WO1995015374A1 - Nouvelle metalloprotease et adn codant pour cette derniere - Google Patents

Description

明 細 書

発 明 の 名 称

新規な メ タ 口プロ テアーゼおよ び それを コ ー ドする D N A

技術分野

本発明は、 癡纏胞の存在の有無、 癌の悪性度の診断等 に、 あるいばそ ©、他の医学的、 生理学的分野の用途に有 用な.餹欐なメ 夕 プロテア一ゼに関する。

さ らに詳し く 言 / ば、 本発明は ヒ ト癌細胞で特異的に 発現 している メ タ 口 プロ テア一ゼの 1 種な らびにそれを コ ー ドする遣伝子 D NA配列、 その DNA配列を含有する塩基 配列を有するプラ ス ミ ド、 そのプラ ス ミ ドを有する宿主 細胞、 該宿主細胞を用いる該タ ンパク質の製造方法、 前 記 D N A配列 とハイ ブ リ ダィ ズするプロ ーブ、 該プロ ーブ を用いる前記 DNA配列を有する DNAま たは R NAの検出方法、 前記のタ ンパク 質に特異的に結合するモ ノ ク ロ ーナル抗 体に関する ものであ る。

背景技術

コ ラ ーゲ ン、 プロ テオグ リ カ ン、 エラ スチ ン、 フ イ ブ ロ ネ ク チ ン、 ラ ミ ニ ン等の複雑な成分か ら構成される細 胞外マ ト リ ッ ク スの分解には、 基質特異性を異にする マ ト リ ッ ク スメ タ ロ プロテア一ゼと総称される一群の酵素 (以下 MMP sと略記する）が関与 している。

こ れま で MMPsと しては、 間質型コ ラ ゲナーゼ（MMP - 1 )、 72kDaゼラ チナ一ゼ（I V型コ ラ ゲナーゼあ る いはゼラ チナ ーゼ A と もい う ： MMP- 2)、 92kDaゼラ チナーゼ（IV型 コ ラ ゲナーゼあ る いはゼラ チナーゼ B と もい う ： MMP-9)、 ス ト ロ ムラ イ シ ン一 1 (MMP- 3)、 マ ト リ ラ イ シ ン（MMP-7)、 好中球コ ラ ゲナーゼ（ M M P - 8 )、 ス ト ロ ム ラ イ シ ン一 2 (MMP-10)、 ス ト ロ ムラ イ シ ン— 3 (MMP- 11)等が報告され ている。

こ れらの MMPSはフ ァ ミ リ ー ,形成 し、 遺伝子の一 造は既に報告されている。 決定，されている MMPsフ ァ ミ リ 一間の一次構造においては、 MMP 7を除き各 MMPは基本的 に N —末端プロペプチ ド ドメ イ ン、 Zn +結合触媒 ドメ ィ ン、 C 一末端へモぺキ シ ン凝血酵素様 ドメ イ ンの 3 つか ら構成されている。 MMP- 7においてはへモぺキシ ン凝血 酵素様 ドメ ィ ンはない。 MMP- 2と MMP-9では、 こ の他にゼ ラ チ ン結合 ドメ イ ンを含んでいる。 さ らに、 MMP-9では、 Z n ⁺結合触媒 ドメ ィ ンと C 一末端へモぺキ シ ン凝血酵素 様 ドメ イ ンの間にプロ リ ンに富む V型コ ラ ーゲ ン α 2鎖 と相同性の高い ドメ ィ ンが挿入されている。

転移性の高い癌細胞では、 IV型コ ラ ーゲ ンを主た る基 質 とする IV型 コ ラ ゲナーゼ（ΜΜΡ-2、 ΜΜί>- 9)の顕著な発現 が見 られる こ とが報告されてお り （キ ャ ンサー リ サーチ (Cancer Res. ) 、 第 46巻、 1〜 7頁（1986) ； バイ オケ ミ カ ル ア ン ド バイ オフ イ ジ力ノレ リ サーチ コ ミ ュニケ一 シ ョ ンズ（Biochem. Biophys. Res. Commun. )ヽ 第 154卷、 832〜 838頁（1988) ； キ ャ ンサー（Cancer)、 第 71巻、 1368 〜 1383頁（ 1993))、 また、 MMP - 9の活性化が MMP— 3の作用 によ っ て引 き起こ さ れる こ とが報告されている （ザ ジ ャ ーナル ォブ ノくィ ォ ロ ジカノレ ケ ミ ス ト リ ー（ J . B i o l . Chem . )第 267巻、 3581〜 3584頁（ 1992 ) )。

マ ト リ ッ ク ス メ タ 口 プロ テアーゼの発現の程度は、 癌 の悪性度を診断する指標 とな る。

発明の開示

本発明者 らは新規 ¾マ ト リ ッ' ス メ タ 口 プロ テア一ゼ (以下本明細書におい、て S Τ-ΙΙΡέ:記述する）を見出 し、 その構造分析を行っ た。

本発明によ り 、 下記に記載される とお り 、 新規な メ タ 口 プロテア一ゼタ ンパク質、 その タ ンパク 質を コ ー ドす る塩基配列を有する DN A、 こ の DN A塩基配列を有するブラ ス ミ ド、 こ のプラ ス ミ ドを有する宿主細胞な らびに上記 メ 夕 口 プロ テア一ゼタ ンパ ク 質を特異的に認識する モ ノ ク ロ 一ナル抗体が提供される。

1. 配列表配列番号 1 に示されている ァ ミ ノ 酸配列を 有する タ ンパク質。

2. 配列表配列番号 1 に示されている ア ミ ノ 酸配列を 有する タ ンパク 質を コ 一 ドする配列表配列番号 2 に示さ れている塩基配列を有する DNA。

3. 配列表配列番号 2 に示 されている塩基配列を有す る D N A配列を含有 し、 配列表配列番号 1 に示 されている タ ンパ ク 質を発現する プラ ス ミ ド。

4. 配列表配列番号 2 に示 されている塩基配列を有す る D N A配列を含有 し、 配列表配列番号 1 に示されている タ ンパ ク 質を発現する プラ ス ミ ドを有する宿主細胞。

5. 配列表配列番号 1 に示されている ア ミ ノ 酸配列を 有する タ ンパク 質を特異的に認識するモ ノ ク ロ ーナル抗 体。

以下に、 本発明を詳細に説明する。

本発明者 らは、 公知 マ ト リ ッ ク スメ タ 口プロ テア一 ゼ（MMP)フ ァ ミ リ ーのア ミ ノ 酸配列から選択 した高度に 保存されている配列 ¾ (配列表配列番号 3 および 4 )よ り 、 配列表配列番号 5 および 6 に記載 した配列を有するオ リ ゴヌ ク レオチ ドプラ イ マーを設計、 合成 した。 該オ リ ゴ ヌ ク レオチ ドプラ イ マー と ヒ ト胎盤 cDNAラ イ ブラ リ ーを 用い、 PCR反応を行い、 得られた PCR産物の各 DNAの塩基 配列を決定 し、 公知の MMPと相同でない配列を有する 390 b. p.の DNA断片を得た。 こ の 390b. p. DNA断片をプロ ーブ と し、 ヒ ト胎盤 cDNAラ イ ブラ リ ーのス ク リ ーニ ングを行 い、 得 られた陽性ク ロー ンのフ ァ 一 ジ DNA中に組み込ま れていた cDNAの塩基配列を決定 した。 塩基配列は配列表 配列番号 2 に記載の塩基配列であ る。 配列表配列番号 2 に記載の塩基配列 と同一の配列は、 GENBANKZEMBL DNA Data Base中には存在せず、 こ の塩基配列を有する DNAは 全 く 新規な ものであ る こ とが認め られた。

配列表配列番号 2 に記載 した上記の ク 口 一 ンの cDNAの 塩基配列は、 3' 非翻訳配列と共に推定 582ァ ミ ノ 酸残基 のオープン リ ーディ ングフ レームを有 していた。 開始コ ド ン は塩基番号 112に位置 し、 停止 コ ド ン は塩基番号 1858に存在する。 こ のオープ ン リ ーディ ングフ レームは、 配列表配列番号 1 に記載 した 582ァ ミ ノ 酸か らな る配列 を コ ー ド してお り 、 開始コ ド ンのす ぐ下流か ら推定され る シ グナル配列が続き、 C末端のア ミ ノ 酸番号 533か ら 562に 20個以上の疎水性ア ミ ノ 酸の連続 した膜結合型タ ンパ ク 質に特徴的な疎水性領域（配列表配列番号 ' 7 )が存 在する こ とが認め られた。

図 2 に示すよ う に MT-MMPの "Fミ ノ酸酷彌と公知の MMP フ ァ ミ リ ーのア ミ ノ 酸配列との相同性を調査 した結果、 MT-MMPは公知の MMPフ ァ ミ リ 一 と高い相同性を示 した。

1IMPフ ァ ミ リ 一で保存されている前駆体と成熟体のプロ セ ッ シ ン グ部位近傍の配列、 および活性部位の配列は MT -MMP中で最も良好に保存さ れていた。 ま た MT- MMPでは、 他の M M Pフ マ ミ リ 一のァ ミ ノ 酸配列上には認め られない 配列表配列番号 7 に示 した疎水性ア ミ ノ 酸の連続 した配 列が存在 し、 膜貫通型タ ンパク質の構造的特徴を有する こ とか ら、 他の MPフ ア ミ リ ー と は異な る膜結合型の MMP であ る こ とが強 く 示唆された。

MT- MMPの ヒ ト組織中での発現を各種の組織由来 Poly(A) RNAに対する ノ ーザ ンブロ ッ ト分析によ り 検討 した結果、 胎盤、 肺、 腎臓で高い発現を している こ とが認め られた (図 3参照）。 ま た、 ヒ ト 肺偏平上皮癌の正常部分および 癌部分か ら抽出 した RNAに対 しノ ーザ ンブロ ッ ト分析を 行っ た結果、 MT - MMPは癌部位で特異的に発現 している こ とが認め られた（図 4参照）。 なお、 本発明の MT- MMPは、 抗 MT- MJIPモノ ク ロ 一ナル抗 体を用いた免疫沈降や免疫染色実験によ り遺伝子 ¾物が 分泌される こ とな く 細胞膜上に発現されている こ とが示 され、 ま た、 MT-MMP遣伝子を ト ラ ン スフ ヱ ク シ ヨ ン した 細胞では、 MT- MMPの発現に依存した MMP- 2の活性化が観 察され （ネイ チ ヤ ー （Nature)、 第 370卷、 61〜 65頁 (ί994'"₀

以上述べた本発明者 らの研究成果によ り 、 本発明によ り 、 配列表配列番号 1 に記載されたア ミ ノ 酸配列を有す る新規なマ ト リ ッ ク スメ タ 口 プロテアーゼタ ンパク質が 提供される。

ま た、 本発明によ り配列表配列番号 1 に記載されたァ ミ ノ 酸配列を有する タ ンパク質を コ 一 ド している配列表 配列番号 2 に記載された塩基配列を有する DNA、 該 DNAを 有 し発現 し得るプラ ス ミ ド、 こ のプラ ス ミ ドを有する宿 主細胞が提供される。 上記の宿主細胞と しては、 大腸菌 枯草菌な どの原核細胞宿主、 酵母、 COS細胞、 CH0細胞、 3T3細胞な どの真核細胞、 Sf 21な どの昆虫細胞等、 通常 遺伝子組換え技術で用い られる全ての宿主細胞を用いる こ とができ る。 上記のプラ ス ミ ドと しては、 通常用い ら れる宿主細胞に応 じた発現べク 夕 一を用いる こ とができ る o

さ らに本発明によ り 、 配列表配列番号 2 に記載された 塩基配列を有する DNAか ら転写さ れる raRNAが提供 され る。 上記の DNAある いは RNAとハイ ブ リ ダイ ズし、 該 DNAま たは RNAを特異的に検出するプロ ーブも提供されるが、 該プロ ーブは、 通常使用 さ れる放射性同位元素、 酵素な ど に よ り 標識 さ れ、 通常の ブ ロ ッ テ イ ン グ分析、 I n situハイ ブ リ ダィ ゼー シ ヨ ンで該 DNAあ る いは BNAと特異 的にハイ ブ リ ダィ ズ し、 検出でき る ものであれば配列表 配列番号 2 に記載 した塩基配列の一部を有する、も ©であ ればよ く 、 どのよ う な塩基配列でも よい。

さ らに、 本発明は、 本発明に係る MT-MMPと特異的に糕 合する モ ノ ク ロ ーナル抗体を提供する。

本発明に係るモ ノ ク ロ ーナル抗体は、 ヒ ト MT-MMPを免 疫原 と して公知の方法、 例えば ミ ルシ ュ タ イ ン らの方法 (ネィ チ ヤ —（Nature)、 第 256巻、 495〜 497頁（1975)) に よ り 製造する こ とができ る。 こ の方法において、 免疫原 と しては天然型 ヒ ト MT- MMP、 組換え ヒ ト MT- MMPおよびそ れ らの一部のァ ミ ノ 酸 列を有する合成べプチ ド等の何 れで も よい。

本発明によ り 、 本発明に係る新規な MT-MMPのア ミ ノ 酸 配列を有する タ ンパク 質を コ ー ドする塩基配列を有する DNAをク ロー ン化 し、 その DNAおよびその DNAにコー ドさ れている 夕 ンパク質を遺伝子工学的方法によ り 製造する こ とができ る。 こ の新規な MT- MMPの cDNAク ロ ー ンを用い る こ と によ り 、 上記の塩基配列を遺伝子工学的に常用 さ れる方法を用いて他のべク タ ーあ る いは宿主への ク ロ ー ン化を行う こ とができ る。 ま た、 上記の cDNAの塩基配列 に準拠 して適宜、 プロ ーブに適 した DNAを設計 し、 調製 する こ とができ る。 さ ら に、 本発明に係わる MT- MMPの遺 伝子塩基配列を も と に遺伝子工学的に常用 される方法を 用いる こ と によ り 、 MT- MMPのア ミ ノ 酸配列中に適宜、 1 個ない しは複数個以上のア ミ ノ 酸の置換、 欠失、 挿入、 .：;.転移あるいは付加した如き変異を導入 した相当する タ ン ' タ質を製造する こ とができ る。 メ タ 口 プロ テア ーゼの - . 共通の糠徵である前駆体 と成熟体のプロ ッ セ シ ン グ部位 近傍の配列や活性部位の配列、 ドメ イ ン構造、 MT- MMPの 特徴であ る C末端近傍に存在する疎水性ア ミ ノ酸の連続 した疎水性領域が維持されていれば、 上記の如き誘導体 は全て本発明に包含される。

本発明の前述 した種々 の態様を利用する こ とによ り 、 癌細胞の存在の有無、 癌の悪性度な どの診断用の診断剤 あ る いは診断方法の用途に、 あ る いはま た、 その他の医 学的生理学的分野の用途に適用 される種々 の技術手段を 提供する こ とができ る。

以下、 実施例によ り 本発明を具体的に説明するが、 本 発明は、 これ ら実施例によ り 限定される も のではない。0 実施例

実施例 1

新規な メ タ 口プロ テア一ゼ（MT- MMP)cDNAの単離

( a ) cDNAラ イ ブラ リ ーの構築

ヒ ト 胎盤組織か ら全 R N Aを グァニ ジ ン一塩化セ シ ウ ム5 法 （バイ オケ ミ ス ト リ ー （Biochemistry)、 第 18巻、 5294 〜 5299頁（1979) ) によ り抽出 し、 ポ リ （A) ⁺ RNAをオ リ ゴ (dT)—セルロ ースカ ラ ムを使用 して精製 した。 精製 した ポ リ （A) + RNAをテ ンプレー ト、 オ リ ゴ（dT)をプライマー と してガブラ ー · ホフ マ ン（Gubler · Hoffman)法（ジー ン (Gene). 第 25巻、 263〜 269頁（ 1983) ) に従い、 cDNAを合 成 した。 T ₄ DNAポ リ メ ラ 一ゼによ り cDNAの末端を平滑化 した後、 E c 0 R I メ チラ ーゼによ り c D N A中に存在する EcoR I サイ ト をメ チル化 した。 さ ら に EcoR I リ ンカ一

[ d(pG-G-A-A-T-T-C-C) と cDNAを T₄DNAリ ガーゼを用い 連結 さ せた後、 E c oR I 消化する こ と に よ り 両末端に EcoR I サイ ト を有する cDNAを構築 した。 こ の cDNAを λ gtllの EcoR I サイ ト に T₄DNAリ ガーゼを用い連結させ た。 次に こ の cDNAを例えばィ ン ビ ト ロパ ッ ケー ジ ングキ ッ ト （ A m e r s h a m )を使用 し、 イ ン ビ ト ロパ ッ ケー ジ ング を行い、 cDNAラ イ ブラ リ ーを構築 した。 cDNAラ イ ブラ リ 一 と し て市販の例え ば ヒ ト 胎盤 c D N A ラ イ ブラ リ 一 (CLONTECH)を使用する こ と もでき る。

( b ) 合成オ リ ゴヌ ク レオチ ドプラ イ マーの作製

既知の MMPsフ ァ ミ リ ーのァ ミ ノ 酸配列の中か ら、 MMPs フ ア ミ リ ー中で高度に保存されている ア ミ ノ 酸配列と し て配列表配列番号 3 ( P - 1 )および配列番号 4 に記載 した 配列（P- 2)を選択 した。 こ のオ リ ゴペプチ ド P-1およびォ リ ゴぺプチ ド P - 2のそれぞれに対応するオ リ ゴデォキ シ ヌ ク レオチ ドプラ イ 'マ一を設計 した。 すなわち、 オ リ ゴ ペプチ ド中に 2 つ以上の コ ド ンでコ ー ドさ れる ア ミ ノ 酸 が存在する場合そ の混合物と し配列表配列番号 5 (ブラ イマ一 1 )および配列番号 6 (プラ イ マ 一 2 )に記載 した 配列の ごと く 設計 した。 こ のプラ イ マ一 1 およびプラ イ マー 2を DNAシンセサイザ Model 392 (Applied Biosys- terns) を使用 し、 /3 — シァ ノ エチルフ ォ フ ォ ア ミ ダイ ト (/S— cyanoethyl pfe sphoaraidite)法によ り 合成 した。 得 れたプライ マー 1およ プラ イ マ 一 2 は 10mMリ ン酸 ナ ト リ ゥ ム緩衝液 a 6. 8;で平衡化 し た二 ッ ク カ ラ ム (rharraacia)を用い精製 した。

( c ) PCRによ る遺伝子増幅

ヒ ト胎盤由来の cDNAをテ ンプ レー ト、 前項（b )に記載 したプラ イ マー 1 およびプラ イ マー 2 をプラ イ マー と し て PCR反応（PCRテ ク ノ ロ ジ一（PCB Technology)63〜67頁、 ス ト ッ ク ト ンプ レス (Stockton Press))を行っ た。

その結果、 390 b. p. の PCR産物を得た。 得られた PCR産 物を適当なプラ ス ミ ド、 例えば pUC 119や pBluescriptに ク ロ ーニ ング し、 こ の PCR産物の塩基配列を、 蛍光 DNAシ 一ケンサ Model 373A(Applied Biosystems)ヽ Taqダイプ ラ イ マ ー サ イ ク ノレ シ ー ク ェ ン シ ン グキ ッ ト （Appl i ed- Biosystems) を使用 し決定 した。 塩基配列を決定 した種 々 の PCR産物の中か ら既知 MMPの塩基配列と相同性のない PCR産物 Aを得た。 こ の PCR産物 Aを前述の（ a )項に記載 した ヒ ト 胎盤組織 cDNAラ イ ブラ リ 一をス ク リ ーニ ングす るためのプロ ーブと して用いた。 プロ ーブの ³² P標識は、 ラ ンダムプライ ム ド DNAラベ リ ングキ ッ ト （Boehringer Mannhaim)を使用 して行っ た。

(d ) cDNAラ イ ブラ リ ーからの新規 MMP遺伝子のス ク リ 一二 ン グと塩基配列の決定

前述の（ a )に記載 した ； I g t l l中に構築 した ヒ ト胎盤 cDNAライ ブラ リ ーを宿主菌大腸菌 Y1090に感染させ、 プ ラー ク を形成させた。 すなわち、 Y1090株を 0. 02%マル ト ースを含む L培地で 1 晚培養後、 集菌 し、 ΙΟπΜ MgS0₄ に懸濁 した。 こ の細胞懸濁液と フ ァ ー ジ液を混合 し 37°C 15分間イ ンキ ュベー ト し、 フ ァ ー ジを宿主菌に吸着させ た。 これに軟寒天を加え、 Lプレー ト上に広げた （上記 の操作を以後プ レーテ ィ ングと称す） 。 プ レー ト を 42°C で 1 晚イ ンキ ュベー ト し、 プラ ー ク を形成させた後、 ナ イ ロ ン フ イ ノレ タ ー（例えば、 ノヽィ ボ ン ド 一 N (Amersham)) あ る い はニ ト ロ セ ノレ ロ ー ス フ ィ ル タ ー （例え ば H A T F (Millipore))をプ レー ト上に置き、 約 30秒間放置 した。 膜を穏やかに剥が しアルカ リ 変性液（0.1M NaOH、 1.5M NaC に 30秒間浸 した後、 中和液（1.5M NaC 含有 0.5M Tris— HC 緩衝液、 pH8 )に 5分間浸 した。 こ のフ ィ ルタ 一を 2 X SSPE(0.36M NaC 、 20mM NaH₂P0" 2 mM EDTA) で洗浄 した後、 風乾 した。 上述のプラ ー ク のフ ィ ルタ 一 への転写を繰 り 返 し、 少な く と も 2枚のフ ィ ルタ 一を調 製 した。 但 し、 2枚目以降のフ イ ノレタ ー とプ レー ト の接 触時間は 2分間程度に延長 した。 こ の フ ィ ル タ ーを 80°C で 2 時間べ一キ ン グ し、 DNAを固定 した。 1 つのプ レー ト か ら調製 した少な く と も 2枚のフ ィ ルタ ーをそれぞれ 42°C、 1 時間洗浄液（ 1 M NaC 、 1 mM EDTAおよび 0.1 % SDS含有 50ιπΜ Tris— HC 緩衝液、 pH8.0) で洗浄後、 ハイ ブ リ ダィ ゼー シ ヨ ンノく ッ グ中にフ イ ノレタ ーを入れ、 プ レ ハ イ ブ リ ダィ ゼ一 シ ヨ ン溶液（50% formamide、 5 Denhardt' s溶液（0. 2%ゥ シ血清ァ ノレブ ミ ン、 0. 2 % polyvinylpyrolidone) 5 SSPE^ 0.1¾ SDS. 100 g/ 熱変性サケ精子 DNA)に翳 、 で 6〜 ίΤ'時間プ レハ イ ブ リ ダィ ゼ一 シ ヨ ンを If た。 ¾に 1 β 0で、 5分間加 熱変性させた（ c )項で記載 した ^{3 2} Ρ標識プローブをプレ ハイ ブ リ ダィ ゼ一 シ ヨ ン溶液に添加 し、 42°Cで 1 晚ハイ ブ リ ダィ ゼ一 シ ョ ンを行っ た。 ハイ ブ リ ダィ ゼー シ ョ ン 完了後、 フ ィ ルタ ーを室温で多量の 0. 1%SDS含有 2 X SSC溶液で洗浄 した。 次にフ ィ ルターを 0. 1%SDS含有 1 X SSC溶液中に 68°C、 15分間置いた。 このフ イ ノレターを 風乾 した後、 X線フ ィ ルム（Kodak XR)と重ね— 70°Cで 1 週間ォー ト ラ ジオグラ フ ィ ーを行っ た。 X線フ ィ ルムを 現像 し、 1 枚のプ レー トか らできた 2枚のフ ィ ルムを重 ね、 重な る シグナルをマー ク した。 マー ク した シグナル に相当するプラーク を SM溶液（lOOmM N:aC および 10mM MgS0₄含有 50mM Tris— HC 緩衝液、 pH7.5) に懸濁 した。 こ のフ ァ ー ジ懸濁液を適度に希釈 してプ レーテ ィ ング し 上記と同様のス ク リ ーニ ングを行い、 組換え体フ ァ ー ジ を得た。

( e ) 組換え体 A gtll DNAの調製

ク ロ ー ン化 したフ ァ ー ジをそれぞれプ レーテ ィ ング し 42°C、 3 時間イ ンキ ュベー ト し、 続いて 37°C、 1 晚イ ン キ ュベ一 ト した後 SM溶液に数滴の ク ロ 口 ホルムを加え室 温で 30分間放置 した。 SM溶液と共に上層の軟寒天を搔き 取 り 、 遠心分離 した。 遠心後の上清に終濃度 10%にな る よ う にポ リ エチ レ ン グ リ コ ールを加え撹拌 した後、 4 °C で 1 時間放置 した。 こ れを遠心分離 し上清を捨て、 フ ァ ー ジ粒子を回収 した。 こ のフ ァ ー ジ粒子を SM溶液に懸濁 し、 グ リ セ ロ ールグラ ジェ ン ト超遠心分離法 （モ レキュ ラ 一 ク ロ 一 ニ ン グ、 ァ ラ ボ ラ ト リ ー マ ニ ュ ア ル (Molecular cloning, a laboratory manual) T . マ二 ァスチス（T. Maniastis)他著、 コ ール ド スプ リ ング ハ 一ノくー ラ ボラ ト リ ー プレス（Cold Spring Harbor Laboratory Press)発行、 2.78頁（ 1989) )によ り 精製 した（ 得 られたフ ァ 一 ジを T M溶液に懸濁 し、 DNase I および Nase Aで処理後、 20mM EDTA、 50 ^ 9 / nR Proteinase K および 0.5% SDSの混合液を加え 65°C、 1 時間イ ンキュべ 一 卜 した。 こ れをフ ヱ ノ ール抽出、 ジェチルェ一テル抽 出後、 エタ ノ ール沈殿によ り DNAを沈殿させた。 得 られ た DNAを 70%エタ ノ ールで洗浄後乾燥 じ、 TE溶液（ 10mM EDTA含有 10mM Tris— HC 緩衝液、 pH 8 ) に溶解 した。

( f ) 挿入断片の塩基配列決定

前項（ e )で調製 した ； gtll DNAを EcoR I で分解し、 揷入 断 片 を 分離精製 後 、 ベ ク タ ー p B l u e s c r i p t (Stratagene) ©EcoR I 部位にク ローニングした。 この 組換え体 P Bluescriptで大腸菌 NM522 XLI-Blueを形質 転換 した。 形質転換細胞を F' 選択後、 ヘルパー フ ァ ー ジ VCSM13(Stratagene)を感染させ終液培養 した。 培養液 を遠心分離 し菌体を除き、 これに PEGZNaC を加えフ ァ ー ジを沈殿させた。 沈殿を TE溶液に懸濁後、 1 本鎖 D N A をフ ヱ ノ ール抽出、 エタ ノ ール沈殿によ り 回収 した。 こ の 1 本鎖 DNAの塩基配列を蛍光 DNAシーケ ンサ Model 373A (Applied Biosystems) ^ Tagダ プライマ一サイ クノレシ ー ク ェ ン シ ングキ ッ ト （Applied ffii®system 》を使用 し決 定 した。 決定 した塩基配列の全長は 340¾塩基対であ り 、 その配列は配列表配列番号 2 に記載 した。 G E N B A N K / EMBL DNA Data Baseを使用 し、 配列表配列番号 2 に記載 した塩基配列を検索 したが、 同一の配列は存在 しなかつ

( g ) 遺伝子産物の解析

配列表配列番号 2 に記載 した遺伝子塩基配列か ら予想 される配列表配列番号 ： I に記載 したァ ミ ノ 酸配列の親水 疎水性値をカ イ ト · ドー リ ト ル（Kyte · Doolittle)法（ジ ヤ ーナル ォブ モ レキ ュ ラ ーノくィ ォ ロ ジ一（ J . M 01. Biol. )、 第 157巻、 105〜 132頁（1982))によ り 算出 し、 図 1 に示す親水性、 疎水性分布図を決定 した。 配列表配列 番号 1 のァ ミ ノ 酸 533位か ら 562位の C末端領域に膜結合 型タ ンパク質に特徴的な 20個以上の疎水性ァ ミ ノ 酸が連 続する配列か らな る疎水性領域が存在 し、 その配列を配 列表配列番号 7 に示 した。 こ のよ う な疎水性のア ミ ノ 酸 が連続 している配列は、 既知の MMPsには見 られない配列 であ る。

配列表配列番号 1 に記載 した ァ ミ ノ 酸配列を公知の MMPsのア ミ ノ 酸配列とその相同性を比較 した結果、 配列 表配列番号 1 に示 したア ミ ノ 酸配列は、 MMPsフ ァ ミ リ ー と相同性を示 した。 特に、 MMPsフ ァ ミ リ ーで非常に高度 に保存されている 前駆体 と活性型の切断部位および活性 餛黻は ΜΓ - HPでもそれぞれ高い保存性を示 した （配列表 黼猁番号 1、 ア ミ ノ 酸 88位〜 97位およびア ミ ノ 酸番号 112位〜 222粒）。

実施例 2 遺伝子発現

( a ) 組織での発現

ヒ ト心瞧、 脳、 胎盤、 肺、 肝臓、 骨格筋、 腎臓、 膝臓 各組織由来のポ リ （A) ⁺RNAをブロ ッ ト してあるメ ンブレ ン ヒ ューマ ン マルチプル テ ィ ッ シ ュ ノ ーザン ブロ ッ ッ（CL0NTECH)に対し、 ^{3 2} P標識した実施例 1 ( c )項に 記載 した PCR産物 Aをプロ ーブと して用いてハイ プ リ ダ ィ ゼ一 シ ヨ ンを行っ た。 3x SSC(0.45M NaC 、 0.045M trisodiumcitrate— 2H₂0、 pH7.0) で湿らせたヒユ ーマ ン マルチプル テ ィ ッ シ ュ ノ ーザ ン ブロ ッ ツのフ ィ ル タ ーをプ レハイ ブ リ ダィ ゼー シ ヨ ン溶液（0.75M NaC 、 2.5mM EDTA、 0.5 x Denhardt' s溶液、 50%For画 ideおよ び 1 %SDS含有 20mM Tris— HC 緩衝液、 pH7.5) 中で穏ゃ かに撹拌 しなが ら 2〜 3時間プ レハイ ブ リ ダイ ズ した。 次にハイ ブ リ ダィ ゼ一 シ ョ ン溶液 （プ レハイ ブ リ ダィ ゼ ーシ ヨ ン溶液に 10%Sodium Dextran, 50 ケ精子 DNAを加えた溶液）に熱変性 したプロ ーブを加えプ レハイ プ リ ダイ ゼー シ ョ ン溶液と交換 し、 43°Cで 1 晚ハ イ ブ リ ダィ ゼー シ ョ ンを行っ た。 ハイ ブ リ ダィ ゼ一 シ ョ ン完了後、 0. 1 %SDS含有 2 X SSC溶液で洗浄した。 次に フ ィ ルタ 一を 0. 1 %SDS含有 1 X SSC溶液中に 68°C、 15分 間置いた。 こ のフ ィ ルタ 一を風乾 した後、 X'線フ ィ ルム (Kodak XR)と重ね— 70°Cで 1 週間ォー トラ ジ ォグラフ ィ 一を行っ た。 MT-MMP遣伝子の転写産物の'サイ ズば、 ftれ の組織でも 4.8kb.であ つ'た。 現像 した X線ナイ ルムをデ ン シ ト メ一タ ーで ト レース し シグナルの強度を測定 した 結果、 MT- MMP遺伝子は、 調べた組織中、 肺、 胎盤、 腎臓 で高い発現を認めた。

(b ) 癌組織での発現

ヒ ト肺偏平上皮癌 2 例それぞれか ら正常組織と癌組織 を採取 し、 全 R N Aをグァニジ ン一塩化セ シ ウ ム法によ り 抽出 した。 10// 9の該 RNAそれぞれを 1 %ァガロ ース電気 泳動後、 ナ イ ロ ン メ ンブ レ ンに ト ラ ン ス フ ァ ー し、 実施 例 1 ( c )項に記載 した ^{3 2} P標識 したプローブを使用 して ノヽイ ブ リ ダィ ゼー シ ヨ ンを行っ た。 ハイ ブ リ ダィ ゼ一 シ ヨ ンお よ びオ ー ト ラ ジオ グラ フ ィ 一の ト レ ー ス は前項 ( a )と同様に行っ た。 いずれの ヒ ト肺偏平上皮癌におい て も癌組織（図 4 T参照）での発現が正常組織（図 4 N 参照）に比べ有意に高値を示 した。

実施例 3 モ ノ ク ロ ー ナル抗体の調製

( a ) 抗原ポ リ ペプチ ドの調製 配列表配列番号 1 に記載 した MT- MMPのア ミ ノ 酸配列中 よ り 他の MMPフ ァ ミ リ ー と の相同性が低い特異的な配列 と して配列表配列番号 8 (配列表配列番号 1 ア ミ ノ 酸番 号 160位〜 173位の配列）、 同 9 (配列表配列番号 1 ァ ミ ノ 酸番号 320位〜 333位の配列）および同 10 (配列表配列番号 1 ァ ミ ノ 酸番号 498位〜 512位の配列）に記載 した配列（以 下それぞれ恭 ¹ !1ペプチ ド A、 ポ：リ ベプチ ド Bおよびポ リ ペプチ ド C と略記する》 を選択 した。 これ らのポ リ ぺプ チ ドをぺプチ ド合成機 （ぺプチ ドシ ンセサイ ザー 9600、 MilliGen/ Biosearch)を用い Fmoc-BOP法によ り 合成 し、 N末端に システィ ンを導人 した。 合成 した各ペプチ ドは 高速液体ク ロ マ ト グラ フ ィ 一によ り 精製 した。

( b ) 各ポ リ べプチ ドとキーホール リ ンべ ッ 卜へモ シァ 二 ンの複合体の調製

2 β?キーホーノレ リ ンべ ッ 卜 へモ シァニ ン（KLH)を 1 »ί の 0. 1 Mリ ン酸緩衝液（ρΗ7. 5)に溶解した もの と 1. 85 H 9 Ν― (, ε ― maleimidocaproyloxy)succinimide¾r 200 / £CD ジ メ チルホルムア ミ ドに溶解 した もの と混合 し、 30°C、 30分間反応させた。 ついで、 上記の混合液を 0. 1 M リ ン 酸緩衝液（PH7.0)で平衡化した PD— lO(Pharmacia)でゲル ろ過 した。 マ レイ ミ ドが結合 した KLHを分取 し、 1.5 以 下に濃縮 した。 マ レイ ミ ドが結合 した KLHに対 し 50倍モ ル量の前記（ a )で合成 した各ポ リ べプチ ドを 1 _B の 0. 1 ！^ リ ン酸緩衝液（pH7. 0)に溶解 した ものとをそれぞれ混 合 し、 4 °C、 20時間イ ンキュベー ト し、 KLH—ポ リ ぺプ チ ド複合体を調製 した。

( C ) 抗体産生細胞の調製

前項（ b )で調製 した 3種類のポ リ ペプチ ド A、 ポ リ べ プチ ド B およ びポ リ べプチ ド C と KLHとの複合体それぞ れ を完全フ ロ イ ン ドア ジ ュバ ン ト と共に 8週令 Balb/c雌マウ スに腹腔内投'与 し、 初回免疫 した。 18日 後に 0. 1Mリ ン酸緩衝液（ p H 7. 5)に溶解した各複合体 200 9 をそれぞれの初回免疫 したマウ スに腹腔内投与 し、 追加兔？疫 した。 さ らに 32曰後に追加免疫時と同様に各複 合体 100〃 9を静脈内投与 し、 最終免疫と した。 その 3 曰 後に脾臓を摘出 し、 脾細胞懸濁液を調製 した。

(d ) 細胞融合

8 ーァザグァニ ン耐性 ミ エローマ細胞 SP2(SP2ZO-Ag 14)と の融合は、 オイ （Oi) らの方法（セ レ ク テ ッ ド メ ソ ッ ド イ ン セルラ ー ィ ムノ ロ ジー（Selected Method in Cellular I mraunology B. B . ミ ツ シェノレと S. M . シーギ編（ed. B. B. Mishell and S. . Shiigi), W. H. フ リ ーマ ン ア ン ド カ ンノ、。ニー（W. H . Freeman and Company)発行、 351〜 372頁（ 1980) ) を若干改変 して行つ た。 以下では、 ポ リ ペプチ ド A— K L H複合体で免疫 した マウ ス由来の有核脾細胞と ミ エロ ーマ細胞 SP2との融合 に関 して詳述する。

前項（ c )で調製 した有核脾細胞（生細胞率 100% ) それ それと ミ エロ ーマ細胞（生細胞率 100% ) とを 5 ： 1 の比 率で以下の手順で融合 した。 ポ リ ペプチ ド A脾細胞懸濁 液と ミ エローマ細胞をそれぞれ RPMI1640培地で洗浄 した（ 次に同 じ培地に懸濁 し、 融合させるために有核脾細胞 3 X 10⁸個と ミ エローマ細胞 6 X 10⁷個を混合 した。 次に遠 心分離によ り細胞を沈殿させ、 上清を完全に吸引除去し た。 沈殿した細胞に 37°Cに加温した PEG4000溶液 （50% (w/v)ポ リエチレングリ コ 一ノレ 4Q00含有 RPMI-1640培地） 2.0« を 1 分間で滴下 し、 1分間撹拌 L、 細胞を再懸濁、 分散させた。 次に37でに加.'疆 た81^>1111 40培地2. 0»ι を 1 分間で滴下 した。 こ の操作をさ らに 1 回繰 り返 した後- 同培地 14* を 2〜 3分間で常に撹拌しながら滴下 し、 細 胞を分散させた。 これを遠心分離 し、 上清を完全に吸引 除去 した。 次にこ の沈殿 した細胞に 37°Cに加温 した NS-1 培地（除菌ろ過 した 15% (w/v)仔牛胎児血清（JRH Biosciences)含有 RPMI1640培地） 30» を速ゃカヽに加え、 大きい 細胞塊を注意深 く ピペッ ティ ングで分散 した。 さ らに同 培地 30»ι を加えて希釈し、 ポ リ ス チ レ ン製 96穴マイ ク ロ ゥ エルにゥ ヱル当 り 6. Ox 10⁵個 /0.1"の細胞を加えた。 細胞を加えた上記マイ ク ロ ウ エルを 7 %炭酸ガス / 93% 空気中で温度 37°C、 湿度 100%で培養 した。

ポ リ ペプチ ド B — KLH複合体で免疫 したマウス由来脾 細胞の場合では、 脾細胞 6. 4 x l 0⁸個と ミ エローマ細胞 1. 28 X 10⁸個を混合し、 上記で使用 した PEG4000溶液、 RPMI 1640培地、 NS-1培地をそれぞれ 4.3B 、 38.7»ι 、 129 _π 用いた。 ポ リ べプチ ド C — KLH複合体で免疫したマウ ス由来の脾細胞の場合、 脾細胞 6.8x 10⁸俩と ミ エロ ーマ 細胞 1.36 x 10⁸個を混合 し、 PEG4000溶液、 RPMI 1640培地 NS- 1培地をそれぞれ 4.5« 、 40.5«i 、 135M 使用 した。 ( e ) 選択培地によ るハイ プ リ ドーマの選択的増殖

前項（d )の培養開始後翌日 （ 1 曰 目）、 細胞にパスツ ー ノレピぺッ トで HAT培地（NS-1培地に ヒポキサンチ ン （ 100 fi H) , ア ミ ノ プテ リ ン（0. 4〃 M)およびチ ミ ジ ン（16〃 M) を加えた培地） 2.滴（約 0.1« ）を加えた。 2 、 3、 5 、 8 日 目 に培地の半分.（約 0.1« を新 しい HAT培地で置き換え11日 目 に培地の半分を新 しい HT培地 （ア ミ ノ ブテ リ ン不 含 HAT培地）で置き換えた。 14日 目 にハイ プ リ ドーマの生 育が肉眼にて認め られた全ゥ ュ ルについて固相—抗体結 合テ ス ト法（ELISA) によ り 陽性ゥ ヱルを調べた。 すなわ ち、 ポ リ スチ レ ン性 96穴プレー ト を抗原 と したポ リ ぺプ チ K A、 B お よ び C それぞれでコ ー ト し、 次に洗浄用 PBS(0.05% Tween20含有）を用いて洗浄 して未吸着のぺプ チ ドを除いた。 さ ら に各ゥ エ ルの未 コ ー ト 部分を 1 % B S Aでブロ ッ ク した。 こ の各ゥ ヱ ルにハイ ブ リ ドーマの 生育が確認された ゥ ヱ ルの上清 0. 1 »! を添加 し、 室温で 約 1 時間静置 した。

2次抗体と して西洋わさ びペルォキ シダ一ゼ標識ャギ 抗マウ ス免疫グロ プ リ ンを加え、 さ らに室温で約 1 時間 静置 した。 次に基質であ る過酸化水素と o — フ エ二 レ ン ジァ ミ ンを加え、 発色の程度をマイ ク ロ プ レー ト用吸光 度測定機（MRP- A4、 東ソ 一） を用いて 492nmの吸光度で測 定 した。 ( f ) ハイ ブ リ ドー マの ク ロ ーニ ング

前項（ e )で得 られた各抗原べプチ ドに対する陽性ゥ ェ ル中のハイ プ リ ドーマを、 限界希釈法を用いてモ ノ ク ロ

— ン化 した。 すなわち、 96穴マイ ク ロ ウ ヱ ノレにハイ プ リ ドー マをゥ エ ル当 り 5個、 1 個、 0. 5個にな る よ う に希 釈 し、 それぞれ 36穴、 36穴、 24穴に加えた。 5 日 目、 12 日 目 に全ゥ ヱルに約 0. In の NS-1培地を追 お。 ク 口」 —ニ ング開始後約 2週間で、 肉眼的パに +分なノ'、、イブ リ ド —マの生育を認め、 コ ロニー形成陰性ゥ エルが 50%以上 である群について（ e )に記載 した ELISAを行った。 調べ た全ゥ ヱ ルが陽性でない場合、 抗体陽性ゥ ヱ ル中の コ ロ ニー数が 1 個のゥ ヱ ルを 4 〜 6個選択 し、 再ク ロ ーニ ン グを行っ た。 最終的に表 1 および表 2 にま とめて示 した よ う に各ポ リ べプチ ド A、 ポ リ べプチ ド B またはポ リ べ プチ ド C に対する モ ノ ク ロ ーナル抗体を産生するハイ ブ リ ドーマがそれぞれ 12個、 20個、 9個得られた。

( g ) ハイ プ リ ドーマの培養とモ ノ ク ロ ー ナル抗体の精 製

得 られた各ハイ プ リ ドーマ細胞を NS-1培地で培養 し、 そ の上清か ら濃度 10〜： 100// 9 « のモ ノ ク ロ ーナル抗体 を得る こ とができ た。 ま た、 得 られたハイ プ リ ドー マを 10⁷個を予め 1 週間前にプ リ ス タ ンを腹腔内投与 したマ ウ ス （BALBZ c 系、 雌、 6週齢）に同 じ く 腹腔内投与 し、 1 〜 2週間後、 腹水中か ら も 4〜 7 «₉/ « のモノ ク ロ 一 ナル抗体を含む腹水を得る こ とができた。 得 られた腹水 を 40 %飽和硫酸ア ンモニゥ ムで塩析後、 IgGク ラ ス の抗 体をプロティ ン Aァ フ ィ ゲル（Bio- Rad)に吸着させ、 0.1 Mク ェ ン酸緩衝液（pH 5 )で溶出する こ と に よ り 精製 し

7*- o

( h ) モ ノ ク ロ ー ナル抗体の ク ラ ス、 サブ ク ラ スの決 定

蹒述した E L I S Aに従い、 各ポ リ ペプチ ド A、 ポ リ ぺプ ·. ·''ド B ま たはポ リ べプチ ド Cを コ 一 ト したマイ ク ロ タ イ ド ー シ ョ ンプ レ ー 卜 に、 （ f )で得 られたモ ノ ク ロ ー ン の上清を加えた。 次に PBSで洗浄後、 アイ ソ タ イ プ特異 的ゥサギ抗マウ ス IgG抗体（Zyraed Lab. )を加えた。 PBSに よ り 洗浄後、 西洋わさ びペルォキ シダ一ゼ標識ャギ抗ゥ サギ IgG(H + L)を加え、 基質と して過酸化水素および 2， 2' 一ア ジ ノ 一 ジ （ 3 —ェチルペ ンゾチア ゾ リ ン酸）を用いて ク ラ ス、 サブク ラ スを決定 した。

( i ) 抗 MT-MMPモ ノ ク ロ ー ナル抗体の特異性

ヒ ト新生児線維芽細胞（NB1RGB)の培養上清中か らそれ ぞれ精製 した潜在型 MMP- 1 ( ク リ ニ力 キ ミ 力 ァ ク タ (Clin. Chim. Acta). 第 219巻、 1 〜 14頁（ 1993) )、 潜在 型 MMP— 2(ク リ ニ力 キ ミ 力 ァ ク タ （Clin. Chim. Acta). 第 221巻、 91〜 103頁（1993))および潜在型 MMP- 3 (ク リ ニ 力 キ ミ 力 ァク タ（Clin. Chim. A c t a )、 第 211卷、 59〜 72頁（1992))、 ヒ ト直腸癌細胞（Car- 1)の培養上清か ら精 製 した潜在型 MMP- 7(キ ヤ ンサー リ サーチ（Cancer Res. ) 第 50巻、 7758〜7764頁、 （1990)) 、 ヒ ト好中球よ り精製 した潜在型 M M P - 8 (バイ オ ロ ジカノレ ケ ミ ス ト リ ー ホ ッ プ セイ ラ ー（Biol. Chera. Hoppe - Sey ler)ゝ 第 371卷ヽ サ プルメ ン ト 、 295〜 304頁、 （1990)) 並びに ヒ ト線維芽細 胞腫株（HT 1080)の培養上清か ら精製 した潜在型 MMP - 9 (ザ ジ ャ ーナル ォブ ノくィ ォ ロ ジ カ ノレ ケ ミ ス ト リ ー (J. Biol. Chera)、 第 267巻、 21712〜21719頁、 （ 1992)) をそれぞれ抗原 と して使用 し、 前述の（ e ) に記戴

ELISAによ り ヒ ト MT-MMPぺプチ ドと陽性反応を示す 種 類の抗 MT-MMPモ ノ ク ロ ーナル抗体（モ ノ ク ロ ー ン番号 113 - 5B7、 113- 15E7、 114- 1F1、 114-2F2および 118-3B1 )の交 差反応性を調べた。

すなわち、 ポ リ スチ レ ン製 96穴プ レー ト を使用 し、 各 ウエノレに精製した各 MMP 1、 MMP 2、 MMP-3. MMP 7、 MMP -8および MMP- 9をそれぞれ 50ngZWellで加え コ ー ト した。 洗浄用 PBSで洗浄 し未吸着の抗原を除去 した後、 各ゥェ ルの未コ 一 ト部分を 3 %スキム ミ ルク含有 PBSでプロ ッ ク した。 こ の各ゥエルに各抗 MT-MMPモ ノ ク ロ ーナル抗体 それぞれを 1 ノ Wel lで加え、 室温で約 1 時間静置 し た。 プ レー ト を洗浄後、 2次抗体と し Tペルォキ シ ダー ゼ標識ャギ抗マウ ス免疫グロ プ リ ンを加え さ らに室温で 約 1 時間反応させた。 次に基質であ る過酸化水素と 0 — フ エ 二 レ ン ジア ミ ンを加え、 発色の程度をマイ ク ロ プ レ 一 ト用吸光度測定機（MRP-A4、 東ソ一）を用いて 492nmの 吸光度で測定 した。

その結果、 表 3 に示 したよ う に、 抗 MT-MMPモ ノ ク ロ ー ナル抗体は何れも、 供試 した MT- MMP以外の精製 MMPsと反 応性を示さなかっ た。

ポ リ ペプチ ド モ ノ ク ロ ー ン番号 サブク ラ ス Z鎖

A 114-1F2 7 1/ κ

114-2F2 r 1/ Κ

114-3H7 r \/ Κ

Π4-5Ε4 r \/ Κ

11¾4-6G6 r \/ Κ

114-8D10 r \/ Κ

114-9H3 n / κ

114-15E8 7 \/ Κ

114-16C11 Ύ \/ Κ

114-18E4 r \/ Κ

114-19F11 7 1/ Κ

114-20H5 β / κ

Β 113-1E3 r 3/ c

113-2E9 7 3/ c

113-3F6 r 2bZ K

113-4H7 •r / K

113-5B7 r 3/ /

113-7C6 r 2b, K

113-9G9 r 3/ c

113-10F2 7 Z/ K

113-13G11 ァ 3Z

113-15E7 r 3/ c

113-16H8 r 3/ c

113-17G12 IL / K

113-19A10 IL / K

113-20G11 r 3/ /

113-21H3 r 1/ K

113-26D3 H / K

113-44C1 Ί \/ K

113-46B7 7 \/ K

113-53G5 n / K

113-63E8 Ί \/ K 表 2

ポ リ ペプチ ド モ ノ ク ロ ー ン番号 サブク ラ ス 鎖

C 118- 3B1 7 2b/ κ

118- 6F3 Ύ 2b/ κ

118 - 8D11 Ί \/ κ

118 - 9B11 Ύ 1/ i

118- 13D11 a / κ

118- 18C12 Ί \/ κ

118- 20A3 7 2b/ κ

118- 25C3 Ύ 1/ ic

118- 26F5 7 3/

3 モノクローン 交 差 反 応 性

番 号 MMP-1 MMP-2 MMP-3 MHP-7 ΜΜΡ-8 ΜΜΡ-9

113-5B7

113-15E7

114-1F2

114-2F2

118-3B1

：反応せず

実施例 4 遺伝子産物の発現と同定

実施例 1 ( f )で構築 した MT- MMP遺伝子を ク ロ ー ン化 し た組換え pBluescriptか ら EcoR I 切断によ り 挿入断片を 切出 し、 真核細胞用発現ベク ター pSG5 (Stratagene)の EcoR Iサイ ト に ク ロ ーニ ング した。 該組換え pSG5を ヒ ト 線維芽細胞腫株 HT1 80に リ ン酸カルシゥ ム法によ り ト ラ ンスフ ヱ ク シヨ ンした すなわち、 蒸留水に 20 )& 9の組 換え pSG5、 t & 2 M £aC£₂を加え、 次 fこ 2 x ffBSP溶 液（1.5ra¾i Na₂HP0" !OnW K 280mM NaC および 12mM Glucose含有 50raM HEPES緩衝液、 ρΗ7· 1) をチュ ーブの底 に加え全量が 1 » にな る よ う に した。 これを混合後、 室 温で 30分程度放置 し、 沈殿形成を十分行っ た。 沈殿を ピ ベ ッ テ ィ ングによ り 分散 し、 HT1080細胞に滴下 した後、 CO ₂ィ ンキュベータ 一中で約 4時間ィ ンキュベー ト した。 次に培地を除き、 15%グ リ セ リ ン溶液を加え 1 〜 3時間 処理 した後、 グ リ セ リ ンを吸引除去、 PBSで洗浄後、 ³⁵S 一 メ チォニ ンを含む新鮮な培地を加えた。 培養を継続 し . 細胞タ ンパク質を ^{3 5} Sで標識 した。 因みに、 HT1080細胞 におけ る MT-MMP遺伝子の発現はノ ーザンブロ ッ ト分析で は検出できない。

細胞を溶解緩衝液 1 %Triton X - 100、 1 % bovine hemog丄 obin、 丄 mM lodoacetamide^ 0.2 U try sin inhibitor, 1 mM PMSFおよび 0. 14M NaC^含有 0.01M Tris— HC 緩衝液、 pH8 )中で 4 °C、 1 時間イ ンキュベー 卜 した。 細胞溶解液を遠心分離 し、 上清を回収 した。 上 清に実施例 3 で得 られたモ ノ ク ロ ーナル抗体をカ ツ プ リ ン グさせたセフ ァ ロ ー ス一 4B(Pharraacia) を加え、 4 °C で 2 時間撹拌 しなが らイ ンキ ュベー ト し、 免疫沈降を行 つ た。 免疫沈降には実施例 3 で得 られたポ リ ペプチ ド A に対する 12個のモ ノ ク ロ ーナル抗体の う ち非特異的反応 性の低いモ ノ ク ロ ー ン番号 114-1F2および 114-2F2 (受託 番号 FERM BP-4743) の 2 種類をそれぞれ使用 した。 次に . 遠心分離に よ り 免疫沈降させたモ ノ ク ロ 一ナル抗体を力 ッ プ リ ン グ した セ フ ァ ロ ー ス 一 4 Bを沈殿 させ、 洗浄液 ( 1 %Tr i ton X - 100、 1 % bovine hemoglobinおよび 0.14M NaC 含有 0.01M Tris— HC 、 pH8 )で 3 回洗浄 し、 最後に 0.05M Tris- HC 緩衝液、 pH6.8で洗浄 した。 こ の 洗浄 したモ ノ ク ロ ーナル抗体をカ ツ プ リ ング したセフ ァ ロ ー ス一 4Bに SDSポ リ ア ク リ ノレア ミ ド電気泳動用サ ンプ ル緩衝液を加え、 100°Cで 5 分間加熱 した後、 SDSポ リ ア ク リ ルア ミ ド電気泳動を行っ た。 泳動後のゲルを X線フ イ ノレム（Kodak XR)と重ね一 70°Cで 1 週間ォー ト ラ ジオグ ラ フ ィ ーを行っ た後、 現像 した X線フ ィ ルムをデン シ ト メ ー タ ーで ト レー ス し シ グナルの強度を測定 した。 使用 した抗 MT- MMPモ ノ ク 口 一ナル抗体モ ノ ク ロ ー ン番号 114- 1F2および 114-2F2はいずれも、 63kDaのタ ンパク質を免 疫沈降 した。 対照 と した MT-MMP遺伝子を含ま ないベ ク タ 一 pSG5のみを ト ラ ンスフ ヱ ク シ ヨ ン した細胞では、 抗 MT - MMPモノ ク ローナル抗体モノ ク ロー ン番号 114- 1F2およ び 114-2F2で 63kDaタ ンパ ク質は免疫沈降されなかっ た。 免疫沈降で検出 さ れた タ ンパ ク質の分子量 63kDaは、 配 列表配列番号 1 に記載 したァ ミ ノ 酸配列か ら算出 される 分子量 65.78kDaと ほぼ一致 した。 さ ら に、 配列表配列番 号 1 に記載 したァ ミ ノ 酸配列のァ ミ ノ 酸 13位力、ら 101位 ま でを欠失 した変異体 MT- MMP発現プラ ス ミ ドを作成 し、 前述と同様 HT1080細胞に ト ラ ン ス フ エ ク シ ヨ ン し、 免疫 沈降を行っ た。 変異体 MT- MJP遣 fe子を導入した Ε ΟδΟ細 胞では、 63kDa夕 ン ノ、° ク 質は機 ¾されず、 5)5kBa夕 ンパク 質を検出 した。 こ の分子量は、 導入 した欠失.か ら予想さ れる分子量と一致 した。

実験例

( a ) MT- MMPの発現によ る潜在型 MMP- 2の活性化

実施例 4 で構築 した MT- MMP遺伝子を ク ロ ー ン化 した組 換え pSG5あ る いは コ ン ト ロ ールと してベク タ ー pSG5単独 を同 じ く 実施例 4 に記載 した リ ン酸カ ルシウ ム法によ り HT 1080細胞、 あ る いはマ ウ ス胎児由来線維芽細胞 NIH3T3 に ト ラ ン ス フ ヱ ク シ ヨ ン し た。 た だ し、 ^{3 5} S— メ チォ二 ン含有新鮮培地の代わ り に、 通常の新鮮培地を使用 した , なお、 HT1080細胞および NIH3T3細胞は、 何れも潜在型 MMP- 2およ び潜在型 MMP-9を分泌 してお り （図 6 中の 66kDa および 97.4kDaのバ ン ドにそれぞれ相当）、 ま た、 MT- MMP 遺伝子を ト ラ ン ス フ ヱ ク シ ョ ン した細胞では、 MT- MMPカ 発現 している こ と を免疫沈降実験によ り確認 した （実施 例 4参照）。

得 られた ト ラ ン ス フ ク タ ン ト を無血清培地中で 24時 間培養 し、 回収 した培養上清をザィ モグラ フ ィ 一に供試 した。 培養上清を SDSポ リ ア ク リ ルア ミ ド電気泳動用緩 衝液（非還元）と混和後 4 °Cで一晩放置 した後、 1 m₉Z " のカゼイ ン含有 10 %ポ リ ア ク リ ノレア ミ ドゲルを用い、 電 流 20mA、 4 °Cで電気泳動を行っ た。 泳動終了後、 ゲルを 2.5 % 1 r i t 0 n X-100含有ゼラチナーゼ用緩衝液（ 5 mM CM 2 ^ 1 M ZnS0₄含有 Tris— HC 、 pH7.6)で 15分 ゆ 《 《 振盪させなが ら洗浄 し、 こ の操作を 2 回繰 り 返 し た。 次にゲルを 1 % Triton X- 100含有ゼラ チナーゼ用緩 衝液中に浸 し、 37°Cで一晩放置 した。 緩衝液を廃棄 し、 ゲルを 0.02%ク マ シ一ブ リ リ ア ン ト ブルー R ( 50%メ タ ノ ール一 10%酢酸に溶解）で 1 時間染色後、 脱色液（5 % メ タ ノ ール一 7.5%酢酸）に浸 し脱色 した。

図 6 に示すよ う に、 MT-MMP遺伝子を ト ラ ンスフ ヱ ク シ ヨ ン した HT1080細胞では、 新たに 64kDaと 62kDaのノ 'ン ド が生 じ、 潜在型 M M P - 2の活性化が確認された。 こ の活性 型 MMP- 2は、 細胞を 100 9 ι« の コ ンカナバ リ ン Aで処 理 して誘導される活性型 MMP-2分子 と同 じ分子量を示 し、 ま た抗 MMP- 2モ ノ ク ロ ーナル抗体と特異的に反応 した。 こ の活性化は、 ベ ク タ ー単独を ト ラ ン ス フ ヱ ク シ ヨ ン し た コ ン ト ロ ールでは観察 さ れなか っ た。 一方、 潜在型

MMP- 9は、 コ ン ト ロ ールの細胞と同様に分子量の変化は 認め られず、 活性化は認め られなかっ た。 こ の MT- MMPの 発現に伴う潜在型 MMP- 2の活性化は、 MT- MMP遺伝子を ト ラ ンスフ ヱ ク シ ヨ ン した NIH3T3細胞でも観察された。 ( b ) MT- MMP発現細胞膜画分によ る潜在型 MMP-2の活性 ィ匕

前項（ a ：)の記載と同様に MT- MMP遺伝子を ク ロ ー ン化 し た組換え pSG5あ る いは コ ン ト ロ ールと してべク タ 一 pSG5 単独を リ ン酸カルシウ ム法に よ り ア フ リ カ ミ ド リ ザル腎 由来細胞 COS - 1に ト ラ ンスフ ヱ ク シ ヨ ン した。 釋られた ト ラ ンスフ エ ク タ ン ト ,か ら ス ト ロ ン ジ ン C tron *£n)ら'の 方法 （ザ ジ ャ ーナル ォブ バイ オ 口 ジ )My π リ 一 （J. Biol. Chem. )、 第 2' 6 巻、 ； 033〜 1403S頁' 1S93)) に従い、 細胞膜画分を調製 した。

ト ラ ン ス フ エ ク タ ン ト を P B Sで洗浄後、 遠心に よ り 細胞を集め 8. 5 % Sucro s e , 50 m M NaC^、 10 m M N - e t h y 1 m a 1 e i m i d e、 10 g / n £ aprotinin、 1 β g / nR pepstatin 1 μ. g / n β leupeptinヽ 1 raM phenyl - raethylsulf onyl fluoride含有 25raM Tr i s— HC 緩衝液（pH 7. 4)に懸濁 した o 細胞懸濁液を Dounce homogenizerで破 砕 し、 破碎液を遠心分離（3000 X g 、 10分間、 4 °C )した。 得 られた上清を さ らに超遠心分離（100， 000 X 9 、 2 時間） し、 沈殿を 50raM NaC 、 1 OmM N— e t h y :1 m a 1 e i m i d e、 10 g / niR aprotinin、 1 g / η β pepstatin A、 \ μ. g / m£ leupeptin^ 1 mM phenyl methylsulfonyl fluoride含 有 25mM Tris— HC 緩衝液（pH7. 4) に懸濁 した。 こ の懸濁 液 を段階的 シ ョ 糖密度勾配遠心（ 2 0、 30、 50、 60 % Sucrose溶液、 100, 000 9 、 2 時間、 4 °C ) で分画 し、 生 じた細胞膜画分のバン ドを回収 した。 こ の画分を再度 超遠心分離（100, 000 X g . 2 時間）によ り沈殿させた後、 0. 1M CaC 、 0.25% Triton X - 100含有 25 HEPES/ KOH(pH7.5)に懸濁 し、 タ ンパク質終濃度 1〜 2 *9ノ《 と なる よ う に調整 した。 この懸濁液を超遠心分離（100, 000

9 . 1.5時間、 4 °C )し不溶残渣を除き得られた上清を 細胞膜画分と した _ra

ベタタ一 pSG 単独または MT- MMP遺伝子を ト ラ ンスフ エ ク シ 3 ン た - 1細胞および無処理の C0S-1細胞からそ れぞれ調製 した毓胞膜画分（タ ンパク質含量 20 9 )を HT1080細胞の培養上清と 37°Cで 2時間ィ ンキュベ一 ト し た。 これら試料を用いて前項（ a )に記載したザィ モグラ フ ィ ーを行った。

その結果、 MT- MMP遺伝子を ト ラ ンスフ ヱ ク シ ョ ン した COS- 1細胞由来の細胞膜画分を用いた場合のみ、 新たな 64kDaと 62kDaの ノくン ドが出現 し、 HT1080細胞の培養上清 中に存在する潜在型 MMP- 2の活性化が観察された（図 7参 照）。 こ の潜在型 MP- 2の活性化は、 組換え TIMP-2の添加 によ り阻害された。 この結果から、 細胞膜上に発現 した MT-MMPによる潜在型 MMP- 2の活性化が示された。

( c ) In vitroにおける MT-MMP発現による浸潤能の促 細胞の浸潤能の測定は、 ボイデン チャ ンバ一（Boyden Chamber)法（キャ ンサー リサーチ（Cancer Res. )、 第 47 巻、 3239〜3245頁（1987)) を改変 して行い、 操作はバイ ォ コ ー ト マ ト リ ゲ ル イ ン べ一 ジ ョ ン チ ャ ン バ一

一 31 された用紙 (規則 ₉₁ (Becton Dickinson)の操作方法に従 つ ," 前述の（ a )の記載と同様に MT- MMP遺伝子を ク ロ ー ン化 した組換え PSG5あ る いは コ ン ト ロ ーノレと してべ ク タ ー PSG5単独を リ ン酸カルシウ ム法に よ り HT1080細胞、 あ る いは NIH3T3細胞に ト ラ ンスフ エ ク シ ヨ ン した。 こ れ らの 宿主細胞はいずれも潜在型 MMP- 2を分 z泌 している .， 得ら れた ト ラ ン ^ ^;フ ヱ ク タ ン ト を 0.1% ½A含有 DMEM培地に懸 濁 し、 2 X 10⁵個の細胞をバイ オコ 卜 マ ト リ ゲ ンベー ジ ョ ン チ ャ ンバ一中の未コ ー ド、フ イ ノレタ —（ポア サイ ズ 8 《)あ る いは予め膨涠させたマ ト リ ゲルコ ー ト フ ィ ルタ ー上に接種 した。 24時間、 37°C炭酸ガスィ ンキ ュベー タ 一中で培養 した後、 フ ィ ルタ ーを 10秒間メ 夕 ノ ール中に浸 し固定 した。 次にへマ ト キ シ リ ンで 3 分間水 洗後、 ェォ ジ ンで 10秒間染色 し、 フ ィ ルタ ー下面に浸涠 した細胞数を光学顕微鏡下（400倍）で計測 した。

MT- MMP遺伝子を ト ラ ンスフ ヱ ク シ ヨ ン した HT1080細胞 および NIH3T3細胞では、 いずれも コ ン ト ロ ールのベク タ 一単独を ト ラ ンスフ ヱ ク シ ヨ ン した細胞に比べ、 2倍以 上の浸潤 した細胞が観察された（図 8 マ ト リ ゲル参照）。 すなわち、 MT-MMPの発現によ り 細胞の浸潤能が上昇 した こ とが示された。 また、 こ の測定系に 10〃 9 Ζπ^の組換 え ΤΙΜΡ- 2を添加する と明 らかに細胞の浸潤能が抑制さ れ る こ とが認め られた（図 8 マ ト リ ゲル + rTIMP- 2参照）。 ,

.32- Hされた用 ¾ (纖 ; 図面の簡単な説明

図 1 は、 MT- MMPのア ミ ノ 酸配列のカ イ ト · ドー リ ト ノレ 法によ る親水性、 疎水性分布図であ る。

図 2 A、 2 B、 2 C、 2 D、 2 E、 2 F、 2 G、 2 H は、 MT-MMPのァ ミ ノ 酸配列 と公知の MMPフ ア ミ リ ー（MMP- 1ヽ MMP - 2、 MMP - 3、 MP - Ί、 MBP - 8、 MMP-9. MMP - 1(K MMP - 11) のア ミ ノ 酸配到との配,彌上の'枏同性を比較 した図で あ る。 各図中の齠号ほ、 そ ぞれァ ミ ノ 酸を表 し、 A は Ala、 C は Cys、 D は Asp、 Eは Glu、 F は Phe、 G は Gly、 Hは His、 I は Ile、 Kは Lys、 Lは Leu、 Mは Met、 Nは Asn、 P は Pro、 Q は Gln、 R は Arg、 S は Ser、 丁は Thr、 Vは Val、 Wは Trp、 Yは Tyrに対応する。 これらの 2 A 〜 2 Hの図は一体とな っ て 1 つの図を構成する。

図 3 は、 ノ ーザ ンブロ ッ ト分析によ る各種の ヒ ト組織 中での MT- MMP mRNAの発現を相対的に示 した も のであ る。

図 4 は、 ノ ーザ ンプロ ッ ト分析によ る ヒ ト肺偏平上皮 癌 2例の正常部および癌部における MT- MMP raRNAの発現 を相対的に示 した ものであ る。

図 5 は、 MT-MMP cDNA導入 HT1080細胞中で発現 した MT -

MMPタ ンパ ク 質を免疫沈降法に よ り 検出 した結果を示 し た ものであ る。 図はデン シ ト メ 一 夕 によ る ス キ ャ ンを示 した ものであ り 、 黒塗 り部分が抗 MT- MMPモ ノ ク ロ ーナル 抗体で免疫沈降 した MT-MMPの位置を示す。

図 6 は、 MT - MMP cDNA導入 HT1080細胞および MT- MMP cDNA導入 NIH3T3細胞の培養上清のザィ モ グラ フ ィ 一によ り、 MT-MMPの発現による潜在型 MMP- 2の活性化を示 した ものであ る。

図 7 は、 MT- MMP cDNA導入 COS- 1細胞の細胞膜画分によ る潜在型 MMP - 2の活性化をザィ モグラ フ ィ 一によ り示 し た ものである。

図 8 は、 MT-MMPの発現によ る細胞の浸潤能の促進を一 部改変 したボイ デン チ ャ ンノ 一 (Boyden Chamber) 法に よ り 示 した ものであ る。

【配列表 1 】

配列— 号 ： I

配列の長さ ： 5 8 2

配列の型 ： ァ ミ ノ ¾

ト ォ： 口 ジ一-: g |g上

配列の 類 ： タ ンパク質

配列

Met Ser Pro A la Pro Arg Pro Ser Ars. (T»s Eeu Leu Lean Pro Leu,

1 5 10 15

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20 25 30

Ser Ser Phe Ser Pro Glu Ala Trp Leu Gin Gin Tyr Gly Tyr Leu

35 40 45

Pro Pro Gly Asp Leu Arg Thr His Thr Gin Arg Ser Pro Gin Ser

50 55 60

Leu Ser Ala Ala He Ala Ala Met Gin Lys Phe Tyr Gly. Leu Gin

65 70 75

Val Thr Gly Lys Ala Asp Ala ASP Thr Net Lys Ala Met Ars Arg

80 85 - 90

Pro Ars Cys Gly Val Pro Asp Lys Phe Gly Ala Glu lie Lys Ala

95 100 105

Asn Val Arg Ars Lys Arg Tyr Ala l ie Gin Gly Leu Lys Trp Gin

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配列番号 ： i ( つづ き ）

Asp Gly Lys Phe Va I Phe Phe Lys Gly ASP Lys H is Trp Va I Phe

380 385 390

ASP Glu Ala Ser Leu G I u Pro Gly Tyr Pro Lys His l ie Lys Glu

395 400 405

Leu Gly Arg C I y Leu Pro Thr ASP Lys l ie Asp kla. i a Leus IPte

10 415 2GD

Trp Met Pro Asn Gly Lys Thr Tyr Phe Phe Ars Klls' *sra Lys Ti rr

425 430 435

Tyr Arg Phe Asn Glu Glu Leu Arg Ala Ya 1 Asp Ser Glu Tyr Pro

440 445 450

Lys Asn l ie Lys Va I Trp Glu .Gly Me Pro Glu Ser Pro Arg Gly

455 460 465

Ser Phe Met Gly Ser Asp Glu Val Phe Thr Tyr Phe Tyr Lys Gly

470 475 480

Asn Lys Tyr Trp Lys Phe Asn Asn G I n Lys Leu Lys Va I Glu Pro

485 490 495

G I y Tyr Pro Lys Ser A I a Leu Ars Asp Trp Met Gly Cys Pro Ser

500 505 510

Gly Gly Arg Pro Asp Glu Gly Thr Glu Glu Glu Thr Glu Val J le

515 520 525 l ie l ie Giu Va I Asp Glu Glu Gly Gly Gly Ala Val Ser Ala A la

530 535 540

A la Va I Va I し eii Pro Va I Leu Leu Leu Leu Leu Va I Leu A I a Va I

5Ί5 550 555

Cly Leu Ala Val Phe P.he Phe Ars Ars His Gly Thr Pro Ars Arg

560 565 570

Leu Leu Tyr Cys C! I n Arg Ser Leu Leu ASP Lys Va I

575 580 【配列表 4 ]

配列番号 ： 2

配列の長さ ： 34 03 配列の型 ： 核 g

鎖の ¾ ： 二本鎖

J" Φ シー ； 面鎖状 配 ¾⑩醒题： C&M Go mRNA 源

生物名 ： ヒ ト

組織の 類 ： 胎盤

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l 11二一」」目 Ililil1.1191VVVV V.FGVVVVVVV [酉 列表 i 〇 】

配 ^号 ： 3

gi!列の長さ ： 7

i2列の ： ア ミ ノ酸

ト ポ ロ ジー ： 直 状

配列の随類 ： ぺプチ ド

フ ラ グメ ン ト お : 中 ΙϋΙ都フ ラ グメ ン ト

配列 ' 、

Pro Ar し ys C 1 Va I Pro Asp

] 5

【配列表 1 1 】

配列番号 ： 4

配列の長さ ： 9

配列の型 ： ア ミ ノ酸

ト ポロ ジー ： 直鎩状

配列の随類 ： べプチ ド

フ ラ グメ ン ト型 ： 中 Ril都フ ラ グメ ン ト

配列

G 1 y Asp A 1 a His Phe As Asp Asp G I u

1 5

【配列表 1 2 】

配列番号 ： 5

配列の長さ ： 2 0

配列の型 ： 核酸

鎖の数 ： 二本鎖

トボロ ジ一 ： 状

配列の ϋ類 ： 他の核 ¾ 合成 DNA

配列

CC(C/A)(C/A)G(G A/C)TC(T/C)(C/C) C(G/A/C)(C/A)( A/T) (G/C/T)CC(T/A)CA 【配列.表 1 3 】

配列 S号 ： 6

¾列の ISさ ： 25

¾列の ： 核 ¾

の ： 二本 .

ト ポ ロ ジ ー ： K羝状

配列の毯笾 ： ill!の梭 台成 DNA

列

((τι//a^^c{ /m /t ί /Ίί/c) C( /^) TC(G/A)AA(G/A)TC(C/A)(G/A) iC/A/T) E//A))FCCT/C)

【配列表〗 4 }

配列番号 ： 7

配列の長さ ： 2 7

配列の型 ： ァ ミ ノ ¾

ト ポ ロ ジー ： 直 状

配列の匪類 ： ペプチ ド

フ ラ グメ ン ト お : 中 l!il部フ ラ グメ ン ト

配列

Cly Gly Gly A In Va! Ser A la A la A la Yal Va I Leu Pro Va I Leu

1 δ 10 ]5

Leu Leu Leu Leu Va I Leu A la Va I Gly Leu A I a Va I Phe Phe Phe

20 25

【配列表 1 5】

配列番号 ： 8

配列の長さ ： 1 4

配列の型 ： ァ ミ ノ ¾

トポロ ジー ： ϋ鎖状

配列の ¾ ： ぺプチ ド

配列

Arg G I u Va I Pro Ty r Ala T r l ie Ars G I u Gly His Glu Lys

1 5 10 [配列表 1 6】

配列^号 ： 9

配列の長さ ： 1 4

配列の型 ： ァ ミ ノ ¾

ト ポ ロ ジー ： E顯状

配列の ΠΠϊΙί ： ベプチ ド

配列 ί ^i;

Asp Cly Asn P e Asp

Val Ala Met Leu Arg Cly Clu Ifett

1 5 10 -

【配列表 1 7 】

配列番号 ： 1 0

配列の長さ ： 1 5

配列の型 ： ア ミ ノ酸

トポロ ジー ： 直鎮状

配列の褪類 ： ぺブチ ド

配列

Pro Lys Ser A In Leu Arg Asp Trp Met G!y Cys Pro Ser Gly Gly 1 5 10 15

Claims

請 求 の 範 囲

1 . 配列表配列番号 1 に示 されている ァ ミ ノ 酸配列を有 する タ ンパク 質。

2 . 配列表配列番号 1 に示されている ァ ミ ノ 酸配列を有 する タ ンパク 質を コ ー ドする配列表配列番号 2 に示さ れている塩基配列を有する DNA。

3 . 配列衷配到番号 2に示されている塩基配列を有する D N A配列 念有 し、 配列表配列番号 1 に示されている タ ンパク質を発現するプラ ス ミ ド。

4 . 配列表配列番号 2 に示されている塩基配列を有する D N A配列を含有 し、 配列表配列番号 1 に示されている タ ンパク質を発現するプラ ス ミ ドを有する宿主細胞。

5 . 配列表配列番号 1 に示されている ァ ミ ノ 酸配列を有 する タ ンパク質を特異的に認識するモ ノ ク ロ 一ナル抗 体。