HCl buffer.
  • the electrophoresis gels are incubated at 37 ° C for 48 hours in a 100 mM Tris-HCl buffer containing 10 mM CaCl2, 0.001% NaN3, 0.0015% Brij 35, 1 mM ZnCl2. After carefully removing the incubation buffer, the gels are stained for 20 minutes with stirring with a Coomasie R250 solution (5mg / ml) containing acetic acid (10%), propanol-2 (30%), then discolored (acetic acid 10%, methanol 40%), up to '' with visualization of the bands. The gels are photographed.
  • the samples are incubated in the presence of specific inhibitors; Phenyl methyl sulfonyl fluoride or PMSF (2 mM final) inhibitor of serine endopeptidases, ethylenediaminetetraacetic acid or EDTA (20 mM final) inhibitor of metalloendopeptidases, N-ethyl maleimide or NEM (2 mM final).
  • specific inhibitors Phenyl methyl sulfonyl fluoride or PMSF (2 mM final) inhibitor of serine endopeptidases, ethylenediaminetetraacetic acid or EDTA (20 mM final) inhibitor of metalloendopeptidases, N-ethyl maleimide or NEM (2 mM final).
  • FIG. 9 shows the expression of the matrix metalloproteinases detected in the extracts of wounds as a function of the treatment or not with the CMDBS and as a function of the healing time.
  • Tracks 1.12 represent healthy skin which serves as an internal witness to migration.
  • Lanes 2, 3, 4 and 13, 14, 15 represent the extracts obtained from scars treated with CMDBS at a rate of 50 mg / ml (6 different rats).
  • Tracks 5 to 11 and 16, 17 represent the corresponding witnesses. Each track represents a different rat.
  • Two types of collagenases are found in healthy skin: The 72 kDa form and its activated form 68 kDa.
  • 92 kDa is present identically. The difference is in the expression levels of 72 kDa and its activated form, 68 kDa.
  • D5 and D6 in wounds treated or not with CMDBS, 92 kDa is present identically. The difference is in the expression levels of 72 kDa and its activated form, 68 kDa.
  • the 72 kDa and the 68 kDA are expressed very significantly compared to the wounds treated with CMDBS.
  • this difference is confirmed since for the same protein deposition as on D5, the activity of collagenases is such that lanes 16 and 17 appear in the form of two white traces. This activity which does not exist in rats treated with CMDBS.
  • CMDBS therefore modulates the expression levels of MMPs either directly or indirectly through their inhibitory role on plasmin, which is one of their activators.
  • HSS Heparans Sulfates purified from Sulodexide TABLE 5

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Abstract

Utilisation d'au moins un polymère ou un biopolymère, appelés HBGFPP, protégeant spécifiquement les facteurs de croissance des familles des FGF et TGFbêta de la dégradation trypsique et n'inhibant pas de manière significative la coagulation, pour la fabrication d'un médicament pour le traitement des inflammations.

Description

utilisation des polymères protégeant des facteurs de croissance pour le traitement de l'inflammation
La présente invention a pour objet l'utilisation de polymères ou de biopolymères pour la préparation d'un médicament pour le traitement de l'inflammation.
Elle est en outre relative a une composition contenant ces polymères et destinée à un tel traitement.
L'inflammation est une manifestation particulièrement complexe qui s'installe à la suite d'une lésion tissulaire spontanée ou traumatique. Caractérisée par une modification de la perméabilité capillaire, elle s'accompagne d'une infiltration de composants sanguins, moléculaires et cellulaires, qui se manifeste généralement par des érythèmes et des oedèmes. De nombreux médiateurs chimiques sont libérés ou activés pendant ce processus au cours duquel des éléments du sang, en particulier des globules blancs s'accumulent et relarguent différentes activités lytiques. De nombreuses substances sont employées comme agents anti-inflammatoires. Elles peuvent grossièrement être classées en agents stéroïdiens et non stéroïdiens.
Les facteurs de croissance appartenant à la famille des Heparin Binding Growth Factors (HBGF) sont naturellement relargués dans le cas d'une lésion ou d'un traumatisme tissulaire soit directement par ces tissus au niveau de leurs cellules constitutives , à partir des éléments de la matrice extracellulaire qui représente un site de stockage naturel de ces molécules, soit par les cellules circulantes et en particulier les cellules de l'inflammation. La réaction inflammatoire s'accompagne d'une augmentation locale des concentrations en facteurs de croissance dont certains appartiennent à la famille des HBGF.
Le sucrose sulfate ester et son sel d'aluminium le sucralfate sont des produits décrits et utilisés comme agents anti-inflammatoires (Brevet US N°3,432,489) et dans différentes associations et compositions pharmaceutiques décrites dans une série de brevets (US 4.975.281, 4.885.281, US 5.013.557, US 5.164.379, US 5.196.405, US 5.240.710 et DK 102.488 et DK 505.588).
D'autres composés ont été décrits comme des agents anti-inflammatoires: la suramine, composant organique sulphonaté par LAROCCA R et coll. (US 7479817), des compositions contenant des mélanges de bas poids moléculaires de l'héparine par COHEN IR et coll. (W09219249), des fragments d'héparine présentant des effets inhibiteurs du système du complément par EKRE H P et coll. (WO9202232), des produits dérivant par modifications chimiques de protéines glycosylées par MIYAZAKI K et coll. (EP454898), des protéoglycanes heparane sulfate comme le syndecan par BERNFIELD M et coll. (WO9305167), des oligosaccharides dérivés de dermatanes sulfates par BIANCHINI P et coll. (WO9305075).
Une composition contenant en association de l'héparine et du sulodexide, qui est un mélange de polymères comprenant des glycosaminoglycanes (GAG), a d'autre part été étudiée pour son action dans le traitement de traumatismes légers (Dragani et al., 1989, Minerva Medica, 80, n°4, 397-403). Néanmoins ces deux composés n'ont pas été testés séparément.
Il n'est donc pas possible de déterminer si l'un de ces deux composés est responsable de l'activité thérapeutique.
L'activité d'un autre mélange de glycosaminoglycanes, le mésoglycan, sur les hémorroïdes a été testée par Saggioro et al., (1985, Min. Diet. e. Gastr, 31, 311-315). Il ressort de cette publication que le mésoglycan est très efficace à l'encontre des hémorroïdes et permet d'éliminer les symptômes tout en améliorant l'aspect endoscopique.
Néanmoins cette publication est limitée à des polymères d'un type bien particulier, qui de plus présentent une composition d'origine animale mal définie et sujette à des variations.
La synthèse d'une autre famille de polymères, appelés CMDBS (Carboxy Méthyl Dextrane Benzylamine Sulfonate) a été décrite dans le brevet FR 2 461 724 ainsi que dans le brevet US 4 740 594. Certains de ces polymères miment l'héparine et peuvent être utilisés en tant que produits de remplacement de l'héparine du plasma, grâce à leurs propriétés anticoagulante et anticomplément.
Parmi l'ensemble des polymères CMDBS, certains miment une autre propriété de l'héparine qui consiste en une stabilisation, protection et potentialisation in vitro de l'activité biologique des facteurs de croissance de la famille FGF . (Tardieu et coll , Journal of Cellular Physiology, 1992, 150 pages 194 à 203).
Le brevet FR 2 644.066 décrit l'utilisation de certains CMDBS associés aux FGF pour la cicatrisation de la peau et de la cornée. Des expériences ont été réalisées en provoquant une blessure cutanée à l'aide d'un emporte pièce de 6 mm de diamètre chez le rat. Dans cet exemple, le CMDBS associé au FGF 2 permet d'obtenir un effet net sur la vitesse et la qualité de la réparation de la peau.
Il ressort donc de l'analyse de l'état de la technique que des polymères de type CMDBS ont déjà été utilisés en association avec des facteurs de croissance sur certaines lésions d'un type bien précis de tissu, le tissu cutané.
Du fait de l'imprévisibilité des effets thérapeutiques d'une molécule donnée, il n'était pas évident que ces polymères, seuls , et non associés à des facteurs de croissance, puissent avoir un effet sur d'autres tissus que ceux de la peau.
En effet, il est bien connu que les différents tissus du corps humain ou animal présentent des spécificités tant structurelles que fonctionnelles qui rendent impossible toute prédiction quant à l'effet de la molécule, connue pour son effet sur la cicatrisation du tissu cutané , sur des tissus de diverses origines soumis à une inflammation.
De même , il est bien connu qu'il est impossible de prédire l'activité in vivo d'une molécule sur un tissu particulier à partir de résultats obtenus in vitro sur un modèle expérimental spécifique.
De manière surprenante, il a été trouvé, selon l'invention, que certains polymères définis comme appartenant à la classe des HBGFPP et en particulier des CMDBS avaient un effet sur l'intensité de la réaction inflammatoire qu'ils diminuent de façon très marquée tout en accélérant les processus de réparation, de régénération et de restauration de tissus lésés. A une augmentation de la vitesse et de la qualité de la cicatrisation des lésions des tissus du tractus digestif, des tissus cutanés, des tissus osseux, les HBGFPP associent des effets anti-inflammatoires.
II a en outre été montré que des doses très faibles de ces polymères permettent d'obtenir des effets thérapeutiques.
La présente invention a pour objet une utilisation d'au moins un polymère ou d'un biopolymère, appelés HBGFPP, à l'exclusion du mésoglycan, protégeant spécifiquement les facteurs de croissance des familles des FGF et TGF bêta de la dégradation trypsique et n'inhibant pas de manière significative la coagulation, pour la fabrication d'un médicament pour le traitement des inflammations de divers tissus.
Un tel polymère présente particulièrement une activité anti-coagulante inférieure à 50 unités internationales par mg de polymère mesurée selon Maillet et al (Mol. Immunol, 1988, 25, 915-923). Avantageusement, il potentialise les FGF in vitro. Préférentiellement, il n'active substantiellement pas le système du complément, c'est-à-dire qu'il possède une activité anti-complément supérieure à 0,5 μg pour le CH5O (selon Mauzac et al., Biomaterials, 6, 61-63, 1985).
Selon la présente invention on entend par polymères toutes substances naturelles, naturelles modifiées chimiquement ou totalement synthétiques répondant à la définition donnée ci-dessus.
Ainsi il peut s'agir de :
- polymères obtenus à partir de dextranes mais modifiés par d'autres types de substitutions avec d'autres types de radicaux,
- polymères naturels autres que ceux dérivant de dextranes mais comportant des résidus osidiques (cellulose, chitine, fucanes, etc...),
- polymères obtenus par polymérisation de monomères de natures non osidiques (poly acide malique, poly acide oxalique, poly acide lactique, polystyrène, polyéthylène glycol) modifiés ou non.
Avantageusement, ledit polymère ou biopolymère est un polysaccharide qui peut être composé principalement de résidus glucose.
Il peut aussi comprendre des résidus glucosamine et/ou d'acide uronique, particulièrement sous la forme de dimère glucosamine-acide uronique.
Des polysaccharides particulièrement préférés sont des dextranes substitués, des glycosaminoglycanes éventuellement associés à un lipide, un peptide ou un protide ou des sulfates de ces polymères.
Un tel polymère présente avantageusement un poids moléculaire d'au moins 10 kDa et préférentiellement d'environ 40 kDa.
La présente invention est en outre relative à une composition pharmaceutique contenant ces polymères.
Les polymères et/ou biopolymères peuvent être sélectionnés à partir de substances naturelles qui peuvent ensuite être éventuellement modifiées par additions de groupements chimiques appropriés, ou encore être obtenus entièrement par synthèse . Ces polymères naturels, semi synthétiques ou entièrement synthétiques sont ensuite sélectionnés sur la base de leurs capacités à interagir spécifiquement avec plusieurs facteurs de croissance notamment ceux de la famille des FGF et des TGF bêta. Ils peuvent être également sélectionnés pour leurs capacité à protéger ce ou ces facteurs contre des dégradations protéolytiques, et à agir comme des inhibiteurs d'activités protéinasiques impliquées dans le processus inflammatoire comme l'élastase leucocytaire, et la plasmine par exemple, et pour leur activité anti-coagulante. Ces polymères sont désignés sous le sigle générique de HBGFPP (heparin binding growth factor protectors and promotors). Deux prototypes de ces polymères ou bio polymères sont donnés comme exemples ainsi que les procédés et critères de sélection de ces polymères.
Le premier exemple de HBGFPP appartient à la famille des CMDBS qui sont des produits connus, à savoir des dextranes biospécifiques fonctionnalisés, substitués par des résidus carboxyméthyle, benzylamide et benzylamine sulfonate. Ces polymères illustrent l'obtention de HBGFPP à partir de produits naturels (dextrans) subséquemment chimiquement substitués. Le deuxième exemple décrit la sélection de produits complètement naturels comme les glycosaminoglycanes sulfates purifiés à partir d'extraits tissulaires.
Ces deux exemples illustrent les capacités de ces HBGFPP à d'interagir, à stabiliser, à protéger et à potentialiser les facteurs de croissances des familles FGF et TGF bêta et leur utilisation dans une composition pharmaceutique permettant le traitement d'inflammations de toutes origines.
Les différents exemples décrits dans cette invention montrent qu'en plus des effets cicatrisants propres des CMDBS sur différents types de régénération ou de cicatrisation tissulaire, l'intensité de la réaction inflammatoire locale est très fortement diminuée.
On entend, dans la présente demande, par traitement toute opération curative ou préventive effectuée pour la prophylaxie ou la résorption d'inflammations faisant intervenir en particulier des activités protéinasiques comme l'élastase leucocytaire, la plasmine, les métalloprotéinases en supplément d'effets stimulateurs de la régénération et de la cicatrisation tissulaire.
Les exemples ci-après illustrent une diminution de l'intensité de la réaction inflammatoire observée dans des tissus lésés traités par une fraction efficace de HBGFPP par exemple de CMDBS associé à un ou plusieurs véhicules compatibles et pharmaceutiquement acceptables avec le type de lésion. La composition pharmaceutique peut être également associée à des agents comme par exemple des antibactériens, des antifongiques, des vitamines ou analogues, des antiseptiques, des analgésiques, des agents protecteurs des rayonnements solaires et d'autres agents anti-inflammatoires ou tous autres types de composés associés pour leur effets spécifiques et administrée sous toute formes galléniques pharmaceutiques acceptables et compatibles avec le type de traitement envisagé.
Avantageusement, une telle composition est conçue pour être directement absorbée par voie orale, déposée sur la lésion ou injectée si celle ci est directement accessible notamment dans les lésions sous cutanées, buccales ou rectales ou encore lors des interventions chirurgicales en déposant ou injectant les tissus. La dose unitaire est de 10 à 2500 μg CMDBS ou de HBGFPP par ml ou cm2 de tissu à traiter sous un volume adapté à la spécificité de la pathologie. La dose de produit CMDBS ou HBGFP utilisée correspond selon la surface de la plaie à une fraction d'une solution de départ de 10 à 2500 μg par millilitre (ce qui pour une application locale sur des plaies courantes implique une dépose rarement supérieure à quelques centaines de microlitres de la solution) cette dose étant appliquée une ou deux fois par 24 heures. Les compositions utilisées de sucralfate sont de 0.01 à 5% (selon le brevet US N° 5 196 405 ) soient des concentrations au moins 10 fois supérieures à celles décrites dans la présente invention et les effets décrits dans tous les exemples de ce brevet US Nº5 196405 sont obtenus à partir de compositions 50 milligrammes par millilitre.
Le véhicule peut être du sérum physiologique ou des tampons tels que le PBS contenant NaCl 0.15 molaire ou toute autre sorte de solution compatible et non irritante pour le tissu lésé. Des formulations permettant d'obtenir des solutions pâteuses ou en gel ou en aérosol selon les techniques courantes connues de l'homme de l'art peuvent être proposées selon le type et l'accessibilité de la lésion.
Les domaines d'applications de ces composés correspondent sur un plan thérapeutique ou prophylactique aux pathologies associées aux activités de l'élastase et/ou de la plasmine.
Les principales pathologies associées à une activité de type elastase recouvrent les principaux domaines suivants :
- les lésions cutanées incluant les lèvres, la cavité buccale, la gencive (les maladies parodontales), les muqueuses par exemple vaginale et les surfaces anales pour des éruptions superficielles inflammatoires, pruritiques, érythémateuse, l'acné ou les rosacées comme l'inflammation de type séborrhée ou pustulaire, les furoncles, les abcès;
les infections bactériennes, fungiques, virales du revêtement cutané comme candida ou herpès,
- les dermatites à l'état aigu ou chronique en réponse à différents agents comme les coups de soleil ou brûlures superficielles,
- les réactions inflammatoires en réaction à des corps étrangers comme des pansements, des cathéters et les hémorroïdes;
- les vulvites ou prurits périanaux;
- les pathologies et désordres habituels de la sphère oto-rhino-laryngologique et pulmonaires comme les sinusites ou les rhinites allergiques, aiguës ou chroniques, les otites, les réactions inflammatoires pulmonaires, les oedèmes, les emphysèmes, les fibroses, des réactions secondaires à des bronchites, l'asthme;
- les pathologies oculaires en rapport avec des désordres de l'inflammation des produits de beauté allergisants, les conjonctivites, kératites ponctuées, les ulcères ;
les maladies liées à des désordres immunologiques ou viraux comme les arthrites et la polyarthrite rhumatoïde, les synovites, la goutte et différentes formes d'inflammation arthritiques, le lupus érythémateux, l'anaphylaxie, les septicémies bactériennes, le SIDA;
les maladies parasitaires comme la toxoplasmose, le cytomegalovirus, la malaria, la polyomélyte, etc.;
le traitement des réactions inflammatoires des organes comme les glomérulonéphrities par exemple pour le rein, ou celles associées à des procédures chirurgicales supposant ou non l'implantation de matériaux étrangers à l'organisme;
- les pathologies vasculaires avec notamment les anévrismes athéromateux ou celles liées au vieillissement comme celle de type artériocléromateux.
Les principales pathologies associées aux activités de type plasmine recouvrent en outre les domaines de la progression tumorale et des complications induites.
L'invention sera illustrée, sans être aucunement limitée par les exemples qui suivent, dans lesquels:
La figure 1 représente la formule du CMDBS.
La figure 2 illustre la potentialisation de l'activité biologique des FGF1 (2a) et FGF2 (2b) par l'héparine, le mésoglycan et le sulodexide. La mesure de l'activité biologique est effectuée sur des cellules CCL39 par la mesure de l'augmentation de l'incorporation de thymidine tritiée en fonction de la dose de FGF1 et de FGF2 ajoutée seule ou en présence de 20 μg d'héparine, de 10 μg de mésoglycan, ou de
10μg de sulodexide.
Les figures 3 et 4 illustrent l'effet protecteur de l'héparine, du mésoglycan et du sulodexide contre une dégradation thermique du FGF1(3) et FGF2 (4). Les échantillons de FGF sont incubés seuls ou en présence de 20 μg d'héparine, de 10 μg de mésoglycan ou de 10 μg de sulodexide à 20°C (a) et 37°C (b) pendant 1, 7, 15, 30 jours. La mesure de l'activité biologique présentée en abscisse correspond aux valeurs des unités de stimulation (ED50) de l'incorporation de thymidine tritiée dans des cellules CCL39.
La figure 5a illustre l'effet protecteur de l'héparine, du mésoglycan et du sulodexide contre une dégradation proteolytique du 125I-FGF1. La digestion protéolytique a été effectuée à 37 "C et les échantillons ont été séparés par électrophorèse sur gel de polyacrylamide à 18% . Les gels sont séchés et autoradiographies. La première piste contient le 125I-FGF1 seul, dans la deuxième (piste 2) le 125I-FGF1 est incubé en présence de trypsine et d'héparine (piste 3), de mésoglycan (piste 4) ou de sulodexide (piste 5).
La figure 5b illustre l'effet protecteur de l'héparine, du mésoglycan et du sulodexide contre une dégradation protéolytique du 125I-FGF2. La disposition des pistes est identique à celle présentée pour le 125I-FGF1 en 5a.
Les figures 6A et 6B sont des profils d'élution sur colonne de DEAE-Trisacryl respectivement des fractions HSM (Fig.6A) et HSS (Fig.6B), en présence de fractions chondroïtines sulfates (CSA) pour le calibrage de la colonne.
Les figures 7A et 7B représentent respectivement des tissus osseux présentant une inflammation traitée par un pansement de collagene imbibé de sérum physiologique (7A), et le même pansement imbibé de CMDBS (7B).
Les figures 8A à 8C d'une part et 8D à 8F d'autre part représentent respectivement des coupes de plaies cutanées traitées avec du collagene imbibé de CMDBS et du collagene imbibé d'une solution physiologique.
La figure 9 illustre l'expression de métalloprotéinases à J = 5 (pistes 1 à 11) et J = 6 (pistes 12 à 17) dans des tissus sains (pistes 1 et 12), des tissus cicatriciels traités par le CMDBS ( ppstes 2 à 4 et 13 à 15), et des tissus cicatriciels traités par de la solution physiologique (pistes 5 à 11, 16 et 17).
EXEMPLE 1: Préparation et sélection des CMDBS
a) Préparation des CMDBS
Les CMDBS sont des dextranes substitués par des groupements carboxymethyl, benzylamide et benzylamide sulfonate. La méthode de synthèse des CMDBS peut être celle décrite par M.MAUZAC et J.JOSEFONVICZ dans
Biomaterials 1984,5,301-304.
Selon ce procédé, le carboxyl méthyle dextrane
(CMD) est préparé à partir de dextrane par substitution de quelques unités glycosylées avec des groupes carboxyliques sur le carbone en position 5 ou
6.
Dans une deuxième étape, la benzylamide est couplée aux groupes carboxyliques pour former le carboxyméthyl-benzylamide dextrane (ou CMBD). Enfin quelques noyaux aromatiques du benzylamide sont sulfones pour aboutir au carboxymethyle dextrane benzylamide sulfonate ou CMDBS.
Les sels de sodium de ces dérivés sont ultrafiltrés, lyophilisés et dissous dans le tampon approprié avant utilisation.
La formule générale des CMDBS est représentée sur la figure 1.
Les CMDBS possèdent une distribution statistique des différents substituants. Les pourcentages pour chaque type de CMDBS sont déterminés par les méthodes classiques,
b) Sélection des CMDBS
i:Tests de protection et de stabilisation des FGFs
Lors de la synthèse des CMDBS il est possible de contrôler le taux de substitution de chacun des groupements par modification des conditions de la réaction de substitution. Le contrôle des paramètres comme la température, le temps de réaction, les concentrations relatives des constituants et le nombre de réaction de substitution etc..permettent d'obtenir un très grand nombre de polymères substitués. La substitution des hydroxyles par le carboxymethyl sur les carbones en position 5 et 6 permet d'obtenir des taux de carboxyméthylation allant de 0 à 200% (100% pour chacun des carbones en position 5 et 6). Le groupement carboxymethyl peut être à son tour partiellement ou totalement utilisé pour la fixation de la benzylamide. Les groupes benzylamides peuvent être partiellement ou totalement utilisés pour la sulfonation. Les dextranes substitués fonctionnalisés utilisés selon l'invention sont parmi ceux spécialement décrits dans le brevet français nº2.461.724. Outre la capacité à stabiliser et protéger les facteurs de croissance de la famille FGF comme décrit dans la publication de Tardieu et coll J.Cell.Physio.1992 150 p 194 à 203 ; et dans le brevet Français N°2.461.724; le CMDBS sélectionné doit pouvoir interagir avec au moins un membre de la famille des facteurs de croissance de la famille TGF bêta selon une méthode d'évaluation décrite ci-dessous et protéger les TGF bêta contre une protéolyse. ii: Evaluation des capacités d'interactions entre CMDBS et les facteurs de croissance de la famille TGF bêta.
Afin de mesurer la capacité de certains CMDBS à interagir avec les membres de la famille TGF bêta et de par cette interaction protéger les TGF bêta, un test de criblage a été établi. Ce test consiste à mesurer la capacité du CMDBS sélectionné à permettre au TGF bêta de garder son activité biologique malgré un traitement protéasique.
Dans l'exemple ci dessous le CMDBS utilisé est le lot 26.2 défini par un taux de substitution de 110% de motifs carboxyméthyles, 3,6% de motifs benzylamides et 36,5% de motifs sulfonates et possède une activité anti coagulante de 4 Ul/mg (Unités Internationales).
L'activité anti-complément de ce lot est de 1,1 μg de
CH50, mesurée selon Mauzac et al (précédemment cités).
L'héparine utilisée comme témoin provient des établissements Sanofi. (Institut Choay) et présente une activité anticoagulante de 175 Ul/mg
Le TFG bêta 1 est préparé à partir de plaquettes sanguines humaines selon le protocole décrit dans de nombreuses publications et couramment utilisés par l'homme de l'art, par exemple dans la publication Growth Factors and their Receptors 1992 , vol. 1 PP 419-472 par A. Roberts et M.Sporn édité par A. Roberts et M.Sporn et publiée par Springer Verlag Berlin. Le test d'activité biologique du TGF bêta utilisé dans cet exemple est celui de l'inhibition de croissance des cellules CCL64 (provenant de l'Ame'ican Tissue Culture Collection). Cette inhibition est mesurée par la capacité du TGF b à inhiber l'incorporation de Thymidine tritiée d'une manière dose dépendante dans ces cellules CCL64 stimulées par le facteur de croissance FGF ou par du sérum de veau foetal selon le protocole décrit par Van Zolen dans Progress in Growth Factor Resarch, 1990 ,2 p. 131 à 152. Le TGF bêta est utilisé à deux doses, l'une correspondant à la capacité d'inhibition de 50% de l'incorporation de Thymidine tritiée (définie comme l'unité d'activité inhibitrice) l'autre, correspondant à la capacité d'inhibition de 100%. Dans cet exemple les valeurs obtenues sont de 250 pg de TGF bêta pour obtenir l'unité d'activité d'inhibition sur les cellules CCL64 cultivées dans 1 ml de milieu de culture. Le 100% d'inhibition est obtenu avec lng de TGF bêta dans 1 ml de milieu de culture.
Un échantillon de 50ng de TGF bêta dans du tampon phosphate salin contenant 0.1% de sérum albumine bovine (provenant de la société SIGMA à Saint Louis USA) est incubé seul, ou associé soit à 5000 ug de CMDBS, soit à 5000 μg d'héparine, avec ou sans 500 μg de trypsine. Le volume final de la solution incubée est ajusté à 1 ml et l'incubation est effectuée à 37°C durant un temps variable (10 minutes dans l'exemple décrit tableau 1).
Des échantillons d'un volume de 20 μl de chacune des réactions d'incubation sont prélevés et ajoutés aux cellules CCL64 cultivées dans des plateaux de 24 puits contenant chacuns un millilitre de milieu de culture selon le protocole décrit par E.Zohlen mentionné ci dessus. Dans ces conditions la concentration finale de TGF bêta par puits est de 1ng/ml. La tableau 1 résume les résultats obtenus dans diverses conditions et montre l'effet protecteur du CMDBS. Ainsi après 10 mn d'incubation à 37°C, 75% de l'activité biologique du TGF bêta est encore présente, alors que l'héparine qui pourtant peut se fixer au TGF bêta (Mac Caffrey et al., J. of Cell Physiology, 1992, vol.52, 430-440) ne protège pas le TGF bêta contre cette dégradation protéolytique (il reste moins de 20% d'activité biologique). Il est à rappeler que dans le cas des FGFs l'héparine assure une protection contre la protéolyse induite par la trypsine. (Tardieu et al.. Journal of Cellular Physiology, 1992, 150: 194-203).
II a été vérifié que le CMDBS n'avait pas de pouvoir inhibiteur sur l'activité de la trypsine (tableAU 2). Ainsi,10 μg de trypsine ont été incubés soit avec un substrat (S.87 fourni par la société Serbio, Paris et utilisé selon les recommandations de ce fournisseur) ou soit avec ce substrat et un inhibiteur de la trypsine tel celui provenant du soja (comme le Soyabean trypsin inhibitor ou STI de chez Sigma) ces incubations étant faites en l'absence ou en présence de quantités variables de CMDBS (lot AM26). L'activité enzymatique de la trypsine a été mesurée par absorption spectrophotometrique du produit de transformation du S 87 en fonction du temps d'incubation.
Exemple 2: Sélection d'autres HBGFPP :
Une préparation commerciale de protéoglycosaminoglycane et glycosaminoglycanes, le sulodexide a été sélectionnée selon sa capacité à interagir avec les facteurs de croissance de la famille des FGF ainsi qu'avec ceux de la famille des TGF bêta.
Des préparations d'héparane sulfate obtenues par fractionnement du mésoglycan et du sulodexide ont d'autre part été testées.
Le mésoglycan et le sulodexide ont été fournis par la Société Sigma Chemical Co , Saint Louis MO USA. Leurs propriétés sont résumées dans le tableau 3.
Les cellules utilisées dans cet exemple sont les cellules CCL39 qui proviennent de l'American Tissue Culture Collection. Les conditions de culture et de tests de mesure d'activité biologique des FGFs sont les mêmes que celles décrites dans la publication Tardieu et coll J.Cell.Physiol. 1992. Les facteurs de croissance FGF utilisés sont les formes recombinantes FGF1 et FGF 2.
a) Effet du sulodexide sur l'activité biologique des FGFs in vitro.
Dans ces expériences le FGFl ou 2 est utilisé à une dose correspondant à la dose efficace (notée ED50) pour induire une stimulation de l'activité biologique de 50% de la dose induisant la stimulation maximale. L'activité biologique est mesurée par la capacité d'induire une augmentation de l'incorporation de thymidine tritiée dans les cellules selon les protocoles largement décrits dans de nombreuses publications dont celle de Tardieu et coll mentionnée précédemment et également dans le brevet français N°2 644 066.
Dans cet exemple 1ΕD50 est de 5 ng/ml pour le FGFl et de 3 ng/ml pour le FGF 2, valeurs mesurées expérimentalement (Figs.2a et 2b). La même expérience de stimulation en fonction de la dose de FGF est effectuée en présence de 10 μg/ml de Sulodexide ou 20 ug/ml d'Héparine. La figure 2 montre que dans ces conditions 1ΕD50 devient 0.4 ng/ml et 0.2 ng/ml respectivement pour les FGF1 et FGF2 en présence de ces doses de Sulodexide ou d'Héparine. Outre cette capacité à potentialiser l'activité biologique des FGFs les HBGFPP protègent les FGFs contre les dégradations thermiques ainsi que contre l'inactivation induite par l' action protéolytique de la trypsine. (Figs.4 et 5). De la même manière ces HBGFPP protègent FGF1 et 2 contre une inactivation induite par l'activité protéolytique de la trypsine (Figs.5a et 5b).
b) Effets protecteurs du sulodexine, du dextrane, du dextrane sulfate et de la sucrase vis-à-vis des TGFbêta.
Plusieurs autres composés ont été évalués : le dextrane sulfate (Sigma Chemical, de poids moléculaire 40.000, le dextrane ayant servi à la synthèse du CMDBS (également de chez Sigma) de la sucrase ou sucrose octasulfate (fournie par D. Bar Shalom, Société BUKH MEDIC, au Danemark). Certains de ces composés ont été choisis car ils protègent et stabilisent les FGF tels que la sucrase se confère au brevet US N° 5202311 ou le dextrane sulfate se confère au brevet japonais n° 138 907/88). Le dextrane est celui qui a servi a la synthèse du CMDBS AM26.
L'expérience de protection de l'activité biologique des TGFbêta a été réalisée de la même manière qu'avec les CMDBS ainsi que décrit dans l'exemple 1 ii. Le mélange d'incubation contient 50 ng de TGF bêta (dans 0.1 % d'albumine sérique de bovin) et de la trypsine (500 μg). Le Mésoglycan ou le Sulodexide ou le dextran sulfate ou le dextran ou la sucrase sont utilisés à la dose de 5000 μg.
L'activité biologique du TGFbêta est mesurée comme décrit ci-dessus après une dilution de 50 fois et en utilisant des cellules CCL64.
Les résultats sont présentés dans le tableau 4. Ces résultats illustrent que, comme certains
CMDBS capables de répondre aux deux critères de sélection vis-à-vis des FGF et TGFbêta, le sulodexide présente une activité protectrice significative pour les TGFbêta.
c) Isolement de la fraction Héparane Sulfate du Sulodexide et du Mésoglycan
Le Sulodexide et le Mésoglycan correspondent à des mélanges de plusieurs substances dont l'essentiel est constitué de différents glycosaminoglycanes (GAG).
Par une première étape de purification, il a été établi qu'un gramme de produit sec de chacun de ces deux produits contenait respectivement 874 mg pour le mésoglycan et 795 mg pour le sulodexide de GAG totaux.
Cette purification a été obtenue en soumettant ces produits solubilisés à une chromatographie échangeuse d'ions (DEAE - Trisacryl) pour enlever tous les contaminants protéiques. Les GAG totaux ont alors été purifiés en éluant le gel de DEAE avec une solution d'acétate de sodium, pH 4, contenant 1,5 M NaCl.
Après une phase de dialyse extensive contre de l'eau, 60 mg de chaque produit de GAG ont été digérés par la chondroïtinase ABC pendant une nuit à 37ºC ( l unité par mg de GAG). Cette enzyme dégrade tous les GAG à l'exclusion des héparanes sulfates (HS). Les produits de digestion ont été soumis à une chromatographie sur tamis moléculaire (G50 Sephadex, colonne de 1,8 × 95 cm). L'élution est ensuite réalisée en tampon bicarbonate d'ammonium sous un débit de 18 ml/h. Le matériel non digéré qui correspond à des GAG de nature HS est collecté dans le volume mort d'elution de la colonne.
Les concentrations en GAG sont calculées à partir de leur contenu en acide uronique par la méthode au carbazole (Bitter T. et Muir H.M., 1962, Anal. Biochem 4, 330-334).
Ces dosages ont permis de préciser la composition suivante de chacun des produits:
Sulodexide Mésoglycan GAG totaux 79 % 87 % Fraction Héparane Sulfate (HS) 48 % 52 % Autres GAG 31 % 35 %
Les fractions HS de chacun de ces deux produits ont été chromatographiées à nouveau sur un gel de DEAE Trisacryl. 1 mg de chaque fraction HS, purifiée à partir du mésoglycan (Fig. 6A) ou du sulodexide ( Fig. 6B), dans 3 ml a été déposé sur une colonne équilibrée avec du tampon 0,05 M NaCI, 0,05 M TMS-Hel pH 7,5. Après un lavage de la colonne par 10 volumes du même tampon suivi d'un lavage par 10 volumes d'un tampon 0,05 M NaCI, 0,05 M d'acétate de sodium pH 4, le matériel fixé à la colonne est désorbé par un gradient salin allant de 0,05 M NaCI à 1,5 M NaCI dans le même tampon acétate. 1 ml de chaque fraction collectée a été dosé par la méthode au carbazole.
Le matériel correspondant aux constituants HS de chacun des produits d'origine présente approximativement le même profil d'elution et donc à peu près la même charge apparente. Ce maximum du pic d'elution est obtenu pour une concentration saline de 0,94 M NaCI. Une fraction définie de chondroïtine sulfate (CSA) a été soumise au même protocole en vue de calibrer la chromatographie. Cette fraction CSA qui ne contient qu'un groupe sulfate par disaccharide est élue à la force ionique de 0,72 M NaCI.
Ces résultats montrent que la fraction HS contient plus de groupements sulfates que les CSA de référence. La fraction HS présente environ deux groupes sulfates par unité dissacharidique.
Ces fractions ont été testées pour connaître leur pouvoir protecteur vis-à-vis du TGF β et du FGF en comparaison des pouvoirs établis avec les produits bruts respectifs.
Evaluation semi-guantitative des effets protecteurs du FGF par différents polymères.
Comme décrit ci-dessus, une quantité constante de FGF radioactif est incubée dans des conditions différentes. Après autoradiographie des produits de la réaction, la quantité de FGF radioactif non dégradé est quantifiée par densitométrie. Les valeurs correspondent au pourcentage de FGF radiomarqué retrouvé par rapport à la quantité déposée en début de réaction. (Tableau 5).
Les résultats des tableaux 4 et 5 montrent que les fractions HSM et HSS issues respectivement du mésoglycan et du sulodexide présentent des effets protecteurs supérieurs à ces deux compositions et proches de 100%.
EXEMPLE 3: Effets inhibiteurs in vitro des CMDBS et des glycosaminoglycanes sur l'activité de l'élastase leucocytaire et sur la plasmine.
Les pouvoirs d'inhibition de différents CMDBS et de leurs composés intermédiaires de leur synthèse, ont été établis pour l'élastase leucocytaire et la plasmine.
L'élastase leucocytaire purifiée a été obtenue par Elastin Products Co (Owenville, MO, USA) et la plasmine chez SIGMA.
L'inhibition des activités enzymatiques par ces différents composés est effectuée à 37ºC dans un bain thermostaté. Les enzymes considérées sont mises en solution dans un tampon Tris-HCL 100 mM, pH8 pour l'élastase et pH 7,4 pour la plasmine, en présence de 0,02% d'azide de sodium et de 0,01% Triton X100 pour la plasmine. Les concentrations des substrats et celles des enzymes. sont : 0,10 mM MeO-Suc-Ala-Ala-Pro-Val-pNA (paranitroanilide) pour l'élastase à 8,3 nM et 0,20 mM dVal-Leu-dLys-pNA pour la plasmine à 77 nM. Pour chacune des conditions est établi l'IC50.
Le tableau 6 donne les résultats obtenus dans lesquels, le lot AM6 correspond à un dextrane T40 de 40 000 kD. Le lot EM5 correspond à un dextrane T10 de 10 000 kD. Les produits intermédiaires de synthèse sont répertoriés d'après les sigles désignés ci-dessus indexés d'un numéro qui précise le nombre de chacune des réactions de substitution.
Les valeurs des IC50 démontrent que les CMDBS ont des effets inhibiteurs de type hyperbolique non compétitif sur l'activité de l'élastase leucocytaire comparables à ceux de l'héparine, l'un des meilleurs inhibiteurs de cette activité (Ki de l'ordre de 1 nM). Les CMDBS exercent de plus et à l'inverse de l'héparine des effets inhibiteurs sur la plasmine.
Il ressort en outre du tableau 6 que les effets inhibiteurs des fractions HSM et HSS sont supérieurs à ceux du mésoglycan et du sulodexide, respectivement. EXEMPLE 4: Effet anti-inflammatoire des CMDBS dans le tissu osseux.
Afin d'étudier l'effet anti-inflammatoire des CMDBS dans le tissu osseux on a utilisé un modèle de régénération de l'os calvaria chez le lapin. Après avoir effectué une découpe de cet os dans sa demi épaisseur on a comparé la réaction inflammatoire dans le tissu de granulation en présence ou en absence de CMDBS.
Des lapins adultes blancs de la race New Zealand ayant fini leur croissance osseuse et pesant 3 à 4 kg sont répartis en 2 groupes de 8 lapins des deux sexes . Ces lapins ont été anesthésiés par injection intrapéritonéale d'hydrochloride kétamine (100 mg/kg) et d'acépromazine (100 mg/kg). Une incision paramédiane fronto-pariétale a été réalisée pour accéder à la calvaria. Quatre défauts osseux de 5 mm de diamètres et 3 mm de profondeur ont été réalisés à l'aide d'une fraise . Durant l'intervention, le côté opéré a été constamment irrigué pour éviter des accidents thermiques. Les deux régions céphaliques n'ont pas été comblées et de ce fait, servent de contrôle alors que les côtés postérieurs gauche et droit sont comblés avec du collagene (collagene hémostatique microfilaire (Pangen) provenant des laboratoires Fournier Dijon, France) ou du collagene imprégné la nuit dans une solution de CMDBS à 100 μg/ml. Une hémostase appropriée a été réalisée avant de procéder à la suture de la plaie. Les plaies sont refermées avec du fil en nylon de suture et le côté opéré est recouvert d'un pansement stérile. Les animaux ont été laissés en convalescence et aucune complication post-opératoire n'a été constatée. Les animaux ont été euthanasiés aux jours 3, 4, 8 et durant les 12 semaines qui ont suivi l'intervention. Tous les animaux ont reçu un traitement identique et ont servi pour leur propre contrôle. Après examen macroscopique du site de l'opération, les crânes sont décalcifiés et inclus dans de la paraffine. Le côté opéré a été étudié au microscope pour être mis en culture. Après que les modèles soient décalcifiés et posés dans de la paraffine, des sections sagittales (5 mm d'épaisseur) des zones correspondants aux défauts ainsi créés ont été découpées à l'aide d'un microtome et colorées à l'hématoxylin et à l'éosine. Ces coupes sont étudiées au microscope et les défauts ont été 100 fois grossis, en utilisant une grille de 2,5 × 2.5 mm normalisée par 10 divisions de 0,25 mm de chaque côté. Ces mesures ont été ensuite rapportées sur un graphique pour comparer les résultats suivant les différents groupes traités.
Dans ce travail, on a utilisé le CMDBS ,lot
AM26, dont le contenu en acide méthylcarboxylique est de 110 %, celui en benzylamide de 2,5 % et en benzylamide sulfoné de 36,5% . L'activité anticoagulante spécifique de ce CMDBS est 4 IU/mg comparé à l'héparine standard (échantillon nº108, Sanofi-Choay Recherches, Gentilly, France) qui a une activité anticoagulante de 173 IU/mg.
Les figures 7A et 7B montrent la différence de la réaction inflammatoire observée après 3 semaines dans le tissu de granulation correspondant au comblement du défaut osseux réalisé expérimentalement.
Dans la figure 7A qui correspond au pansement de collagene imbibé uniquement de sérum physiologique, la réaction inflammatoire est très forte; le tissu de granulation contient un grand nombre de cellules inflammatoires et peu de cellules ostéoblastiques .
Par contre, le même traitement avec un collagene imbibé de la solution de CMDBS a fait régresser très nettement cette réaction inflammatoire, favorisant la réparation du défaut osseux et démontrant ainsi l'effet antiinflammatoire du CMDBS.
EXEMPLE 5 : Effet anti-inflammatoire du CMDBS sur la mugueuse gastrigue.
Principe
L'administration par voie orale d'1 ml d'éthanol absolu chez le rat provoque dans l'heure qui suit l'apparition de lésions hémorragiques de la muqueuse gastrique.
Méthodes
Des groupes de 6 rats mâles Sprague Dawley, d'environ 200g, sont mis en jeûne hydrique 24H avant l'essai. Le jour du test, 1 ml est administré par voie orale et les animaux sont sacrifiés 1 h 30 après.
L'estomac est prélevé, ouvert selon la grande courbure et rincé.
L'atteinte de la muqueuse est cotée selon le barème suivant.
0: muqueuse normale
1: petites stries roses hémorragiques superficielles
2: stries hémorragiques superficielles rouges, courtes et larges
4: stries hémorragiques superficielles rouges-noires, longues et larges
5: perforation
Traitement:
Le CMDBS a été dissous dans l'eau distillée, la
PGE2 dans l'ethanol à 10% puis dilué dans le soluté physiologique. Les traitements sont effectués par voie orale, 1 heure avant l'ethanol et 45 mn après sous un volume de 5ml/kg.
Expression des résultats Pour chaque lot d'animaux, les valeurs moyennes +/- e.s.m. des scores d'altération ont été calculées. Elles sont présentées dans le tableau 7. La comparaison statistique est effectuée à l'aide du test non paramétrique de White, par rapport au groupe témoin avec une différence significative notée p ≤ 0,01.
Résultats
Comme l'illustrent ces résultats, l'administration d'éthanol absolu induit chez la majorité des animaux l'apparition de larges stries hémorragiques confluentes. Chez les animaux témoins le score d'altération est de 3,75 +/ - 0,17.
Le CMDBS administré per os à la dose de 100 μg/kg (2 fois par jour ) réduit en 24 heures de 56% (p>0,01) la gravité des lésions. Aux doses supérieures l'activité cytoprotectrice n'est pas retrouvée. Le CMDBS exerce des effets comparables à la prostaglandine E2 considérée comme un agent protecteur de la muqueuse gastrique contre des agents topiques irritants qui induisent une réaction inflammatoire intense locale (réduction de 63% des lésions).
EXEMPLE 6 : Effet anti-inflammatoire sur des colites induites par le TNB chez le rat.
Principe:
L'administration intrarectale d'acide trinitrobenzene sulfonique (TNB) entraîne chez le rat l'apparition d'un colite chronique, associée à de graves lésions de la muqueuse produites par une réaction inflammatoire aigûe avec libération de médiateurs (PAF, interleukines, éicosanoïdes), et accompagnée d'un oedème important quantifiable au Bleu d'Evans.
Méthodes.
Des groupes de 6 rats mâles Sprague Dawley, d'environ 200g, sont mis en jeune hydrique 24 heures avant l'essai. Le jour du test, les animaux sont anesthésiés au pentobarbital (30 mg/kg) par voie intraperitonéale. 20 mg de TNB dissous dans 0,25 ml d'éthanol à 50% sont instillés dans le colon à 6 cm de l'anus. Les animaux sont remis dans leur cage après le réveil avec nourriture et boisson à volonté.
4 jours plus tard, les animaux sont sacrifiés et le colon est prélevé. 30 mn avant le sacrifice, 1 ml de Bleu Evans est administré par voie veineuse pour évaluer l'oedème accompagant la colite selon le protocole suivant: Le colon est mis dans un tube contenant 9 ml de formamide. Après centrifugation, le surnageant est prélevé et un dosage spectrométrique est effectué à 620nm de longueur d'ondes.
Traitement:
Le CMDBS a été dissous dans la carboxyméthylcellulose à 0,5%. Les traitements ont été effectués par voie intrarectale sous un volume de 1 ml/kg, 4 heures avant le TNB 1 fois par jour jusqu'au sacrifice de l'animal.
Résultats
Pour chaque lot d'animaux, les valeurs moyennes +/- e.s.m. des scores d'altération ont été calculées. Elles sont présentées dans le tableau 8. La comparaison statistique est effectuée à l'aide du test "t" de variance par rapport au groupe témoin avec une différence significative notée p ≤ 0,05.
Dans cet exemple, le CMDBS a un effet anti-inflammatoire comme le montre le dénombrement des cellules inflammatoires révélées par coloration au bleu d'Evans. 300 μg de CMDBS par kg réduisent de moitié cette coloration ( p ≤ 0,05).
EXEMPLE 7 : Effet sur l'inflammation cutanée chez le rat.
A. Animaux
Les expérimentations ont été effectuées sur des rats mâles Hairless OFA-hr/hr Ico, EOPS, exempts d'organismes pathogènes spécifiques, âgés. ia.EOPS (Exempts d'organismes pathogènes spécifiques); de 9 à 10 semaines (250-300 gr) (IFFA CREDO, France). Ces rats se caractérisent par un système pileux très peu développé dû à un gène récessif hr, défini par le terme "Hairless". Dès réception, les rats sont stabulés et hébergés selon les directives de la Communauté Economique Européenne, décret d'Avril 1986, n° 86/609/CEE.
B. Mode opératoire
Les rats sont anesthésiés par injection intrapéritonéale de pentobarbital sodique (0.1 ml/100 g pour les rats sains et 0.05 ml/100 g pour les rats diabétiques). Trois défauts cutanés dermo-épidermiques sont pratiqués de part et d'autre de la colonne vertébrale à l'aide d'un emporte pièce de 6 mm de diamètre. Des compresses de collagene bovin inactivé
(PANGEN, Fournier) sont découpées à l'emporte pièce, imbibées de la solution à tester ou d'une solution de
PBS.ia.PBS; pendant 2 heures à température ambiante avant d'être déposées dans chaque plaie. L'ensemble est alors recouvert d'un pansement occlusif (OPSITE) gardant le collagene hydraté, puis d'un élastoplaste empêchant le rat de se débarrasser de son pansement.
Les rats sont placés dans des cages individuelles avec eau et nourriture à volonté. Chaque condition expérimentale regroupe des lots de 6 à 10 animaux. Le processus cicatriciel est considéré à des temps variables exprimés en jours (Jx) après la date de l'opération (J0).
C. Traitement des plaies
Les plaies des rats sains sont traitées avec des pansements de collagene imbibés d'une solution physiologiques contenant ou non du CMDBS-AM6 à 50 μg/ml.
D. Prélèvements des plaies
Les lots d'animaux témoins (sans CMDBS) ou traités (avec CMDBS) sont sacrifiés par injection d'un excès de pentobarbital sodique. Les contours de la plaie sont reportés sur un calque, puis la plaie est prélevée à l'aide du même emporte-pièce de la même dimension que celui utilisé à J0 et conservée à -80ºC. Pour l'étude histologique, les pièces sont prélevées en prévoyant un excès de 5 mm de peau non lésée autour des contours d'origine puis placées dans un fixateur dont la composition varie en fonction de l'étude envisagée.
E. Etude histologigue
Les prélèvements de tissus sont placés pendant 24 à 48 heures dans un excès de fixateur (paraformaldéhyde 4%, glutaraldêhyde 0.1%, saccharose 5%, PBS 100mM, pH7) puis déshydratés progressivement avant d'être inclus dans du Paraplast Plus (Prolabo). Des coupes de 5 mm sont réalisées avec un microtome à paraffine (Reichert-Yung) et colorées au trichrome de Masson (GABE, 1988).
Les résultats des observations histologiques sont présentés sur les figures 8A à 8F qui rapportent cette étude histologique de la cicatrisation cutanée à J6 post-opératoire, (coloration des coupes au Trichrome de Masson).
Les figures 8A à 8C présentent les plaies traitées avec du CMDBS (50 μg/ml) et les figures 8D à 8F représentent les plaies traitées avec le véhicule seul. Ces figures montrent une inégalité dans la qualité du tissu de granulation. Il existe un aspect plus mature de la cicatrice (Fig.8A, x4) par rapport au témoin (Fig.8D, x4). Un agrandissemnt (x25) de la région épidermique montre une reconstitution de celle-ci dans les deux cas (Fig.8B et 8E x25).
La différence réside dans la maturation du tissu de granulation : la plaie traitée (Fig.8C x25) avec du CMDBS montre la présence de fibroblastes (flèche) qui commence à s ' orienter et qui produisent une matrice en quantité plus importante que dans la plaie témoin. Les cellules inflammatoires dans les plaies traitées avec du CMDBS sont en nombre restreint par rapport au témoin (Fig.8F x25) qui montre la persistance de phénomènes imflammatoires importants. EXEMPLE 8 : Mise en évidence des activités métalloprotéinases matricielles extraits des tissus cutanés en cours de cicatrisation.
Des prélèvements de tissu cutané sont effectués selon le même protocole et les mêmes conditions expérimentales que ceux présentés dans l'exemple précédent.
Traitement des plaies
Les plaies des rats sains sont traitées avec des pansements de collagene imbibés d'une solution physiologique contenant ou non du CMDBS-AM6 à 50 μg/ml. Les métalloprotéinases matricielles (MMPs) et, plus particulièrement les collagénases 92 kD
(collagènase de type V) et 72 kD ( collagénase de type
IV), sont mises en évidence grâce à la technique du zymogramme.
La peau prélevée à J0 est nommée contrôle (C). Le prélèvement effectué au jour x (Jx) au même emplacement selon les contours d'origine est nommé plaie (P). C et P sont toujours traités en même temps et selon le même protocole.
Chaque prélèvement est pulvérisé une minute dans un broyeur à azote liquide (Bioblock). La poudre est pesée et mélangée dans un tampon 100 mM phosphate pH7.4, 1M NaCI (1ml pour 100 mg de poudre). L'ensemble est homogénéisé à l'Ultra-turax pendant 30 secondes, laissé 1 heure à 4ºC puis centrifugé à 43700g (Beckman J2-21) à 4°C pendant 30 minutes. Le volume du surnageant est mesuré puis aliquoté avant d'être conservé à -80°C.Le culot, pesé, est conservé à -80ºC.
Les extraits obtenus à partir de broyats de peau cicatricielle ou non (25 mg de protéines en tampon non réducteur, non chauffés), sont déposés sur des gels de polyacrylamide 10% contenant 1 mg/ml de gélatine (Sigma, ref G2500). Après migration en tampon de Laemmli, les protéines déposées sur gels sont renaturees avec une solution de Tris-HCl 100 mM, pH 7.4 contenant 2.5% de triton x100 (2 fois 30 minutes). Le Triton est éliminé par deux lavages en tampon Tris-HCl 100 mM. Les gels d'electrophorese sont incubés à 37°C durant 48 heures dans un tampon Tris-HCl 100 mM contenant 10 mM de CaCl2, 0.001% NaN3, 0.0015% Brij 35, 1 mM ZnCl2. Après avoir éliminé soigneusement le tampon d'incubation, les gels sont colorés durant 20 minutes sous agitation avec une solution de Bleue de Coomasie R250 (5mg/ml) contenant de l'acide acétique (10%), du propanol-2 (30%), puis décolorés (acide acétique 10%, méthanol 40%), jusqu'à visualisation des bandes. Les gels sont photographiés. Afin de s'assurer que les différentes bandes de digestion obtenues sont bien dues à des MMPs, les échantillons sont incubés en présence d'inhibiteurs spécifiques; Phényl méthyl sulfonyl fluoride ou PMSF (2 mM final) inhibiteur des serines endopeptidases, l'acide éthylène diamine tétracétique ou EDTA (20 mM final) inhibiteur des métallo-endopeptidases, le N-éthyl maléimide ou NEM (2 mM final).
La figure 9 montre l'expression des Métallo-Protéinases Matricielles détectées dans les extraits de plaies en fonction du traitement ou non par le CMDBS et en fonction du temps de la cicatrisation.
25 mg de protéines obtenues à partir des extraits de broyats de peau saine ou de peau cicatricielle à J5 et J6 post-opératoires sont déposés sur un gel de polyacrylamide 10% contenant comme substrat 1 mg/ml de gélatine. Les pistes 1,12 représentent la peau saine qui sert de témion interne de migration. Les pistes 2, 3, 4 et 13, 14, 15 représentent les extraits obtenus à partir de cicatrices traitées avec du CMDBS à raison de 50 mg/ml (6 rats différents). Les pistes 5 à 11 et 16, 17 représentent les témoins correspondants. Chaque piste représente un rat différent.
Deux types de collagènases sont retrouvés dans la peau saine : La forme de 72 kDa et sa forme activée la 68 kDa. Par contre, à J5 et J6, dans les plaies traitées ou non avec le CMDBS, la 92 kDa est présente de manière identique. La différence réside dans les niveaux d'expression de la 72 kDa et de sa forme activée, la 68 kDa. A J5, dans les plaies témoins la 72 kDa et la 68 kDA sont exprimées de manière très importante par rapport aux plaies traitées avec du CMDBS. De plus, il y a apparition d'espèces de bas poids moléculaires qui n'existent pas dans les plaies traitées avec le CMDBS. A J6, cette différence se confirme puisque pour le même dépôt protéique qu'à J5, l'activité des collagènases est telle que les pistes 16 et 17 apparaissent sous forme de deux traces blanches. Cette activité qui n'existe pas chez les rats traités au CMDBS.
Les CMDBS modulent donc les niveaux d'expression des MMPs soit directement soit indirectement à travers leur rôle inhibiteur sur la plasmine qui est un de leurs activateurs.
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TABLEAU 4
Protection du TGFbêta par divers polymères TGF bêta 100% TGF bêta + trypsine 0% TGF bêta + mésoglycan 100% TGF bêta + mésoglycan + trypsine 50% TGF β + HSM 100% TGF β + HSM + trypsine 75% TGF bêta + sulodexide 100% TGF bêta + sulodexide + trypsine 20% TGF β + HSS 100% TGF β + HSS + trypsine 45% TGF bêta + Dextrane 100% TGF bêta + Dextrane + trypsine 0% TGF bêta + Dextrane Sulfate 100% TGF bêta + Dextrane Sulfate + trypsine 0% TGF bêta + Sucrase 100% TGF bêta + Sucrase + trypsine 0% HSM = Héparanes Sulfates purifiés à partir du Mésoglycan
HSS = Héparanes Sulfates purifiés à pariir de Sulodexide TABLEAU 5
Protection du FGF par divers polymères
PROTECTION EN %
FGF seul 100 FGF + Trypsine 0
FGF + Trypsine + Héparine 100
FGF + Trypsine + Mésoglycan 75
FGF + Trypsine + Sulodexide 70
FGF + Trypsine + Mésoglycan traité 0 Héparinase
FGF + Trypsine + Sulodexide traité 0 Héparinase
FGF + Trypsine + Héparine Traité 0 Héparinase
FGF + HSM + Trypsine 95
FGF + HSS + Trypsine 90
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Figure imgf000043_0001
Figure imgf000043_0002

Claims

REVENDICATIONS
1. Utilisation d'au moins un polymère ou un biopolymère, appelés HBGFPP, à l'exclusion du mésoglycan, protégeant spécifiquement les facteurs de croissance des familles des FGF et TGFbêta de la dégradation trypsique et n'inhibant pas de manière significative la coagulation, pour la fabrication d'un médicament pour le traitement des inflammations.
2. Utilisation selon la revendication 1, caractérisée en ce que le polymère ou biopolymère présente une activité anti-coagulante inférieure à 50 unités internationales par mg de polymère.
3. Utilisation selon l'une des revendications 1 et 2, caractérisée en ce que ledit polymère présente une activité anti-complément.
4. Utilisation selon l'une des revendications 1 à 3, caractérisée en ce que ledit polymère n'active substantiellement pas le système du complément.
5. Utilisation selon l'une des revendications 1 à 4, caractérisée en ce que ledit polymère inhibe substantiellement les activités protéasiques de l'élastase et/ou de la plasmine.
6. Utilisation selon l'une des revendications 1 à 5, caractérisée en ce que ledit polymère ou biopolymère est un polysaccharide.
7. Utilisation selon la revendication 6, caractérisée en ce que ledit polysaccharide est principalement composé de résidus glucose.
8. Utilisation selon la revendication 6, caractérisée en ce que le polysaccharide comprend des résidus glucosamine et/ou d'acide uronique.
9. Utilisation selon la revendication 8, caractérisée en ce que le polysaccharide comprend des dimères glucosamine-acide uronique.
10. Utilisation selon l'une des revendications 8 et 9, caractérisée en ce que ledit polysaccharide est un glycosaminoglycane éventuellement associé à un lipide, un peptide ou un protide, ou un sulfate d'un de ces composés.
11. Utilisation selon l'une des revendications 1 à 6, caractérisée en ce que ledit polysaccharide est un dextrane substitué.
12. Utilisation selon la revendication 11, caractérisée en ce que ledit polysaccharide est un CMDBS.
13. Utilisation selon l'une des revendications 1 à 5, caractérisée en ce que ledit polymère est de nature non-osidique.
14. Composition pharmaceutique pour le traitement des inflammations contenant au moins un polymère tel que défini dans l'une des revendications 1 à 13 en association avec au moins un excipient pharmacologiquement acceptable.
15. Composition selon la revendication 14, caractérisée en ce qu'elle contient entre environ 10 et 2500 μg de polymère ou de biopolymère/ml de composition.
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