PROCEDIMIENTO PARA LA PRODUCCIÓN DE UNA VACUNA SUBUNIDAD CONTRA EL PARVOVIRUS PORCINO
CAMPO DE LA INVENCION
La presente invención se refiere en general a proteínas virales y a ensayos y vacunas que las utilizan, y en particular a una proteína relacionada con el antígeno mayoritario (VP2) de la cápsida del Parvovirus porcino (PPV). Dicha proteína se ha producido en un sistema de expresión de baculovirus multiplicados en un cultivo de células de un huésped permisivo. La proteína obtenida tiene la peculiar característica de formar cápsidas quiméricas vacías, que pueden ser utilizadas en la formulación de vacunas.
ANTECEDENTES DE LA INVENCION
El parvovirus porcino (PPV) es una de las causas principales de fallo reproductivo en cerdos, resultando en muerte y momificación fetal, abortos y otros transtornos reproductivos de las cerdas preñadas (Joo & Johnson. 1976. Veterinary
Bulletin 46, 653-660; Mengeling. 1978. J. Am. Vet. Med. Assoc. 172, 1291-1294) . PPV es un parvovirus autónomo que contiene una molécula de DNA de cadena sencilla de aproximadamente 5000 nucleótidos (Mollitor et al. 1984. Vvrology 137, 241-254) . La secuencia completa del genoma ha sido descrita recientemente por nuestro grupo, (Ranz et al. 1989.
J. Gen. Virol. 70, 2541-2553) . Se han descrito 4 proteínas específicas de virus: 3 proteínas que forman la cápsida (VP1, VP2 y VP3 de pesos moleculares 83000, 64000 y 60000 dalton, respectivamente) y una proteína no estructural NS1.
El PPV pertenece al grupo de parvovirus del virus de la rata de Kilham (KRV), que está formado además de por KRV, por el virus mínimo de ratón (MVM), el LuIII , H-1, el virus
de la panleukopenia felina (FPLV), el virus de la parvovirosis canina (CPV) y el virus de la enteritis de los visones (MEV) . Todos estos virus comparten varios rasgos comunes con otros parvovirus autónomos:
1. Existen dos grandes fases abiertas de lectura.
2. El mRNA de ambas fases de lectura es poliadenilado y 3'-coterminal.
3. La fase de lectura izquierda codifica para las proteínas no-estructurales necesarias para la replicación del DNA viral y la fase de lectura derecha codifica para las proteínas capsídicas.
Existen en la actualidad vacunas que protegen contra la parvovirosis porcina basadas en los métodos tradicionales de inactivación con agentes químicos y/o búsqueda de mutantes atenuados para el virus. Sin embargo todos los intentos previos de producción de nuevas vacunas utilizando proteínas recombinantes producidas en microorganismos procarióticos (v.g. E.coli) han resultado fallidos. En esta invención se describe un método para la producción de un nuevo tipo de vacunas basadas en las propiedades inmunogénicas de la proteína mayoritaria VP2 expresadas en un sistema de baculovirus crecidos en células susceptibles.
Durante los últimos años, nuestro laboratorio ha venido trabajando en el conocimiento de la biología molecular del PPV. Los hallazgos obtenidos se resumen en dos publicaciones pioneras: - A. Ranz, JJ. Manclus, E. Díaz, J.I. Casal (1989). Porcine Parvovirus: DNA secjuence and genome organization. J. Gen. Virol. 70, 2541-2553. - J./. Casal, E. Díaz, A. Ranz & JJ. Manclus (1990). Construction of an infectious genomic
clone of PPV: Effect ofthe 5' end on DNA replication. Virology. 177, 764-767.
Estas publicaciones se relacionan con el conocimiento de las secuencias del DNA viral que codifican para la proteínas que forman la cápsida del virus. Estas secuencias nos han permitido identificar el gen que codifica para la VP2 del PPV y su manipulación e inserción en los vectores adecuados para la expresión en el sistema de baculovirus. Este sistema permite la producción a gran escala basándose en la replicación de baculovirus recombinantes derivados del virus de la polihedrosis nuclear de Autographa californica (AcMNPV) en células de insecto en cultivo. El estado de la técnica con respecto a estos sistemas se reúne en dos artículos científicos que son los siguientes:
1 . Luckow, VA. & Summers, MD. (1988). Trenas in the development of baculovirus expression vectors. Bio/Technology 6, 47-55. 2 . J. Violará et al (1990). Synthesis of the membrane fusión and hemagglutinin proteins of
Measles virus using a novel baculovirus vector containing the β-galactosidase gene. J. Virol. 64. 37-50.
La síntesis de la proteína VP2 en el sistema de baculovirus posee ventajas notables y sustanciales sobre la producción del virus en cultivo de tejidos y posterior purificación del mismo, tanto en cuanto a coste económico del proceso, como en rendimiento en antígeno inmunizante. Por otro lado evita la necesidad de sacrificar animales para el establecimiento en cultivo de células capaces de replicar el virus, evita el mantenimiento de reservorios virales y los riesgos habituales en el manejo de virus, etc.
COMPENDIO DE LA INVENCION
La presente invención proporciona un procedimiento nuevo para la producción de una vacuna subunidad de origen recombinante para la protección de cerdos contra PPV. La nueva vacuna así producida puede contener: i) la proteína VP2 del PPV producida en un sistema de expresión de baculovirus multiplicados en un cultivo de células de un huésped permisivo (en adelante, para referirnos a esta proteína opcionalmente, utilizaremos la expresión "VP2 de la invención); o ii) cápsidas quiméricas vacías formadas por el ensamblaje de la VP2 de la invención.
La proteína VP2 de la invención tiene la característica peculiar de formar cápsidas quiméricas vacías, que opcionalmente podrían incorporar epítopos correspondientes a otras proteínas virales mediante manipulación genética de los baculovirus recombinantes, o manipulación química de las propias cápsidas.
Por consiguiente, la presente invención tiene por objeto un nuevo procedimiento para la obtención de nuevas vacunas subunidad, mejoradas, capaces de proteger cerdos contra las infecciones causadas por PPV. Como se ha mencionado antes dichas vacunas pueden contener bien la proteína VP2 de la invención o bien cápsidas quiméricas vacías formadas por dicha proteína VP2 ya que dichas cápsidas vacías tienen una alta actividad hemaglutinante y un alto poder inmunogénico, superiores a las de otras proteínas recombinantes de PPV producidas anteriormente en cualquier otro sistema. Las nuevas vacunas proporcionadas por esta invención y que constituyen un objeto de la misma pueden
contener bien dichas cápsidas vacías junto con un diluyente inmunológicamente aceptable sin necesidad de emplear adyuvante, bien la proteína VP2 de la invención junto con un diluyente y un adyuvante.
Dado que dichas cápsidas quiméricas pueden ser manipuladas química o genéticamente para introducir en ellas epítopos correspondientes a otros péptidos o proteínas virales no relacionadas, el empleo de dichas cápsidas tanto para fines vacunales contra PPV, como el empleo de dichas cápsidas modificadas para incorporar otros epítopos y constituir de este modo una vacuna polivalente también constituyen objetos adicionales de esta invención. La proteína VP2 obtenida según la invención y las cápsidas quiméricas que pueden formar pueden ser útiles en diagnóstico para detectar la presencia de anticuerpos específicos del PPV o para inducir anticuerpos policlonales o monoclonales capaces de detectar el PPV. El empleo de la proteína VP2 de la invención y de las cápsidas quiméricas que pueden formar para los fines arriba indicados también constituyen otro objeto de la presente invención. Otro objeto adicional de esta invención lo constituye un baculovirus recombinante, y su procedimiento de obtención, capaz de producir una proteína recombinante VP2 de PPV idéntica a la de origen viral como se ha demostrado mediante ensayos de reactividad antigénica y otros ensayos de funcionalidad biológica. El baculovirus recombinante se ha denominado AcMNPV.pPPVEx8 y ha sido depositado el 2.3.91 en la European Collection of Animal Cell Cultures, (ECACC) en Portón Down, Salisbury, Whiltshire SP4 OJG (Gran Bretaña) con el n-5 de accesión V91030213.
Un objeto adicional de la invención lo constituye el nuevo vector de transferencia en baculovirus (pPPVEx8) que contiene la secuencia de ácidos nucleicos que codifican para la VP2 de la invención. Este nuevo vector mediante un procedimiento conocido como recombinación homologa con la cepa salvaje del AcMNPV da lugar al citado baculovirus recombinante AcMNPV.pPPVEx8.
Esta invención también proporciona la secuencia de ácidos nucleicos que codifica para la proteína VP2 obtenida según la invención (figura 1).
Las cápsidas quiméricas vacías de PPV formadas por autoensamblaje de las proteínas VP2 recombinantes de PPV también constituyen un objeto adicional de esta invención.
BREVE DESCRIPCION DE LAS FIGURAS
La figura 1 muestra la secuencia de nucleótidos que codifica para la VP2 de la invención así como su secuencia de aminoácidos. La secuencia de nucleótidos está indicada en la dirección 5'→ 3' de izquierda a derecha. Los aminoácidos se han designado según el código de tres letras generalmente aceptado.
La figura 2 muestra la construcción del vector de expresión pPPVEx8 indicando las manipulaciones adecuadas para la inserción del gen de VP2 de PPV en el plásmido pJVP10Z.
La figura 3 muestra la presencia de cápsidas quiméricas vacías formadas por agregación de la proteína VP2 de la invención, tal y como se observa al microscopio electrónico.
La figura 4 muestra el valor de los títulos medios de anticuerpos de sueros procedentes de 2 cerdos inmunizados 2 veces con⋍ 3μg de cápsidas quiméricas vacías de PPV adyuvantadas con Alhydrogel + QuilA. La respuesta de anticuerpos se midió por:
A. ELISA anti PPV virion (●—●)
B. Inhibición de la hemaglutinación de PPV (■—■)
C. Neutralización de PPV (▲—▲)
La figura 5 muestra los valores de los títulos de anticuerpos contra PPV determinados por ELISA en cerdas preñadas vacunadas con cápsidas quiméricas de PPV (▲,▼ ) y no vacunadas (■) sometidas a inoculación viral (challenge) con una estirpe virulenta de PPV.
DESCRIPCION DETALLADA DE LA INVENCION
La invención proporciona un procedimiento nuevo para la obtención de una vacuna subunidad de origen recombinante adecuada para la protección contra infecciones causadas por PPV. La nueva vacuna puede contener la proteína VP2 del PPV producida en un sistema de expresión de baculovirus multiplicados en un cultivo de células de lepidóptero u otro huésped permisivo, o cápsidas quiméricas formadas por ensamblaje de dicha VP2.
La invención también proporciona un baculovirus recombinante capaz de expresar la VP2 de PPV cuando se inocula en un huésped permisivo, así como el procedimiento de obtención de dicho baculovirus recombinante.
La obtención del baculovirus recombinante comprende básicamente las etapas de:
a) Preparación del gen que codifica para la proteína VP2 del PPV;
b) inserción del gen de VP2 en un vector de transferencia de baculovirus;
c) transfección de células huésped permisivas con el citado vector de transferencia de baculovirus que lleva inserto el gen de la VP2; y
d) selección del baculovirus recombinante que expresa la proteína VP2 del PPV.
Adicionalmente se efectúa la caracterización del baculovirus recombinante obtenido así como la caracterización de las proteínas y cápsidas producidas. Estas etapas se describirán con detalle posteriormente.
En una realización preferida, el gen que codifica para la proteína VP2 de PPV se obtiene a partir del plásmido pPPV15, previamente construido en nuestro laboratorio, que contiene todas las secuencias codificantes para VP2 y se inserta en el sitio Nhel del plásmido pJVP10Z derivado del AcMNPV, con lo que se obtiene un vector de transferencia de baculovirus. En nuestra invención el vector denominado pPPVEx8 demostró tener el DNA correspondiente al gen de la VP2 de PPV en la orientación correcta para su expresión por el promotor de la polihedrina del virus AcMNPV.
El vector pPPVEx8 se utilizó para cotransfectar, junto con DNA de la cepa silvestre de AcMNPV, células huésped permisivas. Entre estas células se pueden citar células de lepidópteros o sus larvas. En una realización preferida de esta invención se transfectaron células de Spodoptera frugiperda (S. frugiperda) , generalmente de la cepa Sf9, con pPPVEx8, aunque resulta obvio suponer que se podrían obtener resultados semejantes transfectando otras células
permisivas para la replicación del baculovirus recombinante.
Efectuada la transfección se seleccionaron los baculovirus recombinantes tras retirada y titulación de los sobrenadantes producidos en monocapas confluentes de células S. frugiperda . Las placas azules que no contenían evidencia de la polihedrina viral por microscopía óptica se recogieron y retitularon sobre células S. frugiperda para obtener los baculovirus recombinantes. El baculovirus recombinante denominado AcMNPV.pPPVEx8 es capaz de expresar la proteína VP2 de PPV y se ha depositado en la ECACC con el ns de accesión V91030213. Mediante un ensayo de "Dot Blot" se comprobó que el gen de la VP2 se había integrado correctamente en el genoma del baculovirus recombinante citado.
Las proteínas expresadas por las células S. frugiperda infectadas con el baculovirus recombinante se analizaron por electroforesis en geles de gradiente del 8% al 15% de
SDS-poliacrilamida y se tiñeron con azul de Coomasie observándose la presencia mayoritaria de una proteína con un peso molecular aparente de 64 KDa, equivalente al de la VP2 viral en el carril correspondiente al virus recombinante. Pruebas de inmunodetección demostraron que los antisueros policlonales anti-PPV reaccionaban con la
VP2 expresada por el baculovirus recombinante. En base a estos resultados se puede afirmar que la VP2 recombinante expresada por el baculovirus recombinante en células S. frugiperda es antigénicamente indistinguible de la VP2 de origen viral.
La proteína VP2 obtenida según el procedimiento antes descrito puede utilizarse con fines diagnósticos para
detectar la presencia de anticuerpos específicos de PPV o para inducir anticuerpos policlonales o monoclonales capaces de detectar el PPV. Adicionalmente, pueden también utilizarse para inmunizar animales contra PPV. Ensayos ELISA demostraron que sueros procedentes de animales inmunizados con la VP2 de la invención purificada reconocían los antígenos virales mientras que ensayos de inhibición de hemaglutinación (IHA) demostraron que sueros de animales inmunizados con la proteína VP2 de la invención purificada presentaban títulos de IHA del orden de 1/320 cuando se utilizaba como antígeno 4 unidades de HA de PPV purificado, lo que permite afirmar que los animales inmunizados con la VP2 de la invención tienen un alto grado de protección.
En base a los resultados obtenidos, la proteína VP2 expresada por el sistema de baculovirus recombinante de la invención puede ser utilizada para su formulación en vacunas al objeto de proteger cerdos contra la infección causada por PPV. Estas vacunas pueden ser tanto pasivas como activas. Una vacuna pasiva se podría obtener inmunizando animales con la VP2 recombinante y purificada de la invención y posteriormente aislando anticuerpos policlonales contra dicha VP2 que una vez purificados pueden usarse en aplicaciones terapéuticas o profilácticas. Una vacuna activa puede prepararse resuspendiendo la VP2 recombinante de la invención en un diluyente inmunológicamente aceptable más un adyuvante. Anteriormente se ha mencionado que la proteína VP2 obtenida según el procedimiento de esta invención tiene la peculiaridad de que puede agregarse operando según nuestras condiciones y formar cápsidas quiméricas vacías pseudo-virales de estructura regular y uniforme y con un tamaño de 22 nm aproximadamente como se ha demostrado por
microscopía electrónica. Hasta la fecha nadie ha descrito la formación de cápsidas pseudo-virales, en Parvovirus porcino, "in vitro", usando exclusivamente su proteína VP2. Este hecho permite purificar fácilmente las proteínas VP2 recombinantes obtenidas. Adicionalmente, las cápsidas vacías formadas por el ensamblaje de la VP2 de la invención tienen una alta actividad hemaglutinante y un alto poder inmunogénico, superior al de otras proteínas recombinantes de PPV producidas anteriormente en otros sistemas. Por tanto, dichas cápsidas pueden ser formuladas para su empleo en vacunas capaces de proteger cerdos contra la infección causada por PPV. En general, puede prepararse una vacuna activa resuspendiendo dichas cápsidas vacías, en un diluyente inmunológicamente aceptable sin necesidad de utilizar un adyuvante. Un aspecto importante de estas cápsidas quiméricas vacías, que puede resultar obvio para una persona experta en esta tecnología, es que pueden ser manipuladas química o genéticamente para introducir epítopos correspondientes a péptidos o proteínas de otros virus, de cuya infección se desea proteger, y actuar por tanto como una vacuna polivalente.
Como diluyente inmunológicamente aceptable pueden utilizarse soluciones salinas con tampón de fosfato (PBS) u otras soluciones salinas similares. Como adyuvante pueden utilizarse suspensiones de geles de alúmina y otros adyuvantes habitúaIntente utilizados en la formulación de vacunas.
DESCRIPCION DETALLADA DE UN MODO PREFERIDO DE REALIZACION
DE LA INVENCION. (EJEMPLO)
1. OBTENCION DE BACULOVIRUS RECOMBINANTES QUE EXPRESAN EL GEN DE LA VP2 DE PPV.
1.1. Preparación del gen de la VP2 del PPV
El genoma entero del PPV fue clonado por primera vez en nuestros laboratorios, en el plásmido bacteriano pUC18, dando lugar a un clon genómico llamado pPPV10, tal como se describe en la publicación "Construction of an infectious genomic clone of Porcine Parvovirus: Effect of the 5'-end on DNA replication", Casal et al (1990), Viroloev 177, 764-767. En nuestros experimentos se utilizó como virus de partida la estirpe viral NADL-2 que se puede obtener de la American Type Culture Collection, Rockville, Maryland (USA) con el ns de accesión ATCC-VR742.
El clon genómico pPPV10 se utilizó como material de partida para, tras diversas manipulaciones genéticas, obtener otro plásmido denominado pPPV15 (figura 2 ) , que contiene todas las secuencias que codifican para la VP2 de PPV en un fragmento de DNA de aproximadamente 1.9
Kpb. El inserto de DNA se dispuso de tal forma que podía ser extraído en un solo paso con la endonucleasa de restricción BamHI. El inserto de 1.9 Kpb se aisló por electroforesis en geles de agarosa de bajo peso molecular y se insertó en el vector pMTL-25 previamente digerido con BamHI y tratado con fosfatasa.
El plásmido así construido se denominó pPPV17 y contenía las secuencias que codifican para la VP2 del PPV flanqueadas por dos sitios de restricción Xbal . 1.2. Inserción del gen de la VP2 en un vector de transferencia de baculovirus
El vector plasmídico con sitio único Nhel derivado de
AcMNPV ( plásmido p JVP 10 Z ) , ( Violará, J. et al. J. Virol 64, 37-50, 1990) , fue una donación del Dr. Cris Richardson (NRC. Quebec.
Canadá) y fue usado para clonar el fragmento Xbal obtenido a partir del plásmido pPPV17 tal como se muestra en la figura 2. Como puede verse en dicha figura, el fragmento Xbal del pPPV17 (que contiene el gen que codifica para la VP2 del PPV) se insertó en el sitio Nhel de PJVP10Z. Los plásmidos obtenidos que contenían el gen de la VP2 insertado fueron purificados de acuerdo al método de la lisis alcalina (Bimboim & Doly. NucleicAcidsRres.7, 1513-1523. 1979) y caracterizados por mapeo con endonucleasas de restricción. El recombinante llamado pPPVEx8 demostró tener el DNA correspondiente al gen de la VP2 de PPV en la orientación correcta para su expresión por el promotor de la polihedrina del AcMNPV. 1.3. Transfección y selección de virus recombinantes
Células de S.fiugiperáa fueron transfectadas con mezclas del DNA infeccioso purificado a partir de AcMNPV y DNA plasmídico procedente de pPPVEx8 de acuerdo con el procedimiento descrito por Buranáet al. Virology 101.286-290. 1980. DNA de AcMNPV (1μg) purificado por el método de Smith y Summers Virology 123. 393-406. 1983 , se mezcló con dos cantidades diferentes del DNA plasmídico (1 y 5μg) y se llevó a 750 JU.1 con solución salina tamponada con Hepes (25 mM Hepes, pH 7.1, 140 mM NaCl y 125 mM CaCl2). La solución de DNA se inoculó sobre monocapas de 2 × 108 células de S.frugiperda y se incubó durante 4 h a temperatura ambiente. Después se retiró el sobrenadante y se añadieron 5 mi de medio, conteniendo 10% suero fetal de ternera. Tras 4 días de incubación, los sobrenadantes fueron recogidos y titulados en monocapas confluentes de células S.frugiperda . Para mejorar la detección de las placas recombinantes, se añadió a la agarosa el indicador azul X-gal. Las placas azules que no contenían evidencia de
cuerpos de oclusión (polihedrina viral) por microscopía óptica fueron recogidas y retituladas sobre células de S.frugiperda para obtener los virus recombinantes. Siguiendo un tercer plaqueo se obtuvieron stocks de los virus recombinantes con alto título (107-8 pfu/ml).
El baculovirus recombinante fue llamado AcMNPV.pPPVEx8 y está depositado en la European Collection of Animal Cell Cultures, (ECACC) con el ns de accesión V91030213.
2. ENSAYO DE DOT BLOT
Para determinar si se había integrado el gen de VP2 en el genoma del baculovirus recombinante se realizó un ensayo "Dot Blot" según el procedimiento siguiente.
Para obtener DNA a partir del virus recombinante, las células S.ftugiperáa fueron infectadas con virus a una multiplicidad de infección de 5 PFU/célula y se incubaron a 27°C durante 48 h. Las células infectadas fueron recogidas, sonicadas y centrifugadas a 1000 rpm durante 10 min para eliminar restos celulares. El sobrenadante fue utilizado como material de partida para los ensayos.
Un volumen de 100μl se desnaturalizó con 10μl de NaOH 1M, se hirvió durante 5 min y se colocó inmediatamente sobre hielo. La mezcla se neutralizó con 10 μl de PO4H2Na 1M. Inmediatamente se añadió una solución 20×SSC hasta obtener una concentración final 6×SSC (SSC, solución salina citrato).
La solución fue transferida a un filtro de nitrocelulosa previamente humedecido con 6×SSC. Se lavó con más 6×SSC y se secó a 37°C durante 30 min. El DNA
se fijó al filtro de nitrocelulosa con luz U.V. durante 2-3 min. Las membranas de hibridaron entonces con una sonda específica del DNA correspondiente a la VP2, marcada con Fósforo-32, a 37°C durante la noche. Posteriormente se lavó con soluciones conteniendo concentraciones decrecientes de SSC y se autorradiografió.
Se observó una fuerte señal de hibridación sólo en el caso de los pocilios que contenían sobrenadantes procedentes de los cultivos infectados con baculovirus recombinantes, indicando que el gen de la VP2 se había integrado dentro de genoma viral.
3. ANALISIS DE PROTEINA E INMUNODETECCION
Células S.frugiperáa fueron infectadas con el baculovirus recombinante a una multiplicidad de 5 PFU/célula e incubadas a 27°C durante 48 h. Las células se recogieron por centrifugación a 1000 rpm durante 10 min, se lavaron dos veces con solución salina tamponada con fosfato pH 7.4 y se resuspendieron a 1.106 células/ml con buffer de lisis (5% dodecil sulfato sódico (SDS), 1% ß-mercaptoetanol y 17,4% glicerol). Las muestras se cargaron en geles de gradiente del 8 al 15% de SDS-poliacrilamida para electroforesis y se tiñeron con azul de Coomasie o se transfirieron a membranas de nitrocelulosa para la inmunodetección. Por tinción con azul de Coomasie se observó la presencia mayoritaria de una proteína con un peso molecular aparente de 64 KDa, equivalente al de la proteína VP2 viral, en el carril correspondiente al baculovirus recombinante.
Para la inmunodetección, las proteínas se transfirieron a membranas de nitrocelulosa según técnicas previamente
descritas (BurnettAnal. Biochem. 112. 195-203, 1981. Towbin etal, Proc. NatlAcad. Sci. USA 76. 4350-4354. 1979) . La transferencia de proteínas se hizo en un aparato PhastSystem (Pharmacia). En general se utilizaron 25 mA/gel durante 10-15 minutos. Los filtros de nitrocelulosa se bloquearon con 3% de leche en polvo desnatada en Tris HCl 20 mM pH 7.5, NaCl 500 mM (TBS) durante 30 min a temperatura ambiente. A continuación las tiras se incubaron durante una hora a temperatura ambiente con el primer antisuero de conejo anti-PPV, se lavaron con TBS-0.05% Tween-20 durante 30 min a temperatura ambiente y se incubaron con suero de cabra anti-conejo marcado con biotina a una dilución 1:500 durante una hora a temperatura ambiente. Las tiras se lavaron de nuevo y se dejaron reaccionar con estreptavidina marcada con peroxidasa, a una dilución de 1:2000 durante 30 min a temperatura ambiente. Después de un lavado extenso, los filtros se revelaron con una solución de TBS conteniendo 0.5 mg/ml de 4-cloro-1-naftol (Sigma), 17% (v/v) de metanol y 0.015% de peróxido de hidrógeno en TBS hasta que aparecieron bandas visibles. La reacción se paró tratando las tiras con agua destilada.
Todos los antisueros policlonales de conejo, preparados contra partículas virales completas de PPV reaccionaron con la proteína VP2 expresada por el baculovirus recombinante.
3.1 Purificación de la proteina recombinante y de las cápsidas
Células de S.frugiperáa fueron infectadas con virus recombinante AcMNPV.pPPVEx8 con una multiplicidad de infección de 5-10 PFU/célula e incubadas a 27°C durante 48-72 h. Las células se recogieron por centrifugación
a 1000 rpm durante 10 min, se lavaron dos veces con solución salina tamponada con fosfato pH 7.4 y se resuspendieron a 2 × 107 células/ml en buffer bicarbonato 25 mM, pH 9.5. Las células resuspendidas se rompen por sonicación y se centrifugan a 10.000 rpm durante 10 min para eliminar restos celulares. El sobrenadante conteniendo la proteína VP2 recombinante se puede purificar fácilmente aprovechando su capacidad autoagregante para formar cápsidas vacías. Para ello bien se purifican por precipitación con sulfato amónico al 20% o bien se centrifugan las cápsidas vacías sobre gradientes de CsCl a 45.000 rpm durante 14 horas. Las cápsidas presentan una densidad de flotación (ρ ) de 1.30 g/cm3 cuando se bandean en gradientes de CsCl. La pureza de la preparación se determinó por electroforesis en geles de poliacrilamida como se describió anteriormente y resultó tener una pureza en proteína VP2 superior al 99%. 4. ACTIVIDAD HEMAGLUTINANTE DE LA PROTEINA VP2
La actividad hemaglutinante se realizó de acuerdo al procedimiento ya conocido (Joo. H.S. etal.Aust. Vet. J. 52:422-424. 1976) . Esta actividad funcional viene asociada exclusivamente al carácter particulado del producto que lo diferencia claramente de otros anteriores.
El título de hemaglutinación de las cápsidas formadas por ensamblaje de la VP2 resultó ser de 5 × 105 unidades/ml.
5. CONFIRMACION DE LA PRESENCIA DE CAPSIDAS VACIAS POR MICROSCOPIA ELECTRÓNICA
Una preparación de VP2 purificada fue teñida por
contraste negativo con acetato de uranilo y observada al microscopio electrónico a una magnificación de 40000 × 2.5 aumentos, observándose la presencia de un gran número de partículas quiméricas pseudo-virales (cápsidas), de estructura regular y uniforme y con un tamaño aproximado de 22 nm (Figura 3).
6. INMUNIZACION DE CONEJOS Dos conejos, raza neozelandesa de 2 Kg de peso, fueron inmunizados intramuscularmente por tres veces con 100 μg de una preparación de VP2 de la invención purificada. La is vez en adyuvante completo de Freund, la 2a y 3a con adyuvante incompleto. Una semana después de la inmunización se sangró el conejo y se valoraron los sueros obtenidos por un ensayo de ELISA y por otro de inhibición de la hemaglutinación (IHA), según los protocolos que se describen a continuación. 6.1. Cuantificación de anticuerpos anti-PPV por ELISA e IHA
La presencia de anticuerpos específicos para PPV en el suero de los animales inmunizados fue determinada mediante un ensayo de ELISA indirecto. Como antígeno se utilizó tanto virus PPV purificado, como proteína VP2 purificada. Brevemente, placas de poliestireno se recubrieron con 0.5 μg/pocillo de virus ó 0.25 μg/pocillo de VP2 en 100 μl de buffer carbonato (0.05 M, pH 9.6) a 4°C durante la noche. Las placas se lavaron con PBS (NaCl 0.15 M en fosfato sódico 0.1 M pH 7.4) conteniendo 0.05% Tween-20 y se incubaron con el antisuero de conejo anti-PPV durante 2h a 37°C, se lavaron de nuevo y se incubaron con IgG de cabra anticonejo marcado con biotina. El anticuerpo marcado con
biotina se incubó posteriormente con estreptavidina marcada con peroxidasa durante 30 min a temperatura ambiente. Las placas se lavaron de nuevo y la reacción coloreada se reveló con o-fenilendiamina como sustrato para la peroxidasa, durante 10 min en la oscuridad y se leyó a 450 nm en un espectrofotómetro multicanal.
Los sueros presentaban un título por ELISA de V1600 frente a la proteína VP2 y V3200 frente al virus original PPV.
El ensayo de IHA se realizó de acuerdo a técnicas "standard" ya previamente descritas (Joo, H.S. et al Aust. Vet. J. 52:422-424. 1976) . El título de IHA fue de 1/320 utilizando como antígeno 4 unidades de HA de PPV purificado. Dada la buena correlación observada experimentalmente entre los títulos de IHA y los títulos de protección de los animales frente a la infección por el virus, se asume que animales capaces de desarrollar ese título presentan un alto grado de protección.
7. INMUNIZACION DE CERDOS Dos cerdos fueron inmunizados con preparaciones de cápsidas quiméricas de PPV formadas por autoensamblaje de proteínas VP2 recombinantes. Uno de los cerdos era seronegativo para PPV, pero el otro tenía un nivel bajo de anticuerpos debido a que la madre estaba vacunada. Los dos cerdos se mantuvieron en una unidad de aislamiento durante el experimento.
La vacuna se formuló mezclando las cápsidas (⋍3μg) con un sistema adyuvante standard: 50% Alhydrogel (Superfos. Denmark) + 500 u.g QuilA (Superfos). Todos
los constituyentes se mantuvieron a concentraciones
"standard", siendo la única diferencia el reemplazamiento del virus inactivado por cápsidas de
PPV. Los cerdos se vacunaron subcutáneamente con 2 ml en una 1a dosis y con 1 mi en la 2a dosis tras 3 semanas. Se tomaron muestras de suero semanalmente, antes y 10 días después de la segunda vacunación. La presencia de anticuerpos contra PPV en el suero de los animales inmunizados se ensayó por tres diferentes métodos: 1. ELISA anti PPV virion. 2. Inhibición de la Hemaglutinación (Joo et al. 1976. Aust. Vet. J. 52, 422-424) y 3.
Neutralización de PPV (Holm Jensem, M. (1981). Acta Vet. Scaná.22, 85-98) .
Todos los títulos obtenidos por la vacuna recombinante a base de cápsidas (Fig. 4) fueron de la misma magnitud que los obtenidos habitualmente por la vacuna comercial inactivada, indicando que las cápsidas quiméricas de PPV son altamente inmunogénicas y pueden reemplazar a los viriones inactivados. A pesar de que uno de los cerdos tenía anticuerpos maternales residuales, la respuesta a la vacuna no fue inhibida y alcanzó niveles similares a los obtenidos con el cerdo seronegativo.
La respuesta se obtuvo con una dosis baja de producto (cápsidas) recombinante (⋍ 3 μg) lo que demuestra un alto potencial para la aplicación comercial como vacuna.
8. PROTECCION "in vivo" FRENTE A VIRUS VIRULENTO
Se llevó a cabo un experimento de descarga para investigar la eficacia de las cápsidas recombinantes de VP2 en la inducción de inmunidad protectiva contra PPV en cerdas preñadas.
Antes de ser inseminadas artificialmente, 2 cerdas seronegativas fueron vacunadas con la misma preparación vacunal que se describió en el ejemplo anterior. El contenido en antígeno, adyuvantes y formulación de la vacuna fue el mismo y las 2 cerdas se vacunaron dos veces con un intervalo de 3 semanas. Una cerda preñada
(seronegativa) se utilizó como control no vacunado. A los 40 días de gestación las 3 cerdas preñadas fueron inoculadas por vía intravenosa con 107 TCDI50 de una estirpe virulenta de PPV, estirpe "839" (Sφrenseny Askaa. 1981.
Acta vet. Scand. 22, 171-179) . Las 3 cerdas fueron sacrificadas a los 66 días de gestación.
Se registraron la longitud total y las grandes lesiones patológicas (GPL) de cada feto. Se recogieron también muestras de sangre de cordón umbilical de los fetos y los sueros se chequearon para anticuerpos anti-PPV por un test indirecto de inmunofluorescencia (IFAT)
(S≠rensen et al. 1980, Acta Vet. Scand. 21, 312-317) . Anticuerpos anti-PPV se chequearon también por un test de inmunoelectroforesis contracorriente. Además de lo anterior, estas muestras se chequearon también para su contenido en IgM o IgG por "rocket" electroforesis
(Dalsgaará et al. 1979, Acta Vet. Scanά.20,312-320). Cuando no se pudo obtener sangre de cordón umbilical se utilizaron fluidos abdominales o extractos de tejido cerebral.
Se recogieron tejidos fetales de riñon, hígado y pulmón y se examinaron para la presencia de antígeno de PPV por el test ELISA, habitualmente utilizado en el State Veterinary Institute for Virus Research, Lindholm (SVIV) para diagnóstico de PPV. También se recogieron muestras de suero de las cerdas antes de la vacunación, en la revacunación, 10 días después, en el tiempo de la inoculación viral y en el sacrificio, que se chequearon
para la presencia de anticuerpos anti-PPV por el test ELISA ya citado anteriormente.
Las tres cerdas permanecieron sanas durante todo el experimento. El desarrollo de títulos de anticuerpos anti-PPV se muestra en la figura 5. Como puede verse en dicha figura, la cerda no vacunada permaneció seronegativa hasta la inoculación viral. Tras la infección se produjo un dramático incremento en el título de anticuerpos contra-PPV registrado en la autopsia, indicando la existencia de una infección por PPV. Las 2 cerdas vacunadas muestran títulos que se incrementan tras la vacunación y revacunación. Estos títulos sufren un incremento posterior debido a la administración de virus virulento. a) Fetos del control no vacunado
En la autopsia, los fetos de la cerda 1451 (control no vacunado) mostraban lesiones típicas de infección intrauterina de PPV (Bachmann et al. 1975, Infecí. Immunity, 12, 455-460; Joo et al. 1976. Arch. Virol. 51, 123-129; Joo et al. 1977, J. Compar. Path. 87, 383-391; Nielsen et al. 1991, Vet. Micróbiol. 28 1-11). Cuatro fetos estaban vivos. Uno de ellos no mostraba signos de GPL, ahora bien los otros 3 mostraron GPL de severidad variable: decoloración típica, morbidez, con grandes volúmenes de fluidos ascíticos, edema, estasis pulmonar y eritema, atrofia tímica y hepatomegalia. Otros 5 fetos estaban muertos y tenían severas GPL incluyendo retardo en el crecimiento, edema universal extremo, hiperemia y pronunciada destrucción de tejidos. Tres fetos tenían longitudes (CR) de 11.5 a 12.5 cm indicando detención del crecimiento a los 57 días de gestación. Se detectó antígeno de PPV en todos los fetos de la
cerda no vacunada utilizando la técnica ELISA ya descrita. En fluidos pleurales de tres fetos se detectó respuesta de anticuerpos ( fetal ) anti-PPV al virus del "challenge", medida por IFAT y e inmunoelectroforesis contracorriente. La presencia de estas muestras de anticuerpos de las clases IgG e IgM se confirmó por "rocket" inmunoelectroforesis. Los fetos porcinos son capaces de inducir una respuesta de anticuerpos anti PPV a los 60 días de gestación (J. Nielsen et al. 1991, Veterinary Microbiólogo 28, 1-11). b) Fetos de las cerdas vacunadas
En las cerdas vacunadas, una de ellas tenía 10 fetos y la otra 8 fetos. Todos ellos estaban vivos y normales en la autopsia. Todos los fetos aparecían sanos. No se detectó antígeno de PPV en ninguno de los fetos. Tampoco se detectó presencia de anticuerpos anti PPV en sangre o fluido pleural por ninguna de las técnicas empleadas. La ausencia de inmunoglobulinas de tipo IgG o IgM se confirmó por "rocket" inmunoelectroforesis.
Sobre la base de los resultados arriba descritos se puede afirmar que las cápsidas de VP2 recombinante de PPV expresadas en el sistema de baculovirus/células de insecto son capaces de inducir una inmunidad protectiva completa contra una inoculación intravenosa con virus PPV virulento en cerdas preñadas. A la vista de los resultados obtenidos, se demuestra que las cápsidas de VP2 recombinante pueden constituir la base para nuevas vacunas comerciales útiles en el control de la infección por PPV en cerdos. Asimismo, dado que los epítopos inmunodominantes esenciales de PPV se expresan sobre las cápsidas de VP2, dichas
cápsidas pueden ser útiles como reactivo en el diagnóstico de la infección por PPV en cerdos, por ejemplo, en kits para el diagnóstico de anticuerpos. FORMULACION DE UNA VACUNA CONTRA LA INFECCION CAUSADA POR PPV
Se puede obtener una vacuna pasiva inmunizando animales con las cápsidas formadas por la proteína VP2 recombinante purificada como se describe en la presente invención. Anticuerpos policlonales dirigidos contra esta VP2, pueden aislarse de suero, leche u otros fluidos corporales del animal. Estos anticuerpos pueden ser posteriormente purificados y usados para aplicaciones terapéuticas o profilácticas.
Una vacuna activa puede ser preparada resuspendiendo las cápsidas de VP2 recombinante descrita en la presente invención en un diluyente inmunológicamente aceptable tal como PBS, más un adyuvante tal como Alhydrogel o QuilA. Inyecciones iniciales y de recuerdo o administración oral de la solución vacunal pueden ser utilizadas para conferir inmunidad. Una vacuna activa puede ser también preparada suspendiendo las cápsidas vacías formadas por ensamblaje de la proteína recombinante VP2, en un diluyente inmunológicamente aceptable sin necesidad del uso de adyuvantes. Resulta también evidente para cualquier persona experta en el arte que estas cápsidas quiméricas formadas por VP2 pueden ser manipuladas genéticamente para introducir epítopos correspondientes a otras proteínas virales y actuar por tanto como vacuna polivalente.
10.CONCLUSIONES
El baculovirus AcMNPV. pPPVEx8 es capaz de producir una VP2 recombinante de PPV completamente idéntica a la proteína VP2 de PPV como se ha demostrado por secuencia de DNA, estimación de su peso molecular y caracterización antigénica. La VP2 recombinante obtenida según nuestro procedimiento posee la extraordinaria capacidad de formar cápsidas vacías, lo que le confiere una actividad hemaglutinante e inmunogénica claramente superior a la de otras proteínas recombinantes previamente descritas, como se ha demostrado en los experimentos de inmunización de animales aquí descritos.
Esta alta capacidad inmunogénica puede ser aprovechada por personas expertas en el arte para introducir epítopos correspondientes a otras proteínas virales que se pueden introducir en ellas por manipulación genética de los baculovirus recombinantes, o por manipulación química de las cápsidas formadas.
Traducción de las leyendas de las figuras Figura 2
(a) Aislar fragmentos en gel de agarosa.
(b) Ligar.
(c) Fosfatasa.
Figura 4
(a) Logaritmo del título
(b) Días post inmunización
(c) Segunda inmunización
Figura 5
(a) Vacunación de hembras preñadas con cápsidas quiméricas de PPV formadas por auto ensamblaje de
VP2 recombinante
(b) ELISA, títulos de anticuerpos contra PPV
(c) Días post vacunación
(d) Primera vacuna
(e) Segunda vacuna
(f) Challenge
(g) Inseminación artificial
(h) Autopsia La muestra del Baculovirus recombinante ha sido depositada en la EUROPEAN COLLECTION OF ANIMAL CELL CULTURES (ECACC) en fecha cuatro de Marzo de 1991.
Descrito el objeto de la presente invención se declara que lo que constituye la esencialidad de la misma es lo que se menciona en las siguientes.