WO1992014832A1 - Processes for purifying human bcdf - Google Patents

Description

明 細 書

ヒ 卜 B C D F の精製法

'n.

(技術分野）

本発明 は、 医薬品 と し て用 い ら れる ヒ ト B 細胞分化因子 （以 下、 ヒ ト B C D F と い う ） の精製法に関す る も の で あ る 。 具体 的に は、 ヒ ト B C D F — D N Aを組み込んだ微生物由来の ヒ ト B C D F培養産物 よ り 医薬品 と し て使用可能な純度 と 安全性が 保障 さ れ う る ヒ ト B C D F の精製法に関す る 。

(背景技術）

ヒ ト B 細 胞 を 抗 体 産生細胞 へ分化 さ せ る 因子 で あ る ヒ 卜 B C D F ( B — c e l l D i f f e r e n c i a t i o n F a c t o r ) は 1 9 8 6 年にそ の c D N Aが ク ロ ー ニ ン グ さ れた （ N a t u r e , 3 2 4 , 7 3 ( 1 9 8 6 ) ) 。 そ の後、 該物質は B 細胞刺激因子 （ B S F — 2、 B - c e 1 1 S t i m u 1 a t o r y F a c t o r — 2 ) ま た は イ ン タ ー ロ イ キ ン 6 ( I L - 6 ) と も よ ばれ る よ う に な り 、 そ の物性 も 概略明 ら かに な つ て い る （分子量約 2 1 0 0 0 , 等電点約 6 . 2 ) 。 ま た、 ヒ ト B C D F は種々 の生物活性を示す こ と が報告 さ れて い る 。 こ の な かで も血球の幹細胞の増殖作用、 血 し ょ う 板前駆钿胞か ら血 し ょ う 板を分化させる作用、 B リ ン パ球を抗 体産生細胞へ分化させる作用等医薬どして有用な作用を有 して いる。 すなわち、 ヒ ト B C D F は他の制癌剤使用や骨 ¾移植に 伴う血球の減少を捕う 薬、 あ る い は ワ ク チ ン の作用を増強する 薬と して医薬分野への利用が期待されてい る も のであ る。

本発明者ら は、 既に ヒ ト B C D F の c D N Aを組み込んだ大 腸菌を生産宿主と して、 こ れよ り 得 られる ヒ ト B C D F培養物 よ り 、 箇便にかつ効率的に ヒ ト B C D Fを精製処理する方法の —部を開示 した （特開平 1 — 8 3 0 9 4、 同 1 — 3 0 0 8 9 8 及び同 2 — 1 8 6 9 9 6 号公報参照） 。 しか し、 これらの精製 方法は、 ヒ ト B C D F培養物の精製法を検討する 中で判明 して きた ヒ ト B C D F の類縁体等の不純物を も合わせて除去する為 には必ず し も充分な方法と は いえな い。 ま た、 精製純度も研究 レ ベルで用 い る に は充分であ る が、 医薬品 と して用 い る ヒ ト B C D F を製造する に は不充分であ っ た。 ヒ ト B C D F を医薬 と して用い る ために は、 人に安全に投与する に足る高純度でか つ人体に有害な成分を含ま な い医薬原体を低コ ス ト で生産する 工業的生産を前提と し た実用的な精製工程を作り 上げる必要が め っ た o 一般に、 大腸菌を宿主 と し た組み替え D N A を用 い て生理活 性蛋白質を生産す る 際に天然型 と 一次構造が一部異な る 類縁体 や、 該蛋白質中の ジ ス ル フ ィ ド結合が天然型 と 異な る 結合の類 縁体が混入す る こ と が知 ら れて い る 。 ま た、 イ ン タ ー ロ イ キ ン 2 やイ ン タ ー フ ェ ロ ン等で知 ら れて い る よ う に、 本来モ ノ マ ー (単量体） で存在す る はずの該蛋白質が非共有結合で分子間会 合 し た高分子量体が混入す る 場合 も あ る。 ま た、 精製過程で 目 的の該蛋白質が切断又は部分修飾さ れた り 、 一次構造が変異 し た り 、 立体構造が変化 し た り し て類縁体が生 じ る 場合 も あ る 。 こ れ ら類縁体 は いずれ も 人体に繰 り 返 し投与 さ れた場合、 不要 な抗体を生 じ て有害な免疫反応を引 き起 こ す危険性があ る 。 ヒ ト B C D F の会合体につ い て は、 後述の如 く 、 本発明者 ら がそ の存在を初め て明 ら か に し たわ けで、 従 っ てそ の精製方法 は従 来知 ら れて い な か っ た。

更に は、 前述の類縁体の 除去方法 と 合わせて、

( 1 ) 生理活性が低下す る お そ れの あ る ヒ ト B C D F の変性 物質の生成を最小限 に抑え、

( 2 ) 人体に有害な危険の お そ れがあ る 微生物由来の 蛋 白 質 を除去 し 、 ( 3 ) 微生物由来又は工程中に混入する発熱性物質 （ェ ン ド ト キ シ ン等） を除去 し た高純度の ヒ ト B C D F、

を取得 し う る精製法の組み合わせは開示さ れていなかっ た。

ま た、 ヒ ト B C D Fの よ う な リ ンホカイ ン は本来生体内で数 p g / m 1 程度の濃度で作用 してい る ものであ るが、 リ ンホカ ィ ンを医薬原料と して取 り 扱 う 場合は数 ingZ ml程度の高濃度で 取り 扱う こ とが望ま し い。 そ の理由は、 1 ) 高い投与の毒性試 IIが行な う こ とができ る ので、 リ ンホカイ ン の安全性評価がよ り 精度の高い も の と な る こ と、 2 ) 医薬原体か ら医薬製剤を作 る際、 種々の添加剤を加えて も適正の投与 «度に調製でき る の で、 医薬製剤を作り やすい こ と、 3 ) 精製工程のスケールを小 さ く する こ とができ る ので、 操作 · 装置を簡略化でき る こ と等 の利点があ る か ら であ る。 し か し なが ら、 一般に リ ンホカ イ ン は疎水性が高 く 、 高濃度にな る と会合 · 沈殿ま たは変性する危 険性が増加する ので、 本発明の ヒ ト B C D Fの精製において も 、 細胞培養等の希薄濃度条件下での精製と異な り 、 独自の精製条 件を検討し な ければな ら ない と い う 問題があ っ た。

(発明の開示）

本発明の課題は、 産生宿主由来の不純物蛋白質ゃェ ン ド ト キ シ ン 、 精製工程由来の混入不純物、 及び ヒ ト B C D F 由来の一 次構造の異な る 変異体や会合体 （高分子量体） 等の類縁体を含 ま な い高純度かつ安定な高濃度の ヒ ト B C D F 溶液を工業的 ス ケ ールで効率的生産が可能な精製方法を提供す る こ と に あ る 。

本発明者は、 前記課題を解決す る為に鋭意検討を重ね た結果 ヒ ト B C D F 遺伝子を組み込んだ大腸菌を大量培養 し て得た菌 体中の ヒ 卜 B C D F を精製す る に際 し、 （ 1 ) 高濃度の蛋白質 変性剤を用 い た可溶化 （抽出） 並びに酸化反応及び リ フ ォ ー ル デイ ン グ工程、 （ 2 ) イ オ ン交換ク ロ マ ト グラ フ ィ ー及び逆相 高速液体 ク ロ マ ト グ ラ フ ィ ー （以下、 逆相 H P L C と 略す） を 用 い た菌体蛋白質、 エ ン ド ト キ シ ン 、 ヒ ト B C D F の一次構造 変異体等の除去工程、 （ 3 ) ゲル《通法を用 い た蛋白質変性剤 有機溶媒、 ヒ ト B C D F の会合体の除去工程を駆使す る こ と に よ り 、 ヒ ト に投与可能な高純度かつ工業的に ス ケ ー ルア ッ プ可 能な ヒ ト B C D F の精製法を見い 出 し、 本発明を完成さ せ る に 至 っ た。

すなわ ち 、 本発明 は、

( 1 ) ヒ ト B C D F 遗伝子を組み込んだ微生物を培養 し て得 ら れる ヒ ト B C D F 培養物か ら ヒ ト B C D F を可溶化 し た還元型 ヒ ト B C D F可溶化溶液を酸化反応及び リ フ ォ ールディ ング処 理に付する に際し、 該還元型 ヒ ト B C D F可溶化溶液を用いて 酸化反応せ しめた後、 グァニ ジ ン塩酸塩濃度を 4 〜 7 M と し た 酸化型 ヒ ト B C D F溶液をゲル »通ク ロ マ ト処理に付する こ と を特豢とする ヒ ト B C D F の精製法、 及び、

( 2 ) 有機溶媒を含有する ヒ ト B C D F溶液か らゲル ¾遏ク ロ マ ト カ ラ ムを用いて展開溶媒を通液せ しめ る こ と によ り 該有機 溶媒を除去する に際 し、 （ i ) ゲル瀘遏ク ロマ ト カ ラ ム に有機 溶媒を含む展開溶媒で接液 し た後、 （ i i ) 該 ヒ ト B C D F 溶 液をフ ィ ー ド し、 耪いて、 （ i i i ) 展開溶媒の有機溶媒 Sを ステ ッ プワイ ズグラ ジェ ン ト又は リ ニア グラ ジェ ン ト プロ グラ ムによ り （ i ) で用いた展開溶媒の有機溶媒量よ り 滅少せ し め て通液する こ と によ り 、 有機溶媒を除去 した ヒ ト B C D F 水溶 液を取得する こ とを特徵とする ヒ ト B C D F の精製法に関する も のであ る。

更には、 （ 3 ) ヒ ト B C D F 遺伝子を組み込んだ微生物を培 養 して得 られる ヒ ト B C D F 培養物か ら の ヒ ト B C D F を精製 する方法において、

( i ) ヒ ト B C D F培養物か ら ヒ ト B C D F を可溶化 した還元 型 ヒ ト B C D F 可溶化溶液を用 い て酸化反応せ し め た後、 グァ 二 ジ ン塩酸塩濃度を 4 . 0 〜 7 . 0 M と し た酸化型 ヒ ト B C D F 溶液をゲル滅通ク ロ マ ト 処理に付す る 工程

( i i ) ヒ ト B C D F溶液を多糖、 デキ ス ト ラ ン又 は合成ポ リ マ ー をベー ス と し たイ オ ン交換体を リ ガ ン ド に有す る ゲル担体 ク ロ マ ト カ ラ ム に フ ィ ー ド し た後、 溶離液の塩濃度を変化せ し め て ヒ ト B C D F を精製す る イ オ ン交換 ク ロ マ ト 処理工程、

( i i i ) ヒ ト B C D F 溶液を、 炭素数が 1 〜 8 個の ア ルキ ル 基を リ ガ ン ド と し かつ ポ ア サ イ ズが 2 5 0 オ ン グス ト ロ ー ム以 上であ る逆相 ク ロ マ ト 担体を充填 し た カ ラ ム に接触せ し め て、 ヒ ト B C D F を精製す る 逆相 ク ロ マ ト 処理工程、

( i V ) ゲル滅通 ク ロ マ ト カ ラ ム に初め に有機溶媒を含む展開 溶媒で接液 し た後、 ヒ ト B C D F 溶液を フ ィ ー ド し、 続い て、 展開溶媒の有機溶媒量を ス テ ッ プ ワ イ ズ グ ラ ジェ ン ト 又は リ ニ ア グ ラ ジェ ン ト プ ロ グラ ム に よ り 、 ゲル »過 ク ロ マ ト カ ラ ム に 初め に接液 し た有機溶媒を含む展開溶媒の有機溶媒量よ り 減少 せ し め て通液す る こ と に よ り 、 有機溶媒を除去 し た ヒ ト B C D F 水溶液を取得す る ゲル »過 ク ロ マ ト 処理工程、

を含む こ と を特徵 と す る ヒ ト B C D F の精製法に関す る 。 以下、 本発明を詳細に説明する。

本発明で用 い る原料は、 ヒ ト B C D F ¾伝子を組み込んだ微 生物、 例えば、 大腸菌等を培養 して得 られる ヒ ト B C D F培養 物であ る。 ヒ ト B C D F培養物中の ヒ 卜 B C D F は、 通常、 大 部分が教生物中に不溶性顆粒と して存在する ので、 こ れを原料 と して も よ い。 こ れ らの ヒ ト B C D F は大部分、 構成する 4 つ の シ ス テ ィ ン （ ⁴⁴、 ⁵⁰、 ⁷³、 ⁸³ C y s ) が ジ ス ル フ ィ ド結合を していない遊離のチオール構造であ る還元型と して存在する。 次に、 ヒ ト B C D F不溶性顆粒か ら ヒ ト B C D F を可溶化す る工程について述べる。 常法に従い、 ヒ ト B C D F 不溶性顆粒 は、 必要に応 じ蒸留水に懸酒後、 比较的低回転で逮心分離 し、 付着 し た不純物を洗浄除去する。 得られたペ レ ツ ト を低濃度の E D T A溶液 （ 1 〜 ： L O m M) に懸濁後、 ヒ 卜 B C D F の最終 濃度が 1 . 0 〜 3 . O mgZ mlにな る よ う に、 蛋白質変性剤であ る グァニ ジ ン塩酸塩の高濃度溶液 （例えば 6 M ) で還元型 ヒ ト B C D F を可溶化する。 蛋白質変性剤と して必要に よ り 尿素等 を含有 していて も よ い。 1 0 〜 3 5 で、 好ま し く は 2 0 〜 2 8 で に て、 1 〜 4 時間ゆ っ く り と攙拌す る が、 そ の 際、 p H は 5 . 5 〜 6 . 0 以下に保ち、 分子間ジ ス ル フ イ ド結合形成に よ る ァ グ リ ゲー シ ヨ ン （分子間凝集） を引 き 起 こ さ な い よ う にす る 。 通常、 天然型の ヒ ト B C D F は分子内 に 4 個の シ ス テ ィ ン ( 44、 50、 73、 83 _{C y s )} を有 し 、 2 個の分子内 ジ ス ル フ ィ ド 結合 （ ⁴⁴ C y s — C y s 、 ⁷³ C y s — ⁸³ C y s ) を形成 し て い る 。 上述の通 り 、 可溶化 し た段階で は ヒ ト B C D F は殆 どの シ ス テ ィ ン は遊離の チ .オ ー ル構造であ る 為、 次の酸化反応及び リ フ ォ ー ルディ ン グ処理を行な う 必要があ る 。

酸化反応及び リ フ ォ ールデ ィ ン グ処理工程につ いて記述す る にあ た り 、 本処理工程の特徼につ いて記載す る 。

上述の如 く 、 天然型 ヒ ト B C D F で は分子内 ジ ス ル フ ィ ド結 合を有す る が、 大腸菌等の徼生物内で発現 し蓄積 し た ヒ ト

B C D F は還元状態 （チオ ー ル型） かつ不溶性凝集体

( i n c l u s i o n o d y ) を形成す る 。 従 っ て、 天然 型の ヒ ト B C D F に再生す る に は、 分子内 ジ ス ル フ ィ ド結合を 形成さ せ る と 同時に天然型の立体構造 （未変性の高次構造） に す る 必要があ る 。 本発明の酸化反応及び リ フ ォ ールデ ィ ン グ処 理方法は、 先ず ヒ ト B C D F を高濃度の グァ ニ ジ ン塩酸塩溶液 中で、 完全変性状態 （ ヒ ト B C D F は還元伏態で あ る ） で酸化 反応 さ せて ヒ ト B C D F 単量体の分子内 ジ ス ル フ ィ ド結合を完 全形成せ し めて酸化型 ヒ ト B C D F に し、 続いて、 特定の グァ ニ ジ ン埴酸埴.濃.度に保っ てグァニ ジ ン塩酸塩等を晚塩する こ と によ り 、 天然型ヒ ト B C D F の立体構造を形成する こ と に特徼 があ る。 本発明の処理工程は、 従来の酸化反応及び リ フ ォ ー ル ディ ン グ工程に比べ短時間であ り 、 かつ反応進行中の沈殿に よ る ヒ ト B C D F の収率低下を防 ぐ と共に、 希釈等によ る液 S增 大を抑え る こ とができ る点でも優れてい る。

以下、 酸化反応工程について具体的に記述する。 可溶化した ヒ ト B C D F 溶液を必要に応 じ グァ ニ ジ ン埴酸埴溶液で希釈 し て も よ いが、 グァニ ジ ン塩酸塩濃度 は 4 〜 7 M好ま し く は 5 . 0 〜 6 . 0 Mに靄整すればよ い。 グァニ ジ ン塩酸塩濃度を 4 M以下 にす る と、 ヒ ト B C D F の回収率が低下す る ので好 ま し く な い。 なお、 ヒ ト B C D F の 濃度は溶解 し ていれば特 に限定さ れないが、 0 . 1 〜 2 . O mg m l好ま し く は 0 . 5 〜 0 . 8 Z m Iがよい。 更に、 p H条件は、 チオール基の解離を 可能 に す る 為 に、 塩基性物質、 例 え ば水酸化 ナ ト リ ウ ム 水 溶液等を添加 して、 p Hを 6 . 5 〜 9 . 0 好ま し く は 8 . 0 〜 8 . 6 に篛整するのがよい。 こ う して、 ゆ っ く り 攪拌しなが ら 1 0 〜 3 5 で好ま し く は 2 0 〜 2 8 での温度で、 3 〜 2 4 時間 好 ま し く は 1 0 〜 1 5 時間、 ヒ ト B C D F の酸化反応を行な い 天然型の分子内 ジ ス ル フ ィ ド結合を完全に形成せ し め酸化型 ヒ ト B C D F にす る。 なお、 ¹³ C — N M R を利用 し た研究か ら 、 部分 ¾元型 ヒ ト B C D F (例え ば、 ⁷³ C y s と ⁸³ C y s が結合 し 、 ^{4 q} C y s と ^{5 Q} C y s は未結合状態に あ る も の） は p H 6 . 5 以上で は極めて短時間の う ち に分子内 ジ ス ル フ ィ ド結合 （酸 化） さ れ る が、 p H 5 以下で は比較的安定に存在す る も の の や は り ゆ っ く り と 分子内 ジ ス ル フ ィ ド結合 し 、 天然型の分子内 ジ ス ル フ ィ ド綰合 （酸化型 ヒ ト B C D F ) に な る こ と がわかる 。

更に、 天然型の ジ ス ル フ ィ ド結合形成を よ り 短時間で達成す る 為に 、 還元型及び酸化型 ダル タ チオ ン を適当 な組み合わせ (各 0 . 0 0 2 〜 0 . 5 m M ) で添加す る こ と も で き る 。 但 し ダル タ チオ ン置が多 い場合に は （具体的 に は、 還元型グルタ チ オ ン の場合は I m M以上、 酸化型 ダル タ チ オ ン の場合は 0 . 1 m M以上） 、 ヒ ト B C D F と ダル タ チ オ ン と が直接 ジ ス ルフ ィ ド結合 し た混合 ジ ス ルフ ィ ドを形成す る こ と があ る の で好ま し く な い。 な お、 ヒ ト B C D F の分子内 ジ ス ル フ ィ ド結合の進行 は逆相 H P L C (例えば、 バイ ダ ッ ク 社製 「 2 1 4 T P 5 4 」 等） の ク ロ マ ト グラ ム の保持時間の変化に よ り 確認す る こ と が でき る。 こ う して得 られる粗精製の B C D F 溶液は 3〜 1 0 で の低温条件下で少な く と も 1 週間は安定であ る 。

次に、. 前述の工程で用いたグァニ ジ ン塩酸塩を主に除去 しつ つ、 ヒ ト B C D F を リ フ ォ ールディ ン グす る工程が必要であ る。 本工程では液体ク ロマ ト処理、 特にゲル «過ク ロ マ ト処理が有 効であ る。 使用する ク ロマ ト担体と しては、 多糖、 デキス ト ラ ン も し く はそれ らの化学修飾体、 ま たは合成ポ リ マ ー体で、 分 画分子量が 5 0 0 0 以下であればよ い。 具体的には 「セ フ ア デ ッ ク ス G — 2 5 J ( フ ア ルマ シ ア （株） ） 、 「セ ル 口 フ ァ イ ン G H — 2 5 」 （チ ッ ソ （株） ） 、 「 ト ヨノ、。—ル H W— 4 0」 (東ソ一 （株） ） 、 「セルロ ース C W— 3 5 」 （東ソ一 （株） ） 等が用い られるが、 これら に哏定さ れる も のではない。 ク ロ マ ト担体は、 カ ラ ム充填 し、 緩街液で平衡化さ せる。 平衡化に用 い る緩街液は次工程を考盧 し、 5〜 5 O m Mの酔酸ま たはギ酸 緩銜液 （ p H 4 . 0〜 5 . 8 ) 、 そのカ ウ ン タ 一力チオ ン と し て ナ ト リ ウ ム イ オ ン、 カ リ ウ ム イ オ ン 、 ア ン モ ニ ゥ ム イ オ ン等 が使用可能であ る。 前工程で得た ヒ ト B C D F 溶液を該緩衝液 で平衡化 し た担体 l m l あた り 0 . 1 5〜 0 . 2 4 ml負荷後、 該緩衝液で展開溶離 し、 ヒ 卜 B C D F 画分を得る 。 こ の際、 ヒ ト B C D F 溶液中の き ょ う 雑成分 （菌体由来蛋白質、 糖蛋白 質、 糖脂質等） も 併せて除去す る 為に は、 ク ロ マ ト 担体を選択 し 、 かつ平衡化緩街液の 度や P H を コ ン ト ロ ー ルす る こ と に よ り 、 よ り 高い精製効果を与え る こ と が可能で あ る 。 例えば、 ク ロ マ ト 担体 と し て 「セ フ ア デ ッ ク ス G — 2 5 」 、 平衡化緩衝 液に p H 4 . 7〜 5 . 3 好ま し く は 4 . 9 〜 5 . 1 で 5〜 1 5 m M好 ま し く は 8〜 1 O m Mの酢酸ナ ト リ ゥ ム緩衝液を用 い る と 、 き ょ う 雑成分は該ク ロ マ ト 担体に比較的強い親和性を示 し ヒ ト B C D F 画分 と グァニ ジ ン埴酸埴及び き よ う 雑成分は よ り 良 く 分離 さ れ る 。

こ う し て、 該ゲル滅遢ク ロ マ ト 工程で得 ら れ る ヒ ト B C D F は、 天然型 B C D F の分子内 ジ ス ル フ ィ ド結合及び立体構造を 有す る も の であ り 、 その蛋白質純度 は、 分析用逆相 H P L C及 び S D S — P A G E の分析か ら 少な く と も 8 0 %以上、 通常は 9 0 %以上であ る 。 ま た、 該画分は沈殿物を ほ と ん ど含ま な い 清澄溶液で、 3〜 1 0 での低温下で無菌的 に保存す る こ と で、 少な く と も 1 0 日 間は安定であ る 。 な お、 酸化反応及び リ フ ォ 一ル デ ィ ン グ処理工程の反応の進行 は、 シ ス テ ィ ン や フ エ ニル ァ ラ ニ ン 等の ァ ミ ノ 酸の カ ルボニル炭素を ¹³ C で選択的に標識 し た ヒ ト B C D F の ¹³ C — N M Rを測定す る こ と に よ り 確認で き る 。

こ う し て得 ら れる ヒ ト B C D F溶液か ら 医薬グ レ ー ドの ヒ ト B C D F を諝製する為に は、 更にイ オ ン交換ク ロ マ ト グラ フ ィ 一及び逆相 H P L C に よ る精製を行 う こ と が必須であ り 、 こ れ ら に よ り 更に残存する き よ う 雜成分、 特に截生物菌体由来蛋白 質、 エ ン ド ト キ シ ン及び ヒ ト B C D F の 一次構造変異体を除去 する こ と がで き る。 こ こ でい ぅ ヒ ト B C D F の一次構造変異体 と はべプチ ド結合切断物や構成ア ミ ノ 酸の 酸化体等を さ し、 通 常培養及び可溶化の段階で生成 し てい る も の と 推定さ れる 。

イ オ ン交換ク ロ マ ト グラ フ ィ ー に よ る 処理を行 う 場合は、 特 に含有さ れる き よ う 雑成分及びェ ン ド ト キ シ ン の殆どを除去す る こ と がで き る 。 こ こ で用 い る イ オ ン交換体は、 陽イ オ ン交換 ク ロ マ ト 担体及び陰イ オ ン交換ク ロ マ 卜 担体の いずれで も よ い。

陽イ オ ン交換ク ロ マ ト担体を用 い る 場合は、 多糖、 デキス 卜 ラ ン 、 合成ポ リ マ ー等をベー ス と し た弱酸性又 は強酸性陽ィ ォ ン交換体を リ ガ ン ドに有する ゲルであ れば何で も よ く 、 例えば、 「 C Mセ フ ァ ロ ー ス F F J ( フ ア ル マ シ ア （株） ） 、 「 C Mセ ル ロ フ ァ イ ン C一 5 0 0 」 （チ 、ッ ソ （株） ） 等があ る 。 こ れを、 カ ラ ム に充填 し、 酢酸又はギ酸緩衝液 （ P H 4 . 5 〜 5 . 5 ) で平衡化 し て お き 、 ヒ ト B C D F 溶液を負荷 （ ク ロ マ ト 担体 l mlあ た り 蛋 白 質 1 〜 ： L O mg) し て吸着せ し め た後、 充分 に 平衡化緩衝液で洗浄す る 。 そ の 後、 平衡化緩衝液に塩類、 例 え ば塩化ナ ト リ ウ ム、 酢酸ナ ト リ ウ ム、 ギ酸ナ ト リ ウ ム も し く は そ れ ら の ナ ト リ ゥ ム塩の かわ り に 力 リ ゥ ム埴ま た は ァ ン モニ ゥ ム埴を グラ ジェ ン ト （濃度勾配） 変化をつ けて添加 し 、 ヒ ト B C D F を溶 出す る 。 例 え ば、 1 0 m M酔酸ナ ト リ ウ ム 平衡 化緩衝液 （ p H 5 . 0 ) 及 び 0 . 5 M齚酸ナ ト リ ウ ム 緩衝液 ( P H 5 . 5 ) を使用 し て溶出す.る 。 その際、 後者の割合を順 次高め る （ リ ニア グラ ジ ェ ン ト 溶出） 。 な お、 溶出液の総使用 量は、 カ ラ ム容量の 1 0 倍程度 と すればよ い。 溶出液 と し て用 い る 齚酸又はギ酸緩衝液の p H は、 平衡化緩衝液よ り 0 . 5 〜 1 . 0 上昇 さ せ て も よ い 。 こ う し て得 ら れ る ヒ ト B C D F は 天然型 ヒ ト B C D F であ り 、 該画分の蛋白質純度は少な く と も 9 5 %以上、 通常 9 8 %以上で、 ェ ン ド ト キ シ ン含量は蛋白質 l mgあ た り 0 ， 5 エ ン ド ト キ シ ン ユニ ッ ト （ E U ) 以下であ る ， —方、 陰イ オ ン交換 ク ロ マ ト 担体を用 い る 場合は、 多糖、 デ キ ス ト ラ ン、 合成ポ リ マ ー等を ベ ー ス と し た弱塩基性ま た は強 塩基性陰イ オ ン交換体を リ ガ ン ド に有す る ゲルであ れば何で も よ く 、 例えば、 「 D E A E セ フ ァ ロ ー ス F F J ( フ ア ル マ シ ア (株） ） 、 「 D E A E セ ル口 フ ァ イ ン A — 5 0 0 」 （チ ッ ソ (株） ） 等が用 い ら れ る 。 こ れを、 カ ラ ム に 充填 し 、 p H 7 . 5 〜 ； L 0 . 0 で緩街作用を有する緩街液 （例えば、 ト リ ス ジエタ ノ ールア ミ ン等） で予め平衡化 してお き、 ヒ ト B C D F 溶液を負荷 （ク ロ マ ト 担体 1 mlあた り 蛋白質 1 〜 1 0 mg) し た 後、 充分に平衡化緩衝液で洗浄する。

こ の 際、 該 ヒ ト B C D F 溶液は前述の変性剤 を含 ま な い ヒ ト B C D F溶液に該平銜化锾街液を添加 し、 p H を 8 . 5 〜 9 . 5 に謁整した も のがよ り 好ま しい。

その後、 平衡化緩街液に塩類、 例えば埴化ナ ト リ ゥ ム又は塩 化カ リ ウム等の塩化物をグラ ジェ ン ト変化をつ けて添加 し、 ヒ ト B C D F を溶出する 。 例えば、 5 O m M ト リ ス ー埴酸埴平衡 化緩街液 （ P H 8 . 5 ) 及び 0 . 5 m M塩化ナ ト リ ウ ム水溶液 を使用 して溶出する。 その際、 後者の割合を順次高め る （ リ ニ アグラ ジユ ン ト 溶出） 。 なお、 溶出液の総使用量は、 カ ラ ム容 量の 1 0 倍程度とす 'ればよ い。 得 られる ヒ ト B C D F は も ち ろ ん天然型 ヒ ト B C D F であ り 、 該画分の蛋白質純度は 9 0 %以 上、 エ ン ド ト キ シ ン含量は蛋白質 l mgあた り 5 0 E IJ以下であ る o 上記の陽イ オ ン又 は陰イ オ ン交換 ク ロ マ ト 処理に よ り 得 ら れ る ヒ ト B C D F 溶液は、 3 〜 1 0 での低温下で無菌的 に保存す る こ と で少な く と も 1 ヶ月 間 は安定であ る 。

次に、 逆相 H P L C に よ る 処理は、 残存す る き よ う 雑物、 ェ ン ド ト キ シ ン及び ヒ ト B C D F—次構造変異体を除去す る の に 適す る 。 逆相 H P L C ク ロ マ ト 担体 と し て は、 2 5 0 オ ン グス ト ロ ー ム以上の ポ ア サ イ ズを有す る シ リ 力 ゲル ま た は合成ポ リ マ ーをベー ス と し 、 炭素数が 1 〜 8 個の ア ルキル基等を リ ガ ン ド と し て有す る も の が用 い ら れる 。 例えば、 Γ 2 1 4 Τ Ρ 1 0 2 2 」 （バイ ダ ッ ク 社） 、 「 Y M C A P — 8 0 3 」 （山村化 学研究所 （株） ） 等があ る が、 こ れ ら に限定 さ れ る も の で は な い o

溶出液 と し て、 イ オ ン ペ ア試薬であ る 0 . 0 1 〜 ； L . 0 %濃 度の ト リ フ ルォ ロ 酢酸、 ヘ プタ フ ルォ ロ 酪酸、 酢酸、 ギ酸及び それ ら の ナ ト リ ウ ム塩を含み、 かつ p H 2 . 0 〜 5 . 5 に調整 し た水溶液 と 該イ オ ン ペ ア試薬 0 . 0 1 〜 1 . 0 %を含む ァ セ ト ニ ト リ ル、 エ タ ノ ー ル、 プ ロパ ノ ール等の有機溶媒の組み合 わせが好ま し い。 ま た、 供 さ れる ヒ ト B C D F 溶液は、 適宜、 蒸留水等を添加す る こ と に よ り 、 該 ヒ ト B C D F 溶液 に含有す る塩濃度を充分に低下さ せて最終埴 S度を 1 0 O m M以下に し かつ該イオ ンペア試薬を添加 して p Hを 2 . 0 〜 5 . 5 好ま し く は 3 . 0 〜 3 . 5 に調整する のがよ い。 該ヒ ト B C D F 溶液 をク ロマ ト担体 1 B1あた り 蛋白質 l 〜 4 mg負荷した後、 溶出液 のグラ ジェン ト変化をつ けて有機溶媒濃度をゆ る やかに上昇さ せ、 ヒ ト B C D F を単離精製する。 き ょ う 雑物、 エ ン ド ト キ シ ン、 一次構造変異体等の不純物 と ヒ ト B C D F の分離効率は、 特にイ オ ンペア試薬の澳度と p H によ り 大き く 影響される為、 これら不純物の含有量に合わせて至適条件を選択する と よ い。

こ う して得られる ヒ ト B C D F は、 前記イ オ ン交換ク ロ マ 卜 処理と組み合わせた場合、 蛋白質純度は 9 9 %以上 （ S D S — P A G E分析では き ょ う 雑物は検出 されない） 、 エ ン ド ト キ シ ン含量は蛋白質 I mgあた り 0 . 1 E U以下とな る。 ま た、 得 ら れた ヒ ト B C D F は、 3 〜 1 0 での低温下で無菌的に保存す る こ とで少な く と も 1 週間は安定であ る。

さ て、 逆相 H P L C 工程で得 ら れる ヒ ト B C D F 画分に は 有機溶媒を含有 し て い る 為、 こ れを除去する工程が必要で あ る 。 し か し なが ら 、 単純 に有機溶媒を除去 し たの では、 ヒ ト B C D F の分子間会合が進んで、 ヒ ト B C D F会合体にな り 易 く 、 ヒ ト B C D F モ ノ マ ー の回収率が大 き く 低下す る 場合があ る こ と を本発明者 ら は見出 し た。 該 ヒ ト B C D F 会合体 は 、 G P C - L A L L S ¾ ( A. C. Ou a n o, J o u r n a l o f Po l yme r S c i e n c e, 12, 1151 - 1162, 1974) に よ り 主に ヒ ト B C D F の二 量体で あ る こ と がわか り 、 主に疎水性相互作用 に基づ く 非共有 結合に よ り 会合 し てい る と推定 さ れ る 。

逆 相 H P L C 工程 で 得 ら れ る ヒ ト B C D F 画 分 の ヒ ト B C D F は、 邋当量の有機溶媒の添加に よ り 可逆的に会合 · 解 離をす る こ と か ら 、 有機溶媒の除去に 際 し て は特段の手法が要 求 され る 。 有機溶媒除去方法 と し て は、 通常、 ゲル »過ク ロ マ ト 法、 膜透析法、 限外濾過法、 減圧濃縮法、 凍結乾燥法及び冷 却相分離法 （特開平 1 一 8 3 0 9 4 号公報参照） 等が考え ら れ る 。 し か し 、 減圧濃箱法や凍結乾燥法で は、 該 ヒ ト B C D F 会 合体が 6 0 〜 8 0 % も生成す る の で適用 で き な い。

本発明 は、 好ま し い除去方法 と し て、 ゲル «過 ク ロ マ ト 法に を採用 し た も のであ'り 、 必要に応 じ て前記の方法 と 組み合わせ て も も ち ろ んか ま わな い。 本工程で用 い る ゲル ¾過 ク ロ マ ト 担 体 は、 前述の リ フ ォ ールデ ィ ン グ処理工程で用 い た ク ロ マ ト 担 体 と 同様の も ので よ い。 該担体を カ ラ ム充填 し 、 こ れに有機溶 媒を含む ヒ ト B C D F溶液を負荷し た後、 有機溶媒を含む展開 溶媒を用い、 かつ展開溶媒中の有機溶媒量を段階的 （ス テ ッ プ ワイ ズ） に又は経時的 （ リ ニア） に減少させて通液 し、 当初含 有した有機溶媒を含まない ヒ ト B C D F溶液を分取す る。 すな わち、 本発明は、 有機溶媒を含む ヒ ト B C D F 溶液か ら有機溶 媒を徐々 に除 く こ と で ヒ ト B C D F会合体の生成を最小限に抑 える こ とができ る 。

以下に具体的方法を記述する。

カ ラ ム充填 し たゲル »通ク ロマ ト担体を予めァセ ト ニ ト リ ル - エタ ノ ールま たはプロパノ ール等の有機溶媒を 5 〜 5 0 %、 好 ま し く は 7 〜 1 5 %含む 5 〜 5 O m Mの醉酸等の有機酸又はそ の塩の緩銜液で平衡化 し てお き、 こ れに有機溶媒を含む ヒ ト B C D F 溶液をゲル »通ク ロ マ ト 担体 l mlあ た り 0 . 1 5 〜 0 . 2 4 ml負荷 し 、 該緩衝液を展開溶媒 と し て逋液 し、 ヒ ト B C D F 画分を分取する 。 続いて、 有機溶媒を含ま な い 3 〜 2 0 m Mの酢酸、 ギ酸又は ク ェ ン酸等の有機酸の アルカ リ 金属 塩等の、 p H 3 . 5 〜 7 . 5 好ま し く は 4 . 0 〜 5 . 5 の緩衝 液で前記と 同様のゲル »過ク ロ マ ト担体カ ラ ム を平衡化 し、 前 述のゲル « [遏ク ロ マ ト処理で得られた ヒ B C D F 画分を該担 体 1 mlあ た り 0 . 1 5 〜 0 . 2 4 ml負荷 し、 該緩衝液で展開す る 。

こ う し て、 ス テ ッ プ ワ イ ズプ ロ グラ ム で 2 段階の ゲル慮過 ク 口 マ ト 処理で得 ら れ る ヒ 卜 B C D F 画分は、 逆相 H P L C 工程 の ヒ ト B C D F 画分 と 同様の蛋白質純度を有 し 、 ヒ ト B C D F 会合体 の含有量 は 1 0 %以下、 通常 は 5 %以下で あ り 、 3 〜 1 0 での低温下で無菌的 に保存す る こ と で少な く と も 1 週間 は 安定であ る 。

し か し な が ら 、 直接、 有機溶媒を含 ま な い 展開溶媒 （緩衝 液） でゲル »遏ク ロ マ ト 担体を平衡化 し、 有機溶媒を含む ヒ ト

B C D F 溶液を フ ィ 一 ド後、 該展開溶媒だけ を通液す る ゲル濂 通 ク ロ マ ト 処理で は、 展開溶媒の p H、 有機酸塩の種類に 関係 な く ヒ ト B C D F の 4 0 %以上が会合す る ので本発明の 目 的 に は適さ な い。 ただ し 、 1 段階の ゲル »過ク ロ マ ト 処理で も 、 予 めゲル濂通 ク ロ マ ト 担体を前述の ァセ ト ニ ト リ ル、 エ タ ノ ー ル ま た は プ ロ パ ノ ー ル等の有機溶媒を含む有機酸又 は そ の塩の緩 衝液で平衡化 し た後、 展開溶媒中の有機溶媒量を ス テ ッ プ ワ イ ズグラ ジェ ン ト ま た は リ ニ ア グラ ジェ ン 卜 の プ ロ グ ラ ム で減少 さ せ る こ と に よ り ヒ ト B C D F の会合体生成 は有効に 防止で き る も の であ る 。 次に、 ヒ ト B C D F を更に濃縮 し たい場合、 及び Z又はゲル 爐遏法によ り有機溶媒除去 し た ヒ ト B C D F溶液の保存中等で 生成した若干量の ヒ ト B C D F分解物を除去したい場合は、 必 要に応じて、 11イ オ ン交換ク ロ マ 卜処理をする のが好ま し い。 すなわち、 多糖、 デキ ス ト ラ ン又は合成ポ リ マーをベース と し た弱酸性又は強酸性陽イ オ ン交換体を リ ガン ドに有する ゲル、 例えば、 「 C Mフ セ ア ロ ー ス F F」 （ フ ア ルマ シ ア （株） ） 、 「 C Mセ ル 口 フ ァ イ ン C 一 5 0 0 」 （ チ ヅ ソ （株） ） な どを カラ ムに充填 し、 こ れを 1 0 〜 2 5 m M好ま し く は 1 5 〜 2 0 m Mの醉酸、 ギ酸も し く は ク ェ ン酸のナ ト リ ウム埴又はカ リ ゥ ム塩を含有する緩街液 （ P H 4 . 0 〜 5 . 5 ) で平衡化 し、 前 工程で得た ヒ ト B C D F 画分を ク ロ マ ト担体 1 mlあた り 蛋白質 1 0 〜 3 0 の割合でカ ラ ム に負荷 し、 充分に平衡化緩衝液で 非吸着分を洗浄する。 その後、 平衡化緩衝液に塩化ナ ト リ ウ ム 等の塩類を 1 0 〜 5 0 O m M ま で経時的に添加せ し めて ヒ ト B C D F をグラ ジェ ン ト溶出する か、 p H 6 . 0 〜 6 . 7 好ま し く は p H 6 . 4 〜 6 . 6 に し た 5 〜 2 0 m M好ま し く は 8 〜 1 5 m Mの ク ェ ン酸ナ ト リ ウ ム緩衝液に、 3 0 〜 1 0 0 111 好 ま し く は 4 0 〜 6 O m Mにな る よ う に塩化ナ ト リ ウ ム等の塩を 含有 さ せた緩衝液へ一挙に変更 し て ヒ ト B C D F を溶出 さ せ る と よ い。 特に、 後者の溶出方法は、 ヒ ト B C D F 会合体を増加 さ せずに高濃度 ヒ ト B C D F 溶液を得 る の に有効であ る 。 そ し て ヒ ト B C D F は酸性条件下で切断 さ れやすい配列を有す る

( ^{1 0} A s p - ¹⁴¹ P r o ) が、 保存中 に こ の分解物が生成 し た場合は当該処理法に よ り 除去す る.こ と がで き る 。 こ う し て得 ら れ る ヒ ト B C D F純度は該分解物含量が低下す る こ と で向上 し 、 濃度は 3 〜 8 BigZ mlと 飛躍的 に上昇す る 。

と こ ろ で、 有機溶媒除去処理 し た ヒ ト B C D F 溶液又は続い て陽イ オ ン交換ク ロ マ ト 処理で濃縮さ れた ヒ ト B C D F 溶液は ヒ 卜 B C D F 会合体が若干量残存す る 場合があ る 。 そ の場合、 直ち にゲル »通ク ロ マ ト 処理 に付 し て、 該会合体を完全に分離 除去 し て も よ い 。 こ の 場合、 デ キ ス ト ラ ン 、 ァ ガ ロ ー ス の デ キ ス ト ラ ン 架棰体、 親水性 シ リ カ ゲ ル ま た は合成 ポ リ マ ー を ベ ー ス と す る ゲル »通担体 カ ラ ム 例 え ば、 「セ フ ァ タ リ ル S - 2 0 0 」 ， 「ス ー パ ー デ ッ ク ス 7 5 」 （以上、 フ ア ル マ シ ア

(株） ） 、 「 T S K G — 2 0 0 0 S W」 （東 ソ 一 （株） ） な どを用 い る 。 こ れに予め緩衝液 と し て 5 〜 1 0 0 m M好ま し く は 1 0 〜 2 O m Mの ク ェ ン酸、 リ ン酸 も し く は ク ェ ン酸 と リ ン 酸混合物のナ ト リ ゥ ム塩又は力 リ ゥム塩でかつ p Hを 5 〜 8好 ま し く は 6 . 0 〜 7 . 0 に謂製 し た も の を用 い て平衡化 し て お き 、 有機溶媒除去処理又は次の陽イ オ ン交換 ク ロ マ ト処理 で得た ヒ ト B C D F溶液をゲル滅通担体 l mlあ た り 0 . 0 1 〜 0 . 0 5 ml負荷 した後、 該平衡化緩街液で展開する こ と によ り . ヒ ト B C D F会合体と分離された純粋な ヒ ト B C D F モ ノ マ ー を得る こ とがでる。 なお、 ヒ ト B C D F は疎水性が高 く 、 ゲル tt通担体と親和性を有する こ とが多いの で、 例えば浸透圧の諝 整を 目的と して埴化ナ ト リ ウ ム等の塩を添加する場合は、 当該 工程の後に行な う のが好ま しい。

こ う して、 ヒ ト B C D F遺伝子を組み込んだ後生物を培養 し て得 ら れる ヒ ト B C D F培養物か らの ヒ ト B C D Fを精製する に際 し、

( i ) ヒ ト B C D F可溶化溶液の酸化反応及び リ フ ォ ールデ ィ ン グ処理工程、

( i i ) イ オ ン交換ク ロ マ ト処理工程かつ逆相 H P L C工程、 ( i i i ) ゲル滅遏ク ロ マ ト によ る有機溶媒除去工程、 を組み 合わせて得 ら れる ヒ ト B C D F 溶液 （濃度は 0 . 1 〜 5 ig/ il) は、 銀染色法を用い る S D S — P A G E にてき ょ う 雑成分 由 来バ ン ドが検出 さ れず、 逆相 H P L C 、 イ オ ン 交換 H P L C 及びゲル «過 H P L C にて単一 ピ ー ク を示 し 、 ¹³ C — N M R等か ら 、 天然型 ヒ ト B C D F であ る こ と がわ か る 。 又、 微生物 （大腸菌等） 由来蛋白質又は そ の部分精製物を抗原 と し て 常 法 に よ り 調 製 し た ポ リ ク ロ ー ナ ル 抗大 腸 菌 蛋 白 質抗体 等 を 用 い た ウ ェ ス タ ン ブ ロ ッ テ イ ン グ ま た は 、 該抗体を 用 い た酵素免疫測定法 （ E L I S A ) に よ る 測定に お い て も 該 ヒ ト B C D F 溶液中の微生物由来蛋白質は数 p p m以下であ る 。 更 に、 エ ン ド ト キ シ ン含量は ヒ ト B C D F l mgあ た り 0 . 1 E U 以下 （通常は 0 . 0 1 E U以下） であ り 、 以上の 品質純度 は本 発明の精製法に よ り 得 ら れ る ヒ ト B C D F が治療を 目 的 と す る 医薬品製剤の原料 と し て使用可能であ る こ と を示す も のであ る 本発明の方法で得 ら れた ヒ ト B C D F 溶液は直ち に ま た は凍結 や低温保存を経て し か る べ き 製剤化工程を経て、 安定な製剤 と す る こ と がで き る 。

(図面の簡単な説明）

図 1 は 、 ヒ ト B C D F可溶化後、 ジ ス ル フ ィ ド結合が還元状 態に あ る ヒ ト B C D F の逆相 H P L C 分析の ク ロ マ ト グ ラ ム を 示す。

図 2 は、 リ フ ォ ー ルデイ ン グ後の正 し い分子内 ジ ス ル フ ィ ド 結合を形成 し た天然型 ヒ ト B C D F の逆相 H P L C分析の ク ロ マ ト グラ ムを示す。

図 3 は、 濃縮された ヒ ト B C D F溶液を精製する ゲル «遏ク ロ マ ト工程の ク ロ マ ト グラ ムを示す。

図 4 は、 精製 ヒ ト B C D F の逆相 H P L C ク ロ マ ト グラ ムを 示す。

図 5 は、 精製 ヒ ト B C D F のイオ ン交換 H P L C ク ロ マ ト グ ラ ムを示す。

図 6 は、 精製 ヒ ト B C D Fのゲル «通 H P L C ク ロ マ ト ダラ ムを示す。

(発明を実施する ための最良の形態）

以下、 本発明を実施例にて具体的に説明する。

実施例 1

ヒ 卜 B C D F をコ ー ドする D N Aを導入 し た大腸菌 H B 1 0 1 / p B S F 2 - S D 7 A J 1 2 4 4 8 ( F E R M P — 1 0 7 5 8、 F- E R M B P — 3 7 5 3 ) を合成培地で培 養 し 、 卜 リ プ ト フ ア ン プロ モー タ ーをイ ン ドー ル ァ ク リ ル酸 ( I A A ) で誘導する こ と によ り 、 ヒ ト B C D F を不溶性顆粒 と し て菌体内に著量に蓄積させた （特開平 3 — 5 3 8 8 4 号公 報記載の方法） 。 こ の顆粒を常法 （特開昭 6 1 - 2 5 7 9 3 1 号公報記載の方 法） に従い、 顆粒懸濁液 ( 1 0 m M E D T A , 1 . 6 L ) に 調製後、 グァ ニ ジ ン塩酸塩を最終濃度 6 M に な る 様に添加 し 、 室温に て、 p H約 5 . 5 で 4 時間擾拌 し 、 ヒ ト B C D F を可溶 化 し た。 ヒ ト B C D F 量 は 図 1 に示 し た様 に 、 .逆相 H P L C カ ラ ム (バイ ダ ヅ ク 社製 「 2 1 4 T P 5 4 」 ， 4 . .6 mm x 2 5 0 mm) に よ り 分析 し た （以下、 同様の方法） 。 分析条件を第 1 表に ま と めて示す。 第 1表： HPLC分析条件 カラム：バイダック 「2 1TP54J

溶出液： A, 0.1% TFA

溶出液： B, 0. \% TFAかつ 80% ァセトニトリル

溶出プログラム： lml/inin (リニアグラジェント溶出）

時 ¾ Win) A (%) B (%)

0 60 40

27 25 ' . 75

30 0 100

検出： 280ηο (0.04 Abs) 次に、 ヒ ト B C D F濃度が 0 . T nigZ mlにな る よ う に 6 Mグ ァ ニ ジ ン塩酸塩水溶液を添加 した後、 最終濃度 1 O m Mの ト リ ス ー塩酸塩、 及び若干置の水酸化ナ ト リ ゥ ム水溶液を添加する こ と に よ り p Hを 8 . 5 に調整 した。 室温にて緩やかに 1 5 時 間攪拌 し た後、 分子内 ジスルフ ィ ド結合を有する ヒ ト B C D F に変換 した。 該 ヒ ト B C D F の逆相 H P L C 分析 （分析条件は 前記と 同様） によ る ピー ク は抽出直後の ヒ ト B C D F の ピー ク に比べ保持時間が約 2 分間短縮 した （図 2 ) 。

得 られた溶液の う ち 2. 4 L を l O m M S^酸ナ ト リ ウ ム緩衝 液 ( p H 5 . 0 ) で平衡化 した 「セフ ア デ 'ッ ク ス G — 2 5 」 力 ラ ム （ 2 5 . 2 cm X 2 5 cm^ フ ア ルマ シア社製） に添加後、 該緩街液で展開 して、 ヒ ト B C D F 画分 2 . 9 L を得た。 ヒ ト B C D F純度は約 9 2 % . 供 し た蛋白質の 8 8 %を回収でき た。

こ れ ら の工程を操 り 返 して得た ヒ ト B C D F 画分 4 . 5 L を、 該緩衝液 で平銜化 し た 「 C M — セ フ ァ ロ ー ス F F 」 カ ラ ム ( 1 1 . 3 cm ¾6 x 9 cm、 フ ア ル マ シ ア社製） へ負荷 し、 1 L の 該緩衝液で洗净 し た。 その後、 該緩衝液及び 0 . 5 M fi^酸ナ ト リ ウ ム緩衝液 （ P H 5 . 5 ) を用いて溶出 し た。 その際、 後者 の割合を順次高めた （ リ ニアグラ ジェ ン ト 溶出法 （流速 1 0 0 ml/rni n) ) 。 なお、 溶出液の総使用量は、 カ ラ ム容積の 1 0 倍 量 と し た。 か く し て、 ヒ ト B C D F 画分を得た。 ヒ ト B C D F 純度は約 9 8 %、 供 し た蛋 白質の 7 5 %を回収 し た。 エ ン ド ト キ シ ン含量は 0 . 3 E U Z mgヒ ト B C D F 以下であ っ た （生化 学工業 （株） 製、 L A L ア ツ セ ィ キ ッ ト 「 ト キ シ カ ラ ー シ ス テ ム」 に よ る ） 0

得 ら れた B C D F 画分の う ち 1 0 0 ml ( ヒ ト B C D F 2 6 0 mg) を蒸留水 2 0 0 mlで希釈 し 、 塩濃度を 1 / 3 に低下 さ せ た 後、 2 Nギ酸水溶液を滴下 し て p H を 3 . 5 に調整 し 、 更 に最 終濃度 1 0 %の ァ セ ト ニ ト リ ルを添加 し て室温で 5 分間、 緩や か に *拌 し た 。 こ れを 0 . 5 %ギ酸ナ ト リ ウ ム 锾街液 （ P H 4 . 0 ) で平衡化 し た逆相 H P L C カ ラ ム （バ イ ダ ヅ ク 社製 「 2 1 4 T P 1 0 2 2 」 ， 2 2 mm x 2 5 0 mm) に負荷 し 、 該 緩衝液に ァ セ ト ニ ト リ ルを最終濃度 6 0 %に な る よ う に添加 し た 溶 出緩街液 （ B 液） と の リ ニ ア グ ラ ジ ェ ン ト 溶出法 （流速 9 ml/ iii n) に よ り 、 ヒ 卜 B C D F 画分 6 3 il ( ヒ ト B C D F 1 9 0 mg) を得た。 該処理を 同様に緣 り 返 し て精製 し た と こ ろ ヒ ト B C D F 純 度 は 9 9 % 以 上 （逆相 H P L C , S D S — P A G E に よ る ） 、 エ ン ド ト キ シ ン含量は 0 . 0 1 E U mgヒ ト B C D F 以下であ り 、 負荷 し た う ち 7 5 %を回収出来た。 次いで、 前工程の ヒ ト B C D F 画分 6 3 mlを 2 O m M齚酸か つ 1 0 %ァセ ト ニ ト リ ルの緩衝液で平衡化 し た 「セ フ ア デ ッ ク ス G — 2 5 J カ ラ ム （ 9 cm 0 x 5 cm、 フ ア ルマ シア社製） に負 荷 し、 該緩銜液で展開 し、 ヒ ト B C D F画分 1 5 O lを得た。 該カ ラ ムを今度は 5 m M酔酸ナ ト リ ゥ ムの緩街液 （ p H 4 . 5 ) で平衡化 し、 前工程画分の う ち、 7 5 mlを負荷 し、 該緩衝液で 展開 し、 ヒ ト 8 0 0 画分 8 5 1111を得た。 これら 2 段階ゲル ¾ 遏工程で、 負荷した ヒ ト B C D F の う ち 7 0 %を回収する と共 に溶液中のァセ トニ ト リ ルを除去 し た。 当該工程で生成 し た ヒ ト B C D F会合体量は約 5 %であ っ た。

次に、 2 0 m M酔酸ナ ト リ ウ ム緩衝液 （ p H 4. 5 ) で平衡 化 した 「 C M—セ フ ァ ロ ー ス F F」 （ 5 cm0 x 2 , 5 cm、 フ ァ ルマ シア社製） に前工程で得た ヒ ト B C D F の総合画分 1 . 3 L を負荷 し、 1 0 O mlの該緩衝液で洗浄後、 1 0 m Mク ェ ン酸 ナ ト リ ウ ムかつ 5 O m M塩化ナ ト リ ゥ ム の緩衝液 （ p H 6 . 5 ) で一挙 に 溶出 し 、 濃縮 ヒ ト B C D F 画分 1 1 0 ml ( ヒ ト

B C D F 7 5 0 ig) を得た。 ヒ ト B C D F会合体量は 5 %以下、 負荷 し た う ち 7 5 %の ヒ 卜 B C D F を回収す る と 共に濃度は 6 . 8 iag/alまで上昇 し た。

更に、 1 0 m Mク ェ ン酸ナ ト リ ウ ム緩衝液 （ p H 6 . 0 ) で 平衡化 し た 「ス ー パ ー デ ッ ク ス 7 5 」 p r e p r a d e ( 6 cm ^ x 6 0 ci フ ア ルマ シ ア社製） に対 し、 前工程で得た 濃縮 ヒ ト B C D F溶液 7 O mlを負荷 し、 該緩銜液で展開 し て、 ヒ 卜 B C D F モ ノ マ ー 画分 7 0 ml (精製 ヒ ト B C D F 3 0 0 mg) を得た （図 3 の斜線部分） 。

こ の 精製 ヒ ト B C D F は 、 逆相 H P L C 、 イ オ ン 交 換

H P L C、 ゲル爐通 H P L C の各分析に よ り 単一 ピ ー ク を示 し ( 図 4 , 5 及 び 6 参照） 、 S D S — P A G E (銀染色） に よ り 単一バ ン ド を示 し た。 第 2 表 （ a ) 〜 （ c ) に こ れ ら の

H P L C の分析条件を示す。

第 2表： HP LC分析条件

(a) i¾¾HPLCクロマト条件（ヒト BCDF, 25/»)

カラム： 「2 UTP54J (4. 6ΒΒ Χ25 ΟΙΙ¾ ノ、 *イダック）

溶出液： A, 0.05%テトラフルォロ酪酸

B, 0.05%テトラフルォロ酔酸かつ 80%ァセトニトリル 溶出プログラム： ludZain (リニアグラジェント溶出）

時間 (a in) A ) B (%)

0 50 50

20 25 75

22 0 100

(b) ィォン^H P L Cクロマド条件

カラム： 「TSK SpNPRJ (4. 6nm 3. 5DO, 東ソー製）

溶出液： Α, 0.01M酢酸ナトリウム， ρΗ 5.0

Β, 0.5 Μ酔酸ナトリゥム， ρΗ 5.5 溶出プログラム： 1 al/ii n (リ二アグラジェント溶出）

時間 (璽 ) A (%) B %

0 100 0

1.0 80 20

6.0 30 70

6. 5 0 100

7.0 0 100

(c) ゲル戶通 HPLCクロマト条件（精製ヒト BCDF, 250^(100ί®)

カラム： 「Siiperde∑ 75HRJ 10/30

30απ, フアルマシア製） 溶出液： lOnMクェン酸かつ 8.7πιΙίリン酸

Η 7.0 (水酸化ナト ゥム水溶液で調整）

流 速： 0.8ml/fflin 図 5中、約 0.5分のピークはインジェクションショック!こよるものであり、 そして 6.37分のそれは分析中に生 ^:じた凝集体によるものである。 また、 図 6中、 約 19分のピークはサンプル中の塩によるものである。 ま た、 ポ リ ク ロ ー ナ ル抗大腸菌抗体を用 い る ウ ェ ス タ ン プ ロ ッ テ ィ ン グで もバ ン ド は検出 さ れず、 ま た、 同抗体を用 い た酵 素免疫甜定法に よ る 測定で も 大腸菌由来蛋白質の混入は数 P P m以下であ り 、 大腸菌由来蛋白質の混入が充分低い レベルで あ る こ と が示さ れた。 L A L ア ツ セ ィ に よ る ェ ン ド ト キ シ ン含量 は 0. O l E U Zngヒ ト B C D F以下であ っ た。 以上の精製ェ 程に よ る ヒ ト B C D F の総合回収率は 1 5 %であ っ た。

第 3表に本実施例の精製の概要を記 し た。

溶 I 第 3表：ヒ卜 B CDF精製の概要 精 製 工 化化程 試薬 ， 条件 精製 効果 工程収率 トタ聰 不溶性顆粒回収 菌体破枠，遠心分離 可溶性菌体 の

除去

6Mグァニジン埴酸埴 ヒ ト B C D Fの 100% 蘭 P H約 5.5 完全な可溶化

6Mグァニジン塩酸埴 ジスルフィ 90% 90% p H約 8, 5 ド桔合の形成

室温下 15時間

リフォールディング 「セフアデヅクス G- 25J 88% 79%

10層聯酸ナトリウム

pH 5.0

» イ オ ン交換 Γ0Ϊセファロース FFJ 75% 59% クロマトグラフィ一 酔酸ナトリウム

リニアグラジェント

pH 5.0→5.5

逆栢 H P L C バイダヅク C_A (300A) ヒト BCDF類緣 75% 45%

0.5%ギ酸ナ リウム 体（一,

pH 4.0 体）の

ァセトニトリル エンドトキシンの

リニアグラジェント 除去

脱有核浴媒 「セフアデヅクス G-25J ァセトニトリルの 70% 31%

20重雕酸、.蘭ァセトニ 除

卜リル（1段目）、 ヒ卜 BCDF会合

5鼴 Μ酢酸ナトリウム 体の 防止

(2段目）

隠イ オ ン交換 セファロース FFJ ヒ卜 BCDF濃縮 .75% 23% クロマトグラフィー 20蘿 ^酸ナ卜リゥム ぺプチド結^ I断

→10rilクェン酸ナトリ 物の除去

ゥムかつ SOali NaCl ,

pH 6.5

ステップワイズグラジ

ェント

ゲ ル » 逼 「スーパ一デッタス 75」 ヒ卜 BCDF会合 65% 15%

10nMクェン酸ナトリウ 体の除去

ム， pH 6.0 実施例 2

実施例 1 と 同様に し て得 ら れた可溶化 し た ヒ ト B C D F 溶液

( 2 O ml) を用 いて、 以下に述べ る 以外は実施例 同様の方 法で酸化反応及び リ フ ォ ー ルデ ン グ処理を し た。 すな わ ち 、 ト B C D F 濃度を一定 （ 0 . Τ ΙΜΖ ΠΙ Ι又は 0 7 mg/m 1 ) に し て、 グァ ニ ジ ン塩酸塩濃度を 2 M〜 6 M又 は 0 . 6 M、 還元 型ダル タ チオ ン及び酸化型ダルタ チオ ン の濃度を そ れぞれ 1 0 m M〜 0 m M及び l m M〜 0 m Mの条件下で酸化反応、 統いて ゲル »通ク ロ マ ト 処理を行な っ た。 な お、 ゲル滅通条件は第 4 表に示す通 り であ る

第 4 表 ： ゲル «過条件

力 ム 2 . 6 ci l 8 ci ( 9 6 nil)

充 填 剤 「セ フ ア デ ッ ク ス G — 2 5 」

( フ ア ル マ シ ア （株） ）

展 開 液 ： l O m M酔酸ナ ト リ ウ ム 、 p H 5 . 0

検 出 ： 吸光度 （ 2 8 0 n m )

サ ン プ ル容 2 0 m

そ の結果 は、 第 5 表に示す と お り であ っ た 第 5表：ゲル慮通クロマト処理 酸 件 回収率 * 形成されたジスルフィ ド結合

(1) 2Hグァニジン埴酸埴 20 %

pH 8.0

還 グルタチオン 10鼴》

酸 ί ^ダルタチオン laii

(2) 4 グァニジン塩!^ 46 % び混合ジスルフィ ド結合の pH 8.5

«¾Sダルタチオン 10霣 M

酸 グルタチ才ン laM

(3) 6Mグァニジン埴醭埴 90 % ^^及び混合ジスルフィ ド結合の pH 8.5

還 グノレタチオン ί靂 M

酸 { グルタチオン 0. ΙιΗ

(4) 6Mグァニジン塩 90 % ^ .

pH 8.5

iS5^グゾレタチオン 0. OliU

酸 ίί ^ダルタチオン 0.002ιΗ

(5) 6Μグァニジン塩 90 % び^間ジスルフィ ド結合 H 8.5 ' (ヒト BCD F二量体） の混^ f 還 ^グルタチオン 添加せず

酸 ikifダルタチオン 添加せず

(6) 0. グァニジン塩酸塩 38 % 天然型。 なお、 溶液中に還元型が ΡΗ8. 5 36%及び沈鑀物中に還元型が 22% 還 ¾(グル夕チオン ΙΒΜ 存在した。

' 酸 { ダルタチオン 0·1ΒΜ .

ヒト BCDF 0.17ag/ml

* 回収率は、酸 { S応開 の遼 ヒト BCDF量を 100%としたときの 15時間後の天然 型ヒト B C D Fの を示す。

« 形成されたジスルフィ ド桔合の確認は、逆相 HPLC (^折条件は図 1に同じ） による。 註） 上記酸 il ^件 （1)〜 (5) のヒト B C D F«¾は、全て 0.7«gZnilである。 第 5 表中の （ 3 ) の条件で は、 酸化反応の進行が速 く （ 3 〜 6 時間で終了） 、 ヒ ト B C D F 回収率 も高いが、 形成 さ れた ジ ス ル フ ィ ド 桔合 の 中 に は グ ル タ チ オ ン と の 混会 ジ ス ル フ ィ ド が含 ま れ て い た。 同表 （ 4 ) の 条件で は 、 酸化反応の 進行 は同表 （ 3 ) の条件よ り 運いが （ 1 0 〜 1 5 時間要す） 、 ヒ ト B C D F 回収率は高 く 、 形成 さ れた ジ ス ル フ ィ ド結合は天然型 のみであ っ た。 同表 （ 5 ) の条件で は、 ヒ ト B C D F 回収率 は 高いが、 ヒ ト B C D F の数％が分子間 ジ ス ル フ ィ ド結合 し た ヒ ト B C D F二量体を形成 し て い た。 ま た、 同表 （ 6 ) の よ う に ヒ ト B C D F 澳度を 0 . 1 7 mg/ml ま で希釈 し て も グァ ニ ジ ン 塩酸塩 *度が充分高 く な い と ヒ ト B C D F を効率よ く 回収で き な い こ と がわ か っ た 。 こ れ は 、 原料 で あ る 可溶化 し た ヒ 卜 B C D F が再 び 沈 » (殆 ど 、 ジ ス ル フ ィ ド結合 を 形成 し て い な い 還元型 の ヒ ト B C D F ) し た こ と に よ る 。 な お 、 ヒ ト B C D F 濃度を高 く す る と 沈 »画分に失 う 比率が更に高 ま つ た , こ う し て、 高濃度 グ ァ ニ ジ ン塩酸埴及び低濃度チオ ー ル ジ ス ル フ ィ ド試薬を用 い る こ と に よ り 、 グルタ チオ ン と の混合 ジ ス ル フ ィ ド桔合ゃ ヒ ト B C D F の分子間 ジ ス ル フ ィ ド結合を防止 で き 、 天然型の ヒ 卜 B C D F を高収率で得 ら れる こ と がわか つ た。

なお、 ジスルフ ィ ド結合形成の確認は図 1 に示 した逆相 H P L C で行い、 混合ジスル フ ィ ド結合形成の確認はマススぺク ト ル （ M S ) 測定による分子量增加を検出する こ とで行い、 ま た 分子間ジスルフ ィ ド結合を形成す る ヒ ト B C D F会合体の確認 は、 S D S — P A G E法 （非還元条件） で行っ た。

施例 3

公知文献 （内田 ら、 Journa l o f 6 i o m o 1 e c n 1 a r NO, 1, 49- 64, 1991) の方法に従い、 ヒ ト B C D F培養の栄養源と して、 システィ ン （ C y s ) 及び ヒ ト B C D F の一次構造上広範囲に 分布 してい る フ ヱ ニルァ ラ ニ ン （ P h e ) の各カ ルボニル炭素 を ¹³ Cで標識 したア ミ ノ 酸をそれぞれ別々 に用いて、 標識 ヒ ト B C D F を培養調製 し、 実施例 1 の方法でそれぞれ精製 した。

ヒ ト B C D F の 分子内 ジ ス ル フ ィ ド結合を再度 リ フ ォ ー ルディ ン グする ために、 得 ら れた ヒ ト B C D F画分 1 O ml中に l O O mMジ チオ ス レィ ト ール （ D T T ) 0 . 0 4 ailを添加 し て ヒ ト B C D F の分子内 ジ ス ル フ ィ ド結合を還元 し た （逆相 H P L C で確認） 。 続いて、 塩酸で p H 5 に調整し、 6 Mグァ 二 ジ ン塩酸塩で平衡化 し た 「セ フ ア デ ッ ク ス G — 2 5 」 に通液 し て D T T を完全除去 し た。 得 ら れた ヒ ト B C D F 画分を 6 M グァ ニ ジ ン塩酸塩で希釈 し て ヒ ト B C D F 濃度を 0 . 7 mg/ml と し た。 再び、 第 5 表の条件 （ 4 ) で酸化反応及び リ フ ォ ー ル デ ィ ン グ処理 し 、 得 ら れ た ヒ ト B C D F の 高次構造を ¹³ C — N M R を 用 い て観察 し た。 タ ン パ ク 質の 主鎖 カ ル ボニ ル炭素 C — N M R スぺ ク ト ルは溶液内の タ ンパ ク 質分子の高次構造 に 関 し 、 有用 な指標 と な る も のであ る 。

2 種の標識 ヒ ト B C D F は、 本発明の精製法に よ る も の と こ れを再度 リ フ ォ ールディ ン グ し た も の と で ¹³ C — N M R スぺ ク ト ル に相違は な く 、 それぞれの ア ミ ノ 酸残基に対応す る シ グナ ルの みが観察 さ れた （ C y s 4 本 ； P h e 7 本） 。

従 っ て、 本発明の精製品 と こ れを再度 リ フ ォ ー ルデ ィ ン グ し た ヒ ト B C D F の高次構造は同一かつ均一で あ る こ と が分か っ た , ま た、 2 種の標識 ヒ ト B C D F の緩衝液を 0 . 1 Mホ ウ酸緩 街液 （ P H 8 . 5 ) で置換 し 、 標識 ヒ ト B C D F 1 分子に対 し 当 の D T T を添加 し 3 0 分放置 し た後、 13 C — N M R ス ぺ ク ト ルを測定 し た。 C y s — ¹³ C で標識 し た ヒ ト B C D F の酸化 型 と 還元型 （部分還元型を含む） の ¹³ C — N M R ス ぺ ク ト ル の 比較 と C 末端側の ⁷³ C y s 及び ⁸³ C y s を ¹³ C — ¹⁵ N二重標識 法で標識 したスぺク ト ルの比較によ り ジスルフ ィ ド結合の有無 や状態を推定でき る こ とがわかっ た。 こ れに よ る と、 ^{7 3} C y s と ⁸³ C y s が結合し、 ⁴⁴ C y s と ^{5 Q} C y s は未結合状態にあ る 部分還元型 ヒ ト B C D F は ρ Η 6 · 5 以上では極めて短時間の う ち に分子内 ジスルフ ィ ド結合 （酸化） される が、 ρ Η 5 以下 では比較的安定に存在する も ののやは り ゆ つ く り と分子内 ジス ルフ ィ ド結合する こ とが判明 し た。

ヒ ト B C D Fの酸化及び リ フ ォ ールディ ン グにつ いては、 酸 化反応の不十分さや再還元も懸念さ れる が、 ヒ ト B C D F にお いては第 5 表の条伴 （ 4 ) を用いて酸化反応及び リ フ ォ ールデ ィ ン グ処理をすれば、 部分還元型 ヒ ト B C D F は生成しない こ とか分かつ た o

実施例 4

実施例 1 で得 られた逆相 H P L C の ヒ ト B C D F画分 （ァセ ト ニ ト リ ル含量 4 5 〜 5 5 % ) を用 い、 下記条件の減圧濃縮法、 凍結乾燥法及びゲル濂通法によ り 該画分中の有機溶媒除去を行 な っ た。

その結果を第 6 表に示 した。 なお、 ゲル攄過法によ っ て得 ら れた ヒ ト B C D F画分のァセ ト ニ ト リ ル含量はいずれも 1 %以 下であ っ た。 4 第 6表：有機溶媒除去 有機難除 件 生成したヒト BCDF会合体量 *

(1)船濃縮法 60〜80%

(2)凍結乾燥法 60〜80%

(3)ゲル ¾«法 ) 50〜60%

0. 1%トリフルォロ酢酸、 pHl. 8

(4)ゲル 法（1腕理） 40〜50%

lOmMi ナトリウム、 pH4. 5

(5)ゲル 法 ) 40〜50%

1 OmMクェン酸ナトリウム、 pH6. 0

(6)ゲル ««法 ) 40〜50%

1 OmMリン酸ナトリウム、 pH8. 0

(7)ゲル »«法（2段処理） <5%

2 OmM酢酸かつ 10%ァセトニトリル（1段目）

5mM|¾tナトリウム pH4. 5 (2段目）

* したヒト BCDF会合体量は »イオン交換 HPLC (^析条件は図 5と同じ） で Mlした。 ヒト BCDF会合体は G PC- LALLS法によりヒト BCDFの 非共 ^: ^合による二量体であることを¾¾した。

第 7表に第 6 表に記 した以外の有機溶媒除去の条件を示す , 第 7 表 ： 有機溶媒除去条件

( a ) 減圧濃縮条件 （第 6 表の （ 1 ) ) 装 置 ： 逮心形エバポ レータ 「 R D — 3 1 J

(ャマ ト科学 （株） ） 真空度 ： 2 T o r r 加 滠 ： 4 0 で， 4 0 分 サ ン プル： ft ： 5 ml

( b ) 凍結乾燥条件 （第 6 表の （ 2 ) ) 装 置 ： 「モ デル T D — 3 」 （ F T S シ ス テ ム ズ社） 真空度 ： l O m T o r r 加 温 ： 5 で， 1 5 時間 サ ン プル量 ： 1 0 mlバ イ ア ル に 5 ml入れる 。

( c ) ゲル »遏条件 （第 6 表の （ 3 ) 〜 （ 7 ) ) カ ラ ム ： 2 . 6 cm x l 8 cm ( 9 6 ml) 充填剤 ： 「セ フ ア デ ッ ク ス G — 2 5 」 （ フ ア ル マ シ ア ） 展開液 ： 第 6 表に示す 検 出 ： 吸光度 （ 2 8 0 n m ) サ ン プル ： 1 4 . 4 ml

( (3) 〜 （6) 及び （7) の 1 段目）

2 1 . 0 ml ( (7) の 2 段目 ） こ れよ り 、 ゲル »過法において有機溶媒を段階的に減少させ る こ と に よ り ヒ ト B C D F会合体の生成を顕著に抑え る こ とが で き る こ とが判明 し た。

(産業上の利用可能性）

本発明の精製法によれば、 ヒ ト B C D F 遣伝子を組み込んだ 微生物か ら生産さ れる ヒ ト B C D F を ヒ ト の治療目的に使用可 能な純度ま で効率よ く 精製する こ と がで き、 かつ工業的スケ ー ルに逋用で き る こ とか ら産業上での利用が可能と な る。

Claims

請 求 の 範 囲

1 . ヒ ト B C D F遺伝子を組み込んだ後生物を培養 し て得られ る ヒ ト B C D F培養物か ら ヒ 卜 B C D F を可溶化 し た還元型 ヒ ト B C D F可溶化溶液を酸化反応及び リ フ ォ ールディ ング処理 に付する に際 し、 該還元型 ヒ ト B C D F可溶化溶液を用いて酸 化反応せ し めた後、 グァニジ ン塩酸塩濃度を 4 〜 7 Mと した酸 化型 ヒ 卜 B C D F溶液をゲル »遏ク ロ マ 卜処理に付する こ とを 特徵とする ヒ ト B C D F の精製法。

2 . 有機溶媒を含有する ヒ ト B C D F溶液か ら ゲル «過ク ロ マ ト カ ラ ムを用いて展開溶媒を通液せ し め る こ と に よ り 該有機溶 媒を除去する に際 し、 （ i ) ゲル «遏ク ロ マ ト カ ラ ム に有機溶 媒を含む展開溶媒で接液した後、 （ i i ) 該 ヒ ト B C D F溶液 を フ ィ ー ド し、 続いて、 （ i i i ) 展開溶媒の有機溶媒量をス テ ツ プワ イ ズグラ ジェ ン 卜又は リ ニア グラ ジェ ン 卜 プロ グラ ム に よ り （ i ) で用い ·た展開溶媒の有機溶媒量よ り 弒少せ しめて 通液する こ と に よ り 、 有機溶媒を除去 し た ヒ ト B C D F水溶液 を取得する こ と を特後とする ヒ ト B C D F の精製法。

3 . ヒ ト B C D F遣伝子を組み込んだ徵生物を培養 して得られ る ヒ ト B C D F 培養物か ら の ヒ ト B C D F を精製す る 方法に お い て、

( i ) ヒ ト B C D F培養物か ら ヒ ト B C D F を可溶化 し た還元 型 ヒ ト B C D F 可溶化溶液を用 い て酸化反応せ し め た後、 グァ 二 ジ ン塩酸塩濃度を 4 〜 7 M と し た酸化型 ヒ ト B C D F溶液を ゲル ¾過 ク ロ マ ト 処理に付す る 工程、

( i i ) ヒ ト B C D F 溶液を多糖、 デキ ス ト ラ ン又 は合成ポ リ マ ー をベ ー ス と し たイ オ ン交換体を リ ガ ン ド に有す る ゲル担体 ク ロ マ ト カ ラ ム に フ ィ ー ド し た後、 溶離液の塩濃度を変化せ し めて ヒ ト B C D F を精製する イ オ ン交換 ク ロ マ ト 処理工程、

( i i i ) ヒ ト B C D F溶液を、 炭素数 1 〜 8 個の ア ルキル基 を リ ガ ン ド と し かつ ポ アサイ ズが 2 5 0 オ ン グ ス ト ロ ー ム以上 で あ る 逆相 ク ロ マ ト 担体を充填 し た カ ラ ム に接触せ し めて、 ヒ ト B C D F を精製す る 逆相 ク ロ マ 卜 処理工程、

( i V ) ゲル »過 ク ロ マ 卜 カ ラ ム に初め に有機溶媒を含む展開 溶媒で接液 し た後、 ヒ ト B C D F 溶液を フ ィ ー ド し 、 続い て、 展開溶媒の 有機溶媒量をス テ ッ プ グ ラ ジ ェ ン ト 又 は リ ニ ア グラ ジ ェ ン ト プ ロ グ ラ ム に よ り 、 ゲル ¾過 ク ロ マ ト カ ラ ム に初め に 接液 し た有機溶媒を含む展開溶媒の有機溶媒量 よ り 減少せ し め て通液する こ と によ り 、 有機溶媒を除去 した ヒ ト B C D F水溶 液を取得する ゲル »遏ク ロ マ ト処理工程、

を含むこ とを特徵とする ヒ ト B C D F の精製法。