B e s c h r e i b u n g
Sekretion von Proteinen der äußeren Membran Gram-negativer Bakterien mittels Gram-positiver Wirtsorganismen
Die Erfindung betrifft das in Anspruch 1 angegebene Verjähren zur Herstellung von aus Kulturüberstand erhältl en äußeren Membranproteinen Gram-negativer BakLerien durch Gram-positive Wirtszellen, eine Genstruktur nach Anspruch 2, einen Vektor nach Anspruch 3, enthaltend eine Genstruktur nach Anspruch 2, Gram-positive Wirtszellen nach Anspruch 4, Außenmembranproteine nach Anspruch 5 und 6 sowie deren Verwendung nach den
Ansprüchen 7 bis 10.
Proteine der äußeren Membran von Gram-negativen Bakterien sind häufig auf der Zelloberfläche dieser Bakterien exponiert und bei pathogenen Bakterien mögliche Angriffspunkte für die Erkennung der Bakterien durch das Immunsystem des befallenen Wirts. Es ist daher wünschenswert, mit Hilfe gereinigter Außenmembranproteine durch Impfung einen Schutz des Wirts gegen das entsprechende Bakterium zu erreichen (Smyth, C.J. (1985) Immunology of outer membrane proteins of Gram-negative bacteria. In: Intmunology of the Bacterial Cell Envelope (Stewart-Tull, D.E.S., Davies, M.; eds.) John Wiley and Sons Ltd. pp. 177 - 201). Eine weitere Anwendungsmöglichkeit von isolierten Membranproteinen ist deren Verwendung als Antigen in diagnostischen Testsystemen.
Ein Weg zur Gewinnung der Proteine ist deren Isolation
aus der äußeren Membran Gram-negativer Bakterien. Problematisch dabei ist aber, daß die Außenmembranproteine eine hohe Affinität zu den ebenfalls in der äußeren Membran lokalisierten Lipopolysacchariden besitzen, so daß die Proteine nur.sehr schwer von diesen Endotoxinen abtrennbar sind (Nikaido, H., Vaara M. (1985) Molecular basis of bacterial outer membrane permeability. Microbiol. Rev. 49, 1 - 32). Daher bietet sich als weiterer möglicher Weg zur Produktion von Außenmembranproteinen an, für deren Synthese Gram-positive Bakterien zu verwenden, die aufgrund des Fehlens einer äußeren Membran kein Lipopolysaccharid besitzen. Deshalb ist zu erwarten, daß mit Hilfe dieser Organismen endotoxinfreie Außenmembranproteine gewinnbar sind.
Es wurden auch schon verschiedene Außenmembranproteine Gram-negativer Bakterien (z.B. OmpA, OmpF ) intrazellulär in dem Gram-positiven Bakterium Bacillus subtilis eriolglich exprimiert (Puohiniemi, R., Butcher, S-, Tarkka, E., Sarvas, M. (1991) High level production of Escherichia coli outer membrane proLeins OmpA and OmpF intracellularly in Bacillus subtilis. FEMS Micro-bioi. Lett. 83, 29 - 34). Des weiteren wurde versucht, Außenmembranproteine durch die Zytoplasmamembran Gram-positiver Bakterien zu exportieren, indem zum einen das Membranprotein mit einem Gram-positiven Signalpeptid, das für die Einschleusung sekretorischer Proteine in den Exportweg und für den nachfolgenαen Membrantransport notwendig ist, fusioniert wurde, zum anderen eine Fusion des Membranproteins mit 298 Aminosäuren des sekretorischen Proteins α-Amylase von Bacillus amyloliquefaciens durchgeführt wurde. In all diesen Fällen fand aber eine an sich zu erwartende Sekretion bzw. ein Transport derart fusionierter Membranproteine
nicht statt (Kallio, P., Simonen, M., Palva, I.,
Sarvas, M. (1986), Synthesis of OmpA protein of
Escherichia coli K12 in Bacillus subtilis, J. Gen .
Microbiol. 132, 677 - 687; Puohiniemi, R., Simonen, M., Muttilainen, S., Himanen, J.-P., Sarvas, M. (1992), Secretion of the Escherichia coli outer membrane proteins OmpA and OmpF in Bacillus subtilis is blocked at an early intracellular step., Mol. Microbiol. 6,
981 - 990; Simonen, M., Tarkka, E., Puohiniemi, R., Sarvas, M. (1992), Incompatibility of outer membrane proteins OmpA and OmpF of Escherichia coli with secretion in Bacillus subtilis: Fusions wi tli secretable peptides, FEMS Microbiol. Lett. 100, 233 - 242). Im Gegensatz dazu fand zwar nach Expression eines Außenmembranproteins von Escherichia coli gemeinsam mit dem authentischen Gram-negativen Signalpeptid in Bacillus subtilis ein Transport durch dessen Zytoplasmamembran statt, doch blieb das Protein zeilassoziiert, wurde also nicht in das Kulturmedium sekretiert (Meens, J., Frings, E., Klose, M., Freudl, R. (1993), An outer membrane protein (OmpA) of Escherichia coli can be translocated across the cytoplasmic membrane of Bacillus subitilis, Mol. Microbiol. 9, 847 - 855). Aufgabe der Erfindung ist daher, ein Verfahren zu entwickeln, das es ermöglicht, äußere Membranproteine Gram-negativer Bakterien durch Gram-positive Bakterien so herstellen zu lassen, daß die Außenmembranproteine sowohl durch die Membran transportiert werden als auch aus dem Kulturüberstand erhältlich sind.
Zur Lösung der Aufgabe wird zunächst ein Genkonstrukt hergestellt, das ein für ein Außenmembranprotein kodierendes Gen enthält, sowie eine diesem Gen vorgeschaltete, für ein Propeptid eines Exportproteins eines
Gram-positiven Bakteriums kodierende Pro-Gensequenz und eine dieser Genseguenz wiederum vorgeschaltete, für ein Signalpeptid eines Exportproteins eines Gram-positiven Bakteriums kodierende Pre-Gensequenz . Dabei können die Pre-Pro-Gensequenzen aus nur einem oder auch aus zwei unterschiedlichen Gram-positiven Bakterien stammen. Die einzelnen Genabschnitte können beispielsweise durch die Polymerase-Kettenreaktion (PCR) isoliert und durch Ligation miteinander verknüpft werden. Anschließend wird die so konstruierte Genstruktur in einen Vektor kloniert, der in dem zu verwendenden Gram-positiven Bakterium repliziert werden kann oder durch Einkreuzen in das Chromosom zum Einbau der Genstruktur in das Chromosom des Gram-positiven Wirtsbakteriums führt. So ist beispielsweise bei Verwendung von Staphylococcus carnosus als Vektor pC 194 oder bei Bacillus subtilis als Vektor pUB 110 geeignet.
Der dem Genkonstrukt notwendigerweise vorzuschaltende Promotor kann entweder mit der Genstruktur zusammen konstruiert werden oder auf dem zu verwendenden Vektor bereits vorhanden sein. Der Vektor wird schließlich in ein Gram-positives Bakterium nach gängiger Methode transformiert, wonach das Außenmembranprotein mit Signalpeptid und Propeptid nicht nur exprimiert, sondern darüber hinaus auch durch die Membran der Gram-positiven Wirtszelle transportiert und sogar in das Kulturmedium freigesetzt wird. Als Wirtszelle ist prinzipiell jedes beliebige Gram-positive Bakterium geeignet, sofern nur Vektoren und Transformationssysteme für diese existieren. Bevorzugt werden aber insbesondere solche Gram-positiven Wirtszellen, die wenig Proteaseaktivität im Kulturmedium aufweisen; denn in diesen Fällen bleibt das freige
setzte Protein im Medium über lange Zeiträume stabil.
Ausführungsbeispiel: Es wurde zunächst ein Plasmid (pJM30) konstruiert, das das Gen des reifen AuBenmembranproteins OmpA von
Escherichia coli, fusioniert mit dem Gen, welches für die Pre-Pro-Sequenz einer Lipase aus Staphylococcus hyicus kodiert, enthält. Nach Transformation des Plasmids in Staphylococcus carnosus wurde die Sekretion des Pro(Lip)-OmpA-Fusionsproteins nachgewiesen: a) Konstruktion des Plasmids pJM30. Das Lipasegen aus Staphylococcus hyicus stand auf dem Plasmid pLipPSl zur Verfügung (W. Liebl et al. (1986): Studies on lipase directed export of Escherichia coli ß-lactamase in Staphylococcus carnosus. Mol. Gen.
Genet. 204 : 166-173). Die Expression des Lipasegens erfolgt konstitutiv und wird durch den endogenen
Lipasepromotor kontrolliert. Um ein promotorloses
Lipasegen isolieren zu können, wurde im Plasmid pLipPSI ein Pstl-Linker in eine Accl-Schnittstelle ligiert, die 60 Bp oberhalb des Translationsstartes zwischen der postulierten Promotor-Region (F. Götz et al. (1985): Complete nucleotide sequence of the lipase gene from Staphylococcus hyicus cloned in Staphylococcus
carnosus. Nucl. Acids Res. 13: 3895-3906) und dem
Lipase-Strukturgen liegt. Das so konstruierte Plasmid pLipPSl-Pl wurde in Staphylococcus carnosus TM300 transformiert (F. Götz et al. (1987): Improvements of protoplast transformation in Staphylococcus carnosus. FEMS Microbiol. Letters 40: 285-288). Aus dem Plasmid pLipPSI-Pl wurde das promotorlose Lipasegen als 2,04 kB großes PstI-Fragment isoliert. Dieses Fragment wurde
anschließend in die PstI-Schnittstelle des Plasmids pUC18 (C. Yanisch-Perron et al. (1985): Improved M13 phage cloning vectors and host strains: Nucleotide sequences of M13mp18 and pUC19 vectors. Gene 33: 103-119), bei dem vorher die Sall-Schnittstelle aufgefüllt worden war, ligiert. Der Ligationsansatz wurde in den E.coli Stamm JM109 transformiert und die erhaltenen Transformanden auf Expression des Lipasegens getestet. Dies führte zur Isolierung des Plasmids pJM1, bei dem das Lipasegen in der gewünschten Orientierung unter der induzierbaren Kontrolle des lac-Promotor/Operator
Systems stein..
Im Kulturmedium von S. hyicus wird die Prolipase
(bestehend aus Prosequenz und reiler Lipase) durch eine bisher nicht bekannte, extrazelluläre Protease zur reifen Lipase abgebaut. Die Spaltung zwischen Prosequenz und reifer Lipase erfolgt dabei zwischen den Aminosäuren Thr245 und Val246 (M. van Oort et al. (1989): Purifjcat.Lon and Substrate specificity of Staphylococcus hyicus. Biochem. 28 : 9278-9285).
Zur Konstruktion eines Gens, das für eine Fusion von Signal- und Prosequenz der S.hyicus-Lipase mit dem reifen Teil des OmpA-Proteins kodiert, wurde eine SnaBI- Schnittstelle an der den Aminosäuren Thr245/Val246 entsprechenden Position in das Lipasegen eingeführt. Als Template für die Mutagenese wurde ein 1,3 kB großes SalI/HindIII-Fragment des Lipasegens (isoliert aus pJM1), das für einen Teil der Prosequenz und die gesamte reife Lipase kodiert, in den Vektor Ml3mpl8 kloniert. Die Mutagenese wurde mit dem Oligonukeotid K23 (Fig. 1) nach der Methode von Kunkel (Kunkel, T.
(1985), Rapid and efficient site-specific mutagenesis without phenotypic selection, Proc. Natl. Acad. Sci.
USA, 82/ 488-492) durchgeführt. Aus einem Klon mit dem gewünschten Basenaustausch wurde das Fragment isoliert und ins Plasmid pJM1 zurückgesetzt (Plasmid pJM1-K23). Zur Konstruktion eines-OmpA-Gens, bei dem der für die Signalsequenz kodierende Bereich deletiert ist, wurde durch Mutagenese mit dem Oligonukleotid K8 (Fig. 1) eine Eco47/3-Schnittstelle an der Position, die der Signalpeptidase-SchnittstelJe entspricht, eingeführt. Als Template wurde ein im Vektor M13mp18 kloniertes,
1,1 kB großes EcoRI/BamHI-Fragment mit dem ompA-Gen aus dem Plasmid pRD87 verwendet. Aus einem KJon mit dem gewünschten Basenaustausch wurde das Fragment isoliert, und ins Plasmid pRD87 zurückgesetzt (Plasmid pRD87-K8). Aus dem Plasmid pJMl-K23 wurde der für die reife Lipase kodierende Bereich durch SnaBI/HindIII-Verdau entfernt und durch das Eco47/3/HindIII-Fragment des Plasmids PRD87-K8, das für das reife OmpA-Protein kodiert, ersetzt (Figur 2).
Das resultierende Plasmid pJM3 trägt das gewünschte Hybridgen unter der Kontrolle der lac-Promotor/Operator Region. Für die Expression in S. carnosus wurde das Hybridgen auf einem 1,8 kB großen PstI-Fragment aus dem Plasmid pJM3 isoliert und in den Vektor pLipPSI-PI ligiert, aus dem das Lipasegen durch Pstl-Partialverdau entfernt worden war. Dies führte zum Plasmid pJM30.
Allgemeine gentechnische Methoden wie die Spaltung von DNA mit Restriktions-Endonukleasen, Ligation von DNA-Fragmenten und Transformation von E.coli wurden nach Sambrook et al. (1989) durchgeführt (J. Sambrook et al. (1989): Molecular cloning. A Laboratory Manual, 2nd edn. Cold Spring Harbor, New York: Cold Spring Harbor Laboratory Press). b) Sekretion des Pro(Lip)-OmpA-Fusionsproteins im Stamm Staphylococcus carnosus TM300.
Die Expression des Pro(Lip)-OnipA-Gens im Plasmid pJM30 wird durch den Lipase-Promotor kontrolliert und erfolgt somit konstitutiv. Zellen des S. carnosus Stammes
TM30ü/pJM30, hinterlegt bei der DSM am
unter der Nummer 8802 , wurden 1 2 Std. bei 37°C kultiviert. Zellen und Kulturmedium wurden getrennt aufgearbeitet. Nach gelelektrophoretischer Trennung der Proteine wurden Western-Blots sowohl mit Lipase-spezi.fisehen als auch mit OmpA-spezifischen Antiköprern durchgeführt. Das Ergebnis ist in Figur 3 a/b dargestellt.
Das PrO(Lip)-OmpA-Gen kodiert für ein 570 Aminosäuren großes Fusionsprotein mit einem berechneten Molekulargewicht von 72,2 kDa. Nach Abspaltung der 38 Aminosäuren großen Signalsequenz beträgt das berechnete Molekulargewicht des prozessierten Fusionsproteins 67,4 kDa. Im Kulturüberstand des Stammes TM300/pJM30 konnte eine Proteinbande mit einem scheinbaren Molekulargewicht von ca. 78 kDa nachgewiesen werden, die mit beiden Antikörpern eine deutliche Reaktion zeigt (Figur 3 a/b,
Spur 3). Hierbei handelt es sich offensichtlich um das bei der Translokation prozessierte und ins Medium freigesetzte Fusionsprotein. In der Zellproteinfraktion wurden zwei Proteinbanden mit einem scheinbaren Moleku
largewicht von ca. 78 kDa und 82 kDa gefunden, die ebenfalls mit beiden Antikörpern reagieren. Die genaue Lokalisierung dieser Proteine erfolgte durch Trypsinbehandlung protoplastierter Zellen von TM300/pJM30
(Figur 3c ) . In der unbehandelten Protoplasten-Probe (Figur 3c ; Spur 1) ist die Menge des 78 kDa Proteins deutlich geringer als in den nicht-protoplastierten Zellen (Figur 3b; Spur 2). Die Menge des 82 kDa Proteins ist dagegen in beiden Proben gleich (äquivalente Zellproteinmengen aufgetragen). Durch Trypsinbehandlung wird das 78 kDa Protein vollständig verdaut, während das 82 kDa Protein stabil bleibt (Figur 3c ; Spur 2). Nach Ultraschall-Aufschluß der Protoplasfen werden beide Proteine vollständig abgebaut (Figur 3c; Spur 3). Die Intaktheit der Protoplasten konnte durch einen
Western-Blot mit Antikörpern gegen die im Cytoplasma lokalisierte Chloramphenicol-Acetyltransferase, die auf dem Plasmid pJM30 kodiert ist, nachgewiesen werden (Daten nicht gezeigt).
Die Unterschiede zwischen dem berechneten und dem durch SDS-Polyacrylamid-Gelelektrophorese bestimmten Molekulargewicht sind möglicherweise auf den Lipase-Anteil des Fusionsproteins zurückzuführen. Die Prolipase zeigt aus bisher unbekannten Gründen im SDS-Polyacrylamidgel ein Molekulargewicht von 86 kDa, während der berechnete Wert bei 71,4 kDa liegt (F. Götz et al. (1985), Complete nucleotide sequence of the lipase gene from Staphylococcus hyicus cloned in Staphylococcus carnosus. Nucl. Acids Res. 13, 3895-3906).
Die Ergebnisse der Trypsinbehandlung zeigen, daß es sich bei dem 82 kDa großen Protein offensichtlich um den nicht-prozessierten Vorläufer des Lipase-OmpA-Fusionsproteins handelt, der im Cytoplasma akkumuliert
wird. Die in der Zellproteinfraktion gefundene, prozessierte Form des Fusionsproteins ist mit Sicherheit auf der Außenseite der Plasmamembran lokalisiert, da ein großer Teil des Proteins schon bei der Protoplastierung der Zellen abgelöst wird und der restliche Anteil durch Trypsin abgebaut wird. Entscheidend ist jedoch, daß das OmpA-Protein mit Hilfe des Lipase-Propeptids zum allergrößten Teil in löslicher Form ins Medium sekretiert wird. Da Staphylococcus carnosus sehr wenig Proteaseaktivität im Kulturüberstand aufweist., bleibt das Hybridprotein im Modium über lange Zeit stabi l . Während das Propeptid - dessen genaue Funkt ion bisher noch unbekannt ist - im Normalfall nach dem Membrandurchgang entweder autoka talytiseh oder durch im extrazellulären Medium vorhandene Proteasen vom reifen Protein abgespalten wird, bleibt gemäß des Ausführungsbeispiols das Propeptid am Außenmembranprotein gebunden. Um eine Abspaltung auch des Propoptids zu erreichen, könnte durch Synthese von Oligonukleotiden eine Gensequenz hergestellt werden, die für eine Aminosäuresequenz kodiert, welche einer Proteaseschnittstelle entspricht. Die Gensequenz könnte zusätzlich zwischen dem für das Außenmembranprotein kodierende Gen und der ProGensequenz eingebaut werden, so daß nach Freisetzung des Hybridproteins dieses mit der entsprechenden Protease behandelt wird. Danach ist möglicherweise nur noch das reife Außenmembranprotein aus dem Kulturmedium oder -überstand erhältlich.