WO1993001834A1 - Synergistisch wirkende antikörperzusammensetzung - Google Patents

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WO1993001834A1
WO1993001834A1 PCT/EP1992/001689 EP9201689W WO9301834A1 WO 1993001834 A1 WO1993001834 A1 WO 1993001834A1 EP 9201689 W EP9201689 W EP 9201689W WO 9301834 A1 WO9301834 A1 WO 9301834A1
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antibodies
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gly
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PCT/EP1992/001689
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Ulrich Weidle
Werner Scheuer
Brigitte Kaluza
Gert Riethmüller
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Boehringer Mannheim Gmbh
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    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K16/00—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies
    • C07K16/18—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies against material from animals or humans
    • C07K16/28—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies against material from animals or humans against receptors, cell surface antigens or cell surface determinants
    • C07K16/2866—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies against material from animals or humans against receptors, cell surface antigens or cell surface determinants against receptors for cytokines, lymphokines, interferons
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
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    • C07K16/2803—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies against material from animals or humans against receptors, cell surface antigens or cell surface determinants against the immunoglobulin superfamily
    • C07K16/2812—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies against material from animals or humans against receptors, cell surface antigens or cell surface determinants against the immunoglobulin superfamily against CD4
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K38/00—Medicinal preparations containing peptides

Definitions

  • the present invention relates to a synergistic antibody composition for improving immunosuppression, which contains two antibodies against different T-cell surface markers.
  • the purine analog azathioprine acts as an antimetabolite on all proliferating cells. Disadvantages of this substance are its potential liver toxicity and the Induction of bone marrow depression. This leads to a reduction in all blood cells.
  • Glucocorticoids are non-cytotoxic immunosuppressants. However, they lead to intolerable side effects (growth disorders, hypertension, heart failure), especially when the therapy is prolonged, which forces the patient to stop taking the medication.
  • Anti-lymphocyte globulin (ALG) and cyclosporin have a higher specificity than the aforementioned substances, but they affect the whole of the immune system and increase the risk of virus and bacterial infections through this general immunosuppression. Further disadvantages are that ALG can only be administered for a limited time due to its sensitization potential. Treatment with cyclosporin can lead to an increased incidence of tumors.
  • T cells T lymphocytes
  • CD4 and CD8 are surface antigens on them
  • CD8 positive T cells interact with the T cell receptor in the context of MHC class I molecules (killer cells).
  • CD4-positive T cells interact with the T cell receptor in the context of MHC class II molecules on corresponding recipient cells (helper T cells, suppressor T cells).
  • EP-A 0 240 344 discloses in Example 5 (column 8) a combination of anti-CD4 MAKs with anti-IL2R ⁇ (CD25) MAKs to prevent transplant rejection. However, complete inhibition is only achieved when combined with a third MAK against CD8.
  • the antibody YCTLD45.1 used in combination as an anti-IL2R ⁇ -MAK does not in itself show any noteworthy inhibition of the immune response. However, it is not disclosed what properties the antibodies which can be used in combination must have, so that complete inhibition can generally be expected.
  • the object of the invention is achieved by a synergistic antibody composition for improvement immunosuppression, which is characterized in that it
  • (b) contains at least one monoclonal anti-IL2R ⁇ or anti-IL2Rß antibody which is already strongly inhibitory in and of itself,
  • a strongly inhibiting antibody at a concentration of 10,000 ng / ml inhibits allogeneically induced lymphocyte proliferation in the absence of other antibodies by at least 40%.
  • the molar ratio of the antibodies (a) and (b) is preferably between 1:10 and 10: 1.
  • the molar ratio of the antibodies (a) and (b) is preferably between 1: 1000 and 10: 1.
  • the combination anti-CD4-MAK and anti-IL2R ⁇ -MAK is preferred according to the invention.
  • Anti-IL2 receptor antibodies A prerequisite for the synergistic effect when combining monoclonal anti-CD4 or.
  • Anti-IL2 receptor antibodies is that each of these antibodies alone has to show an immunosuppressive, ie strongly inhibiting, lymphocyte proliferation.
  • This "strongly inhibiting" effect in the sense of the present invention is shown by the fact that the antibody in question alone inhibits at least 40% allogeneically induced lymphocyte proliferation (MLR) at a concentration of 10,000 ng / ml.
  • MLR allogeneically induced lymphocyte proliferation
  • the surprising synergism according to the invention is only determined when an anti-IL2R ⁇ or anti-IL2Rß-MAK which is already strongly inhibiting in itself is used in combination with an anti-CD4-MAK.
  • an anti-IL2R ⁇ -MAK that does not or only weakly inhibits is used, then in combination with an anti-CD4-MAK that is already strongly inhibiting by itself, no increased suppressive effect compared to the use of the anti-CD4-M4AK was found.
  • the two antibodies (a) and (b) are preferably used in a molar ratio of 1:10 to 10: 1 for an optimal synergistic effect.
  • the molar ratio of the antibodies (a) and (b) is particularly preferably from 1: 5 to 5: 1, most preferably from 3:10 to 3: 1.
  • a molar ratio of the antibodies (a) and (b) of 1: 1000 to 10: 1 is preferably selected.
  • the antibody composition according to the invention can contain both one and more anti-CD4 antibodies and both one and more anti-IL2R ⁇ or anti-IL2Rß antibodies, the molar ratio always being based on the sum of all when using several antibodies of one specificity Antibody relates to a specificity.
  • the two antibodies must be used together, but not necessarily simultaneously, in order to show the synergistic effect.
  • the term “joint use” is to be understood to mean that a certain time lag can also be tolerated when administering both antibodies.
  • the effectiveness of the antibody administered first must not have clearly decreased. In practice, such a possible time delay can be up to 12 hours.
  • Another advantage of the antibody combination according to the invention is its high specificity. Since anti-IL2R ⁇ or anti-IL2Rß antibodies bind in particular to the activated T lymphocytes and only the anti-CD4 antibodies bind to the entirety of all T helper cells, the combination of these antibodies according to the invention in the inventions - The general immune response is only marginally suppressed according to small amounts.
  • the antibodies suitable as components of the antibody composition according to the invention can be murine, human, chimerized or humanized antibodies or antibody fragments. Human, chimerized or humanized antibodies or antibody fragments of this type are preferably used, since in this way the possibility of an immune reaction against the administered antibodies is kept as low as possible.
  • Chimerized or humanized antibodies in the sense of the present invention are non-human antibodies, for example of murine origin, in which murine sequences have been replaced by human sequences by means of known genetic engineering methods.
  • the chimerized antibodies only the constant region of the antibody is replaced by a corresponding human region, while in the case of humanized antibodies the CDR regions (complementary-determining regions) of human V regions for the light and the heavy chain of an antibody by the CDR Regions of a murine or other rodent antibody can be exchanged, so that the humanized antibody corresponds to a human antibody except for the CDR regions.
  • Antibody fragments are also suitable for the method according to the invention, for example
  • Fab or F (ab) 2 antibody fragments that can be obtained using standard methods.
  • anti-IL2R ⁇ antibodies A detailed description of suitable anti-IL2R ⁇ antibodies can be found in PCT / EP91 / 01737.
  • Anti-CD4 antibodies are in Eur.J. Immunol. 18 (1987) 495-502. A
  • anti-IL2Rß antibodies can be found in Takeshita, T., Goto, Y., Tada, K., Nagata, K., Asao, H., Sugamura, K .: J.Exp.Med. 169: 1323-1332 (1989); Tsudo, M., Kitamura, F., Mijasaka, M .: Proc.Natl.Acad.Sci.USA 86 (1989) 1982-1986 and Niguma, T., Sakagami, K., Kawamura, T., Haisa, M ., Fujiwara, T., Kusaka, S., Uda, M., Orita, K .:
  • SEQ ID NO. 1 and 2 show nucleotide and amino acid sequences of the anti-CD4 antibody MT 15.1
  • SEQ ID NO. 3 and 4 show nucleotide and amino acid sequences of the anti-CD4 antibody MT 3.10
  • SEQ ID NO. 5 and 6 show nucleotide and amino acid sequences of the anti-IL2R ⁇ antibody MAK 179.
  • SEQ ID No. 9 and 10 show nucleotide and amino acid sequences of the anti-ILR ⁇ antibody A41.
  • the anti-ILR ⁇ antibody M-215 (SEQ ID. 7 and 8), which has only a weakly inhibitory action, in combination with a strongly inhibiting anti CD4 antibody shows no synergistic effect.
  • Suitable constant regions (murine or human) for these antibodies are described in: Sequences of proteins of immunological interest; E. Kabat, T. Wu, M. Reid-Miller, H. Perry and K. Gottesman, US Department of Health and Human Services, 1987, p. 282-325.
  • the genes for the constant regions can be fused with the genes for the variable regions using standard cloning techniques in molecular biology.
  • the present invention furthermore relates to a medicament which consists of components (1) and (2), the two components to be administered together but can be formulated separately, which is characterized in that component (1) is for one alone strongly inhibiting monoclonal anti-CD4 antibody (a) as the active ingredient and component (2) contains an individually strongly inhibiting monoclonal anti-IL2R ⁇ or anti-IL2Rß antibody (b) as the active ingredient, optionally with customary pharmaceutical auxiliaries -, diluents, carriers and fillers.
  • component (2) contains an individually strongly inhibiting monoclonal anti-IL2R ⁇ or anti-IL2Rß antibody (b) as the active ingredient, optionally with customary pharmaceutical auxiliaries -, diluents, carriers and fillers.
  • the molar ratio of the two antibodies of components (1) and (2) in the drug is preferably from 1:10 to 10: 1.
  • the molar ratio of the two antibodies is particularly preferably from 1: 5 to 5: 1, most preferably from 3:10 to 3: 1.
  • an anti-IL2R ⁇ antibody is used as the active ingredient of component (2), the ratio of the two antibodies of components (1) and (2) is preferably from 1: 1000 to 10: 1.
  • the two components of the medicament according to the invention are to be administered together, although the term “together” does not necessarily mean at the same time. It is therefore clear that the two components of the medicament according to the invention can be formulated separately.
  • the antibodies are formulated using standard methods, e.g. in intravenously administrable physiological solutions.
  • Another object of the present invention is the use of the antibody composition according to the invention or the medicament according to the invention in an immunosuppressive therapy, in particular in a therapy for suppressing an immune reaction after organ or tissue transplantation and autoimmune diseases.
  • a medicament according to the invention is administered which contains the combination of an anti-CD4 and an anti-IL2R ⁇ or anti-IL2Rß antibody.
  • MAKs against surface structures are used at a concentration of 1 to 5 mg / kg body weight (daily for 10 to 14 days).
  • anti-CD4 plus anti-IL2R ⁇ or Anti-CD4 plus anti-IL2Rß could reduce the effective dose to 100 to 200 ⁇ g / kg.
  • Anti CD4 MAK MT 15.1 under the name Clone 15-1 / P3 / 14 (ECACC 90090705) deposited on 07.09.1990,
  • Anti CD4 MAK MT 3.10 under the name Clone 3.101 / 5B10 (ECACC 90090702) deposited on 07.09.1990 and
  • Anti IL2R ⁇ MAK 179 deposited under the designation 3G10 / 179 (ECACC 90071905) on 07/19/1990.
  • the monoclonal anti IL2Rß antibody A41 was marketed under the name MAK ⁇ -IL-2R> M-A23A41 at the German Collection of Microorganisms and Cell Cultures GmbH (DSM), Mascheroder Weg 1b, D-3300 Braunschweig, on July 30, 1991 under the no DSM ACC 2015 deposited.
  • SEQ ID NO.1 shows the nucleotide and amino acid sequence
  • SEQ ID NO.2 shows the nucleotide and amino acid sequence
  • SEQ ID NO.3 shows the nucleotide and amino acid sequence
  • SEQ ID NO.4 shows the nucleotide and amino acid sequence of the heavy chain of the anti-CD4 antibody MT 3.10, the amino acids 1-106 of the
  • V region and amino acids 107-118 correspond to the J3 region
  • SEQ ID NO.5 shows the nucleotide and amino acid sequence of the light chain of the anti-IL2R ⁇ antibody MAK 179, the amino acids 1-95 of the
  • SEQ ID NO.6 shows the nucleotide and amino acid sequence of the heavy chain of the anti-IL2R ⁇ antibody MAK 179, the amino acids 1-98 of the
  • V region which correspond to amino acids 99-102 of the D region and amino acids 103-113 of the J3 region
  • SEQ ID NO.7 shows the nucleotide and amino acid sequence of the light chain of the anti-IL2R ⁇ antibody MAK M-215, with amino acids 1-94 of the V region, amino acids 95-106 of the J4 region and amino acids 107 to 123 correspond to the beginning of the C region,
  • SEQ ID NO.8 shows the nucleotide and amino acid sequence of the heavy chain of the anti-IL2R ⁇ antibody MAK M-215, where amino acids 1-97 of the V region, amino acids 98-104 of the D region, amino acids 105- 119 correspond to the J3 region and amino acids 120-164 correspond to the beginning of the C region,
  • SEQ ID NO.9 shows the nucleotide and amino acid sequence
  • SEQ ID NO.10 shows the nucleotide and amino acid sequence of the heavy chain of the anti-IL2R ⁇ antibody MAK A41, where amino acids 1-98 of the V region, amino acids 99-104 of the D region and amino acids 105-118 of the J region and nucleotide 355 correspond to the first base pair of the C region.
  • the Mixed Lymphocyte Reaction (mixed lymphocyte culture) is based on the property of T-lymphocytes to proliferate in vitro after detection of foreign antigens.
  • Foreign antigens can be bacteria and viruses, but also transplantation antigens on foreign tissue or cells.
  • the human lymphocyte line RPMI 1788 (ATCC CLL156) was used to induce the T cell proliferation of peripheral blood lymphocytes (PPBL) obtained by plasmaphoresis. This cell line was completely blocked in its self-proliferation by treatment with mitomycin C. Only the T-lymphocytes of the PPBL proliferate in the MLR. The activation of the T lymphocytes can be completely inhibited by adding immunosuppressive substances.
  • the MLR is carried out based on Selected Methods in Cellular Immunology Mishell BB, Shiigi SM eds. WH Freeman and Company San Francisco (1980). Medium (RPMI 1640 complete)
  • Vitamin solution (Boehringer Mannheim, catalog No. 210 307):
  • PPBL cells From lymphocyte concentrate (obtained from
  • lymphocytes were obtained by density centrifugation using a lymphocyte separation medium (Boehringer Mannheim, catalog No. 295 949). After washing the cells twice in RPMI 1640 completely, a cell titer of 10 6 / ml was set.
  • RPMI 1788 cells (ATCC CCL 156) are treated with mitomycin C. 10 7 cells / ml are mixed with 50 ⁇ g mitomycin (dissolved in 100 ⁇ l RPMI 1640 completely) and incubated for 45 minutes at 37 ° C., 5% CO 2 . The cells are then centrifuged off and washed twice with RPMI 1640 (completely).
  • a cell titer of 1 x 10 6 / ml is set.
  • methyl 3 H thymidine (specific activity 25 Ci / mmol, TRK 120, Amersham-Buchler, Braunschweig) are added in 25 ⁇ l medium.
  • the cells are incubated for a further 24 hours in an incubator at 37 ° C. and 5% CO 2 .
  • the cells are then harvested with an Inotech harvester (Inotech, Wohlen, Switzerland) on glass fiber filter plates.
  • the filter counting system INB-384 (Inotech) determines the radioactivity of the filter plates.
  • the percentage inhibition as specified in Tables 1, 2a and 2b is determined from the ratio of the measured radioactivity for a test batch with sample substance to a test batch without sample substance. (The concentration data in the tables are to be understood as quantitative data per ml test volume.)
  • Table 1 shows the dose-response curve when the monoclonal antibodies MAK were used alone 179 (anti-IL2R ⁇ antibody) or MT 3.10 or MT 15.1 (anti-CD4 antibody) in the allogenously induced lymphocyte proliferation (MLR). From the values it can be seen that the inhibitory effects of the individual antibodies reach a maximum value of between 60 and 70% at a concentration of approx. 300 ng / ml. The inhibitory effect can no longer be improved by further addition of the same antibody up to a concentration of 30,000 ng / ml.
  • the following table 2a shows the inhibition of allogeneically induced lymphocyte proliferation (MLR) by combination of MAK 179 and MT 3.10. Surprisingly, it was found that by using both antibodies together, a very clear improvement in the inhibitory effect occurs. Almost complete inhibition of allogeneically induced lymphocyte proliferation is found even when 100 ng / ml of the two antibodies are used.
  • Table 2b shows the inhibition of allogeneically induced lymphocyte proliferation (MLR) by combination of MAK 179 and MT 15.1. Almost complete inhibition of allogeneically induced lymphocyte proliferation is found even when using 100 ng / ml of the two antibodies.
  • Example 1 The dose-response curve of the strongly inhibiting anti-IL2R ⁇ antibody A41 alone and in combination with the strongly inhibiting anti-CD4 antibodies MT3.10 and MT 15.1 already tested in Example 1 was investigated. The test was carried out in accordance with Example 1. The results are described in Tables 4a and 4b.
  • ACG CTT CCG TAC ACG TTC GGA GGG GGG ACC A ⁇ G CTG GAA ATA AAA 381 Thr Leu Pro Tyr Thr Phe Gly Gly Gly Thr Lys Leu Glu Ile Lys
  • AGC AGA GTC GAG GCT GAA GAT GCT GCC ACT TAT TAA TCC CAG CAG TGG 336
  • GGC CAA GGG ACT CTC GTC ACT CTC TCT GCA GCC AAA ACA ACA CCC CCA 432 Gly Gln Gly Thr Leu Val Thr Val Ser Ala Ala Lys Thr Thr Pro Pro
  • GCA AGA GGG GGA TTC CCC TAT GCT ATC GAC TAC TCG GCT CAA GGA ACC 336 Ala Arg Gly Gly Phe Pro Tyr Gly Met Asp Tyr Trp Gly Gln Gly Thr

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Abstract

Die vorliegende Erfindung betrifft eine synergistisch wirkende Antikörperzusammensetzung zur Verbesserung der Immunsuppression, die a) mindestens einen für sich alleine bereits stark inhibierenden monoklonalen Anti-CD4-Antikörper und b) mindestens einen für sich alleine bereits stark inhibierenden monoklonalen Anti-IL2Rα- oder Anti-IL2Rβ-Antikörper enthält sowie ein auf dieser Antikörperzusammensetzung basierendes Arzneimittel.

Description

Synergistisch wirkende Antikörperzusammensetzung
B e s c h r e i b u n g
Die vorliegende Erfindung betrifft eine synergistisch wirkende Antikörperzusammensetzung zur Verbesserung der Immunsuppression, die zwei Antikörper gegen verschiedene T-Zell- Oberflächenmarker enthält.
In der Transplantationschirurgie sind in den letzten zehn Jahren deutliche Fortschritte erzielt worden. Insbesondere haben sich die therapeutischen Maßnahmen, welche die Funktion und die Überlebenszeit des transplantierten Organs sicherstellen sollen, wesentlich verbessert. Trotz dieser positiven Entwicklung gewähren die heute etablierten Maßnahmen auch für einen begrenzten Zeitraum keinen hundertprozentigen Transplantationserfolg. Dies liegt zum einen an der Qualität des zu transplantierenden Organs und der Operationstechnik, zum großen Teil jedoch daran, daß die Spenderorgane von einem genetisch differenten Individuum stammen. Diese genetische Nichtkompatibilität zwischen Empfänger und Spender (allogenes Transplantat) verursacht im Empfänger eine Immunreaktion gegen Major Histocompatibility Complex (MHC)-kodierte Oberflächenantigene des Transplantats. Zur Verhinderung dieser Abstoßungsreaktion, die sowohl akut als auch chronisch verlaufen kann, muß die immunologische Reaktivität des Empfängers gezielt durch eine immunsuppressive Therapie unterdrückt werden. Alle heute in der Klinik verwendeten Immunsuppressiva bewirken jedoch eine mehr oder weniger unspezifische Immunsuppression. Die daraus resultierenden Nebenwirkungen sind zum Teil gravierend.
So wirkt das Purinanalogon Azathioprin (Drug Evaluation, 6th Edition American Medical Association 1151 (1986)) als Antimetabolit auf alle proliferierenden Zellen. Nachteile dieser Substanz sind jedoch ihre potentielle Lebertoxizität und die Induktion einer Knochenmarksdepression. Dadurch kommt es zur Verminderung aller Blutzeilen.
Glucokortikoide gehören zu den nichtcytotoxischen Immunsuppressiva. Sie führen jedoch insbesondere bei einer längeren Therapiedauer zu nicht tolerablen Nebenwirkungen (Wachstumsstörungen, Hypertonie, Herzinsuffizienz), die zur Absetzung der Medikation zwingen.
Anti-Lymphozyten-Globulin (ALG) und Cyclosporin besitzen eine höhere Spezifität als die zuvor genannten Substanzen, wirken jedoch auf die Gesamtheit des Immunsystems und erhöhen durch diese generelle Immunsuppression das Risiko von Virus- und Bakterieninfektionen. Weitere Nachteile sind, daß ALG aufgrund seines Sensibilisierungspotentials nur zeitlich befristet verabreicht werden kann. Die Behandlung mit Cyclosporin kann zu einer erhöhten Tumorinzidenz führen.
Akute Abstoßungskrisen bei Organtransplantationen konnten auch erfolgreich mit Anti-T-Zell-Antikörpern behandelt werden (Cosimi AB: Transplant.Proc. 15 (1983), S. 1889; Kreis, H. et al., Transplant.Proc. 17 (1985), S. 1315; Krikma, R.L. et al., Transplantation 36 (1983), S. 620). T-Zellen (T-Lymphozyten) werden in CD4-positive und CD8-positive Zellen unterteilt. CD4 und CD8 sind Oberflächenantigene auf diesen
Zellen. CD8-positive T-Zellen interagieren mit dem T-Zell- Rezeptor in Kontext mit MHC Klasse I Molekülen (Killerzellen). CD4-positive T-Zellen interagieren mit dem T-Zell-Re- zeptor in Kontext mit MHC Klasse II Molekülen auf entsprechenden Rezipientenzellen (Helfer-T-Zellen, Suppressor T- Zellen).
Es wurde gezeigt, daß sowohl mit Anti-CD4-Antikörpern als auch mit Anti-CD8-Antikörpern die Abstoßungsreaktion bei Organtransplantationen verhindert werden kann (vgl. z.B.
Benjamin, R.J. and Waldmann, H.: Induction of tolerance by monocional antibody therapy, Nature 320 (1986), S. 449; Benjamin, R.J., Cobbold, S.P., Clark, M.P. and Waldmann, H.:
Tolerance to rat monocional antibodies. Implications for serotherapy. J.Exp.Med. 163 (1986), S. 1539; Cobbold, S.P., Martin, G., Quin S.X. and Waldmann, H.: Monocional antibodies to promote marrow engraftment and tissue graft tolerance.
Nature 323 (1986), S. 164; Quin S.X, Cobbold, S.P., Tighe, H., Benjamin, R. and Waldmann, H.: CD4 Mab pairs for immunosuppression and tolerance induction. Eur.J. Immunol. 18 (1987) S. 495).
Der Nachteil bei der immunsuppressiven Behandlung mit derartigen Antikörpern ist jedoch, daß diese in einer relativ großen Menge eingesetzt werden müssen. Damit kann es selbst bei chimärisierten Antikörpern zu heftigen Immunreaktionen kommen.
Die EP-A 0 240 344 offenbart in Beispiel 5 (Spalte 8) eine Kombination von Anti-CD4-MAKs mit Anti-IL2Rα (CD25)-MAKs zur Verhinderung von Transplantatabstoßungen. Eine vollständige Hemmung wird jedoch nur bei Kombination mit einem dritten MAK gegen CD8 erreicht. Der in der Kombination als Anti-IL2Rα-MAK verwendete Antikörper YCTLD45.1 zeigt für sich alleine keine nennenswerte Hemmung der Immunreaktion. Es wird jedoch nicht offenbart, welche Eigenschaften die in Kombination verwendbaren Antikörper besitzen müssen, damit generell eine vollständige Hemmung erwartet werden kann.
Eine Aufgabe der vorliegenden Erfindung besteht somit darin, ein immunsuppressives Mittel zur Verfügung zu stellen, welches zuverlässig die Abstoßungsreaktion gegen Transplantate unterdrücken kann und nur in geringen Dosen verabreicht werden muß.
Gelöst wird die erfindungsgemäße Aufgabe durch eine synergistisch wirkende Antikörperzusammensetzung zur Verbesserung der Immunsuppression, welche dadurch gekennzeichnet ist, daß sie
(a) mindestens einen für sich alleine bereits stark inhibierenden monoklonalen Anti-CD4-Antikörper und
(b) mindestens einen für sich alleine bereits stark inhibierenden monoklonalen Anti-IL2Rα- oder Anti-IL2Rß-Antikörper enthält,
wobei ein stark inhibierender Antikörper bei einer Konzentration von 10.000 ng/ml die allogen induzierte Lymphozytenproliferation in Abwesenheit anderer Antikörper zu mindestens 40 % hemmt.
Wenn es sich bei dem Antikörper (b) um einen Anti-IL2Rα-Anti- körper handelt, dann liegt das molare Verhältnis der Antikörper (a) und (b) vorzugsweise zwischen 1:10 und 10:1. Wenn es sich dagegen bei dem Antikörper (b) um einen Anti-IL2Rß-Antikörper handelt, dann liegt das molare Verhältnis der Antikörper (a) und (b) vorzugsweise zwischen 1:1000 und 10:1. Die Kombination Anti-CD4-MAK und Anti-IL2Rα-MAK ist erfindungsgemäß bevorzugt.
Eine Voraussetzung für den synergistischen Effekt bei der Kombination von monoklonalen Anti-CD4-bzw. Anti-IL2-Rezeptor- Antikörpern ist, daß jeder dieser Antikörper bereits für sich alleine eine immunsuppressive, d.h. die Lymphozytenproliferation stark inhibierende Wirkung zeigen muß. Diese "stark inhibierende" Wirkung im Sinne der vorliegenden Erfindung zeigt sich darin, daß der betreffende Antikörper bereits alleine die allogen induzierte Lymphozytenproliferation (MLR) bei einer Konzentration von 10.000 ng/ml zu mindestens 40 % hemmt. Antikörper, die in einer Konzentration von 10.000 ng/ml bei der MLR keine Hemmwirkung oder eine Hemmwirkung von weniger als 40 % zeigen, sind daher als Bestandteile einer erfindungsgemäßen Zusammensetzung im allgemeinen nicht geeignet. Es wurde gefunden, daß die Kombination eines stark inhibierenden monoklonalen Antikörpers gegen die CD4-Struktur mit einem stark inhibierenden monoklonalen Antikörper gegen die α-Kette des IL2-Rezeptors (Anti-IL2Rα-Antikörper) oder die ß- Kette des IL2-Rezeptors (Anti-IL2Rß-Antikörper) überraschenderweise die Inhibierung der Proliferation der T-Helferzellen synergistisch steigert, so daß auf diese Weise Transplanta- tionsabstoßungen vermieden werden. Es zeigt sich, daß bei einem üblicherweise verwendeten in vitro Testsystem für die immunologische Histokompatibilität zweier Individuen (Mixed Lymphocyte Reaction, MLR, Selected Methods in Cellular
Immunology, Mishell, B.B., Shiigi S.M. eds. WH Freeman and Company, San Francisco 1980) die gleichzeitige Zugabe zweier monoklonaler Antikörper (Anti-CD4, Anti-IL-2 Rezeptor) synergistisch die Lymphozytenproliferation hemmt. Die wirksame Dosis dieser Antikörperkombination ist damit überraschenderweise wesentlich geringer als die wirksame Dosis der Antikörper, wenn sie einzeln eingesetzt werden. Weiterhin wurde überraschenderweise festgestellt, daß bei der Kombination von Anti-IL2Rα-Antikörpern mit Anti-CD4-Antikörpern eine bis zu 96 %ige Hemmung der MLR erzielt werden kann. Bei Verwendung von Anti-IL2Rα-Antikörpern oder Anti-CD4-Antikörpern allein wird dagegen selbst bei Konzentrationen von 30 μg/ml keine stärkere Hemmung als 70 % erreicht. Bei der Kombination von Anti-IL2Rß-Antikörpern mit Anti-CD4-Antikörpern kann ebenfalls überaschenderweise eine bis zu 96%ige Hemmung der MLR erzielt werden.
Der erfindungsgemäße und überraschende Synergismus wird nur dann festgestellt, wenn ein für sich alleine bereits stark inhibierender Anti-IL2Rα-oder Anti-IL2Rß-MAK in Kombination mit einem Anti-CD4-MAK verwendet wird. Verwendet man hingegen beispielsweise einen nicht bzw. nur schwach inhibierenden Anti-IL2Rα-MAK, so wurde in Kombination mit einem für sich alleine bereits stark inhibierenden Anti-CD4-MAK keine verstärkte suppressive Wirkung gegenüber der alleinigen Verwendung des Anti-CD4-M4AK festgestellt. Bei einer Kombination von Anti-CD4-MAK und Anti-IL2Rα-MAK werden für einen optimalen synergistischen Effekt vorzugsweise die beiden Antikörper (a) und (b) in einem molaren Verhältnis von 1:10 bis 10:1 verwendet. Besonders bevorzugt beträgt das molare Verhältnis der Antikörper (a) und (b) von 1:5 bis 5:1, am meisten bevorzugt von 3:10 bis 3:1. Bei Verwendung der Kombination Anti-CD4-MAK und Anti-IL2Rß-MAK wird vorzugsweise ein molares Verhältnis der Antikörper (a) und (b) von 1:1000 bis 10:1 gewählt. Die erfindungsgemäße Antikörperzusammensetzung kann sowohl einen als auch mehrere Anti-CD4-Antikörper und sowohl einen als auch mehrere Anti- IL2Rα- oder Anti-IL2Rß-Antikörper enthalten, wobei sich bei Verwendung von mehreren Antikörpern einer Spezifität das molare Verhältnis immer jeweils auf die Summe aller Antikörper einer Spezifität bezieht.
Weiterhin wurde festgestellt, daß für die erfindungsgemäße Verwendung die Anwendung der beiden Antikörper zwar gemeinsam, aber nicht unbedingt gleichzeitig erfolgen muß , um den synergistischen Effekt zu zeigen. Unter dem Begriff "gemeinsamen Anwendung" ist im Sinne der vorliegenden Erfindung zu verstehen, daß auch eine gewisse zeitliche Versetzung bei der Verabreichung beider Antikörper toleriert werden kann. Es ist jedoch erforderlich, daß bei Verabreichung des zweiten Antikörpers die Wirksamkeit des zuerst verabreichten Antikörpers noch nicht deutlich nachgelassen haben darf. In der Praxis kann eine derartige in Frage kommende zeitliche Versetzung etwa bis zu 12 Stunden betragen.
Ein weiterer Vorteil der erfindungsgemäßen Antikörperkombina- tion ist ihre hohe Spezifität. Da Anti-IL2Rα- oder Anti- IL2Rß-Antikörper insbesondere an die aktivierten T-Lymphozy- ten binden und lediglich die Anti-CD4-Antikörper an die Gesamtheit aller T-Helferzellen binden, wird durch die erfindungsgemäße Kombination dieser Antikörper in den erfin'dungs- gemäß geringen Mengen die allgemeine Immunreaktion nur unwesentlich unterdrückt. Die als Komponenten der erfindungsgemäßen Antikörperzusammensetzung geeigneten Antikörper können murine, humane, chimäri- sierte oder humanisierte Antikörper oder Antikörperfragmente sein. Vorzugsweise verwendet man humane, chimärisierte oder humanisierte Antikörper oder derartige Antikörperfragmente, da auf diese Weise die Möglichkeit einer Immunreaktion gegen die verabreichten Antikörper möglichst gering gehalten wird. Chimärisierte oder humanisierte Antikörper im Sinne der vorliegenden Erfindung sind nicht-humane Antikörper z.B. murinen Ursprungs, bei denen mittels bekannter gentechnologischer Methoden murine Sequenzen durch humane Sequenzen ersetzt worden sind. Bei den chimärisierten Antikörpern wird dabei nur die konstante Region des Antikörpers durch eine entsprechende humane Region ersetzt, während bei humanisierten Antikörpern die CDR-Regionen (complementary-determining regions) von humanen V-Regionen für die leichte und die schwere Kette eines Antikörpers durch die CDR-Regionen eines murinen oder anderen Nager-Antikörpers ausgetauscht werden können, so daß der humanisierte Antikörper bis auf die CDR-Regionen einem humanen Antikörper entspricht. Ebenfalls geeignet für das erfindungsgemäße Verfahren sind Antikörperfragmente, z.B.
Fab- oder F(ab)2-Antikörperfragmente, die nach Standardmethoden gewonnen werden können.
Eine genaue Beschreibung von geeigneten Anti-IL2Rα-Antikör- pern findet man in der PCT/EP91/01737. Anti-CD4-Antikörper sind in Eur.J.Immunol. 18 (1987) 495-502 genannt. Eine
Beschreibung von geeigneten Anti-IL2Rß-Antikörpern findet man in Takeshita, T., Goto, Y., Tada, K., Nagata, K., Asao, H., Sugamura, K.: J.Exp.Med. 169 (1989) 1323-1332; Tsudo, M., Kitamura, F., Mijasaka, M.: Proc.Natl.Acad.Sci.USA 86 (1989) 1982-1986 und Niguma, T., Sakagami, K., Kawamura, T., Haisa, M., Fujiwara, T., Kusaka, S., Uda, M., Orita, K.:
Transplantation 52 (1991) 296-302. Besonders geeignet ist eine Kombination von Anti-CD4- und Anti-IL2Rα- oder Anti-IL2Rß-Antikörpern, deren Sequenzen für die variablen Regionen der leichten bzw. schweren Ketten in den beiliegenden Sequenzprotokollen beschrieben sind. SEQ ID NO. 1 und 2 zeigen Nukleotid- bzw. Aminosäuresequenzen des Anti-CD4-Antikörpers MT 15.1, SEQ ID NO. 3 und 4 zeigen Nukleotid- bzw. Aminosäuresequenzen des Anti-CD4-Antikörpers MT 3.10, SEQ ID NO. 5 und 6 zeigen Nukleotid- bzw. Aminosäuresequenzen des Anti-IL2Rα-Antikörpers MAK 179. SEQ ID No. 9 und 10 zeigen Nukleotid- bzw. Aminosäuresequenzen des Anti- ILRß-Antikörpers A41. Während sich die zuvor genannten Anti- körper zur Herstellung einer erfindungsgemäßen Zusammensetzung eignen, wurde dagegen festgestellt, daß der alleine nur schwach inhibitorisch wirkende Anti-ILRα-Antikörper M-215 (SEQ ID. 7 und 8 ) in Kombination mit einem stark inhibierenden Anti-CD4-Antikörper keinen synergistischen Effekt zeigt. Geeignete konstante Regionen (murin oder human) für diese Antikörper sind beschrieben in : Sequences of proteins of immunological interest; E. Kabat, T. Wu, M. Reid-Miller, H. Perry and K. Gottesman, U.S. Department of Health and Human Services, 1987, p. 282-325. Die Fusion der Gene für die konstanten Regionen mit den Genen für die variablen Regionen kann mittels Standard-Klonierungstechniken der Molekularbiologie erfolgen.
Weiterhin ist ein Gegenstand der vorliegenden Erfindung ein Arzneimittel, das aus Komponenten (1) und (2) besteht, wobei die beiden Komponenten gemeinsam zu verabreichen sind, aber getrennt formuliert sein können, welches dadurch gekennzeichnet ist, daß die Komponente (1) einen für sich alleine stark inhibierenden monoklonalen Anti-CD4-Antikörper (a) als Wirkstoff und die Komponente (2) einen für sich alleine stark inhibierenden monoklonalen Anti-IL2Rα- oder Anti-IL2Rß-Antikörper (b) als Wirkstoff enthält, gegebenenfalls mit üblichen pharmazeutischen Hilfs-, Verdünnungs-, Träger- und Füllstoffen. Bei Verwendung eines Anti-IL2Rα-Antikörpers als Wirk- stoff der Komponente (2) ist das molare Verhältnis der beiden Antikörper der Komponenten (1) und (2) im Arzneimittel vorzugsweise von 1:10 bis 10:1. Besonders bevorzugt beträgt das molare Verhältnis der beiden Antikörper von 1 : 5 bis 5:1, am meisten bevorzugt von 3:10 bis 3:1. Verwendet man hingegen einen Anti-IL2Rß-Antikörper als Wirkstoff der Komponente (2), dann ist das Verhältnis der beiden Antikörper der Komponenten (1) und (2) vorzugsweise von 1:1000 bis 10:1.
Wie bereits oben ausgeführt, sind die beiden Komponenten des erfindungsgemäßen Arzneimittels gemeinsam zu verabreichen, wobei der Begriff "gemeinsam" jedoch nicht unbedingt gleichzeitig bedeuten muß. Daher ist klar, daß die beiden Komponenten des erfindungsgemäßen Arzneimittels getrennt formuliert sein können. Die Formulierung der Antikörper erfolgt mittels Standardmethoden, z.B. in intravenös verabreichbaren physiologischen Lösungen.
Ein weiterer Gegenstand der vorliegenden Erfindung ist die Verwendung der erfindungsgemäßen Antikörperzusammensetzung oder des erfindungsgemäßen Arzneimittels bei einer immunsuppressiven Therapie, insbesondere bei einer Therapie zur Unterdrückung einer Immunreaktion nach Organ- oder Gewebetransplantationen und Autoimmunerkrankungen.
Bei einem derartigen Behandlungsverfahren wird ein erfindungsgemäßes Arzneimittel verabreicht, das die Kombination eines Anti-CD4- und eines Anti-IL2Rα- oder Anti-IL2Rß-Antikörpers enthält. Bei einem derartigen therapeutischen Verfahren ist es überraschenderweise möglich, die Menge der
verwendeten Antikörper gegenüber dem getrennten Einsatz der MAKs um den Faktor 10 herabzusetzen. Bei den verschiedenen in vivo Transplantationsmodellen werden MAKs gegen Oberflächenstrukturen bei einer Konzentration von 1 bis 5 mg/kg Körpergewicht (täglich für 10 bis 14 Tage), eingesetzt. Bei einer erfindungsgemäßen Kombination Anti-CD4 plus Anti-IL2Rα bzw. Anti-CD4 plus Anti-IL2Rß könnte die effektive Dosis auf 100 bis 200 μg/kg herabgesetzt werden.
Folgende Antikörper wurden bei der ECACC, Public Health Laboratory Service, Porton Down, Salisbury, Witshire SP 5 OJG, Großbritannien hinterlegt:
Anti CD4 MAK MT 15.1 unter der Bezeichnung Clone 15-1/P3/14 (ECACC 90090705) hinterlegt am 07.09.1990,
Anti CD4 MAK MT 3.10 unter der Bezeichnung Clone 3.101/5B10 (ECACC 90090702) hinterlegt am 07.09.1990 und
Anti IL2Rα MAK 179 unter der Bezeichnung 3G10/179 (ECACC 90071905) hinterlegt am 19.07.1990.
Der monoklonale Anti IL2Rß-Antikörper A41 wurde unter der Bezeichnung MAK<-IL-2R>M-A23A41 bei der Deutschen Sammlung von Mikroorganismen und Zellkulturen GmbH (DSM), Mascheroder Weg 1b, D-3300 Braunschweig, am 30.07.1991 unter der Nr. DSM ACC 2015 hinterlegt.
Die folgenden Beispiele sollen in Verbindung mit den Sequenzprotokollen SEQ ID NO. 1 bis NO. 10 die Erfindung weiter verdeutlichen.
SEQ ID NO.1 zeigt die Nukleotid- und Aminosäuresequenz
der leichten Kette des Anti-CD4-Antikörpers MT 15.1, wobei die Aminosäuren 1-95 der V- Region und die Aminosäuren 96-107 der J2-Re- gion entsprechen,
SEQ ID NO.2 zeigt die Nukleotid- und Aminosäuresequenz
der schweren Kette des Anti-CD4-Antikörpers MT 15.1, wobei die Aminosäuren 1-107 der V-Region und die Aminosäuren 108-120 der J4-Region entsprechen,
SEQ ID NO.3 zeigt die Nukleotid- und Aminosäuresequenz
der leichten Kette des Anti-CD4-Antikörpers MT 3.10, wobei die Aminosäuren 1-100 der V-Region und die Aminosäuren 101-111 der J1-Region
entsprechen,
SEQ ID NO.4 zeigt die Nukleotid- und Aminosäuresequenz der schweren Kette des Anti-CD4-Antikörpers MT 3.10, wobei die Aminosäuren 1-106 der
V-Region und die Aminosäuren 107-118 der J3- Region entsprechen,
SEQ ID NO.5 zeigt die Nukleotid- und Aminosäuresequenz der leichten Kette des Anti-IL2Rα-Antikörpers MAK 179, wobei die Aminosäuren 1-95 der
V-Region und die Aminosäuren 96-107 der
J1-Region entsprechen,
SEQ ID NO.6 zeigt die Nukleotid- und Aminosäuresequenz der schweren Kette des Anti-IL2Rα-Antikörpers MAK 179, wobei die Aminosäuren 1-98 der
V-Region, die Aminosäuren 99-102 der D-Region und die Aminosäuren 103-113 der J3-Region entsprechen,
SEQ ID NO.7 zeigt die Nukleotid- und Aminosäuresequenz der leichten Kette des Anti-IL2Rα-Antikörpers MAK M-215, wobei die Aminosäuren 1-94 der V-Region, die Aminosäuren 95-106 der J4-Region und die Aminosäuren 107 bis 123 dem Beginn der C-Region entsprechen,
SEQ ID NO.8 zeigt die Nukleotid- und Aminosäuresequenz der schweren Kette des Anti-IL2Rα-Antikörpers MAK M-215, wobei die Aminosäuren 1-97 der V-Region, die Aminosäuren 98-104 der D-Region, die Aminosäuren 105-119 der J3-Region und die Aminosäuren 120-164 dem Beginn der C-Region entsprechen,
SEQ ID NO.9 zeigt die Nukleotid- und Aminosäuresequenz
der leichten Kette des Anti-IL2Rß-Antikörpers MAK A41, wobei die Aminosäuren 1-96 der V-Re- giön, die Aminosäuren 97-107 der J-Region und das Nukleotid 322 dem ersten Basenpaar der C-Region entsprechen, und SEQ ID NO.10 zeigt die Nukleotid- und Aminosäuresequenz der schweren Kette des Anti-IL2Rß-Antikörpers MAK A41, wobei die Aminosäuren 1-98 der V-Region, die Aminosäuren 99-104 der D-Region, die Aminosäuren 105-118 der J-Region und das Nukleotid 355 dem ersten Basenpaar der C-Region entsprechen.
Beispiel 1
Messung der Inhibition der Mixed Lymphocyte Reaction (MLR) durch Antikörper
Die Mixed Lymphocyte Reaction (gemischte Lymphozyten Kultur) basiert auf der Eigenschaft von T-Lymphozyten, nach Erkennen von Fremdantigenen in vitro verstärkt zu proliferieren.
Fremdantigene können Bakterien und Viren sein, aber auch Transplantationsantigene auf fremdem Gewebe oder Zellen. Zur Induktion der T-Zell-Proliferation von durch Plasmaphorese gewonnenen peripheren Blut-Lymphozyten (PPBL) wurde die humane Lymphozyten-Linie RPMI 1788 (ATCC CLL156) verwendet. Durch Behandlung mit Mitomycin C wurde diese Zelllinie in ihrer Eigenproliferation vollständig blockiert. In der MLR proliferieren also nur die T-Lymphozyten der PPBL. Die Aktivierung der T-Lymphozyten kann durch Zugabe von immunsuppressiven Substanzen komplett inhibiert werden.
Die Durchführung der MLR erfolgt in Anlehnung an Selected Methods in Cellular Immunology Mishell B.B., Shiigi S.M. eds. WH Freeman and Company San Francisco (1980). Medium (RPMI 1640 komplett)
440 ml RPMI 1640 (Boehringer Mannheim, Katalog Nr. 209 945) 50 ml fötales Kälberserum (FKS) (Boehringer Mannheim,
Katalog Nr. 210 471)
5 ml Glutaminlösung, 200 mmol/l (Boehringer Mannheim,
Katalog Nr. 210 277) 5 ml Vitaminlösung (1 %) (Boehringer Mannheim,
Katalog Nr. 210 307)
1 ml Penicillin (50 000) und Streptomycin (50 mg)
(Boehringer Mannheim, Katalog Nr. 210 404) in RPMI 1640
Vitaminlösung (Boehringer Mannheim, Katalog Nr. 210 307):
Figure imgf000015_0001
PPBL-Zellen: Aus Lymphozytenkonzentrat (gewonnen durch
Plasmaphorese, Bayerisches Rotes Kreuz, München) wurden die Lymphozyten durch Dichtezen- trifugation mittels Lymphozyten-Trennmedium (Boehringer Mannheim, Katalog Nr. 295 949) gewonnen. Nach zweimaligem Waschen der Zellen in RPMI 1640 komplett wurde ein Zelltiter von 106 /ml eingestellt.
RPMI 1788-Zellen:
Humane Lymphozytenlinie (ATCC CCL 156; IgM- lambda Ketten sezernierend) RPMI 1788-Zellen (ATCC CCL 156) werden mit Mitomycin C behandelt. Dazu werden 107 Zellen/ml mit 50 μg Mitomycin (gelöst in 100 μl RPMI 1640 komplett) versetzt und 45 Minuten bei 37°C, 5 % CO2 inkubiert. Danach werden die Zellen abzentrifugiert und 2 x mit RPMI 1640 (komplett) gewaschen.
Es wird ein Zelltiter von 1 x 106 /ml eingestellt.
Zur Durchführung der MLR werden 100 μl PPBL ( 105 -Zellen) in Medium, RPMI 1640 komplett, 100 μl RPMI 1788-Zellen (105- Zeilen) in Medium, RPMI 1640 komplett und 20 μl Probensubstanz (MAK 179 und/oder MAK M 15.1) in den in den Tabellen 1 bis 2b angegebenen Konzentrationen in Flachboden-Gewebekulturplatten (96 Vertiefungen, , Fa. Nunc) gegeben. Es wird vier Tage im Brutschrank bei 37°C und 5 % CO2 inkubiert. Das Ausmaß der Proliferation wird durch Einbau von radioaktivem Thymidin in die DNS quantifiziert. Dafür werden 0,5 μCi/Ver- tiefung Methyl-3 H Thymidin (spezifische Aktivität 25 Ci/mmol, TRK 120, Amersham-Buchler, Braunschweig) in 25 μl Medium zugegeben. Die Zellen werden weitere 24 Stunden im Brutschrank bei 37°C und 5 % CO2 inkubiert.
Anschließend werden die Zellen mit einem Inotech-Harvester (Fa. Inotech, Wohlen, Schweiz) auf Glasfiberfilterplatten geerntet. Mit dem Filter Counting System INB-384 (Inotech) wird die Radioaktivität der Filterplatten bestimmt. Aus dem Verhältnis der gemessenen Radioaktivität für einen Testansatz mit Probensubstanz zu einem Testansatz ohne Probensubstanz wird die prozentuale Inhibition, wie sie in den Tabellen 1, 2a und 2b angegeben ist, bestimmt. (Die Konzentrationsangaben in den Tabellen sind als Mengenangaben pro ml Testvolumen zu verstehen.)
Die folgende Tabelle 1 zeigt die Dosis-Wirkungskurve bei jeweils alleiniger Anwendung der monoklonalen Antikörper MAK 179 (Anti-IL2Rα-Antikörper) oder MT 3.10 bzw. MT 15.1 (Anti- CD4-Antikörper) in der allogen induzierten Lymphozyten Proliferation (MLR). Aus den Werten ist ersichtlich, daß die Hemmwirkungen der einzelnen Antikörper bei einer Konzentration von ca. 300 ng/ml einen Maximalwert zwischen 60 bis 70 % erreichen. Durch weitere Zugabe desselben Antikörpers bis zu einer Konzentration von 30000 ng/ml kann die Hemmwirkung nicht mehr verbessert werden.
Tabelle 1:
Hemmung der MLR in Prozent gegenüber Kontrolle
Figure imgf000017_0001
Die folgende Tabelle 2a zeigt die Inhibition der allogen induzierten Lymphozyten Proliferation (MLR) durch Kombination von MAK 179 und MT 3.10. Überraschenderweise wurde gefunden, daß durch gemeinsame Anwendung beider Antikörper eine sehr deutliche Verbesserung der Hemmwirkung eintritt. Bereits bei Einsatz von jeweils 100 ng/ml der beiden Antikörper wird eine fast vollständige Inhibition der allogen induzierten Lympho- zyten-Proliferation festgestellt.
Figure imgf000018_0001
Die folgende Tabelle 2b zeigt die Inhibition der allogen induzierten Lymphozyten-Proliferation (MLR) durch Kombination von MAK 179 und MT 15.1. Man findet bereits bei Einsatz von jeweils 100 ng/ml der beiden Antikörper eine fast vollständige Inhibition der allogen induzierten Lymphozyten-Proliferation.
Figure imgf000019_0001
Vergleichsbeispiel
Es wurde auch die Wirkung der Kombination eines alleine nur schwach inhibierenden Anti-IL2Rα-Antikörpers (M-215) mit den stark inhibitorisch wirksamen Anti-CD4-Antikörpern 3.10 bzw. 15.1 getestet. Die Testdurchführung erfolgte, wie in Beispiel 1 beschrieben. Die Ergebnisse sind in den Tabellen 3a und 3b dargestellt.
Figure imgf000020_0001
Aus den Tabellen 3a und 3b ist ersichtlich, daß eine Kombination der Antikörper M-215 und MT 3.10 bzw. M-215 und MT 15.1 auch bei extrem hohen Konzentrationen keinen synergistischen Effekt zeigt. Beispiel 2
Es wurde die Dosis-Wirkungskurve des alleine stark inhibierenden Anti-IL2Rß-Antikörpers A41 alleine und in Kombination mit den bereits in Beispiel 1 getesteten stark inhibierenden Anti-CD4-Antikörpern MT3.10 und MT 15.1 untersucht. Die Testdurchführung erfolgte gemäß Beispiel 1. Die Ergebnisse sind in den Tabellen 4a und 4b beschrieben.
Figure imgf000021_0001
Figure imgf000022_0001
Aus den Tabellen 4a und 4b ist ersichtlich, daß eine Kombination der Antikörper A41 und MT3.10 bzw. A 41 und MT 15.1 eine synergistische Wirkung gegenüber einer alleinigen
Verabreichung der Antikörper zeigt. SEQUENZLISTE
(1) ALLGEMEINE INFORMATION:
(iii) ANZAHL DER SEQUENZEN: 10
(2 ) INFORMATION FÜR SEQ ID NO: 1:
(i) SEQIMNZKENNZEICHEN:
(A) LÄNGE: 381 Basenpaare
(B) TYP: Nukleinsäure
(C) STRÄNGFORM: einzel
(D) TOPOLOGIE: linear
(ix) MERKMAL:
(A) BEZEICHNUNG: kodierende Sequenz
(B) POSITION: 1..381
(ix) MERKMAL:
(A) BEZEICHNUNG: reifes Peptid
(B) POSITION: 61..381
(ix) MERKMAL:
(A) BEZEICHNUNG: Signalpeptid
(B) POSITION: 1..60
(xi) SEQUENZBESCHREIBUNG: SEQ ID NO:1:
ATG ATG TCC TCT GCT CAG TTC CTT GGT CTC CTG TTG CTC TGT TTT CAA 48 Met Met Ser Ser Ala Gln Phe Leu Gly Leu Leu Leu Leu Cys Phe Gln
-20 -15 -10 -5
GGT ACC AGA TGT GAT ATC CAG ATG ACA CAG ACT ATA TCC TCC CTC TCT 96 Gly Thr Arg Cys Asp Ile Gin Met Thr Gln Thr Ile Ser Ser Leu Ser
1 5 10
GCC TCT CTG GGA GAC AGA GTC ACC ATC ACT TGC AGG GCA ACT CAG GAC 144 Ala Ser Leu Gly Asp Arg Val Thr Ile Ser Cys Arg Ala Ser Gin Asp
15 20 25
ATT AAC AAT TAT TTA AGC TGG TAT CAG CAG AAA CCA GAT GGA ACT GTT 192 Ile Asn Asn Tyr Leu Ser Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Asp Gly Thr Val
30 35 40
AAA CTC CTG ATC TAC TAC ACA TCA AGA TTA CAT TCA GGA GTC CCA TCA 240 Lys Leu Leu Ile Tyr Tyr Thr Ser Arg Leu His Ser Gly Val Pro Ser
45 50 55 60
AGG TTC AGT GGC ACT GGG TCT GGA ACA GAT TAT TCT CTC ACC ATT ACC 288 Arg Phe Ser Gly Ser Gly Ser Gly Thr Asp Tyr Ser Leu Thr Ile Thr
65 70 75 AAC CTG GAG CAA GAA GAT GTT GCC ACT TAC TTT TGC CAA CAG GCT AAT 336 Asn Leu Glu Gln Glu Asp Val Ala Thr Tyr Phe Cys Gin Gin Gly Asn
80 85 90
ACG CTT CCG TAC ACG TTC GGA GGG GGG ACC AÄG CTG GAA ATA AAA 381 Thr Leu Pro Tyr Thr Phe Gly Gly Gly Thr Lys Leu Glu Ile Lys
95 100 105
(2 ) INFORMATION FÜR SEQ ID NO:2:
(i) SEQUENZKENNZEICHEN:
(A) LÄNGE: 417 Basenpaare
(B) TYP: Nukleinsäure
(C) STRONGFORM: einzel
(D) TOPOLOGIE: linear
(ix) MERKMAL:
(A) BEZEICHNUNG: kodierendes Peptid
(B) POSITION: 1..417
(ix) MERKMAL:
(A) BEZEICHNUNG: reifes Peptid
(B) POSITICN: 58..417
(ix) MERKMAL:
(A) BEZEICHNUNG: Signalpeptid
(B) POSITION: 1..57
(xi) SEQUENZBESCΗREIBUNG: SEQ ID NO:2:
ATG GCT TGG GTG TGG ACC TTG CTT TTC CTG ATG GCA GCT GCC CAA ACT 48
Met Ala Trp Val Trp Thr Leu Leu Phe Leu Met Ala Ala Ala Gln Ser
-19 -15 -10 -5
ATC CAA GCA CAG ATC CAG TTG CTG CAG TCT GGA CCT GAG CTG AAG ACG 96
Ile Gln Ala Gln Ile Gln Leu Val Gln Ser Gly Pro Glu Leu Lys Thr
1 5 10
CCT GGA GAG ACA CTC AAG ATC TCC TGC AAG GCT TCT GCT TAT ACC TTC 144
Pro Gly Glu Thr Val Lys Ile Ser Cys Lys Ala Ser Gly Tyr Thr Phe
15 20 25
ACA GAC TAT TCA ATA CAC TGG GTG AAG CAG GCT CCA GGG AAG GAT TTA 192
Thr Asp Tyr Ser Ile His Trp Val Lys Gln Ala Pro Gly Lys Asp Leu
30 35 40 45
AAG TGG ATC GGC TGG ATA AAC ACT GAG ACT GCT GAG CCA ACA TAT GCA 240
Lys Trp Met Gly Trp Ile Asn Thr Glu Thr Gly Glu Pro Thr Tyr Ala
50 55 60
GAT GAC TTC ACG GGA CGG TTT GCC TTC TCT TTG GAA ACC TCT GCC AGC 288
Asp Asp Phe Thr Gly Arg Phe Ala Phe Ser Leu Glu Thr Ser Ala Ser
65 70 75
ACT GTC TAT TTG CAG ATC AAC AAC CTC AAA AAT GAG GAC ACG TCT ACA 336
Thr Val Tyr Leu Gln Ile Asn Asn Leu Lys Asn Glu Asp Thr Ser Thr
80 85 90 TAT TTC TCT GCT ATT CAT TAC TAC GCC TAC GGG GAT CCT TTG GAC TAC 384 Tyr Phe Cys Ala Ile His Tyr Tyr Ala Tyr Gly Asp Pro Leu Asp Tyr
95 100 105
TGG GCT CAA GGA ACC TCA CTC ACC GTC TCC TCA 417 Trp Gly Gln Gly Thr Ser Val Thr Val Ser Ser
110 115 120
(2) INFORMATION FÜR SEQ ID NO:3:
(i) SEQUENZKENNZEICHEN:
(A) LÄNGE: 393 Basenpaare
(B) TYP: Nukleinsäure
(C) STRANGFORM: einzel
(D) TOPOLOGIE: linear
(ix) MERKMAL:
(A) BEZEICHNUNG: kodierende Sequenz
(B) POSITION: 1..393
(ix) MERKMAL:
(A) BEZEICHNUNG: reifes Peptid
(B) POSITION: 61..393
(ix) MERKMAL:
(A) BEZEICHNUNG: Signalpeptid
(B) POSITION: 1. .60
(xi) SEQUENZKENNZEICHEN: SEQ ID NO:3:
ATG GAG ACA GAC ACA ATC CTC CTA TGG GTG CTC CTG CTC TGG CTT CCA 48 Met Glu Thr Asp Thr Ile Leu Leu Trp Val Leu Leu Leu Trp Val Pro
-20 -15 -10 -5
GGC TCC ACT GCT GAC ATT GTC CTG ACC CAA TCT CCA GCT TCT TTG CCT 96
Gly Ser Thr Gly Asp Ile Val Leu Thr Gln Ser Pro Ala Ser Leu Pro
1 5 10
ATC TCT CTA GGG CAG AGG GCC ACC ATC TCC TGC AÄG GCC AGC CAA ACT 144
Met Ser Leu Gly Gin Arg Ala Thr Ile Ser Cys Lys Ala Ser Gln Ser
15 20 - 25
CTT GAT TAT GAT GCT GAT ACT TAT ATG AAC TGG TAC CAA CAG AAA CCA 192
Leu Asp Tyr Asp Gly Asp Ser Tyr Met Asn Trp Tyr Gln Gln Lys Pro
30 35 40
GGA CAG CCA CCC AAA CTC CTC ATC TAT GCT GCA TCC AAT CTA GAA TCT 240
Gly Gln Pro Pro Lys Leu Leu Ile Tyr Ala Ala Ser Asn Leu Glu Ser
45 50 55 60
GGG ATC CCA GCC AGA TTT ACT GGC ACT GGG TCC GGG ACA GAC TTC ACC 288
Gly Ile Pro Ala Arg Phe Ser Gly Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr
65 70 75
CTC AAC ATC CAT CCT GTC GAG GAG GAG GAT GCT GCA ACC TAT TAC TCT 336
Leu Asn Ile His Pro Val Glu Glu Glu Asp Ala Ala Thr Tyr Tyr Cys
80 85 90 CAG CAA ACT ACT GAG GAT CCT CCG ACG TTC GCT GGA GGC ACC AAG CTG 384 Gln Gln Ser Ser Glu Asp Pro Pro Thr Phe Gly Gly Gly Thr Lys Leu
95 100 105
GAA ATC AAA 393
Glu Ile Lys
110
(2 ) INFORMATION FÜR SEQ ID NO:4 :
(i) SEQUENZKENNZEICHEN:
(A) LÄNGE: 408 Basenpaare
(B) TYP: Nukleinsäure
(C) STRÄNGFORM: einzel
(D) TOPOLOGIE: linear
(ix) MERKMAL:
(A) BEZEICHNUNG: kodierende Sequenz
(B) POSITION: 1..408
(ix) MERKMAL:
(A) BEZEICHNUNG: reifes Peptid
(B) POSITTCN: 55..408
(ix) MERKMAL:
(A) BEZEICHNUNG: Signalpeptid
(B) POSITION: 1..54
(xi) SEQUENZKENNZEICHEN: SEQ ID NO:4:
ATC GAA TGG AGG ATC TTT CTC TTC ATC CTG TCA GGA ACT GCA GCT CTC 48 Met Glu Trp Arg Ile Phe Leu Phe Ile Leu Ser Gly Thr Ala Gly Val
-18 -15 -10 -5
CAC TCC CAG GTT CAC CTG CAG CAG TCT GGA CCT GAG CTG GTG AAG CCT 96
His Ser Gln Val His Leu Gln Gln Ser Gly Pro Glu Leu Val Lys Pro
1 5 10
GGG CCT TCA GTC AAG ATC TCC TGC AAG GCT TCT GGA TAC ACA TTC ACT 144 Gly Pro Ser Val Lys Met Ser Cys Lys Ala Ser Gly Tyr Thr Phe Thr
15 20 25 30
GAC TAT CTT CTA ACT TGG ATC CAA CAG AGA ACT GGA CAG GTC CTT GAG 192 Asp Tyr Val Val Ser Trp Met Gln Gln Arg Thr Gly Gln Val Leu Glu
35 40 45
TGG ATT GGA GAG ATT TAT CCT GGA ACT GCT ACT GCT TAT TAC AAT GAA 240 Trp Ile Gly Glu Ile Tyr Pro Gly Ser Gly Ser Ala Tyr Tyr Asn Glu
50 55 60
AAA TTC AAG GGC AAG GCC ATA CTC ACT GCA GAC AAA TCC TCC AGC ACA 288 Lys Phe Lys Gly Lys Ala Ile Leu Thr Ala Asp Lys Ser Ser Ser Thr
65 70 75
GCC TAC ATC GAG TTC AGC AGC CTG ACA TCT GAG GAC TCT GCG CTC TTT 336 Ala Tyr Met Glu Phe Ser Ser Leu Thr Ser Glu Asp Ser Ala Val Phe
80 85 90 TTC TCT GCA AGA CGG GGG GAT GCT TCC CTC GGC TTT GCT CAC TGG GGC 384
Phe Cys Ala Arg Arg Gly Asp Gly Ser Leu Gly Phe Ala His Trp Gly
95 100 105 110
CAA GGG ACT CTC CTC ACT GTC GCT 408 Gin Gly Thr Leu Val Thr Val Ala
115
(2 ) INFORMATION FÜR SEQ ID NO:5:
(i) SEQUENZKENNZEICHEN:
(A) LÄNGE: 381 Basenpaare
(B) TYP: Nukleinsäure
(C) STRÄNGFORM: einzel
(D) TOPOLOGIE: linear
(ix) MERKMAL:
(A) BEZEICHNUNG: kodierende Sequenz
(B) POSITION: 1..381
(ix) MERKMAL:
(A) BEZEICHNUNG: reifes Peptid
(B) POSITION: 61..381
(ix) MERKMAL:
(A) BEZEICHNUNG: Signalpeptid
(B) POSITION: 1. .60
(xi) SEQUENZKENNZEICHEN: SEQ ID NO:5:
ATC ATG GTC CTT GCT CAG TTT CTT GCA TTC TTG TTC CTT TGG TTT CCA 48
Met Met Val Leu Ala Gln Phe Leu Ala Phe Leu Leu Leu Trp Phe Pro
-20 -15 -10 -5
GCT GCA AGA TGT GAC ATC CTG ATG ACC CAA TCT CCΑ TCC ATC TCT 96
Gly Ala Arg Cys Asp Ile Leu Met Thr Gin Ser Pro Ser Ser Met Ser
1 5 10
GTA TCT CTC GGA GAC ACA GTC AGC ATC ACT TCC CAT GCA ACT CAG GGC 144
Val Ser Leu Gly Asp Thr Val Ser Ile Thr Cys His Ala Ser Gln Gly
15 20 25
ATC AGA ACT AAT ATA CTG TGG TTC CAG CAG AAA CCA GGG AAA TCA TTT 192
Ile Arg Ser Asn Ile Val Trp Leu Gln Gln Lys Pro Gly Lys Ser Phe
30 35 40
AGG GGC CTC ATC TAT CAT GGA ACC AAG TTC GAA GAT GGA CTT CCA TCA 240
Arg Gly Leu Ile Tyr His Gly Thr Lys Leu Glu Asp Gly Val Pro Ser
45 50 55 60
AGG TTC ACT GGC ACT GGA TCT GGA GCA GAT TAT TCT CTC ACC ATC AGC 288 Arg Phe Ser Gly Ser Gly Ser Gly Ala Asp Tyr Ser Leu Thr Ile Ser
65 70 75
AGC CTC GAA TCT GAA GAT TTT GCA GAC TAT TAT TCT CTA CAG TAT GCT 336
Ser Leu Glu Ser Glu Asp Phe Ala Asp Tyr Tyr Cys Val Gln Tyr Ala
80 85 90 CAG TTT CCT CGG ACG TTC GCT GGA GGC ACC AÄG CTG GAA ATC AAA 381 Gln Phe Pro Arg Thr Phe Gly Gly Gly Thr Lys Leu Glu Ile Lys
95 100 105
(2 ) INFORMATION FÜR SEQ ID NO: 6:
(i) SEQUENZKENNZEICHEN:
(A) LÄNGE: 396 Basenpaare
(B) TYP: Nukleinsäure
(C) STRÄNGFORM: einzel
(D) TOPOLOGIE: linear
(ix) MERKMAL:
(A) BEZEICHNUNG: kodierende Sequenz
(B) POSITION: 1..396
(ix) MERKMAL:
(A) BEZEICHNUNG: reifes Peptid
(B) POSITION: 58..396
(ix) MERKMAL:
(A) BEZEICHNUNG: Signalpeptid
(B) POSITION: 1. .57
(xi) SEQUENZKENNZEICHEN: SEQ ID NO: 6:
ATG GAC TCC AGG CTC AAT TTA CTT TTC CTT GTC CTT ATT TTA AAA GCT 48
Met Asp Ser Arg Leu Asn Leu Val Phe Leu Val Leu Ile Leu Lys Gly
-19 -15 -10 -5
GTC CAG TCT GAT GTC CAG CTC GTG GAG TCT GGG GGA GGC TTA GIG CAG 96
Val Gln Cys Asp Val Gln Leu Val Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val Gln
1 5 10
CCT GGA GGG TCC CGG AAA CTC TCC TCT GTT GCC TCT GGA TTC ACT TTC 144
Pro Gly Gly Ser Arg Lys Leu Ser Cys Val Ala Ser Gly Phe Thr Phe
15 20 25
ACT ACC TTT GGA ATC CAC TGG GTT CCT CAG GCT CCA GAG AAG GGG CTC 192
Ser Thr Phe Gly Met His Trp Val Arg Gln Ala Pro Glu Lys Gly Leu
30 35 40 45
GAG TGG GTC GCA TAC ATT ACT ACT GGC ACT GCT ACC ATC TAC TAT GCA 240
Glu Trp Val Ala Tyr Ile Ser Ser Gly Ser Gly Thr Ile Tyr Tyr Ala
50 55 60
GAC ACA GTG AAG GGC CGA TTC ACC ATC TCC AGA GAC AAT CCC AAG AAT 288
Asp Thr Val Lys Gly Arg Phe Thr Ile Ser Arg Asp Asn Pro Lys Asn
65 70 75
ACC CTC TTC CTC CAA ATC ACC ACT CTA AGG TCT GAG GAC ACG GCC ATG 336
Thr Leu Phe Leu Gln Met Thr Ser Leu Arg Ser Glu Asp Thr Ala Met
80 85 90 TAT TAC TCT GCA AGA GAT TGG ATG AAC TGG GGC CAA GGG ACT CTG GTC 384 Tyr Tyr Cys Ala Arg Asp Trp Met Asn Trp Gly Gln Gly Thr Leu Val
95 100 105
ACT GTC TCT GCA 396 Thr Val Ser Ala
110
(2 ) INFORMATION FÜR SEQ ID NO:7 :
(i) SEQUENZKENNZEICHEN:
(A) LÄNGE: 435 Basenpaare
(B) TYP: N ukleinsäure
(C) STRÄNGFORM: einzel
(D) TOPOLOGIE: linear
(ix) MERKMAL:
(A) BEZEICHNUNG: kodierende Sequenz
(B) POSITION: 1..435
(ix) MERKMAL:
(A) BEZEICHNUNG: reifes Peptid
(B) POSITION: 67..435
(ix) MERKMAL:
(A) BEZEICHNUNG: Signalpeptid
(B) POSITION: 1. .66
(xi) SEQUENZKENNZEICHEN: SEQ ID NO: 7:
ATC GAT TTT CAA GTG CAG ATT TTC AGC TTC CTC CTA ATC ACT GCT TCA 48
Met Asp Phe Gln Val Gln Ile Phe Ser Phe Leu Leu Ile Ser Ala Ser
-22 -20 -15 -10
GTC ATA ATG TCC AGA GGC AAA ATT GTT CTC TCC CAG TCT CCA GCA ATC 96
Val Ile Met Ser Arg Gly Lys Ile Val Leu Ser Gln Ser Pro Ala Ile
-5 1 5 10
CTC TCT GCA TCT CCA GGG GAG AAG GTC ACA ATC ACT TCC AGG GCC AGC 144
Leu Ser Ala Ser Pro Gly Glu Lys Val Thr Met Thr Cys Arg Ala Ser
15 20 25
TCA ACT ATA ACT TAC ATC CAC TGG TAC CAG CAG AAG CCA GGA TCC TCC 192
Ser Ser Ile Ser Tyr Met His Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Ser Ser
30 35 40
CCC AAA CCC TOG ATT CAA GCC ACA TCC AAC CTG GCT TTT GGA GTC CCT 240
Pro Lys Pro Trp Ile Gln Ala Thr Ser Asn Leu Ala Phe Gly Val Pro
45 50 55
TCT CGC TTC ACT GGC ACT GGG TCT GGG ACC TCT TAC TCT CTC ACA ATC 288
Ser Arg Phe Ser Gly Ser Gly Ser Gly Thr Ser Tyr Ser Leu Thr Ile
60 65 70
AGC AGA GTC GAG GCT GAA GAT GCT GCC ACT TAT TAA TCC CAG CAG TGG 336
Ser Arg Val Glu Ala Glu Asp Ala Ala Thr Tyr Tyr Cys Gln Gln Trp
75 80 85 90 ACT ACT AAC CCA TTC ACG TTC GGC TCG GGG ACA AAG TTC GAA ATG AAA 384 Ser Ser Asn Pro Phe Thr Phe Gly Ser Gly Thr Lys Leu Glu Met Lys
95 100 105
CGG GCT GAT GCT GCA CCA ACT CTA ICC ATC ITC CCA CCA TCC ACT GAG 432 Arg Ala Asp Ala Ala Pro Thr Val Ser Ile Phe Pro Pro Ser Ser Glu
110 115 120
CAG 435 Gln
(2) INFORMATION FÜR SEQ ID NO:8:
(i) SEQUENZKENNZEICHEN:
(A) LÄNGE: 549 Basenpaare
(B) TYP: Nukleinsäure
(C) STRÄNGFORM: einzel
(D) TOPOLOGIE: linear
(ix) MERKMAL:
(A) BEZEICHNUNG: kodierende Sequenz
(B) POSITTON: 1..549
(ix) MERKMAL:
(A) BEZEICHNUNG: reifes Peptid
(B) POSITION: 58..549
(ix) MERKMAL:
(A) ΕEZEICHNUNG: Signalpeptid
(B) POSITION: 1. .57
(xi) SEQUENZBESCHREIBUNG: SEQ ID NO:8:
ATC GCT GTG CTG GGG CTC CTT CTC TGC CTC GTC ACT TTC CCA AGC TCT 48 Met Ala Val Leu Gly Leu Leu Leu Cys Leu Val Thr Phe Pro Ser Cys
-19 -15 -10 -5
GTC CCG TCC CAG GTG CAG CTC AAG GAG TCA GGG CCT GGC CTC GTG GCG 96
Val Pro Ser Gln Val Gin Leu Lys Glu Ser Gly Pro Gly Leu Val Ala
1 5 10
CCC TCA CAG AGC CTC TCC ATC ACA TGC ACC GTC TCA GGG TTC TCA TTA 144
Pro Ser Gln Ser Leu Ser Ile Thr Cys Thr Val Ser Gly Phe Ser Leu
15 20 25
ACT ACC TAT ACT CTA TAC T GG CTT CGC CAG CCT CCA GGA AAG GCT CTC 192
Ser Thr Tyr Ser Val Tyr Trp Val Arg Gln Pro Pro Gly Lys Gly Leu
30 35 40 45
GAG TGG CTC GGA GTG ATA TCG ACT GAT GGA AGC ACA ACC TAT AAT TCA 240
Glu Trp Leu Gly Val Ile Trp Ser Asp Gly Ser Thr Thr Tyr Asn Ser
50 55 60
ACT CTC AAA TCC AGA CTG ACC ATC AGC AAG GAC AAC TCC AAG ACT CAA 288
Thr Leu Lys Ser Arg Leu Thr Ile Ser Lys Asp Asn Ser Lys Ser Gln
65 70 75
CTT TTC TTA AAA GIG AAC ACT CTC CAA ACT GAT GAC ACA GCC ATG TAC 336
Val Phe Leu Lys Val Asn Ser Leu Gln Thr Asp Asp Thr Ala Met Tyr
80 85 90 TAC TCT GCC AGA ACC TAT GCT TAT GAC GGG TCC TGG CTT GCT TAC TGG 384 Tyr Cys Ala Arg Thr Tyr Gly Tyr Asp Gly Ser Trp Leu Ala Tyr Trp
95 100 105
GGC CAA GGG ACT CTC GTC ACT CTC TCT GCA GCC AAA ACA ACA CCC CCA 432 Gly Gln Gly Thr Leu Val Thr Val Ser Ala Ala Lys Thr Thr Pro Pro
110 115 120 125
TCA GTC TAT CCA CTG GCC CCT GGG TCT GGA GAT ACA ACT GCT TCC TCC 480 Ser Val Tyr Pro Leu Ala Pro Gly Cys Gly Asp Thr Thr Gly Ser Ser
130 135 140
GTG ACT CTG GGA TGC CTC GTC AAG GGC TAC TTC CCT GAG TCA GTG ACT 528 Val Thr Leu Gly Cys Leu Val Lys Gly Tyr Phe Pro Glu Ser Val Thr
145 150 155
CTG ACT TGG AAC TCT GGA TCC 549 Val Thr Trp Asn Ser Gly Ser
160
(2) INFORMATION FÜR SEQ ID NO:9:
(i) SEQUENZKENNZEICHEN:
(A) LÄNGE: 322 Basenpaare
(B) TYP: Nukleinsäure
(C) STRANGPORM: einzel
(D) TOPOLOGIE: linear
(ix) MERKMAL:
(A) BEZEICHNUNG: kodierende Sequenz
(B) POSITICN: 1..321
(ix) MERKMAL:
(A) BEZEICHNUNG: reifes Peptid
(B) POSΓΠON: 1..321
(xi) SEQUENZKENNZEICHEN: SEQ ID NO:9:
GAC GTC TTC CTC ACT CAG TCT CCA GCC ATC CTG TCC GTG AGT CCA GGA 48 Asp Val Leu Leu Thr Gln Ser Pro Ala Ile Leu Ser Val Ser Pro Gly
1 5 10 15
GAA AGA GTC ACT TTC TCC TCT AGG GCC ACT CAG AGC ATT GGC ACA AGC 96 Glu Arg Val Ser Phe Ser Cys Arg Ala Ser Gln Ser Ile Gly Thr Ser
20 25 30
ATA CAC TGG TAT CAG CAA AGA ACA AAT GGT CCT CCA AGG CTT CTC ATA 144 Ile His Trp Tyr Gin Gln Arg Thr Asn Gly Pro Pro Arg Leu Leu Ile
35 40 45
AAG TAT GCG TCT GAG TCA ATC TCT GGG ATC CCT TCC AGG TTT ACT GGC 192 Lys Tyr Ala Ser Glu Ser Ile Ser Gly Ile Pro Ser Arg Phe Ser Gly
50 55 60
ACT GGA TCA GGG ACA GAT TTT ACT CTT AGC ATC AGC ACT CTG GAG TCT 240 Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Ser Ile Ser Ser Val Glu Ser
65 70 75 80
GAA GAT ATT GCA GAT TAT TAC TCT CAA CAA ACT AAT AGC TGG CCA ACC 288 Glu Asp Ile Ala Asp Tyr Tyr Cys Gln Gln Thr Asn Ser Trp Pro Thr
85 90 95
ACG TTC GGA GGG GGG ACC AAG CTC GAA ATT AAA C 322
Thr Phe Gly Gly Gly Thr Lys Leu Glu Ile Lys
100 105 (2) INFORMATION FÜR SEQ ID NO:10:
(i) SEQUENZKENNZEICHEN:
(A) LÄNGE: 355 Basenpaare
(B) TYP: NukleInsäure
(C) STRANGFORM: einzel
(D) TOPODOGIE: linear
(ix) MERKMAL:
(A) BEZEICHNUNG: kodierende Sequenz
(B) POSITION: 1..354
(ix) MERKMAL:
(A) BEZEICHNUNG: reifes Peptid
(B) POSITION: 1..354
(xi) SEQUENZKENNZEICHEN: SEQ ID NO:10:
GAG GTC CAG CTG CAA CAG TTT GGA GCT GAA TTG GTC AAG CCT GGG ACT 48 Glu Val Gln Leu Gln Gln Phe Gly Ala Glu Leu Val Lys Pro Gly Thr
1 5 10 15
TCG CTG AAG ATA TCC TGC AAG GCT TCT GGC TAC ATT TTC ACT GAC TAC 96 Ser Val Lys Ile Ser Cys Lys Ala Ser Gly Tyr Ile Phe Thr Asp Tyr
20 25 30
AAC ATC GAC TGG GTC AAG CAG AGC CAT GGA AAG AGC CTT GAG TGG ATT 144 Asn Met Asp Trp Val Lys Gln Ser His Gly Lys Ser Leu Glu Trp Ile
35 40 45
GGA GAT ATT GAT CCT AAC TTT GAT ACT TCC ACT TAC AAC CAG AAG TTC 192 Gly Asp Ile Asp Pro Asn Phe Asp Ser Ser Ser Tyr Asn Gln Lys Phe
50 55 60
AAG GGA AAG GCC ACA TTG ACT CTA GAC AAG TCC TCC AAC ACA GCC TAC 240 Lys Gly Lys Ala Thr Leu Thr Val Asp Lys Ser Ser Asn Thr Ala Tyr
65 70 75 80
ATC GAG CTC CGC AGC CTG ACA TCT GAG GAC ACT GCA GTC TAT TAC TCT 288 Met Glu Leu Arg Ser Leu Thr Ser Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys
85 90 95
GCA AGA GGG GGA TTC CCC TAT GCT ATC GAC TAC TCG GCT CAA GGA ACC 336 Ala Arg Gly Gly Phe Pro Tyr Gly Met Asp Tyr Trp Gly Gln Gly Thr
100 105 110
TCA CTC ACC GTC TCC TCA G 355
Ser Val Thr Val Ser Ser
115

Claims

P a t e n t a n s p r ü c h e
1. Synergistisch wirkende Antikörperzusammensetzung zur Verbesserung der Immunsuppression,
d a d u r c h g e k e n n z e i c h n e t , daß sie
(a) mindestens einen für sich alleine bereits stark inhibierenden monoklonalen Anti-CD4-Antikörper und
(b) mindestens einen für sich alleine bereits stark inhibierenden monoklonalen Anti-IL2Rα- oder Anti- IL2Rß-Antikörper enthält,
wobei ein stark inhibierender Antikörper bei einer Konzentration von 10.000 ng/ml die allogen induzierte Lym- phozytenproliferation in Abwesenheit anderer Antikörper zu mindestens 40 % hemmt.
2. Antikörperzusammensetzung nach Anspruch 1,
d a d u r c h g e k e n n z e i c h n e t, daß sie als Antikörper (b) mindestens einen Anti-IL2Rα- Antikörper enthält, wobei das molare Verhältnis der Antikörper (a) und (b) von 1:10 bis 10:1 ist.
3. Antikörperzusammensetzung nach Anspruch 2 ,
d a d u r c h g e k e n n z e i c h n e t , daß das molare Verhältnis der Antikörper (a) und (b) von 1:5 bis 5:1 ist.
4. Antikörperzusammensetzung nach Anspruch 2,
d a d u r c h g e k e n n z e i c h n e t , daß das molare Verhältnis der Antikörper (a) und (b) von 3:10 bis 3:1 ist.
5. Antikörperzusammensetzung nach einem der Ansprüche 1-4, d a d u r c h g e k e n n z e i c h n e t , daß der Antikörper (a) die in SEQ ID NO. 1 und 2 oder die in SEQ ID NO. 3 und 4 dargestellten Aminosäuresequenzen als variable Regionen der leichten bzw. schweren Kette aufweist.
6. Antikörperzusammensetzung nach einem der Ansprüche 1-5, d a d u r c h g e k e n n z e i c h n e t , daß der Antikörper (b) die in SEQ ID NO. 5 und 6 dargestellten Aminosäuresequenzen als variable Regionen der leichten bzw. schweren Kette aufweist.
7. Antikörperzusammensetzung nach Anspruch 1,
d a d u r c h g e k e n n z e i c h n e t, daß sie als Antikörper (b) mindestens einen Anti-IL2Rß- Antikörper enthält, wobei das molare Verhältnis der Antikörper (a) und (b) von 1:1000 bis 10:1 ist.
8. Antikörperzusammensetzung nach Anspruch 7,
d a d u r c h g e k e n n z e i c h n e t, daß der Antikörper (b) die in SEQ. ID NO. 9 und 10 dargestellten Aminosäuresequenzen als variable Regionen der leichten bzw. schweren Kette aufweist.
9. Antikörperzusammensetzung nach einem der vorhergehenden Ansprüche,
d a d u r c h g e k e n n z e i c h n e t , daß die Antikörper (a) und (b) murine, humane, chimärisierte oder humanisierte Antikörper oder Antikörperfragmente sind.
10. Arzneimittel, das aus Komponenten (1) und (2) besteht, wobei die beiden Komponenten gemeinsam zu verabreichen sind, aber getrennt formuliert sein können,
d a d u r c h g e k e n n z e i c h n e t , daß die Komponente (1) einen für sich alleine stark inhibierenden monoklonalen Anti-CD4-Antikörper (a) als Wirkstoff und die Komponente (2) einen für sich alleine stark inhibierenden monoklonalen Anti-IL2Rα- oder Anti- IL2Rß-Antikörper (b) als Wirkstoff enthält, gegebenenfalls mit üblichen pharmazeutischen Hilfs-, Verdün- nungs-, Träger- und Füllstoffen.
11. Arzneimittel nach Anspruch 10,
d a d u r c h g e k e n n z e i c h n e t, daß die Komponente (2) einen für sich alleine stark inhibierenden monoklonalen Anti-IL2Rα-Antikörper (b) als Wirkstoff enthält, wobei das molare Verhältnis der beiden Antikörper der Komponenten (1) und (2) im Arzneimittel von 1:10 bis 10:1 ist.
12. Arzneimittel nach Anspruch 11,
d a d u r c h g e k e n n z e i c h n e t , daß das molare Verhältnis der beiden Antikörper von 1:5 bis 5:1 ist.
13. Arzneimittel nach Anspruch 11,
d a d u r c h g e k e n n z e i c h n e t , daß das molare Verhältnis der beiden Antikörper von 3:10 bis 3:1 ist.
14. Arzneimittel nach einem der Ansprüche 10 bis 13,
d a d u r c h g e k e n n z e i c h n e t , daß der Antikörper (a) die in SEQ ID NO. 1 und 2 oder die in SEQ ID NO. 3 und 4 dargestellten Aminosäuresequenzen als variable Regionen der leichten bzw. schweren Kette aufweist.
15. Arzneimittel nach einem der Ansprüche 10 bis 14,
d a d u r c h g e k e n n z e i c h n e t , daß der Antikörper (b) die in SEQ ID NO. 5 und 6 dargestellten Aminosäuresequenzen als variable Regionen der leichten bzw. schweren Kette aufweist.
16. Arzneimittel nach Anspruch 10,
d a d u r c h g e k e n n z e i c h n e t, daß die Komponente (2) einen für sich alleine stark inhibierenden monoklonalen Anti-IL2Rß-Antikörper (b) als Wirkstoff enthält, wobei das molare Verhältnis der beiden Antikörper der Komponenten (1) und (2) im Arzneimittel von 1:1000 bis 10:1 ist.
17. Arzneimittel nach Anspruch 16,
d a d u r c h g e k e n n z e i c h n e t, daß der Antikörper (b) die in Seq. ID No. 9 und 10 dargestellten Aminosäuresequenzen als variable Regionen der leichten bzw. schweren Kette aufweist.
18. Arzneimittel nach einem der Ansprüche 10 bis 17,
d a d u r c h g e k e n n z e i c h n e t , daß die Antikörper (a) und (b) murine, humane, chimärisierte oder humanisierte Antikörper oder Antikörperfragmente sind.
19. Verwendung einer Antikörperzusammensetzung nach einem der Ansprüche 1 bis 9 oder eines Arzneimittels nach einem der Ansprüche 10 bis 18 bei einer immunsuppressi- ven Therapie, insbesondere bei der Therapie nach Organoder Gewebetransplantationen.
20. Verfahren zur Herstellung eines Arzneimittels für eine immunsuppressive Therapie, insbesondere für die Therapie nach Organ- und Gewebetransplantationen, worin man ein aus Komponenten (1) und (2) bestehendes Arzneimittel bereitstellt, dessen beide Komponenten gemeinsam zu verabreichen sind, aber getrennt formuliert werden können, d a d u r c h g e k e n n z e i c h n e t , daß die Komponente (1) einen stark inhibierenden monoklonalen Anti-CD4-Antikörper (a) als Wirkstoff und die Komponente ( 2 ) einen stark inhibierenden monoklonalen Anti-IL2Rα- oder Anti-IL2Rß-Antikörper (b) als Wirkstoff enthält, gegebenenfalls mit üblichen pharmazeutischen Hilfs-, Verdünnungs-, Träger- und Füllstoffen.
21. Verfahren nach Anspruch 20,
d a d u r c h g e k e n n z e i c h n e t, daß man als Antikörper (b) einen Anti-IL2Rα-Antikörper verwendet, wobei das molare Verhältnis der beiden Antikörper der Komponenten (1) und (2) von 1:10 bis 10:1 ist.
22. Verfahren nach Anspruch 20,
d a d u r c h g e k e n n z e i c h n e t, daß man als Antikörper (b) einen Anti-IL2Rß-Antikörper verwendet, wobei das molare Verhältnis der beiden Antikörper der Komponenten (1) und (2) von 1:1000 bis 10:1 ist.
23. Verfahren zur immunsuppressiven Therapie, insbesondere für die Therapie nach Organ- und Gewebstransplantationen,
d a d u r c h g e k e n n z e i c h n e t , daß man ein Arzneimittel nach einem der Ansprüche 10 bis 18 verabreicht.
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Families Citing this family (1)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
KR20050082389A (ko) * 2004-02-18 2005-08-23 메덱스젠 주식회사 직렬 연쇄체를 갖는 면역접합체를 포함하는 장기이식합병증 치료용 약제학적 조성물

Citations (4)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
EP0235805A2 (de) * 1986-03-04 1987-09-09 The Royal Free Hospital School Of Medicine Immunsuppression
EP0296082A1 (de) * 1987-06-12 1988-12-21 Immunotech S.A. Aktiver Wirkstoff und diesen enthaltendes Arzneimittel zur Verhinderung oder Bekämpfung der Abstossung von Organtransplantaten
WO1992004051A1 (de) * 1990-09-12 1992-03-19 Boehringer Mannheim Gmbh Monoklonale antikörper gegen den interleukin 2-rezeptor
EP0240344B1 (de) * 1986-04-02 1993-11-18 The Wellcome Foundation Limited Monoklonale Antikörper und deren Verwendung

Patent Citations (4)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
EP0235805A2 (de) * 1986-03-04 1987-09-09 The Royal Free Hospital School Of Medicine Immunsuppression
EP0240344B1 (de) * 1986-04-02 1993-11-18 The Wellcome Foundation Limited Monoklonale Antikörper und deren Verwendung
EP0296082A1 (de) * 1987-06-12 1988-12-21 Immunotech S.A. Aktiver Wirkstoff und diesen enthaltendes Arzneimittel zur Verhinderung oder Bekämpfung der Abstossung von Organtransplantaten
WO1992004051A1 (de) * 1990-09-12 1992-03-19 Boehringer Mannheim Gmbh Monoklonale antikörper gegen den interleukin 2-rezeptor

Non-Patent Citations (1)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Title
SCANDINAVIAN JOURNAL OF IMMUNOLOGY Bd. 34, Nr. 5, November 1991, OXFORD Seiten 627 - 633 D. A. STEINBRÜCHEL ET AL. 'MONOCLONAL ANTIBODY TREATMENT (ANTI-CD4 AND ANTI-INTERLEUKIN-2 RECEPTOR) COMBINED WITH CYCLOSPORIN A' DAS GANZE ARTIKEL *

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DE4143214A1 (de) 1993-01-28
IE922028A1 (en) 1993-01-27
AU2378892A (en) 1993-02-23
IL102562A0 (en) 1993-01-14

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