WO1992019648A1

WO1992019648A1 - Substance wf11243

Info

Publication number: WO1992019648A1
Application number: PCT/JP1992/000586
Authority: WO
Inventors: Akihiko Fujie; Shigehiro Takase; Michio Yamashita; Tomoko Nakanishi; Seiji Hashimoto; Masakuni Okuhara
Original assignee: Fujisawa Pharmaceutical Co., Ltd.
Priority date: 1991-05-09
Filing date: 1992-05-08
Publication date: 1992-11-12
Also published as: EP0584360A4; DE69217936T2; IL101717A0; HU9303165D0; IL101717A; DE69217936D1; AU1740492A; EP0584360B1; ATE149521T1; CA2102705A1; AU652639B2; MX9202145A; EP0584360A1; US5547934A; TW199162B; US5446022A; HUT69150A

Description

W F 1 1 2 4 3物質産業上の利用分野

本発明は、 W F 1 1 24 3物質またはその塩、それらの製法及び用途に関するものである。 W F 1 1 243物質は、微生物、特にかびの培養物から分離採取された従来未知の新規物質であリ、すぐれた抗真菌性及び抗原虫性を示し、真菌

細 1 及び原虫に由来する'各種害作用の軽滅ないし防止、各種疾病の予防、治療剤等各種医薬として有用であって、カリニ肺炎の予防、治療にも非常に有用である。

したがって本発明は、医薬品、化粧品、飲食品等各種技術分野において重要な役割を果すものである。

従来の技術 - 従来より、微生物の培養物からあるいは化学合成により各種の抗真菌剤が製造されている。これらの抗真菌剤としては、すぐれたものもいくつかは認められるが、薬効のほかに酎性菌の出現、安全性の問題等各種の問題点があり、これをすベて完全に解消して満足しうるものとした抗真菌剤はないのが状であな。

また最近になって原虫による疾患、特にニューモシスティスカリニ ( Pneumocyst is carinii ) によってひき起 e れる各種疾患、例えばカリニ肺炎がクローズアップされ、その予防、治療法の開発も当業界において強く求められている。発明が解決すべき課題

本発明は、上記した技術の現状に鑑みてなされたものであつて、カリニ肺炎その他の疾患をひき起す病原性微小体であるニューモシステイスカリニその他原虫類の生育阻害、殺滅に有効な新しい抗原虫剤のほか、更に、各種の真菌の生育阻害、殺滅にも有効な従来未知のすぐれた新しい抗真菌剤を開発する目的でなされたものである。

餵題を解決するための手段

上記目的を達成するために各方面から検討した結果、本発明者らは、安全性の面から天然物に着目し、微生物の発酵生産物に注目するに至り、各種微生物を検索した結果、京都府と綾部市で採取した落葉サンプルから新たに分離したかぴ ' No . 11 243株が培養液中に目的物質を蓄積することを発見した。そして更にこの物質についてその理化学的性質を詳細に研究したところ、従来未知の新規物質であることを確認し、この物質を新たに WF 11 243物質と命名し、また、 WF 11 243物質の塩酸塩を FR901469物質と命名し、そして更に研究の結果、その工業的製法を確立し、本発明を完成するに至った。

図面の簡単な説明

図 1 は FR901469物質の^{1 3} C核磁気共鳴スぺクトルを示す図面である。

図 2は FR901469物質の¹ H核磁気共鳴スぺクトルを示す図面である。

本発明に係る WF 1 1 243物質は、その塩酸塩 FR 901469物質が次に示される理化学的性質を有する新規物質である。 901469物質の理化学的性質（1)

(1) 物質の色及び状態

白色粉末

(2) 融点

182〜187。C

(3) 比旋光度

ί Υ_ϋ ³ +29° (c=1.5，メタノール）

(4) 分子式.

(5) 元素分析

計算値（％) (C₇₁H₁₁₆N₁₄0_Z3- HC1 · 8H₂0に対し）：

C, 49.74； H, 7.82； N, 11.44

実測値（％) ： C, 49.65； H, 7.72； N, 11.40

(6) 溶剤に対する溶解性

易溶：メタノール、水

難溶：アセトン

不溶： II -へキサン

(7) 呈色反応

陽性：沃素蒸気反応、硫酸セリウム反応、ニンヒドリン反応、陰性：モーリッシュ反応、エールリツヒ反応 (8) 薄層クロマトグラフィー

― 固定相展開溶媒 R f値シリカゲル n-ブタノール：酢酸：水 0.42 60 F_ZS4 (4 ： 1 ： 2) (E.Merck社製）

RP-18 45%ァセトニトリル水 0.18 ¥F_2S4S (0.5%N1 H₂P0₄含有）

(E.Merck社製） (9) 赤吸収スぺク卜ル

(FT-IR(KBr)) 有意なピークは次のとおりである

KBr ： 3400， 2920， 1730， 1660, 1650， 1635， 1540， 1520, max

1460, 1250， 1090cm-¹

(10) 髙速液体クロマトグラフィー

カラム： YMC' Pack ODS-A (AM-303,S-5, 120A,

4.6mmID 250mm； YHC CO., Ltd)

検出： 210nm

展開溶媒： 0.5%NH₄H₂P0₄含有 45%ァセトニトリル水

流速： 1 mfiZmin

保持時間（RT)： 10.9min

(11) ¹³C核磁気共鳴スペクトル（100MHz, CD₃0D) そのチャートを図 1に示す。

δ c ： 176.1(s)， 174.6(s)， 174.0(s), 173.8(s), 173.4(s), 172.8(s), 172.6(3)， 172.5(s), 172.4(s), 172. l(s), 171.9(s), 171.8(s)， 171.7(s), 171.2(s), 156.1(s)， (,, 1.39S,3H, d J6HZ.13H. d J6HZ5==

(,.( 18,)91H m.(,) 171H s.716.21450H m〜

(,. 230(,1)H m.( 2.5,)21203.H m 2.03192H m3〜〜

(,,. 245)1(H d,d J1,4 an.d 9HZ 2317H brH d J13Z==

s,,. 256 dd J13 a 11ndHZ=

(,(..,, 3002933H. m 2801Hd d J1 an13d 1HZ〜=

(,,S,., 3701.H dd Jll an 4HZd 35H br dJZllH==

(,(,) 3.9.81H m 3.9383 s27H〜

έ

1·35(3Η, d， J=6.5Hz), 1.30(3H, d， J=6Hz) ,

1.28(22H, m)， 1.13(3H, d， J=6Hz) , 0.89(3H, t, J=7Hz)

0.8K3H, d, J=6.5Hz), 0.80(3H, d， J=6.5Hz)。

(13) 分子式及ぴ FAB-MS

C₇₁H_11BN_a40₂₃ -HCl

FAB-MS m/z 1533(M+H)+;

HRFAB-HS m/z 1555.8240

(C₇₁H_11BPi₁₄0₂₃Naの計算値 1555.8235)

(14) アミノ酸分析

Thr(4), Gly(l), Ala(l), Val(l), Tyr(l), Orn(l)

(6N HC1, 110°C, 20時間加水分解）。

(15) 紫外線吸収スぺク卜ル

有意なピークは次のとおりである。

H₂0

λ ： 225 (sh), 275(1200), 280 (sh) nm

max

0.01N HC1

% ： 225 (sh), 275, 280 (sh) nm

max

0.01N NaOH

λ 240, 292 nm

max また、本発明に係る WF11243物質は、上記した理化学的性質からみてポリペプチドの性状を示しているが、その構造決定を試みた結果それに成功し、次の式〔 I〕で示される推定化学構造式を得た。

本発明.に係る WF11243物質は、例えば、本発明者らが京都府綾部市で採取した落葉サンプルから新たに分離,した微生物 Να 11243株によって生産されるほ力、、ペプチド合成等化学合成法によっても製造することができる。

この Na 11243株は、各種培地上で抑制的に拡がり、淡ォレンジ色の集落を形成する。以下に Na 11243株の菌学的性質を示す。

各種培地上での培養性状を次の表 1 に示した。麦芽抽出寒天培地の中心に接種し、 25 °Cで 14日間培養した時の生育はきわめて抑制的で、直径 0·5〜： 1.0 c mに拡がった。集落の表面は隆起し、淡オレンジ色であった。また、無色の粘性の浸出液を生産した。集落裏面は灰色味オレンジ色であった。アナモルフを生じた。同様の培養をポテト ' デキストロース寒天培地上で行った時は、生育はきわめて抑制的であった (0.5 〜： l,0cm)。集落表面は隆起し、放射状の溝を生じ、淡オレンジ色であった。また、無色の粘性の浸出液を生産した。集落裏面は淡黄色であった。アナモルフを生じた。

Να 11243株の培養上の特徴 (1) 培地培養上の特徵麦芽抽出寒天生育：きわめて抑制的、直径 0.5〜： LOcm

表面：円形、隆起、分生子構造を形成した、無色の粘性の浸出液を生じた、淡オレンジ色生裏 (5A3)

育面

裏面：灰色味才レンジ色 (5B4)

ポテ卜 ·デキストロース寒天生育：きわめて抑制的、直経 0.5〜1.0cm

. 表面：円形、隆起、放射状の溝を生じた、分生子構造を形成した、無色の粘性の浸出液を生じた、淡オレンジ色 (5A3)

裏面：淡黄色 (4A3)

ッァペック · ドックス寒天生育：きわめて抑制的、直径 0.1〜0.5cm

表面：円形、平坦で薄く、分生子構造を形成した、オレンジ色味白色（5 A 2)

黄色味灰色 ( B2)

サブロー寒天きわめて抑制的、直径 0.5〜： 1.0cm

円形、隆起、放射状の溝を生じた、分生子構造は観察されなかった、無色の粘性の浸出液を生じた、灰色味オレンジ色 (5B 3) 茶色 (6E7)

オートミ一ル寒天生育きわめて抑制的、直径 0.5〜； I· 0cm

円形から不規則、放射状の溝を生じた、分生子構造を形成した、オレンジ色味白色 (5 A 2) 、コロニー中央は黒色

裏面：淡黄色（4 A 3) (続)

Να 11243株の培養上の特徴 _(2)

Y P S s寒天生育：きわめて抑制的、直径 0.5〜； 1.0cm

表面：円形、隆起、放射状の溝を生じた、分生子構造は観察されなかった、無色の粘性の浸出液を生じた、明オレンジ色 (5A4) 淡黄色（4 A 3)

コーンミール寒天きわめて抑制的、直径 0.5〜： 1.0cm

円形から不規則、放射状の溝を生じた、分生表裏

育面面生子構造を形成した、無色の粘性の浸出液を生じた、オレンジ色味白色（5 A 2) 、コロニー中央は喑茶色 (6 F 8)

裏面暗灰色 (1 F1)

MY 20寒天生育：きわめて抑制的、直径 0.1〜0.5cm

表面：不規則、隆起、しわ状、分生子構造を形成した、無色の粘性の浸出液を生じた、明ォレンジ色（5A4)

裏面：明オレンジ色（5A4) 以上の特徴は、 25°Cで、 14日間培養後に観察した、色調の記載は、メチュ —ン 'ノヽンドブック ·ォブ'カラー (Methuen Handbook of Colour) をもとにして行った（参考文献 (1)) 。

参考文献

(1) エイ ·コーナラップ'アンド ·ジヱイ ·エッチ ·ウォンスシャ一荖、メチュ —ン 'ハンドブック 'ォブ 'カラー、 3版、メチューン社、ロンドン、 1983 年 (A.Kornerup and J . H . Wanscher： Methuen Handbook of Colour, Third ed., Methuen, London, 1983) lo

NCL 11243株は？〜 29 で生育可能で、最適生育温度は 22〜 26 である（ポテト，デキス卜ロース寒天培地上で測定した）。これらの性質を総合的に検討した結果、この NOL 11243株を、かびに属するものと同定して Να 11243株と命名し、これを通産省工業技術院微生物工業技術研究所に寄託した（受託番号 FERH ΒΡ-3373 寄託日： 1991年 4月 23日）。

WF11243物質の生産は、単に説明を目的として挙げただけの本明細書記載の特定の微生物の使用に限定されるものではないことを理解すべきである。この発明は、記載の微生物から： X線照射、紫外線照射、 Ν-メチル -Ν'-ニトロ- Ν-ニトロソグァ二ジン、 2-アミノプリン等の変異処理によリ取得できる人工変異株並びに自然変異株を含めて WF11243物質を生産しうる全ての変異株の使用をも包含するものである。

本発明に係る WF11243物質は、かびに属する該物質生産菌 (例えば iid 11243株）を资化しうる炭素及び窒素源を含む栄養培地中に接種し、好気条件下で培養することにより（例えば、振とう培養、通気携拌培養等）、生産せしめることができる。

炭素源としては、グルコース、シユークロース、綴粉、変性^粉、プラクトース、グリセリンその他の炭水化物を使用するのが好ましい。

窒素源としては、オートミール、酵素エキス、ペプトン、グルテンミール、綿実粉、綿実油粕、大豆粉、コーンスティ一プリカ一、乾燥酵母、小麦胚芽、落花生粉、チキン骨肉ミ一ル等を使用するのが好ましいが、アンモニゥム塩（例えば、硝酸アンモニゥム、硫酸アンモニゥム、リン酸アンモニゥム等）、尿素、アミノ酸等の無機及び有機の窒素化合物も有利に使用することができる。

これらの炭素源及び窒素源は、併用するのが有利であるが、鈍粋なものを必らずしも使用する必要はない。不純なものには、生長因子や微量要素が含まれている場合などもあり、有利な場合があるからである。

必要ある場合には、例えば次のような無機塩類を培地に添加してもよい：炭酸ナトリウム、炭酸カリウム、リン酸ナトリウム、リン酸カリウム、塩化ナトリウム、塩化カリウム、ヨウ化ナトリウム、ヨウ化カリウム、マグネシウム塩、銅塩、コバルト塩等。

特に、培地が強く発泡するのであれば、必要あるときに、液体パラフィン、動物油、植物油、鉱物油、シリコン等を添加してもよい。

目的物質を大量に工業生産するには、他の発酵生産物の場合と同様に、通気攪拌培養するのが好ましい。少量生産の場合は、フラスコを用いる振とう培養が好適である。

また、培養を大きなタンクで行う場合、 WF 1 1 243物質の生産工程において菌の生育遅延を防止するため、はじめに比較的少量の培地に生産菌を接種培養した後、次に培養物を大きな生産タンクに移してそこで生産培養するのが好ましい。この場合、前培養に使用する培地及び生産培養に使用する培地の組成は、両者ともに同一であってもよいし必要あれば両者を変えてもよい。

培養は通気攪拌条件で行うのが好ましく、例えばプロペラやその他機械による攪拌、フアーメンターの回転または振とう、ポンプ処理、空気の吹込み等既知の方法が適宜使用される。通気用の空気は滅菌したものを用いる。

培養温度は、本 WF11243物質生産菌が本物賓を生産する範囲内で適宜変更しうるが、通常は 1 〜40°C、好ましくは 14〜 36°Cで培養するのがよい。培養時間は、培養条件や培養量によっても異なるが通常は約 1 日〜 1週間である。

発酵終了後、培養物から目的とする WF11243物質を回収する。すなわち、菌体は、直接水及び Z又は有機溶媒による抽出、あるいは、これを機械的に又は超音波等既知の手段を用いて破壊した後、水及び Z又は有機溶媒で抽出した後、常法にしたがって回収、精製する。培養液の場合は、直接、常法にしたがって回収、精製すればよい。

回収、精製方法としては、例えば、水、有機溶媒、これらの混合溶媒による溶媒抽出；クロマトグラフィー；単一溶媒又は混合溶媒からの再結晶等常法が適宜単独であるいは組合わせて使用できる。

WF11243物質の回収、精製は上記のように既知の方法を適宜利用して行うが、例えば次のようにしてもよい。培養物をアセトン水で抽出し、中性で中性吸着樹脂〔例えば HP-20 (三菱化成社製）〕に吸着させ、酸性化アセトン水で溶出し、满縮し、さらに齚酸ェチルで洗滌した後、ブタノールで抽出し、必要に応じて中性吸着樹脂による脱着を繰り返し精製する。 WF11243物質は雨性物質であり、塩基または酸と反応して塲を形成することができる。 WF 11243物質は遊離の状態 (WF 1 1 243物質自体）でも回収 13、精製することができるし、ま ' たそれらの塩としても回収、精製できる。また、これらは常法によリ相互に変換することもできる。

W F 1 1 24 3物質の塩基との塩としてはナトリウム塩、カリゥム塩などのアルカリ金属塩、カルシウム塩、マグネシウム塩等のアルカリ土金属塩、アンモニゥム塩などの無機塩基との塩、メチルァミン塩、ェチルァミン塩、プロピルアミン塩、イソプロピルアミン塩、ブチルァミン塩、 t -ブチルァミン塩、ジメチルァミン塩、ジェチルァミン塩、トリメチルアミン塩、卜リエチルァミン塩、ピリジン塩、ピコリン塩、ジシクロへキシレアミン塩、 , Ν ' -ジベンジノレエチレンジァミン塩などの有機アミン塩、アルギニン塩、ァスパラギン塩、グルタミン酸塩などのアミノ酸塩など有機塩基との塩などが挙げられ、酸との塩としては、塩酸塩、臭化水素酸塩、ヨウ化水素酸塩、硫酸塩、硝酸塩、リン酸塩などの無機酸付加塩、酢酸塩、トリフルォロ酢酸塩、マレイン酸塩、酒石酸塩、メタンスルホン酸塩、ベンゼンスルホン酸塩、ギ酸塩、トルェンスルホン酸塩などの有機酸付加塩、ァスパラギン酸塩、グルタミン酸塩などのアミノ酸付加塩などのような酸付加塩が挙げられる。

この発明の製剤は、有効成分として WF 1 1 243物質及ぴノ又はその塩類を直腸投与、経肺（経轟ないしバッカル吸入）、点轟、点眼、外用（局所）、経口または非経口（皮下、静脈内および筋肉内を含む ) などの投与または吸入に適した有機あるいは無機担体または賦形剤と共に含有する固形、半固形あるいは液状の製剤の形で用いる I午ことができる。有効成分は例えば、錠剤、ペレツ卜剤、卜ローチ、カプセル剤、坐剤、クリーム剤、軟齊剤、エアゾール剤、吸入用粉末薬、液剤、乳剤、滕濁剤、その他使用に適した剤形に用いられる慣用の無毒性の医薬として許容される担体と共に配合することができる。さらに、必要に応じて補助剤、安定化剤、粘稠化剤、着色剤および香料を使用することができる。 WF11243物質及び Z又はその塩類は疾患の経過または状態に所望の治療効果を生じるに足りる量を製剤に含有させればよい。

この製剤をヒトに適用する場合、静脈内、筋肉内または経口投与によるのが好ましい。有効成分の治療有効量は治療される各患者の年令および条件によって変動するが、一般に有効成分を、静脈内投与の場合にはヒトの体重 l kg当リー日量 0. 01〜： I 00mg、筋肉内投与の場合にはヒト体重 1 kg当り 1 日量 0. 1〜100mg、経口投与の場合にはヒ卜体重 l kg当り 1 日量 0. 5〜： L OOmgで感染症の治療または予防のために投与することができる。

本発明に係る WF11243物質及び/又はその塩は、各種の真菌類感染症の予防及び Z又は治療に広く有効であるが、各種の原虫による疾患の予防及び/又は治療にも広く有効であって、カリニ肺炎その他ニューモシステイスカリニ感染症の予防及び又は治療にも特に有用であるが、ニューモシスティスカリニ感染の治療または予防に当たっては、特に以下の点に留意するべきである。

p 入による投与に対して本発明の化合物は、圧力容器または噴霧器からエー口ゾル噴霧の形態で供給することが便利である。化合物はまた処方することができる粉末として供耠することもでき、この粉末組成物は通気粉末吸入装置によって吸入させることができる。吸入に好ましい供給系は計量された服用量吸入エーロゾルであり、これは適当な推進薬例えばフル才ロカーボンまたはヒドロカーボン中化合物の懸濁液または溶液として処方することができる。

肺及び気管支に直接治療することがが望ましいため、エー口ゾル投与が好ましい投与方法である。通気法もまた特に感染が耳や他の体腔に広がってしまう場合に望ましい方法である。

また、非経口投与は静脈内滴注投与を用いて使用することもできる。

以下、本発明を実施例について更に詳しく説明する。

実施例 1

( (1) WF11243物質の発酵生産）

シユークロース 4 %、綿実油粕 2 %、乾燥酵母 1 %、ぺプ卜ン 1 %、 KH₂P0₄ 0.2% , CaC0₃ 0.2 % . ツイーン（Tween) 80 0.1 %からなる前培養培地を 500 容エルレンマイヤーフラスコに 160ηιβずつ分注し、 121 °Cで 3 0分間滅菌した。この各々の培地に Νοι 11243株（FERM BP- 3373)の斜面培養物を 1 白金耳ずつ接種し、 25 °Cで 4 日間搌とう培養した。

次に、変性澱粉 2 %、グルコース 0 · 5 %、綿実油粕 1 %、ダルテンミール 1 %、 KH₂P0₄ 2 % , Na_zHP0₄ · 12H₂0 1.5% , ZnS0₄-7H₂0 0.001 % , アデ力ノール LG-109 (旭電化社製） /ら

0.025 % . シリコン KM70 (信越化学工業社製） 0.025 %からなる本培養培地を調製しておき、この本培養地 20 β を 30 β容ジヤーファーメンターに注入した。これを， 121。Cで 30分間滅菌した後、先に得た前培養物を 2 %接種し、 25·Όで 4 日間培養した。提拌は 200rpm、通気量は 20 £ 分で行った。培養物中の WF11243物貧の量は HPLC〔カラム： Hibar LiChrosper 100RP 18(Merck社製）；溶媒： 0 · 5 % NH₄ H₂ P0₄を含む 50 %ァセ卜二卜リル水；検出： UV 210nm；流速： 1 πι£ 分〕で定量した。検定サンルは、培養液に等量のアセトンを添加し、濾過した後、適量まで瀵縮したものを用いた。

((2) WF11243物質の抽出、精製）

上記の培養方法で得られた培養物 75 β に等量のアセトンを加え時々攪拌しながら室温で、ー晚放置後、ろ過することで培養抽出物を得た。その抽出液に水 65 ώ を加え、その ρΗを 6Ν NaOHで ΡΗ 6·5に修正後、 6·5 β の ΗΡ-20 (三菱化成社製）に付した。 35 β の水、 40%アセトン水 27 £ でカラムを洗浄した後、最終濃度として 0.002Νの HC1を含む 80%ァセトン水 48 β で目的物質を溶出した。

なお、精製は、 Candida albicansに対する抗菌力、また、 HPLC 〔カラム： YMC Packed Column AH-303 (S-5, 120A, 0DS) YMC Co. , LTD) ；移動層： 0.5% NH₄H₂P0₄を含む 45%ァセト二トリゾレ水；検出： UV 210nm；流速： 1 m£/min ；リテンションタイム（RT) ： 10.9分〕を指標に行った。

上記で得た溶出液を、減圧下で 1.9 β まで濂縮し、 ΡΗを 6.0 に修正後、 2倍量の酢酸ェチルで洗浄した。次にブタノール 1·9 β で活性成分を抽出し、減庄濂縮後、水 1 β で置換した。その水溶液の ΡΗを 1 N HC1で 3.0に修正後、再度、酢酸ェチル I JK でその水溶液を洗浄、次いで、ブタノール 1 で活性成分を抽出した。その有機溶媒層を 1 %重曹水 1 ώ および ΡΗ 4 の塩酸水 1 β で洗浄した後、その有機溶媒層を滅庄濂縮した。次にその残渣を 50%ァセトニトリル水 3.0 J8 で溶解し、 1.3 £ の HP- 20のカラムに付した。カラムを水 3.5 β、 50% メタノール水 3.5 £、 80%メタノール水 3.5 fi 、メタノール 3.8 で洗浄した後、最終漉度として 0.002Νの HC fi を含む 80%ァセトン水 2·7 β で活性成分を溶出した。次にその溶出液を滅圧濃縮し、その残渣を 20% メタノール水 5 β で溶解後、逆相系担体 (YMC - Gel , 0DS-AH , 120-S50, YMC Co. , し TD製）のカラム (500m£) に付した。カラムは予め 0.5 % NH₄H₂ P0₄を含む 20 % ァセトニトリル水で平衡化し、目的物質を含む溶液をチヤ一ジ後、 0.5 % NH₄H₂P0₄を含む 30 %ァセトニトリル水 1 β 、同 35 %ァセトニ卜ノレ水 1 £ 、同 40 %ァセトニトリノレ水 1 β で洗浄、同 45%アセト ^ トリル水、 2 β で目的物質を溶出した。

溶出活性画分 280mfiを等量の水で希釈後、再度、逆相系担体（YMC - Gel， 0DS-AM , 120-S50) のカラム（180mfi) に付し、 0.5 %NH₄H_zP0₄を含む 30 %ァセトニトリノレ水 0.4 β 、同 35 %ァセトニ卜リル水 0.4 £ 、同 40%ァセトニトリ水 0·4 β で力ラムを洗浄後、同 43 %ァセトニトリル水で展開し、目的物質を溶出した。この溶出活性画分 55m£を等量の水で希釈し、 40raj2の HP- 20のカラムに付した。このカラムを水 180πιβを等量の水で希釈し、 40m£の ΗΡ-20のカラムに付した。このカラムを水 180 12

mJ2で洗浄後、最終濃度として 0.002Nの HC1を含む 80%ァセトン水 100mj2目的物質を溶出した。この溶出液を滅圧濃縮し、アセトンを除去後、凍結乾燥することによリ、 WF11243物賓の塩酸塩（FR901469物質と称する）の白色粉末を 72mg得た。

((3) FR901469物質の物理化学的性質）

このようにして得られた FR901469物質の物理化学的性質は、表 2〜表 5に示したとおりである。なお、アミノ酸分析は次のようにして行った。まず， FR901469物質 1 mgを、 6N HC1 ( 1 πιβ) を用いて封管中 110"Cで 20時間加水分解した。加水分解終了後、反応混合物を蒸発乾固し、これをアミノ酸分析器 (Hitachi 835 Automatic Amino - Acid Analyzer) により分析した。その結果は、 Thr(4)、 Gly(l), Ala(l), Val(l), Tyr (1)、 Orn(l)であった。そしてその化学構造は、次の式（ I ) のように決定された。

C I ) 実施例 2 (FR901469物質の生物的性質）

((1) 抗菌力）

FR901469物質の抗菌作用を下記の 96ゥ： nルマルチ卜レーを使用するマイクロブロス希釈法常法により測定した。

斜面培地で培養した菌より、イーストナイトロジェンベースデキストロース（YNBD)培地で試験菌懸濁液（生菌数 2 X 10^s 個/ ηιβ) を調製した。 FR901469物質の YNBD中連続 2倍希釈列を作リ各ゥエルに 100 βずつ加えた。さらに各ゥエルに試験菌懸濁液を 100 βずつ加えた後、 37°Cで 24時間（Candida 及ぴ Aspergillus属）又は 48時間（Cryptococcus属）培養した培養終了後各ゥエルの濁度を測定し、薬剤無添加ゥエルの 1/2の濁度を示すゥエルの薬剤濂度を 50%増殖阻止漉度（IC_{S 0}) として表わした。結果を下記の表 2 に示す。

表 2

FR901469物質の抗菌力

験 IC_{S Q} ( /niJe)

Candida albicans FP582 く 0.0093

FP578 0.16

FP629 0.16

FP633 0.16

Candida uti丄 is YC123 0.16

Candida krusei YC109 0.0039

Candida tropica & is YC118 0.0039

Cryptococcus neoformans YC203 >10

Aspergillus fumigatus 8004 〈0.0093

Aspergillus niger ATCC9642 0.63

( (3 ) 実験マウス感染における Candida a lbicans に対する FR901469物質の感染防御効果）

FR 901469物貧の抗真菌剤としての生体での有効性を下記の方法で明らかにした。

試験動物は、生後 4週令、体重 18〜21 g の ICR系雌マウスを用い、 1群が 5匹よりなる。生理食塩水に懸濁した Candida albican s FP633 を、 1匹当たり 2 X 10^ε個の生菌数になるように、マウスの側尾静脈に注射することによリ感染させた。感染 1時間後、 FR901469物質の生理食塩水溶液を皮下注射によリマウスに投与した。この皮下注射をさらに感染翌日から 1 日 1 回、 3 日間繰り返した。感染後 14日目のマウスの生存匹数を観察し、得られた結果を下記の表 3 に示す

表 3

FR901469物質の生体内感染防御効果

FR901469投与量（mg/kg) 生存匹数

10 5

1 5

0 0

( (4) 毒性試験）

生後 5週令の ICR系雌マウス 5匹に、 FR901469物質を lOOmg /kg の投与量で毎日 1 回、 3 日間連続腹腔内注射したが死亡例はなく、体重増加も無投与マウス群と全く同じであり、 VF 11243物質の安全性の髙さが確認された。

実施例 3 (注射剤の製造）

(1) 実施例 1で製造した FR901469物質 5 _g

(2) 食塩 9 _g

(3) 炭酸水素ナ卜リウム 1 g (1)〜（4)の全成分を蒸留水 lOOmfiに溶解した後、アンプルに Ι ηιβずつ分注して、注射剤 1000本を製造した。

実施例 4 (吸入エーロゾル剤の製造）

式（ I )で示される化合物 2重量％、エタノール 33重量％、プロペラント（プロパン：イソブタン =70 ： 30混合物） 65重量％を、バルブ装着酎圧容器に充填して吸入エー口ゾル剤を製造した。発明の効果 zz

本発明は、 WF 1 1 243物賓を提供するものであるが、この物質は従来未知の新規薬理活性物質であって、すぐれた抗真菌及び抗原虫作用を示し、医薬品、化粧品、工業薬品、飲食品の各技術分野において真菌及び原虫の生育防止ないし抑制、死滅にきわめて有用である。本発明に係る物質は、このようにすぐれた抗真菌作用を有すると同時に抗原虫作用も併有する点で特镦的であり、後者については例えばカリニ肺炎の予防、治療にも著効がある点で特に特徵的である。

また本発明に係る有効成分の推定構造式が明らかにされたので、微生物による工業的製造のほかに有機合成による製造も可能となり、その結果各種誘導体の製造も可能となるので、新規化合物の製造及び新規用途の開発もおおいに期待できる。

規則第 13規則の 2の寄託された微生物への言及

α 11243

ィ当該微生物を寄託した寄託機関の名称及びあて名名称通商産業省工業技術院微生物工業技術研究所あて名〒305 日本国茨城県つくば市東 1丁目 1番 3号口ィの寄託機関に寄託した日付

平成 3年（1991年） 4月 23日

ノ、ィの寄託機関が寄託について付した受託番号

FERM BP - 3373

Claims

%

請求の範 _a_

1. その塩酸塩が次に示される物性を有するとを特徴とする ¥F11243物質またはその塩。

(1) 物質の色及び状態

白色粉末

(2) 融点

182〜187

(3) 比旋光度

〔_α + 29。 (c=1.5, メタノール）

(4) 分子式

C₇H 0 HC1

(5) 元素分析

計算値 (%) (C_7XH_xlGN_i40₂₃ - HC1 · 8H₂0に対し) ：

C, 49.74 ; H, 7.82； N, 11.44

実測値（％) ： C, 49.65； H, 7.72； N, 11.40

(6) 溶剤に対する溶解性

易溶：メタノール、水

難溶：ァセ卜ン

不溶： n-へキサン

(7) 呈色反応

陽性：沃素蒸気反応、琉酸セリウム反応、ニンヒドリン反応，陰性：モーリッシュ反応、エールリツヒ反応 '(s)r9Sl '(s) iZJ '(^S 'UI '(^S)8' T '(^S)6*UI

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'(P)Z'8S '(P)8*6S '(P)S.09 '(P)6O9 '(P) ·Ι9 '(Ρ)ί' 9

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'(Ρ)0·Ζ£ '(Ρ)ΖΉ 'ΖΧ(Ρ)6·乙 Π '(^S)9*8ZT 'ZX (P) 'm

？ ζ SS00/Z6d£/JDd 8W6I/^6 OAV Z7

1.35(3H, d， J=6.5Hz), 1.30(3H, d， J=6Hz) ,

1.28(22H, m)， 1.13(3H, d， J=6Hz) , 0.89(3H, t, J=7Hz)

0.81(3H, d， J=6.5Hz), 0.80(3H， d， J=6.5Hz)₀

(13) 分子式及び FAB-MS

FAB-MS m/z 1533(M+H)+; HRFAB-HS m/z 1555.8240 (C₇₁H_llsN₁₄0₂₃Naの計算値 1555.8235)

(14) アミノ酸分析

Thr(4)， Gly(l), Ala(l), Val(l), Tyr(l), Orn(l) (6N HCl, 110°C, 20時間加水分解）。

(15) 紫外線吸収スぺクトル

有意なピークは次のとおりである。

H₂0

X ： 225 (sh), 275(1200)， 280 (sh) nm

max

0.01N HCl

λ 225 (sh), 275， 280 (sh) nm

max

0.01N NaOH

λ ： 240, 292 nm

max zs

2. WF11243物質生産菌を培養して WF11243物質を生成せしめ、これを採取することを特徴とする WF11243物質またはその塩の製造方法。

3. WF11243物賓生産菌が、 Not 11243株であることを特徵とする請求の範囲第 2項記載の製造方法。

4. WF11243物質生産菌。

5. 1^11243物質生産菌が1¾111243株でぁる請求の範囲第 4項記載の WF11243物賓生産菌。

6. WF11243物賓またはその塩を有効成分とする抗真菌剤。

7. WF11243物質またはその塩を有効成分とする抗原虫剤。

8. 原虫、ニュ一モシステイスカリニ (Pneumocystis cari nii)である請求の範囲第 7項記載の抗原虫剤。