WO1991014705A1 - Fused antigen polypeptide - Google Patents

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WO1991014705A1
WO1991014705A1 PCT/JP1991/000376 JP9100376W WO9114705A1 WO 1991014705 A1 WO1991014705 A1 WO 1991014705A1 JP 9100376 W JP9100376 W JP 9100376W WO 9114705 A1 WO9114705 A1 WO 9114705A1
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WO
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dna
polypeptide
psghec
hepatitis
antigen polypeptide
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PCT/JP1991/000376
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Inventor
Kazuki Morita
Mamoru Hasegawa
Yashiharu Yokoo
Moriyuki Sato
Susumu Sekine
Seiji Sugimoto
Hideharu Mori
Terukatsu Arima
Hajima Yoshida
Original Assignee
Kyowa Hakko Kogyo Co., Ltd.
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Publication date
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    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K14/00—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof
    • C07K14/435—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof from animals; from humans
    • C07K14/575—Hormones
    • C07K14/61—Growth hormone [GH], i.e. somatotropin
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
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    • C07K14/005—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof from viruses
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K2319/00—Fusion polypeptide
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N2770/00—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA ssRNA viruses positive-sense
    • C12N2770/00011—Details
    • C12N2770/24011—Flaviviridae
    • C12N2770/24211—Hepacivirus, e.g. hepatitis C virus, hepatitis G virus
    • C12N2770/24222—New viral proteins or individual genes, new structural or functional aspects of known viral proteins or genes

Definitions

  • the present invention relates to a fusion antigen polypeptide obtained by fusing an antigen polypeptide derived from a non-human non-hepatitis C (hepatitis C) -related antigen with a polypeptide (heterologous polypeptide) different from the antigen polypeptide.
  • a recombinant plasmid incorporating a DNA encoding the fusion antigen polypeptide, a method for producing a fusion antigen polypeptide using a microorganism containing the recombinant plasmid, and the fusion antigen The present invention relates to a method for detecting an anti-hepatitis C virus antibody using a polypeptide.
  • the antigen-antibody reaction has been applied in various fields of medical and academic fields, and the fusion antigen polypeptide of the present invention is expected to be used in a wide range of fields.
  • Hepatitis C is also thought to be caused by non-A non-B hepatitis virus (also called Hepatitis C Virus (HCV) or ⁇ , ⁇ B Hepatitis Virus (NANBV), where HCV is used here).
  • HCV Hepatitis C Virus
  • NANBV Hepatitis Virus
  • Serum diagnosis of HCV infection is an important clinical diagnostic technique for the diagnosis of hepatitis C and prevention of HCV infection by transfusion, etc. This is based on the presence or absence of antibodies against serum HCV-associated antigens. It is performed by examining using an antibody reaction.
  • HCV-related gene cloned from hepatitis C serum [Arima et al., Experimental Medicine Vol.7, No.2, 94-101 (1989); Arima et al., Gastroenterologia Japonica 24, 540- 548 (1989)] and used for hepatitis C testing.
  • a fusion antigen polypeptide obtained by fusing a hepatitis C-associated antigen polypeptide with a heterologous protein is produced and used by a microorganism.
  • a heterologous protein to be fused Cho et al. Superoxide de dismutase (hereinafter abbreviated as S0D), and Arima et al. / S—D—galactosidase (8—D — Ga lactosidase (hereinafter abbreviated as / S-gal).
  • serum contains natural antibodies against these foreign proteins, and these antibodies may react with the foreign proteins. This not only increases the power-off value of diagnostic reagents, but also makes it necessary to absorb the antibodies by adding the heterologous protein to the serum prior to the test, making the operation extremely complicated and diagnosing. This can lead to a significant decrease in the accuracy of
  • a fusion antigen polypeptide in which an antigen polypeptide is chemically bound to a carrier such as bovine serum albumin, a mixture of several antigen molecules, or a pathogen The crude extract of is used, but there are problems in the stable supply of fusion antigen polypeptide and safety.
  • the method of directly expressing antigen polypeptides in microorganisms is used, but in many cases, expression is difficult due to the molecular weight, stability, and toxicity of the antigen polypeptide, and the antigen polypeptide is stable and inexpensive. Cannot be supplied to
  • the present inventors have studied a method for producing an antigen polypeptide useful for the detection of hepatitis C, and as a result, have found that one or more hepatitis C-related antigen polypeptides and salmon salmon; (Chum salmon growth hormone, hereinafter abbreviated as sGH) and a fusion antigen polypeptide in a form fused with methionine.
  • the present inventors have also proposed a method for detecting an anti-hepatitis C antibody using this fusion antigen polypeptide for a sample that cannot be detected by a conventionally reported detection method. They confirmed that they could be detected even if they were present, and found that they were superior to the conventional method, and completed the present invention.
  • the present invention provides at least one antigen polypeptide derived from a hepatitis C-related antigen (hereinafter abbreviated as hepatitis C-related antigen polypeptide), and a polypeptide different from the antigen polypeptide.
  • Antigen (hereinafter abbreviated as a heterologous polypeptide), a fusion antigen voriveptide fused with at least one of the above, a recombinant plasmid incorporating a DNA encoding the fusion antigen polypeptide, and the recombinant It is intended to provide a method for producing a fusion antigen polypeptide using a microorganism containing a plasmid and a method for detecting an anti-hepatitis C virus antibody (anti-HCV antibody) using the fusion antigen polypeptide.
  • anti-HCV antibody anti-hepatitis C virus antibody
  • FIG. 1 Construction process of plasmid pSGHEl.
  • Fig. 7 Plasmids pSGHEl, pSGHEC-2, pSGHBC-14, pSGHEC—SDS of fusion antigen polypeptide produced by Escherichia coli transfected with 18S and pSGHEC-1414—Starting point of polyacrylamide gel electrophoresis 7 ⁇ 3 ⁇ 4 o
  • FIG. 8 Construction process of plasmid pSGHEC-14A.
  • FIG. 10 SDS-polyacrylamide gel electrophoresis results of fusion antigen polypeptide produced by Escherichia coli transfected with brasmid pSGHEC-14A and pSGHEC-14B.
  • HCV-related hepatitis C-related antigen polypeptide used in the present invention Any antigen can be used. Specifically, clone No. 2 and clone No. 18 cloned by Arima et al. As HCV-related antigens [Arima et al., Gastro-enterologia Japonica 24_, 54 0-5 4 8 (1989)] and clone No. 14 can be used.
  • the antigens indicated by these clone numbers are hereinafter abbreviated as C-12, C-14 and C-18.
  • the amino acid sequences of these antigens and the nucleotide sequence of the DNA encoding them are shown in SEQ ID NOs: 13 and 14.
  • the methods for obtaining these three clones are as follows. First, the plasma of a hepatitis C patient is used as a material. RNA is extracted from this plasma, and cDNA is prepared by a random primer method. Using this cDNA, a cDNA library is prepared using the cDNA cloning system ⁇ gt11 kit (Amersham). This library is transferred to a nitrocellulose membrane, and imino screening is performed using serum obtained from the recovery phase of acute hepatitis and serum from a patient with chronic hepatitis that has been absorbed with Escherichia coli cells.
  • SEQ ID NO: 41 is the DNA sequence of C-14, where 15th A is G, 33rd A is G, 66th C is exactly, and 69th C is This is exactly what the 9th A is converted to a G.
  • SEQ ID NO: 42 is a deletion of the 94th to 108th positions of the DNA base sequence of SEQ ID NO: 41.
  • HCV-related antigens include Science 2 4 4, 3 5 9-
  • the heterologous polypeptide used in the present invention does not specifically react with the antibody in human serum, and any heterologous polypeptide that is expressed by a microorganism in a form fused with the hepatitis C-associated antigen polypeptide may be used. it can.
  • a polypeptide of chum salmon growth hormone (sGH) is preferably used.
  • sGH chum salmon growth hormone
  • the fusion antigen polypeptide can be obtained by recombinant DNA technology by encoding a DNA encoding a fusion antigen polypeptide in which an HCV-related antigen is bound to a heterologous polypeptide having a molecular weight of 2,000 or more, preferably via methionine.
  • a recombinant plasmid is constructed by integrating the gene reading frame into the vector DNA, and transforming the microorganism using the recombinant plasmid.
  • the transformed microorganism is cultured, and the fusion antigen is transformed into a culture. It can be obtained by producing and accumulating peptides, and collecting the fusion antigen boripeptide from the culture.
  • any vector DNA can be used as long as the inserted DNA can be expressed in a microorganism.
  • it has an appropriate promoter, for example, a promoter for tributane (trp system) or lactose (lac system) —the target DNA can be inserted downstream of the promoter, and furthermore, it is possible to insert a Shina Dalgarno sequence. Plasmids adjusted to an appropriate distance from the translation initiation codon, for example, 6 to 18 bases, can be used.
  • Specific preferred vector DNAs include pGEL 1 (FERM BP-629, JP-A-61-93197), pKYP 10 (JP-A-58-110600), pGHA2 (FERM BP-400, JP-A-60-221091).
  • a microorganism capable of expressing DNA encoding the fusion antigen polypeptide of the present invention and producing and accumulating the polypeptide in a culture can be used. Any can be used. Preferably, a microorganism belonging to Escherichia coli is used.
  • a fusion antigen polypeptide in which chum salmon growth hormone and an HCV-related antigen are bound via methionine is produced according to the following steps.
  • Steps 1-16 relate to the production of the fusion antigen polypeptides sGHEl, sGHEC-2, sGHEC-14, sGHEC-18S and sGHEC-1414
  • Steps 7-9 relate to the production of the fusion antigen polypeptides sGHEC-14A and SGHEC-14B .
  • DNs represented by SEQ ID NOs: 4, 5, 6, 7, 8, 9, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 15, 16, 17, 18, and 19 A is chemically synthesized.
  • DNAs are synthesized by an automatic DNA synthesizer using a solid phase synthesis method based on the phosphoramidite method.
  • DNA 4 the DNA represented by SEQ ID NO: 4
  • DNA 5 the DNA represented by SEQ ID NO: 5
  • gene 20 A plasmid containing a double-stranded DNA fragment (hereinafter referred to as gene 20) is created.
  • DNA 6 a double-stranded DNA formed from the DNA represented by SEQ ID NO: 6 (hereinafter referred to as DNA 6) and the DNA represented by SEQ ID NO: 7 (hereinafter referred to as DNA 7) and the DNA represented by SEQ ID NO: 8 DNA (hereinafter referred to as DNA 8) and the double-stranded DNA formed from the DNA represented by SEQ ID NO: 9 (hereinafter referred to as DNA 9) are ligated to each other, and are represented by SEQ ID NO: 21 Create a plasmid containing a double-stranded DNA fragment (hereinafter referred to as gene 21).
  • gene 21 a double-stranded DNA fragment
  • DNA 10 a double-stranded DNA formed from DNA represented by SEQ ID NO: 10 (hereinafter referred to as DNA10) and DNA represented by SEQ ID NO: 11 (hereinafter referred to as DNA 11).
  • DNA 13 and double-stranded DNA formed from DNA (hereinafter referred to as DNA 13) represented by SEQ ID NO: 13; DNA represented by SEQ ID NO: 14 (hereinafter referred to as DNA) Lower DNA 14) and a DNA represented by SEQ ID NO: 15 (hereinafter referred to as DNA 15) and a double-stranded DNA formed from the DNA represented by SEQ ID NO: 16 (hereinafter referred to as DNA 16)
  • DNA represented by SEQ ID NO: 17 are ligated together to form a double-stranded DNA fragment represented by SEQ ID NO: 22 (ligand).
  • a brassmid with the gene 22 will be created.
  • a plasmid containing the double-stranded DNA fragment represented by SEQ ID NO: 23 (hereinafter referred to as gene 23) is constructed.
  • the gene 20 is a peptide consisting of C-12
  • the gene 21 is a peptide consisting of C-14
  • the gene 22 Has a nucleotide sequence encoding a peptide consisting of C118.
  • Gene 23 is a linker for linking chum salmon growth hormone to each clone, and has a base sequence encoding a methionine, glutamic acid, phenylalanine, and a stop codon immediately after, and a glutamate.
  • the nucleotide sequence encoding the acid and phenylalanine serves as an EcoRI recognition site.
  • Step 2 Incorporation of Linker Gene into sGH Expression Plasmid: A plasmid PSGH1B2 used for expression of sGH gene produced according to the method described in JP-A-61-93197 is used. Bglll of PSGH1B2—Pvu I digested fragment (about 1,17 kb) and Nsi I-Pvu I digested fragment of PSGH1B2 (about 1.8 O kb) mixed with DNA 18 and DNA 19 Riga The double-stranded DNA is bound by a protease and glutamate via a methionine to a polypeptide consisting of a methionine at the amino terminal and amino acids 1 to 103 of sGH.
  • pSGHEl a plasmid containing a gene encoding a polypeptide to which acid and phenylalanine are linked (see Fig. 1) Amino acid sequence of the fusion polypeptide expressing pSGHEl in SEQ ID NO: 24 And the DNA sequence encoding it and the EcoRI recognition site. Underline in SEQ ID NO: 24 indicates a linker region.
  • the pSGHEl created in step 2 is cut with EcoRI, and then treated with Bacterial Alkaline Phosphatase (BAP). Then, it is digested with Hind111 and PvuI, and an EcoRI-HindIII fragment of about 320 bp and an EcoRI-PvuI fragment of about 1.8 kb are isolated. After pSGHEl is digested with Hind III and Pvu I, an approximately 850 bp Hind III-Pvu I digested fragment is isolated. When the DNA fragment and the double-stranded DNA fragment formed from DNA 4 to DNA 5 are ligated with DNA ligase, brassmid pSGi! EC-2 is obtained (see FIG. 2).
  • BAP Bacterial Alkaline Phosphatase
  • SEQ ID NO: 25 shows the amino acid sequence of the fusion antigen polypeptide expressed by PSGHEC-2 and the DNA sequence encoding it.
  • the underline in SEQ ID NO: 25 indicates the C-12 region.
  • the pSGHE1 created in step 2 is cut with EcoRI and then treated with Bacterial Alkaline Phosphatase (BAP). Then, it is digested with Hind III and Pvul, and an EcoRI-HindIII fragment of about 32 Obp and an EcoRI-Pvul fragment of about 1.8 kb are isolated. After digestion of pSGHEl with HindIII and PvuI, an approximately 850 bp HindIII-PvuI digested fragment is isolated. Plasmid pSGHEC-14 is obtained by combining the above DNA fragment and a double-stranded DNA fragment formed from DNA 6 to DNA 9 with DNA ligase (see FIG. 3).
  • BAP Bacterial Alkaline Phosphatase
  • pSGHEC—14 is The sGH gene encoded by pSGHE1 and the gene encoded by C-14 are retained through a gene encoding methionine.
  • SEQ ID NO: 26 shows the amino acid sequence of the fusion antigen polypeptide expressed by pSGHEC-14 and the DNA sequence encoding it. The underline in SEQ ID NO: 26 indicates the C114 region.
  • the pSGHE1 created in step 2 is cut with EcoRI and then treated with Bacterial Alkaline Phosphatase (BAP). Then, it is digested with HindIII and Pvul, and an EcoRI-HindIII fragment of about 32 Obp and an EcoRI-Pvul fragment of about 1.8 kb are isolated. After digesting pSGHE1 with HindIII and PvuI, an approximately 850 bp HindIII-PvuI digested fragment is isolated. When the DNA fragment and the double-stranded DNA fragment formed from DNA 10 to DNA 17 are ligated with DNA ligase, brasmid pSGHEC-18 is obtained (see FIG. 4).
  • BAP Bacterial Alkaline Phosphatase
  • SEQ ID NO: 27 shows the amino acid sequence of the fusion antigen polypeptide expressed by pSGHEC-18 and the DNA sequence encoding it.
  • the underline in SEQ ID NO: 27 indicates the C-18 region.
  • pSGHEC-14 A representative example using pSGHEC-14 created in step 3 is shown.
  • pSGHEC cut 14 with Pst ⁇ . Then, it is partially digested with EcoRI restriction enzyme to isolate an EcoRI-Pstl fragment of about 1.4 kb and an EcoRI-Pstl fragment of about 1.85 kb. Plasmid pSGHEC-1414 is obtained when the above DNA fragments are ligated with DNA ligase (see FIG. 6). pSGHEC-1414 retains a gene encoding sGH of pSGHE1 and a gene encoding two C114s via a gene encoding methionine.
  • SEQ ID NO: 28 shows the amino acid sequence of the fusion antigen polypeptide expressed by pSGHEC-1414 and the DNA sequence encoding it.
  • the underline in SEQ ID NO: 28 indicates a region where C114 is linked to two. Note that this step 5 makes it possible to link different types of antigen genes, which can be used for producing chimeric antigens.
  • Step 6 Production, isolation and purification of fusion antigen polypeptide in which chum salmon growth hormone and HCV-related antigen are bound
  • E. coli obtained by introducing the plasmid pSGHEl, pSGHEC-2, pSGHEC-14, pSGHEC- 18S, or pSGHEC-1414 produced in step 2, step 3, step 4, and step 5 into E. coli Is cultured in a medium, and a fusion antigen polypeptide in which chum salmon growth hormone and an HCV-related antigen are bound is collected from the culture.
  • the target fusion antigen polypeptide produced in the E. coli cells exists as water-insoluble granules. After completion of the culture, the cells are collected, crushed, and the crushed liquid is centrifuged to separate granules containing a fusion antigen polypeptide in which chum salmon growth hormone and an HCV-related antigen are bound.
  • Plasmids pSGHE1, pSGHEC-2, pSGHEC-14, pSGHEC-18S, fusion antigen polypeptides produced by E. coli harboring pSGHEC-1414 are sGHEL, sGHEC-2, sGHEC-14, and sGHEC, respectively. ⁇ 18 S, sGHEC-1414 and ⁇ [Step 7] Synthesis of HCV-related antigen gene
  • DNAs shown in the sequence listings 29, 30, 30, 31, 32, 33, 34, 35, and 36 are chemically synthesized.
  • the synthesis of these DNAs is performed by an automatic DNA synthesizer using a solid phase synthesis method by a phosphoramidite method.
  • a double-stranded DNA formed from DNA (hereinafter, referred to as DNA 33) and DNA represented by SEQ ID NO: 34 (hereinafter, referred to as DNA 34) is ligated with a ligase and expressed as SEQ ID NO: 37.
  • a plasmid containing a double-stranded DNA fragment (hereinafter referred to as gene 37) is constructed.
  • DNA3 double-stranded DNA formed from DNA29 and DNA30
  • DNA31 and DNA32 double-stranded DNA formed from DNA31 and DNA32
  • DNA3 DNA represented by SEQ ID NO: 35
  • DNA 36 DNA represented by SEQ ID NO: 36
  • DNA 36 DNA represented by SEQ ID NO: 38
  • a plasmid with the gene 38) is created.
  • Each of the double-stranded DNA fragments prepared from these synthesized DNAs has a gene 37 as a C-14 peptide, and a gene 38 as a C2-14 peptide as a C2-14 peptide. It has a nucleotide sequence encoding a peptide from which the amino acid at position 36 has been removed.
  • the gene 37 was obtained by partially changing the base sequence without changing the amino acid sequence of C-14, and the 15th base A of the C-14 base sequence was replaced with G, The third A is converted to G, the sixth C to T, the 69th C to D, and the 9.9th A to G.
  • Gene 38 is No. 93 of the nucleotide sequence of Gene 37 This is a synthetic DNA in which the 107th position has been deleted from the eye.
  • the peptide consisting of gene 37 or the DNA encoding it is C-14A
  • the peptide consisting of gene 3 & or the DNA encoding it is C-14B. It is written.
  • pSGHEl created in step 2 is cut with EcoRI, it is treated with Bacterial Alkaline Phosphatase (BAP). Then, it is digested with Hind III and Pvu I, and an EcoRI-Hind III fragment of about 32 Obp and an EcoRI-Pvu I fragment of about 1.8 kb are isolated. After pSGHE1 is digested with HindIII and PvuI, an approximately 850 bp HindIII-PvuII digested fragment is isolated. Plasmid pSGHEC-14A is obtained by combining the above DNA fragment and a double-stranded DNA fragment formed from DNA29 to DNA34 with DNA ligase (see FIG. 8).
  • BAP Bacterial Alkaline Phosphatase
  • SEQ ID NO: 39 shows the amino acid sequence of the fusion antigen polypeptide expressed by pSGHEC- 14A and the DNA sequence encoding it.
  • the underline in SEQ ID NO: 39 indicates the C-14A region.
  • pSGHEl created in step 2 is cut with EcoRI, it is treated with Bacterial Alkaline Phosphatase (BAP). Then, it is digested with Hind III and Pvu I, and an EcoRI-HindIII fragment of about 32 Obp and an EcoRI-PvuI fragment of about 1.8 kb are isolated. After pSGHE1 is digested with HindIII and PvuI, an approximately 850 bp HindIII-PvuI digested fragment is isolated. Plasmid pSGHEC-14B is obtained by combining the above DNA fragment with a double-stranded DNA fragment formed from DNA29 to DNA32 and DNA35 to DNA36 with DNA ligase (see FIG. 9). ).
  • pSGHEC-14B retains the sGH gene encoded by pSGHEl and the gene encoded by C-14B via the gene encoding methionine.
  • PSGHEC—14B is expressed in SEQ ID NO: 40 The amino acid sequence of the fusion antigen polypeptide and the DNA sequence encoding it are shown. The underline in SEQ ID NO: 40 indicates the C-14B region.
  • Step 9 Production, isolation and purification of fusion antigen polypeptide in which chum salmon growth hormone and HCV-related antigens (C-14A, C-14B) are bound, and plasmid pSGHEC produced in step (8) Using 14A and pSGHEC-14B, the fusion antigen polypeptide was produced, isolated and purified by the method described in Step 6.
  • the fusion antigen polypeptides containing brasmid pSGHEC-14A and pSGHEC-14B are referred to as sGHEC-14A and sGHEC-14B, respectively.
  • the granules are obtained according to the method described in JP-A-60-244259, and a denaturant (preferably 4 M or more urea or 3 M or more guanidine hydrochloride) is added. Dissolved in a buffer solution (pH 5 to 12) or a solubilizer solution (preferably 50% or more formic acid). After purifying the supernatant in the presence of a denaturing agent or a solubilizing agent, if necessary, the denaturing agent or the solubilizing agent is removed to obtain a crudely purified fraction.
  • a denaturant preferably 4 M or more urea or 3 M or more guanidine hydrochloride
  • the cells are disrupted according to the method described in JP-B-63-17898, and the supernatant is used as a crudely purified fraction. If produced in culture supernatant, centrifuge Prepare the culture supernatant by separation and use it as a crudely purified fraction.
  • the present invention also provides an anti-HCV antibody detection method using the above-mentioned fusion antigen polypeptide.
  • the immunological methods used in the present invention include the following, which can be carried out using the methods described in the respective documents.
  • RIA Radio Imnoassy
  • the fusion antigen polypeptide is coated on the wells of a microtiter plate, and the serum sample is transferred to a suitable buffer such as Buffer A CO. 15 M NaCK 0.1% gelatin, 1% bovine serum albumin and 0.1%. % put NaN 3 1 Z 1 5 M-phosphate isocyanatomethyl Li um buffer containing a (pH 7. 2) solution was diluted with] the Ueru, at 4-3 7, allowed to stand for 1 hour to 1 week, suitable Wash the wells well with buffer-for example, Buffer B CO. 0.5% Tween 20 and 1/15 M sodium phosphate buffer (pH 7.2) containing 0.15 M NaCl.
  • Buffer A CO 15 M NaCK 0.1% gelatin, 1% bovine serum albumin and 0.1%.
  • ⁇ ⁇ Add a conjugate obtained by binding the herb anti-human immunoglobulin antibody Fab fragment and horseradish peroxidase by the periodate method to an appropriate buffer, for example, dilute the buffer with a buffer B. You. After standing at 4 to 45 for 1 to 24 hours, wash with the same buffer. Then, a suitable substrate solution such as an ortho-phenylenediamine substrate solution
  • the method shown here is merely an example, and the antibody, substrate solution, color former, and the like can be appropriately changed.
  • reaction conditions in the above recombinant DNII technology are generally as follows.
  • 0.1 to 20 ⁇ g of DNA is mixed with 2 to 200 mM (preferably 10 to 40 mM) of tris-HC1 (H6.0 to 9. 5 preferably pH7. 0 ⁇ 8. 0), 0 ⁇ 2 0 OmM NaCl or KC1, 2 ⁇ 3 0 mM (preferably. 5 to 1 MgCl 2 in 0 mM), 0 ⁇ 2 0 mM of 2- menu mercapto
  • a reaction solution containing ethanol use 0.1 to 100 units of the restriction enzyme (preferably 1 to 3 units for 1 cz g of DNA) at 20 to 70 ° C (the optimal temperature is (Depending on the restriction enzyme used)) for 15 to 24 hours.
  • Purification of the DNA fragment generated by restriction enzyme digestion is performed by the LGT method, polyacrylamide gel electrophoresis, or the like.
  • the binding reaction of the DNA fragment is carried out at 2 to 200 mM (preferably 10 to 40 mM) of Tris-HCl (pH 6.1 to 9.5, preferably ⁇ 7.0 to 8.0), 2 to 2 mM. 0 mM (preferably 5 ⁇ 1 0 mM) MgCl 2 in, 0. 1 ⁇ 1 0 mM (preferably 0.5 ⁇ 2. 0 mM) ATP of,. 1 to 5 0 mM (preferably. 5 to 1 0 mM)
  • a reaction solution containing dithiothreitol use 0.3 to 10 units of T4 DNA ligase at 1 to 37 ° C (preferably 3 to 20 ° C) for 15 minutes to 72 hours (preferably). 2 to 20 hours).
  • the recombinant plasmid DNA produced by the ligation reaction may be used, if necessary, by the transformation method of Koen et al. [SN Cohen et al .: Proceding of the National Accademia. ⁇ Ob / Sai E. coli (Proc. Natl. Acad. Sci.) ⁇ USA. _6_9_, 2110 (1972)].
  • the fusion antigen polypeptide of the present invention can be produced as follows.
  • Escherichia coli W3110 strA and HB101 are transformed using the plasmid, and Escherichia coli having the plasmid is selected from ampicillin-resistant colonies.
  • Escherichia coli having a plasmid is selected from ampicillin-resistant colonies.
  • a synthetic medium or a natural medium can be used as long as it is suitable for the growth of Escherichia coli and production of the fusion antigen polypeptide. Wear.
  • the carbon source glucose, fracture toast, easy preparative Ichisu, Glycerol, mannitol, sorbitol, etc.
  • nitrogen sources NH 4 C1, (NH 4 ) 2 S0 4, vane Roh acid, yeast extract, polypeptone, meat extract, Ba click ingested Ributon, and corn 'Steve' liquor
  • K 2 HP0 4, KH 2 P0 4, NaCK MgS0 4, such as Vita Mi emissions B ,, MgCl 2 can be used .
  • the cultivation is performed by aeration and agitation cultivation at pH 5.5 to 8.5 at a temperature of 18 to 40.
  • the fusion antigen polypeptide After 5 to 90 hours of culturing, the fusion antigen polypeptide accumulates in the water-insoluble granules in the cultured cells.
  • the cells are collected from the culture, the cells are disrupted, and the disrupted liquid is centrifuged.
  • the fusion antigen polypeptide is collected from the precipitate obtained by separation using gel filtration column chromatography, HPLC, or the like.
  • the fusion antigen polypeptide was detected by heating and dissolving the cultured cells directly in Laemmli's Samburu buffer (Laemmli: Laemmli, Nature 227, 680 (1970)).
  • Laemmli's Samburu buffer Laemmli: Laemmli, Nature 227, 680 (1970)
  • —Polyacrylamide gel (Laemmli's method: ibid.), Coomassie Brilliant Blue dye [Cooraassie Brilliant Blue] dye [Bio-Rad (Bio-
  • DNAs 4 to 19 were synthesized by a solid phase synthesis method using a phosphoramide method [SL Beaucage et al., Tetrahedron Letters 22, 1859 (1981). LJ McBrie et al. 5 (1983)], using an automated DNA synthesizer 38 OA of Applied Biosystems as follows.
  • Silica gel is used as the solid support and the 5 'hydroxyl group of the nucleotide bonded to it via the 3' hydroxyl group is converted to (1) the nucleotide by the phosphoric acid amidite method.
  • the next nucleotide was similarly condensed.
  • the steps (1) to (3) were repeated to synthesize DNA on the carrier.
  • the DNA-bound carrier is left in a thiophenol solution for 1 hour at room temperature to remove the protecting group of lysic acid, and then left in concentrated ammonia water at room temperature for 1 hour to remove DNA from the carrier. Let go. Concentrated aqueous ammonia containing DNA was heated in a sealed container at 60 for 12 hours to remove the protecting groups on the base.
  • DNA 4 as an example, synthesis is performed using a carrier to which 0.2 moles of nucleotides are bound, followed by removal of protecting groups and release reaction from the solid phase to obtain a crude product of DNA 4 21 OD. The unit (260 nnTC measurement) was obtained. 5 OD units of this crude product were purified by electrophoresis on a 10% polyacrylamide gel (2 x 13 cm x 13 cm) using a tris-borate buffer (pH 8) containing 7 M urea.
  • DNA 4 was extracted with 1 ml of 0.2 M triethylamine carbonate buffer (pH 8) (hereinafter referred to as TEAB) for 18 hours, and then the extract was subjected to Sephadex DE 5 DNA 4 was adsorbed through column 2 (diameter 6 and length 5 mm). Elution was performed with 2 ml of 2 M TEAB to obtain a pure product of DNA 4 in 1.4 0. D. units.
  • TEAB triethylamine carbonate buffer
  • DNAs other than DNA 4 were also synthesized with similar yields.
  • the structure of pKYPIO was confirmed by digestion with EcoRI, KpnK BaraHI, and BgllK Pstl (Takara Shuzo) and agarose gel electrophoresis.
  • the structure of PSGH1B2 was confirmed by agarose gel electrophoresis after digestion with EcoRI, Hindlll, BglII, BamHI, and NsiK Pstl (Takara Shuzo).
  • a solution containing 10 units of the restriction enzyme Pvul (manufactured by Takara Shuzo), 10 units of Bglll (manufactured by Takara Shuzo), and 10 units of Nsil (manufactured by Takara Shuzo) was prepared using 2 ug of the plasmid PSGH1B2 obtained in Example 2 [1 OmM Squirrel-HC1 (pH 7.5), 7 mM MgCl 2 , 6 mM 2-mercaptoethanol, 100 mM NaCl] 301 and digested at 37 ° C. for 2 hours.
  • the reaction solution was subjected to agarose gel electrophoresis containing ethidium bromide, and the gel pieces containing the DNAs of about 1.17 kb and about 1.80 kb were cut out by detection with ultraviolet light (wavelength: 302 nm).
  • 0.5 ml of phenol was added to the gel pieces and the mixture was frozen and thawed.
  • the aqueous layer was washed with a mouth-mouth form, and the upper DNA was recovered by ethanol precipitation.
  • Each of DNA 18 and DNA 19 was added to T 4 polynucleotide kinase reaction buffer [50 mM Tris-HCKPH7.5], 1 OmM MgCl 2 , 5 mM dithiothreitol (hereinafter abbreviated as DTT). ), IraM ATP, 0.1 mM spermidine, 0.1 mM EDTA) 4
  • DTT dithiothreitol
  • This reaction solution was mixed in 4 ⁇ 1 portions, and the DNA fragments obtained above were added in 0.08 praole each, and a buffer for T4 ligase reaction (28 mM Tris-HCl (pH 7.5), 9 mM MgCl 2 , 1 mM) was added. 0 mM DTT, 0.03 mM EDTA, 0.7 mM ATP, 0.03 mM spermidine], and added T4DNA ligase (Takara Shuzo Co., Ltd.) (175 units) to obtain 30 ⁇ 1. . The binding reaction was performed at 4 for 16 hours.
  • pSGHEl The structure of pSGHEl was confirmed by agarose gel electrophoresis after digestion with BglII, PvuK HindIII, EcoRI and NsiI.
  • the cleavage reaction of the restriction enzymes 1 Omm preparative Risu HC1 (pH 7.5), so that the optimal concentration of each enzyme to a solution of the composition of 7mM MgCl 2, 6 mM 2- mercaptoethanol (0 ⁇ 2 0 OmM) NaCl
  • the reaction was performed using the added reaction solution.
  • Hindlll (Takara Shuzo) 10 units, Pvul (manufactured by Takara Shuzo Co., Ltd.) (10 units) was added, and the digestion reaction was performed at 37 ° C for 2 hours. Simultaneously, 10 units of Hindlll (manufactured by Takara Shuzo) and 10 units of Pvul (manufactured by Takara Shuzo) were added to PSGHE1, and a digestion reaction was performed at 37 for 2 hours.
  • the above reaction mixture is subjected to agarose gel electrophoresis containing ethidium bromide, and detected by ultraviolet rays (wavelength: 302 nm) to obtain DNA fragments of about 320 b, about 850 b, and about 1.8 kb.
  • Wavelength: 302 nm ultraviolet rays
  • This reaction solution was mixed with 41 each, and the DNA fragments obtained above were added with 0.08 pmole of each, and a buffer for T4 ligase reaction (28 mM Tris-HCl (pH 7.5), 9raM MgCl 2 , 10 mM DTT, 0.03 mM EDTA, 0.7 mM ATP, 0.03 mM spermidine], and add 17 5 units of T4DNA ligase (Takara Shuzo). ⁇ 1 The binding reaction was performed at 4 for 16 hours.
  • the reaction was transformants conversion by the method of Cohen et al. Escherichia coli HB101 strain was used to obtain colonies of ampicillin resistant (Ap r). Plasmid DNA was recovered from this colony by the alkaline treatment method to obtain pSGHEC-2. The structure of pSGHEC-2 was confirmed by digestion with BglII, PvuU Hindlll, and EcoRI and agarose gel electrophoresis. The cleavage reaction of the restriction enzymes 1 0 mM Application Benefits Sue HC1 (PH7. 5), 7 mM MgCl 2, 6mM 2- To a solution of the composition of mercapto ethanol so that the optimal concentration of each enzyme (0-200 mM) NaCl The reaction was performed using the added reaction solution.
  • Escherichia coli strains containing PSGHEC-2 include Escherichia coli SGHEC 2, FERM Deposited as BP-2 732 in the Institute of Microorganisms and Industrial Technology (Microelectronics Research Institute) on January 18, 1990 under the terms of the Budapest Treaty.
  • the plasmid pSGHEl 2 obtained in Example 3 was dissolved in the restriction enzyme reaction solution (100 mM NaCl) 301 shown in Example 2, and 10 units of EcoRI (Takara Shuzo) was added thereto. For 2 hours. Next, 1 unit of Bacterial Alkaline Phosphatase (Takara Shuzo) was added to the reaction solution, and the mixture was reacted at 65 with 30 minutes.
  • Hind III (Takara Shuzo Co., Ltd.) 1 0 units
  • Pvul (Takara Shuzo Co., Ltd.) 1 0 c simultaneously Hind III (Takara Shuzo Co., Ltd.) pSGHEl was 2 hours and digested at a unit added 3 7 10 units, Pvul ( 10 units were added, and a digestion reaction was performed at 37 for 2 hours.
  • This reaction mixture was subjected to agarose gel electrophoresis containing ethidium gel, and ultraviolet light (wavelength: 302 nm) was detected to cut out about 320 b. About 850 b and about 1.8 kb of DNA fragments. .
  • 0.5 ml of phenol was added, frozen and thawed, and the aqueous layer was purified with black-mouthed form, and the DNA fragment was recovered by ethanol precipitation.
  • T4 polynucleotide kinase reaction buffer [50 mM Tris-HCl (pH 7.5), 10 mM MgCl 2 , 5 mM DTT, 1 mM ATP. 0.1 mM Spermidine, 0.1 mM EDTA) Dissolve in 30 z1 portions, add 3 units of T4 polynucleotide kinase (Takara Shuzo Co., Ltd.). Heated for 15 minutes to inactivate the enzyme. Mixing the reaction mixture by 4 a 1, respectively 0.08pmole added DNA fragment obtained in the above, T 4 for ligase reaction buffer [28 mM preparative Risu HC1 (pH7.
  • E. coli HB101 was transformed by the method of Cohen et al. And conversion, to obtain colonies of ampicillin-resistant (Ap r).
  • the plasmid DNA was recovered from this colony by the alkaline treatment method to obtain pSGHEC-14.
  • the structure of pSGHEC-14 was cut with BglII, Pvul, Hindlll, and EcoRI, and confirmed by agarose gel electrophoresis. Restriction enzyme cleavage reaction is carried out in a solution composed of 10 mM Tris-HCl (pH 7.5), 7 mM MgCl 2 , 6 mM 2-mercaptoethanol so that the optimal concentration of each enzyme is obtained (0 to 200 mM). ) The reaction was performed using a reaction solution to which NaCl was added.
  • Escherichia coli strains containing PSGHEC- 14 were submitted to Escherichia coli SGHEC 14 and FERM BP-273 1 under the terms of the Budapest Treaty by the Institute of Microbiology and Industrial Technology (Micro-Institute), January 1990. Deposited on 18th.
  • Example 6 Preparation of plasmid pSGHEC-18
  • the plasmid pSGHEl 2 obtained in Example 3 was dissolved in the restriction enzyme reaction solution (100 mM NaCl) 301 shown in Example 2, and 10 units of EcoRI (Takara Shuzo) was added. A time digestion reaction was performed. Next, 1 unit of Bacterial Alkaline Phosphatase (manufactured by Takara Shuzo Co., Ltd.) was added to the reaction solution, and the mixture was reacted at 65 with 30 minutes. Then, 10 units of Hindlll (manufactured by Takara Shuzo) and 10 units of Pvul (manufactured by Takara Shuzo) were added, and a digestion reaction was carried out at 37 ° C for 2 hours.
  • the reaction mixture is subjected to agarose gel electrophoresis containing ethidium gel and detected with ultraviolet light (wavelength: 302 nm) to obtain DNA fragments of about 320 b, about 850 b, and about 1.8 kb. I cut it out. 0.5 ml of phenol was added to the gel pieces, frozen and thawed, and the aqueous layer was washed with chloroform. After that, the DNA fragment was recovered by ethanol precipitation.
  • each T 4 polynucleotidyl click Reochi Dokina over peptidase reaction buffer Each 1 0 pmole [50mM preparative Risu HC1 (pH7. 5), 1 0 mM MgCl 2, 5 mM DTT, 1 mM ATP, 0.1 mM spermidine, 0.1 mM EDTA] dissolved in 30 1 each, and T4 polynucleotide kinase (Takara Shuzo) After adding 3 units and performing a phosphorylation reaction at 37 for 40 minutes, the enzyme was inactivated by heating at 65 ° C for 15 minutes.
  • the reaction solution was mixed 4 ⁇ 1 each, and 0.08 pmole of each of the DNA fragments obtained above was added thereto, and a buffer solution for T4 ligase reaction [28 mM Tris-HCl (pH 7.5), 9 ⁇ MgCl 2 , 10 mM DTT, 0.03 mM EDT A. 0.7 mM ATP, 0.03 mM spermidine], and T4 DNA ligase (Takara Shuzo) 175 units were added to give 301.
  • the binding reaction was performed at 4 eC for 16 hours.
  • Escherichia coli HB101 strain using a reaction was transformants conversion by the method of Cohen et al, to obtain colonies one ampicillin-resistant (Ap r). Plasmid DNA was recovered from this colony by the alkaline treatment method to obtain pSGHEC-18. The structure of pSGHEC-18 was confirmed by agarose gel electrophoresis after digestion with BglII, PvuU Hindlll and BcoRI. Cleavage reaction of restriction enzyme 1 O mM preparative Risu HC1 (pH7.
  • the reaction mixture is subjected to agarose gel electrophoresis containing ethidium bromide, and detected by ultraviolet light (wavelength: 302 nm).
  • the approximately 2.36 kb DNA fragment of pSGHEC-18 and the approximately 1.1 kb DN fragment of pKYP10 are detected.
  • a fragment was cut out.
  • 0.5 ml of phenol was added to the gel pieces, frozen and thawed, and the aqueous layer was washed with chloroform. After that, the above DNA fragment was recovered by ethanol precipitation.
  • T4 ligase anti-application buffer [28 mM Tris-HC1 (pH 7.5), 9 mM MgCl 2 . TT, 0.3 mM EDTA, 0.7 mM AT P. 0.03 mM spermidine], and 175 units of T4DNA ligase (Takara Shuzo) were added. In addition, 30; The binding reaction was performed at 4 ° C for 16 hours.
  • the reaction was transformants conversion by the method of Cohen et al. Escherichia coli HB101 strain was used to obtain colonies of ampicillin resistant (Ap r). Plasmid DNA was recovered from this colony by the alkaline treatment method to obtain pSGHEC-18S. The structure of PSGHEC-18S was confirmed by digestion with BglII, Pvul, Hindlll, and EcoRI and agarose gel electrophoresis. Cleavage of the restriction enzyme was performed so that the optimal concentration of each enzyme was adjusted to a solution of 1 O mM Tris-HC1 (pH 7.5), 7 raM MgCl 2 , and 6 mM 2-mercaptoethanol (0- (200 mM) NaCl was used for the reaction.
  • Escherichia coli strain containing SGHEC-18S was submitted to the Institute of Microorganisms and Industrial Technology (MIC) under the terms of the Budapest Treaty as Escherichia coli SGHEC18S. FBRM BP—27 29 January 1, 1990 8 Deposited on date.
  • MIC Institute of Microorganisms and Industrial Technology
  • the reaction was transformants conversion by the method of Cohen et al. Escherichia coli HB101 strain was used to obtain colonies of ampicillin resistant (Ap r). Plasmid DNA was recovered from this colony by the alkali treatment method to obtain pSGHEC-1414. The structure of pSGHEC-1414 was confirmed by agarose gel electrophoresis after digestion with BglII, Pvul, Hindlll and EcoRI. Restriction cleavage reaction is 1 O mM preparative squirrel one HC1 enzyme (pH7. 5), 7 mM MgCl 2, 6 mM 2- mercapto E To a solution of the composition of ethanol so that the optimal concentration of each enzyme (0 (200 mM) NaCl was used for the reaction.
  • Escherichia coli strains containing PSGHEC-1414 were submitted to Escherichia coli SGHEC1414 and FERM BP-273 by the Institute of Microorganisms and Industrial Technology (MIC) under the terms of the Budapest Treaty on January 18, 1990. Has been deposited.
  • MIC Institute of Microorganisms and Industrial Technology
  • Escherichia coli W3110 strA (FERM BP-732) was transformed by the method described in Example 3.
  • the resulting Ap r of the roller twenty-one the 8 ml of LG medium (1% Bak preparative tryptone, 0.5 yeast extract, 0.5% NaCl, 0. 1% glucose, 5 0 wg / ml Anpishiri emissions, pH 7 .4) and cultured at 30 ° C for 16 hours.
  • the culture solution 2 0 0 1 1 0 ml of MC G media (0. 6% Na 2 HP0 4 , 0. 3% KH 2 P0 4, 0. 0 5% NaCl, 0. 1% NH 4 CU 0. .!.
  • Escherichia coli W3110 strA (FERM BP-732) was transformed by the method shown in Example 3.
  • the obtained Ap r colonies were inoculated into an LG medium as in Example 9, and cultured at 30 ° C for 16 hours.
  • This culture was inoculated into a medium in which 50 ml of ampicillin was added to 10 ml of MCG medium and cultured at 30 ° C. for 24 hours. The culture was centrifuged at 7,000 rpm for 5 minutes to collect the cells, and the cells were dissolved in a sample buffer of Laemmli, heated, and subjected to SDS-polyacrylamide gel electrophoresis. As a result, the polypeptide band was detected at a site having a molecular weight of about 14,800 (see FIG. 7B). Escherichia coli W3110 strA strain without pSGHEC-2 did not have a corresponding band. This indicates that the Escherichia coli W3110 strA strain carrying pSGHEC-2 produces the fusion antigen polypeptide sGHEC-2 of sGH with the HCV-related antigen encoded by C-2.o
  • E. coli W3110 strA (FERM BP-732) was transformed by the method described in Example 3.
  • the resulting Ap 'colonies were inoculated into an LG medium as in Example 9, and cultured at 30 ° C for 16 hours.
  • This culture solution 2001 was inoculated into a medium in which 50 ⁇ g / ml of ampicillin was added to 10 ml of MCG medium, and cultured for 30 hours and 24 hours. culture The solution was centrifuged at 7,000 rpm for 5 minutes to collect the cells, and the cells were dissolved in a sample buffer of Laemmli, heated, and subjected to SDS-polyacrylamide gel electrophoresis. As a result of staining with, a polypeptide band was detected at a site having a molecular weight of about 17,100 (see Fig. 7C). E. coli W3110 strA strain without pSGHEC-14 did not have a corresponding band. This suggests that the E. coli W3110 strA strain carrying pSGHEC-14 produces sGHEC-14, a fusion antigen polypeptide of sGH with HCV-related antigen encoded by C-14. It is shown that.
  • Escherichia coli W3110 strA strain (FERM BP-732) was transformed by the method shown in Example 3 using pSGHEC-18S obtained in Example 7. The obtained Apr colony was inoculated into an LG medium in the same manner as in Example 9, and cultured at 30 for 16 hours.
  • This culture solution 2 5 JCI g Toributofa emissions and 3 0 MC G medium containing Anpishiri emissions of S ZML of ZML [Na 2 HP0 4 0. 6%, H 2 P0 4 0.3%, NaCl 0. 5 weathervane Amino Acids 0 .. 5 MgS0 4 1 mM, Vita Mi emissions B Interview 4 / mK pH7 4) was inoculated into 1 0 ml, after 4-8 hours at 3 0 C, an inducer of Application Benefits Butofa down 3; 5- Indoleacrylic acid (3-indoleacrylic acid; hereafter abbreviated as IAA) was added in an amount of 10 ⁇ g Zml, and the culture was further continued for 2 to 12 hours.
  • IAA 5- Indoleacrylic acid
  • the culture was centrifuged at 7,000 rpm for 5 minutes to collect the cells, and the cells were dissolved in Remley's sample buffer, heated, and subjected to SDS-polyacrylamide gel electrophoresis.
  • polypeptide band was detected at a site with a molecular weight of about 20,400 (see Fig. 7D).
  • Escherichia coli W3110 strA strain without pSGHEC-18S did not have a corresponding band. This holds pSGHEC—18S It is shown that Escherichia coli W3110 strA strain produced sGHEC-18S, a fusion antigen of HCV-related antigen encoded by C-118 and sGH.
  • Escherichia coli W3110 strA (FERM BP-732 :) was transformed by the method shown in Example 3.
  • the obtained Ap r colonies were inoculated into an LG medium as in Example 9, and cultured at 30 ° C for 16 hours.
  • This culture solution was inoculated into a medium obtained by adding 50 g / ml of ampicillin to 10 ml of MCG medium, and cultured for 30 to 24 hours.
  • the culture was centrifuged at 7, OOOrpm for 5 minutes to collect the cells, the cells were dissolved in Remuri's sample buffer, heated, and subjected to SDS-polyacrylamide gel electrophoresis to remove Coomassie Prilian Blue.
  • Example 11 The culture solution obtained in Example 11 was centrifuged at 8000 rpm for 40 minutes to collect cells, and washed with 30 mM NaCl and 30 mM Tris-HCl buffers (pH 7.5). sGHEC-14 was expressed as granules in E. coli. First, sGHEC-14 granules were purified from the washed cells to a purity of 90 according to the method described in JP-A-60-244259. 80 mg of these granules were solubilized in 70% formic acid to make 40 ml, centrifuged at 12000 rpm for 20 minutes, and sGHEC-14 was purified using reverse phase HPLC. The operating conditions for reverse phase HPLC are as follows. Column: Hi—PORE C 421.5 mm x 25 cm (Biorad) Solution A: 0.1% trifluoroacetic acid, 15% acetonitril
  • Solution B 0.1% trifluoroacetic acid, 90% acetonitrile
  • sGHEC-14 was eluted in reverse phase HPLC by 26-28 minutes after the start of the gradient. After dissolving 40 ml of the eluted fraction in 1 ml portions, the mixture was freeze-dried to obtain a sample of sGHEC-14. The 1 vial was dissolved in 1 ml of 0.1% trifluoroacetic acid and analyzed by protein assay kit (BioRad) SDS-polyacrylamide gel. The protein concentration was 0.2 to 0.6 mg / ml. ml (0.44 mg / ml for sGHEC-14, in terms of bovine serum albumin) and a purity of 90 or more.
  • sGHEl, sGHEC-12, sGHEC-18S, sGHEC-1414 are also refined. It can be manufactured.
  • WB Western blotting
  • the purified C114 fusion antigen polypeptide obtained in Example 14 was used as the HCV-related fusion antigen used.
  • the plate was immersed in a block (10 mM phosphate buffer, pH 7.2, 500 mM NaCK, 5% skim milk, 1 drop of antifoam) and shaken at room temperature for 2 hours. After shaking, the nitrocellulose membrane was cut into strips so that the protein amount became 3 g Z strip. This strip was immersed in a 3 ral block, and 30 ⁇ l of human serum was added thereto, followed by overnight treatment at room temperature.
  • the filter was washed with Tween-PBS (1 O mM phosphate buffer PH 7.2, 500 mM NaCl, 0.05 ⁇ Tween 20), and then the anti-human immunoglobulins peroxidase conjugate was used.
  • Tween-PBS 1 O mM phosphate buffer PH 7.2, 500 mM NaCl, 0.05 ⁇ Tween 20
  • the anti-human immunoglobulins peroxidase conjugate was used.
  • the coloring agent used was a mixture of 60 mg of 4-chloro-11-naphthol (BioRad) plus cold methanol and a mixture of 100 ml of PBS and 100 ml of hydrogen peroxide.
  • the color reaction was allowed to react for 30 minutes, protected from light, and then washed with water to complete the reaction.
  • the sera used are as follows.
  • the PIB method is an abbreviation of the plaque-imno's blot method [Arima et al., Japanese clinical practice 48, 27–32 (1990)], and the chiron method is described in Kuo, G. et al, Science 244, 362–.
  • Serum (1) (2) is PIB method C-14 (-), C-18 (+) Patient serum: (3)-(10) is PIB method C-14 (+) Patient serum: (11)-(: 15): PIB method C-14 (1)
  • Patient serum: ( 15E) is PIB method C114 (1)
  • Chiron method (+) serum: (16E) is PIB method C114 (1), Chiron method (1).
  • Table 2 shows the results of Western blotting for sera (1) to (: 15).
  • Table 3 shows the results of Western blotting from serum (1E) to (: 16E).
  • the C-14 determination according to the conventional PIB and the WB determination according to the present invention showed a very good correlation.
  • a C-14 negative test sample by the conventional PIB method must be detected by the WB method using the fusion antigen polypeptide used in the present invention.
  • (16E) a sample determined to be negative by the chiron method could be detected by the WB method according to the present invention. It was found that none of the WB methods using the fused sGH polypeptide alone showed reactivity with serum. Therefore, the fusion antigen polypeptide of the present invention is considered to be extremely effective for use in serodiagnosis for detecting anti-HCV antibodies.
  • HBV Hepatitis B virus carrier
  • DNAs 29 to 36 were synthesized in the same manner as in Example 1.
  • This reaction mixture is subjected to agarose gel electrophoresis containing ethidium gel, and ultraviolet (wavelength: 302 nm) is detected to cut out DNA fragments of about 320 b, about 850 b, and about 1.8 kb.
  • ultraviolet wavelength: 302 nm
  • 0.5 ml of phenol was added to the gel pieces, frozen and thawed, and the aqueous layer was purified with black-mouthed form, and the above DNA fragment was recovered by ethanol precipitation.
  • DNA 29-34 10 pmole each with T4 polynucleotide kinase-buffer for reaction (50 mM Tris-HC1 (pH 7.5), 10 mM MgCl 2 , 5 mM DTT, 1 mM ATP, 0.1 mM spermidine, 0.1 mM EDTA] 30 ⁇ 1 each, and add 3 units of T4 polynucleotide kinase (Takara Shuzo). After that, heating was performed at 65 for 15 minutes to inactivate the enzyme.
  • the reaction mixture was mixed with 4 ml each, and 0.08 pmole of each of the DNA fragments obtained above was added, and a buffer for T4 ligase reaction (28 mM Tris-HCKPH7.5), 9 mM MgCl 2 , 10 mM mM DTT, 0.03 mM EDTA, 0.7 mM ATP, and 0.03 mM spermidine], and add 175 units of T4DNA ligase (Takara Shuzo), and add 1 The binding reaction was performed at 4 ° C for 16 hours.
  • E. coli HB101 was transformed by the method of Cohen et al. And conversion, to obtain colonies of ampicillin resistant (Ap r). Plasmid DNA was recovered from this colony by the manual treatment method to obtain pSGHEC-14A. The structure of pSGHEC-14A was confirmed by agarose gel electrophoresis after digestion with BglII, PvuK HindIII and EcoRI. Restriction enzymes disconnect reaction 1 OiiiM bets Risu HCKPH7.
  • Escherichia coli strains containing SGHEC-14A were deposited as Escherichia coli SGHEC14A, FERM BP-3261 with the Institute of Microbial Industry and Technology (MIC) under the terms of the Budapest Treaty on February 1, 1991. I have.
  • the reaction mixture is subjected to agarose gel electrophoresis containing ethidium gel and detected with ultraviolet light (wavelength: 302 nm) to obtain DNA fragments of about 320 b, about 850 b, and about 1.8 kb. I cut it out. 0.5 ml of phenol was added to the gel pieces, frozen and thawed, and the aqueous layer was washed with black-mouthed form, and the DNA fragment was recovered by ethanol precipitation.
  • T4 ligase reaction buffer 28 mM Tris-HCl (pH 7.5), 9 mM MgCl 2 2 , 10 raMD TT. 0.03 mM EDTA, 0.7 mM ATP, 0.03 mM spermidine], and add 175 units of T4 DNA ligase (Takara Shuzo). / 1 4 ° C in 1 6 hour coupling reaction was carried out t HB101 E. coli strain using the reaction solution transformants' to conversion by the method of Cohen et al, to obtain colonies of ampicillin resistant (Ap r).
  • Plasmid DNA was recovered from this colony by the manual treatment method to obtain pSGHEC-14B.
  • the structure of pSGHEC-14B was confirmed by agarose gel electrophoresis after digestion with BglII, PvuK HindIII and EcoRI. Cleavage of the restriction enzyme should be carried out in a solution with the composition of 10 mM Tris-HCl (pH 7.5), 7 mM MgCl 2 , 6 mM 2-mercaptoethanol to obtain the optimal concentration of each enzyme (0 to (200 mM) NaCl was used for the reaction.
  • Escherichia coli strains containing pSGHEC-14B were deposited as Escherichia coli SGHEC14B, FBRM BP-13262 with the Institute of Microbial Industry and Technology (MIC) under the terms of the Budapest Treaty on February 1, 1991. I have.
  • Escherichia coli W3110 strACFERM BP-732) was transformed by the method shown in Example 3 using pSGHEC-14A obtained in Example 17.
  • the obtained Apr colony was inoculated into an LG medium in the same manner as in Example 9, and cultured at 30 for 16 hours.
  • This culture solution 200 n1 was inoculated into a medium in which 50 g / ml of ampicillin was added to 10 ml of MCG medium, and cultured at 30 for 24 hours. The culture is centrifuged at 7,000 rpm for 5 minutes to collect the cells, which are then dissolved in a sample buffer of Remuri, heated, and then subjected to SDS-polyacrylamide. Gel electrophoresis was performed, and staining was performed using Coomassie Pleuriant Blue. As a result, a polypeptide band was detected at a site having a molecular weight of about 17,100 (see FIG. 10F).
  • pSGHEC—E. coli W3110 strA strain without 14A did not have a corresponding band. This suggests that E. coli W3110 strA strain carrying pSGHEC-14A produced sGHEC-14A, a fusion antigen polypeptide of sGH with HCV-related antigen encoded by C-14A. Which indicates that.
  • Example 18 Escherichia coli W3110 strACFBRM BP-732) was transformed by the method shown in Example 3. The obtained Apf colony was inoculated into an LG medium as in Example 9, and cultured at 30 for 16 hours.
  • the culture solution 200 01 was inoculated into a medium obtained by adding 50 ⁇ g Zml of ampicillin to 10 ml of MCG medium, and cultured at 30 ° C for 24 hours.
  • the culture was centrifuged at 7, OOOrpm for 5 minutes to collect the cells, and the cells were dissolved in a sample buffer of Laemmli, heated, and subjected to SDS-boriacrylamide gel electrophoresis, followed by coomassie brilliant blue.
  • the polypeptide band was detected at a site having a molecular weight of about 16,500 (see FIG. 10G).
  • No corresponding band was found in E. coli W3110 strA strain without pSGHEC-14B. This means that E. coli W3110 strA strain carrying pSGHEC-14B produced sGHEC-14B, a fusion antigen polypeptide of HCV-related antigen encoded by C-14B and sGH. It shows that you are doing.
  • SGHEC-14A and SGHEC-14B were purified in the same manner as in Example 14. It can be manufactured.
  • fusion antigen polypeptide in which an antigen polypeptide is fused with a heterologous polypeptide.
  • the fusion antigen polypeptide can be used for accurate serodiagnosis of patients infected with hepatitis C virus.
  • Sequence type nucleic acid
  • Sequence type Other nucleic acids cDNA derived from RNA from sera of patients with abnormal liver function other than hepatitis B (hepatitis C virus-related antigen gene)
  • Sequence type nucleic acid
  • GAA TTC CGA GAA CAA GAC CAG ATA AAA ACC AAA GAC AGA ACA CAA CAG 48 Glu Phe Arg Glu Gin Asp Gin lie Lys Thr Lys Asp Arg Thr Gin Gin
  • AGA AAG ACG AAA AGA AGC ACC AAT CGC AGG CGA AGC AAA AAC GAA AAA 96 Arg Lys Thr Lys Arg Ser Thr Asn Arg Arg Arg Ser Lys A sn Glu Lys
  • Sequence type nucleic acid
  • GAC ACA CAC AAG AAA CAA AGG AGG TAC AAA GAA AAA GAA AAA ACG GCA 96 Asp Thr His L s L s G 1 n Arg Ar g Tyr L s Glu L s Glu Lys Thr Ala
  • Sequence type nucleic acid
  • Type of row E Other nucleic acid synthesis D N A
  • Sequence type nucleic acid
  • Type of row E Other nucleic acid synthesis D N A
  • Sequence type nucleic acid
  • Sequence type nucleic acid
  • Type of row E Other nucleic acid synthesis D N A
  • Sequence type nucleic acid
  • Type of row E Other nucleic acid synthesis D N A
  • Sequence type nucleic acid
  • Type of row E Other nucleic acid synthesis D N A
  • Sequence type nucleic acid
  • Type of row E Other nucleic acid synthesis D N A
  • Sequence type nucleic acid
  • Sequence type nucleic acid
  • Sequence type nucleic acid
  • Type of SB column Other nucleic acid synthesis D N A
  • Sequence type nucleic acid
  • Sequence type nucleic acid
  • Synthetic D ⁇ ⁇ fragment formed from SEQ ID NO: 10. 11, 12. 13.14, 15. 16.17
  • Sequence type nucleic acid
  • Sequence type other nucleic acid Synthetic DNA fragment formed from SEQ ID NO: 18, 19 Characteristic of linker DNA sequence used for constructing plasmid
  • Sequence type nucleic acid
  • Sequence type Other nucleic acid DNA fragment formed from SEQ ID NO: 18.19 linked to salmon growth hormone DNA fragment
  • Sequence type nucleic acid
  • Sequence type Other nucleic acid DNA fragment formed from Sequence Listing 4.5
  • Type of BB column Other nucleic acids Sequence listing DNA fragments formed from Sequence Listings 6.7 and 8.9
  • Sequence type nucleic acid
  • Sequence type Other nucleic acids Sequence Table 10. 11, 12, 13, U.15. 16, 17 DN
  • Sequence type nucleic acid
  • Sequence type Other nucleic acid DNA fragment (tandem) formed from Sequence Listing 6, 7, 8, 9 incorporated into DNA fragment of Sequence Listing 24
  • Sequence type nucleic acid
  • Sequence type nucleic acid
  • Sequence type nucleic acid
  • Sequence type nucleic acid
  • Type of SB column Other nucleic acid synthesis D N A
  • Sequence type nucleic acid
  • Sequence type nucleic acid
  • Sequence type nucleic acid
  • Sequence type DNA fragment formed from other nucleic acid sequence listing 29, 30, 31.32, 33.34 Sequence characteristics
  • Sequence type nucleic acid
  • Sequence type other nucleic acids Sequence fragments 29, 30, 31, 32, 35, 36 DNA fragments formed from sequences Sequence characteristics
  • Sequence type nucleic acid
  • Sequence type nucleic acid
  • Sequence type Other nucleic acids DNA fragments formed from the sequence listings 29.30, 31, 32, 35, and 36 were incorporated into the DNA fragment in Sequence Listing 24.
  • Sequence type nucleic acid
  • Sequence type Other nucleic acid DNA base of SEQ ID NO: 2
  • AGA AAG ACG AAA AGA AGT ACT AAT CGC AGG CGA AGC AAA AAC GAA AAA 96 Arg L s Thr Lys Arg Ser Thr Asn Ar Arg Arg Ser Lys A sn Glu L s
  • AAG AAA AAA AAA AAG GAA TTC 114
  • Sequence type nucleic acid
  • AGA AAG ACG AAA AGA AGT ACT AAT CGC AGG CGA AGC AAA AAC GAA GAA 96 Arg Lys Thr Lys Arg Ser Thr Asn Arg Arg Arg Ser L s A sn Glu Glu

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Description

明 細 書
,τ、· V ？。チド，
技 術 分 野
本発明は、 非 Α非 Β型肝炎 （C型肝炎） 関連抗原に由来する抗原ボ リぺプチ ドと該抗原ポリベプチドとは異種のボリペプチ ド （異種ポリ ペプチ ド） とが融合した融合抗原ポリペプチ ド、 該融合抗原ボリぺブ チ ドをコ一 ドする DN Aを組み込んだ組換え体ブラスミ ド、 該組換え 体ブラスミ ドを含む微生物を用いる融合抗原ポリべプチ ドの製造法お よび該融合抗原ボリぺプチ ドを用いた抗 C型肝炎ウィルス抗体検出法 に関する。 抗原抗体反応は、 医療および学術分野の種々の領域におい て応用されており、 本発明の融合抗原ポリベプチドは幅広い分野にお いて用途が期待される。
背 景 技 術
C型肝炎は非 A非 B型肝炎ウィルス （Hepatitis C Virus(HCV) ま たは ηοηΛ, ποη B Hepatitis Virus (NANBV) とも言うが、 ここでは HCVを用いる。 〕 が原因ウィルスと考えられており、 HCV 感染の血 清診断は、 C型肝炎の診断および輸血等による HCV感染の予防のた めに重要な臨床診断技術である。 これは血清中の H CV関連抗原に対 する抗体の有無を抗原抗体反応を利用して調べることにより行われて いる。
チョーらは、 チンパンジー血清からの HCVのクローン化に成功し 〔チョーら（ Choo， Q. -L. , et al)サイエンス（Science) 244 , 359 - 362(1989) 〕 、 それにより、 C型肝炎診断検査薬が開発された 〔ク ォら（Kuo， G. et al) 、 サイエンス（Science) 244 ， 362— 364(1989) ； EUROPEAN PATENT APPLICATION 0318216 〕 。
C型肝炎患者血清から HCV関連遺伝子がクローン化 〔有馬ら、 実 験医学 Vol.7, No. 2, 94 一 101 (1989) ； 有馬ら、 ガス トロエンター ロロジァ ジャポニカ（ Castroenterologia Japonica )24, 540-548 ( 1989)〕 され、 C型肝炎検査に用いられている。 上記従来法では、 C 型肝炎関連抗原ポリベプチドと異種蛋白とを融合させた融合抗原ポリ ぺプチ ドを微生物で生産させて使用している。 融合させる異種蛋白と して、 チョーらは、 スーパーォキシドジスムターゼ（Superoxi de di smutase，以下 S 0 Dと略記する） を、 有馬らは、 /S — D —ガラク ト シダ一ゼ （ 8— D — ga lac t os i dase,以下 /S— gal と略記する） を用い ている。
個人によっては、 血清中には、 これら異種蛋白に対する自然抗体が 存在しており、 この抗体が異種蛋白と反応してしまう可能性がある。 そのため診断検査薬の力ッ トオフ値が高値になるばかりではなく、 検 査に先立ってその異種蛋白を血清に加えることにより、 抗体に吸収を かける必要が生じ、 操作が非常に煩雑になり、 診断の正確性の著しい 低下をまねく場合がある。
このような場合、 ゥシ血清アルブミ ン（ Bov ine serum albumin )な どの担体に抗原ボリぺプチ ドを化学的に結合させた融合抗原ポリぺプ チ ド、 数種の抗原分子の混合物あるいは、 病原体の粗抽出液が用いら れているが、 融合抗原ポリペプチドの安定供給、 安全性の面で問題が ある。 また抗原ポリぺプチドを微生物で直接発現させる方法がとられ ているが、 抗原ポリペプチドの分子量、 安定性、 毒性の面から、 発現 が困難な場合が多く、 抗原ポリべプチ ドを安定かつ安価に供給するこ とはできない。
本発明者らは、 C型肝炎の検出のために有用な抗原ポリべプチ ドの 製造法について研究をした結果、 1種以上の C型肝炎関連抗原ポリぺ プチ とシ口サケ成; ¾ホノレモン ( chum salmon growth hormone以下 s G Hと略記する） とがメチォニンを介して融合した形の融合抗原ポ リぺプチ ドの製造法を確立した。
本発明者らは、 またこの融合抗原ポリぺプチ ドを用いた抗 C型肝炎 抗体検出法は、 従来報告されている検出法では検出できない検体につ いても検出できることを確認し、 従来法より優れていることを見い出 し本発明を完成するに至った。
発 明 の 開 示
本発明は、 C型肝炎関連抗原に由来する抗原ポリペプチ ド （以下 C 型肝炎関連抗原ポリべプチ ドと略記する） の少なく とも 1つと、 該抗 原ポリべプチ ドとは異種のポリべプチ ド （以下異種ポリべプチ ドと略 記する） の少なく とも 1つとが融合した融合抗原ボリベプチド、 該融 合抗原ポリペプチドをコー ドする D N Aを組み込んだ組換え体プラス ミ ド、 該組換え体プラスミ ドを含む微生物を用いる融合抗原ポリぺブ チ ドの製造法および該融合抗原ボリぺプチ ドを用いた抗 C型肝炎ウイ ルス抗体 （抗 H C V抗体） の検出法を提供する。
図面の簡単な説明
図 1 プラスミ ド pSGHElの造成工程。
図 2 " pSGHEC-2 "
図 n Γ'ΗΡΓ― 1 A //
図 4 〃 pSGHEC- 18 " ο
図 5 〃 PSGHEC- 18S " ο
図 6 " pSGHEC- 1414" 。
図 7 プラスミ ド pSGHEl, pSGHEC-2, pSGHBC 一 14， pSGHEC— 18S および pSGHEC - 1414を導入した大腸菌が生産する融合抗原 ポリぺプチ ドの SDS —ポリアク リルァミ ドゲル電気泳動の 糸口 7ϊ¾ o
図 8 プラスミ ド pSGHEC— 14A の造成工程。
図 9 " pSGHEC- 14B " 。
図 10 ブラスミ ド pSGHEC— 14A および pSGHEC- 14B を導入した大 腸菌が生産する融合抗原ポリぺブチドの SDS —ポリアク リ ルアミ ドゲル電気泳動の結果。
本発明に用いる C型肝炎関連抗原ポリペプチ ドとしては H C V関連 抗原であればいかなるものも用いることができる。 具体的には H C V 関連抗原として有馬らがクローン化した、 クローン No. 2、 クローン No. 18 〔有馬ら、 ガス トロエンターロロジァ · ジャポニカ（Gastro- enterologia Japonica) 2 4_, 5 4 0 - 5 4 8 (1989 ) 〕 およびクロ —ン No. 1 4を用いることができる。
これらクローン No. で示される抗原を以下 C一 2, C— 1 4および C一 1 8 と略記する。 これら抗原のァミ ノ酸配列およびそれをコ一 ド する DNAのヌクレオチド配列を配列番号 1一 3に示す。
これら 3種のクローンの取得方法は、 以下の通りである。 まず材料 として C型肝炎患者の血漿を用いる。 この血漿より RN Aを抽出し、 ランダムブライマー法により c DN Aを調製する。 この c DNAを c D N A cloning system λ gt 1 1キッ ト （アマ一シャム社） を用い て cDNAライブラ リ イ一を作製する。 このライブラ リ イ一をニトロセル ロース膜へ転写し、 急性肝炎回復期血清と慢性肝炎患者からの血清を 大腸菌菌体成分で吸収操作したものでィムノスク リ一二ングを行う。
これら 3種のクローンの患者血清との反応性は、 日本臨床 4 8 ,
2 7 - 3 2 ( 1990 )に記載の方法で検出する。
また C一 1 4のア ミ ノ酸配列を変えずに DN A塩基配列を一部変換 した配列を配列番号 4 1に、 配列番号 4 1の DN A塩基配列を一部欠 失させたものを配列番号 4 2に示す。 すなわち配列番号 4 1 は、 C一 1 4の D N A塩基配列のうち 1 5番目の Aを Gに、 3 3番目の Aを G に、 6 6番目の Cを丁に、 6 9番目の Cを丁に、 9 9番目の Aを Gに 変換したものである。 配列番号 4 2は、 配列番号 4 1の DNA塩基配 列の 9 4番目から 1 0 8番目を欠失したものである。
HC V関連抗原としては、 サイエンス（Science) 2 4 4 , 3 5 9 -
3 6 2 (1989 ) 、 サイエンス （Science) 2 4 4, 3 6 2 - 3 6 4
( 1989 ). および EUROPIAN PATENT APPLICATION 0318216に記載の抗 原を用いることもできる。 本発明に用いる異種ポリペプチ ドはヒ ト血清中の抗体と特異的に反 応せず、 C型肝炎関連抗原ポリべプチ ドと融合した形で微生物により 発現されるものならいかなるものも用いることができる。 具体的には、 シロザケ成長ホルモン（ sGH ) のポリべプチ ドが好適に用いられる。 シロザケ成長ホルモンの配列、 遺伝的情報、 製造法などについては、 プロシイーデイ ング . ォブ · ザ ' ナショナル ' ァ力デミ ィ . ォブ . サ ィエンス（Proc. Natl. Acad. Sci. ) USA, 82, 4306- 4310(1985). 特開昭 61— 15699 、 同 61— 93196 、 同 61— 93197 および同 61— 210100 に記載されている。
融合抗原ポリべプチ ドは、 H CV関連抗原が好ましく はメチォニン を介して、 分子量 2000以上の異種ポリべプチ ドに結合した融合抗原ポ リペプチ ドをコー ドする DN Aを組換え DN A技術により遺伝子の読 みとりフレームを合わせてベクター DNAに組み込むことにより組換 え体プラスミ ドを造成し、 これを用いて微生物を形質転換させ、 この 形質転換微生物を培養し、 培養物中に該融合抗原ボリべプチドを生成 蓄積させ、 該培養物から該融合抗原ボリベプチ ドを採取することによ り得られる。
ベクター DNAとしては挿入した DN Aが微生物中で発現できるも のならいずれでも用いることができる。 好ま しく は、 適当なプロモー タ一、 例えばト リ ブトフ ァ ン（trp系） 、 ラク トース（lac系） のプロモ —夕一を持ち、 その下流に目的 DNAを挿入でき、 しかもシャイ ンダ ルガーノ配列と翻訳開始コ ドンとの間を適当な距離、 例えば 6〜 1 8 塩基数に調節したプラスミ ドを用いることができる。
具体的に好適なベクタ一 DN Aとしては、 pGEL 1 (FERM BP-629、 特 開昭 61 - 93197)、 p KY P 10 (特開昭 58 - 110600) 、 p G H A 2 (FERM BP- 400 、 特開昭 60— 221091) などが挙げられる。
微生物としては、 本発明の融合抗原ポリべプチ ドをコー ドする DN Aが発現して、 培養物中に該ポリべプチ ドを生成蓄積できるものなら いかなるものも用いることができる。 好適にはェッシヱ リ ヒア ' コ リ ( Escherichia coli )に属する微生物が用いられる。
以下、 シロザケ成長ホルモンと H CV関連抗原とを結合させた融合 抗原ポリベプチ ドの製造法について具体的に説明する。
シロザケ成長ホルモンと H C V関連抗原とをメチォニンを介して結 合させた融合抗原ポリベプチドは以下の工程に従って製造される。 工程 1一 6は融合抗原ポリペプチ ド sGHEl， sGHEC— 2， sGHEC— 14， sGHEC -18S および sGHEC — 1414の製造に関し、 工程 7〜 9は融合抗 原ポリペプチ ド sGHEC - 14A および SGHEC—14B の製造に関する。
〔工程 1〕 HCV関連抗原およびリ ンカ一遺伝子の合成
まず、 配列番号 4 , 5 , 6 , 7, 8 , 9 , 1 0， 1 1 , 1 2， 1 3， 1 4, 1 5, 1 6， 1 7, 1 8 , および 1 9で示される DN Aを化学 合成する。
これらの DN Aの合成はリ ン酸アミダイ ト法による固相合成法を用 いて、 DNA自動合成機により行う。
配列番号 4で表される DNA (以下 DNA 4という） と配列番号 5 で表される DNA (以下 DNA 5 という） とから形成される二重鎖 D NAを用いて、 配列番号 2 0で表される二重鎖 DNA断片 （以下遣伝 子 2 0 という） を持ったプラスミ ドを造成する。
(配列番号 2 0中、 EcoRI に向かう引出し線は、 これらの制限酵素に よる切断部位を示す。 以下同じ）
同様にして、 配列番号 6で表される DN A (以下 DNA 6 という） と 配列番号 7で表される DNA (以下 DNA 7 という） とから形成され る二重鎖 DN Aおよび配列番号 8で表される DN A (以下 DNA 8 と いう） と配列番号 9で表される DNA (以下 DNA 9 という） とから 形成される二重鎖 DNAをリガーゼで結合して、 配列番号 2 1で表さ れる二重鎖 DNA断片 （以下遺伝子 2 1 という） を持ったプラスミ ド を造成する。 同様に配列番号 1 0で表される DNA (以下 DNA10という） と配 列番号 1 1で表される DN A (以下 DNA 1 1 という） とから形成さ れる二重鎖 DNA、 配列番号 1 2で表される DNA (以下 DNA 1 2 という） と配列番号 1 3で表される DN A (以下 DNA 1 3 という） とから形成される二重鎖 DNA、 配列番号 1 4で表される DNA (以 下 DNA 1 4 という） と配列番号 1 5で表される DNA (以下 DNA 1 5 という） とから形成される二重鎖 DN Aおよび配列番号 1 6で表 される DNA (以下 DNA 1 6 という） と配列番号 1 7で表される D N A (以下 DNA 1 7という） とから形成される二重鎖 DN Aをリガ ーゼで結合して、 配列番号 2 2で表される二重鎖 DNA断片 （以下遺 伝子 2 2 という） を持ったブラスミ ドを造成する。
同様に配列番号 1 8で表される DN A (以下 DNA 1 8 という） と 配列番号 1 9で表される DN A (以下 DNA 1 9 という） とから形成 される二重鎖 DNAを用いて、 配列番号 2 3で表される二重鎖 DNA 靳片 （以下遺伝子 2 3 という） を持ったブラスミ ドを造成する。
これら合成した DN Aにより調製された二重鎖 DN A断片は、 各々、 遺伝子 2 0は C一 2からなるペプチ ドを、 遺伝子 2 1は C一 1 4から なるぺプチ ドを、 遺伝子 2 2は C一 1 8からなるペプチ ドをコー ドし ている塩基配列を有している。 遺伝子 2 3は、 シロザケ成長ホルモン と各クローンを連結するためのリ ンカ一で、 メチォニン、 グルタ ミ ン 酸、 フヱニルァラニン、 そのすぐ後に終止コ ドンをコー ドしている塩 基配列を有しグルタ ミ ン酸、 フエ二ルァラニンをコー ドしている塩基 配列は、 EcoRI 認識サイ トとなる。
〔工程 2〕 リ ンカ一ン遺伝子の s GH発現プラスミ ドへの組込み ： 特開昭 61— 93197 に記載された方法に従って製造した s GH遺伝子 の発現に用いるブラスミ ド PSGH1B2 を用いる。 PSGH1B2 の Bglll— Pvu I消化断片 （約 1, 1 7 kb) と PSGH1B2 の Nsi I - Pvu I消化断片 (約 1. 8 O kb) と、 DNA 1 8、 DNA 1 9、 とを混合し DN Aリガ ーゼで二重鎖 DN A間を結合し、 ァ ミ ノ末端のメチォニンと s GHの 1番目から 1 0 3番目のァミ ノ酸からなるポリぺプチ ドにメチォ二ン を介してグルタ ミ ン酸、 フェニルァラニンが結合したポリぺプチ ドを コ一ドする遺伝子を有するプラスミ ド pSGHEl を造成する （図 1参照） 配列番号 24に pSGHEl が発現する融合ポリぺプチ ドのァミ ノ酸配 列とそれをコ一 ドする DN A配列および EcoRI認識サイ トを示す。 配 列番号 24中下線はリ ンカー領域を示す。
〔工程 3〕 HC V関連抗原遺伝子の s GH発現ブラスミ ドへの組み 込み。
工程 2で造成した pSGHEl を EcoRIで切断後、 Bacterial Alkaline Phosphatase (BAP)で処理する。 ついで Hind 111， Pvu Iで切断し、 約 3 2 0 bpの EcoRI— Hind III断片と、 約 1.8 kbの EcoRI— Pvu I断片 を単離する。 pSGHElを Hind III， Pvu Iで切断後、 約 8 5 0 bpの Hind III一 Pvu I消化断片を単離する。 上記 D N A断片と. D N A 4〜 DNA 5から形成される二重鎖 DNA断片を DNAリガーゼで結合す ると、 ブラスミ ド pSGi!EC— 2が得られる （図 2参照） 。 pSGHEC— 2は、 pSGHElがコー ドする s GH遺伝子と、 C一 2がコー ドしている遺伝子 をメチォニンをコー ドする遺伝子を介して保持する。 配列番号 2 5に PSGHEC- 2が発現する融合抗原ボリべプチドのァミ ノ酸配列とそれを コ一ドする DN A配列を示す。 配列番号 2 5中下線は C一 2領域を示 す。
工程 2で造成した pSGHE 1を EcoR Iで切断後、 Bacterial Alkaline Phosphatase (BAP)で処理する。 ついで Hind III， Pvulで切断し、 約 3 2 Obpの EcoRI— Hind III断片と、 約 1.8 kbの EcoRI— Pvul断片を 単離する。 pSGHElを Hind III, Pvu Iで切断後、 約 8 5 0 bpの Hind III 一 Pvu I消化断片を単離する。 上記 DNA断片と DNA 6〜DN A 9から形成される二重鎖 DNA断片を DNAリガーゼで結合すると、 プラスミ ド pSGHEC— 1 4が得られる （図 3参照） 。 pSGHEC— 1 4は、 pSGHE 1がコー ドする s GH遺伝子と、 C— 1 4がコー ドしている遺 伝子をメチォニンをコ一 ドする遺伝子を介して保持する。 配列番号 26 に pSGHEC — 1 4が発現する融合抗原ポリぺブチドのァミ ノ酸配列と それをコー ドする DN A配列を示す。 配列番号 2 6中下線は C一 1 4 領域を示す。
工程 2で造成した pSGHE 1を EcoR Iで切断後、 Bacterial Alkaline Phosphatase (BAP) で処理する。 ついで Hind III, Pvulで切断し、 約 3 2 O bpの EcoRI— Hind III断片と、 約 1. 8 kbの EcoRI— Pvul断片を 単離する。 pSGHE 1を Hind III , Pvu Iで切断後、 約 8 5 0 bpの Hind III 一 Pvu I消化断片を単離する。 上記 DNA断片と DNA 1 0〜D N A 17から形成される二重鎖 DN A断片を DN Aリガーゼで結合する と、 ブラスミ ド pSGHEC— 1 8が得られる （図 4参照） 。 pSGHEC— 1 8 は、 pSGHElがコー ドする s GH遣伝子と、 C— 1 8がコー ドしてい る遺伝子をメチォニンをコー ドする遣伝子を介して保持する。 配列番 号 2 7に pSGHEC— 1 8が発現する融合抗原ポリぺプチドのァミ ノ酸配 列とそれをコー ドする DN A配列を示す。 配列番号 2 7中下線は C一 1 8領域を示す。
〔工程 4〕 pSGHEC- 1 8のプロモーター置換
PSGHEC- 1 8を Hindlll ， Pvulで切断後、 約 2.36kbの D N A断片を 単離する。 PKYP1 0を Hindi II , Pvu Iで切断後、 約 1.0 kbの DN A 断片を単離する。 上記 DN Aを DN Aリ ガーゼで結合すると、 pSGHEC 一 1 8 Sが得られる （図 5参照） 。 pSGHEC— 1 8 Sは、 pSGHEC— 1 8 のプロモーターを置換したもので、 s GHをコー ドする遺伝子と、 C 一 1 8がコ一 ドしている遺伝子をメチォニンをコ一 ドする遺伝子を介 して保持する。 pSGHEC— 1 8 Sが発現する融合抗原ポリべプチ ドのァ ミ ノ酸配列とそれをコ一 ドする DN A配列は配列番号 2 7に示される。 配列番号 2 7中下線は、 C一 1 8領域を示す。
〔工程 5〕 HCV関連抗原遺伝子を 2個以上もしく は 2種以上保持 する発現ベクターの構築
工程 3で造成した pSGHEC - 1 4を使用した代表例を示す。 pSGHEC— 1 4を Pst〖 で切断する。 ついで制限酵素 EcoRIで部分分解し、 約 1. 4 O kbの EcoRI— Pstl断片と約 1. 8 5 kbの EcoRI— Pstl断片を単離 する。 上記 DNA断片を DNAリガーゼで結合するとプラスミ ド pSGH EC— 1414が得られる （図 6参照） 。 pSGHEC— 1414は、 pSGHE 1 の s G Hをコー ドする遺伝子と、 C一 1 4を 2個コ一 ドしている遺伝子をメ チォニンをコ一 ドする遺伝子を介して保持する。 配列番号 2 8に pSGHEC 一 1414が発現する融合抗原ポリペプチ ドのァミ ノ酸配列とそれをコー ドする DN A配列を示す。 配列番号 2 8中下線は、 C一 1 4が 2連結 した領域を示す。 なおこの工程 5により、 種類の違う抗原遺伝子の連 結が可能となり、 キメラ抗原作製に利用できる。
〔工程 6〕 シロザケ成長ホルモンと H CV関連抗原が結合した融合 抗原ポリぺプチ ドの生産と単離 ·精製
工程 2、 工程 3、 工程 4、 工程 5で製造したブラスミ ド pSGHE l、 pSGHEC— 2、 pSGHEC- 1 4、 pSGHEC- 1 8 S、 または pSGHEC - 1414を 大腸菌に導入し、 得られた形質転換大腸菌を培地に培養して該培養物 よりシロザケ成長ホルモンと H C V関連抗原とが結合した融合抗原ポ リぺプチ ドを採取する。 大腸菌菌体内に生産された目的の融合抗原ポ リペプチ ドは非水溶性の顆粒として存在する。 培養終了後、 菌体を集 め、 これを破碎し、 破砕液を遠心分離し、 シロザケ成長ホルモンと H C V関連抗原とが結合した融合抗原ポリベプチ ドを含有する顆粒を分 離する。
以下、 融合抗原ポリペプチ ドの精製法について説明する。 プラスミ ド pSGHE l、 pSGHEC- 2、 pSGHEC- 1 4、 pSGHEC- 1 8 S、 pSGHEC - 1414を保持する大腸菌が生産する融合抗原ポリぺプチドは、 それぞれ sGHE l、 sGHEC - 2、 sGHEC - 14、 sGHEC ー 1 8 S、 sGHEC —1414と δΐίす α 〔工程 7〕 H CV関連抗原遣伝子の合成
まず、 配列表 2 9、 3 0、 3 1、 3 2、 3 3、 3 4、 3 5および 3 6で示される DNAを化学合成する。
これらの DNAの合成はリ ン酸アミ ダイ ト法による固相合成法を用 いて、 DNA自動合成機により行う。
配列番号 2 9で表される D N A (以下 DNA 2 9 という） と配列番 号 3 0で表される DNA (以下 DNA 3 0 という） とから形成される 二重鎖 DNA、 配列番号 3 1で表される DN A (以下 DNA 3 1 とい' う） と配列番号 3 2で表される DN A (以下 DNA 3 2という） とか ら形成される二重鎖 DN Aおよび配列番号 3 3で表される DNA (以 下 DNA 3 3 という） と配列番号 3 4で表される DNA (以下 DNA 3 4 という） とから形成される二重鎖 DN Aをリガーゼで結合して、 配列番号 3 7で表される二重鎖 DN A断片 （以下遺伝子 3 7という） を持ったプラスミ ドを造成する。
同様に DNA 2 9 と DNA 3 0から形成される二重鎖' D N A、 DN A 3 1、 DNA 3 2とから形成される二重鎖 D N Aおよび配列番号 35 で表される DN A (以下 DNA 3 5 という） と配列番号 3 6で表され る DNA (以下 DNA 3 6 という） とから形成される二重鎖 D N Aを リガーゼで結合して配列番号 3 8で表される二重鎖 DNA断片 （以下 遺伝子 3 8 という） を持ったプラスミ ドを造成する。
これら合成した DN Aにより調製された二重鎖 DN A断片は、 各々 . 遺伝子 3 7は C一 1 4からなるペプチ ドを、 遺伝子 3 8は、 C一 1 4 からなるペプチ ドの 3 2番目から 3 6番目のァミ ノ酸を除去したぺプ チ ドをコ一ドしている塩基配列を有している。 なお遺伝子 3 7は、 C 一 1 4のア ミ ノ酸配列を変えずに塩基配列を一部変更したもので、 C 一 1 4の塩基配列のうち 1 5番目の塩基 Aを Gに、 3 3番目の Aを G に、 6 6番目の Cを Tに、 6 9番目の Cを丁に、 9 9番目の Aを Gに 変換したものである。 遺伝子 3 8は、 遺伝子 3 7の塩基配列の 9 3番 目から 1 0 7番目を欠失した合成 DN Aである。
以下、 遺伝子 3 7から成るペプチドもしく は、 それをコー ドしてい る DNAを C一 1 4 A、 遺伝子 3 &から成るペプチドもしく はそれを コー ドしている DNAを C一 1 4 Bと記す。
〔工程 8〕 HC V関連抗原遺伝子の s GH発現プラスミ ドへの組み 込み o
工程 2で造成した pSGHElを EcoRI で切断後、 Bacterial Alkaline Phosphatase(BAP)で処理する。 ついで Hind III， Pvu I で切断し、 約 3 2 Obpの EcoRI - Hind III断片と、 約 1.8kb の EcoRI — Pvu I 断片 を単離する。 pSGHE 1 を Hind III、 Pvu I で切断後、 約 850bp の Hind III -Pvu 〖 消化断片を単離する。 上記 DNA断片と DNA 2 9〜D N A 3 4から形成させる二重鎖 DNA断片を DNAリガーゼで結合す ると、 プラスミ ド pSGHEC— 1 4 Aが得られる （図 8参照） 。 pSGHEC— 1 4 Aは、 pSGHElがコー ドする sGH 遺伝子と、 C一 1 4 Aがコー ドし ている遺伝子をメチォニンをコ一 ドする遺伝子を介して保持する。 配 列番号 3 9に pSGHEC - 1 4 Aが発現する融合抗原ポリぺプチドのァミ ノ酸配列とそれをコー ドする DN A配列を示す。 配列番号 3 9中下線 は C一 1 4 A領域を示す。
工程 2で造成した pSGHElを EcoRI で切断後、 Bacterial Alkaline Phosphatase(BAP)で処理する。 ついで Hind III、 Pvu I で切断し、 約 3 2 Obpの EcoR I— Hind III断片と、 約 1.8kb の EcoR I— Pvu I 断片 を単離する。 pSGHE 1 を Hind III、 Pvu I で切断後、 約 8 5 0 bpの Hind III— Pvu I 消化断片を単離する。 上記 DNA断片と DNA 2 9 〜DNA 3 2と DNA 3 5〜DNA 3 6とから形成される二重鎖 D N A断片を DNAリガーゼで結合すると、 プラスミ ド pSGHEC— 1 4 Bが 得られる （図 9参照） 。 pSGHEC- 1 4 Bは、 pSGHElがコー ドする sGH 遺伝子と、 C一 1 4 Bがコー ドしている遺伝子をメチォニンをコー ド する遺伝子を介して保持する。 配列番号 4 0に pSGHEC— 1 4 Bが発現 する融合抗原ポリべプチ ドのアミ ノ酸配列とそれをコ一 ドする D N A 配列を示す。 配列番号 4 0中下線は C一 1 4 B領域を示す。
〔工程 9〕 シロザケ成長ホルモンと H C V関連抗原 （ C一 1 4 A、 C - 1 4 B ) が結合した融合抗原ポリべプチ ドの生産と単離 · 精製 工程 （ 8 ) で製造したブラスミ ド pSGHEC— 1 4 A、 pSGHEC - 1 4 B を用いて、 工程 6に記載された方法で、 融合抗原ポリペプチドの生産 と単離 ·精製を行った。 なお、 ブラスミ ド pSGHEC— 1 4 A、 pSGHEC— 1 4 Bを保持する融合抗原ポリペプチ ドは、 それぞれ sGHEC— 1 4 A、 sGHEC - 1 4 Bと記す。
融合抗原ポリぺブチ ドの精製
( 1 ) 融合抗原ポリペプチドの粗精製面分の調製
粗精製画分の調製は既知の方法を組合せることにより可能であるが、 好ましく は下記の通りである。
融合抗原ポリベプチドが顆粒として生産された場合は、 特開昭 60 - 244259に示された方法にしたがって顆粒を取得し、 変性剤 （好ましく は 4 M以上の尿素、 または 3 M以上のグァニジン塩酸） を含む緩衝液 ( PH 5〜 1 2 ) または可溶化剤溶液 （好ましく は 5 0 %以上のギ酸） に溶解する。 その上清を必要に応じて変性剤または可溶化剤存在下で 精製後、 変性剤又は可溶化剤を除去し、 粗精製画分とする。 変性剤ま たは可溶化剤存在下での精製および、 変性剤または可溶化剤の除去は 既知の方法 〔特開平 1 - 1 31 195、 日本生化学会編、 生化学実験講座 1， タンパク質の化学 I I， 東京化学同人、 P. 1 1〜P. 3 5 4 ( 1 976)、 日本生 化学会編、 続生化学実験講座 2 . タンパク質の化学上、 東京化学同人. P. 3〜 1 2、 P. 8〜 1 8 6 ( 1 987)〕 を組み合わせることによってでき る
融合抗原ポリぺプチ ドが菌体内可溶性画分に生産された場合は、 特 開昭 63— 17898 に示された方法にしたがって菌体破砕後、 その上清を 粗精製画分とし、 融合蛋白質が培養上清に生産された場合は、 遠心分 離により培養上清を調製し、 粗精製画分とする。
(2) 融合抗原ポリペプチドの精製方法
粗精製画分からの融合抗原ポリべプチドの精製は既知の方法 〔日本 生化学会編、 生化学実験講座 1 . タンパク質の化学 I I、 東京化学同人. P. 11〜354 、 P. 8 1〜 1 8 6 (1987)〕 を組み合わせることによって可 能である。
本発明は、 また上記融合抗原ポリべプチドを用いる抗 H C V抗体検 出法を提供する。
以下、 融合抗原ポリべプチドを用いた抗 H C V抗体検出方法につい て説明する。
本発明で用いる免疫学的方法としては、 下記のものがあげられ、 各 文献記載の方法を用いて実施できる。
〇ェンザィム · ィムノアッセィ （以下 E I Aという）
酵素免疫測定法、 医学書院、 石川栄治ら、 1978年、
〇ラジオ · ィムノアッセィ （以下 R I Aという） 免疫血清学、 医歯薬 出版、 稲井真彌ら、 1981年
〇フルォレツセンス · ィムノアッセィ （以下 F I Aという）
同 上
〇逆受身凝集反応
同 上
〇フィ トへマ トァグリチネーシヨ ン
同 上
〇レーザーネフロメ ト リー
同 上
〇免疫溶血反応 （赤血球またはリボソームを用いる方法）
同 上
〇パーティ クルァグリチネ一ショ ン
最新検査、 医典社、 VOL. 2 No. 2 , 151 〜157 、 1984、 Gann 75- 845 、 1984
〇ウエスタ ン · プロ ッティ ング
R I A, E I A, F I Aにおいては、 均一系のみならず、 サン ドィ ッチ法などの不均一系の分析方法も可能である。
具体例として E I Aをサン ドィツチ法で行う例を下記に示す。
融合抗原ポリペプチ ドをマイクロタイタープレー トのゥエルにコー ティ ングし、 血清試料を適当な緩衝液たとえば緩衝液 A CO. 1 5 M NaCK 0. 1 %ゼラチン、 1 %牛血清アルブミ ンおよび 0. 1 % NaN3 を含む 1 Z 1 5 Mリ ン酸ナト リ ウム緩衝液 （pH7. 2 ) 〕 で希釈した液 をゥエルに入れ、 4〜 3 7で、 1 時間〜 1週間静置し、 適当な緩衝液- たとえば緩衝液 B CO. 0 5 % Tween 2 0および 0. 1 5 MNaClを含む 1 / 1 5 Mリ ン酸ナ ト リウム緩衝液 （pH7. 2 ) 〕 でゥエルをよく洗浄 する。
ゥサギ抗ヒ ト免疫グロプリ ン抗体の Fab フラグメ ン トとホースラディ ッシュパーォキシダーゼとを過沃素酸法により結合させたコンジュゲ 一トを適当な緩衝液、 たとえば緩衝液 Bで希釈した液をゥエルに入れ る。 4〜4 5でで 1〜2 4時間静置後、 同じ緩衝液で洗浄する。 つい で適当な基質溶液たとえばオルソ · フエ二レンジアミ ン基質溶液
CO. 0 2 %オルソ · フエ二レンジアミ ンおよび 3 5 mM過酸化水素を含 む 1 Z 1 5 Mリ ン酸ナト リゥム緩衝液 （pH7. 2 ) ) をゥヱルに入れ、 1 5〜 3 7でで 5〜 6 0分間静置する。 2N H2S04で反応を停止させ、 室温で 1〜 1 0分間放置後、 マイクロタイタープレー ト用フォ トメ一 夕一で 4 1 O nmおよび 6 0 O nmにおける吸光度 （0. D. ) を測定し、 前 者の値から後者の値を差し引いた値を抗体値とする。
ここに示した方法は一例示であり、 抗体や基質液、 発色剤などの変 更は、 適宜行うことができる。
ウエスタン · プロッティ ング法で行う抗 HCV抗体測定例を下記に 示す。 精製された融合抗原ポリベプチ ドを直接レムリのサンプルバッ ファ —で加熱、 溶解後、 S D S—ポリアク リルア ミ ドゲルで泳動する。 同 —ゲル上の蛋白質をニ トロセルロース膜に移した後、 正常人血清、 C 型肝炎患者血清を用いてウェス夕ン · ブロッテイ ング 〔バーネッ ト (Burnett) 、 アナール バイオケミ カル（Anal. Biochem. )112 , 195 (1981)〕 を行う。
上記組換え DN Α技術における反応の条件は、 一般的に下記のとお りである。
DN Aの制限酵素による消化反応は、 通常 0. l〜2 0 ^ gの DNA を 2〜2 0 0 mM (好ましく は 1 0〜4 0 mM) の ト リス— HC1 ( H6. 0 〜9. 5好ましく は pH7. 0〜8. 0 ) 、 0〜 2 0 OmM NaCl または KC1 、 2〜 3 0 mM (好ましく は 5〜 1 0 mM) の MgCl2、 0〜 2 0 mMの 2—メ ルカプトェタノールを含む反応液中で、 制限酵素 0. 1 - 1 0 0単位 (好ましく は 1 cz gの DNAに対して 1〜3単位） を用い、 2 0〜7 0 °C (至適温度は用いる制限酵素により異なる） において、 1 5分間 〜2 4時間行う。
制限酵素消化によって生じた DN A断片の精製は、 L GT法やポリ ァク リルァミ ドゲル電気泳動法などによって行う。
D N A断片の結合反応は、 2〜 2 0 0 mM (好ましく は 1 0〜 4 0 mM) の ト リスー HCl(pH6. 1〜9. 5、 好ましく は ρΗ7· 0〜8. 0 ) 、 2〜 2 0 mM (好ましく は 5〜 1 0 mM) の MgCl2、 0. 1〜 1 0 mM (好ましく は 0.5 〜2. 0 mM) の A T P、 1〜 5 0 mM (好ましく は 5〜 1 0 mM) のジチォ スレイ トールを含む反応液中で、 T 4 DNAリガーゼ 0. 3〜 1 0単位 を用い、 1〜 3 7 °C (好ましく は 3〜 2 0 °C) で 1 5分間〜 7 2時間 (好ましく は 2〜2 0時間） 行う。
結合反応によって生じた組換え体プラスミ ド DNAは、 必要により コーェンらの形質転換法 〔エス . ェヌ · コ一ェン（S. N. Cohen) ら ： プロシ一ディ ング . ォブ · ザ . ナショナル . ァカデミィ ■ ォブ · サイ エンス（Proc. Natl. Acad. Sci.)ヽ USA. _6_9_ ， 2110 ( 1972 )〕 によって、 大腸菌に導入する。
組換え体ブラスミ ド DNAを持つ大腸菌から該 DNAの単離は、 セ シゥム · ク口ライ ドーェチジゥム · プロ ミ ド密度勾配超遠心法 〔ディ 一 . ビー - ク レゥエル（D. B. Clewell) ら ： プロシ一ディ ング · ォブ • ザ ' ナショナル ' ァ力デミィ ' ォブ ' サ.ィエンス（Proc. Natl. Acad. Sci. ) , USA, 6 2 , 1159 (1969)〕 あるいはバーンボイ厶（Birnboim) らの方法 〔ェイチ · シ一 · バーンボイム（H. C. Birnboim) ら ： ヌク レ イ ツ ク · ァシ ド · リサーチ（Nucleic Acids Res. ) 7， 1513(1979)) な どを用いて行う。
プラスミ ド DN Aを制限酵素で消化後ァガロースゲル電気泳動ある いはポリアク リルアミ ドゲル電気泳動により切断部位を調べる。 さら に DN Aの塩基配列を決定する必要があるときはマキサム · ギルバー ト法 〔プロシーデイ ング · ォブ · ザ， ナショナル ' ァ力デミィ . ォブ ' サイエンス（Proc. Natl. Acad. Sci.), USA 、 7 4, 560(1977 )3 または M l 3ファージを用いたサンガー（Sanger)法 〔サンガ一（Sanger) ら： プロシ一デイ ング · ォブ · ザ . ナショナル · ァカデミィ . ォブ . サイエンス（Proc. Natl. Acad. Sci. ), USA : 7 4, 5463(1977)： ァ マーシャム（ Amersham ：)社 M 1 3クローニング ' アン ド ' シークェ ンシンク、、 ， ノヽン ドブック（ Cloning and sequencing handbook ) 〕 （こ よって決定する。
本発明の融合抗原ポリベプチ ドは以下のとおりに製造できる。
すなわち、 プラスミ ドを用いて大腸菌 W3110 strA や HB101 を形質 転換させ、 アンピシリ ン耐性のコロニーの中からプラスミ ドを有する 大腸菌を選び出す。 プラスミ ドを有する大腸菌を培地に培養すること により培養物中に融合抗原ポリベプチドを生成させることができる。
ここで用いる培地としては大腸菌の生育ならびに融合抗原ポリぺプ チ ドの生産に好適なものならば合成培地、 天然培地のいずれも使用で きる。
炭素源としては、 グルコース、 フラク トース、 ラク ト一ス、 グリセ ロール、 マンニトール、 ソルビトールなどが、 窒素源としては、 NH4C1 、 (NH4)2S04 、 カザミ ノ酸、 酵母エキス、 ポリペプトン、 肉エキス、 バ ク ト ト リブトン、 コーン ' スティーブ ' リカーなどが、 その他の栄養 源としては、 K2HP04、 KH2P04、 NaCK MgS04、 ビタ ミ ン B ,、 MgCl2 などが使用できる。
培養は pH5. 5〜8. 5、 温度 1 8〜 4 0 で通気攪拌培養により行わ れる。
培養 5〜9 0時間で培養菌体中に該融合抗原ポリべプチ ドが非水溶 性の顆粒として蓄積するので、 培養物から菌体を集菌し、 菌体を破碎 し、 破砕液を遠心分離して得られる沈殿物よりゲル濾過カラムクロマ トグラフィ一、 HPLC 等を用いて該融合抗原ポリベプチ ドを採取する。 また該融合抗原ポリぺプチ ドの検出は培養菌体を直接レムリ （Laemmli ) のサンブルバッファー 〔レムリ（ Laemmli：)、 ネイチヤー（Nature)227， 6 8 0 ( 1970 )〕 に加熱、 溶解後、 S D S—ポリアク リルアミ ドゲル 〔レムリ （Laemmli) の方法 ： 同上文献〕 にかけ、 クマシ一ブリ リアン トブゾレー (Cooraassie Brilliant Blue ) 色素 〔ノくィォ · ラッ ド（ Bio-
Rad ) 社製〕 を用いて染色して行う。
実施例
実施例 1 DN A 4〜 1 9の製造
DNA 4〜 1 9の合成はリ ン酸アミ ダイ ト法による固相合成法 〔S. L. Beaucageら、 テ 卜ラヘドロン - レターズ( Tetrahedron Letters ) 2 2 , 1859( 1981 ). L. J.McBrieら、 同^ 2 4 5 ( 1983 )〕 に従 レ、、 アプライ ドバイオシステム社の DNA自動合成機 3 8 O Aを用い て下記のとおり行った。
シリカゲルを固相担体とし、 これに 3 ' 水酸基を介して結合したヌ ク レオチ ドの 5 ' 水酸基に（1) ヌク レオチドをリ ン酸ア ミ ダイ ト法に より縮合し（2) 縮合したヌ ク レオチ ドの亜リ ン酸結合を沃素で酸化し てリ ン酸結合にし、 （3) 縮合したヌ ク レオチ ドの 5 ' 水酸基上の保護 基をト リ フルォロ酢酸で除去した。 次に（1) の工程に戻って次のヌク レオチ ドを同様に縮合した。 こう して （1)〜（3) の工程が繰り返され て DNAが担体上に合成された。 合成終了後、 DNA の結合した担体を チオフエノール溶液中に室温で 1時間放置してリ'ン酸の保護基を除去 した後、 濃アンモニア水中に室温で 1時間放置して DN Aを担体から 遊雜させた。 DN Aを含む濃アンモニア水を密封容器中 6 0でにて 1 2時間加熱して塩基上の保護基を除去した。
DNA 4を例にとると、 0. 2 moleのヌク レオチ ドの結合した担体 を用いて合成を行い、 次いで保護基の除去と固相からの遊離反応を行 つて DNA4の粗生成物 2 1 O.D.単位 （ 2 6 0 nnTC測定） を得た。 こ の粗生成物の 5 O.D.単位を 7 M尿素を含むト リスー硼酸緩衝液 （pH 8 ) を用いて 1 0 %ボリアク リルアミ ドゲル （ 2匪厚、 1 3 cmx 13cm) の電気泳動で精製し、 DNA 4を含むゲルの領域をとり、 0.2M炭酸 ト リェチルアミ ン緩衝液（pH8 ) (以下 T E A Bという） 1 mlで DN A 4を 1 8時間かけて抽出し、 ついでその抽出液をセフアデックス DE 5 2のカラム （径 6画、 長さ 5 mm) に通して DNA 4を吸着させた。 2 M T E A B 2 mlで溶出して 1.4 0. D.単位の DN A 4の純品を得 た。
DN A 4以外の DNAも同程度の収率で合成された。
これら DN Aの 5 '水酸基をファージ T 4ポリ ヌ ク レオチドキナー ゼと 〔ァ一32 P〕 ATPを用いる常法 〔 M. Maxamら、 メ ソッヅ ' イ ン · ェンザィモロジィ（Methods in Enzymology)Vol. 65, Part i , p.499, Academic Press(1980) 〕 でリ ン酸化して放射性ラベルをつけ た。 ラベルをつけた DN Aを 7 IV [尿素を含むト リスー硼酸緩衝液で 12 %ボリアク リルアミ ドゲル電気泳動を行い、 DN Aの純度と鎖長を確 認した。 実施例 2 プラスミ ド pKYPIOおよび PSGH1B2 の分離精製 pKYPIOを含む大腸菌 （Escherichia coli HB101, ボリバー（Bol i var) ら ； ジーン（Gene)、 2_, 75(1977)〕 および PSGH1B2 を含む大腸菌
(Escherichia coli HB101〕 〔特開昭 61— 93197 〕 をそれぞれ 5 0 zg/mlのアンピシリ ンを含む L培地 （ 1 %バク ト ト リプトン、 0.5 %酵母エキス、 1 %NaCl、 pH7. 5 ) 1 0 ml、 で 3 7。C、 1 8時間培養 した。
この培養液全量を 5 0 /zgZmlのァンピシリ ンを含む L培地 11 に植 菌し、 3 7eCで培養した。 4時間後に、 クロラムフヱニコールを 170 ； Zmlとなるよ'うに加え、 さらに 3 7°C、 1 6時間培養した。 遠心 分離法 （5，000rpm 1 0分間） により集菌を行い、 0. 8 % NaCl で菌 体を洗浄した後、 5 OmMト リス塩酸 （pH8. 0 ) 2 0mlに懸濁し、 水冷 した。 1 0 mgZmlのリゾチームを 8 ml加え氷中に 1 0分間静置した後 、 0. 5 M EDTAを 9. 6 ml加え、 水中に 1 0分間静置し、 2 %ト リ ト ン X- 1 0 0 (和光純薬工業社製） を 2.3ιπ1加え水中にさらに 1時間静 置した。 50,000x gで 4 °C、 ，1時間超遠心分離を行い、 上清約 4 0 ml を得た。 次にこの上清に 3 M NaOHを加え pHを 12. 5 として、 室温で 1 0分間静かに攪拌した。
2 Mト リス塩酸 （pH7. 5 ) を加え、 pHを 8.5にもどし、 さらに 3分間 攪拌した。 この時点で液の容量は約 5 5mlであった。 1/9 容の 5 M NaClを加えた後、 1 OmMト リス塩酸 （PH7. 5 ) 、 1 mMEDTAで飽和した フエノールを等量加え、 激しく攪拌した後、 低速遠心分離法 （3,300 rpm 、 1 0分間、 以下同条件） により水層を集めた （以下、 この処理 をフヱノール抽出と略記する。 ） 。 1Z250 容の 5 mg/mlRNase A (シ グマ社製） を加え、 3 7で、 1時間 RNA分解反応を行った後 1 5 容の 5 M NaClを加え、 1 3 容の 3 0 % P E G 6000 (半井化学; uu 社製） を加え一 2 0 °Cに 2時間静置した。 遠心分離法で沈殿を集め、 1 OmMト リス塩酸 （pH7.5 ) および 1 mM EDTAからなる液 2 mlに溶か し、 ソジゥム ■ ドデシル · サルフェイ ト（SDS) を 0.5 %となるように 加え、 ProteinaseK (シグマ社製） を 5 0 g Zmlとなるように加え て、 3 7°C、 1時間蛋白質分解反応を行った。
フエノール抽出を 3回繰り返し行った後、 等量のクロ口ホルムを加 え、 激しく攪拌した後低速遠心分離法により水層を集めた。 1/ 0容 の 3 M酢酸ナト リ ゥムを加え、 2.5倍容のェ夕ノールを加え、 一 2 0 て、 1時間静置した。 冷却遠心分離法 （4て、 ll.OOOrpm 1 0分間） で沈殿を集め、 1 OmMト リス塩酸 （pH7.5 ) および 1 mMEDTAからなる' 液 l mlに溶かした。 このようにして pKYPIO および PSGH1B2 各々 800 〃 gを得ることができた。 pKYPIOの構造は、 EcoRI、 KpnK BaraHI、 BgllK Pstl (宝酒造社製） で切断してァガロースゲル電気泳動で確 認した。 また、 PSGH1B2 の構造は、 EcoRI、 Hindlll 、 BglII、 BamH I 、 NsiK Pstl (宝酒造社製） で切断してァガロースゲル電気泳動で 確認した。
実施例 3 プラスミ ド pSC-HElの作製
実施例 2で得たプラスミ ド PSGH1B2 2 ug を制限酵素 Pvul (宝酒造 社製） 1 0単位、 Bglll (宝酒造社製） 1 0単位、 Nsil (宝酒造社製） 1 0単位を含む溶液 〔 1 OmMト リス- HC1 (pH7.5 ) 、 7 mM MgCl2, 6 mM 2 -メルカプトエタノール、 1 0 0 mM NaCl 〕 3 0 1 に溶解 し、 3 7°C、 2時間消化反応を行った。 この反応液をェチジゥムプロ ミ ドを含むァガロースゲル電気泳動にかけ、 紫外線 （波長 3 0 2 nm) で検出して約 1. 1 7kbと約 1. 8 0 kbの DN Aを含むゲル片を切り出し た。 ゲル片にフエノール 0.5 mlを加えて凍結 · 溶解し、 水層をク口口 ホルムで洗浄後、 ェタノール沈殿により上部 D N Aを回収した。
DNA 1 8, DNA 1 9各 l O pmole を各々 T 4ポリ ヌ クレオチ ド キナーゼ反応用緩衝液 〔5 0 mMト リスー HCKPH7.5 ) 、 1 OmM MgCl2、 5 mMジチオスレィ トール （以下 D TTと略記する） 、 I raM ATP、 0. 1 mMスペルミ ジン、 0. 1 mM EDTA) 3 0 1 ずつに溶解し、 T 4ポリ ヌク レオチ ドキナーゼ （宝酒造社製） 3単位を加え、 3 7°C、 4 0分間リ ン酸化反応を行った後、 6 5 で 1 5分間加熱して酵素を 失活させた。 この反応液を 4 ^1 ずつ混合し、 上記で得た DNA断片 を各々 0.0 8 praole 加え、 T 4 リガーゼ反応用緩衝液 〔 2 8 mMト リス 一 HCl(pH7.5)、 9mM MgCl2、 1 0 mM DTT、 0.0 3mM EDTA、 0.7 mM AT P、 0.0 3 mMスペルミ ジン〕 の組成になるよう調整し、 T 4 DN Aリガーゼ （宝酒造社製） 1 7 5単位を加え、 3 0〃 1 とし た。 4でで 1 6時間結合反応を行った。
この反応液を用いて大腸菌 HB101株 〔ボリバー（Bolivar) ら ； ジー ン （Gene) 、 2_, 7 5 (1977)〕 を Cohenらの方法 〔エス · ェヌ ' コ一 ェン（S. N. Cohen ) ら ； プロシーデイ ング ' ォブ · ザ · ナショナル ' ァカデミィ * ォブ ， サイエンス（ Proc. Natl. Acad. Sci. )， USA. 69, 2110( 1972 )〕 により形質転換し、 アンピシリ ン耐性（ ΑρΓ ) の コロニーを得た。 このコロニーよりアルカリ処理法 〔マニアテイス (Maniatis)ら編 ； モレキュラー · クローニング（Molecular Cloning), p.368, コ一ル ド ' スプリ ングハーバー（Cold Spring Harbor)社刊〕 によってプラスミ ド DNAを回収し、 pSGHElを得た。 pSGHElの構造は、 Bgl II、 PvuK Hind III、 EcoRI 、 Nsi Iで切断してァガロースゲル電 気泳動により確認した。 制限酵素の切断反応は 1 OmMト リスー HC1 (PH7.5 ) 、 7mM MgCl2、 6 mM 2—メルカプトエタノールの組成の 溶液に各酵素の至適濃度になるよう （ 0〜2 0 OmM ) NaCl を加えた 反応液を用いて行った。
実施例 4 プラスミ ド pSGHEC— 2の作製
実施例 3で得たプラスミ ド pSGHElの 2 g を実施例 3に示した制限 酵素用反応液（100mM NaCl) 3 0 1 に溶解し、 EcoRI (宝酒造社製） 1 0単位を加え 3 7でで 2時間消化反応を行った。 次にこの反応液に Bacterial Alkaline Phosphatase (宝酒造社製） を 1単位加え 6 5 °Cで 3 0分間反応させた。 ついで Hindlll (宝酒造社製） 1 0単位、 Pvul (宝酒造社製） 1 0単位を加え 3 7 °Cで 2時間消化反応を行った。 同時に PSGHE1を Hindlll (宝酒造社製） 10単位、 Pvul (宝酒造社製） 1 0単位を加え、 3 7で、 2時間消化反応を行った。
上記反応液をェチジゥ厶ブ口 ミ ドを含むァガロースゲル電気泳動に かけ、 紫外線 （波長 3 0 2 nm) で検出して約 3 2 0 b、 約 8 5 0 bと 約 1. 8 kbの D N A断片を切り出した。 ゲル片にフエノール 0.5 mlを 加えて凍結 ' 溶解し、 水層をクロ口ホルムで洗浄後、 エタノール沈殿 により上記 DN A断片を回収した。
DNA 4 , DN A 5 , 各 1 0 pmole を各々 T 4ポリ ヌクレオチ ドキ ナーゼ反応用緩衝液 〔 5 0 mMト リスー HC1 (pH7.5 ) 、 1 0 raM MgCl2- 5 mMD T T、 1 mMATP 、 0. 1 mMスペルミ ジン、 0. 1 mM EDTA〕 S 0 n I ずつに溶解し、 T 4ポリ ヌク レオチ ドキナーゼ （宝酒造社製） 3単位 を加え 37°C、 4 0分間リ ン酸化反応を行った後、 6 5 °Cで 1 5分間加 熱して酵素を失活させた。 この反応液を 4 1 ずつ混合し、 上記で得 た DN A断片を各々 0. 0 8 pmole を加え、 T 4 リガーゼ反応用緩衝液 〔28mMト リス - HCl(pH7. 5 ) 、 9raM MgCl2、 1 0 mM DTT、 0. 0 3 mM EDTA、 0.7mM A T P、 0.0 3 mMスペルミ ジン〕 の組成にな るよう調整し、 T 4 DN Aリガーゼ （宝酒造社製） 1 7 5単位を加え、 3 0〃 1 とした。 4でで 1 6時間結合反応を行った。
この反応液を用いて大腸菌 HB101株を Cohenらの方法により形質転 換し、 アンピシリ ン耐性（ Apr ) のコロニーを得た。 このコロニーよ りアルカ リ処理法によってブラスミ ド DNAを回収し、 pSGHEC— 2を 得た。 pSGHEC— 2の構造は、 Bgl II、 PvuU Hindlll 、 EcoRI で切断 してァガロースゲル電気泳動により確認した。 制限酵素の切断反応は 1 0 mMト リ スー HC1 (PH7. 5 ) 、 7 mM MgCl2 、 6mM 2—メルカプト エタノールの組成の溶液に各酵素の至適濃度になるよう（0〜200mM ) NaClを加えた反応液を用いて行った。
PSGHEC - 2を含む大腸菌菌株は Escherichia coli SGHEC 2、 FERM BP— 2 7 3 2としてブダぺス ト条約の条件で工業技術院微生物工業技 術研究所 （微ェ研） に平成 2年 1月 1 8 日付で寄託してある。
実施例 5 プラスミ ド pSGHEC— 1 4の作製
実施例 3で得たプラスミ ド pSGHElの 2 を実施例 2に示した制限 酵素用反応液（100 mM NaCl) 3 0 1 に溶解し、 EcoRI (宝酒造社 製） 1 0単位を加え 3 7 °Cで 2時間消化反応を行った。 次にこの反応 液に Bacterial Alkaline Phosphatase (宝酒造社製） を 1単位加え 65 でで 3 0分間反応させた。 ついで Hind III (宝酒造社製） 1 0単位、 Pvul (宝酒造社製） 1 0単位を加え 3 7でで 2時間消化反応を行った c 同時に pSGHElを Hind III (宝酒造社製） 10単位、 Pvul (宝酒造社製） 1 0単位を加え、 3 7で、 2時間消化反応を行った。
この反応液をェチジゥムブ口 ミ ドを含むァガロースゲル電気泳動に かけ、 紫外線 （波長 3 0 2 nm) 検出して約 3 2 0 b. 約 8 5 0 bと約 1. 8kbの DN A断片を切り出した。 ゲル片にフエノール 0.5 mlを加 えて凍結 ' 溶解し、 水層をクロ口ホルムで浼浄後、 エタノール沈殿に より上記 DN A断片を回収した。
DNA 6〜9， 各 1 0 pmole を各々 T 4ポリ ヌクレオチドキナーゼ 反応用緩衝液 〔 5 0 mMト リスー HCl(pH7. 5 ) 、 1 0 mM MgCl2 、 5mM D T T、 1 mM ATP. 0. 1 mMスペルミ ジン、 0. 1 mM EDTA) 3 0 z 1 ずつに溶解し、 T 4ポリ ヌクレオチドキナーゼ （宝酒造社製） 3単位 を加え、 37で、 40分間リ ン酸化反応を行った後、 6 5でで 1 5分間加 熱して酵素を失活させた。 この反応液を 4 a 1 ずつ混合し、 上記で得 た DNA断片を各々 0.08pmole 加え、 T 4 リガーゼ反応用緩衝液 〔28 mMト リスー HC1 (pH7. 5 )、 9 mM MgCl2、 1 0 mM DTT、 0. 0 3 mM EDTA. 0. 7 mM ATP、 0. 0 3 mMスペルミ ジン〕 の組成になるよ う調整し、 T 4 DN Aリガーゼ （宝酒造社製） 1 7 5単位を加え、 30 H 1 とした。 4 °Cで 1 6時間結合反応を行った。
この反応液を用いて大腸菌 HB101株を Cohenらの方法により形質転 換し、 アンピシリ耐性（ Apr ) のコロニーを得た。 このコロニーより アル力 リ処理法によってブラスミ ド DN Aを回収し、 pSGHEC— 1 4を 得た。 pSGHEC— 1 4の構造は、 Bgl II、 Pvul、 Hindlll 、 EcoRI で切 断してァガロースゲル電気泳動により確認した。 制限酵素の切断反応 は 1 0 mMト リスー HCl(pH7. 5 ) 、 7 mM MgCl2 、 6 mM 2—メルカプト エタノールの組成の溶液に各酵素の至適濃度になるよう （ 0〜2 0 0 mM ) NaCl を加えた反応液を用いて行った。
PSGHEC- 1 4を含む大腸菌菌株は Escherichia coli SGHEC 1 4、 FERM BP- 2 7 3 1 としてブダぺス ト条約の条件で工業技術院微生物 工業技術研究所 （微ェ研） に平成 2年 1月 1 8 日付で寄託してある。 実施例 6 プラスミ ド pSGHEC— 1 8の作製
実施例 3で得たブラスミ ド pSGHElの 2 を実施例 2に示した制限 酵素用反応液 （lOOmM NaCl) 3 0 1 に溶解し、 EcoRI (宝酒造社製） 1 0単位を加え 3 7でで 2時間消化反応を行った。 次にこの反応液に Bacterial Alkaline Phosphatase (宝酒造社製） を 1単位加え 6 5 でで 3 0分間反応させた。 ついで Hindlll (宝酒造社製） 1 0単位、 Pvul (宝酒造社製） 1 0単位を加え 3 7 °Cで 2時間消化反応を行った。 同時に pSGHElを Hindlll (宝酒造社製） 10単位、 Pvul (宝酒造社製） 1 0単位を加え、 3 7で、 2時間消化反応を行った。
この反応液をェチジゥムブ口 ミ ドを含むァガロースゲル電気泳動に かけ、 紫外線 （波長 3 0 2 nm) で検出して約 3 2 0 b、 約 8 5 0 bと 約 1. 8 kbの DN A断片を切り出した。 ゲル片にフエノール 0. 5mlを 加えて凍結 ' 溶解し、 水層をクロ口ホルムで洗浄後、 エタノール沈殿 により上記 DN A断片を回収した。
DN A 1 0〜 1 7 , 各 1 0 pmole を各々 T 4ポリ ヌ ク レオチ ドキナ ーゼ反応用緩衝液 〔50mMト リスー HC1 (pH7. 5 ) 、 1 0 mM MgCl2、 5 mM D T T、 1 mM A T P、 0. 1 mMスペルミ ジン、 0. 1 mM EDTA〕 3 0 1 ずつに溶解し、 T 4ポリ ヌ ク レオチ ドキナーゼ （宝酒造社製） 3単位を加え 37で、 4 0分間リ ン酸化反応を行った後、 6 5 °Cで 15分 間加熱して酵素を失活させた。 この反応液を 4 ^ 1 ずつ混合し、 上記 で得た D N A断片を各々 0. 0 8 pmole を加え、 T 4 リガーゼ反応用緩 衝液 〔 2 8 mMト リス— HCl(pH7. 5 )、 9 πιΜ MgCl2、 1 0 mM D TT、 0. 0 3 mM E D T A. 0. 7 mM AT P、 0. 0 3 mMスペルミ ジン〕 の組 成になるよう調整し、 T 4 DNAリガーゼ （宝酒造社製） 175 単位を 加え、 3 0 1 とした。 4 eCで 1 6時間結合反応を行った。
この反応液を用いて大腸菌 HB101株を Cohenらの方法により形質転 換し、 アンピシリ ン耐性（ Apr ) のコロニ一を得た。 このコロニーよ りアルカ リ処理法によってプラスミ ド DNAを回収し、 pSGHEC— 1 8 を得た。 pSGHEC - 1 8の構造は、 Bgl II、 PvuU Hindlll 、 BcoRI で 切断してァガロースゲル電気泳動により確認した。 制限酵素の切断反 応は 1 O mMト リスー HC1 (pH7. 5 ) 、 7 mM MgCl2 、 6 mM 2—メル 力ブトエタノールの組成の溶液に各酵素の至適濃度になるよう （ 0〜 2 0 O raM )NaClを加えた反応液を用いて行った。
実施例 7 ブラスミ ド pSGHEC— 1 8 Sの作製
実施例 6で得たプラスミ ド pSGHEC-18 と pKYPIO (特開昭 58 - 110600) の各 2 ; g を、 Hindlll (宝酒造社製） 1 0単位、 Pvul (宝酒造社製） 1 0単位を含む溶液 〔 1 0 mMト リス- HC1 (ρΗ7· 5 ) 、 7 mM MgCl2、 6 mM 2—メルカブトエタノール、 1 0 0 mM NaCU 3 0 ^ 1 に溶解 し、 3 7 °C、 2時間消化反応を行った。 この反応液をェチジゥムプロ ミ ドを含むァガロースゲル電気泳動にかけ、 紫外線 （波長 3 0 2 nm) で検出して pSGHEC— 1 8の約 2. 3 6 kb DNA断片と pKYP 1 0の約 1. 1 kbDN Α断片を切り出した。 ゲル片にフエノール 0. 5 mlを加えて 凍結 ' 溶解し、 水層をクロ口ホルムで洗浄後、 エタノール沈殿により 上記 DNA断片を回収した。
上記で得た DN A断片各々 0. 0 8 pmole を混合し、 T 4 リガーゼ反 応用緩衝液 〔 2 8 mMト リスー HC1 (pH7. 5 )、 9 mM MgCl2. lOmM D T T、 0, 0 3 mM EDTA、 0. 7 mM AT P. 0. 0 3 mMスペルミ ジン〕 の 組成になるよう調整し、 T 4 DN Aリガ一ゼ （宝酒造社製） 1 7 5単 位を加え、 3 0 ; 1 とした。 4 °Cで 1 6時間結合反応を行った。
この反応液を用いて大腸菌 HB101株を Cohenらの方法により形質転 換し、 アンピシリ ン耐性（ Apr ) のコロニーを得た。 このコロニーよ りアルカ リ処理法によってプラスミ ド DNAを回収し、 pSGHEC— 18S を得た。 PSGHEC-18Sの構造は、 Bgl II、 Pvul、 Hindlll 、 EcoRI で 切断してァガロースゲル電気泳動により確認した。 制限酵素の切断反 応は 1 O mMト リ スー HC1 (pH7. 5 ) 、 7 raM MgCl2 、 6 mM 2—メル カプトェタノ一ルの組成の溶液に各酵素の至適濃度になるよう （ 0〜 2 0 0 mM ) NaCl を加えた反応液を用いて行った。
SGHEC- 1 8 Sを含む大腸菌菌株は Escherichia coli SGHEC18S. FBRM BP— 2 7 2 9 としてブダぺス ト条約の条件で工業技術院微生物 工業技術研究所 （微ェ研） に平成 2年 1 月 1 8 日付で寄託してある。 実施例 8 ブラスミ ド pSGHEC— 1414の作製
実施例 5で得たプラスミ ド pSGHEC— 1 4の 5 ug を実施例 3に示し た制限酵素用反応液 （ 1 0 0 mM NaCl ) 3 0 ^ 1 に溶解し、 Pstl (宝 酒造社製） 1 0単位を加え、 3 7 °Cで 2時間消化反応を行った。 次に この反応液に EcoRI (宝酒造社製） 1単位を加え 3 7でで 1 時間部分 消化を行った。 この反応液をェチジゥムブロ ミ ドを含むァガロースゲ ル電気泳動にかけ、 紫外線 （波長 3 0 2 nm) で検出して約 1. 4 kbの DNA断片と約 1. 8 5 kbの DNA断片を切り出した。 ゲル片にフエノ ール 0. 5 mlを加えて凍結 · 溶解し、 水層をクロ口ホルムで洗浄後、 ェ タノール沈殿により上記 DN A断片を回収した。
上記で得た DNA断片各々 0. 0 8 pmole を 1 0 〃 1 になるよう混合 し、 T 4 リガーゼ反応用緩衝液 〔 2 8 mMト リス— HC1 (pH7. 5 ) 、 9 mM MgCl2、 1 O mM D TT、 0. 0 3 mM EDTA、 0. 7 mM ATP 、 0. 0 3 mMスペルミ ジン〕 の組成になるよう調整し、 T 4 DNAリガ一ゼ （宝 酒造社製） 1 7 5単位を加え、 3 0 ; 1 とした。 4 で 1 6時間結合 反応を行った。
この反応液を用いて大腸菌 HB101株を Cohenらの方法により形質転 換し、 アンピシリ ン耐性（ Apr ) のコロニーを得た。 このコロニーよ りアルカリ処理法によってプラスミ ド DNAを回収し、 pSGHEC— 1414 を得た。 pSGHEC—1414の構造は、 Bgl II、 Pvul、 Hindlll 、 EcoRI で 切断してァガロースゲル電気泳動により確認した。 制限酵素の切断反 応は 1 O mMト リス一HC1 (pH7. 5 ) 、 7 mM MgCl2 、 6 mM 2—メル カプトェタノールの組成の溶液に各酵素の至適濃度になるよう （ 0〜 2 0 0 mM ) NaCl を加えた反応液を用いて行った。
PSGHEC— 1414を含む大腸菌菌株は Escherichia coli SGHEC1414 、 FERM BP— 2 7 3 0 としてブダぺス ト条約の条件で工業技術院微生物 工業技術研究所 （微ェ研） に平成 2年 1 月 1 8 日付で寄託してある。 実施例 9 プラスミ ド pSGHElを導入した大腸菌による sGHEl の生産
実施例 3で得られた pSGHElを用いて実施例 3に示した方法で大腸菌 W3110 strA( FERM BP— 732 ) を形質転換した。 得られた Aprのコロ 二一を 8 mlの L G培地 （ 1 %バク ト ト リプトン、 0. 5 酵母エキス、 0. 5 % NaCl 、 0. 1 %グルコース、 5 0 wg/mlァンピシリ ン、 pH7.4) に接種し、 3 0 °C、 1 6時間培養した。 この培養液 2 0 0 1 を 1 0 mlの MC G培地 （0. 6 % Na2HP04、 0. 3 %KH2P04、 0. 0 5 % NaCl 、 0. 1 % NH4CU 0. 5 %グルコース、 0. 5 %カザミ ノ酸、 1 mM MgS04、 0. 1 mM CaCl2、 4 μ. g/mlビタ ミ ン B ! 、 pH7. 4 ) に 5 0 ； igZmlの アンピシリ ンを添加した培地に接種し、 3 0 °C、 2 4時間培養した。 培養液を 7， 000rpmで 5分間遠心分離して菌体を集め、 この菌体をレ ムリ （ eram li) のサンプルバッファ一に溶解し、 加熱後、 レムリの 方法に従って S D S—ポリアク リルア ミ ドゲル電気泳動を行い、 クマ シーブリ リアン トブルーを用いて染色した結果、 分子量約 12600 の部 位にポリぺプチ ドバン ドを検出した （図 7 A参照） 。 pSGHElを含まな い大腸菌 W3110 strA 株には相当するバン ドは存在しなかった。 この ことは sGHEl を保有する大腸菌 W3110 strA 株が sGHEl を生産してい るこ とを示している。
実施例 1 0 プラスミ ド pSGHEC- 2を導入した大腸菌による sGHEC— 2の生産
実施例 4で得られた pSGHEC— 2を用いて実施例 3に示した方法で大 腸菌 W3110 strA( FERM BP- 7 3 2 ) を形質転換した。 得られた Apr のコロニーを実施例 9 と同様に L G培地に接種し、 3 0 °C、 1 6時間 培養した。
この培養液 を 1 0mlの MC G培地に 5 0 zg /mlのァン ピシリ ンを添加した培地に接種し、 3 0 °C、 2 4時間培養した。 培養 液を 7,000rpmで 5分間遠心分離して菌体を集め、 この菌体をレムリの サンプルバッファ一に溶解し、 加熱後、 S D S—ポリアク リルア ミ ド ゲル電気泳動を行い、 クマシ一プリ リアン トブルーを用いて染色した 結果、 分子量約 14800 の部位にポリペプチ ドバン ドを検出した （図 7 B参照）。 pSGHEC- 2を含まない大腸菌 W3110 strA 株には相当する バン ドは存在しなかった。 このことは、 pSGHEC— 2を保有する大腸菌 W3110 strA 株が、 C— 2によりコー ドされる H C V関連抗原と sGH との融合抗原ポリべプチ ド sGHEC— 2を生産していることを示してい o
実施例 1 1 プラスミ ド pSGHEC— 1 4を導入した大腸菌による融合抗 原ボリぺプチ ドの生産
実施例 5で得られた pSGHEC- 1 4を用いて実施例 3に示した方法で 大腸菌 W3110 strA( FERM BP- 7 3 2 ) を形質転換した。 得られた Ap' のコロニーを実施例 9 と同様に L G培地に接種し、 3 0 °C、 1 6時間 培養した。
この培養液 2 0 0 1 を 1 0mlの MC G培地に 5 0〃 g /mlのァン ピシリ ンを添加した培地に接種し、 3 0て、 2 4時間培養した。 培養 液を 7，000rpmで 5分間遠心分離して菌体を集め、 この菌体をレムリの サンプルバッファ一に溶解し、 加熱後、 S D S—ポリアク リルアミ ド ゲル電気泳動を行い、 クマシ一ブリ リアン トブル一を用いて染色した 結果、 分子量約 17100 の部位にポリべプチ ドバン ドを検出した （図 7 C参照） 。 pSGHEC— 1 4を含まない大腸菌 W3110 strA 株には相当す るバン ドは存在しなかった。 このことは、 pSGHEC— 1 4を保有する大 腸菌 W3110 strA 株が、 C一 1 4によりコ一ドされる H C V関連抗原 と s G Hとの融合抗原ポリペプチド sGHEC— 1 4を生産していること を示している。
実施例 1 2 プラスミ ド pSGHEC— 18S を導入した大腸菌による融合抗 原ポリぺプチ ドの生産
実施例 7で得られた pSGHEC— 18S を用いて実施例 3に示した方法で 大腸菌 W3110 strA 株（FERM BP- 7 3 2 ) を形質転換した。 得られた Apr のコロニーを実施例 9 と同様に L G培地に接種し、 30で、 1 6時 間培養した。
この培養液 を 2 5 jCi g Zmlの トリブトファ ンと 3 0 S Zmlのァンピシリ ンを含む MC G培地 〔Na2HP04 0. 6 %、 H2P04 0.3 %、 NaCl 0. 5 カザミ ノ酸 0. 5 MgS04 1 mM、 ビタ ミ ン Bュ 4 /mK pH7. 4 ) 1 0 mlに接種し、 3 0 Cで 4〜 8時間培養後、 ト リ ブトファ ンの誘導物質である 3 ；5—イン ドールアク リル酸 （ 3 — indoleacrylic acid ，以下 I A Aと略す） を 1 0 〃 g Zml加え、 さら に 2〜 1 2時間培養を続けた。
培養液を 7，000rpmで 5分間遠心分離して菌体を集め、 この菌体をレ ムリのサンプルバッファーに溶解し、 加熱後、 S D S—ポリアク リル ァミ ドゲル電気泳動を行い、 クマシ一プリ リアン トブルーを用いて染 色した結果、 分子量約 20400 の部位にポリペプチ ドバン ドを検出した (図 7 D参照） 。 pSGHEC - 18S を含まない大腸菌 W3110 strA 株には 相当するバン ドは存在しなかった。 このことは、 pSGHEC— 18S を保有 する大腸菌 W3110 strA 株が、 C一 18によりコー ドされる H C V関連 抗原と sGH との融合抗原ボリペプチド sGHEC— 18Sを生産しているこ とを示している。
実施例 1 3 プラスミ ド pSGHEC— 1414を導入した大腸菌による融合抗 原ポリぺブチ ドの生産
実施例 8で得られた pSGHEC— 1414を用いて実施例 3に示した方法で 大腸菌 W3110 strA( FERM BP- 7 3 2：)を形質転換した。 得られた Apr のコロニーを実施例 9 と同様に L G培地に接種し、 3 0 °C. 1 6時間 培養した。 この培養液 を 1 0 mlの MC G培地に 5 0 g / mlのアンピシリ ンを添加した培地に接種し、 3 0て、 2 4時間培養し た。 培養液を 7， OOOrpmで 5分間遠心分離して菌体を集め、 この菌体を レムリ のサンプルバッファーに溶解し、 加熱後、 S D S—ポリアク リ ルァミ ドゲル電気泳動を行い、 クマシ一プリ リアン トブルーを用いて 染色した結果、 分子量約 21700 の部位にボリべプチドバン ドを検出し た （図 7 E参照） 。 pSGHEC— 1414を含まない大腸菌 W3110strA株には 相当するバン ドは存在しなかった。 このことは、 pSGHEC- 1414を保有 する大腸菌 W3110strA株が、 C一 1 4にコー ドされている H C V関連 抗原を 2個と s G Hとの融合抗原ポリべプチ ド sGHEC— 1414を生産し ていることを示している。
実施例 1 4 大腸菌によって産生された sGHEC- 1 4ポリペプチ ドの 精製
実施例 1 1 によって得られた培養液を 8000rpm 、 4 0分間遠心して 集菌し、 3 0 mM NaCl 、 3 0 mMTris-HCl 緩衝液 （ pH7. 5 ) で洗浄し た。 sGHEC — 1 4は大腸菌内に顆粒として発現した。 まず、 洗浄菌体 から sGHEC— 1 4顆粒を特開昭 60-244259 に示された方法に従い純度 9 0 にまで精製した。 この顆粒 8 0 O mgを 7 0 %ギ酸に可溶化し、 4 0 mlとし、 12000rpm、 2 0分間遠心後、 逆相 HPLCを用い、 sGHEC - 1 4を精製した。 逆相 H P L Cの操作条件は以下のとおりである。 カラム ： Hi— PORE C 4 2 1. 5 mm x 2 5 cm (バイオラ ッ ド社製） A 液 ： 0. 1 % ト リ フルォロ酢酸、 1 5 %ァセ トニ ト リル
B 液 ： 0. 1 % ト リ フルォロ酢酸、 9 0 %ァセトニ ト リル
グラジェン ト ：
Figure imgf000034_0001
流 速 ： 2 0 mlZ分
検 出 ： 紫外吸収 2 2 0 nm
力ラム温度 ： 3 5 °C
sGHEC - 1 4は逆相 H P L Cにおいて、 グラジェン ト開始後 2 6〜 2 8分に溶出された。 この溶出画分 4 0 mlを 1 mlずつ分注後、 凍結乾 燥し、 sGHEC— 1 4 の標品を得た。 この 1バイアルを 0. 1 % ト リ フ ルォロ酢酸 1 mlに溶解後タンパク質ァッセィキッ ト （バイオラッ ド社 製） S D S —ポリアク リルア ミ ドゲルにより分析したところ、 蛋白濃 度 0. 2〜0. 6 mg/ml ( sGHEC— 1 4の場合 0. 4 4 mg/ml , 牛血清アル ブミ ン換算） 、 純度 9 0 以上であった。
同様な方法で sGHEl, sGHEC 一 2， sGHEC 一 18S， sGHEC— 1414も精 製可能である。
実施例 1 5 H C V関連融合抗原ポリペプチ ドを用いた抗 H C V抗体 の検出
人血清を試料として、 ウェスタンブロッテイ ング （以下 WBと略記 する） を行った 〔バーネッ ト（Burnett),アナ一ルバィオケミ （Anal. Biochem. ) 11_2_, 195( 1981 ) 〕 。
使用した H C V関連融合抗原としては、 実施例 1 4で得た精製され た C一 1 4融合抗原ポリべプチ ドを用いた。
精製された C— 1 4融合抗原ポリベプチド 1 00 g を. S D S—ポリ 了ク リルァ ミ ドゲルで泳動後、 同一ゲルを二トロセルロース膜に電気 的にブロッテイ ングした 〔トウビィ ン（Towbin), プロシ一デイ ング - ォブ · ザ · ナショナル . ァ力デミ ィ ' ォブ · サイエンス（ proc. Natl.
Acad. Sci. USA ) 7 _6 , 4350( 1979 )〕 。 プロッティ ング後、 ブロッ ト （ 1 0 mMリ ン酸バッファー pH7. 2 , 5 0 0 mMNaCK 5 % スキムミ ルク， 消泡剤 1滴） 液に浸し、 室温で 2時間振とう した。 振とう後、 二トロセルロース膜を短冊状に切り、 蛋白量 3 g Z短冊になるよう にした。 この短冊を 3 ralのブロッ トに浸し人血清を 3 0 μ.1 加え室温 で一夜処理した。 次いでフィルターを Tween— PBS( 1 O mMリ ン酸ノく ッ ファー PH7. 2 , 5 0 0 mM NaCl , 0.05^ Tween 2 0 ) で洗浄した後, 抗人ィムノ グロブリ ンズ · パーォキシダーゼコンジュゲー トを加え室 温で 2時間反応させた。 次に Tween— P B Sで洗浄し最後に P B Sで 洗浄した後、 発色剤を加えた。 発色剤は、 4一クロロー 1 一ナフ トー ル （バイオラッ ド社） 6 0 mgに、 冷メタノールを加えたものと、 P B S 1 0 0 mlに過酸化水素水 6 0 il l を混合したものを用いた。 発色反 応は遮光し、 3 0分間反応させた後、 水で洗浄して終了した。
使用した血清は以下の通りである。 なお P I B法とはプラーク · ィ ムノ ' ブロ ッ ト法 〔有馬ら、 日本臨床 48 ， 27— 32(1990)〕 の略であ り、 カイロン法は Kuo, G. et al, Science 244 , 362— 364( 1989 ) に記載の方法である ： 血清（1) (2)は、 P I B法 C一 1 4 (― ) , C一 1 8 ( + ) 患者血清 ： （3) 〜（10)は P I B法 C— 1 4 ( + ) 患者血清 ： (11)〜(： 15)は、 P I B法 C一 1 4 (一） 患者血清 ： （1E)〜(： 14E) は P I B法 C一 1 4 (一） 患者血清 ： （15E) は P I B法 C一 1 4 (一） ， カイロン法 （+ ) 血清 ： （16E) は P I B法 C一 1 4 (一） ， カイロン 法 （一） である。 表 2は血清 （1)〜(： 15)までのウェスタンプロッティ ングの結果を示す。 表 3は血清（1E)〜(： 16E) までのウェスタンブロッ ティ ングの結果を示す。
(1) 〜（10)において従来法 P I Bによる C一 1 4判定と本発明にか かわる W B判定は、 非常によい相関を示した。 （11)〜（15), (1E)〜 (16E) においては、 従来法の P I B法による C— 14判定陰性検体を、 本発明で用いた融合抗原ポリべプチ ドによる W B法では検出すること ができた。 また（16E) においては、 カイロン法で陰性判定の検体を、 本発明による W B法で検出することができた。 融合させた s G Hボリ ぺプチドのみを用いた W B法では、 いずれも血清と反応性を示さない ことが判明した。 従って、 本発明の融合抗原ポリペプチ ドは、 抗 H C V抗体を検出する血清診断に用いるに極めて有効であると考えられる。
2
患者血清の検定比較 rfn 樓 P x T I 1_> VV JD 暫 断
1 一 一 慢性肝炎
2 ―
3 + + 慢性肝炎
4 + + 〃
U + 1 1 〃
6 + + 〃
7 + +
8 + + 肝硬変
9 + + 慢性肝炎
10 + +
11
12 + 肝硬変
13 H B V
14 H BV
15 + 肝硬変
S G ： セーグレ ン症候群
H B V ： B型肝炎ウィルス保持者
3
患者血清の検定比較 血清 診断 P I B WB カイ C3 ン
1E 肝硬変 - +
2E +
3E C回復期 一 +
4E 肝硬変 - +
5E 〃 一 +
6E +
7E 急性肝炎 -
8E 肝硬変 -
9E 慢性肝炎 - +
10E 急性肝炎 - +
11E
12E 肝硬変 - +
13E +
14B 慢性肝炎 - +
15E + +
16E + 実施例 1 6 DNA 2 9〜3 6の製造
DN A 2 9〜3 6の合成は実施例 1 と同様の方法で行った。
実施例 1 7 プラスミ ド pSGHEC— 1 4 Aの作製
実施例 3で得たプラスミ ド pSGHElの 2 μ. を実施例 2に示した制限 酵素用反応液 （lOOmM NaCl) 3 0 μ.1 に溶解し、 EcoRI (宝酒造社製） 1 0単位を加え 3 7 °Cで 2時間消化反応を行った。 次にこの反応液に Bacterial Alkaline Phosphatase (宝酒造社製） を 1単位加え 6 5 でで 3 0分間反応させた。 ついで Hind III (宝酒造社製） 1 0単位、 Pvul (宝酒造社製） 1 0単位を加え 3 7 °Cで 2時間消化反応を行った。 同時に pSGHElを Hindlll (宝酒造社製） 10単位、 Pvul (宝酒造社製） 1 0単位を加え、 3 7で、 2時間消化反応を行った。
この反応液をェチジゥムブ口 ミ ドを含むァガロースゲル電気泳動に かけ、 紫外線 （波長 3 0 2 nm) 検出して約 3 2 0 b、 約 8 5 0 bと約 1. 8 kbの DN A断片を切り出した。 ゲル片にフエノール 0. 5 mlを加え て凍結 '溶解し、 水層をクロ口ホルムで 浄後、 エタノール沈殿によ り上記 DNA断片を回収した。
DNA 2 9〜3 4， 各 1 0 pmole を各々 T 4ポリ ヌク レオチドキナ —ゼ反応用緩衝液 〔50mMト リス- HC1 (pH7. 5 ) 、 1 0 mM MgCl2、 5 mM DTT、 1 mM A T P、 0. 1 mMスペルミ ジン、 0. 1 mM EDTA〕 3 0 ^1 ずつに溶解し、 T 4ポリ ヌク レオチ ドキナーゼ （宝酒造社製） 3単位を加え、 3 7で、 4 0分間リ ン酸化反応を行った後、. 6 5でで 1 5分間加熱して酵素を失活させた。 この反応液を 4 ;zl ずつ混合し、 上記で得た DNA断片各々 0. 0 8 pmole を加え、 T 4 リガーゼ反応用 緩衝液 〔 2 8 mMト リスー HCKPH7. 5 )、 9mM MgCl2、 1 0 mM DTT、 0. 0 3 mM E D T A、 0. 7 mM A T P、 0. 0 3 mMスペルミ ジン〕 の組 成になるよう調整し、 T 4 DN Aリガーゼ （宝酒造社製） 175 単位を 加え、 3 0 1 とした。 4 °Cで 1 6時間結合反応を行った。
この反応液を用いて大腸菌 HB101株を Cohenらの方法により形質転 換し、 アンピシリ ン耐性（ Apr ) のコロニーを得た。 このコロニーよ りアル力 リ処理法によってプラスミ ド DNAを回収し、 pSGHEC— 1 4 Aを得た。 pSGHEC— 1 4 Aの構造は、 Bgl II、 PvuK Hind III、 EcoR I で切断してァガロースゲル電気泳動により確認した。 制限酵素の切 断反応は 1 OiiiMト リスー HCKPH7. 5 ) 、 7 raM MgCl2 、 6 mM 2—メ ルカプトェタノールの組成の溶液に各酵素の至適濃度になるよう （ 0 〜2 0 0 mM ) NaClを加えた反応液を用いて行った。
SGHEC- 1 4 Aを含む大腸菌菌株は Escherichia coli SGHEC14A 、 FERM BP — 3261としてブダぺス ト条約の条件で工業技術院微生物工業 技術研究所 （微ェ研） に平成 3年 2月 1 日付で寄託してある。
実施例 1 8 プラスミ ド pSGHEC— 1 4 Bの作製
実施例 3で得たプラスミ ド pSGHElの 2 g を実施例 2に示した制限 酵素用反応液 （lOOmM NaCl) 3 0 fi 1 に溶解し、 EcoRI (宝酒造社製） 1 0単位を加え 3 7でで 2時間消化反応を行った。 次にこの反応液に Bacterial Alkaline Phosphatase (宝酒造社製） を 1単位加え 6 5 °Cで 3 0分間反応させた。 ついで Hind 〖II (宝酒造社製） 1 0単位、 Pvul (宝酒造社製） 1 0単位を加え 3 7でで 2時間消化反応を行った。 同時に PSGHElを Hindlll (宝酒造社製） 10単位、 Pvul (宝酒造社製） 1 0単位を加え、 3 7 °C、 2時間消化反応を行った。
この反応液をェチジゥムブ口 ミ ドを含むァガロースゲル電気泳動に かけ、 紫外線 （波長 3 0 2 nm) で検出して約 3 2 0 b、 約 8 5 0 bと 約 1. 8 kbの DN A断片を切り出した。 ゲル片にフエノール 0.5 mlを加 えて凍結 ' 溶解し、 水層をクロ口ホルムで洗浄後、 エタノール沈殿に より上記 DN A断片を回収した。
DNA 2 9〜 3 2， DNA 3 5〜 3 6各 1 0 pmole を各々 T 4ポリ ヌク レオチ ドキナーゼ反応用緩衝液 〔50mMト リス— HC1 (pH7. 5 ) 、 1 0 mM MgCl2、 5raMDTT、 1 mM A T P、 0. 1 mMスペルミ ジン、 0. 1 mM EDTA〕 3 0 1 ずつに溶解し、 T 4ポリ ヌク レオチ ドキナー ゼ （宝酒造社製） 3単位を加え 37で、 4 0分間リ ン酸化反応を行った 後、 6 5 °Cで 15分間加熱して酵素を失活させた。 この反応液を 4 / 1 ずつ混合し、 上記で得た DN A断片各々 0. 0 8 pmole を加え、 T 4 リ ガーゼ反応用緩衝液 〔 2 8 mMト リスー HCl(pH7. 5 )、 9mM MgCl2、 10 raMD TT. 0. 0 3 mM EDTA、 0. 7mM A T P、 0. 0 3 mMスペルミ ジン〕 の組成になるよう調整し、 T 4 DNAリガーゼ （宝酒造社製） 175 単位を加え、 3 0 / 1 とした。 4 °Cで 1 6時間結合反応を行った t この反応液を用いて大腸菌 HB101株を Cohenらの方法により形質転' 換し、 アンピシリ ン耐性（ Apr ) のコロニーを得た。 このコロニーよ りアル力 リ処理法によってプラスミ ド DNAを回収し、 pSGHEC— 1 4 Bを得た。 pSGHEC— 1 4 Bの構造は、 Bgl II、 PvuK Hind III、 EcoR I で切断してァガロースゲル電気泳動により確認した。 制限酵素の切 断反応は 1 0 mMト リスー HCl(pH7. 5 ) 、 7 mM MgCl2 、 6 mM 2—メ ルカブトェタノールの組成の溶液に各酵素の至適濃度になるよう （ 0 〜 2 0 0 mM ) NaClを加えた反応液を用いて行った。
pSGHEC - 1 4 Bを含む大腸菌菌株は Escherichia coli SGHEC14B 、 FBRM BP 一 3262としてブダぺス ト条約の条件で工業技術院微生物工業 技術研究所 （微ェ研） に平成 3年 2月 1 日付で寄託してある。
実施例 1 9 プラスミ ド pSGHEC— 1 4 Aを導入した大腸菌による融合 抗原ポリぺプチ ドの生産
実施例 1 7で得られた pSGHEC— 1 4 Aを用いて実施例 3に示した方 法で大腸菌 W3110 strACFERM BP- 7 3 2 ) を形質転換した。 得られた Apr のコロニーを実施例 9 と同様に L G培地に接種し、 3 0で、 1 6 時間培養した。
この培養液 2 0 0 n 1 を 1 0 mlの MC G培地に 5 0 g /mlのァン ピシリ ンを添加した培地に接種し、 3 0で、 2 4時間培養した。 培養 液を 7，000rpmで 5分間遠心分離して菌体を集め、 この菌体をレムリの サンプルバッファ一に溶解し、 加熱後、 S D S—ポリアク リルアミ ド ゲル電気泳動を行い、 クマシ一プリ リアン トブルーを用いて染色した 結果、 分子量約 17100 の部位にポリペプチ ドバン ドを検出した （図 10 F参照） 。 pSGHEC— 1 4 Aを含まない大腸菌 W3110 strA 株には相当 するバン ドは存在しなかった。 このことは、 pSGHEC— 1 4 Aを保有す る大腸菌 W3110 strA株が、 C一 1 4 Aによりコー ドされる H C V関連 抗原と s GHとの融合抗原ポリペプチ ド sGHEC— 1 4 Aを生産してい ることを示している。
実施例 2 0 ブラスミ ド pSGHEC— 1 4 Bを導入した大腸菌による融合 抗原ポリベプチ ドの生産
実施例 1 8で得られた pSGHEC— 1 4 Bを用いて実施例 3に示した方 法で大腸菌 W3110 strACFBRM BP- 7 3 2 ) を形質転換した。 得られた Apf のコロニーを実施例 9 と同様に L G培地に接種し、 3 0で、 1 6 時間培養した。
この培養液 2 0 0 〃 1 を 1 0 mlの MC G培地に 5 0 〃g Zmlのァン ピシリ ンを添加した培地に接種し、 3 0 °C、 2 4時間培養した。 培養 液を 7， OOOrpmで 5分間遠心分離して菌体を集め、 この菌体をレムリの サンプルバッファ一に溶解し、 加熱後、 S D S—ボリアク リルアミ ド ゲル電気泳動を行い、 クマシ一ブリ リアン トブルーを用いて染色した 結果、 分子量約 16500 の部位にポリペプチドバン ドを検出した （図 10 G参照） 。 pSGHEC— 1 4 Bを含まない大腸菌 W3110 strA 株には相当 するバン ドは存在しなかった。 このことは、 pSGHEC— 1 4 Bを保有す る大腸菌 W3110 strA株が、 C— 1 4 Bによりコー ドされる H C V関連 抗原と s G Hとの融合抗原ポリべプチ ド sGHEC— 1 4 Bを生産してい ることを示している。
実施例 2 1
大腸菌によって産生された SGHEC— 1 4 A, SGHEC- 1 4 Bポリべ プチ ドの精製
実施例 1 4 と同様な方法で SGHEC— 1 4 A, SGHEC- 1 4 Bは、 精 製可能である。
産業上の利用可能性
本発明によれば、 抗原ポリべプチドが異種ポリべプチドと融合した 形の融合抗原ポリベプチ ドを大量に製造することができる。 該融合抗 原ポリペプチ ドは、 C型肝炎ウィルスに感染した患者の正確な血清診 断に利用することができる。
【配列表】 配列番号： 1
配列の長さ ： 66
配列の型： 核酸
鎮の数： ニ本鎮
ト ポ ロ ジ ー ： 直鎖状
配列の種類： 他の核酸 B型肝炎以外の肝機能異常者血清からの R N Aを c D N A化 した もの （ C型肝炎ウ ィ ル ス関連抗原遺 伝子）
配列の特徴
特徵を表す記号： CDS
存在位置： 1..66
特徴を決定 した方法： E
特徴を表す記号： peptide
存在位置： 1..22
特徴を決定 した方法： E
配列
GAA TCC CCA ACG CGT CGG CTT GGC CCG CGC CTT GGC CGC CGA CCC GCG 48 G 1 u Phe Pro Thr Arg Arg Leu Gly Pro Arg Leu Gly Arg Arg Pro Ala
1 5 10 15
CTG ATG GCC GTG GAA TTC 66 Leu Met Ala Val Glu Phe
20 配列番号： 2
配列の長さ ： 1
配列の型： 核酸
鎖の数： ニ本鎮
ト ポ ロ ジー： 直鎮状
配列の種類： 他の核酸 B型肝炎以外の肝機能異常者血清からの R N Aを
c D N A化した も の （ C型肝炎ウ ィ ル ス関連抗原遺 伝子）
E列の特徵
特徴を表す記号： CDS
存在位置： 1..114
特徴を決定 した方法： E
特徵を表す記号： peptide
存在位置： 1..38
特徴を決定した方法： E
配列
GAA TTC CGA GAA CAA GAC CAG ATA AAA ACC AAA GAC AGA ACA CAA CAG 48 Glu Phe Arg Glu Gin Asp Gin lie Lys Thr Lys Asp Arg Thr Gin Gin
1 5 10 15
AGA AAG ACG AAA AGA AGC ACC AAT CGC AGG CGA AGC AAA AAC GAA AAA 96 Arg Lys Thr Lys Arg Ser Thr Asn Arg Arg Arg Ser Lys A sn Glu Lys
20 25 30
AAA AAA AAA AAG GAA TCC 114
Lys L s L s Lys Glu Phe
35 配列番号： 3
配列の長さ ： 201
配列の型： 核酸
鎮の数： ニ本鑌
ト ポ ロ ジ ー ： 直鎖状
配列の種類： 他の核酸 B型肝炎以外の肝機能異常者血清か ら の R N Aを
c D N A化した も の （ C型肝炎ウ ィ ル ス関連抗原遺 伝子）
配列の特徴
特徴を表す記号： CDS
存在位置： 1..201
特徴を決定 した方法： E
特徴を表す記号： peptide
存在位置： 1..67
特徵を決定 した方法： E
配列
GAA TTC CAA GAA AAA AAG GGA GAA GCC AGC AAT GGA GAA GCC GAA AAC 48 Glu Phe Gin Glu Lys L s Gly Glu Ala Ser Asn Gly Gl u Ala Glu Asn
5 10 15
GAC ACA CAC AAG AAA CAA AGG AGG TAC AAA GAA AAA GAA AAA ACG GCA 96 Asp Thr His L s L s G 1 n Arg Ar g Tyr L s Glu L s Glu Lys Thr Ala
20 25 30
ACA AAT AAC CCA GGA AAG AAC AAA AAG CCA AGA GTG GGC AGA ATA AAA 144 Thr Asn Asn Pro Gly L s Asn Lys L s Pro Arg Va 1 Gly Arg l ie Lys AAC TGG AAC CGG GAG GGA AGG AAG GAC GCA TAT CAG ATT AGA AAA AGG 192
Asn Trp Asn Arg Glu Gl y Arg Lys Asp Ala Tyr Gin lie Arg Lys Arg
50 55 60
AGG GAA TTC 201 Arg Glu P e
65
配-列番号： 4
E列の長さ ： so
配列の型： 核酸
鑌の数： 一本鎖
ト ポ ロ ジー： 直鎖状
E列の種類： 他の核酸 合成 D N A
配列の特徴
特徴を表す記号： unsure
存在位匱： 1..60
特徴を決定 した方法： E
配列
AATTCCCAAC GCGTCGGCTT GGCCCGCGCC TTGGCCGCCG ACCCGCGCTG ATGGCCGTGG 60
配-列番号： 5
配列の長さ ： 60
配列の型： 核酸
鎮の数： 一本鎮
ト ポ ロ ジー ： 直鎖状
配列の種類： 他の核酸 合成 D N A
配列の特徴
特徴を表す記号： unsure
存在位置： 1..60
特徵.を決定 した方法： E
配列
AATTCCACGG CCATCAGCGC GGGTCGGCGG CCAAGGCGCG GGCCAAGCCG ACGCGTTGGG 60
E.列番号： 6
82列の長さ ： 53
E列の型： 核酸
鎮の数： 一本鑌
ト ポ ロ ジー： 直鎖状
E列の種類： 他の核酸 合成 D N A
配列の特徵
特徵を表す記号： unsure
存在位置： 1.. 53
特徵を決定 した方法： E
配列
AATTCCGAGA ACAAGACCAG ATAAAAACCA AAGACAGAAC ACAACAGAGA AAG 53
E列番号： 7
E列の長さ ： 55
配列の型： 核酸
鎖の数： 一本鎖
ト ポ ロ ジー ： 直鎖状
配列の種類： 他の核酸 合成 D N A
配列の特徵
特徵を表す記号： unsure
存在位置： 1..55
特徵を決定した方法： E
配列
TTTCGTCTTT CTCTGTTGTG TTCTGTCTTT GGTTTTTATC TGGTCTTGTT CTCGG 55
E列番号： 8
@2列の長さ ： 55
SB列の型： 核酸
鎮の数： 一本鎮
ト ポ ロ ジー： 直鎖状
配列の種類： 他の核酸 合成 D N A
配列の特徵
特徴を表す記号： unsure
存在位置： 1.. 55
特徴を決定 した方法： E
配列
ACGAAAAGAA GCACCAATCG CAGGCGAAGC AAAAACGAAA AAAAAAAAAA AAAGG 55
列番号： 9
E列の長さ ： 53
配列の型： 核酸
鑌の数： 一本鑌
ト ポ ロ ジー： 直鑌状
配列の種類： 他の核酸 合成 D N A
K列の特徴
特徴 ¾：表す記号： unsure
存在位置： 1..53
特徴を決定 した方法： E
配列
AATTCCTTTT TTTTTTTTTT TTCGTTTTTG CTTCGCCTGC GATTGGTGCT TCT 53
配列番号： 10
配列の長さ ： 50
82列の型： 核酸
鎖の数： 一本鎮
ト ポ ロ ジー： 直鑌状
配列の種類： 他の核酸 合成 D N A
E列の特徵
特徴を表す記号： unsure
存在位置： 1..50
特徴を決定 した方法： E
配列
AATTCCAAGA AAAAAAGGGA GAAGCCAGCA ATGGAGAAGC CGAAAACGAC 50
S£列番号： 11
82列の長さ ： 52
列の型： 核酸
鎖の数： 一本鎖
ト ポ ロ ジー ： 直鎖状
E列の種類： 他の核酸 合成 D N A
配列の特徴
特徴を表す記号： unsure
存在位置： 1..52
特徴を決定 した方法： E
配列
GTGTGTGTCG TTTTCGGCTT CTCCATTGCT GGCTTCTCCC TTTTTTTCTT GG 52
配列番号： 12
E列の長さ ： 51
配列の型： 核酸
鎮の数： 一本鎮
ト ポ ロ ジー： 直鎮状
E列の種類： 他の核酸 合成 D N A
配列の特徴
特徴 表す 己号： unsure
存在位置： 1..51
特徴を決定 した方法： E
配列
ACACACAAGA AACAAAGGAG GTACAAAGAA AAAGAAAAAA CGGCAACAAA T 51
配列番号： 13
E列の長さ ： 51
配列の型： 核酸
鎮の数： 一本鎮
ト ポ ロ ジー： 直鎖状
E列の種類： 他の核酸 合成 D N A
記列の特徴
特徴を表す記号： unsure
存在位置： 1..51
特徴を決定 した方法： E
配列
TGGGTTATTT GTTGCCGTTT TTTCTTTTTC TTTGTACCTC CTTTGTTTCT T 51
配列番号： 14
E列の長さ ： 51
配列の型： 核酸
鎖の数： 一本鎖
ト ポ ロ ジ ー ： 直鎖状
E列の種類： 他の核酸 合成 D N A
配列の特徴
特徵 ¾:表す 己号： unsure
存在位置： 1..51
特徴を決定 した方法： E
配列
AACCCAGGAA AGAACAAAAA GCCAAGAGTG GGCAGAATAA AAAACTGGAA C 51
配列番号： 15
配列の長さ ： 51
配列の型： 核酸
鎖の数： 一本鑌
ト ポ ロ ジー： 直鑌状
配列の種類： 他の核酸 合成 D N A
配列の特徴
特徴を表す記 ： unsure
存在位置： 1..51
特徴を決定 した方法： E
配列
CTCCCGGTTC CAGTTTTTTA TTCTGCCCAC TCTTGGCTTT TTGTTCTTTC C 51
配列番号： 16
K列の長さ ： 43
配列の型： 核酸
鎖の数： 一本鎖
ト ポ ロ ジー： 直鎖状
配列の種類： 他の核酸 合成 D N A
配列の特徴
特徴を表す記 ： unsure
存在位置： 1..43
特徵を決定 した方法： E
配列
CGGGAGGGAA GGAAGGACGC ATATCAGATT AGAAAAAGGA GGG 43
配列番号： 17
配列の長さ ： 41
配列の型： 核酸
鎖の数： 一本鑌
ト ポ ロ ジー： 直鎮状
配列の種類： 他の核酸 合成 D N A
配列の特徴
特徵 ¾■表す記号： unsure
存在位置： 1..41
特徴を決定 した方法： E
配列
AATTCCCTCC TTTTTCTAAT CTGATATGCG TCCTTCCTTC C 41
82列番号： 18
配列の長さ ： 29
E列の型： 核酸
鎖の数： 一本鑌
ト ポ ロ ジー ： 直鎖状
SB列の種類： 他の核酸 合成 D N A
E列の特徴
特徴を表す記号： unsure
存在位置： 1..29
特徴を決定 した方法： E
E列
GATCATGGAA TTCTAAGTAA GTAAATGCA 29
配列番号： 19
配列の長さ ： 21
E列の型： 核酸
鎖の数： 一本鎖
ト ポ ロ ジ ー ： 直鑌状
配列の種類： 他の核酸 合成 D N A 配列の特徴
特徴を表す記号： unsure
存在位置： 1..21
特徴を決定 した方法： E
配列
TTTACTTACT TAGAATTCCA T 21
配列番号： 20
E列の長さ ： 64
E列の型： 核酸
鎮の数： ニ本鎮
ト ポ ロ ジー ： 直鑌状
配列の種類： 他の核酸 B型肝炎以外の肝機能異常者血清からの R N Aを
c D N A化した もの （ C型肝炎 ウ ィ ル ス関連抗原遺 伝子）
配列番号 4, 5か ら形成される 合成 D N A断片 配列の特徴
特徵を表す記号： CDS
存在位置： 1..64
特徵を決定 した方法： E
12列
EcoR I
配列番号： 21
配列の長さ ： 112
配列の型： 核酸
鎮の数： ニ本鎮
ト ポ ロ ジー： 直鎮状
配列の種類： 他の核酸 B型肝炎以外の肝機能異常者血清か らの R N Aを
c D N Aィ匕した もの
配列番号 6, 7, 8, 9か ら形成される合成 D N A断片 配列の特徴
特徴を表す記号： CDS
存在位置： 1..112
特徵を決定 した方法： E
配列
59
EcoR I
AGAAGCACCAATCGCAGGCGAAGCAAAAACGAAAAAAAAAAAAAAAAGG
112
EcoR I
配列番号： 22
K列の長さ ： 199
配列の型： 核酸
鑌の数： ニ本鎮
ト ポ ロ ジー： 直鎮状
配列の種類： 他の核酸 Β型肝炎以外の肝機能異常者血清か らの R N Aを
c D N A化 した もの
配列番号 10. 11, 12. 13.14, 15. 16.17か ら形成され る合成 D Ν Α断片
配列の特徴
特徴を表す記号： CDS
存在位置： 1..199
特徴を決定 した方法： E
配列
Figure imgf000065_0001
EcoR I
Figure imgf000065_0002
Figure imgf000065_0003
ATTAGAAAAAGGAGGG TAATCTTTTTCCTCCCTTAA 199
EcoRI 配列番号： 23
配列の長さ： 29
配列の型： 核酸
鎖の数： ニ本鎮
ト ポ ロ ジ ー ： 直鎮状
配列の種類： 他の核酸 配列番号 18, 19か ら形成される合成 D N A断片 プ ラ ス ミ ド構築に用いた リ ン カ一 D N A 配列の特徴
特徴を表す記号： unsure
存在位置： 1..29
特徴を決定 した方法： E
配列
MetGluPhe
GATCATGGAATTCTAAGTAAGTAAATGCA TACCTTAAGATTCATTCATTT 29
Bgll I EcoRI Nsi I
配列表 配列番号： 24
配列の長さ ： 337
配列の型： 核酸
鎖の数： ニ本鑌
ト ポ ロ ジー ： 直鑌状
配列の種類： 他の核酸 配列表 18. 19か ら形成される D N A断片をサケ成長ホ ルモ ン D N A断片と連結さ せた も の
配列の特徴
特徴を表す記号： CDS
存在位置： 1.. 337
特徴を決定 した方法： E
特徴を表す記号： peptide
存在位置： 1.. 107
特徴を決定 した方法： E
配列
ATG ATA GAA AAC CAA CGG CTC TTC AAC ATC GCG GTC AGT CGG GTG CAA 48
Met l ie Gl u Asn Gin Arg Leu Phe Asn l ie Ala Yal Ser Arg Val Gin
5 10 15
CAT CTC CAC CTA TTG GCT CAG AAA ATG TTC AAT GAC TTT GAC GGT ACC 96 His Leu His Leu Leu Ala Gin Ly s Met Phe Asn Asp Phe Asp G ly Thr
20 25 30 CTG TTG CCT GAT GAA CGC AGA CAG CTG AAC AAG ATA TTC CTG CTG GAC 144 Leu Leu Pro Asp G 1 u Arg Arg Gin Leu A sn Ly s l ie Phe Leu Leu Asp
35 40 45
TTC TGT AAC TCT GAC TCC ATC GTG AGC CCA GTC GAC AAG CAC GAG ACT 192 Phe Cys Asn Ser Asp Ser lie Val Ser Pro Val Asp Lys His Glu Thr
50 55 60
CAG AAG AGT TCA GTC CTG AAG CTG CTC CAC ATT TCT TTC CGT CTG ATT 240 Gin L s Ser Ser Val Leu Lys Leu Leu His l ie Ser Phe Arg Leu l ie
65 70 75 80
GAA TCC TGG GAG TAC CCT AGC CAG ACC CTG ATC ATC TCC AAC AGC CTA 288 Glu Ser Trp Glu Tyr Pro Ser Gin Thr Leu l ie lie Ser Asn Ser Leu
85 90 95
ATG GTC AGA AAC GCC AAC CAG ATC ATG GAA TTC TAAGTAAGTA AATGCA 337
Met Val Arg Asn Ala Asn Gin lie Met Glu Phe
100 105 EcoRI
配列番号： 25
配列の長さ ： 381
配列の型： 核酸
鎖の数： 二本鎖
ト ポ ロ ジ ー ： 直鎮状
配列の種類： 他の核酸 配列表 4.5か ら形成される D N A断片を配列表 24の
D N A断片中に組み込んだ もの
配列の特徵
特徴を表す記号： CDS
存在位置： 1..381
特徴を決定 した方法： E
特徴を表す記号： peptide
存在位置： 1..127
特徴を決定 した方法： E
配列
ATG ATA GAA AAC CAA CGG CTC TTC AAC ATC GCG GTC AGT CGG GTG CAA 48 Met lie Gl u Asn Gin Arg Leu Phe Asn lie Ala Val Ser Arg Val Gin
5 10 15
CAT CTC CAC CTA TTG GCT CAG AAA ATG TTC AAT GAC TTT GAC GGT ACC 96 His Leu His Leu Leu Ala Gin L s Met Phe Asn Asp Phe Asp Gly Thr
20 25 30
CTG TTG CCT GAT GAA CGC AGA CAG CTG AAC AAG ATA TTC CTG CTG GAC 144 Leu Leu Pro Asp G 1 u Arg Arg Gin Leu Asn Ly s lie Phe Leu Leu Asp
35 40 45
Figure imgf000070_0001
配列番号： 26
配列の長さ ： 429
E列の型： 核酸
鎖の数： 二本鎖
ト ポ ロ ジ ー ： 直鎖状
BB列の種類： 他の核酸 配列表 6.7 , 8.9か ら形成される D N A断片を配列表
24の D N A断片中に組み込んだ も の
配列の特徴
特徵を表す記号： CDS
存在位置： 1..429
特徴を決定 した方法： E
特徴を表す記号： peptide
存在位置： 1..143
特徴を決定 した方法： E
配列
ATG ATA GAA AAC CAA CGG CTC TTC AAC ATC GCG GTC AGT CGG GTG CAA 48 Met lie Glu Asn Gin Arg Leu Phe Asn lie Ala Val Ser Arg Val Gin
5 10 15
CAT CTC CAC CTA TTG GCT CAG AAA ATG TTC AAT GAC TTT GAC GGT ACC 96 His Leu His Leu Leu Ala Gin Ly s Met Phe Asn Asp Phe Asp G ly Thr
20 25 30
CTG TTG CCT GAT GAA CGC AGA CAG CTG AAC AAG ATA TTC CTG CTG GAC 144 Leu Leu Pro Asp Glu Arg Arg Gin Leu Asn Ly s lie Phe Leu Leu Asp
35 40 45 OH S8I 081 sqd n I g s q sx' siq siq s "q n { g us v s ί q jas 2 J v 2iv v USV 6Z^ 3丄丄 WO- OVV VVV VVV VVV VVV WO OVV VVV 03V V03 00V 090 丄 VV
S2I 021 SIT nil ass ajy SAT iqi sxq aiy uto "TO 3JV asV SA1 S Jil 8U 00V 00V OV VVV OOV OVV VDV OVO WO OV OV 3V0 VV 00V VVV V1V
Oil SOI ΟΟΐ
"10 3s v uto n 10 V 9l Ϊ3Η 811 ^10 us usy 3iy 八 ΙΘ^
888 OVO OVO VVO VVO VOO 3丄丄 VVO 3丄 V O丄 V OVO OVV 003 OVV VOV 3丄 i) 3JLV
S6 06 58
nsi -I9S us v "S 811 aII ne im uig JSS o JJ ι^χ nio d_t丄 n t o 22Z V丄 3 OOV 3VV 33丄 31V 31V 010 OOV 0V3 30V 130 OVI 0V9 001 33丄 VVO
08 5L Oi S9 s\ i neq Si sild J9S s ΐ 1 s τ H na naq s^q naq 八 JQS si u \ o 0 Z 丄丄 V 013 100 3丄丄 i3丄 丄 IV OVO 010 310 OVV ί)丄 3 01D 丄 丄 i)V OVV OVO
09 2S OS
•lUI nig S I R s q dsy 八 oi j jas ΙΕΛ 9 ί I dsy ias usy S Q em
13V 0V9 OVO OVV OVO ：)丄 i) VOO 30V 310 31V 031 OVO 丄 3丄 3丄 3丄 1
9.£00/l6df/JDd °L SOIfl/16 OA\ 配列番号： 27
配列の長さ ： 516
配列の型： 核酸
鎖の数： ニ本鎮
ト ポ π ジ ー ： 直鎖状
配列の種類： 他の核酸 配列表 10. 11, 12, 13, U.15. 16, 17か ら形成される D N
A断片を配列表 O D N A断片中に組み込んだもの 配列の特徵
特徴を表す記号： CDS
存在位置： 1.. 516
特徴を決定 した方法： E
特徴を表す記号： peptide
存在位置： 1..172
特徴を決定 した方法： E
配列
ATG ATA GAA AAC CAA CGG CTC TTC AAC ATC GCG GTC AGT CGG GTG CAA 48 Met lie Glu Asn Gin Ar g Leu Phe Asn l ie Ala Val Ser Arg Val Gin
5 10 15
CAT CTC CAC CTA TTG GCT CAG AAA ATG TTC AAT GAC TTT GAC GGT ACC 96 His Leu His Leu Leu Ala Gin Ly s Met Phe Asn Asp Phe Asp G ly Thr
20 25 30
CTG TTG CCT GAT GAA CGC AGA CAG CTG AAC AAG ATA TTC CTG CTG GAC 144 Leu Leu Pro Asp Glu Arg Arg G 1 n Leu Asn Ly s l ie Phe Leu Leu Asp
35 40 45 / 9 εοοιβΛε .¾SO
Figure imgf000074_0001
iVV v。v vvv V
Oil S9T
sqd nio aiv aiV s q a jy si I uio dsv s^qIS 3丄丄 OOV OOV VVV VOV 丄丄 V 0V3 1V1 V30 3V0 3VV
09ΐ 99ΐ 09Ϊ Sf l
Figure imgf000075_0001
OOV VOO 3V3 000 OVV DOi 3VV VVV V丄 V VOV 300 3丄 3 V9V V03 OVV VVVZ.e00/l6df/JOd ZL S l 配列番号： 28
配列の長さ ： 537
配列の型： 核酸
鎖の数： 二本鎖
ト ポ ロ ジ ー ： 直鎮状
配列の種類： 他の核酸 配列表 6 , 7 , 8 , 9か ら形成される D N A断片 （ タ ン デ ム） を配列表 24の D N A断片中に組み込んだもの
配列の特徵
特徴を表す記号： CDS
存在位置： 1..537
特徵を決定 した方法： E
特徴を表す記号： peptide
存在位置： 1..179
特徴を決定 した方法： E
配列
ATG ATA GAA AAC CAA CGG CTC TTC AAC ATC GCG GTC AGT CGG GTG CAA 48 Met lie Gl u Asn Gin Arg Leu Phe Asn l ie Ala Val Ser Arg Val Gin
5 10 15
CAT CTC CAC CTA TTG GCT CAG AAA ATG TTC AAT GAC TTT GAC GGT ACC 96 His Leu His Leu Leu A 1 a Gin L s Met Phe Asn Asp Phe Asp G 1 Thr
20 25 30
CTG TTG CCT GAT GAA CGC AGA CAG CTG AAC AAG ATA TTC CTG CTG GAC 144 Leu Leu Pro Asp G 1 u Arg Arg Gin Leu Asn Lys lie Phe L eu Leu Asp
35 40 45 OH S8T OST a J a ild n 19 s^q sx sx s^i n 10 us s 3JV "V 2 ay us v
IVi OO 3丄丄 VVO OVV VVV VVV VV VVV VVD OVV VVV ΟΟΫ VOO OOV 000 IVV
92ΐ ΟΖΐ SU
jqi ass 21V SXT im SAT say uio uio JIJI ajy asy SAT im s t an m OOV OOV VOV VV OOV OVV vov ovo VVO VOV VOV OVO VVV OOV VVV V1V
ΟΤΐ 90T ΟΟΐ
0 as U19 nio ai nig isw an uio us Mv usy 3i I^A
8SS OVO 3V0 VV3 VVO V90 3丄 1 VV3 D1V 3丄 V OVO OVV 009 OVV VOV 3丄 3 3丄 V
S6 06 S8
nsq JSS usv 3ΐΙ I naq jqi uio JSS OIJ i^i nio di J9S n 10
88Z V丄 3 09V OVV 301 31V OIV 013 03V OVO 30V 133 0V1 OVO 33丄 33丄 VVi)
08 Si OA 39 ai I naq 3i v JOS Q \ s 1 H ns na s naq 八 Jas s q u \ 9 丄丄 V 3丄 3 丄 33 3丄丄 101 丄丄 V 0V3 310 3丄 3 9VV 9丄 3 3丄 3 V3丄 13V OVV 0V0
09 99 03
•iq丄 nig s 1 H sAi dsy IB^ OJJ J3S I ΒΛ S 11 ds v JSS USV SXQ aqj
Z6I 10V 0V3 OVO OVV 3VD 010 VOO OOV 3丄 3 3丄 V 301 OVO 丄 3丄 OVV 丄 3丄 3丄丄 ZL SO /6 OAV卜19卜 εο一
卜
Figure imgf000078_0001
配列番号： 29
配列の長さ ： 40
配列の型： 核酸
鑌の数： 一本鎖
ト ポ ロ ジ ー ： 直鎖状
配列の種類： 他の核酸 合成 D N A
配列の特徴
特徴を表す記号： unsure
存在位置： 1..40
特徴を決定 した方法： E
配列
AATTCCGAGA ACAGGACCAG ATAAAAACCA AGGACAGAAC 40
配列番号： 30
配列の長さ ： 43
配列の型： 核酸
鎖の数： 一本鎮
ト ポ ロ ジー ： 直鎖状
配列の種類： 他の核酸 合成 D N A
配列の特徵
特徴を表す記号： unsure
存在位置： 1.. 43
特徴を決定 した方法： E
配列
CTGTTGTGTT CTGTCCTTGG TTTTTATCTG GTCCTGTTCT CGG 43
配列番号： 31
配列の長さ ： 38
配列の型： 核酸
鎖の数： 一本鎖
ト ポ ロ ジ ー ： 直鎮状
配列の種類： 他の核酸 合成 D N A
配列の特徴
特徴を表す記 ： unsure
存在位置： 1..38
特徴を決定 した方法： E
配列
ACAACAGAGA AAGACGAAAA GAAGTACTAA TCGCAGGC 38
配列番号： 32
配列の長さ： 36
配列の型： 核酸
鎮の数： 一本鎖
ト ポ ロ ジー： 直鎮状
SB列の種類： 他の核酸 合成 D N A
配列の特徴
特徴を表す記号： unsure
存在位置： 1..36
特徵を決定 した方法： E
配列
GCTTCGCCTG CGATTAGTAC TTCTTTTCGT CTTTCT 36
配列番号： 33
配列の長さ ： 30
E列の型： 核酸
鎖の数： 一本鎖
ト ポ ロ ジー： 直鎖状
配列の種類： 他の核酸 合成 D N A 配列の特徴
特徴を表す記号： unsure
存在位置： 1..30
特徵を決定 した方法： E
配列
GAAGCAAAAA CGAAAAAAAG AAAAAAAAGG 30
配列番号： 34
配列の長さ ： 29
配列の型： 核酸
鎖の数： 一本鎮
ト ポ ロ ジ一： 直鎖状
配列の種類： 他の核酸 合成 D N A 配列の特徴
特徴を表す記号： unsure
存在位置： 1..29
特徴を決定 した方法： E
配列
AATTCCTTTT TTTTCTTTTT TTCGTTTTT 29
配列番号： 35
配列の長さ ： 15
配列の型： 核酸
鎖の数： 一本鎖
ト ポ ロ ジ ー ： 直鎖状
配列の種類： 他の核酸 合成 D N A 配列の特徴
特徵を表す ： unsure
存在位置： 1..15
特徴を決定 した方法： E
配列
GAAGCAAAAA CGAAG 15
配列番号： 36
配列の長さ ： 14
配列の型： 核酸
鎖の数： 一本鎖
ト ポ ロ ジー ： 直鎮状
配列の種類： 他の核酸 合成 D N A 配列の特徴
特徴を表す記号： unsure
存在位置： 1..14
特徵を決定 した方法： E
配列
AATTCTTCGT TTTT 14
Ε _列番号： 37
Ε列の長さ ： 112
Κ列の型： 核酸
鎖の数： ニ本鑌
ト ポ ロ ジー： 直鎮状
Ε列の種類： 他の核酸 配列表 29, 30, 31.32, 33.34か ら形成される D N A断片 Ε列の特徵
特徴を表す記号： CDS
存在位置： 1..112
特徴を決定 した方法： E
配列
Figure imgf000087_0001
EcoRl
AGAAGTACTAATCGCAGGCGAAGCAAAAACGAAAAAAAGAAAAAAAAGG
112
EcoRI
配.列番号： 38
配列の長さ ： 97
配列の型： 核酸
鎖の数： 二本鎖
ト ポ ロ ジー ： 直鎮状
配列の種類： 他の核酸 配列表 29 , 30 , 31 , 32 , 35 , 36か ら形成される D N A断片 配列の特徴
特徴を表す記号： CDS
存在位置： 1..97
特徵を決定 した方法： E
配列
Figure imgf000088_0001
EcoRI
AGAAGTACTAATCGCAGGCGAAGCAAAAACGAAG TCTTCATGATTAGCGTCCGCTTCGTTTTTGCTTCTTAA 97
EcoRI
配列番号： 39
配列の長さ ： 429
配列の型： 核酸
鎖の数： ニ本鎮
ト ポ ロ ジー： 直鎖状
配列の種類： 他の核酸 配列表 29, 30.31, 32, 33 , 34か ら形成される D N A断片 を配列表 24の D N A断片中に組み込んだもの
配列の特徵
特徴を表す記号： CDS
存在位置： 1.. 29
特徴を決定 した方法： E
特徴を表す記号： peptide
存在位置： 1..143
特徵を決定 した方法： E
配列
ATG ATA GAA AAC CAA CGG CTC TTC AAC ATC GCG GTC AGT CGG GTG CAA 48 Met 11 e Gl u Asn Gin Arg Leu Phe Asn lie Ala Val Ser Arg Val Gin
5 10 15
CAT CTC CAC CTA TTG GCT CAG AAA ATG TTC AAT GAC TTT GAC GGT ACC 96 His Leu His Leu Leu Ala Gin L s Met Phe Asn Asp Phe Asp Gly Thr
20 25 30
CTG TTG CCT GAT GAA CGC AGA CAG CTG AAC AAG ATA TTC CTG CTG GAC 144 Leu Leu Pro Asp G 1 u Arg Arg Gin Leu Asn Ly s lie Phe Leu Leu Asp
35 40 45 TTC TGT AAC TCT GAC TCC ATC GTG AGC CCA GTC GAC AAG CAC GAG ACT 192 Phe Cys Asn Ser Asp Ser lie Val Ser Pro Val Asp Lys His Glu Thr
50 55 60
CAG AAG AGT TCA GTC CTG AAG CTG CTC CAC ATT TCT TTC CGT CTG ATT 240 Gin L s Ser Ser Val Leu L s Leu Leu His l ie Ser Phe Arg Leu lie
65 70 75 80
GAA TCC TGG GAG TAC CCT AGC CAG ACC CTG ATC ATC TCC AAC AGC CTA 288 Glu Ser Trp Glu Tyr Pro Ser Gin Thr Leu l ie lie Ser Asn Ser Leu
85 90 95
ATG GTC AGA AAC GCC AAC CAG ATC ATG GAA TTC CGA GAA CAG GAC CAG 336 Met Val Arg Asn Ala Asn Gin lie Met Glu Phe Arg Glu Gin ASP Gin
100 105 110
ATA AAA ACC AAG GAC AGA ACA CAA CAG AGA AAG ACG AAA AGA AGT ACT 384 l ie Lys Thr L.vs Asp Arg Thr Gin Gin Arg Lys Thr Lys Arg Ser Thr
115 120 125
AAT CGC AGG CGA AGC AAA AAC GAA AAA AAG AAA AAA AAG GAA TTC 429 Asn Arg Arg Arg Ser Lys Asn Glu Lys Lys Lys Lys Lys Glu Phe
130 135 140 配列番号： 40
配列の長さ ： 414
配列の型： 核酸
鎮の数： 二本鎖
ト ポ ロ ジ一： 直鎮状
配列の種類： 他の核酸 配列表 29.30, 31, 32, 35, 36か ら形成される D N A断片 を配列表 24の D N A断片中に組み込んだ も の
配列の特徴
特徴を表す記号： CDS
存在位置： 1..414
特徴を決定 した方法： E
特徴を表す記号： peptide
存在位置： 1..138
特徴を決定 した方法： E
配列
ATG ATA GAA AAC CAA CGG CTC TTC AAC ATC GCG GTC AGT CGG GTG CAA 48 Met lie Glu Asn Gin Arg Leu Phe Asn lie Ala Val Ser Arg Yal Gin
5 10 15
CAT CTC CAC CTA TTG GCT CAG AAA ATG TTC AAT GAC TTT GAC GGT ACC 96 His Leu His Leu Leu Ala Gin L s Met Phe Asn Asp Phe Asp Gly Thr
20 25 30
CTG TTG CCT GAT GAA CGC AGA CAG CTG AAC AAG ATA TTC CTG CTG GAC 144 Leu Leu Pro Asp Glu Arg Arg G 1 n Leu Asn Lys lie Phe Leu Leu Asp
35 40 45 9δΐ οετ
ailci n i g n \ g us s AI J9s a J V a jy aiy us v Oil VVO VVO 3VV VVV OOV VOO OOV 300 1VV
9Ζΐ OZT SIT im ias aiy sxq iqi sAq aiy uig uio α¾ ajy asy sxq im sx 9\ \ 88 13 13V VOV VVV 90V OVV VOV OVO VVO VOV VOV 3V0 OVV OOV VVV V1V
OTT SOI 001 uiO <Is uig nig v QHd nig ;aj«( 911 u^o usy ei V usv 2i I^A 928 OVO OVO OVO VVO VOO 3丄丄 VVO 31V 31V OVO OVV 009 OVV VOV 010 0丄 V
36 06 S8
nsq J9S us v ユ Θ 11 s \ no jqi uig JQS O JJ nio dJi JSS n i g
89Z V13 39V OVV 331 01V 31V 3丄3 03V OVO 30V 丄 3：) 0V1 OVO 001 001 WD
08 9L 01 99 a ΐ I ns 2 j slid J9S 9 ΐ I s IH naq naq sXq ηοι Ι¾Λ -iss -tss s q u \ g O Z 丄丄 V 3丄3 103 Oil 丄 3丄 丄丄 V 3V0 3丄 3 3丄 3 9VV 010 3丄 9 V01 10V OVV 0V0
09 S9 OS
•nil nto sin s/q dsy I^ OIJ JGS I^A 311 J3S dsy iss usy S Q oqj Z6T 13V OVO OVO 3VV OVO 010 VOO OOV i)丄 3 31V 33丄 3V3 丄3丄 3VV 丄 3丄 丄丄
9.£00/l6df/JDd °― SO^l/16 ΟΛ\ 配列番号： 41
配列の長さ ： 114
配列の型： 核酸
鎖の数： ニ本鑌
ト ポ ロ ジー： 直鎖状
配列の種類： 他の核酸 配列番号 2の D N A塩基 @2列の一部を他の塩基配列
に置換 した も の
配列の特徵
特徴を表す記号： CDS
存在位置： 1..114
特徴を決定 した方法： E
特徴を表す記号： peptide
存在位置： 1..38
特徴を決定 した方法： E 配列
GAA TTC CGA GAA CAG GAC CAG ATA AAA ACC AAG GAC AGA ACA CAA CAG 48
G 1 u Phe Arg Glu Gin Asp Gin lie Lys Thr Lys Asp Arg Thr Gin Gin
5 10 15
AGA AAG ACG AAA AGA AGT ACT AAT CGC AGG CGA AGC AAA AAC GAA AAA 96 Arg L s Thr Lys Arg Ser Thr Asn Ar Arg Arg Ser Lys A sn Glu L s
20 25 30
AAG AAA AAA AAG GAA TTC 114
Lys Lys Lys Lys Glu Phe
35 配列番号： 42
配列の長さ ： 99
配列の型： 核酸
鎖の数： 二本鎖
ト ポ ロ ジー： 直鎖状
配列の種類： 他？）核酸 配列番号 2の D N A塩基配列の一部を他の塩基配列 に置換し且つ一部を欠失させた も の
配列の特徴
特徴を表す記号： CDS
存在位置： 1..99
特徴を決定 した方法： E
特徴を表す記号： peptide
存在位置： 1..33
特徵を決定 した方法： E 配列
GAA TTC CGA GAA CAG GAC CAG ATA AAA ACC AAG GAC AGA ACA CAA CAG 48
Glu Phe Arg Glu Gin Asp Gin lie Lys Thr Lys Asp Arg Thr Gin Gin
5 10 15
AGA AAG ACG AAA AGA AGT ACT AAT CGC AGG CGA AGC AAA AAC GAA GAA 96 Arg Lys Thr Lys Arg Ser Thr Asn Arg Arg Arg Ser L s A sn Glu Glu
20 25 30
TTC 99
Phe

Claims

請 求 の 範 囲
1. C型肝炎関連抗原に由来する抗原ボリペプチ ド （以下 C型肝炎関 連抗原ボリべプチ ドと略記する） の少なく とも 1つと、 該抗原ポリべ プチ ドとは異種のボリべプチド （以下異種ボリべプチ ドと略記する） の少なく とも 1 つとが融合した融合抗原ボリべプチ ド。
2. 異種ポリぺブチ ドがシロザケ成長ホルモンのポリべプチ ドまたは その一部であり、 かつヒ ト血清中の抗体と特異的に反応しないもので ある請求項 1
Figure imgf000095_0001
載の融合抗原ボリぺブチ ド。
3. C型肝炎関連抗原ポリペプチ ドが配列番号 1一 3 , 4 1 および 42 から選ばれる配列を有するポリベプチドである請求項 1記載の融合抗 原ボリぺブチド。
4. C型肝炎関連抗原ボリベプチ ドとシロザケ成長ホルモンのポリぺ プチ ドとがメチォニンを介して結合した形のボリべプチドである請求 項 1記載の融合抗厚ポリぺブチ ド。
5. C型肝炎関連抗原ボリペプチ ドをコー ドする D N Αの少なく とも 1 つと異種ボリペプチ ドをコー ドする D N Aの少なく とも 1 つとが組 み込まれた組換え体ブラスミ ド。
6. 異種ボリぺブチ ドがシロザケ成長ホルモンのボリべプチドまたは その一部であり、 かつヒ ト血清中の抗体と特異的に反応しないもので ある請求項 5記載の組換え体プラスミ ド。
7. C型肝炎関連抗原ポリべプチ ドをコ一ドする D N Aが配列番号 1 一 3 , 4 1 および 4 2から選ばれる配列を有する D N Aである請求項 5記載の組換え体プラスミ ド。
8. C型肝炎関連抗原ポリペプチ ドとシロザケ成長ホルモンのポリべ プチ ドとがメチォニンを介して結合したポリべプチ ドをコー ドする D N Aが組み込まれた組換え体ブラスミ ド。
9. プラスミ ド pSGHEC - 2、 pSGHBC - 1 4、 pSGHBC - 1 8、 pSGHEC - 1 8 S、 pSGHEC - 1 4 1 4、 pSGHEC - 1 4 Aおよび pSGHEC - 1 4 Bか ら選ばれる請求項 5記載の組換え体ブラスミ ド。 .
10. 5 - 9から選ばれる請求項記載の組換え体プラスミ ドを保有する 微生物を培地に培養し、 培養物中に融合抗原ポリベプチドを生成蓄積 させ、 該培養物から融合抗原ポリぺブチドを採取することを特徵とす る融合抗原ポリぺブチ ドの製造法。
11. 微生物がエツシエリ ヒア · コ リに属する請求項 1 0記載の製造法,
12. C型肝炎関連抗原ポリぺブチドとシロザケ成長ホルモンのボリべ プチドとがメチォニンを介して融合した融合抗原ポリべプチドを抗原 物質として用いる免疫学的方法により試料中の抗 C型肝炎ウィルス
( H C V ) 抗体を検出する抗 H C V抗体の検出法。
13. 免疫学的方法が、 ラジオ · ィムノアツセィ， ェンザィム · ィムノ アツセィ， フルォレツセンス · ィムノアツセィ， 逆受身凝集反応， フ ィ トへマ トァグリチネージョ ン， パーティ クルァグリチネージョ ン， レーザーネフロメ ト リー， ウェス夕ン · プロッティ ングおよび免疫溶 血反応 （赤血球またはリボソームを用いる方法） から選ばれる請求項 1 2記載の検出法。
14. 固相にコーティ ングされた抗原物質を用いる請求項 1 3記載の検
15. 固相が、 合成樹脂、 ガラス製のチューブ、 ガラス製のビーズまた はガラス製のマイクロ夕イタ一プレイ トである請求項 1 4記載の検出
¾ ο
PCT/JP1991/000376 1990-03-28 1991-03-22 Fused antigen polypeptide WO1991014705A1 (en)

Applications Claiming Priority (2)

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