WO1992007571A1

WO1992007571A1 - Procede de production d'une emulsion grasse

Info

Publication number: WO1992007571A1
Application number: PCT/JP1991/001508
Authority: WO
Inventors: Junzo Seki; Hirofumi Yamamoto; Shuji Yamane; Yutaka Takahashi; Kouichi Ushimaru
Original assignee: Nippon Shinyaku Co., Ltd.
Priority date: 1990-11-06
Filing date: 1991-11-05
Publication date: 1992-05-14
Also published as: EP0556392A1; EP0556392A4

Description

明細香

脂肪乳剤の製法

技術分野

本発明は、アムホテリシン Bを含有する脂肪乳剤の製造過程において、アムホテリシン Bの有効量を脂肪乳剤中に含有させるための技術に闋する。

背景技術

ァ厶ホテリシン Bは、開発されてから約 30年を柽過した今日でも、全身投与をすることができ、確実な効果を期待することができる重要な抗真菌剤として汎用されている。しかしこの物質は、溶血毒性、膂毒性等の重篤な副作用が発現する欠点を有していた。

近年、リン脂質等からなるリポソーム製剤、又は、単純脂質をリン脂質で乳化する脂肪乳剤製剤とすること等により上記の了ムホテリシン Bの欠点は解消されつつあった。

ァ厶ホテリシン Bはこれらの脂質には容易に溶解しないことが判つていた。そこでこれらの製剤を製造する方法にはこれまで、 ①了厶ホテリシン B及び脂質をクロロホルム、メタノール又はジメチルスルホキサイド等の溶媒に添加して溶解均一化した後に溶媒を除去し水を加えて乳化する方法、 ②アムホテリシン Bをデォキシコール酸ナトリウ厶とともにジメチル了セトアミド等の溶媒に溶解させた後に脂肪乳剤中に加える方法、の二つがあった。 ①では有害な溶媒が残留する危険を払拭することができず、また②では①と同様の欠点に加え、合成界面活性剤であり刺激性や溶血性を有するデォキシコール酸ナトリウムが必ず製剤中に含有される欠点があるほか、了ムホテリシン Bが脂肪乳剤の粒子中に完全には封入されないという大きな欠点を有していた。

特開平 1一 1 6 0 9 1 5号公報にはアムホテリシン Bのリポソ一厶製剤において、予めクロ口ホルム/メタノール混液中でプロトンィ匕したジステアロイルホスファチジルグリセ D—ルと了厶ホテリシン Bの複合体を形成した後乾燥する技術が開示されているが、これとても製造中に有害な溶媒を使用しなければならずその残留に大きな間題があった。

上記の事情に鑑み、了ムホテリシン B含有脂肪乳剤を製造するに際して、有害な物質を用いることなく安定で均一な脂肪乳剤を取得することが、本発明の当初からの目的であった。

発明の開示

本発明者らは、銳意検討を行った結果、以下に示す製造方法により、上記目的を達成することができることを見出した。

太 ¾ ggの葜旨の一つは、了ムホテ D シン B 会有する脂肪乳剤の製造過程において、アムホテリシン Bを非晶煑化して均質に脂質に分散させるに際して、酸及びェタノールを使用するという単純な操作にある。

本発明の要旨の二つめは、アムホテリシン Bを舍有する脂肪乳剤の製造過程において、アムホテリシン Bを穽晶質化して均質に脂質に分散させるに際して、アムホテリシン Bの結晶の存在が確認できなくなるまでこれらを物理的に練合するという単純な摸作にある。ここに脂質とは、リン脂質及び複合脂質を含む概念である。

上記に要旨を記載した二つの発明は、それぞれ别異の発明であるが、産業上の利用分野及び解決しょうとする課題が同一である。

第一の発明について説明する。本発明者らは、アムホテリシン Bがエタノールに容易には溶解しない事実を踏まえ、エタノールを塩酸等の酸によって酸性にすることによりァ厶ホテリシン Bが極めて容易にェタノール中に溶解する事実を発見し、これに基づいて本発明を完成させたものである。

アムホテリシン Bを脂肪乳剤構成成分中に完全に分散させ微細乳化後も安定に脂肪乳剤粒子中に封入させるためには、アムホテリシン Bを非晶質化した状態で脂肪乳剤構成成分に分散させることが必要であるが、本発明により製造したアムホテリシン B脂肪乳剤中では、丁ムホテリシン Bが非晶質化していることが X線回折等により確認されている。

本発明においては、アムホテリシン Bをェタノール中に溶解させる必要がある。

アムホテリシン Bの溶解に用いるエタノ一ルの量及び加える酸の量は、アムホテリシン Bが完全に溶解するために必要な量以上であることが必要である。必要以上の大量のェタノールを用いることは、後の除去操作が容易でなくなるため好ましくない。一般的には、了ムホテリシン B 1 g に対しエタノール 200m l以上加えることが必要である。好ましくは 300〜 800πι 1、より好ましくは 400〜 600ra l のェタノールがよい。

本発明においてアムホテリシン Bをエタノールに溶解させるときには、一般的には、エタノール中にァ厶ホテリシン Bの原末結晶をまず分散する。分散にあたっては、超音波分散機又はポリトロンホモジナイザー等の分散機を用いるのが好ましい。これにより、溶解に長時間を要する大きな結晶状態のものでも、次の酸を加え溶解する操作において、分解が生じるおそれを除くことができる。本発明においては、上記のように了ムホテリシン Bをェタノール中に分散させた後、酸を加える。

本発明に適用する酸は特に限定されないが、例えば、硫酸、硝酸、幾酸等の無機酸のほか、クェン酸、乳酸、マレイン酸等の有機酸を挙げることができる。なかでも塩酸が最も好ましい。

了ムホテリシン Bは酸性で比較的不安定であるため、必要以上の髙濃度の酸を加えることも好ましくない。

加える酸の量は、ァ厶ホテリシン B 1 g に対して 1 〜： 100ミリモル、好ましくは 2 〜20ミリモル、より好ましくは 4〜： L0ミリモルである（5

本発明においては、予め酸性エタノールを作製し、これに了ムホテリシン Bの結晶を加えて溶解してもよい。

本発明においては、上記により作製したァ厶ホテリシン Bの酸性ェタノール溶液にリン脂質又はリン脂質と单脂質の混合物等を加える。

添加するリン脂質又はリン脂質と単鈍脂質の混合物の量は、目的とする脂肪乳剤の処方により定めることができる。この場合には、処方量全量を添加しても良いし、その一部を後に添加することもでさ o

一般に、重量比で了ムホテリシン Bの 0. 5倍量以上が好ましい。より好ましくは、アムホテリシン Bの G. 5倍量 1上 5倍量以下を用いることができる。更に好ましくは、 1 〜 2倍量である。

あまり大量の脂質を添加すると後に行うエタノール除去に長時間を必要とし、また、後の乾燥操作の後ペースト妆を呈し取り扱いが困難となる。これらの脂質は、アム.ホテリシン Bの酸性エタノール溶液にそのまま添加することもできるが、予め脂質をエタノール又は酸性エタノール溶液に溶解して添加することもできる。

アムホテリシン Bは酸性では比較的不安定で分解しやすいので、本発明においては、ァ厶ホテリシン Bの酸性エタノール溶液を脂質と混合した後、なるべく早く酸を中和することが好ましい。

中和に用いるアル力リは特に限定されない。例えば、水酸化ナトリウ厶、水酸化カリウム、アンモニア、トリェチルアミン等を用いることができる。水酸化ナトリウムは、塩酸と中和した際に食塩となるから本発明の目的には好ましい。

本発明においては、了ムホテリシン Bを溶解させる操作を低温中で行うことができる。アムホテリシン Bは酸性で比較的不安定であるので、低温での操作によりアムホテリシン Bの分解を未然に防止することができる。この目的のためには、できるだけ、例えば一 80 :の低温下に操作を行うことが好ましい。

本発明においては、中和した後、用いたエタノールを除去するため凍結乾燥、噴蓀乾燥等の通常の方法により乾燥処理することができる。

これによりアムホテリシン Bが完全に非晶質化し、ェタノールを実質的に含有しないものを得ることができる。

また、中和後析出するものを攄過又は遠心操作により集めて乾燥することもできる。乾燥後、ペースト状を呈して取り扱いが因難な場合には、予め賦形剤又は増量剤を添加することもできる。

このような賦形剤又は増量剤の代表的な例として、塩類、糖類、タンパク質、多糖類、その他の髙分子を挙げることができる。具体的には、食塩やグルコース、マルトース、アルブミン、デキストラン等を挙げることができる。

このような乾操処理のほか、選択透過性膜（例えば、逆浸透膜）を利用してェタノールを除去することもできる。

本発明の脂肪乳剤を製造するにあたっては、中和後、永を添加してアムホテリシン Bと添加した脂質を共沈析出させることができる。そして、永で洗铮することによ 'り中和時に生成した食塩や残存する酸、アルカリも容易に除去することができる。

得られたものは、乾燥することもでき、また湿灑旗のまま他の脂肪乳剤構成脂煑と混合することもできる。更に、適当な孔径の選択透過性膜を用いるとエタノール除去と同時に脱塩をすることができる。

以上のようにして得られた非晶質化された了ムホテリシン Bを含むリン脂質又はリン脂質と単純脂質の混合物は、通常知られる乳化搔作によって所望の添加物や氷を加えて乳化処理することができる

O

上記の工程でエタノールを除去して乾煥後に得られた非晶質化された了ムホテリシン Bを含有する脂燹、又は上記のようにして水添加により得られた共沈物は、後に脂肪乳剤処方として加えられるべきリン脂質若しくは単純脂質又はこれらの混合物等ときわめて容易に混合し均質化することができる。この事実は、本発明の有用な効果の一つである。 ·

本発明に係る脂肪乳剤の製造においては、乳化処理中に熱を加えるまでもなく脂質等が容易に混合し均質化するから、工程の簡素化のみならず、熱に不安定な了ムホ亍リシン Bの分解を未然に防止することができる。

本発明においては、混合又は練合に用いる器具及び装置は、特に限定されない。乳鉢やポリトロンホモジナイザー等を用いても良いし、軟脊製造時等によく用いられる一般的な混合練合装置でもよい

0

本発明においては、エタノール除去操作を行うことなく所望の添加物又は水を加えて乳化することができる。これは、エタノールが製剤処方中に処方されている場合にきわめて有用である。

以下、本発明に係る第二の発明を詳述する。

本発明においては、了厶ホテリシン Bは、粉末状のものを使用することができる。

本発明においては、上記の粉末状のアムホテリシン Bを脂質とともに搣合するに際して、例えば、これらを乳鉢等の容器に入れ、これを棒で物理的に棟ることができる。本発明の実施にあたっては、他の方法、例えば、工業的に常用することができる練合機等を使用することができる。鎳合に用いる器具又は装 gは特に限定されることがない。軟膏製造時等に通常よく用いられる機械は、本発明の実施に適用することができる。

了ムホテリシン Bを非晶質化して均質に脂質に分散させるに際して一定の圧力を付加させながら十分に成分を混合させることが、本発明の効果を生じさせるための必要にして十分な要件であることが判っている。本発明者らによって見出された本発明の要点は、練合に際しての上記の操作以外のいかなるところにも存在しない。

本発明による練合は、十分に行うことにより目的を達成することができるので、それ以上操作を行う必要はない。このような物理的練合は、操作を继続することにより了ムホテリシン Bの非晶質化が次第に達成されてゆくことが判っているから、通常使用されるべき解析手段によって了ムホテリシン Bが非晶質化することを確認するまですることができる。従って、このように確認できた時点が、本発明の繚合搔作の終点となる。

このような解析手段としては、例えば、 X線回折、電子顕微鏡又は熱示差分析等による確認を使用することができる。

本発明の檨合操作によって、了ムホテリシン Bを舍有する脂質を、液又は半固形ペースト妆の物質として取得することができる。この際にはいかなる溶媒を加えることも必要ではない。

本発明の脂肪乳剤の製造においては、上記の棟合操作の後、通常脂肪乳剤を製する際に行うべき搔作を行うことができる。例えば、上記の了ムホテリシン Bを舍有する脂質に、更に脂肪乳剤の構成成分であるリン脂質又は单钝脂質を加えて混合する。

添加するリン脂質又はリン脂質と単饨脂質の混合物の量は、目的とする脂肪乳剤の処方により定めることができる。この場合には、処方量全量を添加しても良いし、その一部を後に添加することもできる。

本発明の脂肪乳剤の製造においては、その後所望量の永を加えて、一般的な粗分散処理に続いて钿乳化処理を行うことができる。これによって均質化した安定なアムホテりシン B含有脂肪乳剤を取得することができる。

本発明においては、添加する脂質の量及びその温度が、混合物の粘度に影響を与えることが判っている。单純脂質は、了厶ホテリシン 3の量の対して、少なくとも 2倍量（重量比）以上が望ましい。これにより、アムホテリシン Bの結晶が容易に単純脂質中に分散し、混合効率を高めることができる。リン脂質は、アムホテリシン B の量に対して、少なくとも 0. 5倍量以上であることが望ましい。それ^下であると均一な混合が因難である。 I ン脂質の量は、 1. 0倍辺上であると更に望ましい。

本発明においては、単純脂質とリン脂質の混合系を用いることができる。リン脂質のみで混合する場合には、操作時に加温することが望ましい。

本発明において了ムホテリシン Bを脂質中に捸合するに際しては、 70で以下で行うことが望ましい。これ以上では了ムホテリシン B が不安定となる。また lO t以下の低温においては粘度が増すために本発明の実施には適切ではない。

以上のようにして得られた非晶質化された了ムホテリシン Bを含むリン脂質又はリン脂質と単純脂質の混合物は、通常知られる乳化操作によつて所望の添加物や水を加えて乳化処理することができる

0

本発明においては、有機溶媒や合成界面活性剤等を全く使用することなく目的を達成することができるから、その残留することによる医薬品としての不利益をすベて解消することができる。

本発明においては、アムホテリシン Bを予め脂肪乳剤構成成分中に均質に混合することができるから、細乳化後もアムホテリシン B が安定に脂肪乳剤粒子中に封入されることとなる。

本発明においては、物理的に據合する際に、適当量の酸を加えることができる。酸の添加により、アムホテリシン Bの均質化が著しく促進されることが判っている。酸を用いた場合は、棟合の後に、酸を中和するのに必要な量のアル力リを加える（最終 P Hは 4〜 8が好ましい）。

本発明に適応する酸は特に限定を受けない。例えば、塩酸、硫酸、硝酸、幾酸等の無機酸のほか、クェン酸、乳酸、マレイン酸等の有機酸を挙げることができる。特に、塩酸が好ましい。また、後の中和に用いる了ルカリとしては、永酸化ナトリウム、永酸化力リゥム、アンモニア、トリェチルアミン等を挙げることができる。塩酸を中和した擦に食塩となるので、氷酸化ナトリゥムが好ましい。

埴酸を用いた場合は、少量でよく、一般に 2〜 6モル Z ·2濃度の希塩酸を添加するのが好ましい。あまり希薄な酸を大量に加えると永が遊雜し、棟合が困難となる。また、濃い酸を加え、必要以上に酸度が上昇するとアムホ亍りシン Βの安定性上好ましくない。塩酸の総添加量はアムホテリシン Β量や大豆油量、リン脂質量により大きく異なるが、一般に據合物 1 gに対し 10ミリモル以下でよい。

このように酸の添加は均質化を促進する効果を有するが、本発明の主たる効果である溶媒を用いることなく了ムホテリシン Bの脂質への均質化を達成するという目的のためには必須ではない。

本発明に係る第一の発明においても第二の発明においても、リン脂質、単純脂質を使用して脂肪乳剤を製造する。

本発明で使用されるリン脂質としては、例えば、卵黄、大豆、牛、隊等由来のリン脂質又は、純若しぐは半合成的に得られるリン脂質を挙げることができる。例えば、ホスファチジルコリン、ホスファチジルエタノールァミン、ホスファチジルセリン、ホスファチジルイノシトール、ホスファチジルグリセ口ール等である。具体的には、卵黄ホスファチジルコリン、大豆ホスファチジルコリン、ジパルミトイルホスフ丁チジルコリン、ジミリストイルホスファチジルコリン、ジステアロイルホスファチジルコリン、ジォレオイルホスファチジルコリン、ジミリストイルホスファチジルグリセロール、ジパルミトイルホスファチジルグリセ —ル、ジステアロイルホスファチジルグリセロール等を挙げることができる。それらの水素添加物も用いることができる。なかでも好ましい代表例として、精製卵黄レシチンを挙げることができる。

本発明に使用される単純脂質としては、例えば、精製大豆油、綿実油、菜種油、胡麻油、コーン油、落花生油、サフラワー油、トリォレイン、トリリノレイン、トリパルミチン、トリステアリン、トリミリスチン、トリァラキドニン等の中性脂質を挙げることができる。また、コレステリリレオレート、コレステリ Jレリノレート、コレステリルミリステート、コレステリルハ'ルミテート、コレステリル了ラキデ一ト等のステロール誘導体も挙げることができる。代表的な例としては、精製大豆油を挙げることができる。

また、脂肪乳剤粒子に表面荷電を賦与するためにステアリルァミン、ジセチルホスフヱート、ホスフ了チジン酸、ホスファチジルグリセロール等の荷電を有する脂質を用いることができる。

本発明のアムホテリシン B含有脂肪乳剤の乳化にあたっては、従来から行われてきた種々の脂肪乳剤製造法をそのまま応用することができる。例えば、ホモミキサー等により粗乳化をおこなった後、マントン一ガウリン型等の加圧噴射式ホモジナイザ一、マイクロフルイダイザ一、超音波ホモジナイザー等により充分に微細化して形成せしめる方法が一般的である。この時、一般に知られる乳化補助剤又は安定化剤として生理的に受け入れられるステロール類、脂肪酸又はそれらの誘導体等.を加えることもできる。これらの代表例としては、コレステロールゃォレイン酸等の脂肪酸等を挙げることができる。

本発明の製造方法を用いた脂肪乳剤の形妆ゃ粒子径は、電子顕激鏡、光散乱方式の粒子径分析装置、メンブレンフィルターによる a 過等により容易に確認することができる。

本発明の脂肪乳剤の製剤の任意の成分として、一般に注射剤に用いられる添加剤及び補助物質などを挙げることができる。例えば、酸化防止剤、防腐剤、安定化剤、等張化剤、接街剤等を挙げることができる。これらの添加剤、補助物煑等の要求量及び最適量は、その目的に応じて変化させることができる。

上記のようにして得られる了厶ホテリシン B全有脂肪乳剤は、必要に応じて滅菌（例えば濾過滅菌や高圧蒸気滅菌等）し、窒素ガスと共にアンブル中に封入することができる。又、必要に応じて凍結乾燥することができる。凍結乾燥させたアムホテリシン B含有脂肪乳剤は、常法通り適当な溶液の添加によって復元することができる o

本発明により製造された了ムホテリシン B会有脂肪乳剤よりなる製剤は、真菌感染症やウイルス感染症等の治療又は予防を目的としてヒト又は種々の動物の静脈内に投与するのが一般的である。この場合、脂肪乳剤粒子の粒子 S等の管理を十分に行う必要がある。一般に 1 ju m以上の粒子が混在すると、毛細血管を塞栓するなど種々の毒性発現が知られているからである。

本発明の脂肪乳剤は、必要に応じて従来品同様、勐脈内、筋肉内、髄腔内及び皮下等に注射剤として投与することもできる。また、点眼剤、点昜剤、経口投与剤、吸入剤、膀胱注入剤、外用剤又は坐剤等としても製剤化し使用することができる。この場合においても、医薬上許容される基剤、賦形剤等の添加剤を任意の成分として挙げることができる。

本発明により製造されたアムホテリシン B含有脂肪乳剤よりなる製剤の投与量は、投与ルート、剤形、症状、目的によって異なるが、脂肪乳剤として一般に、 1〜： L OOOoi lZ回である。また、アムホテリシン Bとしての投与量は、成人に対して一般に 1 〜 200mgZ回でのる。

本発明の脂肪乳剤は、必要に応じて凍結乾燥することにより貯蔵に適する凍結乾燥製剤とすることができる。このような凍結乾燥製剤の製法もまた本発明の技術的範囲に含まれる。

発明を実施するための最良の形態

以下に本発明に係る脂肪乳剤の製造方法に関する実施例及び試験例を挙げて本発明をさらに詳しく銳明する。

実施例 1

氷冷下において、アムホテリシン Bの原末結晶 500tngに対し、ェタノール 250ra lを加え超音波ホモジナイザーを用いて分散する。これに 2 N塩酸 1. 5ra lを加え超音波ホモジナイザーを用いて溶解する 0 これとは別に室温において精製卵黄レシチン 500mgに対し、エタノール 50ni lを加え、超音波ホモジナイザーを用いて分散する。これに 2 Ν塩酸 1. 0m lを加え超音波ホモジナイザーを用いて溶解する。これを氷冷したのち、上記のアムホテリシン B酸性エタノール溶液と充分混合し 2 N水酸化ナトリウム約 2. 5m lを加えて pH 7. 0に調製する。これを減圧下濃縮したのち、水 50ralを加えてさらに減圧下で濃縮する。共沈物を遠心で集めて水で操り返し洗浄した後澳結乾燥した。粉末 X線回折測定の結果、得られた乾逞物中で了ムホテリシン B は完全に穽晶質化されていることが確認された。

この了ムホテリシン Bを含有する凍結乾燥物 6 ragに、精製大豆油 0. 5gおよび精製卵黄レシチン 0. 497gを加えて混繍し均質化する。これに、等張リン酸緩衝液を 8 nil加えホモジナイザーで攪拌し粗乳化液とする。等張リン酸接衝液を加えて lOnilに定容した後、氷冷下、超音波ホモジナイザー（ブランソンモデル 1 8 5 ) で 60分藺乳化し極めて微細な了ムホテリシン Bを舍有する脂肪乳剤を得た。また常法に徒い凍結乾逞し凍結乾燥製剤を得た。

実施例 2

氷冷下において、アムホテリシン Bの原末結晶 lOOmgに対し、ェタノール 50mlを加えポりト口ンホモジナイザーを用いて分散する。これに 2 N塩酸 0. 3mlを加えポリトロンホモジナイザーを用いて溶解する。これとは別に室温において精製卵黄レシチン 500rogに対し、ェタノール 50oilを加え、ポリトロンホモジナイザーを用いて分散する。これに 2 N塩酸 0. 2ralを加え超音波ホモジナイザーを用いて溶解する。これを氷冷したのち、上記のアムホテリシン B酸性エタノール溶液と充分混合し 2 N水酸化ナトリウム約 0. 5ralを加えて pH ?. 0に調製する。

これを滅圧下濃縮した後、氷 50mlを加えてさらに減圧下で滇縮する。共 '沈物を遠心で集めて氷で緣り返し洗浄した後マルトース 5 g を加えて糜結乾燥した。粉末 X線回折測定の結果、得られた乾嫫物中で了ムホテリシン Bは完全に非晶質化されていることが確認されアムホテリシン B 30tngに対応する量の上記で得られた浼結乾燥物に、精製大豆油 0. 6 g及び精製卵黄レシチン 0. 47 gを加えて混練し、これに、 0. 24Mグリセリン水溶液 8 rolを加えホモジナイザーで攪拌し粗乳化液とする。そして、 0. 24Mグリセリン水溶液を加えて lOra lに定容した後、氷冷下、超音波ホモジナイザー（ブランソンモデル 1 8 5 ) で 60分間乳化し極めて微細なアムホテリシン Bを含有する脂肪乳剤を得た。また常法に従い凍結乾煥し凍結乾燥品を得実施例 3

氷冷下において、了厶ホテリシン Bの原末結晶 10 gに対し、エタノール 20 を加えポリトロンホモジナイザ一を用いて分散する。これにクェン酸 18. 5mgを加えポリトロンホモジナイザーを用いて溶解する。これとは別に室温において精製卵黄レシチン 30 g及び精製大豆油 3 gをエタノール 10 ^にポリトロンホモジナイザーを用いて溶解する。これを永冷したのち、上記のァ厶ホテリシン B酸性エタノール溶液と充分混合し 2 N水酸化ナトリゥムを加えて pH 7. (1に調製する。

これを減圧下濃縮した後、共沈物を攄過で集めて水で ϋり返し洗浄した後自然乾燥した。粉末 X線回折測定の結果、得られた乾燥物中で了ムホテリシン Βは完全に非晶質化されていることが確認されアムホテリシン Β 2 gに対応する量の上記で得られた乾燥物に、精製大豆油 20 g及び精製卵黄レシチン 30 gを約 60 *Cで加温混合し、これに、 0. 24Mグリセリン水溶液を lOOrol加えホモミキサ一で撹拌し粗乳化液とする。粗乳化液を水酸化ナトリゥムで中和後、マイク口フルイダィザ一により髙圧乳化し、きわめて微細なアムホテリシン Bを舍有する脂肪乳剤を得た。また常法に従い凍結乾燥し凍結乾煶品を得た。

実施例 4

実施例 3で攄適後に得られた湿潤状態の共沈物 lOragに、コレステリルォレート 0. 5 g及び精製卵黄レシチン 0. 5 gを加え混合する。これに、 0， 24Mグ IIセりン水溶液 8 mlを加えホモジナイザーで攙拌し粗乳化液とする。粗乳化液を氷酸化ナトリゥムで中和後、 0. 24M グリセリン水溶液を加えて lOralに定容した後、超音波ホモジナイザ一（ブランソンモデル 1 8 5 ) で 60分問乳化し極めて微細なアムホ亍 I) シン Bを含有する脂肪乳剤を得た。また常法に従い凍結乾煜し凍結乾逞品を得た。

実施例 5

氷袷下において、アムホテリシン Bの原末結晶 500mgに対し、ェタノール 250m lを加え超音波ホモジナイザーを用いて分散する。これに 2 N塩酸 1. 5ralを加え超音波ホモジナイザ一を用いて溶解する o これとは別に室温においてジパルミトイルホスファチジルグリセロール 500mgに対し、エタノール 50rolを加え、超音波ホモジナイザ一を用いて分散する。これに 2 Ν埴酸 1. 0mlを加え超音波ホモジナィザーを用いて溶解する。これを氷冷した後、上記の了ムホテリシン B酸倥:!：タノール溶液と充分混合し 2 N水酸化ナトリウム約 2. 5 ra lを加えて pH 7. 0に翳製する。

これを逆浸透膜を用いて濃縮した後、精製大豆油 5 g及び精製卵黄レシチン 4 gを加えさらに混合練合する。これに、 10%マルトース水溶液 80m lを加えホモジナイザ一で攪拌し粗乳化液とする。そして、 10%マルトース水溶液を加えて ΙΟΟπι Ιに定容した後、超音波ホモジナイザー（ブランソンモデル 1 8 5 ) で 60分間乳化し極めて微細なアムホテリシン Bを含有する脂肪乳剤を得た。また常法に従い凍結乾燥し凍結乾燥品を得た。

実施例 6

氷冷下において、丁ムホテリシン Bの原末結晶 500mgに対し、ェタノール 250m lを加え超音波ホモジナイザーを用いて分散する。これに 2 N塩酸 2. 5mlを加え超音波ホモジナイザーを用いて溶解する 0 これに精製卵黄レシチン 500mgを加え、超音波ホモジナイザーを用いて充分に溶解した後、 2 N氷酸化ナトリウム約 2. 5mlを加えて H 7. 0に調製する。

これを減圧下濃縮した後、水 50m lを加えてさらに滅圧下で濃縮する。共沈物を遠心で集めて氷で跺り返し洗浄した後凍結乾燥した。粉末 X線回折測定の結果、得られた乾煜物中でアムホテリシン Bは完全に非晶質化されていることが確認された。

得られた乾燥物（アムホテリシン B 3 mgに対応する量）及び精製卵黄レシチン 0. 4 gを乳鉢にとり混合棟合した。これに、精製大豆油 0. 5 g及び 9 %ラクトース水溶液 8 mlを加えホモジナイザーで攙拌し租乳化液とする。そして、 9 %ラクトース水溶液を加えて 10m l に定容した後、超音波ホモジナイザー（ブランソンモデル 1 8 5 ) で 60分間乳化し極めて微細なアムホテリシン Bを含有する脂肪乳剤を得た。また常法に従い凍結乾燥し凍結乾燥品を得た。

実施例 7

実施例 2で得られた乾燥物 170nig、精製大豆油 0. 5 g及び水素添加卵黄レシチン D. 4 g、コレステロール Q. l gを乳鉢にとり混合練合する。これに、 9 %ラクトース氷溶液 8 m lを加えホモジナイザーで攙捽し粗乳化液とする。そして、 9 %ラクドース水溶液を加えて 10m lに定容した後、超音波ホモジナイザー（ブランソンモデル 1 8 5 ) で 60分 M乳化し極めて微細なアムホテリシン Bを舍有する脂肪乳剤を得た。また常法に従い凍結乾燥し凍結乾燥品を得た。

試験例 1 ：粒子径の測定

実施例 1〜 7で得られたアムホテリシン Bを舍有する脂肪乳剤の脂肪乳剤粒子の粒子径について、レーザー光による動的光散乱粒子径測定装置を用いその粒子径について評価したところ、下記の結果を得た。また、いずれも 1 ju m以上の粒子を含まなかった。

実施例番号平均粒子径実施例番号平均粒子痊

1 47 nm 5 47nm

2 70nm 6 45請

3 23nm 7 61nm

4 52nra

実施例 8

了ムホテりシン Bの結晶 3 gに精製卵黄レシチン 3 gを加えメノゥ乳鉢を用い 10分間充分に混合練合した。粉末 X線回折測定の結果、得られた混嬈物中でアムホテリシン Bは完全に非晶質化されていることが確認された。このアムホテリシン Bを舍有する混據物 6 mg に、精製大豆油 0. 5 g及び精製卵黄レシチン 0. 497 gを加えて、更に混練し均質化する。これに、等張リン酸緩衝液を 8 m l加えホモジナイザーで攙拌し粗乳化液とする。そして、等張リン酸緩衝液を加えて 10m lに定容した後、氷冷下、超音波ホモジナイザー（ブランソンモデル 1 8 5 ) で 60分間乳化し極めて微細なアムホテリシン B を舍有する乳剤を得た。また常法に従い凍結乾燥し凍結乾燥品を得た。

実施例 9

了厶ホテリシン Bの結晶 0. lgに精製卵黄レシチン 0. lgを加えメノウ乳鉢を用い予備的に混合練合する。これに 2 N塩酸 0.5inlを加え直ちに混合練合した。粉末 X線回折測定の結果、得られた混棟物中でアムホテリシン Βは完全に非晶質化されていることが確認された。アムホテリシン B30ragに対応する量の上記で得られた混練物に、精製大豆油 0.6g及び精製卵黄レシチン 0.47gを加えて混縯し、これに、 0.24Mグリセリン水溶液 8 mlを加えホモジナイザ一で » 拌し粗乳化液とする。そして、 2 N氷酸化ナトリウム 0.5mlを加えて中和した後、 0.24Mグリセリン水溶液を加えて lOralに定容した後、氷冷下、超音波ホモジナイザー（ブランソンモデル 1 8 5 ) で 60分間乳化し極めて微細なアムホテリシン Bを会有する乳剤を得た。また常法に従い凍結乾燥し凍結乾燥品を得た。

実施例 1 0

アムホテリシン Bの結晶 10 gに精製卵黄レシチン 15gを加え乳鉢を用い予備的に混合據合する。これに 6 N塩酸 20mlを加え直ちにポリトロンホモジナイザーを用いて混合練合した。粉末 X線回折測定の結果、得られた混練物中で了ムホテリシン Bは完全に非晶質化されていることが確認された。了ムホテリシン B 2 gに対応する量の上記で得られた混練物に、精製大豆油 20 g及び精製卵黄レシチン 30 gを約 60 :で加温混合し、これに、 0.24Mグリセリン氷溶液を 100 ml加えホモミキサ一で攪拌し粗乳化液とする。粗乳化液を水酸化ナトリゥムで中和後、マイク口フルイダィザ一により髙圧 ¾化し、きわめて微細な了ムホテリシン Bを舍有する乳剤を得た。また常法に従い凍結乾煶し凍結乾燥品を得た。

実施例 1 1

実施例 1 0で得られた混練物 4 ragに、コレステリルォレート 0.5 g及び精製卵黄レシチン 0.5gを加え混合する。これに 0.24Mグリセリン氷溶液 8 nilを加えホモジナイザーで攪拌し粗乳化液とする。粗乳化液を水酸化ナトリゥムで中和後、 0.24Mグリセリン氷溶液を加えて 10mlに定容した後、超音波ホモジナイザー（ブランソンモデル 1 8 5 ) で 60分間乳化し極めて徴細な了ムホテリシン Bを含有する乳剤を得た。また常法に従い凍結乾燥し凍結乾燥品を得た。実施例 1 2

了ムホテリシン Bの結晶 3 ragに精製大豆油 20ingを加えメノウ乳鉢で約 10分間充分に混合練合し均質化する。これに精製大豆油 0.5g 及び精製卵黄レシチン 0.4g、ジミリストイルホスファチジルグリセロール O.lgを加えさらに混合辕合する。これに、 10%マルトース水溶液 8 mlを加えホモジナイザーで攪拌し粗乳化液とする。そして、 10%マルトース水溶液を加えて 10mlに定容した後、超音波ホモジナイザー（ブランソンモデル 1 8 5 ) で 60分簡乳化し搔めて微細なアムホテリシン Bを舍有する乳剤を得た。また常法に従い凍結乾熳し凍結乾燥品を得た。

実施例 1 3

了ムホ亍リシン B 3aig、精製大豆油 0.5 g及び水素添加卵黄レシチン 0.4g、コレステロール G.lgを乳鉢にとり、約 20分藺充分に混合練合した。粉末 X線回折測定の結果、得られた混糠物中で了ムホテリシン Bは完全に非晶質化されていることが確認された。これに、 9 %ラクトース氷溶液 8 m lを加えホモジナイザーで援拌し粗乳化液とする。そして、 9 %ラクトース水溶液を加えて 100m lに定容した後、超音波ホモジナイザー（ブランソンモデル 1 8 5 ) で 60 分間乳化し極めて微細なアムホテリシン Bを舍有する乳剤を得た。また常法に従い凍結乾燥し凍結乾燥品を得た。

実施例 1 4

アムホテリシン Bの結晶 300mgに精製大豆油 20ragを加え真空らいかい器で約 10分間充分に混合據合し均質化する。これに精製大豆油 50 g及び精製卵黄レシチン 40 g、ジミストィルホスファチジルグリセ σ —ル 1 _gを加えさらに混合練合する。これに、 10%マルトース水溶液 800m lを加えホモジナイザーで ¾拌し粗乳化液とする。そして、 10%マルトース水溶液を加えて 1000m lに定容した後、圧力式ホモジナイザー（日本精機製）で 60分間乳化し極めて微細なアムホテリシン Bを舍有する乳剤を得た。また常法に従い凍結乾燥し凍結乾燥品を得た。

実施例 1 5

ァ厶ホテリシン Bの結晶 3 mgにジミリストイルホスファチジルグリセロール 0. l gを加え、これに 2 N塩酸 G. ltdを加えてメノウ乳鉢で混合縯合し均質化する。これに精製大豆油 0. 5 g及び精製卵黄レシチン 0. 4 gを加えさらに混合練合する。これに、 10%マルトース水溶液 8 nilを加えホモジナイザーで摟拌し粗乳化液とする。そして、 2 N氷酸化ナトリゥムで中和した後、 10%マルトース氷溶液を加えて lOnilに定容し、超音波ホモジナイザー（ブランソンモデル 1 8 5 ) で 60分間乳化して極めて微細な了ムホテリシン Bを舍有する乳剤を得た。また常法に従い凍結乾燥し凍結乾燥品を得た。

試験例 2 ：粒子径の測定

実施例 8〜 1 5で得られたアムホテリシン Bを含有する脂肪乳剤の乳剤粒子の粒子径について、レーザー光による動的光散乱粒子径測定装置を甩いその粒子径について評価したところ、下記の結果を得た。また、いずれも 1 m^上の粒子を舍まなかった。

実施例番号平均粒子径実施例番号平均粒子径

8 45nra 12 48ηπ

9 93nm 13 31nm

10 20nm 14 52nm

11 55ηπι 15 48niD

Claims

92/07571 23 請求の範囲.

( 1 ) アムホテリシン Bを舍有する脂防乳剤を製造する過程において、アムホテリシン Bを非晶質化して均質に脂質に分散させるに際して、酸及びエタノールを使用することを特徴とする脂肪乳剤の製造方法。

( 2 ) アムホテリシン Bを含有する脂肪乳剤を製造する過程において、アムホテリシン Bを非晶質化して均質に脂質に分散させるに際して、アムホテリシン Bの結晶の存在が確認できなくなるまでこれらを物理的に據合することを特徴とする脂肪乳剤の製造方法。

( 3 ) 物理的に棟合するに際して酸を加えることを特徴とする請求の範囲（ 2 ) 記載の脂肪乳剤の製造方法。