WO1995024421A1 - Derive peptidique - Google Patents

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WO1995024421A1
WO1995024421A1 PCT/JP1995/000389 JP9500389W WO9524421A1 WO 1995024421 A1 WO1995024421 A1 WO 1995024421A1 JP 9500389 W JP9500389 W JP 9500389W WO 9524421 A1 WO9524421 A1 WO 9524421A1
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WO
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group
arg
hydrogen atom
alkyl group
tyr
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PCT/JP1995/000389
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English (en)
French (fr)
Inventor
Shinobu Sakurada
Kimie Murayama
Masaharu Nakano
Kazuya Hongo
Satoko Takeshima
Nobuhiro Take
Original Assignee
Daiichi Pharmaceutical Co., Ltd.
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    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K5/00—Peptides containing up to four amino acids in a fully defined sequence; Derivatives thereof
    • C07K5/04—Peptides containing up to four amino acids in a fully defined sequence; Derivatives thereof containing only normal peptide links
    • C07K5/08—Tripeptides
    • C07K5/0802—Tripeptides with the first amino acid being neutral
    • C07K5/0812—Tripeptides with the first amino acid being neutral and aromatic or cycloaliphatic
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
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    • C07K5/04—Peptides containing up to four amino acids in a fully defined sequence; Derivatives thereof containing only normal peptide links
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    • C07K5/1002—Tetrapeptides with the first amino acid being neutral
    • C07K5/1016—Tetrapeptides with the first amino acid being neutral and aromatic or cycloaliphatic
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K38/00—Medicinal preparations containing peptides

Definitions

  • the present invention relates to a peptide derivative that exerts a pharmacological action such as analgesia through an action on an opioid receptor or the like.
  • Obioid receptors such as morphine, to which ovioids bind, were proven to exist in the early 1970s.
  • Opioid receptors are currently roughly classified into 5 and 3 types.
  • Morphine mainly acts as an agonist at the receptor, // exerting pharmacological effects such as analgesia, intestinal motility suppression and respiratory depression.
  • obioid peptides peptides, collectively referred to as obioid peptides.
  • the pharmacological effect of the obioid peptide is considered to be basically the same as that of morphine, and since it is a substance that originally exists in the living body, it is expected that it may be a drug having a safety level higher than that of morphine.
  • natural opioid peptides have problems with pharmacokinetics and are not yet used as pharmaceuticals.
  • delmorphin containing D-alanine
  • the analgesic effect of delmorphin was about 1.000 times stronger than that of morphine when administered intraventricularly, and was found to be relatively stable in the body.
  • synthetic Obioid peptides containing D-amino acids were made.
  • synthetic obioids with high receptor selectivity are expected to be non-narcotic analgesics, and clinical trials have been conducted.However, their efficacy, side effects that may be caused by being agonists, and profitability Therefore, its potential as a pharmaceutical has been questioned.
  • a sustained-release oral preparation of morphine sulfate which is widely used in recent years as a therapeutic agent for cancer pain Cannot be a replacement for MS Contin.
  • the daily dose of MS Contin increases to the order of grams, and it may be difficult to take it.In addition, it may cause itching or other side effects that may be caused by histamine release, and the administration must be discontinued. In some cases. Therefore, an alternative drug that is more safe and effective than morphine is desired. Disclosure of the invention
  • the present inventors have diligently searched for an opioid peptide derivative having an excellent analgesic effect and oral absorbability that can solve the above problems. As a result, they have found that an oligopeptide derivative having an amidino group at the N-terminus and a salt thereof having the basic skeleton of di-Tyr- (or D) -Arg-Phe retains such properties, and completed the present invention.
  • the peptide derivative of the present invention can be represented by the following formula I.
  • Q means D-Arg (D-arginine residue) or L-Arg (L-arginine residue), and R 1 is a hydrogen atom or -s (C 1 -C 1) 6) alkyl groups.
  • R 1 is a hydrogen atom or -s (C 1 -C 1) 6) alkyl groups.
  • Q is D-Arg and R 1 is a hydrogen atom are preferred.
  • R 2 represents a hydrogen atom, a d-6 alkyl group, an aryl group, a d-6 alkoxy group, or an aryl carbonyl group.
  • aryl, alkanoyl, or arylcarbonyl group examples include an aryl group such as a substituted or unsubstituted phenyl group, preferably an unsubstituted phenyl group; an alkanol group such as an acetyl group or a propanol group; or benzoyl.
  • An arylcarbonyl group such as a group can be used.
  • X is - 0R 3, -NR 4 R 5 , or - NR e - represents any CR 7 R 8 R S.
  • R 3 represents a hydrogen atom or a d- 6 alkyl group
  • R 4 represents a hydrogen atom or a d- 6 alkyl group.
  • R 5 is - shows the 6 human de ⁇ Kishiarukiru group or a sulfonic acid-substituted C doctor 6 alkyl group. Hydroxyl group or The sulfonic acid group may be substituted at any position of the alkyl group, but a terminally substituted alkyl group is preferred.
  • R 4 and R 5 may together form a 5- or 6-membered nitrogen-containing saturated heterocyclic group together with the nitrogen atom substituted by R 4 and R 5 , wherein the heterocyclic ring has two or more nitrogen atoms. May be included.
  • - NR 4 as R 5 1-piperazinyl group, and the like can be used 1-pylori Jiniru group, or 1-piperidinyl group.
  • X is NR 6 - may exhibit CR 7 R 8 R 9, R 6 is a hydrogen atom, - showing 6 alkyl group, or a full Eniru d 6 alkyl group Ariru group is substituted, such as based on (Ararukiru group).
  • aralkyl group include a benzyl group.
  • R 7 is a hydrogen atom; a carboxyl group; a carbonyl group substituted by a d-6 alkoxy group such as methoxycarbonyl and ethoxycarbonyl; a substituted or unsubstituted rubamoyl group; a substituted carboxyl group—a 6- alkyl group; Or a C 6 alkyl group substituted with a non-substituted rubamoyl group; or a d 6 alkyl group having a carbonyl group substituted with a d- 6 alkoxy group.
  • R 8 is a hydrogen atom; - 6 alkyl group; Amino to - 6 alkyl group; Amijino group substituted - 6 alkyl group; Guanijino group substituted - 6 alkyl group, hydroxy C physician 6 ⁇ alkyl group; a carboxyl group substituted d - 6 alkyl group, or a substituted or unsubstituted force Rubamoiru is substituted - shows the 6 alkyl group.
  • it may be form a 5- or 6-membered nitrogen-containing saturated heterocyclic group having a carboxyl group on the ring together with the nitrogen atom to which R 6 and R 8 together such connexion R e is substituted.
  • heterocyclic ring examples include a 2-carboxy-1-pyrrolidinyl group (-Pro-OH) and a 3-carboxy-1-piperidinyl group.
  • R 7 is a carboxyl group or a carbamoyl group and R 8 is a hydrogen atom is preferable.
  • R 9 represents a hydrogen atom or a d-6 alkyl group.
  • the alkyl group, alkoxy group, or alkanoyl group may be linear or branched.
  • the compound of the present invention represented by the above formula I has two asymmetric carbons derived from an L-tyrosine residue and a D-Arg or a -Arg residue represented by Q, as well as a filler bound to Q.
  • asymmetric carbon derived from two down residues, (excluding the case provided that R 7 and R 8 indicate the same substituents simultaneously) the asymmetric carbon to which R 7 and R 8 are substituted, and optionally the substituents mentioned above Has one or more asymmetric carbons.
  • -Derived from Tyr, D-Arg, and L-Arg residues Asymmetric carbons other than may be in either R- or S- configuration.
  • the compound represented by the formula I of the present invention includes all optically active or racemic forms, diastereoisomers or any mixtures thereof represented by the above formula.
  • the compounds of the present invention also include acid addition salts such as hydrochloride, acetate or paratoluenesulfonic acid, and base addition salts such as ammonium salt or organic amine salt. Further, in addition to the compounds represented by the above general formula, compounds which are dimers or multimers of the above compounds, and cyclic compounds in which the C-terminal and the N-terminal of these compounds are bound are included.
  • the peptide of the present invention has an analgesic effect exceeding morphine.
  • the histamine releasing effect and heart rate lowering effect associated with the analgesic effect are relatively weaker than morphine, and the degree of cross-resistance with morphine is low, so it is expected that it will be suitable for use in the treatment of cancer pain.
  • Administration routes include intravenous administration, subcutaneous administration, oral administration, and the like. Mucosal absorption preparations including nasal absorption and transdermal absorption preparations are also expected to be useful.
  • the peptide derivative of the present invention can be synthesized by a solid phase method and a liquid phase method usually used for peptide synthesis.
  • a peptide derivative having no amidino group can be synthesized by a solid-phase method, and an amidino group can be introduced into an amino group of tyrosine at the N-terminus to produce a target peptide derivative.
  • the C-terminus can be modified after the introduction of the group.
  • Various excellent protecting groups such as amino groups and condensing agents for condensation reactions are known. For example, refer to the following examples. For example: Hiroshi Suzuki, “Protein Engineering—Basics and Application” Maruzen (1992) and references cited therein; M.
  • the present invention will be described more specifically with reference to Examples, but the present invention is not limited to these Examples.
  • the desired present invention of the present invention encompassed by the general formula I is obtained.
  • the peptide derivative can be easily produced.
  • the meaning of the amino acid group is the same as that usually used.
  • the amino acid means an L-amino acid unless otherwise indicated as D-.
  • the following abbreviations may be used, and similar abbreviations may be used unless otherwise indicated.
  • DIPEA ⁇ , ⁇ -diisopropylethylamine
  • Alko resin p-alkoxybenzyl alcohol resin [4-hydroxymethylphenoxymethyl copolystyrene 1% divinylbenzene resin, J. Am. Chem. So, 95, 1328 (1974)], Watanabe Chemical Industry
  • Fmoc-NH-SAL resin 4- (2 ', 4'-dimethoxyphenyl 9-fluorenylmethoxycarbonylaminomethyl) phenoxy resin: Watanabe Chemical Industry Example 1
  • the above peptide was synthesized by a solid phase method (Original Autoprogram for the Fmoc / NMP method) as follows using a Model 430A peptide synthesizer manufactured by Applied Biosystems (ABI).
  • the Fmoc-S-Ala-Alko resin 0.25 mmol / 675 mg was washed once without being protected, and treated with NMP containing 20% piperidine for 4 minutes, and similarly with NMP containing 20% piperidine for 16 minutes. After washing 5 times with NMP, it was reacted with Fmoc-Phe-OH for 61 minutes. Next, the resultant was washed four times with NP, and the resin was recovered from the fourth washing solution. Unreacted amino groups were reacted with acetic anhydride. ,
  • HPLC was performed using a Cosmosil 8 column with a continuous concentration gradient of a mixture of 0.1% TFA aqueous solution and 0.1% TFA aqueous solution containing 70% acetonitrile (mixing ratio from 0% at the start to 60% after 45 minutes). The flow rate was 10 ml / min.
  • the mixture was prepared using a 0.05% aqueous formic acid solution and a 0.05% aqueous formic acid solution containing 70% acetonitrile (the mixing ratio was 0% at the start of HPLC to 40% after 45 minutes).
  • the procedure was performed in the same manner as in Example 1 except that the continuous concentration gradient was used.
  • Amino acid composition analysis and mass spectrometry were performed in the same manner as in Example 1, and results supporting the above structure were obtained.
  • the tetrabeptide derivative having the above structure was synthesized as follows by a solid phase method using the Fmoc / NMP method. A glass filter was used for filtration.
  • the Fmoc- ⁇ -MeAla-Alko resin was treated three times with 12 ml of DMF, then three times with 12 ml of DMF containing 20% piperidine, and then six times with 12 ml of DMF to remove the Fmoc group.
  • Phe-0H 0.315 g of PyBrop (Watanabe Chemical Industries)
  • 6 ml of concealed 0.273 ml of DIPEA
  • the Fmoc group was removed from Fmoc-Phe-yS-eAla-Alko resin by the same operation as above, and Fmoc-D-Arg (Pmc) -OH 0.557 g, HOBt 0.121 g, HBTU 0.299 g, 0.274 ml of DIPEA was added, and the mixture was shaken for 1 hour to produce Fmoc-D-Arg (Pmc) -PheyS-MeAla-Alko resin. Then, after filtration and washing as in the previous section, unreacted amino groups were capped.
  • the Fmoc group is removed from Fmoc-D-Arg (Pmc) -Phe-S-MeAla-Alko resin by the same operation as above, and Fmoc-Tyr (t-Bu) -0H 0.310 g, HOBt 0.13 g , HBTU 0.25 g and DIPEA 0.235 ml were added and shaken for 1 hour to produce Fmoc-Tyr (t-Bu) -D-Arg (Pmc) -Phe- / S-MeAla-Alko resin. After filtration and washing as in the previous section, unreacted amino groups were capped.
  • the Fmoc group was removed from Fmoc-Tyr (t-Bu) -D-Arg (Pmc) -Phe-yS-MeAla-Alko resin by the same operation as described above, and the method of Matsueda et al. (The Journal of Organic Chemistry 0.99 g of 1H-pyrazole-1-carboxamidine hydrochloride prepared according to the procedure described in the following, 10 to 60 ° C, more preferably 40 to 50 °, by adding 6 ml of DMF 1.293 mU DMF. C was reacted for 1 to 4 hours to amidinate the amino group of N-terminal tyrosine. Then, the mixture was filtered, washed (3 times with 6 ml of NMP, and 3 times with 6 ml of methanol), and dried in vacuum over potassium hydroxide.
  • Example 4 56.2 mg of the crude amidinated peptide was dissolved in 10 ml of a 0.05% aqueous TFA solution and purified with a Shimadzu HPLC system. YMC in HPLC D-0DS-5- ST. 8 column with 0.5% Asetonitori Le containing 0.05% TFA aqueous solution and 70% Asetonitoriru containing 0.05% mixture of TFA in water (mixing ratio by HPLC at the start 0% Flow rate is 1 ml / ⁇ in a continuous concentration gradient from 50 to 90 minutes later. Min) was used. Amino acid composition analysis and mass spectrometry were performed in the same manner as in Example 1, and results supporting the above structure were obtained.
  • Example 4 56.2 mg of the crude amidinated peptide was dissolved in 10 ml of a 0.05% aqueous TFA solution and purified with a Shimadzu HPLC system. YMC in HPLC D-0DS-5- ST. 8 column with 0.5% Asetonitori Le containing 0.0
  • the tetrabeptide derivative having the above structure was synthesized as follows by a solid phase method using the Fmoc / NMP method. A glass filter was used for filtration.
  • the Fmoc group was removed by treating the Fmoc-S-EtAla-Alko resin three times with 20 ml of DMF, then three times with 12 ml of DMF containing 20% piperidine, and then six times with 12 ml of DMF, 0.387 g of Fmoc-Phe-0H, 0.466 g of PyBrop, 12 ml of NMP, and 0.523 ml of DIPEA were added and shaken for 24 hours to produce Fmoc-Phe-3-EtAla-Alko resin.
  • the precipitate was washed with 12 ml of NMP, treated with 0.51 g of unreacted amino group acetylimidazole and 0.174 ml of DIPEA in 12 ml of DMF for 1 hour and capped. Then, the obtained resin was washed again with 12 ml of NMP.
  • the Fmoc group was removed from the Fmoc-Phe- / 3-EtAla-Alko resin by the same operation as described above. Add Fmoc-D-Arg (Pmc) -0.707 g, HOBt 0.153 g, HBTU 0.379 g, DIPEA 0.34 8 ml to the resin and shake for 1 hour to shake Fmoc-D-Arg (Pmc) -PheyS-EtAla-Alko resin was produced. After filtration and washing as in the previous section, unreacted amino groups were capped.
  • the Fmoc group is removed from Fmoc-D-Arg (Pmc) -Phe-S-EtAla-Alko resin by the same operation as above, and Fmoc-Tyr (t-Bu) -0H 0.460 g, HOBt 0.153 g , HBTU 0.399 g, DIPEA 0.348 ml, shaken for 1 hour, Fmoc-Tyr (t-Bu) -D-Arg (Pmc) -Phe-y3-EtAla-Alko
  • Fmoc-Tyr (t-Bu) -D-Arg (Pmc) -Phe- / 5-EtAla-Alko The Fmoc group was removed by the same operation as above, and 1H-bilabour was prepared in the same manner as in Example 3. -1.199 g of 1-carboxamidine hydrochloride, 2.874 ml of DIPEA and 6 ml of DMF were added and reacted at 40 to 50 ° C for 1 hour or 4 hours to amidinate the amino group of tyrosine at the N-terminal. . Then, the mixture was filtered, washed (3 times with 12 ml of NMP, and 3 times with 12 ml of methanol), and dried under vacuum over a medium of lithium hydroxide.
  • Example 5 100 mg of the crude amidinated peptide was dissolved in 20 ml of a 0.05% aqueous TFA solution, and purified in the same manner as in Example 3. Amino acid composition analysis and mass spectrometry were performed in the same manner as in Example 1, and results supporting the above structure were obtained.
  • Example 5 100 mg of the crude amidinated peptide was dissolved in 20 ml of a 0.05% aqueous TFA solution, and purified in the same manner as in Example 3. Amino acid composition analysis and mass spectrometry were performed in the same manner as in Example 1, and results supporting the above structure were obtained.
  • Example 5 100 mg of the crude amidinated peptide was dissolved in 20 ml of a 0.05% aqueous TFA solution, and purified in the same manner as in Example 3. Amino acid composition analysis and mass spectrometry were performed in the same manner as in Example 1, and results supporting the above structure were obtained.
  • Example 5 100 mg of the crude amidinated peptide was dissolved in
  • a protective peptide represented by the following formula: Z-HNC (NZ)- Tyr (Bzl) -D-Arg (Z 2 ) -Phe-OH was produced by a liquid phase method as follows.
  • Boc-D-Arg (Z 2 ) -Phe-OTce 241 was treated with 1000 ml of 4N hydrochloric acid monoethyl acetate to remove the Boc group, and dissolved in 1300 ml of DF in an ice bath. To this solution was added 108 g of Boc-Tyr (Bzl) -0H and 46 g of HOBt, neutralized with 42 ml of TEA, and then condensed with 65 g of EDC ⁇ HC1 to obtain a protected peptide represented by the following formula: Boc- Tyr (Bzl) -D-Arg (Z 2 ) -Phe-OTce was obtained.
  • Z-HNC (NZ) -Tyr (Bzl) -D-Arg (Z 2 ) -Phe-0H to MeOH (EDC-DMAP method); NH 2 Me (EDC-H0 Bt method); H- -ol (EDC- H-Gly-0Bzl ⁇ TosOH (EDC-HOBt method); H-Ala-OBzl-TosOH (EDC-HOBt method); H-e ⁇ Ala-0Et (EDC-HOBt method); or H- ( n- Pr) SAla-OBzl ⁇ TosOH (EDC-HOBt method) was condensed.
  • the product was dissolved in acetic acid in a water bath and catalytically reduced in the presence of palladium carbon. The catalyst was removed, the reaction solution was concentrated under reduced pressure, and the mixture was freeze-dried to obtain the powdered target peptide.
  • the results of amino acid analysis and mass analysis under the following conditions supported the structures of the respective peptide compounds.
  • the above peptide was produced by a liquid phase method starting from the C-terminal using TosOH * Me SAla-OBzl as a starting material.
  • Boc-MePhe-0H and TosOHMe ⁇ Ala-OBzl are condensed by EDC-HOBt method to obtain Boc-MePhe-Me 8Ala-OBzl, and 4N monochloride is obtained from Boc-MePhe-Me ⁇ SAla-OBzl.
  • Boc- D- Arg (Z 2) - condensation by 0H and EDC - HOBt method Boc- D-Arg (Z 2 ) - and MePhe-Me SAla-OBzl did.
  • Boc-D- Arg (Z 2) -MePhe- Me ⁇ Ala- desorption after the Boc group using 4N hydrochloric acid monoacetate Echiruesuteru than OBzl, Boc-Tyr (Bzl) -0H and EDC-HOBt method and, protected peptide: to give the Boc- Tyr (Bzl) -D-Arg (Z 2) -MePhe -MeySAla-OBzl.
  • Z-HNC (N- Z) - was stirred at room temperature was added Pyrazole (the amidino reagent), the protective base peptide: Z-HNC (N- Z) - Tyr (Bzl) - was obtained D- Arg (Z 2) -MePhe- Me ySAla- OBzl.
  • This protected peptide was dissolved in acetic acid, palladium carbon was added, and hydrogen gas was blown into the solution to perform catalytic reduction.
  • Boc-EtPhe-0H instead of Boc-MePhe-0H, by the same method as above, TosOHMe ⁇ SAla-OBzl and condensation by EDC-HOBt method to produce Boc-EtPhe-MeySAla-OBzl did. Then, deprotection and condensation are repeated in the same manner as described above to obtain a protected peptide represented by the following formula: Z-HNC (N-Z) -Tyr (Bzl) -D-Arg (Z 2 ) -EtPhe-Me SAla-OBzl was obtained. This protective peptide was dissolved in acetic acid, palladium carbon was added, and hydrogen gas was blown into the solution to perform catalytic reduction.
  • Boc-D-Arg (Z 2 ) -Phe-OTce was removed from the Boc group using 1000 ml of 4N hydrochloric acid monoacetic acid ethyl ester, and then dissolved in 1300 ml of DMF in an ice bath.
  • 108 g of Boc-Tyr (Bzl) -0H and 46 g of HOBt were added to this solution, neutralized with 42 ml of TEA, and then condensed with 65 g of EDC / HC1 to give a protected peptide represented by the following formula: Boc- Ty r (Bz 1) -D-Ar g (Z 2 ) -Phe-OTce was obtained.
  • Injection volume Inject 20 1 of sample (concentration 1 mg / ml) with an automatic injector Conditions for thin layer chromatography:
  • Test Example-The analgesic effect of the peptide derivative of the present invention was evaluated by the pressure stimulation method as follows. A pressure stimulus was applied to the ridge of the mouse at a rate of 10 mmHg / sec, and the pressure indicating a behavior such as struggling and sticking to the stimulus site was measured, and this was used as a pain response threshold. In the experiments, mice that responded to a pressure of 40 to 50 mmHg in advance were used. The maximum stimulation pressure was 100 mniHg. The analgesic effect is Pt one Po
  • the peptide derivative of the present invention is useful because it can be used for treating cancer pain and the like.

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Description

明 細 書 ぺ プ チ ド 誘 導 体 技術分野
本発明は、 ォピオイド受容体等に対する作用を介して、 鎮痛等の薬理作用を発 揮するべプチド誘導体に係わる。 背景技術
モルヒネ等のオビオイドが結合するオビオイド受容体は、 1970年代前半にその 存在が証明された。 ォピオイド受容体は現在 、 5および の 3種に大別されて いる。 モルヒネは主に//受容体にァゴニストとして作用し、 鎮痛、 腸管運動抑制、 呼吸抑制等の薬理学的効果を発現する。
1975年以降、 オビオイド受容体に結合する内因性のモルヒネ様物質が相次いで 発見された。 現在までのところ、 これらの物質は全てペプチドであり、 オビオイ ドペプチドと総称されている。 オビオイドペプチドの薬理学的効果は基本的には モルヒネと同様と考えられ、 元来生体内に存在する物質であることから、 モルヒ ネ以上の安全性を有する薬剤となる可能性が予想される。 し力、し、 天然のォピオ ィドペプチドでは体内動態面での問題もあり、 未だ医薬品として使用はされてい ない。
1980年代には D-体のァラニンを含有するデルモルフインがカェルの皮膚から単 離された。 デルモルフィンの鎮痛効果は脳室内投与でモルヒネの約 1. 000倍強力 であり、 体内で比較的安定であることが判明した。 その後 D-体のァミノ酸を含む 合成オビオイドペプチドが作られた。 特に Λ受容体選択性の高い合成オビオイド ぺプチドは麻薬性のない鎮痛薬として期待され、 臨床試験も実施されているが、 効果、 ァゴニストであることに起因すると思われる副作用、 および採算性の面 で医薬品としての可能性は疑問視されてきている。
さらに、 これらの合成オビオイドペプチドは経口剤としての利用が困難であり、 例えば近年癌疼痛治療薬として広く使用されている硫酸モルヒネの徐放性経口剤 である MSコンチンの代替薬とはなり得ない。 MSコンチンは一日投与量がグラム単 位にまで増加し、 その服用に困難を伴う場合があり、 また、 ヒスタミン遊離作用 に起因すると考えられるかゆみ等の副作用が発現し、 投与の中止を余儀なくされ る場合もある。 したがって、 モルヒネ以上の安全性および薬効を有する代替薬が 望まれる。 発明の開示
本発明者らは、 上記課題を解決すベく優れた鎮痛効果および経口吸収性を有す るォピオイ ドペプチド誘導体を鋭意探索した。 その結果、 し- Tyr -(し又は D)- Arg - Pheを基本骨格とし、 N 末端にアミジノ基を有するオリゴペプチド誘導体および その塩がかかる特性を保持することを見いだし本発明を完成した。
すなわち、 本発明のぺプチド誘導体は次の式 Iで表すことができる。
NH R1 CH2 C6H5
? H II I I
R - N- C - L-Ty r- Q - N - C- CO- X
H 発明を実施するための最良の形態
上記式中の置換基について述べると、 Q は D-Arg (D-アルギニン残基） または L - Arg (L- アルギニン残基） を意味し、 R1は水素原子または - s (炭素数 1〜6 個の） アルキル基を意味する。 これらのうち、 Q が D-Argであり、 R1が水素原子 である化合物が好ましい。 R2は水素原子、 d - 6アルキル基、 ァリール基、 d - 6ァ ルカノィル基、 またはァリールカルボ二ル基を示す。 ァリール基、 アルカノィル 基、 またはァリールカルボニル基としては、 例えば、 置換若しくは無置換のフエ ニル基、 好ましくは無置換フヱニル基などのァリール基；ァセチル基ゃプロパノ ィル基などのアルカノィル基；又はベンゾィル基などのァリールカルボ二ル基を 用いることができる。
X は- 0R3、 -NR4R5、 又は - NRe- CR7R8RSのいずれかを示す。 R3は水素原子または d -6アルキル基を示し、 R4は水素原子または d _6アルキル基を示す。 R5は - 6ヒ ド□キシアルキル基またはスルホン酸置換 Cい 6アルキル基を示す。 水酸基または スルホン酸基はアルキル基のいかなる位置に置換していてもよいが、 末端置換の アルキル基が好ましい。 R4及び R5は一緒になつて R4及び R5が置換する窒素原子と 共に 5または 6 員含窒素飽和複素環基を示してもよく、 該複素環は 2個以上の窒 素原子を含んでいてもよい。 例えば、 - NR4R5として 1-ピペラジニル基、 1-ピロリ ジニル基、 又は 1-ピペリジニル基などを用いることができる。
また、 X が NR6- CR7R8R9 を示す場合、 R6は水素原子、 - 6アルキル基、 又はフ ェニル基等のァリール基が置換した d 6アルキル基 （ァラルキル基） を示す。 ァ ラルキル基としては、 例えば、 ベンジル基など挙げることができる。 R7は水素原 子；カルボキシル基； メ トキシカルボニル、 エトキシカルボニルなどの d - 6アル コキシ基が置換したカルボニル基；置換若しくは無置換力ルバモイル基； カルボ キシル基が置換した — 6アルキル基；置換若しくは無置換力ルバモイル基が置換 した C i - 6アルキル基； または d— 6アルコキシ基が置換したカルボ二ル基を有する d 6アルキル基を示す。
R8は水素原子； -6アルキル基；ァミノに- 6アルキル基；ァミジノ基が置換し た - 6アルキル基； グァニジノ基が置換した - 6アルキル基、 ヒドロキシ Cい 6ァ ルキル基；カルボキシル基が置換した d - 6アルキル基、 又は置換若しくは無置換 力ルバモイルが置換した — 6アルキル基を示す。 あるいは、 R6及び R8が一緒にな つて Reが置換する窒素原子とともに環上にカルボキシル基を有する 5 または 6 員 の含窒素飽和複素環基を形成しでもよい。 このような複素環としては、 2-カルボ キシ- 1- ピロリジニル基 （-Pro-OH)や 3-カルボキシ -1-ピペリジニル基を挙げる ことができる。 これらのうち、 例えば、 R7がカルボキシェチル基またはカルバモ ィルェチル基であり、 R8が水素原子である組合せが好ましい。 R9は水素原子又は d - 6アルキル基を示す。 上記の各置換基において、 アルキル基、 アルコキシ基、 又はアルカノィル基は直鎖または分枝のいずれでもよい。
上記の式 Iで示される本発明の化合物は、 L-チロシン残基及び Q が示す D-Arg またはし- Arg残基に由来する 2個の不斉炭素の他、 Q に結合するフ 二ルァラ二 ン残基に由来する不斉炭素、 R7および R8が置換する不斉炭素 （ただし R7および R8 が同時に同一の置換基を示す場合を除く） 、 並びに上記の各置換基に任意に存在 する 1以上の不斉炭素を有する。 し- Tyr、 D-Arg 、 及び L- Arg 残基に由来するも の以外の不斉炭素は R-または S-のいずれの配置でもよい。 また、 本発明の式 Iで 示される化合物には、 上記の式で示される任意の光学活性体またはラセミ体、 ジ ァステレオ異性体またはそれらの任意の混合物もすベて包含される。
また本発明の化合物には、 塩酸塩、 酢酸塩、 又はパラトルエンスルホン酸など の酸付加塩や、 アンモニゥム塩又は有機アミン塩などの塩基付加塩が含まれる。 さらに上記の一般式で示される化合物の他、 上記化合物の 2量体ないし多量体で ある化合物、 及びこれらの化合物の C-末端と N-末端が結合した環状の化合物が包 含される。
本発明のペプチドは、 モルヒネを凌駕する鎮痛効果を有する。 鎮痛作用に伴う ヒスタミン遊離作用や心拍数の低下作用がモルヒネに比して相対的に弱く、 モル ヒネとの交差耐性の程度も低いので、 癌疼痛治療に使用するのに適することが予 想される。 投与経路としては静脈内投与、 皮下投与、 経口投与等が挙げられるが、 経鼻吸収を含む粘膜吸収製剤および経皮吸収製剤も有用性が期待される。
本発明のぺプチド誘導体は、 ぺプチド合成に通常用いられる固相法および液相 法で合成することができる。 例えば、 固相法によりアミジノ基を有しないぺプチ ド鎮を合成し、 さらに N末端のチロシンのァミノ基にァミジノ基を導入すること によって目的のペプチド誘導体を製造することができ、 また、 予めアミジノ基を 導入した後 C末端を修飾することもできる。 アミノ基等の保護基および縮合反応 の縮合剤等は、 優れたものが種々知られており、 以下の実施例を参考に、 また、 例えば： 鈴木紘ー編 「タンパク質工学—基礎と応用」 丸善 （株） （1992)及びそこ に引用された文献； M. Bondanszky, et al.， "Peptide Synthesis", John Wi le y & Sons, N. Y. , 1976; 並びに J. M. Stewart and D. J. Young, "Sol id Phase P eptide Synthesis", W. H. Freeman and Co. , San Francisco, 1969等を参照して 適宜選択使用することができる。 固相法では市販の各種ペプチド合成装置、 例え ばパーキン ,エルマ一 · ジャパン製（Perkin Elmer Japan, 旧社名 Appl ied Bio systems)の Model 430Aを利用するのが便利なこともある。 合成に使用する樹脂、 試薬等は市販品等を容易に入手でき、 それらの例は実施例に示した。
実施例 以下に実施例により本発明をさらに具体的に説明するが、 本発明はこれら実施 例に限定されるものではない。 本実施例を参照し、 あるいは本実施例の方法を修 飾 ·変更することによって、 あるいは出発原料または反応試薬を適宜選択するこ とにより、 一般式 Iに包含される本発明の所望の本発明べプチド誘導体を容易に 製造することができる。 なお、 実施例においては、 アミノ酸基の意味は通常用い られているものと同様である。 D-体と L-体があるァミノ酸が言及されている場合 には、 そのアミノ酸は D-と特に表示していない場合は L-アミノ酸を意味する。 ま た、 以下の略号を使うことがあり、 特に示していない場合にも同様な略号を用い る場合がある。
Z ：ベンジルォキシカルボニル基
OTce ： トリクロ口ェチルエステル基
Boc ： t-ブトキシカルボニル基
WSCI ：卜ェチル -3- (3-ジメチルァミノプロピル）-カルボジィミ ド
TosOH ：パラトルエンスルホン酸
OBzl
Me 8 Ala 又は ^SMeAla ： N-メチル ァラニン
H- SAla-ol : NH2CH2CH2CH2OH
Fmoc ： 9-フルォレニルメチルォキシカルボ二 -ル
Pmc ： 2, 2, 5, 7, 8-ペン夕メチルクロマン一 6- -スルホニル
t-Bu ：三級ブチル
NMP ： N-メチルピロリ ドン
D F ： ジメチルホル厶ァミ ド
DMSO ： ジメチルスルホキシド
TFA ： トリフルォロ酉乍酸
TEA ： トリェチルァミン
DCM ： ジクロロメタン
DMAP ： Ν, Ν-ジメチルァミノピリジン
DIPEA ： Ν, Ν-ジイソプロピルェチルアミン
DIPCI ： Ν，Ν-ジイソプロピルカルポジィミ ド HOBt : 1 -ヒドロキシベンゾトリアゾール
EDC ： 1-(3-ジメチルアミノプロピル） - 3-ェチル -カルボジィミ ド
HBTU ： 2- (1H-ベンゾトリアブールー 1-ィル） -1， 1, 3, 3-テトラメチルゥロニゥ ム ·へキサフルォロホスフェート
PyBrop：ブロモトリス （ピロリジノ） ホスホニゥム ·へキサフルォロ
ホスフヱート
Alko樹脂： p-アルコキシベンジルアルコール樹脂 [4-ヒドロキシメチルフエノ キシメチルコポリスチレン 1% ジビニルベンゼン樹脂、 J. Am. Chem. So , 95, 1328 (1974) ]， 渡辺化学工業
Fmoc-NH-SAL樹脂： 4-(2' , 4' - ジメ トキシフエ二ルー 9-フルォレニルメ トキ シカルボニルァミノメチル） フエノキシ樹脂：渡辺化学工業 例 1
H2NC(NH)-Tyr-D-Arg-Phe-NHCH2CH2COOH
Appl ied Biosystems (ABI)社の Model 430A ペプチド合成装置を用いて、 上記 ペプチドを固相法（Original Autoprogram for the Fmoc/NMP method)により以下 のように合成した。
Fmoc- S -Ala- Alko 樹脂 0.25 mmol/675 mg を匿 で 1回洗浄し、 20% ピペリ ジン含有 NMP で 4分間、 さらに同じく 20% ピぺリジン含有 NMPで 16分間処理した。 NMP で 5回洗浄した後、 61分間 Fmoc-Phe-OHと反応させた。 次いで N P にて 4回 洗浄し、 4回目の洗浄液より樹脂を回収し、 未反応のアミノ基は無水酢酸と反応 させた。 ，
以上の 1サイクルを 120 分で行い、 同様の操作を 2サイクル目は Fmoc-Phe- 0H の代わりに Fmoc-D-Arg(Pmc)-0H を用いて、 3サイクル目は Fmoc- Tyr(t- Βι - 0H を用いて繰り返した。 側鎖保護基は、 D- Arg に対しては Pmc を、 Tyr に対しては t-Buを用いた。
上記の操作により得られた樹脂 500 mgをフヱ.ノール （結晶） 0. 75 g、 エタンジ チオール 0. 25 ml、 チオア二ソール 0. 50 ml、 水 0. 50 mlおよび TFA 10. 0 ml の 混合液中で室温にて 3時間撹拌処理し、 樹脂からぺプチドを分離させると同時に 保護基を除去した。 次いで 3〃mのフィルター （ADVANTEC-Polyflon フィルター） で濾過し、 濾液に冷ジェチルエーテル 200 ml を加え、 生じた沈殿を 3〃mのフ ィルター （ADVANTEC-Polyflon フィルター） で濾取した。 フィルター上の沈殿は 2 N酢酸 10〜20 ml に溶解し、 凍結乾燥して粗べプチドを得た。
粗ペプチド 135 mgを水 13.5 mlに溶解し、 1 M の o-メチルイソゥレア 13.5 ml を加え、 4°Cで 14日間撹拌し、 アミジノ化を行った。 得られた粗アミジノ化ぺプ チド 106 mgを 20 mlの 0.1% TFA水溶液に溶解した。 0.01N の塩酸で pH 4〜5 に 調整後、 Gilson HPLC システムでペプチドを精製した。 HPLCには Cosmosil 8力 ラムを用い、 0.1% TFA水溶液および 70%ァセトニトリル含有 0.1% TFA水溶液の 混合液の連続濃度勾配 （混合比は開始時 0%から 45分後の 60%まで） で行い、 流 速は 10 ml/分とした。
精製されたペプチドのうち約 100 ig を加水分解管に採取し 1 mlの 0.2% フエ ノールを含有する 6N塩酸を加え、 脱気封管後、 110でで 24時間加水分解した。 室温冷却後 40°Cで濃縮乾固した後、 0.01N塩酸 1 mlに溶解し、 溶液 をアミ ノ酸分析計で解析した （分析計： 日立 L- 8500、 カラム： Hitachi Customイオン 交換樹脂 #2622、 プレカラム： Hitachi Customイオン交換樹脂 # 2650し、 バッ ファ—： リチウムバッファー （0.09 N-pH 2.8， 0.25 N-pH 3.7， 0.72 N-pH 3.6, 1.00 N-pH 4.1,再生 0.20N) 、 反応温度： 135 °C、 バッファー ·ポンプの流速： 0.30 ml/分、 ニンヒドリン 'ポンプの流速: 0.35 ml/分、 検出器の波長： 570 nm/ 440 nm、 分析時間： 150分） 。 その結果、 ァミノ酸分析の結果は上記の構造を支 持していた。
精製ペプチド約 150 /g を 250c lの 5%酢酸に溶解し、 溶液の ij l を Liquid SIMSにて質量分析した（MS及び MS/MS、 セシウムイオンガン使用、 分析計： Finnigan TSQ 700, Matrix:グリセロール一チォグリセロール（1:1)、 Collision Gas:Arガス 3〜5 mTorr、 Collision Energy： -20 eV， Electron Multiplier: 1000-1500 V)。 その結果は上記の構造を支持していた。 例 2
H2NC(NH)-Tyr-D-Arg-Phe-NHCH2CH2C0NH2 上記べプチド誘導体を、 合成開始時に Fmoc- NH- SAL樹脂 0. 25 mmol/ 385 mgを 用い、 1サイクル目に Fmoc- 8 - Ala-OH を、 2サイクル目に Fmoc- Phe-OHを、 3 サイクル目に Fmoc-D-Arg(Pmc)-OH を用いて、 さらに 4サイクル目に Fmoc-Tyr (t-Bu)-OH を用いたこと以外は実施例 1と同様な操作により得た。
ァミジノ化べプチド誘導体の合成および精製も、 混合液を 0. 05%蟻酸水溶液お よび 70%ァセトニトリル含有 0. 05%蟻酸水溶液 （混合比は HPLC 開始時 0%から 45分後の 40% までの連続濃度勾配） としたこと以外は実施例 1と同様に行った。 アミノ酸組成分析および質量分析も実施例 1と同様に行い、 上記の構造を支持す る結果を得た。 例 3
H2NC(NH)- Tyr-D- Arg- Phe-N(CH3)CH2CH2C00H
上記構造を有するテトラべプチド誘導体を、 Fmoc/NMP法による固相法で以下の ように合成した。 濾過にはグラスフィルターを用いた。
Alko樹脂 0. 500 gを DMF 6 ml で膨潤させた後、 Fmoc- N-メチル - S -ァラニン (Fmoc- ^ -MeAla-OH ) 0. 228 g およびピリジン 0. 093 ml を樹脂に加え、 1分 間振盪し、 次いで塩化 2, 6-ジクロロベンゾィル 0. 147 gを加えて 24時間振盪し た。 生成した Fmoc- yS -MeAla- Alko樹脂を 6 ml の DMFで 3回、 次いで 6 ml の メタノールで 3回、 さらに 6 ml の DCMで 3回洗浄し、 未反応のヒドロキシメチ ル基は DCM 6 ml中で塩化ベンゾィル 0. 0891 mlおよびピリジン 0. 0847 mlを加え 1時間振盪しベンゾィル化した。 さらにアミノ酸樹脂を 6 mlの DCMで 3回、 6 ml の DMFで 3回、 6 ml のメタノールで 3回順次洗浄し、 水酸化カリウムデシケー 夕一中で真空乾燥した。
Fmoc- ^ -MeAla-Alko樹脂を 12 mlの DMFで 3回、 次いで 20 % ピペリジンを 含む DMF 12 ml で 3回、 さらに 12 mlの DMFで 6回処理することにより Fmoc基 を除去し、 Fmoc-Phe-0H 0. 262 g、 PyBrop (渡辺化学工業） 0. 315 g、 匿 6 ml、 DIPEA 0. 273 mlを加え、 24時間振盪し、 Fmoc-Phe- S-MeAla-Alko樹脂を生成さ せた。 濾過し、 6 mlの NMP による洗浄後、 未反応のアミノ基は 1- ァセチルイミ ダゾール 0. 248 g、 DIPEA 0. 0784 ml を含む DMF 6 ml中で 1 時間処理しキヤップ した。 次いで、 得られた樹脂を 6 ml の NMP で洗浄した。
Fmoc-Phe- yS - eAla-Alko樹脂から上記と同様な操作により Fmoc基を除去し、 Fmoc-D-Arg(Pmc)-OH 0. 557 g、 HOBt 0. 121 g、 HBTU 0. 299 g、 DIPEA 0. 274 mlを 加え、 1時間振盪し Fmoc- D- Arg(Pmc)- Phe- yS -MeAla-Alko樹脂を生成させた。 次 いで前項と同様に濾過、 洗浄後、 未反応のアミノ基をキャップした。
Fmoc-D-Arg(Pmc)-Phe- S -MeAla-Alko樹脂から上記と同様な操作により Fmoc基 を除去し、 Fmoc-Tyr(t-Bu)-0H 0. 310 g、 HOBt 0. 103 g、 HBTU 0. 256 g、 DIPEA 0. 235 mlを加え、 1時間振盪し Fmoc-Tyr(t-Bu)- D- Arg(Pmc)- Phe- /S - MeAla- Alko 樹脂を生成させた。 前項と同様に濾過、 洗浄後、 未反応のアミノ基をキャップし た。
Fmoc-Tyr(t-Bu)-D-Arg(Pmc)-Phe- yS -MeAla-Alko樹脂から上記と同様な操作に より Fmoc基を除去し、 Matsuedaらの方法 (The Journal of Organi c Chemi stry, 57, 2497〜2502， 1992) に従って調製した 1H-ピラゾール- 1-カルボキサミジン 塩酸塩 0. 989 g、 DIPEA 1. 293 mU DMF 6 mlを加えて 10〜60°C、 より好ましくは 40〜50°Cで 1時間ないしは 4時間反応させて N末端のチロシンのアミノ基をアミ ジノ化した。 次いで濾過、 洗浄 （NMP 6 mlで 3回、 さらにメタノール 6 ml で 3 回） し水酸化カリウムデシケ一夕中で真空乾燥を行った。
上記の操作により得られた樹脂 596 mg をグラスフィルター上において TFA、 フエノール、 水の混合液 （TFA ：フエノール：水 = 93 : 2: 5) 5 ml で 1時間処理 し濾過した。 同様の操作を計 2回行った。 さらに樹脂を TFA 5 mlで 5分処理し濾 過した。 同様の操作を計 3回行った。 各操作で得られた濾液を合して 20°C以下で 溶媒を減圧留去した。 残渣にジェチルエーテル 20 mlを加え白色沈殿とし、 上清 を捨てる操作を計 3回行い、 得られた白色粉末を水 20 mlに溶解し、 分液ロート 中にてジェチルエーテル 5 ml で 3回洗浄し、 水層を凍結乾燥し、 粗アミジノ化 ぺプチドを得た。
粗ァミジノ化べプチド 56. 2 mgを 0. 05% TFA水溶液 10 mlに溶解し、 島津 HPLC システムにて精製した。 HPLCに YMC D-0DS-5- ST . 8カラムと 0. 5% ァセトニトリ ル含有 0. 05% TFA水溶液および 70%ァセトニトリル含有 0. 05% TFA水溶液の混合 液 （混合比は HPLC開始時 0%から 50分後の 90 までの連続濃度勾配で流速は 1 ml/ θ 分） を用いた。 アミノ酸組成分析および質量分析は実施例 1と同様に行い、 上記 の構造を支持する結果を得た。 例 4
H2NC(NH)- Tyr- D- Arg-Phe-N(CH2CH3)CH2CH2COOH
上記構造を有するテトラべプチド誘導体を、 Fmoc/NMP法による固相法で以下の ように合成した。 濾過にはグラスフィルターを用いた。
Alko樹脂 1. 000 gを NMP 12 ml で膨潤させた後、 Fmoc-N-ェチル ァラニン (Fmoc- yS -EtAla-OH) 0. 475 gおよび DMAP 0. 017 gを加え、 1分間振盪し、 次い で DIPCI 0. 177 g を添加して 24時間振盪した。 生成した Fmoc- -EtAla- Alko樹 脂を NMP 12 mlで 3回、 次いで 12 ml のメタノールで 3回、 さらに DCM 12 ralで 3 回洗浄し、 未反応のヒドロキシメチル基は DCM 12 ml中で塩化ベンゾィル 0. 178 mlおよびピリジン 0. 170 mlを加え 1時間振盪しベンゾィル化した。 さらにァミノ 酸樹脂を 12 mlの DCMで 3回、 12 ml の DMFで 3回、 12 ml のメタノールで 3回 順次洗浄し、 水酸化力リゥムデシケ一夕一中で真空乾燥した。
Fmoc- S -EtAla-Alko樹脂を 20 mlの DMFで 3回、 次いで 20%ピペリジンを含 む DMF 12 ml で 3回、 さらに 12 ml の DMFで 6回処理することにより Fmoc基を除 去し、 Fmoc- Phe-0H 0. 387 g， PyBrop 0. 466 g, NMP 12 ml, 及び DIPEA 0. 523 ml を加え、 24時間振盪し、 Fmoc-Phe- 3 -EtAla-Alko樹脂を生成させた。 濾過後、 12 ml の NMPで洗浄し、 未反応のァミノ基はいァセチルイミダゾ一ル 0. 551 g、 DIPEA 0. 174 mlを含む DMF 12 ml 中で 1時間処理しキャップした。 次いで、 得ら れた樹脂を再度 12 mlの NMPで洗浄した。
Fmoc-Phe- /3 -EtAla-Alko樹脂から上記と同様な操作により Fmoc基を除去した。 樹脂に Fmoc-D- Arg(Pmc)- 0H 0. 707 g、 HOBt 0. 153 g、 HBTU 0. 379 g、 DIPEA 0. 34 8 mlを加え、 1 時間振盪し Fmoc-D-Arg(Pmc)-Phe- yS -EtAla- Alko樹脂を生成させ た。 前項と同様に濾過、 洗浄後、 未反応のアミノ基をキャップした。
Fmoc-D-Arg(Pmc)-Phe- S -EtAla-Alko樹脂から上記と同様な操作により Fmoc基 を除去し、 Fmoc-Tyr(t-Bu)-0H 0. 460 g、 HOBt 0. 153 g、 HBTU 0. 399 g、 DIPEA 0. 348 mlを加え、 1時間振盪し Fmoc-Tyr(t-Bu)-D-Arg(Pmc)-Phe- y3 -EtAla-Alko
1 o 樹脂を生成させた。 上記と同様に濾過、 洗浄後、 未反応のアミノ基をキャップし た。
Fmoc-Tyr(t-Bu)-D-Arg(Pmc)-Phe- /5-EtAla-Alko樹脂から上記と同様な操作に より Fmoc基を除去し、 実施例 3と同様に調製した 1H -ビラブール- 1-カルボキサ ミジン塩酸塩 2. 199 g、 DIPEA 2. 874 ml、 DMF 6 mlを加え 40〜50°Cで 1 時間ない しは 4 時間反応させて N末端のチロシンのアミノ基をアミジノ化した。 次いで濾 過、 洗浄 （NMP 12 ml で 3回、 さらにメタノール 12 mlで 3回） し水酸化力リウ 厶デシケ一夕中で真空乾燥を行つた。
上記の操作により得られた樹脂 1. 514 gをグラスフィルタ一上において TFA、 フエノール、 及び水を含む混合液 （TFA ： フヱノール：水 =93： 2 ： 5) 10 mlで 1時間処理し濾過した。 同様の操作を計 2回行った。 さらに樹脂を TFA 10 ml で 5分処理し濾過した。 同様の操作を計 3回行った。 各操作で得られた濾液を合し て 20°C以下で溶媒を減圧留去した。 残渣にジェチルエーテル 20 mlを加え白色沈 殿とし、 上清を捨てる操作を計 3 回行った。 得られた白色粉末を水 30 mlに溶解 し、 分液ロート中でジェチルエーテル 5 ml で 3回洗浄し、 水層を凍結乾燥し、 粗アミジノ化ペプチドを得た。
粗ァミジノ化べプチド 100 mg を 0. 05% TFA水溶液 20 mlに溶解し、 実施例 3 と同様に精製した。 アミノ酸組成分析および質量分析は実施例 1と同様に行い、 上記の構造を支持する結果を得た。 例 5
H2NC(NH)-Tyr-D-Arg-Phe-OMe
H2NC(NH)- Tyr-D- Arg-Phe-NH e
H2NC(NH)-Tyr-D-Arg-Phe- SAla-ol
H2NC(NH)- Tyr-D- Arg-Phe- Gly - OH
H2NC(NH)-Tyr- D- Arg- Phe-Ala - OH
H2NC(NH)-Tyr-D-Arg-Phe-Mey8Ala-0Et
H2NC(NH)-Tyr-D-Arg-Phe-(n-Pr) SAla-OH
上記のぺプチドの製造原料として、 次式で表される保護べプチド: Z- HNC(N-Z) - Tyr(Bzl)-D-Arg(Z2)-Phe-OH を液相法により以下のようにして製造した。
出発原料である Z-Phe-OTce 254 g を 25%臭化水素—酢酸 900 ml で処理して Z基を脱離した後、 氷浴下で CH2C12 1000 mlに溶解した。 この溶液に Boc- D- Arg (Z2) - OH 288 g， HOBt 85 gを加え、 TEA 77 ml で中和した後、 EDC · HC1 121 g により縮合し Boc- D- Arg(Z2)- Phe- OTceとした。 次いで、 Boc- D-Arg(Z2)- Phe- OTce 241 を 4N塩酸一酢酸ェチルエステル 1000 mlで処理して Boc基を脱離し、 氷 浴下で D F 1300 mlに溶解した。 この溶液に Boc- Tyr(Bzl) - 0H 108 g, HOBt 46 g を加え、 TEA 42 ml で中和した後、 EDC · HC1 65 gにより縮合し、 次式で示され る保護べプチド： Boc- Tyr(Bzl)-D-Arg(Z2)- Phe- OTce を得た。
Boc-Tyr(Bzl)-D-Arg(Z2)-Phe-0Tce 48 gを 4N塩酸一酢酸ェチルエステル 250 ml で処理して Boc 基を脱離後、 氷浴下で DMF 150 ml に溶解した。 この溶液を TEA 7 mlで中和した後、 Z-HNC(N-Z)Pyrazole (アミジノ化試薬) 19 gを加え、 室温で 攪拌し、 次式の保護べプチド: Z-HNC(N- Z)- Tyr(Bzl)-D-Arg(Z2)-Phe-0Tceを得た。 この保護ペプチド 42 gを水浴下酢酸に溶解し、 その中に亜鉛末 21 gを加えて 2時 間攪拌し、 反応液より亜鉛末を除き、 減圧濃縮して保護ペプチド: Z- HN-C(N-Z)- Tyr(Bzl)-D-Arg(Z2)-Phe-0Hを得た。
Z-HNC(N-Z)- Tyr(Bzl)-D-Arg(Z2)-Phe- 0Hに MeOH (EDC-DMAP法）； NH2Me (EDC-H0 Bt法）; H- -ol (EDC-HOBt法）； H-Gly-0Bzl · TosOH (EDC-HOBt 法）； H- Ala- OBzl - TosOH (EDC-HOBt法）； H- e ^Ala-0Et (EDC-HOBt法）； 又は H-(n- Pr) SAla- OBzl · TosOH (EDC-HOBt 法） を縮合させた。 生成物を水浴下酢酸に溶解してパラ ジゥム炭素の存在下で接触還元し、 触媒を除いて反応液を減圧濃縮し、 さらに凍 結乾燥を行って粉末の目的物べプチドを得た。 下記の条件のァミノ酸分析及び質 量分析の結果はそれぞれのペプチド化合物の構造を支持していた。
ァミノ酸分析は、 ぺプチドを約 0.5 mg を加水分解管に採取し、 1 mlの 6N塩 酸を加え、 脱気封管後、 110 °Cで 24時間加水分解した。 室温冷却後 40°Cで濃縮乾 固した後、 残查を精製水 5 mlに溶解した。 この溶解液より 5 1 を採り減圧乾燥 し、 残査に 50 mM NaHC03 緩衝液（ρΗ9· 0) 20 l 、 ダブシルク口ライドーァセト 二トリル溶液 40 ιι \ を加え、 70°Cで 10分間加温した。 反応液を減圧濃縮し、 残 査を 50%エタノール 100〃 1 に溶解し、 その溶液 20 ιι \ を液体クロマトグラフ ィ一で解析した。 質量分析は、 ペプチド約 150 g を 250 1 の 5%酢酸に溶解 し、 1 〃1 を LiquidSIMS にて解析した。 例 6
H2NC(NH)-Tyr- D- Arg- MePhe- MeySAla-OH
H2NC(NH)-Tyr - D- Arg- EtPhe - Me SAla - OH
上記ペプチドは、 TosOH * Me SAla-OBzlを出発原料として、 C-末端より順次液 相法により製造した。 Boc-MePhe- 0Hと TosOH · Me ^Ala-OBzlを EDC-HOBt 法によ り縮合し、 Boc-MePhe-Me 8Ala- OBzlを得て、 Boc- MePhe- Me ^SAla- OBzlより 4N塩 酸一酢酸ェチルエステルを用いて Boc基を脱離後、 Boc- D- Arg(Z2)- 0Hと EDC- HOBt 法により縮合して、 Boc- D-Arg(Z2)- MePhe-Me SAla-OBzlとした。 次いで、 Boc-D- Arg(Z2)-MePhe- Me ^Ala- OBzlより 4N塩酸一酢酸ェチルエステルを用いて Boc基 を脱離後、 Boc-Tyr(Bzl)-0H と EDC-HOBt法により縮合して、 保護ペプチド： Boc- Tyr(Bzl)-D-Arg(Z2)-MePhe -MeySAla-OBzlを得た。
Boc-Tyr(Bzl)-D- Arg(Z2)-MePhe- Me^SAla-OBzlを 4N塩酸—酢酸ェチルエステ ルで処理して Boc基を脱離した後、 Z-HNC(N- Z)-Pyrazole (アミジノ化試薬） を 加えて室温で攪拌し、 保護べプチド： Z-HNC(N- Z)- Tyr(Bzl)- D- Arg(Z2)-MePhe-Me ySAla- OBzlを得た。 この保護ペプチドを酢酸に溶解し、 パラジウム炭素を加えて 溶液に水素ガスを吹き込んで接触還元した。 パラジウム炭素を除いた後、 減圧濃 縮し、 凍結乾燥を行って粉末のペプチド H2NC(NH)-Tyr- D- Arg-MePhe-Me ^Ala- 0H を得た。 このべプチドは、 例 5に記載したァミノ酸分析及び質量分析において上 記の構造を支持する結果を与えた。 '
Boc-MePhe- 0Hの代わりに Boc- EtPhe- 0Hを用いて、 上記と同様の方法により、 TosOH · Me^SAla- OBzlと EDC- HOBt法で縮合して Boc- EtPhe-Me ySAla-OBzlを製造 した。 次いで、 上記と同様の方法により脱保護と縮合を繰り返し、 次式で示され る保護べプチド： Z-HNC(N- Z)-Tyr(Bzl)-D-Arg(Z2)-EtPhe- Me SAla- OBzlを得た。 この保護べプチドを酢酸に溶解してパラジウム炭素を加え、 この溶液に水素ガス を吹き込んで接触還元した。 パラジウム炭素を除いた後、 減圧濃縮し、 凍結乾燥 を行って粉末のペプチド HzNCOO-Tyr-D-Arg-EtPhe-Me /SAla-OHを得た。 このべ プチドは、 例 5に記載したァミノ酸分析及び質量分析により上記の構造を支持す る結果を与えた。 例 7
H2NC(NH)-Tyr-D-Arg-Phe-Me 8Ala-0H
ペプチド合成で通常用いられる液相法で以下のように合成した。 Z-Phe-OTce 254 g を出発原料として、 25%臭化水素—酢酸 900 ml で Z基を脱離後、 氷浴下 で CH2C12 1000ml に溶解した。 この溶液に Boc-D- Arg(Z2)- 0H 288 g、 HOBt 85 g を加え、 TEA 77 mlで中和した後、 EDC - HC1 121 g により縮合し Boc-D-Arg(Z2) - Phe-OTceとした。 次いで、 Boc-D-Arg(Z2)- Phe- OTce 241 gを 4N塩酸一酢酸ェチ ルエステル 1000 mlを用いて Boc基を脱離した後、 氷浴下で DMF 1300 mlに溶解 した。 この溶液に Boc-Tyr(Bzl)-0H 108 g、 HOBt 46 g を加え、 TEA 42 ml で中 和した後、 EDC · HC1 65 gにより縮合して、 次式で示される保護べプチド： Boc - Ty r (Bz 1 ) -D-Ar g (Z 2 ) -Phe-OTce を得た。
Boc-Tyr(Bzl)-D-Arg(Z2)-Phe-0Tce 48 gを 4N塩酸一酢酸ェチルエステル 250 ralで処理して Boc基を脱離し、 氷浴下で DMF 150 mlに溶解した。 この溶液を TEA 7 mlで中和した後、 Z-HNC(N- Z)-Pyrazole (アミジノ化試薬) 19 gを加え、 室温で 攪拌し、 次式の保護べプチド： Z- HNC(N- Z)-Tyr(Bzl)-D-Arg(Z2)-Phe-0Tceを得た。 この保護べプチド 42 g を水浴下酢酸に溶解し、 その中に亜鉛末 21 g を加え、 2時間攪拌した。 反応液より亜鉛末を除いた後に減圧濃縮して保護べプチド： Z - HNC(N- Z)- Tyr(Bzl)-D-Arg(Z2)-Phe-0Hを得た。
上記保護ペプチド: Z-HNC(N-Z)-Tyr(Bzl)-D-Arg(Z2)-Phe-OH 1. 15 g と TosOH · Me ySAla-OBzl 0. 93 g を氷浴下 DMF 30 mKDMSO 10%含有） で溶解し、 この溶液 に HOOBt 0.24 を加えて TEA 0.21 ml で中和した後、 EDC · HC1 0.25 gにより 縮合し、 次式で示される保護べプチド： Z-HNC(N-Z)-Tyr(Bzl)-D-Arg(Z2)-Phe-Me Ala- OBzlを得た。 この保護ペプチド 0. 90 を酢酸 100 ml に溶解し、 その中 にパラジウム炭素 0. 90 g を加え、 この溶液に水素ガスを吹き込んで接触還元し た。 パラジウム炭素を除いた後減圧濃縮し、 凍結乾燥を行って粉末のペプチド： H2NC(NH)- Tyr- D- Arg-Phe-MeySAla- 0Hを得た。 このペプチドは、 実施例 5に記載 したァミノ酸分析及び質量分析において上記の構造を支持する結果を与えた。 以下に本発明のぺプチド誘導体の物理化学的性状として、 HPLCの保持時間及び 薄層クロマトグラフィーの Rf値を表 1に示す。 これらのぺプチド誘導体はいずれ も凍結乾燥品として得た。
HPLCの条件：
装 置 ： 日本分光 880システム
カラム ： Nucleosil 5C18 100 A (4 X150議）
溶 媒 ： A液 （ァセトニトリル：精製水： トリフルォロ酢酸 =10:90:0.1)
B液 （ァセトニトリル：精製水： トリフルォロ酢酸 =70:30:0.1) 勾 配 ： B液 0〜100%/30分
流 速 ： 1 ml/min.
温 度 ： 40°C
検出波長： 230 nm
注入量 ：サンプル （濃度 1 mg/ml) 20 1 を自動注入装置で注入する。 薄層クロマトグラフィーの条件：
Rf8 ： n-ブタノール：酢酸：精製水 =4 :1:5を混合し、 その上層を展開溶媒 として用いた。
Rfb ： n-ブ夕ノール：酢酸：精製水： ピリジン =15:3:10:12 を展開溶媒と して用いた。
： シリ力ゲル (Merck F254) また、 同様の方法により合成した化合物を表 2に示す c
表 1 本発明べプチド誘導体 HPLCC保持時間） Rf ' Rfb
H2NC(NH)-Tyr D-Arg- Phe- NH(CH2) 2C00Me 10. 79 0. 49 0.74 H2NC(NH)-Tyr D-Arg-Phe-OMe 11. 37 0. 60 0.84 H2NC(NH)-Tyr -D-Arg-Phe-NHCH(CH3)CH2OH 9. 11 0.46 0.70 H2NC(NH)-Tyr -D-Arg- Phe-Arg-NH2 7.83 0.23 0.55 H2NC(NH)-Tyr -D-Arg-Phe-Leu-OH 13. 19 0.41 0. 64 H2NC(NH)-Tyr D-Arg-Phe-OH 9. 35 0. 50 0.76 H2NC(NH)-Tyr D - Arg- Phe- Gly- OH 8. 54 0.37 0. 60 H2NC(NH)-Tyr D-Arg-Phe-Asp-OH 8. 41 0.25 0.44 H2NC(NH) - Tyr D - Arg- Phe-Ala- OH 9.27 0. 43 0. 66 H2NC(NH)-Tyr D-Arg-Phe-N(CH3)CH2CH2OH 9. 64 0.51 0.74 H2NC(NH)-Tyr D-Arg-Phe-N(CH3)CH2COOMe 11.49 0. 49 0.74 H2NC(NH)-Tyr D - Arg-Phe- Gly- NH2 8.09 " 0.38 0. 60 H2NC(NH)-Tyr D-Arg-Phe-N(CH3) (CH2) 2C0N(Me) 2 11. 11 0.35 0. 69 H2NC(NH)-Tyr -D- Arg-Phe- Pro-OH 10. 68 0. 33 0.54 H2NC(NH)-Tyr D-Arg-Phe-NHMe 9.01 0.43 0. 68 H2NC(NH)-Tyr -D- Arg-Phe-N(CH3)(CH2) 2CONH(n- Hex) 17.26 0.52 0.79 H2NC(NH)-Tyr -D-Arg-Phe-NHEt 10.24 0.59 0.81 H2NC(NH)-Tyr -D-Arg- Phe-D-Ala-NH2 9. 09 0.40 0. 67 H2NC(NH)-Tyr -D-Arg-Phe-N (CH3 ) CH(CH 3 ) COOH 10. 81 0.42 0. 67 H2NC(NH)-Tyr -D-Arg-D-Phe-N(CH3 ) CH(CH3 ) COOH 11.58 0. 41 0.58 H2NC(NH)-Tyr D-Arg-Phe-NHC(CH3)2COOH 10.57 0.41 0. 61 H2NC(NH)-Tyr -D- Arg-Phe- (R)-NHCH(C2H5)C00H 11. 17 0.39 0.59 H2NC(NH)-Tyr D-Arg-Phe-D-Ala-OH 9. 94 0.40 0. 65 H2NC(NH)-Tyr Arg-Phe-N(CH3)(CH2) 2C00H 11. 65 0.33 0.54 H2NC(NH)-Tyr - D - Arg- Phe- NHCH2CH2S03H 7. 67 0.38 0. 68 1-[H2NC(NH)- Tyr-D-Arg-Phe ] -p i per i di ne 14. 87 0. 66 0. 80 1- [H2NC(NH)- Tyr- D- Arg-Phej- piperazine 7.55 0.28 0. 60 H2NC(NH)-Tyr -D-Arg-Phe-N(CH2C6H5) (CH2) 2COOH 14. 87 0.51 0.70 H2NC(NH)-Tyr -D-Arg-Phe-(R， S)-NHCH2CH(CH3)C00H 9. 96 0.41 0. 62 H2NC(NH)-Tyr - D- Arg- Phe- N(CH2CH3) (CH2)2C00Me 12. 74 . 0.47 0.74 H2NC(NH)-Tyr - D- Arg-Phe- Phe-OH 13. 86 0. 41 0. 62
表 2 本発明べプチド誘導体
Et-HNC(NH)-Tyr-(D)Arg-Phe- e SAla-OH
Et-HNC(NH)-Tyr-(D)Arg-Phe- /SAla-OH
n-Pr-HNC (NH) -Tyr-(D) Arg-Phe- ^Ala-OH
Ph- HNC(NH)- Tyr-(D)Arg-Phe- Ala-OH
Ac-HNC(NH)-Tyr-(D)Arg-Phe- SAla-OH
H2NC(NH)-Tyr-(D)Arg-Phe-NH(n-Pr)
H2NC(NH)-Tyr-(D)Arg-Phe-NH(CH2)2OH
H2NC(NH)-Tyr-(D)Arg-Phe-NHCH(CH3)CH2OH[D]
H2NC(NH)-Tyr-(D)Arg-Phe-NH(CH2)4OH
H2NC(NH)-Tyr-(D)Arg-Phe-Gly-O e
H 2 NC (NH) -Tyr- (D) Arg-Phe-G 1 y-NHMe
H 2NC (NH) -Tyr-(D) Arg-Phe-MeGl y-OH
H2NC(NH)- Tyr- (D)Arg- Phe- Ala-OMe
H2NC(NH)-Tyr-(D)Arg-Phe-Ala-NH2
H2NC(NH)-Tyr-(D)Arg-Phe-Ala-NH e
H2NC(NH)-Tyr- (D)Arg-Phe- (D)Ala-NHMe
H2NC(NH)-Tyr-(D)Arg-Phe-(D)MeAla-OH
H2NC(NH)-Tyr-(D)Arg-Phe- ,8Ala-OH
H2NC(NH)-Tyr-(D)Arg-Phe-Me 3Ala-0H
H2NC(NH)-Tyr-(D)Arg- Phe-Me ySAla-NH2
H2NC(NH)-Tyr-(D)Arg-Phe-MeySAla-NHMe
H2NC(NH)-Tyr-(D)Arg-Phe-Me/8Ala-NHEt
H2NC(NH)-Tyr-(D)Arg-Phe-Me /8Ala-NH(n-Pr)
H2NC(NH)-Tyr-(D)Arg-Phe-Me SAla-N(Et)2
H2NC (NH) -Tyr-(D) Arg-Phe-Et /8 Ala-OMe
H2NC(NH)-Tyr-(D)Arg-Phe-(D)Arg-NH2
H2NC(NH)-Tyr-(D)Arg-P e-Asu-OH
H2NC(NH)-Tyr-(D)Arg-Phe-Sar-OH
H2NC(NH)-Tyr-(D)Arg- Phe-Pro-OH
H2NC(NH)-Tyr-(D)Arg-Phe-Pro-OMe
試験例 - 本発明のぺプチド誘導体の鎮痛効果を圧刺激法にて以下のように評価した。 マ ウスの尾根部に 10 mmHg/秒の割合で圧刺激を加え、 もがき、 刺激部位への嚙み つきなどの行動を示す圧力を測定し、 これを疼痛反応閾値とした。 実験には予め 40〜50 mmHg の圧力に反応するマウスを用いた。 また最大刺激圧は 100 mniHg と した。 鎮痛効果は次式 Pt 一 Po
% of MPE = x 100
Pc 一 Po
(式中、 Poは薬物処理前の疼痛反応閾値、 Ptは薬物処理 t分後の疼痛反応閾値、 Pcは最大刺激圧である） に従い、 percent of maximum possible effect (% of M PE) として算出した。 用量反応曲線から 50 % の％ ofMPE を与える薬物投与量を ED5。値として求め、 薬物の鎮痛効力を比較した。 皮下投与 （背部皮下） 及び経口 投与の結果を表 3に示す。 表 3 本発明べプチド誘導体 EDs
Figure imgf000020_0001
: s. c. P. O. 対照 （モルヒネ） 4. 6 29. 6
H2NC(NH)-Tyr-D-Arg-Phe-NHCH2CH2COOH 0. 14 5. 8
H2NC(NH)-Tyr-D-Arg-Phe-NHCH2CH2CONH2 0. 13 10.7
H2NC(NH)-Tyr- D-Arg-Phe- N(CH3)CH2CH2C00H 0. 10 6. 6
H2NC(NH)-Tyr-D-Arg-Phe- N(CH2CH3)CH2CH2C00H 0. 15 16. 0
H2NC(NH)-Tyr-(D)Arg-Phe-N(Me)2 1.22 *N. T.
H2NC(NH)-Tyr-(D)Arg-Phe-N(CH3)CH2C0NH2 0.27 N. T.
H2NC(NH)-Tyr-D-Arg-Phe-N(CH3)CH2COOH 0. 39 17. 8
H2NC(NH)-Tyr-D-Arg-Phe-NHCH2CH2CH2OH 0.88 N. T.
H2NC(NH)-Tyr-D-Arg-Phe-N(CH3)CH2CH2C0NH 0. 31 24. 6
H2NC(NH)-Tyr-D- Arg- Phe- N(CH3)CH2CH2C00CH3 0. 12 8. 9
1- [H2NC (NH) -Tyr-D-Arg-Phe] -piperidi ne-3-C00H 0.25 N. T.
* N. T.： 試験せず 産業上の利用可能性
本発明のぺプチド誘導体は癌疼痛等の治療に使用することができるので有用で ある。

Claims

求 の 範 囲
1. 下記の式
Figure imgf000021_0001
〔式中、
R1は水素原子または - 6アルキル基を示し；
R2は水素原子、 — 6アルキル基、 ァリール基、 - 6アルカノィル基、 またはァ リールカルボ二ル基を示し；
Q は D - Arg またはし- Arg を示し；
X は 0R3 (R3は水素原子または —6アルキル基を示す） 、
NR4R5(R4は水素原子または d 6アルキル基を示し、 R5は — 6ヒドロキンアルキ ル基またはスルホン酸置換 - 6アルキル基を示し、 あるいは R4及び R5がー緒に なってそれらが置換する窒素原子と共に 5または 6員含窒素飽和複素環を示す)、 又は
NRe-CR7R8R9 (R6は水素原子、 d 6アルキル基、 またはァリール置換 - 6アルキ ル基を示し、 R7は水素原子、 カルボキシル基、 —6アルコキシカルボニル基、 置換若しくは無置換力ルバモイル基、 カルボキシ d 6アルキル基、 置換若しく は無置換力ルノくモィル C i - 6ァルキル基、 または Cい 6アルコキシカルボニル C , - 6 アルキル基を示し、 R8は水素原子、 — 6アルキル基、 ァミノ d 6アルキル基、 アミジノ — 6アルキル基、 グァニジノ — 6アルキル基、 ヒドロキシ — 6アルキ ル基、 カルボキシ — 6アルキル基、 又は置換若しくは無置換力ルバモイル - 6 アルキル基を示し、 あるいは R6及び R8が一緒になつて R6が置換する窒素原子と ともに 5 または 6員カルボキシ置換含窒素飽和複素環を示し、 R9は水素原子ま たは d - 6アルキル基を示す） 〕
で表される化合物およびその塩。
2. R1が水素原子である請求の範囲第 1項に記載の化合物およびその塩。
3. R6がメチルまたはェチルである請求の範囲第 1項又は第 2項に記載の化合物 およびその塩。
4. R7がカルボキシル基または力ルバモイル基である請求の範囲第 1項ないし第 3項のいずれか 1項に記載の化合物およびその塩。
5. R7がカルボキシメチル基または力ルバモイルメチル基である請求の範囲第 1 項ないし第 4項のいずれか 1項に記載の化合物およびその塩。
6. Qが D-Argである請求の範囲第 1項ないし第 5項のいずれか 1項に記載の化 合物およびその塩。
7. R1が水素原子であり、 R6が水素原子であり、 R7がカルボキシメチル基であり、 R8が水素原子である請求の範囲第 6項に記載の化合物。
8. R1が水素原子であり、 R6が水素原子であり、 R7が力ルバモイルメチル基であ り、 R8が水素原子である請求の範囲第 6項に記載の化合物。
9. R1が水素原子であり、 R6がメチル基であり、 R7がカルボキシメチル基であり、 R8が水素原子である請求の範囲第 6項に記載の化合物。
10. R1が水素原子であり、 R6がェチル基であり、 R7がカルボキシメチル基であり、 R8が水素原子である請求の範囲第 6項に記載の化合物。
11. 請求の範囲第 1項に記載の化合物の多量体または環状体およびその塩。
12. 塩酸塩又は酢酸塩である請求の範囲第 1項ないし第 11項に記載の化合物の塩。
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