JPH051099A

JPH051099A - 融合抗原ポリペプチド

Info

Publication number: JPH051099A
Application number: JP15303191A
Authority: JP
Inventors: Kazuki Morita; 和樹守田; Mamoru Hasegawa; 護長谷川; Yoshiharu Yokoo; 義春横尾; Moriyuki Sato; 盛幸佐藤; Susumu Sekine; 進関根; Seiji Sugimoto; 整治杉本; Hajime Koda; 肇好田; Hideji Mori; 秀治森; Terumasa Arima; 暉勝有馬
Original assignee: Kyowa Hakko Kogyo Co Ltd
Current assignee: KH Neochem Co Ltd
Priority date: 1991-06-25
Filing date: 1991-06-25
Publication date: 1993-01-08

Abstract

(57)【要約】【目的】Ｃ型肝炎の検出のために有用な抗原ポリペプ
チドを提供する。【構成】１種以上のＣ型肝炎関連抗原ポリペプチドと
シロザケ成長ホルモンとがメチオニンを介して融合した
形の融合抗原ポリペプチドがＣ型肝炎の検出のために有
用な抗原ポリペプチドとして用いることができる。

Description

【発明の詳細な説明】

【０００１】

【産業上の利用分野】本発明は、非Ａ非Ｂ型肝炎（Ｃ型
肝炎）関連抗原に由来する抗原ポリペプチドと該抗原ポ
リペプチドとは異種のポリペプチド（異種ポリペプチ
ド）とが融合した融合抗原ポリペプチド、該融合抗原ポ
リペプチドをコードするＤＮＡを組み込んだ組換え体プ
ラスミド、該組換え体プラスミドを含む微生物を用いる
融合抗原ポリペプチドの製造法および該融合抗原ポリペ
プチドを用いた抗Ｃ型肝炎ウイルス抗体検出法に関す
る。抗原抗体反応は、医療および学術分野の種々の領域
において応用されており、本発明の融合抗原ポリペプチ
ドは幅広い分野において用途が期待される。

【０００２】

【従来の技術】Ｃ型肝炎は非Ａ非Ｂ型肝炎ウイルス〔He
patitis Ｃ Virus(HCV) または nonＡ， nonＢ Hepatit
is Virus(NANBV) とも言うが、ここではＨＣＶを用い
る。〕が原因ウイルスと考えられており、HCV 感染の血
清診断は、Ｃ型肝炎の診断および輸血等によるＨＣＶ感
染の予防のために重要な臨床診断技術である。これは血
清中のＨＣＶ関連抗原に対する抗体の有無を抗原抗体反
応を利用して調べることにより行われている。

【０００３】チョーらは、チンパンジー血清からのＨＣ
Ｖのクローン化に成功し〔チョーら( Choo, Q. -L., et
al)、サイエンス(Science) 244 ，359 −362(1989)
〕、それにより、Ｃ型肝炎診断検査薬が開発された
〔クオら(Kuo, G. et al) 、サイエンス(Science）244
, 362−364(1989) ；EUROPEAN PATENT APPLICATION 03
18216 〕。

【０００４】Ｃ型肝炎患者血清からＨＣＶ関連遺伝子が
クローン化〔有馬ら、実験医学 Vol.7, No. 2, 94 −10
1(1989) ；有馬ら、ガストロエンターロロジアジャポ
ニカ( Gastroenterologia Japonica )24，540-548 (198
9)〕され、Ｃ型肝炎検査に用いられている。上記従来法
では、Ｃ型肝炎関連抗原ポリペプチドと異種蛋白とを融
合させた融合抗原ポリペプチドを微生物で生産させて使
用している。融合させる異種蛋白として、チョーらは、
スーパーオキシドジスムターゼ(Superoxide dismutase,
以下ＳＯＤと略記する）を、有馬らは、β−Ｄ−ガラク
トシダーゼ（β−Ｄ−galactosidase,以下β−gal と略
記する）を用いている。

【０００５】

【発明が解決しようとする課題】個人によっては、血清
中には、これら異種蛋白に対する自然抗体が存在してお
り、この抗体が異種蛋白と反応してしまう可能性があ
る。そのため診断検査薬のカットオフ値が高値になるば
かりではなく、検査に先立ってその異種蛋白を血清に加
えることにより、抗体に吸収をかける必要が生じ、操作
が非常に煩雑になり、診断の正確性の著しい低下をまね
く場合がある。

【０００６】このような場合、ウシ血清アルブミン( Bo
vine serum albumin )などの担体に抗原ポリペプチドを
化学的に結合させた融合抗原ポリペプチド、数種の抗原
分子の混合物あるいは、病原体の粗抽出液が用いられて
いるが、融合抗原ポリペプチドの安定供給、安全性の面
で問題がある。また抗原ポリペプチドを微生物で直接発
現させる方法がとられているが、抗原ポリペプチドの分
子量、安定性、毒性の面から、発現が困難な場合が多
く、抗原ポリペプチドを安定かつ安価に供給することは
できない。

【０００７】本発明者らは、Ｃ型肝炎の検出のために有
用な抗原ポリペプチドの製造法について研究をした結
果、１種以上のＣ型肝炎関連抗原ポリペプチドとシロザ
ケ成長ホルモン( chum salmon growth hormone以下ｓＧ
Ｈと略記する）とがメチオニンを介して融合した形の融
合抗原ポリペプチドの製造法を確立した。

【０００８】本発明者らは、またこの融合抗原ポリペプ
チドを用いた抗Ｃ型肝炎抗体検出法は、従来報告されて
いる検出法では検出できない検体についても検出できる
ことを確認し、従来法より優れていることを見い出し本
発明を完成するに至った。

【０００９】

【発明の構成】本発明は、Ｃ型肝炎関連抗原に由来する
抗原ポリペプチド（以下Ｃ型肝炎関連抗原ポリペプチド
と略記する）の少なくとも１つと、該抗原ポリペプチド
とは異種のポリペプチド（以下異種ポリペプチドと略記
する）の少なくとも１つとが融合した融合抗原ポリペプ
チド、該融合抗原ポリペプチドをコードするＤＮＡを組
み込んだ組換え体プラスミド、該組換え体プラスミドを
含む微生物を用いる融合抗原ポリペプチドの製造法およ
び該融合抗原ポリペプチドを用いた抗Ｃ型肝炎ウイルス
抗体（抗ＨＣＶ抗体）の検出法を提供する。

【００１０】本発明に用いるＣ型肝炎関連抗原ポリペプ
チドとしてはＨＣＶ関連抗原であればいかなるものも用
いることができる。具体的にはＨＣＶ関連抗原として有
馬らがクローン化した、クローンNo. ２、クローンNo.
18〔有馬ら、ガストロエンターロロジア・ジャポニカ(G
astroenterologia Japonica)２４，５４０−５４８(198
9 ) 〕およびクローンNo. １４を用いることができる。

【００１１】これらクローンNo. で示される抗原を以下
Ｃ−２，Ｃ−１４およびＣ−１８と略記する。これら抗
原のアミノ酸配列およびそれをコードするＤＮＡのヌク
レオチド配列を配列番号１−３に示す。これら３種のク
ローンの取得方法は、以下の通りである。まず材料とし
てＣ型肝炎患者の血漿を用いる。この血漿よりＲＮＡを
抽出し、ランダムプライマー法によりｃＤＮＡを調製す
る。このｃＤＮＡをｃＤＮＡ cloning system λgt１１
キット（アマーシャム社）を用いてcDNAライブラリィー
を作製する。このライブラリィーをニトロセルロース膜
へ転写し、急性肝炎回復期血清と慢性肝炎患者からの血
清を大腸菌菌体成分で吸収操作したものでイムノスクリ
ーニングを行う。

【００１２】これら３種のクローンの患者血清との反応
性は、日本臨床４８，２７−３２(1990 )に記載の方法
で検出する。

【００１３】またＣ−１４のアミノ酸配列を変えずにＤ
ＮＡ塩基配列を一部変換した配列を配列番号４１に、配
列番号４１のＤＮＡ塩基配列を一部欠失させたものを配
列番号４２に示す。すなわち配列番号４１は、Ｃ−１４
のＤＮＡ塩基配列のうち１５番目のＡをＧに、３３番目
のＡをＧに、６６番目のＣをＴに、６９番目のＣをＴ
に、９９番目のＡをＧに変換したものである。配列番号
４２は、配列番号４１のＤＮＡ塩基配列の９４番目から
１０８番目を欠失したものである。

【００１４】ＨＣＶ関連抗原としては、サイエンス(Sci
ence) ２４４，３５９−３６２(1989 ) 、サイエンス(S
cience) ２４４，３６２−３６４( 1989 )、および EUR
OPIAN PATENT APPLICATION 0318216に記載の抗原を用い
ることもできる。

【００１５】本発明に用いる異種ポリペプチドはヒト血
清中の抗体と特異的に反応せず、Ｃ型肝炎関連抗原ポリ
ペプチドと融合した形で微生物により発現されるものな
らいかなるものも用いることができる。具体的には、シ
ロザケ成長ホルモン( sGH )のポリペプチドが好適に用
いられる。シロザケ成長ホルモンの配列、遺伝的情報、
製造法などについては、プロシィーディング・オブ・ザ
・ナショナル・アカデミィ・オブ・サイエンス(Proc. N
atl. Acad. Sci.) USA, 82，4306−4310(1985)、特開昭
61−15699 、同61−93196 、同61−93197 および同61−
210100に記載されている。

【００１６】融合抗原ポリペプチドは、ＨＣＶ関連抗原
が好ましくはメチオニンを介して、分子量2000以上の異
種ポリペプチドに結合した融合抗原ポリペプチドをコー
ドするＤＮＡを組換えＤＮＡ技術により遺伝子の読みと
りフレームを合わせてベクターＤＮＡに組み込むことに
より組換え体プラスミドを造成し、これを用いて微生物
を形質転換させ、この形質転換微生物を培養し、培養物
中に該融合抗原ポリペプチドを生成蓄積させ、該培養物
から該融合抗原ポリペプチドを採取することにより得ら
れる。

【００１７】ベクターＤＮＡとしては挿入したＤＮＡが
微生物中で発現できるものならいずれでも用いることが
できる。好ましくは、適当なプロモーター、例えばトリ
プトファン(trp系) 、ラクトース(lac系)のプロモータ
ーを持ち、その下流に目的ＤＮＡを挿入でき、しかもシ
ャインダルガーノ配列と翻訳開始コドンとの間を適当な
距離、例えば６〜１８塩基数に調節したプラスミドを用
いることができる。

【００１８】具体的に好適なベクターＤＮＡとしては、
pGEL１(FERM BP-629、特開昭61−93197)、ｐＫＹＰ10
（特開昭58−110600) 、ｐＧＨＡ２(FERM BP−400 、特
開昭60−221091) などが挙げられる。

【００１９】微生物としては、本発明の融合抗原ポリペ
プチドをコードするＤＮＡが発現して、培養物中に該ポ
リペプチドを生成蓄積できるものならいかなるものも用
いることができる。好適にはエッシェリヒア・コリ( Es
cherichia coli )に属する微生物が用いられる。

【００２０】

【作用】以下、シロザケ成長ホルモンとＨＣＶ関連抗原
とを結合させた融合抗原ポリペプチドの製造法について
具体的に説明する。シロザケ成長ホルモンとＨＣＶ関連
抗原とをメチオニンを介して結合させた融合抗原ポリペ
プチドは以下の工程に従って製造される。

【００２１】工程１−６は融合抗原ポリペプチドsGHE1,
sGHEC−2, sGHEC−14, sGHEC −18S およびsGHEC −14
14の製造に関し、工程７〜９は融合抗原ポリペプチドsG
HEC−14A および sGHEC−14B の製造に関する。

【００２２】〔工程１〕ＨＣＶ関連抗原およびリンカー
遺伝子の合成まず、配列番号４，５，６，７，８，９，１０，１１，
１２，１３, １４，１５，１６，１７，１８，および１
９で示されるＤＮＡを化学合成する。これらのＤＮＡの
合成はリン酸アミダイト法による固相合成法を用いて、
ＤＮＡ自動合成機により行う。

【００２３】配列番号４で表されるＤＮＡ（以下ＤＮＡ
４という）と配列番号５で表されるＤＮＡ（以下ＤＮＡ
５という）とから形成される二重鎖ＤＮＡを用いて、配
列番号２０で表される二重鎖ＤＮＡ断片（以下遺伝子２
０という）を持ったプラスミドを造成する。（配列番号
２０中、EcoRI に向かう引出し線は、これらの制限酵素
による切断部位を示す。以下同じ）

【００２４】同様にして、配列番号６で表されるＤＮＡ
（以下ＤＮＡ６という）と配列番号７で表されるＤＮＡ
（以下ＤＮＡ７という）とから形成される二重鎖ＤＮＡ
および配列番号８で表されるＤＮＡ（以下ＤＮＡ８とい
う）と配列番号９で表されるＤＮＡ（以下ＤＮＡ９とい
う）とから形成される二重鎖ＤＮＡをリガーゼで結合し
て、配列番号２１で表される二重鎖ＤＮＡ断片（以下遺
伝子２１という）を持ったプラスミドを造成する。

【００２５】同様に配列番号１０で表されるＤＮＡ（以
下ＤＮＡ10という) と配列番号１１で表されるＤＮＡ
（以下ＤＮＡ１１という）とから形成される二重鎖ＤＮ
Ａ、配列番号１２で表されるＤＮＡ（以下ＤＮＡ１２と
いう）と配列番号１３で表されるＤＮＡ（以下ＤＮＡ１
３という）とから形成される二重鎖ＤＮＡ、配列番号１
４で表されるＤＮＡ（以下ＤＮＡ１４という）と配列番
号１５で表されるＤＮＡ（以下ＤＮＡ１５という）とか
ら形成される二重鎖ＤＮＡおよび配列番号１６で表され
るＤＮＡ（以下ＤＮＡ１６という）と配列番号１７で表
されるＤＮＡ（以下ＤＮＡ１７という）とから形成され
る二重鎖ＤＮＡをリガーゼで結合して、配列番号２２で
表される二重鎖ＤＮＡ断片（以下遺伝子２２という）を
持ったプラスミドを造成する。

【００２６】同様に配列番号１８で表されるＤＮＡ（以
下ＤＮＡ１８という)と配列番号１９で表されるＤＮＡ
（以下ＤＮＡ１９という）とから形成される二重鎖ＤＮ
Ａを用いて、配列番号２３で表される二重鎖ＤＮＡ断片
（以下遺伝子２３という）を持ったプラスミドを造成す
る。

【００２７】これら合成したＤＮＡにより調製された二
重鎖ＤＮＡ断片は、各々、遺伝子２０はＣ−２からなる
ペプチドを、遺伝子２１はＣ−１４からなるペプチド
を、遺伝子２２はＣ−１８からなるペプチドをコードし
ている塩基配列を有している。遺伝子２３は、シロザケ
成長ホルモンと各クローンを連結するためのリンカー
で、メチオニン、グルタミン酸、フェニルアラニン、そ
のすぐ後に終止コドンをコードしている塩基配列を有し
グルタミン酸、フェニルアラニンをコードしている塩基
配列は、EcoRI 認識サイトとなる。

【００２８】〔工程２〕リンカーン遺伝子のｓＧＨ発現
プラスミドへの組込み：特開昭61−93197 に記載された
方法に従って製造したｓＧＨ遺伝子の発現に用いるプラ
スミドpSGH1B2 を用いる。pSGH1B2 の BglII−PvuI消化
断片（約1.１７kb）とpSGH1B2 の NsiI − PvuＩ消化断
片（約1.８０kb）と、ＤＮＡ１８、ＤＮＡ１９、とを混
合しＤＮＡリガーゼで二重鎖ＤＮＡ間を結合し、アミノ
末端のメチオニンとｓＧＨの１番目から１０３番目のア
ミノ酸からなるポリペプチドにメチオニンを介してグル
タミン酸、フェニルアラニンが結合したポリペプチドを
コードする遺伝子を有するプラスミド pSGHE1 を造成す
る（図１参照）。

【００２９】配列番号２４に pSGHE1 が発現する融合ポ
リペプチドのアミノ酸配列とそれをコードするＤＮＡ配
列および EcoRI認識サイトを示す。配列番号２４中下線
はリンカー領域を示す。

【００３０】〔工程３〕ＨＣＶ関連抗原遺伝子のｓＧ
Ｈ発現プラスミドへの組み込み。工程２で造成した pSGHE1 を EcoRIで切断後、Bacteria
l Alkaline Phosphatase (BAP)で処理する。ついでHind
III, PvuＩで切断し、約３２０bpの EcoRI−HindIII 断
片と、約1.８kbの EcoRI− PvuＩ断片を単離する。 pSG
HE１をHindIII,PvuＩで切断後、約８５０bpのHindIII
− PvuＩ消化断片を単離する。上記ＤＮＡ断片とＤＮＡ
４〜ＤＮＡ５から形成される二重鎖ＤＮＡ断片をＤＮＡ
リガーゼで結合すると、プラスミドpSGHEC−２が得られ
る（図２参照）。pSGHEC−２は、pSGHE1がコードするｓ
ＧＨ遺伝子と、Ｃ−２がコードしている遺伝子をメチオ
ニンをコードする遺伝子を介して保持する。配列番号２
５にpSGHEC−２が発現する融合抗原ポリペプチドのアミ
ノ酸配列とそれをコードするＤＮＡ配列を示す。配列番
号２５中下線はＣ−２領域を示す。

【００３１】工程２で造成した pSGHE１をEcoRＩで切断
後、Bacterial Alkaline Phosphatase (BAP)で処理す
る。ついでHindIII, PvuI で切断し、約３２０bpの Eco
RI−HindIII 断片と、約1.８kbの EcoRI−PvuI断片を単
離する。 pSGHE１をHindIII, PvuＩで切断後、約８５０
bpの HindIII− PvuＩ消化断片を単離する。上記ＤＮＡ
断片とＤＮＡ６〜ＤＮＡ９から形成される二重鎖ＤＮＡ
断片をＤＮＡリガーゼで結合すると、プラスミドpSGHEC
−１４が得られる（図３参照）。pSGHEC−１４は、 pSG
HE１がコードするｓＧＨ遺伝子と、Ｃ−１４がコードし
ている遺伝子をメチオニンをコードする遺伝子を介して
保持する。配列番号26に pSGHEC −１４が発現する融合
抗原ポリペプチドのアミノ酸配列とそれをコードするＤ
ＮＡ配列を示す。配列番号２６中下線はＣ−１４領域を
示す。

【００３２】工程２で造成した pSGHE１をEcoRＩで切断
後、Bacterial Alkaline Phosphatase (BAP)で処理す
る。ついでHindIII, PvuI で切断し、約３２０bpの Eco
RI−HindIII 断片と、約1.８kbの EcoRI−PvuI断片を単
離する。 pSGHE１をHindIII, PvuＩで切断後、約８５０
bpの HindIII− PvuＩ消化断片を単離する。上記ＤＮＡ
断片とＤＮＡ１０〜ＤＮＡ17から形成される二重鎖ＤＮ
Ａ断片をＤＮＡリガーゼで結合すると、プラスミドpSGH
EC−１８が得られる（図４参照）。pSGHEC−１８は、 p
SGHE１がコードするｓＧＨ遺伝子と、Ｃ−１８がコード
している遺伝子をメチオニンをコードする遺伝子を介し
て保持する。配列番号２７にpSGHEC−１８が発現する融
合抗原ポリペプチドのアミノ酸配列とそれをコードする
ＤＮＡ配列を示す。配列番号２７中下線はＣ−１８領域
を示す。

【００３３】〔工程４〕 pSGHEC−１８のプロモーター
置換 pSGHEC−１８をHindIII , PvuIで切断後、約2.36kbのＤ
ＮＡ断片を単離する。pKYP１０をHindIII , PvuIで切断
後、約1.０kbのＤＮＡ断片を単離する。上記ＤＮＡをＤ
ＮＡリガーゼで結合すると、pSGHEC−１８Ｓが得られる
（図５参照）。pSGHEC−１８Ｓは、pSGHEC−１８のプロ
モーターを置換したもので、ｓＧＨをコードする遺伝子
と、Ｃ−１８がコードしている遺伝子をメチオニンをコ
ードする遺伝子を介して保持する。pSGHEC−１８Ｓが発
現する融合抗原ポリペプチドのアミノ酸配列とそれをコ
ードするＤＮＡ配列は配列番号２７に示される。配列番
号２７中下線は、Ｃ−１８領域を示す。

【００３４】〔工程５〕ＨＣＶ関連抗原遺伝子を２個
以上もしくは２種以上保持する発現ベクターの構築工程３で造成したpSGHEC−１４を使用した代表例を示
す。pSGHEC−１４を PstI で切断する。ついで制限酵素
EcoRIで部分分解し、約1.４０kbの EcoRI−PstI断片と
約1.８５kbの EcoRI−PstI断片を単離する。上記ＤＮＡ
断片をＤＮＡリガーゼで結合するとプラスミドpSGHEC−
1414が得られる（図６参照）。pSGHEC−1414は、 pSGHE
１のｓＧＨをコードする遺伝子と、Ｃ−１４を２個コー
ドしている遺伝子をメチオニンをコードする遺伝子を介
して保持する。配列番号２８にpSGHEC−1414が発現する
融合抗原ポリペプチドのアミノ酸配列とそれをコードす
るＤＮＡ配列を示す。配列番号２８中下線は、Ｃ−１４
が２連結した領域を示す。なおこの工程５により、種類
の違う抗原遺伝子の連結が可能となり、キメラ抗原作製
に利用できる。

【００３５】〔工程６〕シロザケ成長ホルモンとＨＣ
Ｖ関連抗原が結合した融合抗原ポリペプチドの生産と単
離・精製工程２、工程３、工程４、工程５で製造したプラスミド
pSGHE１、pSGHEC−２、pSGHEC−１４、pSGHEC−１８
Ｓ、またはpSGHEC−1414を大腸菌に導入し、得られた形
質転換大腸菌を培地に培養して該培養物よりシロザケ成
長ホルモンとＨＣＶ関連抗原とが結合した融合抗原ポリ
ペプチドを採取する。大腸菌菌体内に生産された目的の
融合抗原ポリペプチドは非水溶性の顆粒として存在す
る。培養終了後、菌体を集め、これを破砕し、破砕液を
遠心分離し、シロザケ成長ホルモンとＨＣＶ関連抗原と
が結合した融合抗原ポリペプチドを含有する顆粒を分離
する。

【００３６】以下、融合抗原ポリペプチドの精製法につ
いて説明する。プラスミドpSGHE １、pSGHEC−２、pSGH
EC−１４、pSGHEC−１８Ｓ、pSGHEC−1414を保持する大
腸菌が生産する融合抗原ポリペプチドは、それぞれsGHE
１、 sGHEC−２、 sGHEC−14、sGHEC −１８Ｓ、sGHEC
−1414と記す。

【００３７】〔工程７〕ＨＣＶ関連抗原遺伝子の合成まず、配列表２９、３０、３１、３２、３３、３４、３
５および３６で示されるＤＮＡを化学合成する。これら
のＤＮＡの合成はリン酸アミダイト法による固相合成法
を用いて、ＤＮＡ自動合成機により行う。

【００３８】配列番号２９で表されるＤＮＡ（以下ＤＮ
Ａ２９という）と配列番号３０で表されるＤＮＡ（以下
ＤＮＡ３０という）とから形成される二重鎖ＤＮＡ、配
列番号３１で表されるＤＮＡ（以下ＤＮＡ３１という）
と配列番号３２で表されるＤＮＡ（以下ＤＮＡ３２とい
う）とから形成される二重鎖ＤＮＡおよび配列番号３３
で表されるＤＮＡ（以下ＤＮＡ３３という）と配列番号
３４で表されるＤＮＡ（以下ＤＮＡ３４という）とから
形成される二重鎖ＤＮＡをリガーゼで結合して、配列番
号３７で表される二重鎖ＤＮＡ断片（以下遺伝子３７と
いう）を持ったプラスミドを造成する。

【００３９】同様にＤＮＡ２９とＤＮＡ３０から形成さ
れる二重鎖ＤＮＡ、ＤＮＡ３１、ＤＮＡ３２とから形成
される二重鎖ＤＮＡおよび配列番号35で表されるＤＮＡ
（以下ＤＮＡ３５という）と配列番号３６で表されるＤ
ＮＡ（以下ＤＮＡ３６という）とから形成される二重鎖
ＤＮＡをリガーゼで結合して配列番号３８で表される二
重鎖ＤＮＡ断片（以下遺伝子３８という）を持ったプラ
スミドを造成する。

【００４０】これら合成したＤＮＡにより調製された二
重鎖ＤＮＡ断片は、各々、遺伝子３７はＣ−１４からな
るペプチドを、遺伝子３８は、Ｃ−１４からなるペプチ
ドの３２番目から３６番目のアミノ酸を除去したペプチ
ドをコードしている塩基配列を有している。なお遺伝子
３７は、Ｃ−１４のアミノ酸配列を変えずに塩基配列を
一部変更したもので、Ｃ−１４の塩基配列のうち１５番
目の塩基ＡをＧに、３３番目のＡをＧに、６６番目のＣ
をＴに、６９番目のＣをＴに、９９番目のＡをＧに変換
したものである。遺伝子３８は、遺伝子３７の塩基配列
の９３番目から１０７番目を欠失した合成ＤＮＡであ
る。

【００４１】以下、遺伝子３７から成るペプチドもしく
は、それをコードしているＤＮＡをＣ−１４Ａ、遺伝子
３８から成るペプチドもしくはそれをコードしているＤ
ＮＡをＣ−１４Ｂと記す。

【００４２】〔工程８〕ＨＣＶ関連抗原遺伝子のｓＧ
Ｈ発現プラスミドへの組み込み。工程２で造成したpSGHE1をEcoRI で切断後、Bacterial
Alkaline Phosphatase(BAP) で処理する。ついでHindII
I, PvuI で切断し、約３２０bpの EcoRI−HindIII 断片
と、約1.8kb のEcoRI −PvuI断片を単離する。pSGHE 1
をHindIII 、PvuIで切断後、約850bp のHindIII −PvuI
消化断片を単離する。上記ＤＮＡ断片とＤＮＡ２９〜Ｄ
ＮＡ３４から形成させる二重鎖ＤＮＡ断片をＤＮＡリガ
ーゼで結合すると、プラスミドpSGHEC−１４Ａが得られ
る（図８参照）。pSGHEC−１４Ａは、pSGHE1がコードす
るsGH 遺伝子と、Ｃ−１４Ａがコードしている遺伝子を
メチオニンをコードする遺伝子を介して保持する。配列
番号３９にpSGHEC−１４Ａが発現する融合抗原ポリペプ
チドのアミノ酸配列とそれをコードするＤＮＡ配列を示
す。配列番号３９中下線はＣ−１４Ａ領域を示す。

【００４３】工程２で造成したpSGHE1をEcoRI で切断
後、Bacterial Alkaline Phosphatase(BAP) で処理す
る。ついでHindIII 、PvuIで切断し、約３２０bpのEcoR
I −HindIII 断片と、約1.8kb の EcoRI−PvuI断片を単
離する。 pSGHE１を HindIII、PvuIで切断後、約８５０
bpの HindIII−PvuI消化断片を単離する。上記ＤＮＡ断
片とＤＮＡ２９〜ＤＮＡ３２とＤＮＡ３５〜ＤＮＡ３６
とから形成される二重鎖ＤＮＡ断片をＤＮＡリガーゼで
結合すると、プラスミドpSGHEC−１４Ｂが得られる（図
９参照）。pSGHEC−１４Ｂは、pSGHE1がコードするsGH
遺伝子と、Ｃ−１４Ｂがコードしている遺伝子をメチオ
ニンをコードする遺伝子を介して保持する。配列番号４
０にpSGHEC−１４Ｂが発現する融合抗原ポリペプチドの
アミノ酸配列とそれをコードするＤＮＡ配列を示す。配
列番号４０中下線はＣ−１４Ｂ領域を示す。

【００４４】〔工程９〕シロザケ成長ホルモンとＨＣ
Ｖ関連抗原（Ｃ−１４Ａ、Ｃ−１４Ｂ）が結合した融合
抗原ポリペプチドの生産と単離・精製工程（８）で製造したプラスミドpSGHEC−１４Ａ、pSGH
EC−１４Ｂを用いて、工程６に記載された方法で、融合
抗原ポリペプチドの生産と単離・精製を行った。なお、
プラスミドpSGHEC−１４Ａ、pSGHEC−１４Ｂを保持する
融合抗原ポリペプチドは、それぞれsGHEC −１４Ａ、sG
HEC −１４Ｂと記す。

【００４５】融合抗原ポリペプチドの精製 (1) 融合抗原ポリペプチドの粗精製画分の調製粗精製画分の調製は既知の方法を組合せることにより可
能であるが、好ましくは下記の通りである。融合抗原ポ
リペプチドが顆粒として生産された場合は、特開昭60−
244259に示された方法にしたがって顆粒を取得し、変性
剤（好ましくは４Ｍ以上の尿素、または３Ｍ以上のグア
ニジン塩酸）を含む緩衝液（pH５〜１２）または可溶化
剤溶液（好ましくは５０％以上のギ酸）に溶解する。そ
の上清を必要に応じて変性剤または可溶化剤存在下で精
製後、変性剤又は可溶化剤を除去し、粗精製画分とす
る。変性剤または可溶化剤存在下での精製および、変性
剤または可溶化剤の除去は既知の方法〔特開平１−1311
95、日本生化学会編、生化学実験講座１, タンパク質の
化学II, 東京化学同人、P.11〜P.３５４(1976)、日本生
化学会編、続生化学実験講座２．タンパク質の化学上、
東京化学同人、P.３〜１２、P.８〜１８６(1987)〕を組
み合わせることによってできる。

【００４６】融合抗原ポリペプチドが菌体内可溶性画分
に生産された場合は、特開昭63−17898 に示された方法
にしたがって菌体破砕後、その上清を粗精製画分とし、
融合蛋白質が培養上清に生産された場合は、遠心分離に
より培養上清を調製し、粗精製画分とする。

【００４７】(2) 融合抗原ポリペプチドの精製方法粗精製画分からの融合抗原ポリペプチドの精製は既知の
方法〔日本生化学会編、生化学実験講座１．タンパク質
の化学II、東京化学同人、P.11〜354 、P.８１〜１８６
(1987)〕を組み合わせることによって可能である。

【００４８】本発明は、また上記融合抗原ポリペプチド
を用いる抗ＨＣＶ抗体検出法を提供する。以下、融合抗
原ポリペプチドを用いた抗ＨＣＶ抗体検出方法について
説明する。本発明で用いる免疫学的方法としては、下記
のものがあげられ、各文献記載の方法を用いて実施でき
る。 ○エンザイム・イムノアッセイ（以下ＥＩＡという）酵素免疫測定法、医学書院、石川栄治ら、1978年、 ○ラジオ・イムノアッセイ（以下ＲＩＡという）免疫血
清学、医歯薬出版、稲井真彌ら、1981年 ○フルオレッセンス・イムノアッセイ（以下 FIAとい
う）同上 ○逆受身凝集反応同上 ○フィトヘマトアグリチネーション同上 ○レーザーネフロメトリー同上 ○免疫溶血反応（赤血球またはリポソームを用いる方
法）同上 ○パーティクルアグリチネーション最新検査、医典社、VOL.２ No. ２．151 〜157、198
4、Gann 75、 845 、1984 ○ウエスタン・ブロッティングＲＩＡ，ＥＩＡ，ＦＩＡにおいては、均一系のみなら
ず、サンドイッチ法などの不均一系の分析方法も可能で
ある。

【００４９】具体例としてＥＩＡをサンドイッチ法で行
う例を下記に示す。融合抗原ポリペプチドをマイクロタ
イタープレートのウェルにコーティングし、血清試料を
適当な緩衝液たとえば緩衝液Ａ〔0.１５Ｍ NaCl、0.１
％ゼラチン、１％牛血清アルブミンおよび 0.１％ NaN
₃ を含む１／１５Ｍリン酸ナトリウム緩衝液（pH7.
２）〕で希釈した液をウェルに入れ、４〜３７℃、１時
間〜１週間静置し、適当な緩衝液、たとえば緩衝液Ｂ
〔0.０５％ Tween２０および 0.１５ＭNaClを含む１／
１５Ｍリン酸ナトリウム緩衝液（pH7.２）〕でウェルを
よく洗浄する。

【００５０】ウサギ抗ヒト免疫グロブリン抗体のFab フ
ラグメントとホースラディッシュパーオキシダーゼとを
過沃素酸法により結合させたコンジュゲートを適当な緩
衝液、たとえば緩衝液Ｂで希釈した液をウェルに入れ
る。４〜４５℃で１〜２４時間静置後、同じ緩衝液で洗
浄する。ついで適当な基質溶液たとえばオルソ・フェニ
レンジアミン基質溶液〔0.０２％オルソ・フェニレンジ
アミンおよび３５mM過酸化水素を含む１／１５Ｍリン酸
ナトリウム緩衝液（pH7.２）〕をウェルに入れ、１５〜
３７℃で５〜６０分間静置する。2N H₂SO₄で反応を停止
させ、室温で１〜１０分間放置後、マイクロタイタープ
レート用フォトメーターで４１０nmおよび６００nmにお
ける吸光度（O.D.) を測定し、前者の値から後者の値を
差し引いた値を抗体値とする。

【００５１】ここに示した方法は一例示であり、抗体や
基質液、発色剤などの変更は、適宜行うことができる。

【００５２】ウエスタン・ブロッティング法で行う抗Ｈ
ＣＶ抗体測定例を下記に示す。精製された融合抗原ポリ
ペプチドを直接レムリのサンプルバッファーで加熱、溶
解後、ＳＤＳ−ポリアクリルアミドゲルで泳動する。同
一ゲル上の蛋白質をニトロセルロース膜に移した後、正
常人血清、Ｃ型肝炎患者血清を用いてウエスタン・ブロ
ッティング〔バーネット(Burnett) 、アナールバイオ
ケミカル(Anal.Biochem.)112 ，195(1981)〕を行う。

【００５３】上記組換えＤＮＡ技術における反応の条件
は、一般的に下記のとおりである。ＤＮＡの制限酵素に
よる消化反応は、通常0.１〜２０μｇのＤＮＡを２〜２
００mM（好ましくは１０〜４０mM）のトリス−HCl ( pH
6.０〜9.５好ましくはpH7.０〜8.０）、０〜２００mM N
aCl またはKCl 、２〜３０mM（好ましくは５〜１０mM）
の MgCl₂、０〜２０mMの２−メルカプトエタノールを含
む反応液中で、制限酵素0.１〜１００単位（好ましくは
１μｇのＤＮＡに対して１〜３単位）を用い、２０〜７
０℃（至適温度は用いる制限酵素により異なる）におい
て、１５分間〜２４時間行う。

【００５４】制限酵素消化によって生じたＤＮＡ断片の
精製は、ＬＧＴ法やポリアクリルアミドゲル電気泳動法
などによって行う。ＤＮＡ断片の結合反応は、２〜２０
０mM（好ましくは１０〜４０mM) のトリス−HCl(pH6.１
〜9.５、好ましくはpH7.０〜8.０）、２〜２０mM（好ま
しくは５〜１０mM) の MgCl₂、0.１〜１０mM（好ましく
は0.5 〜2.０mM）のＡＴＰ、１〜５０mM（好ましくは５
〜１０mM）のジチオスレイトールを含む反応液中で、Ｔ
４ＤＮＡリガーゼ0.３〜１０単位を用い、１〜３７℃
（好ましくは３〜２０℃）で１５分間〜７２時間（好ま
しくは２〜２０時間）行う。

【００５５】結合反応によって生じた組換え体プラスミ
ドＤＮＡは、必要によりコーエンらの形質転換法〔エス
・エヌ・コーエン(S. N. Cohen) ら：プロシーディング
・オブ・ザ・ナショナル・アカデミイ・オブ・サイエン
ス(Proc. Natl. Acad. Sci.)、ＵＳＡ、６９ , 2110 (
1972 )〕によって、大腸菌に導入する。

【００５６】組換え体プラスミドＤＮＡを持つ大腸菌か
ら該ＤＮＡの単離は、セシウム・クロライド−エチジウ
ム・ブロミド密度勾配超遠心法〔ディー・ビー・クレウ
ェル(D. B. Clewell) ら：プロシーディング・オブ・ザ
・ナショナル・アカデミイ・オブ・サイエンス(Proc. N
atl. Acad.Sci.) ，USA,６２ , 1159(1969)〕あるいは
バーンボイム(Birnboim)らの方法〔エイチ・シー・バー
ンボイム(H. C. Birnboim)ら：ヌクレイック・アシド・
リサーチ(Nucleic Acids Res.)７, 1513(1979)〕などを
用いて行う。

【００５７】プラスミドＤＮＡを制限酵素で消化後アガ
ロースゲル電気泳動あるいはポリアクリルアミドゲル電
気泳動により切断部位を調べる。さらにＤＮＡの塩基配
列を決定する必要があるときはマキサム・ギルバート法
〔プロシーディング・オブ・ザ・ナショナル・アカデミ
イ・オブ・サイエンス(Proc.Natl. Acad. Sci.), USA ,
７４，560(1977 )〕またはＭ１３ファージを用いたサ
ンガー(Sanger)法〔サンガー(Sanger)ら: プロシーディ
ング・オブ・ザ・ナショナル・アカデミイ・オブ・サイ
エンス(Proc. Natl. Acad. Sci.), USA ：７４，5463(1
977)：アマーシャム( Amersham )社Ｍ１３クローニン
グ・アンド・シークエンシング・ハンドブック( Clonin
g and sequencing handbook ) 〕によって決定する。

【００５８】本発明の融合抗原ポリペプチドは以下のと
おりに製造できる。すなわち、プラスミドを用いて大腸
菌 W3110 strA やHB101 を形質転換させ、アンピシリン
耐性のコロニーの中からプラスミドを有する大腸菌を選
び出す。プラスミドを有する大腸菌を培地に培養するこ
とにより培養物中に融合抗原ポリペプチドを生成させる
ことができる。

【００５９】ここで用いる培地としては大腸菌の生育な
らびに融合抗原ポリペプチドの生産に好適なものならば
合成培地、天然培地のいずれも使用できる。

【００６０】炭素源としては、グルコース、フラクトー
ス、ラクトース、グリセロール、マンニトール、ソルビ
トールなどが、窒素源としては、NH₄Cl 、(NH₄)₂SO₄、
カザミノ酸、酵母エキス、ポリペプトン、肉エキス、バ
クトトリプトン、コーン・スティープ・リカーなどが、
その他の栄養源としては、K₂HPO₄、KH₂PO₄、NaCl、MgSO
₄、ビタミンＢ₁、 MgCl₂などが使用できる。

【００６１】培養はpH5.５〜8.５、温度１８〜４０℃で
通気攪拌培養により行われる。

【００６２】培養５〜９０時間で培養菌体中に該融合抗
原ポリペプチドが非水溶性の顆粒として蓄積するので、
培養物から菌体を集菌し、菌体を破砕し、破砕液を遠心
分離して得られる沈殿物よりゲル濾過カラムクロマトグ
ラフィー、 HPLC 等を用いて該融合抗原ポリペプチドを
採取する。また該融合抗原ポリペプチドの検出は培養菌
体を直接レムリ(Laemmli )のサンプルバッファー〔レム
リ( Laemmli)、ネイチャー(Nature)227,６８０( 1970
)〕に加熱、溶解後、ＳＤＳ−ポリアクリルアミドゲル
〔レムリ(Laemmli) の方法：同上文献〕にかけ、クマシ
ーブリリアントブルー(Coomassie BrilliantBlue )色素
〔バイオ・ラッド( Bio-Rad ) 社製〕を用いて染色して
行う。

【００６３】

【実施例】

実施例１ＤＮＡ４〜１９の製造ＤＮＡ４〜１９の合成はリン酸アミダイト法による固相
合成法〔S. L. Beaucageら、テトラヘドロン・レターズ
( Tetrahedron Letters ) ２２，1859( 1981 )、L. J.
McBrieら、同２４，２４５( 1983 )〕に従い、アプライ
ドバイオシステム社のＤＮＡ自動合成機３８０Ａを用い
て下記のとおり行った。

【００６４】シリカゲルを固相担体とし、これに３′水
酸基を介して結合したヌクレオチドの５′水酸基に(1)
ヌクレオチドをリン酸アミダイト法により縮合し(2) 縮
合したヌクレオチドの亜リン酸結合を沃素で酸化してリ
ン酸結合にし、(3) 縮合したヌクレオチドの５′水酸基
上の保護基をトリフルオロ酢酸で除去した。次に(1)の
工程に戻って次のヌクレオチドを同様に縮合した。こう
して (1)〜(3) の工程が繰り返されてＤＮＡが担体上に
合成された。合成終了後、DNA の結合した担体をチオフ
ェノール溶液中に室温で１時間放置してリン酸の保護基
を除去した後、濃アンモニア水中に室温で１時間放置し
てＤＮＡを担体から遊離させた。ＤＮＡを含む濃アンモ
ニア水を密封容器中６０℃にて１２時間加熱して塩基上
の保護基を除去した。

【００６５】ＤＮＡ４を例にとると、0.２μmoleのヌク
レオチドの結合した担体を用いて合成を行い、次いで保
護基の除去と固相からの遊離反応を行って DNA４の粗生
成物２１ O.D.単位（２６０nmで測定）を得た。この粗
生成物の５ O.D.単位を７Ｍ尿素を含むトリス−硼酸緩
衝液（pH８）を用いて１０％ポリアクリルアミドゲル
（２mm厚、１３cm×13cm) の電気泳動で精製し、ＤＮＡ
４を含むゲルの領域をとり、0.２Ｍ炭酸トリエチルアミ
ン緩衝液 (pH８)(以下ＴＥＡＢという) １mlでＤＮＡ４
を１８時間かけて抽出し、ついでその抽出液をセファデ
ックスＤＥ５２のカラム（径６mm、長さ５mm) に通して
ＤＮＡ４を吸着させた。２ＭＴＥＡＢ２mlで溶出して
1.４ O.D.単位のＤＮＡ４の純品を得た。

【００６６】ＤＮＡ４以外のＤＮＡも同程度の収率で合
成された。これらＤＮＡの５´水酸基をファージＴ４ポ
リヌクレオチドキナーゼと〔γ− ³²Ｐ〕ＡＴＰを用いる
常法〔 A. M. Maxamら、メソッヅ・イン・エンザイモロ
ジイ(Methods in Enzymology)Vol. 65，Part１，p.499,
AcademicPress(1980) 〕でリン酸化して放射性ラベル
をつけた。ラベルをつけたＤＮＡを７Ｍ尿素を含むトリ
ス−硼酸緩衝液で12％ポリアクリルアミドゲル電気泳動
を行い、ＤＮＡの純度と鎖長を確認した。

【００６７】実施例２プラスミドpKYP10およびpSGH1B
2 の分離精製 pKYP10を含む大腸菌〔Escherichia coli HB101, ボリバ
ー(Bolivar) ら；ジーン(Gene)、２，75(1977)〕および
pSGH1B2 を含む大腸菌〔Escherichia coli HB101〕〔特
開昭61−93197 〕をそれぞれ５０μg ／mlのアンピシリ
ンを含むＬ培地（１％バクトトリプトン、0.５％酵母エ
キス、１％NaCl、pH7.５）１０ml、で３７℃、１８時間
培養した。

【００６８】この培養液全量を５０μg ／mlのアンピシ
リンを含むＬ培地１l に植菌し、３７℃で培養した。４
時間後に、クロラムフェニコールを170 μg ／mlとなる
ように加え、さらに３７℃、１６時間培養した。遠心分
離法（5,000rpm １０分間）により集菌を行い、0.８％
NaCl で菌体を洗浄した後、５０mMトリス塩酸（pH8.
０）２０mlに懸濁し、氷冷した。１０mg／mlのリゾチー
ムを８ml加え氷中に１０分間静置した後、0.５Ｍ EDTA
を9.６ml加え、氷中に１０分間静置し、２％トリトンＸ
−１００（和光純薬工業社製）を2.３ml加え氷中にさら
に１時間静置した。50,000×ｇで４℃、１時間超遠心分
離を行い、上清約４０mlを得た。次にこの上清に３Ｍ
NaOHを加えpHを１2.５として、室温で１０分間静かに攪
拌した。

【００６９】２Ｍトリス塩酸（pH7.５）を加え、pHを8.
５にもどし、さらに３分間攪拌した。この時点で液の容
量は約５５mlであった。1/9 容の５Ｍ NaClを加えた
後、１０mMトリス塩酸（pH7.５）、１mMEDTAで飽和した
フェノールを等量加え、激しく攪拌した後、低速遠心分
離法（3,300 rpm 、１０分間、以下同条件）により水層
を集めた（以下、この処理をフェノール抽出と略記す
る。）。 1／250 容の５mg／ml RNase A( シグマ社製）
を加え、３７℃、１時間ＲＮＡ分解反応を行った後1／5
容の５Ｍ NaClを加え、 1／3 容の３０％ＰＥＧ6000
（半井化学薬品社製）を加え−２０℃に２時間静置し
た。遠心分離法で沈殿を集め、１０mMトリス塩酸（pH7.
５) および１mMEDTAからなる液２mlに溶かし、ソジウム
・ドデシル・サルフェイト(SDS) を0.５％となるように
加え、ProteinaseＫ（シグマ社製）を５０μg ／mlとな
るように加えて、３７℃、１時間蛋白質分解反応を行っ
た。

【００７０】フェノール抽出を３回繰り返し行った後、
等量のクロロホルムを加え、激しく攪拌した後低速遠心
分離法により水層を集めた。 1／10容の３Ｍ酢酸ナトリ
ウムを加え、2.５倍容のエタノールを加え、−２０℃、
１時間静置した。冷却遠心分離法（４℃、11,000rpm １
０分間）で沈殿を集め、１０mMトリス塩酸（pH7.５）お
よび１mMEDTAからなる液１mlに溶かした。このようにし
て pKYP10 およびpSGH1B2 各々800 μｇを得ることがで
きた。pKYP10の構造は、EcoRI 、KpnI、BamHI、BglII
、PstI（宝酒造社製）で切断してアガロースゲル電気
泳動で確認した。また、pSGH1B2 の構造は、EcoRI 、Hi
ndIII 、BglII 、BamHI 、NsiI、PstI（宝酒造社製）で
切断してアガロースゲル電気泳動で確認した。

【００７１】実施例３プラスミドpSGHE1の作製実施例２で得たプラスミドpSGH1B2 ２μg を制限酵素Pv
uI（宝酒造社製）１０単位、 BglII（宝酒造社製）１０
単位、NsiI（宝酒造社製) １０単位を含む溶液〔１０mM
トリス−HCl （pH7.５）、７mM MgCl₂、６mM ２−メル
カプトエタノール、１００mM NaCl 〕３０μl に溶解
し、３７℃、２時間消化反応を行った。この反応液をエ
チジウムプロミドを含むアガロースゲル電気泳動にか
け、紫外線（波長３０２nm）で検出して約1.１７kbと約
1.８０kbのＤＮＡを含むゲル片を切り出した。ゲル片に
フェノール0.５mlを加えて凍結・溶解し、水層をクロロ
ホルムで洗浄後、エタノール沈殿により上部ＤＮＡを回
収した。

【００７２】ＤＮＡ１８，ＤＮＡ１９各１０pmole を各
々Ｔ４ポリヌクレオチドキナーゼ反応用緩衝液〔５０mM
トリス−HCl(pH7.５）、１０mM MgCl₂、５mMジチオスレ
イトール（以下ＤＴＴと略記する）、１mM ＡＴＰ、0.
１mMスペルミジン、0.１mMＥＤＴＡ〕３０μl ずつに溶
解し、Ｔ４ポリヌクレオチドキナーゼ（宝酒造社製）３
単位を加え、３７℃、４０分間リン酸化反応を行った
後、６５℃で１５分間加熱して酵素を失活させた。この
反応液を４μlずつ混合し、上記で得たＤＮＡ断片を各
々0.０８pmole 加え、Ｔ４リガーゼ反応用緩衝液〔２８
mMトリス−HCl(pH7.５）、９mM MgCl₂、１０mM ＤＴ
Ｔ、0.０３mM ＥＤＴＡ、0.７mM ＡＴＰ、0.０３mMス
ペルミジン〕の組成になるよう調整し、Ｔ４ＤＮＡリガ
ーゼ（宝酒造社製）１７５単位を加え、３０μl とし
た。４℃で１６時間結合反応を行った。

【００７３】この反応液を用いて大腸菌 HB101株〔ボリ
バー(Bolivar) ら；ジーン（Gene)、２，７５(1977)〕
を Cohenらの方法〔エス・エヌ・コーエン(S. N.Cohen
) ら；プロシーディング・オブ・ザ・ナショナル・ア
カデミイ・オブ・サイエンス(Proc. Natl. Acad. Sc
i.),ＵＳＡ、69，2110( 1972 )〕により形質転換し、ア
ンピシリン耐性( Ap^r) のコロニーを得た。このコロニ
ーよりアルカリ処理法〔マニアティス (Maniatis)ら
編；モレキュラー・クローニング(Molecular Cloning)
、p.368 ，コールド・スプリングハーバー(Cold Sprin
gHarbor)社刊〕によってプラスミドＤＮＡを回収し、pS
GHE1を得た。pSGHE1の構造は、Bgl II、PvuI、Hind II
I、EcoRI 、NsiIで切断してアガロースゲル電気泳動に
より確認した。制限酵素の切断反応は１０mMトリス−HC
l （pH7.５）、７mM MgCl₂、６mM ２−メルカプトエタ
ノールの組成の溶液に各酵素の至適濃度になるよう（０
〜２００mM) NaCl を加えた反応液を用いて行った。

【００７４】実施例４プラスミドpSGHEC−２の作製実施例３で得たプラスミドpSGHE1の２μg を実施例３に
示した制限酵素用反応液(100mM NaCl) ３０μl に溶解
し、 EcoRI（宝酒造社製) １０単位を加え３７℃で２時
間消化反応を行った。次にこの反応液に Bacterial Alk
aline Phosphatase （宝酒造社製）を１単位加え６５℃
で３０分間反応させた。ついでHindIII（宝酒造社製）
１０単位、PvuI（宝酒造社製）１０単位を加え３７℃で
２時間消化反応を行った。同時にpSGHE1をHindIII （宝
酒造社製）10単位、PvuI（宝酒造社製）１０単位を加
え、３７℃、２時間消化反応を行った。

【００７５】上記反応液をエチジウムブロミドを含むア
ガロースゲル電気泳動にかけ、紫外線（波長３０２nm）
で検出して約３２０ｂ、約８５０ｂと約1.８kbのＤＮＡ
断片を切り出した。ゲル片にフェノール 0.５mlを加え
て凍結・溶解し、水層をクロロホルムで洗浄後、エタノ
ール沈殿により上記ＤＮＡ断片を回収した。

【００７６】ＤＮＡ４，ＤＮＡ５，各１０pmole を各々
Ｔ４ポリヌクレオチドキナーゼ反応用緩衝液〔５０mMト
リス−HCl （pH7.５）、１０mM MgCl₂、５mMＤＴＴ、
１mMATP 、0.１mMスペルミジン、0.１mM EDTA〕３０μ
l ずつに溶解し、Ｔ４ポリヌクレオチドキナーゼ（宝酒
造社製）３単位を加え37℃、４０分間リン酸化反応を行
った後、６５℃で１５分間加熱して酵素を失活させた。
この反応液を４μl ずつ混合し、上記で得たＤＮＡ断片
を各々0.０８pmole を加え、Ｔ４リガーゼ反応用緩衝液
〔28mMトリス−HCl(pH7.５）、9mM MgCl₂、１０mM Ｄ
ＴＴ、0.０３mMＥＤＴＡ、0.７mM ＡＴＰ、0.０３mMス
ペルミジン〕の組成になるよう調整し、Ｔ４ＤＮＡリガ
ーゼ（宝酒造社製）１７５単位を加え、３０μlとし
た。４℃で１６時間結合反応を行った。

【００７７】この反応液を用いて大腸菌 HB101株を Coh
enらの方法により形質転換し、アンピシリン耐性( A
p^r) のコロニーを得た。このコロニーよりアルカリ処
理法によってプラスミドＤＮＡを回収し、pSGHEC−２を
得た。pSGHEC−２の構造は、BglII、PvuI、HindIII 、E
coRI で切断してアガロースゲル電気泳動により確認し
た。制限酵素の切断反応は１０mMトリス−HCl （pH7.
５）、７mM MgCl₂、6mM ２−メルカプトエタノールの
組成の溶液に各酵素の至適濃度になるよう(0〜200mM) N
aClを加えた反応液を用いて行った。

【００７８】pSGHEC−２を含む大腸菌菌株は Escherich
ia coli SGHEC２、FERM BP−２７３２としてブダペス
ト条約の条件で工業技術院微生物工業技術研究所（微工
研）に平成２年１月１８日付で寄託してある。

【００７９】実施例５プラスミドpSGHEC−１４の作製実施例３で得たプラスミドpSGHE1の２μg を実施例２に
示した制限酵素用反応液 (100 mM NaCl) ３０μl に溶
解し、 EcoRI（宝酒造社製）１０単位を加え３７℃で２
時間消化反応を行った。次にこの反応液にBacterial Al
kaline Phosphatase（宝酒造社製）を１単位加え65℃で
３０分間反応させた。ついでHindIII （宝酒造社製）１
０単位、PvuI（宝酒造社製）１０単位を加え３７℃で２
時間消化反応を行った。同時にpSGHE1をHindIII （宝酒
造社製）10単位、PvuI（宝酒造社製）１０単位を加え、
３７℃、２時間消化反応を行った。

【００８０】この反応液をエチジウムブロミドを含むア
ガロースゲル電気泳動にかけ、紫外線（波長３０２nm）
検出して約３２０ｂ、約８５０ｂと約1.８kbのＤＮＡ
断片を切り出した。ゲル片にフェノール0.５mlを加えて
凍結・溶解し、水層をクロロホルムで洗浄後、エタノー
ル沈殿により上記ＤＮＡ断片を回収した。

【００８１】ＤＮＡ６〜９，各１０pmole を各々Ｔ４ポ
リヌクレオチドキナーゼ反応用緩衝液〔５０mMトリス−
HCl(pH7.５）、１０mM MgCl₂、5mM ＤＴＴ、１mM Ａ
ＴＰ、0.１mMスペルミジン、0.１mM EDTA 〕３０μl ず
つに溶解し、Ｔ４ポリヌクレオチドキナーゼ（宝酒造社
製）３単位を加え、37℃、40分間リン酸化反応を行った
後、６５℃で１５分間加熱して酵素を失活させた。この
反応液を４μl ずつ混合し、上記で得たＤＮＡ断片を各
々0.08pmole 加え、Ｔ４リガーゼ反応用緩衝液〔28mMト
リス−HCl （pH7.５) 、９mM MgCl₂ 、１０mM ＤＴ
Ｔ、0.０３mM EDTA、0.７mM ＡＴＰ、0.０３mMスペル
ミジン〕の組成になるよう調整し、Ｔ４ＤＮＡリガーゼ
（宝酒造社製）１７５単位を加え、30μl とした。４℃
で１６時間結合反応を行った。

【００８２】この反応液を用いて大腸菌 HB101株を Coh
enらの方法により形質転換し、アンピシリ耐性( Ap^r)
のコロニーを得た。このコロニーよりアルカリ処理法に
よってプラスミドＤＮＡを回収し、pSGHEC−１４を得
た。pSGHEC−１４の構造は、Bgl II、PvuI、HindIII 、
EcoRIで切断してアガロースゲル電気泳動により確認し
た。制限酵素の切断反応は１０mMトリス−HCl(pH7.
５）、７mM MgCl₂、６mM２−メルカプトエタノールの
組成の溶液に各酵素の至適濃度になるよう（０〜２００
mM ) NaCl を加えた反応液を用いて行った。

【００８３】pSGHEC−１４を含む大腸菌菌株は Escheri
chia coli SGHEC １４、 FERM BP−２７３１としてブダ
ペスト条約の条件で工業技術院微生物工業技術研究所
（微工研）に平成２年１月１８日付で寄託してある。

【００８４】実施例６プラスミドpSGHEC−１８の作製実施例３で得たプラスミドpSGHE1の２μg を実施例２に
示した制限酵素用反応液 (100mM NaCl)３０μl に溶解
し、 EcoRI（宝酒造社製) １０単位を加え３７℃で２時
間消化反応を行った。次にこの反応液に Bacterial Alk
aline Phosphatase （宝酒造社製）を１単位加え６５℃
で３０分間反応させた。ついでHindIII（宝酒造社製）
１０単位、PvuI（宝酒造社製）１０単位を加え３７℃で
２時間消化反応を行った。同時にpSGHE1をHindIII （宝
酒造社製）10単位、PvuI（宝酒造社製）１０単位を加
え、３７℃、２時間消化反応を行った。

【００８５】この反応液をエチジウムブロミドを含むア
ガロースゲル電気泳動にかけ、紫外線（波長３０２nm）
で検出して約３２０ｂ、約８５０ｂと約1.８kbのＤＮＡ
断片を切り出した。ゲル片にフェノール 0.５mlを加え
て凍結・溶解し、水層をクロロホルムで洗浄後、エタノ
ール沈殿により上記ＤＮＡ断片を回収した。

【００８６】ＤＮＡ１０〜１７，各１０pmole を各々Ｔ
４ポリヌクレオチドキナーゼ反応用緩衝液〔50mMトリス
−HCl （pH7.５）、１０mM MgCl₂、５mM ＤＴＴ、１m
MＡＴＰ、0.１mMスペルミジン、0.１mM EDTA〕３０μl
ずつに溶解し、Ｔ４ポリヌクレオチドキナーゼ（宝酒
造社製) ３単位を加え37℃、４０分間リン酸化反応を行
った後、６５℃で15分間加熱して酵素を失活させた。こ
の反応液を４μl ずつ混合し、上記で得たＤＮＡ断片を
各々0.０８pmole を加え、Ｔ４リガーゼ反応用緩衝液
〔２８mMトリス−HCl(pH7.５) 、９mM MgCl₂ 、１０mM
ＤＴＴ、0.０３mM ＥＤＴＡ、0.７mM ＡＴＰ、0.０
３mMスペルミジン〕の組成になるよう調整し、Ｔ４ＤＮ
Ａリガーゼ（宝酒造社製）175単位を加え、３０μl と
した。４℃で１６時間結合反応を行った。

【００８７】この反応液を用いて大腸菌 HB101株を Coh
enらの方法により形質転換し、アンピシリン耐性( A
p^r)のコロニーを得た。このコロニーよりアルカリ処理
法によってプラスミドＤＮＡを回収し、pSGHEC−１８を
得た。pSGHEC−１８の構造は、Bgl II、PvuI、HindIII
、EcoRIで切断してアガロースゲル電気泳動により確認
した。制限酵素の切断反応は１０mMトリス−HCl （pH7.
５）、７mM MgCl₂、６mM ２−メルカプトエタノール
の組成の溶液に各酵素の至適濃度になるよう（０〜２０
０mM )NaClを加えた反応液を用いて行った。

【００８８】実施例７プラスミドpSGHEC−１８Ｓの作
製実施例６で得たプラスミドpSGHEC-18 とpKYP10（特開昭
58−110600) の各２μg を、HindIII （宝酒造社製）１
０単位、PvuI（宝酒造社製) １０単位を含む溶液〔１０
mMトリス−HCl （pH7.５）、７mM MgCl₂、６mM ２−
メルカプトエタノール、１００mM NaCl〕３０μl に溶
解し、３７℃、２時間消化反応を行った。この反応液を
エチジウムプロミドを含むアガロースゲル電気泳動にか
け、紫外線（波長３０２nm）で検出してpSGHEC−１８の
約2.３６kb ＤＮＡ断片とpKYP１０の約 1.１kbＤＮＡ
断片を切り出した。ゲル片にフェノール0.５mlを加えて
凍結・溶解し、水層をクロロホルムで洗浄後、エタノー
ル沈殿により上記ＤＮＡ断片を回収した。

【００８９】上記で得たＤＮＡ断片各々0.０８pmole を
混合し、Ｔ４リガーゼ反応用緩衝液〔２８mMトリス−HC
l （pH7.５) 、９mM MgCl₂、10mM ＤＴＴ、0.０３mM
EDTA、0.７mM ＡＴＰ、0.０３mMスペルミジン〕の組成
になるよう調整し、Ｔ４ＤＮＡリガーゼ（宝酒造社製）
１７５単位を加え、３０μl とした。４℃で１６時間結
合反応を行った。

【００９０】この反応液を用いて大腸菌 HB101株を Coh
enらの方法により形質転換し、アンピシリン耐性( A
p^r)のコロニーを得た。このコロニーよりアルカリ処理
法によってプラスミドＤＮＡを回収し、pSGHEC−18Ｓを
得た。pSGHEC−18Ｓの構造は、Bgl II、PvuI、HindIII
、EcoRI で切断してアガロースゲル電気泳動により確
認した。制限酵素の切断反応は１０mMトリス−HCl （pH
7.５）、７mM MgCl₂、６mM ２−メルカプトエタノー
ルの組成の溶液に各酵素の至適濃度になるよう（０〜２
００mM ) NaCl を加えた反応液を用いて行った。

【００９１】pSGHEC−１８Ｓを含む大腸菌菌株はEscher
ichia coli SGHEC18Ｓ、FERM BP−２７２９としてブダ
ペスト条約の条件で工業技術院微生物工業技術研究所
（微工研）に平成２年１月１８日付で寄託してある。

【００９２】実施例８プラスミドpSGHEC−1414の作製実施例５で得たプラスミドpSGHEC−１４の５μg を実施
例３に示した制限酵素用反応液（１００mM NaCl ）３０
μl に溶解し、PstI（宝酒造社製）１０単位を加え、３
７℃で２時間消化反応を行った。次にこの反応液に Eco
RI（宝酒造社製）１単位を加え３７℃で１時間部分消化
を行った。この反応液をエチジウムブロミドを含むアガ
ロースゲル電気泳動にかけ、紫外線（波長３０２nm）で
検出して約1.４kbのＤＮＡ断片と約1.８５kbのＤＮＡ
断片を切り出した。ゲル片にフェノール0.５mlを加えて
凍結・溶解し、水層をクロロホルムで洗浄後、エタノー
ル沈殿により上記ＤＮＡ断片を回収した。

【００９３】上記で得たＤＮＡ断片各々0.０８pmole を
１０μl になるよう混合し、Ｔ４リガーゼ反応用緩衝液
〔２８mMトリス−HCl （pH7.５) 、９mM MgCl₂、１０mM
ＤＴＴ、0.０３mM EDTA、0.７mM ATP 、0.０３mMス
ペルミジン〕の組成になるよう調整し、Ｔ４ＤＮＡリガ
ーゼ（宝酒造社製）１７５単位を加え、３０μl とし
た。４℃で１６時間結合反応を行った。

【００９４】この反応液を用いて大腸菌 HB101株を Coh
enらの方法により形質転換し、アンピシリン耐性( A
p^r)のコロニーを得た。このコロニーよりアルカリ処理
法によってプラスミドＤＮＡを回収し、pSGHEC−1414を
得た。pSGHEC−1414の構造は、Bgl II、PvuI、HindIII
、EcoRI で切断してアガロースゲル電気泳動により確
認した。制限酵素の切断反応は１０mMトリス−HCl （pH
7.５）、７mM MgCl₂、６mM ２−メルカプトエタノー
ルの組成の溶液に各酵素の至適濃度になるよう（０〜２
００mM ) NaCl を加えた反応液を用いて行った。

【００９５】pSGHEC−1414を含む大腸菌菌株は Escheri
chia coli SGHEC1414 、FERM BP−２７３０としてブダ
ペスト条約の条件で工業技術院微生物工業技術研究所
（微工研）に平成２年１月１８日付で寄託してある。

【００９６】実施例９プラスミドpSGHE1を導入した大
腸菌によるsGHE1 の生産実施例３で得られたpSGHE1を用いて実施例３に示した方
法で大腸菌W3110 strA( FERM BP−732 ) を形質転換し
た。得られたAp^rのコロニーを８mlのＬＧ培地（１％バ
クトトリプトン、0.５％酵母エキス、0.５％ NaCl 、0.
１％グルコース、５０μg／mlアンピシリン、pH7.4)に
接種し、３０℃、１６時間培養した。この培養液２００
μl を１０mlのＭＣＧ培地（0.６％ Na₂HPO₄、0.３％KH
₂PO₄、0.０５％ NaCl 、0.１％ NH₄Cl、0.５％グルコー
ス、0.５％カザミノ酸、１mM MgSO₄、0.１mM CaCl₂、４
μg／mlビタミンＢ₁、pH7.４）に５０μg／mlのアンピ
シリンを添加した培地に接種し、３０℃、２４時間培養
した。

【００９７】培養液を7,000rpmで５分間遠心分離して菌
体を集め、この菌体をレムリ（Laemm li) のサンプルバ
ッファーに溶解し、加熱後、レムリの方法に従ってＳＤ
Ｓ−ポリアクリルアミドゲル電気泳動を行い、クマシー
ブリリアントブルーを用いて染色した結果、分子量約12
600 の部位にポリペプチドバンドを検出した（図７Ａ参
照）。pSGHE1を含まない大腸菌 W3110 strA 株には相当
するバンドは存在しなかった。このことはsGHE1 を保有
する大腸菌 W3110strA 株がsGHE1 を生産していること
を示している。

【００９８】実施例１０プラスミドpSGHEC−２を導入
した大腸菌による sGHEC−２の生産実施例４で得られたpSGHEC−２を用いて実施例３に示し
た方法で大腸菌 W3110strA( FERM BP−７３２) を形質
転換した。得られたAp^rのコロニーを実施例９と同様に
ＬＧ培地に接種し、３０℃、１６時間培養した。

【００９９】この培養液２００μl を１０mlのＭＣＧ培
地に５０μg ／mlのアンピシリンを添加した培地に接種
し、３０℃、２４時間培養した。培養液を7,000rpmで５
分間遠心分離して菌体を集め、この菌体をレムリのサン
プルバッファーに溶解し、加熱後、ＳＤＳ−ポリアクリ
ルアミドゲル電気泳動を行い、クマシーブリリアントブ
ルーを用いて染色した結果、分子量約14800 の部位にポ
リペプチドバンドを検出した（図７Ｂ参照)。pSGHEC−
２を含まない大腸菌 W3110 strA 株には相当するバンド
は存在しなかった。このことは、pSGHEC−２を保有する
大腸菌W3110 strA 株が、Ｃ−２によりコードされるＨ
ＣＶ関連抗原とsGH との融合抗原ポリペプチド sGHEC−
２を生産していることを示している。

【０１００】実施例１１プラスミドpSGHEC−１４を導
入した大腸菌による融合抗原ポリペプチドの生産実施例５で得られたpSGHEC−１４を用いて実施例３に示
した方法で大腸菌 W3110 strA( FERM BP−７３２) を形
質転換した。得られたAp^rのコロニーを実施例９と同様
にＬＧ培地に接種し、３０℃、１６時間培養した。

【０１０１】この培養液２００μl を１０mlのＭＣＧ培
地に５０μg ／mlのアンピシリンを添加した培地に接種
し、３０℃、２４時間培養した。培養液を7,000rpmで５
分間遠心分離して菌体を集め、この菌体をレムリのサン
プルバッファーに溶解し、加熱後、ＳＤＳ−ポリアクリ
ルアミドゲル電気泳動を行い、クマシーブリリアントブ
ルーを用いて染色した結果、分子量約17100 の部位にポ
リペプチドバンドを検出した（図７Ｃ参照）。pSGHEC−
１４を含まない大腸菌 W3110 strA株には相当するバン
ドは存在しなかった。このことは、pSGHEC−１４を保有
する大腸菌 W3110 strA 株が、Ｃ−１４によりコードさ
れるＨＣＶ関連抗原とｓＧＨとの融合抗原ポリペプチド
sGHEC−１４を生産していることを示している。

【０１０２】実施例１２プラスミドpSGHEC−18S を導
入した大腸菌による融合抗原ポリペプチドの生産実施例７で得られたpSGHEC−18S を用いて実施例３に示
した方法で大腸菌 W3110 strA 株(FERM BP−７３２) を
形質転換した。得られたAp^rのコロニーを実施例９と同
様にＬＧ培地に接種し、30℃、１６時間培養した。

【０１０３】この培養液２００μl を２５μg ／mlのト
リプトファンと３０μg ／mlのアンピシリンを含むＭＣ
Ｇ培地〔Na₂HPO₄0.６％、KH₂PO₄ 0.3 ％、 NaCl 0.５
％、カザミノ酸0.５％、MgSO₄１mM、ビタミンＢ₁４μ
g ／ml、pH7.４〕１０mlに接種し、３０℃で４〜８時間
培養後、トリプトファンの誘導物質である３β−インド
ールアクリル酸（３β−indoleacrylic acid ,以下ＩＡ
Ａと略す）を１０μg／ml加え、さらに２〜１２時間培
養を続けた。

【０１０４】培養液を7,000rpmで５分間遠心分離して菌
体を集め、この菌体をレムリのサンプルバッファーに溶
解し、加熱後、ＳＤＳ−ポリアクリルアミドゲル電気泳
動を行い、クマシーブリリアントブルーを用いて染色し
た結果、分子量約20400 の部位にポリペプチドバンドを
検出した（図７Ｄ参照）。pSGHEC−18S を含まない大腸
菌 W3110 strA 株には相当するバンドは存在しなかっ
た。このことは、pSGHEC−18S を保有する大腸菌 W3110
strA 株が、Ｃ−18によりコードされるＨＣＶ関連抗原
とsGH との融合抗原ポリペプチド sGHEC−18Ｓを生産し
ていることを示している。

【０１０５】実施例１３プラスミドpSGHEC−1414を導
入した大腸菌による融合抗原ポリペプチドの生産実施例８で得られたpSGHEC−1414を用いて実施例３に示
した方法で大腸菌 W3110 strA( FERM BP−７３２)を形
質転換した。得られたAp^rのコロニーを実施例９と同様
にＬＧ培地に接種し、３０℃、１６時間培養した。この
培養液２００μl を１０mlのＭＣＧ培地に５０μg ／ml
のアンピシリンを添加した培地に接種し、３０℃、２４
時間培養した。培養液を7,000rpmで５分間遠心分離して
菌体を集め、この菌体をレムリのサンプルバッファーに
溶解し、加熱後、ＳＤＳ−ポリアクリルアミドゲル電気
泳動を行い、クマシーブリリアントブルーを用いて染色
した結果、分子量約21700 の部位にポリペプチドバンド
を検出した（図７Ｅ参照）。pSGHEC−1414を含まない大
腸菌 W3110strA株には相当するバンドは存在しなかっ
た。このことは、pSGHEC−1414を保有する大腸菌 W3110
strA株が、Ｃ−１４にコードされているＨＣＶ関連抗原
を２個とｓＧＨとの融合抗原ポリペプチド sGHEC−1414
を生産していることを示している。

【０１０６】実施例１４大腸菌によって産生された s
GHEC−１４ポリペプチドの精製実施例１１によって得られた培養液を8000rpm 、４０分
間遠心して集菌し、３０mM NaCl 、３０mMTris−HCl 緩
衝液（pH7.５）で洗浄した。sGHEC −１４は大腸菌内に
顆粒として発現した。まず、洗浄菌体から sGHEC−１４
顆粒を特開昭60-244259 に示された方法に従い純度９０
％にまで精製した。この顆粒８００mgを７０％ギ酸に可
溶化し、４０mlとし、12000rpm、２０分間遠心後、逆相
HPLCを用い、 sGHEC−１４を精製した。逆相ＨＰＬＣの
操作条件は以下のとおりである。

【０１０７】カラム：Hi−PORE Ｃ₄２1.５mm×２５cm
（バイオラッド社製）Ａ液：0.１％トリフルオロ酢酸、１５％アセトニトリ
ルＢ液：0.１％トリフルオロ酢酸、９０％アセトニトリ
ルグラジエント：

【０１０８】

【表１】

【０１０９】sGHEC−１４は逆相ＨＰＬＣにおいて、グ
ラジエント開始後２６〜２８分に溶出された。この溶出
画分４０mlを１mlずつ分注後、凍結乾燥し、 sGHEC−１
４の標品を得た。この１バイアルを 0.１％トリフルオ
ロ酢酸１mlに溶解後タンパク質アッセイキット（バイオ
ラッド社製）ＳＤＳ−ポリアクリルアミドゲルにより分
析したところ、蛋白濃度0.２〜0.６mg／ml（ sGHEC−１
４の場合0.４４mg／ml，牛血清アルブミン換算）、純度
９０％以上であった。

【０１１０】同様な方法で sGHE1, sGHEC −２，sGHEC
−18S, sGHEC−1414も精製可能である。

【０１１１】実施例１５ＨＣＶ関連融合抗原ポリペプ
チドを用いた抗ＨＣＶ抗体の検出人血清を試料として、ウエスタンブロッティング（以下
ＷＢと略記する）を行った〔バーネット(Burnett),アナ
ールバイオケミ(Anal. Biochem.) 112 , 195(1981 )
〕。使用したＨＣＶ関連融合抗原としては、実施例１
４で得た精製されたＣ−１４融合抗原ポリペプチドを用
いた。

【０１１２】精製されたＣ−１４融合抗原ポリペプチド
１00μg をＳＤＳ−ポリアクリルアミドゲルで泳動後、
同一ゲルをニトロセルロース膜に電気的にブロッティン
グした〔トウビィン(Towbin), プロシーディング・オブ
・ザ・ナショナル・アカデミィ・オブ・サイエンス( Pr
oc. Natl. Acad. Sci. ) USA ７６，4350( 1979 )〕。
ブロッティング後、ブロット（１０mMリン酸バッファー
pH7.２，５００mMNaCl、５％スキムミルク，消泡剤１
滴）液に浸し、室温で２時間振とうした。振とう後、ニ
トロセルロース膜を短冊状に切り、蛋白量３μg ／短冊
になるようにした。この短冊を３mlのブロットに浸し人
血清を３０μl 加え室温で一夜処理した。次いでフィル
ターを Tween−PBS(１０mMリン酸バッファーpH7.２，５
００mM NaCl ，0.05％ Tween ２０）で洗浄した後、抗
人イムノグロブリンズ・パーオキシダーゼコンジュゲー
トを加え室温で２時間反応させた。次に Tween−ＰＢＳ
で洗浄し最後にＰＢＳで洗浄した後、発色剤を加えた。
発色剤は、４−クロロ−１−ナフトール（バイオラッド
社）６０mgに、冷メタノールを加えたものと、ＰＢＳ１
００mlに過酸化水素水６０μl を混合したものを用い
た。発色反応は遮光し、３０分間反応させた後、水で洗
浄して終了した。

【０１１３】使用した血清は以下の通りである。なおＰ
ＩＢ法とはプラーク・イムノ・ブロット法〔有馬ら、日
本臨床 48 , 27−32(1990)〕の略であり、カイロン法は
Kuo, G. et al,Science 244 ,362−364( 1989 )に記
載の方法である：血清(1)(2)は、ＰＩＢ法Ｃ−１４
(−），Ｃ−１８（＋）患者血清：(3) 〜(10)はＰＩＢ
法Ｃ−１４（＋）患者血清：(11)〜(15)は、ＰＩＢ法Ｃ
−１４（−）患者血清：(1E)〜(14E) はＰＩＢ法Ｃ−１
４（−）患者血清：(15E) はＰＩＢ法Ｃ−１４（−）,
カイロン法（＋）血清：(16E) はＰＩＢ法Ｃ−１４
（−），カイロン法（−）である。表２は血清 (1)〜(1
5)までのウエスタンブロッティングの結果を示す。表３
は血清(1E)〜(16E) までのウエスタンブロッティングの
結果を示す。

【０１１４】(1) 〜(10)において従来法ＰＩＢによるＣ
−１４判定と本発明にかかわるＷＢ判定は、非常によい
相関を示した。(11)〜(15)，(1E)〜 (16E) において
は、従来法のＰＩＢ法によるＣ−14判定陰性検体を、本
発明で用いた融合抗原ポリペプチドによるＷＢ法では検
出することができた。また(16E) においては、カイロン
法で陰性判定の検体を、本発明によるＷＢ法で検出する
ことができた。融合させたｓＧＨポリペプチドのみを用
いたＷＢ法では、いずれも血清と反応性を示さないこと
が判明した。従って、本発明の融合抗原ポリペプチド
は、抗ＨＣＶ抗体を検出する血清診断に用いるに極めて
有効であると考えられる。

【０１１５】

【表２】

【０１１６】

【表３】

【０１１７】実施例１６ＤＮＡ２９〜３６の製造ＤＮＡ２９〜３６の合成は実施例１と同様の方法で行っ
た。

【０１１８】実施例１７プラスミドpSGHEC−１４Ａの
作製実施例３で得たプラスミドpSGHE1の２μg を実施例２に
示した制限酵素用反応液 (100mM NaCl)３０μl に溶解
し、 EcoRI（宝酒造社製）１０単位を加え３７℃で２時
間消化反応を行った。次にこの反応液に Bacterial Alk
aline Phosphatase （宝酒造社製）を１単位加え６５℃
で３０分間反応させた。ついでHind III（宝酒造社製）
１０単位、PvuI（宝酒造社製）１０単位を加え３７℃で
２時間消化反応を行った。同時にpSGHE1をHindIII （宝
酒造社製）10単位、PvuI（宝酒造社製）１０単位を加
え、３７℃、２時間消化反応を行った。

【０１１９】この反応液をエチジウムブロミドを含むア
ガロースゲル電気泳動にかけ、紫外線（波長３０２nm）
検出して約３２０ｂ、約８５０ｂと約1.８kbのＤＮＡ断
片を切り出した。ゲル片にフェノール0.５mlを加えて凍
結・溶解し、水層をクロロホルムで洗浄後、エタノール
沈殿により上記ＤＮＡ断片を回収した。

【０１２０】ＤＮＡ２９〜３４，各１０pmole を各々Ｔ
４ポリヌクレオチドキナーゼ反応用緩衝液〔50mMトリス
−HCl （pH7.５）、１０mM MgCl₂、５mM ＤＴＴ、１m
MＡＴＰ、0.１mMスペルミジン、0.１mM EDTA〕３０μl
ずつに溶解し、Ｔ４ポリヌクレオチドキナーゼ（宝酒
造社製) ３単位を加え、３７℃、４０分間リン酸化反応
を行った後、６５℃で１５分間加熱して酵素を失活させ
た。この反応液を４μl ずつ混合し、上記で得たＤＮＡ
断片各々0.０８pmole を加え、Ｔ４リガーゼ反応用緩衝
液〔２８mMトリス−HCl(pH7.５)、９mM MgCl₂、１０mM
ＤＴＴ、0.０３mM ＥＤＴＡ、0.７mM ＡＴＰ、0.０
３mMスペルミジン〕の組成になるよう調整し、Ｔ４ＤＮ
Ａリガーゼ（宝酒造社製）175 単位を加え、３０μl と
した。４℃で１６時間結合反応を行った。

【０１２１】この反応液を用いて大腸菌 HB101株を Coh
enらの方法により形質転換し、アンピシリン耐性( A
p^r)のコロニーを得た。このコロニーよりアルカリ処理
法によってプラスミドＤＮＡを回収し、pSGHEC−１４Ａ
を得た。pSGHEC−１４Ａの構造は、Bgl II、PvuI、Hind
III、EcoRIで切断してアガロースゲル電気泳動により
確認した。制限酵素の切断反応は１０mMトリス−HCl(pH
7.５）、７mM MgCl₂、６mM ２−メルカプトエタノー
ルの組成の溶液に各酵素の至適濃度になるよう（０〜２
００mM ) NaClを加えた反応液を用いて行った。

【０１２２】pSGHEC−１４Ａを含む大腸菌菌株はEscher
ichia coli SGHEC14A 、FERM BP −3261としてブダペス
ト条約の条件で工業技術院微生物工業技術研究所 (微工
研)に平成３年２月１日付で寄託してある。

【０１２３】実施例１８プラスミドpSGHEC−１４Ｂの
作製実施例３で得たプラスミドpSGHE1の２μg を実施例２に
示した制限酵素用反応液 (100mM NaCl)３０μl に溶解
し、 EcoRI（宝酒造社製）１０単位を加え３７℃で２時
間消化反応を行った。次にこの反応液に Bacterial Alk
aline Phosphatase （宝酒造社製）を１単位加え６５℃
で３０分間反応させた。ついでHind III（宝酒造社製）
１０単位、PvuI（宝酒造社製）１０単位を加え３７℃で
２時間消化反応を行った。同時にpSGHE1をHindIII （宝
酒造社製）10単位、PvuI（宝酒造社製）１０単位を加
え、３７℃、２時間消化反応を行った。

【０１２４】この反応液をエチジウムブロミドを含むア
ガロースゲル電気泳動にかけ、紫外線（波長３０２nm）
で検出して約３２０ｂ、約８５０ｂと約1.８kbのＤＮＡ
断片を切り出した。ゲル片にフェノール0.５mlを加えて
凍結・溶解し、水層をクロロホルムで洗浄後、エタノー
ル沈殿により上記ＤＮＡ断片を回収した。

【０１２５】ＤＮＡ２９〜３２，ＤＮＡ３５〜３６各１
０pmole を各々Ｔ４ポリヌクレオチドキナーゼ反応用緩
衝液〔50mMトリス−HCl （pH7.５）、１０mM MgCl₂、
５mMＤＴＴ、１mM ＡＴＰ、0.１mMスペルミジン、0.１
mM EDTA〕３０μl ずつに溶解し、Ｔ４ポリヌクレオチ
ドキナーゼ（宝酒造社製）３単位を加え37℃、４０分間
リン酸化反応を行った後、６５℃で15分間加熱して酵素
を失活させた。この反応液を４μl ずつ混合し、上記で
得たＤＮＡ断片各々0.０８pmole を加え、Ｔ４リガーゼ
反応用緩衝液〔２８mMトリス−HCl(pH7.５)、９mM MgCl
₂、10mM ＤＴＴ、0.０３mM ＥＤＴＡ、0.７mM ＡＴ
Ｐ、0.０３mMスペルミジン〕の組成になるよう調整し、
Ｔ４ＤＮＡリガーゼ（宝酒造社製）175 単位を加え、３
０μl とした。４℃で１６時間結合反応を行った。

【０１２６】この反応液を用いて大腸菌 HB101株を Coh
enらの方法により形質転換し、アンピシリン耐性( A
p^r)のコロニーを得た。このコロニーよりアルカリ処理
法によってプラスミドＤＮＡを回収し、pSGHEC−１４Ｂ
を得た。pSGHEC−１４Ｂの構造は、Bgl II、PvuI、Hind
III、EcoRIで切断してアガロースゲル電気泳動により
確認した。制限酵素の切断反応は１０mMトリス−HCl(pH
7.５）、７mM MgCl₂、６mM ２−メルカプトエタノー
ルの組成の溶液に各酵素の至適濃度になるよう（０〜２
００mM ) NaClを加えた反応液を用いて行った。

【０１２７】pSGHEC−１４Ｂを含む大腸菌菌株はEscher
ichia coli SGHEC14B 、FERM BP −3262としてブダペス
ト条約の条件で工業技術院微生物工業技術研究所 (微工
研)に平成３年２月１日付で寄託してある。

【０１２８】実施例１９プラスミドpSGHEC−１４Ａを
導入した大腸菌による融合抗原ポリペプチドの生産実施例１７で得られたpSGHEC−１４Ａを用いて実施例３
に示した方法で大腸菌W3110 strA(FERM BP−７３２) を
形質転換した。得られたAp^rのコロニーを実施例９と同
様にＬＧ培地に接種し、３０℃、１６時間培養した。

【０１２９】この培養液２００μl を１０mlのＭＣＧ培
地に５０μg ／mlのアンピシリンを添加した培地に接種
し、３０℃、２４時間培養した。培養液を7,000rpmで５
分間遠心分離して菌体を集め、この菌体をレムリのサン
プルバッファーに溶解し、加熱後、ＳＤＳ−ポリアクリ
ルアミドゲル電気泳動を行い、クマシーブリリアントブ
ルーを用いて染色した結果、分子量約17100 の部位にポ
リペプチドバンドを検出した（図10Ｆ参照）。pSGHEC−
１４Ａを含まない大腸菌 W3110 strA 株には相当するバ
ンドは存在しなかった。このことは、pSGHEC−１４Ａを
保有する大腸菌W3110 strA株が、Ｃ−１４Ａによりコー
ドされるＨＣＶ関連抗原とｓＧＨとの融合抗原ポリペプ
チド sGHEC−１４Ａを生産していることを示している。

【０１３０】実施例２０プラスミドpSGHEC−１４Ｂを
導入した大腸菌による融合抗原ポリペプチドの生産実施例１８で得られたpSGHEC−１４Ｂを用いて実施例３
に示した方法で大腸菌W3110 strA(FERM BP−７３２) を
形質転換した。得られたAp^rのコロニーを実施例９と同
様にＬＧ培地に接種し、３０℃、１６時間培養した。

【０１３１】この培養液２００μl を１０mlのＭＣＧ培
地に５０μg ／mlのアンピシリンを添加した培地に接種
し、３０℃、２４時間培養した。培養液を7,000rpmで５
分間遠心分離して菌体を集め、この菌体をレムリのサン
プルバッファーに溶解し、加熱後、ＳＤＳ−ポリアクリ
ルアミドゲル電気泳動を行い、クマシーブリリアントブ
ルーを用いて染色した結果、分子量約16500 の部位にポ
リペプチドバンドを検出した（図10Ｇ参照）。pSGHEC−
１４Ｂを含まない大腸菌 W3110 strA 株には相当するバ
ンドは存在しなかった。このことは、pSGHEC−１４Ｂを
保有する大腸菌W3110 strA株が、Ｃ−１４Ｂによりコー
ドされるＨＣＶ関連抗原とｓＧＨとの融合抗原ポリペプ
チド sGHEC−１４Ｂを生産していることを示している。

【０１３２】実施例２１大腸菌によって産生された SGHEC−１４Ａ， SGHEC−１
４Ｂポリペプチドの精製実施例１４と同様な方法で SGHEC−１４Ａ， SGHEC−１
４Ｂは、精製可能である。

【０１３３】

【発明の効果】本発明によれば、抗原ポリペプチドが異
種ポリペプチドと融合した形の融合抗原ポリペプチドを
大量に製造することができる。該融合抗原ポリペプチド
は、Ｃ型肝炎ウイルスに感染した患者の正確な血清診断
に利用することができる。

【０１３４】

【配列表】

【０１３５】配列番号：1 配列の長さ：66 配列の型：核酸鎖の数：二本鎖トポロジー：直鎖状配列の種類：他の核酸Ｂ型肝炎以外の肝機能異常者血
清からのＲＮＡをｃＤＮＡ化したもの（Ｃ型肝炎ウイル
ス関連抗原遺伝子）配列の特徴特徴を表す記号：CDS 存在位置：1..66 特徴を決定した方法：E 特徴を表す記号：peptide 存在位置：1..22 特徴を決定した方法：E 配列 GAA TCC CCA ACG CGT CGG CTT GGC CCG CGC CTT GGC CGC CGA CCC GCG 48 Glu Phe Pro Thr Arg Arg Leu Gly Pro Arg Leu Gly Arg Arg Pro Ala 1 5 10 15 CTG ATG GCC GTG GAA TTC 66 Leu Met Ala Val Glu Phe 20

【０１３６】配列番号：2 配列の長さ：114 配列の型：核酸鎖の数：二本鎖トポロジー：直鎖状配列の種類：他の核酸Ｂ型肝炎以外の肝機能異常者血
清からのＲＮＡをｃＤＮＡ化したもの（Ｃ型肝炎ウイル
ス関連抗原遺伝子）配列の特徴特徴を表す記号：CDS 存在位置：1..114 特徴を決定した方法：E 特徴を表す記号：peptide 存在位置：1..38 特徴を決定した方法：E 配列 GAA TTC CGA GAA CAA GAC CAG ATA AAA ACC AAA GAC AGA ACA CAA CAG 48 Glu Phe Arg Glu Gln Asp Gln Ile Lys Thr Lys Asp Arg Thr Gln Gln 1 5 10 15 AGA AAG ACG AAA AGA AGC ACC AAT CGC AGG CGA AGC AAA AAC GAA AAA 96 Arg Lys Thr Lys Arg Ser Thr Asn Arg Arg Arg Ser Lys Asn Glu Lys 20 25 30 AAA AAA AAA AAG GAA TCC 114 Lys Lys Lys Lys Glu Phe 35

【０１３７】配列番号：3 配列の長さ：201 配列の型：核酸鎖の数：二本鎖トポロジー：直鎖状配列の種類：他の核酸Ｂ型肝炎以外の肝機能異常者血
清からのＲＮＡをｃＤＮＡ化したもの（Ｃ型肝炎ウイル
ス関連抗原遺伝子）配列の特徴特徴を表す記号：CDS 存在位置：1..201 特徴を決定した方法：E 特徴を表す記号：peptide 存在位置：1..67 特徴を決定した方法：E 配列 GAA TTC CAA GAA AAA AAG GGA GAA GCC AGC AAT GGA GAA GCC GAA AAC 48 Glu Phe Gln Glu Lys Lys Gly Glu Ala Ser Asn Gly Glu Ala Glu Asn 5 10 15 GAC ACA CAC AAG AAA CAA AGG AGG TAC AAA GAA AAA GAA AAA ACG GCA 96 Asp Thr His Lys Lys Gln Arg Arg Tyr Lys Glu Lys Glu Lys Thr Ala 20 25 30 ACA AAT AAC CCA GGA AAG AAC AAA AAG CCA AGA GTG GGC AGA ATA AAA 144 Thr Asn Asn Pro Gly Lys Asn Lys Lys Pro Arg Val Gly Arg Ile Lys 35 40 45 AAC TGG AAC CGG GAG GGA AGG AAG GAC GCA TAT CAG ATT AGA AAA AGG 192 Asn Trp Asn Arg Glu Gly Arg Lys Asp Ala Tyr Gln Ile Arg Lys Arg 50 55 60 AGG GAA TTC 201 Arg Glu Phe 65

【０１３８】配列番号：4 配列の長さ：60 配列の型：核酸鎖の数：一本鎖トポロジー：直鎖状配列の種類：他の核酸合成ＤＮＡ配列の特徴特徴を表す記号：unsure 存在位置：1..60 特徴を決定した方法：E 配列 AATTCCCAAC GCGTCGGCTT GGCCCGCGCC TTGGCCGCCG ACCCGCGCTG ATGGCCGTGG 60

【０１３９】配列番号：5 配列の長さ：60 配列の型：核酸鎖の数：一本鎖トポロジー：直鎖状配列の種類：他の核酸合成ＤＮＡ配列の特徴特徴を表す記号：unsure 存在位置：1..60 特徴を決定した方法：E 配列 AATTCCACGG CCATCAGCGC GGGTCGGCGG CCAAGGCGCG GGCCAAGCCG ACGCGTTGGG 60

【０１４０】配列番号：6 配列の長さ：53 配列の型：核酸鎖の数：一本鎖トポロジー：直鎖状配列の種類：他の核酸合成ＤＮＡ配列の特徴特徴を表す記号：unsure 存在位置：1..53 特徴を決定した方法：E 配列 AATTCCGAGA ACAAGACCAG ATAAAAACCA AAGACAGAAC ACAACAGAGA AAG 53

【０１４１】配列番号：7 配列の長さ：55 配列の型：核酸鎖の数：一本鎖トポロジー：直鎖状配列の種類：他の核酸合成ＤＮＡ配列の特徴特徴を表す記号：unsure 存在位置：1..55 特徴を決定した方法：E 配列 TTTCGTCTTT CTCTGTTGTG TTCTGTCTTT GGTTTTTATC TGGTCTTGTT CTCGG 55

【０１４２】配列番号：8 配列の長さ：55 配列の型：核酸鎖の数：一本鎖トポロジー：直鎖状配列の種類：他の核酸合成ＤＮＡ配列の特徴特徴を表す記号：unsure 存在位置：1..55 特徴を決定した方法：E 配列 ACGAAAAGAA GCACCAATCG CAGGCGAAGC AAAAACGAAA AAAAAAAAAA AAAGG 55

【０１４３】配列番号：9 配列の長さ：53 配列の型：核酸鎖の数：一本鎖トポロジー：直鎖状配列の種類：他の核酸合成ＤＮＡ配列の特徴特徴を表す記号：unsure 存在位置：1..53 特徴を決定した方法：E 配列 AATTCCTTTT TTTTTTTTTT TTCGTTTTTG CTTCGCCTGC GATTGGTGCT TCT 53

【０１４４】配列番号：10 配列の長さ：50 配列の型：核酸鎖の数：一本鎖トポロジー：直鎖状配列の種類：他の核酸合成ＤＮＡ配列の特徴特徴を表す記号：unsure 存在位置：1..50 特徴を決定した方法：E 配列 AATTCCAAGA AAAAAAGGGA GAAGCCAGCA ATGGAGAAGC CGAAAACGAC 50

【０１４５】配列番号：11 配列の長さ：52 配列の型：核酸鎖の数：一本鎖トポロジー：直鎖状配列の種類：他の核酸合成ＤＮＡ配列の特徴特徴を表す記号：unsure 存在位置：1..52 特徴を決定した方法：E 配列 GTGTGTGTCG TTTTCGGCTT CTCCATTGCT GGCTTCTCCC TTTTTTTCTT GG 52

【０１４６】配列番号：12 配列の長さ：51 配列の型：核酸鎖の数：一本鎖トポロジー：直鎖状配列の種類：他の核酸合成ＤＮＡ配列の特徴特徴を表す記号：unsure 存在位置：1..51 特徴を決定した方法：E 配列 ACACACAAGA AACAAAGGAG GTACAAAGAA AAAGAAAAAA CGGCAACAAA T 51

【０１４７】配列番号：13 配列の長さ：51 配列の型：核酸鎖の数：一本鎖トポロジー：直鎖状配列の種類：他の核酸合成ＤＮＡ配列の特徴特徴を表す記号：unsure 存在位置：1..51 特徴を決定した方法：E 配列 TGGGTTATTT GTTGCCGTTT TTTCTTTTTC TTTGTACCTC CTTTGTTTCT T 51

【０１４８】配列番号：14 配列の長さ：51 配列の型：核酸鎖の数：一本鎖トポロジー：直鎖状配列の種類：他の核酸合成ＤＮＡ配列の特徴特徴を表す記号：unsure 存在位置：1..51 特徴を決定した方法：E 配列 AACCCAGGAA AGAACAAAAA GCCAAGAGTG GGCAGAATAA AAAACTGGAA C 51

【０１４９】配列番号：15 配列の長さ：51 配列の型：核酸鎖の数：一本鎖トポロジー：直鎖状配列の種類：他の核酸合成ＤＮＡ配列の特徴特徴を表す記号：unsure 存在位置：1..51 特徴を決定した方法：E 配列 CTCCCGGTTC CAGTTTTTTA TTCTGCCCAC TCTTGGCTTT TTGTTCTTTC C 51

【０１５０】配列番号：16 配列の長さ：43 配列の型：核酸鎖の数：一本鎖トポロジー：直鎖状配列の種類：他の核酸合成ＤＮＡ配列の特徴特徴を表す記号：unsure 存在位置：1..43 特徴を決定した方法：E 配列 CGGGAGGGAA GGAAGGACGC ATATCAGATT AGAAAAAGGA GGG 43

【０１５１】配列番号：17 配列の長さ：41 配列の型：核酸鎖の数：一本鎖トポロジー：直鎖状配列の種類：他の核酸合成ＤＮＡ配列の特徴特徴を表す記号：unsure 存在位置：1..41 特徴を決定した方法：E 配列 AATTCCCTCC TTTTTCTAAT CTGATATGCG TCCTTCCTTC C 41

【０１５２】配列番号：18 配列の長さ：29 配列の型：核酸鎖の数：一本鎖トポロジー：直鎖状配列の種類：他の核酸合成ＤＮＡ配列の特徴特徴を表す記号：unsure 存在位置：1..29 特徴を決定した方法：E 配列 GATCATGGAA TTCTAAGTAA GTAAATGCA 29

【０１５３】配列番号：19 配列の長さ：21 配列の型：核酸鎖の数：一本鎖トポロジー：直鎖状配列の種類：他の核酸合成ＤＮＡ配列の特徴特徴を表す記号：unsure 存在位置：1..21 特徴を決定した方法：E 配列 TTTACTTACT TAGAATTCCA T 21

【０１５４】配列番号：20 配列の長さ：64 配列の型：核酸鎖の数：二本鎖トポロジー：直鎖状配列の種類：他の核酸Ｂ型肝炎以外の肝機能異常者血
清からのＲＮＡをｃＤＮＡ化したもの（Ｃ型肝炎ウイル
ス関連抗原遺伝子）配列番号4,5 から形成される合成ＤＮＡ断片配列の特徴特徴を表す記号：CDS 存在位置：1..64 特徴を決定した方法：E 配列 AATTCCCAACGCGTCGGCTTGGCCCGCGCCTTGGCCGCCGACCCGCGCTGATGGCCGTGG GGGTTGCGCAGCCGAACCGGGCGCGGAACCGGCGGCTGGGCGCGACTACCGGCACCTTAA 64 EcoRI EcoRI

【０１５５】配列番号：21 配列の長さ：112 配列の型：核酸鎖の数：二本鎖トポロジー：直鎖状配列の種類：他の核酸Ｂ型肝炎以外の肝機能異常者血
清からのＲＮＡをｃＤＮＡ化したもの配列番号6,7,8,9 から形成される合成ＤＮＡ断片配列の特徴特徴を表す記号：CDS 存在位置：1..112 特徴を決定した方法：E 配列 AATTCCGAGAACAAGACCAGATAAAAACCAAAGACAGAACACAACAGAGAAAGACGAAA GGCTCTTGTTCTGGTCTATTTTTGGTTTCTGTCTTGTGTTGTCTCTTTCTGCTTT 59 EcoRI AGAAGCACCAATCGCAGGCGAAGCAAAAACGAAAAAAAAAAAAAAAAGG TCTTCGTGGTTAGCGTCCGCTTCGTTTTTGCTTTTTTTTTTTTTTTTCCTTAA 112 EcoRI

【０１５６】配列番号：22 配列の長さ：199 配列の型：核酸鎖の数：二本鎖トポロジー：直鎖状配列の種類：他の核酸Ｂ型肝炎以外の肝機能異常者血
清からのＲＮＡをｃＤＮＡ化したもの配列番号10,11,12,13,14,15,16,17から形成される合成
ＤＮＡ断片配列の特徴特徴を表す記号：CDS 存在位置：1..199 特徴を決定した方法：E 配列 AATTCCAAGAAAAAAAGGGAGAAGCCAGCAATGGAGAAGCCGAAAACGACACACACAAG GGTTCTTTTTTTCCCTCTTCGGTCGTTACCTCTTCGGCTTTTGCTGTGTGTGTTC 59 EcoRI AAACAAAGGAGGTACAAAGAAAAAGAAAAAACGGCAACAAATAACCCAGGAAAGAACAAA TTTGTTTCCTCCATGTTTCTTTTTCTTTTTTGCCGTTGTTTATTGGGTCCTTTCTTGTTT 119 AAGCCAAGAGTGGGCAGAATAAAAAACTGGAACCGGGAGGGAAGGAAGGACGCATATCAG TTCGGTTCTCACCCGTCTTATTTTTTGACCTTGGCCCTCCCTTCCTTCCTGCGTATAGTC 179 ATTAGAAAAAGGAGGG TAATCTTTTTCCTCCCTTAA 199 EcoRI

【０１５７】配列番号：23 配列の長さ：29 配列の型：核酸鎖の数：二本鎖トポロジー：直鎖状配列の種類：他の核酸配列番号18,19から形成される
合成ＤＮＡ断片プラスミド構築に用いたリンカーＤＮＡ配列の特徴特徴を表す記号：unsure 存在位置：1..29 特徴を決定した方法：E 配列 MetGluPhe GATCATGGAATTCTAAGTAAGTAAATGCA TACCTTAAGATTCATTCATTT 29 BglII EcoRI NsiI

【０１５８】配列番号：24 配列の長さ：337 配列の型：核酸鎖の数：二本鎖トポロジー：直鎖状配列の種類：他の核酸配列表18,19から形成されるＤ
ＮＡ断片をサケ成長ホルモンＤＮＡ断片と連結させたも
の配列の特徴特徴を表す記号：CDS 存在位置：1..337 特徴を決定した方法：E 特徴を表す記号：peptide 存在位置：1..107 特徴を決定した方法：E 配列 ATG ATA GAA AAC CAA CGG CTC TTC AAC ATC GCG GTC AGT CGG GTG CAA 48 Met Ile Glu Asn Gln Arg Leu Phe Asn Ile Ala Val Ser Arg Val Gln 5 10 15 CAT CTC CAC CTA TTG GCT CAG AAA ATG TTC AAT GAC TTT GAC GGT ACC 96 His Leu His Leu Leu Ala Gln Lys Met Phe Asn Asp Phe Asp Gly Thr 20 25 30 CTG TTG CCT GAT GAA CGC AGA CAG CTG AAC AAG ATA TTC CTG CTG GAC 144 Leu Leu Pro Asp Glu Arg Arg Gln Leu Asn Lys Ile Phe Leu Leu Asp 35 40 45 TTC TGT AAC TCT GAC TCC ATC GTG AGC CCA GTC GAC AAG CAC GAG ACT 192 Phe Cys Asn Ser Asp Ser Ile Val Ser Pro Val Asp Lys His Glu Thr 50 55 60 CAG AAG AGT TCA GTC CTG AAG CTG CTC CAC ATT TCT TTC CGT CTG ATT 240 Gln Lys Ser Ser Val Leu Lys Leu Leu His Ile Ser Phe Arg Leu Ile 65 70 75 80 GAA TCC TGG GAG TAC CCT AGC CAG ACC CTG ATC ATC TCC AAC AGC CTA 288 Glu Ser Trp Glu Tyr Pro Ser Gln Thr Leu Ile Ile Ser Asn Ser Leu 85 90 95 ATG GTC AGA AAC GCC AAC CAG ATC ATG GAA TTC TAAGTAAGTA AATGCA 337 Met Val Arg Asn Ala Asn Gln Ile Met Glu Phe 100 105 EcoRI

【０１５９】配列番号：25 配列の長さ：381 配列の型：核酸鎖の数：二本鎖トポロジー：直鎖状配列の種類：他の核酸配列表4,5 から形成されるＤＮ
Ａ断片を配列表24のＤＮＡ断片中に組み込んだもの配列の特徴特徴を表す記号：CDS 存在位置：1..381 特徴を決定した方法：E 特徴を表す記号：peptide 存在位置：1..127 特徴を決定した方法：E 配列 ATG ATA GAA AAC CAA CGG CTC TTC AAC ATC GCG GTC AGT CGG GTG CAA 48 Met Ile Glu Asn Gln Arg Leu Phe Asn Ile Ala Val Ser Arg Val Gln 5 10 15 CAT CTC CAC CTA TTG GCT CAG AAA ATG TTC AAT GAC TTT GAC GGT ACC 96 His Leu His Leu Leu Ala Gln Lys Met Phe Asn Asp Phe Asp Gly Thr 20 25 30 CTG TTG CCT GAT GAA CGC AGA CAG CTG AAC AAG ATA TTC CTG CTG GAC 144 Leu Leu Pro Asp Glu Arg Arg Gln Leu Asn Lys Ile Phe Leu Leu Asp 35 40 45 TTC TGT AAC TCT GAC TCC ATC GTG AGC CCA GTC GAC AAG CAC GAG ACT 192 Phe Cys Asn Ser Asp Ser Ile Val Ser Pro Val Asp Lys His Glu Thr 50 55 60 CAG AAG AGT TCA GTC CTG AAG CTG CTC CAC ATT TCT TTC CGT CTG ATT 240 Gln Lys Ser Ser Val Leu Lys Leu Leu His Ile Ser Phe Arg Leu Ile 65 70 75 80 GAA TCC TGG GAG TAC CCT AGC CAG ACC CTG ATC ATC TCC AAC AGC CTA 288 Glu Ser Trp Glu Tyr Pro Ser Gln Thr Leu Ile Ile Ser Asn Ser Leu 85 90 95 ATG GTC AGA AAC GCC AAC CAG ATC ATG GAA TTC CCA ACG CGT CGG CTT 336 Met Val Arg Asn Ala Asn Gln Ile Met Glu Phe Pro Thr Arg Arg Leu 100 105 110 GGC CCG CGC CTT GGC CGC CGA CCC GCG CTG ATG GCC GTG GAA TTC 381Gly Pro Arg Leu Gly Arg Arg Pro Ala Leu Met Ala Val Glu Phe 115 120 125

【０１６０】配列番号：26 配列の長さ：429 配列の型：核酸鎖の数：二本鎖トポロジー：直鎖状配列の種類：他の核酸配列表6,7,8,9 から形成される
ＤＮＡ断片を配列表24のＤＮＡ断片中に組み込んだもの配列の特徴特徴を表す記号：CDS 存在位置：1..429 特徴を決定した方法：E 特徴を表す記号：peptide 存在位置：1..143 特徴を決定した方法：E 配列 ATG ATA GAA AAC CAA CGG CTC TTC AAC ATC GCG GTC AGT CGG GTG CAA 48 Met Ile Glu Asn Gln Arg Leu Phe Asn Ile Ala Val Ser Arg Val Gln 5 10 15 CAT CTC CAC CTA TTG GCT CAG AAA ATG TTC AAT GAC TTT GAC GGT ACC 96 His Leu His Leu Leu Ala Gln Lys Met Phe Asn Asp Phe Asp Gly Thr 20 25 30 CTG TTG CCT GAT GAA CGC AGA CAG CTG AAC AAG ATA TTC CTG CTG GAC 144 Leu Leu Pro Asp Glu Arg Arg Gln Leu Asn Lys Ile Phe Leu Leu Asp 35 40 45 TTC TGT AAC TCT GAC TCC ATC GTG AGC CCA GTC GAC AAG CAC GAG ACT 192 Phe Cys Asn Ser Asp Ser Ile Val Ser Pro Val Asp Lys His Glu Thr 50 55 60 CAG AAG AGT TCA GTC CTG AAG CTG CTC CAC ATT TCT TTC CGT CTG ATT 240 Gln Lys Ser Ser Val Leu Lys Leu Leu His Ile Ser Phe Arg Leu Ile 65 70 75 80 GAA TCC TGG GAG TAC CCT AGC CAG ACC CTG ATC ATC TCC AAC AGC CTA 288 Glu Ser Trp Glu Tyr Pro Ser Gln Thr Leu Ile Ile Ser Asn Ser Leu 85 90 95 ATG GTC AGA AAC GCC AAC CAG ATC ATG GAA TTC CGA GAA CAA GAC CAG 338 Met Val Arg Asn Ala Asn Gln Ile Met Glu Phe Arg Glu Gln Asp Gln 100 105 110 ATA AAA ACC AAA GAC AGA ACA CAA CAG AGA AAG ACG AAA AGA AGC ACC 384Ile Lys Thr Lys Asp Arg Thr Gln Gln Arg Lys Thr Lys Arg Ser Thr 115 120 125 AAT CGC AGG CGA AGC AAA AAC GAA AAA AAA AAA AAA AAG GAA TTC 429Asn Arg Arg Arg Ser Lys Asn Glu Lys Lys Lys Lys Lys Glu Phe 130 135 140

【０１６１】配列番号：27 配列の長さ：516 配列の型：核酸鎖の数：二本鎖トポロジー：直鎖状配列の種類：他の核酸配列表10,11,12,13,14,15,16,1
7から形成されるＤＮＡ断片を配列表24のＤＮＡ断片中
に組み込んだもの配列の特徴特徴を表す記号：CDS 存在位置：1..516 特徴を決定した方法：E 特徴を表す記号：peptide 存在位置：1..172 特徴を決定した方法：E 配列 ATG ATA GAA AAC CAA CGG CTC TTC AAC ATC GCG GTC AGT CGG GTG CAA 48 Met Ile Glu Asn Gln Arg Leu Phe Asn Ile Ala Val Ser Arg Val Gln 5 10 15 CAT CTC CAC CTA TTG GCT CAG AAA ATG TTC AAT GAC TTT GAC GGT ACC 96 His Leu His Leu Leu Ala Gln Lys Met Phe Asn Asp Phe Asp Gly Thr 20 25 30 CTG TTG CCT GAT GAA CGC AGA CAG CTG AAC AAG ATA TTC CTG CTG GAC 144 Leu Leu Pro Asp Glu Arg Arg Gln Leu Asn Lys Ile Phe Leu Leu Asp 35 40 45 TTC TGT AAC TCT GAC TCC ATC GTG AGC CCA GTC GAC AAG CAC GAG ACT 192 Phe Cys Asn Ser Asp Ser Ile Val Ser Pro Val Asp Lys His Glu Thr 50 55 60 CAG AAG AGT TCA GTC CTG AAG CTG CTC CAC ATT TCT TTC CGT CTG ATT 240 Gln Lys Ser Ser Val Leu Lys Leu Leu His Ile Ser Phe Arg Leu Ile 65 70 75 80 GAA TCC TGG GAG TAC CCT AGC CAG ACC CTG ATC ATC TCC AAC AGC CTA 288 Glu Ser Trp Glu Tyr Pro Ser Gln Thr Leu Ile Ile Ser Asn Ser Leu 85 90 95 ATG GTC AGA AAC GCC AAC CAG ATC ATG GAA TTC CAA GAA AAA AAG GGA 336 Met Val Arg Asn Ala Asn Gln Ile Met Glu Phe Gln Glu Lys Lys Gly 100 105 110 GAA GCC AGC AAT GGA GAA GCC GAA AAC GAC ACA CAC AAG AAA CAA AGG 384Glu Ala Ser Asn Gly Glu Ala Glu Asn Asp Thr His Lys Lys Gln Arg 115 120 125 AGG TAC AAA GAA AAA GAA AAA ACG GCA ACA AAT AAC CCA GGA AAG AAC 432Arg Tyr Lys Glu Lys Glu Lys Thr Ala Thr Asn Asn Pro Gly Lys Asn 130 135 140 AAA AAG CCA AGA GTG GGC AGA ATA AAA AAC TGG AAC CGG GAG GGA AGG 480Lys Lys Pro Arg Val Gly Arg Ile Lys Asn Trp Asn Arg Glu Gly Arg 145 150 155 160 AAG GAC GCA TAT CAG ATT AGA AAA AGG AGG GAA TTC 516Lys Asp Ala Tyr Gln Ile Arg Lys Arg Arg Glu Phe 165 170

【０１６２】配列番号：28 配列の長さ：537 配列の型：核酸鎖の数：二本鎖トポロジー：直鎖状配列の種類：他の核酸配列表6,7,8,9 から形成される
ＤＮＡ断片（タンデム）を配列表24のＤＮＡ断片中に組
み込んだもの配列の特徴特徴を表す記号：CDS 存在位置：1..537 特徴を決定した方法：E 特徴を表す記号：peptide 存在位置：1..179 特徴を決定した方法：E 配列 ATG ATA GAA AAC CAA CGG CTC TTC AAC ATC GCG GTC AGT CGG GTG CAA 48 Met Ile Glu Asn Gln Arg Leu Phe Asn Ile Ala Val Ser Arg Val Gln 5 10 15 CAT CTC CAC CTA TTG GCT CAG AAA ATG TTC AAT GAC TTT GAC GGT ACC 96 His Leu His Leu Leu Ala Gln Lys Met Phe Asn Asp Phe Asp Gly Thr 20 25 30 CTG TTG CCT GAT GAA CGC AGA CAG CTG AAC AAG ATA TTC CTG CTG GAC 144 Leu Leu Pro Asp Glu Arg Arg Gln Leu Asn Lys Ile Phe Leu Leu Asp 35 40 45 TTC TGT AAC TCT GAC TCC ATC GTG AGC CCA GTC GAC AAG CAC GAG ACT 192 Phe Cys Asn Ser Asp Ser Ile Val Ser Pro Val Asp Lys His Glu Thr 50 55 60 CAG AAG AGT TCA GTC CTG AAG CTG CTC CAC ATT TCT TTC CGT CTG ATT 240 Gln Lys Ser Ser Val Leu Lys Leu Leu His Ile Ser Phe Arg Leu Ile 65 70 75 80 GAA TCC TGG GAG TAC CCT AGC CAG ACC CTG ATC ATC TCC AAC AGC CTA 288 Glu Ser Trp Glu Tyr Pro Ser Gln Thr Leu Ile Ile Ser Asn Ser Leu 85 90 95 ATG GTC AGA AAC GCC AAC CAG ATC ATG GAA TTC CGA GAA CAA GAC CAG 338 Met Val Arg Asn Ala Asn Gln Ile Met Glu Phe Arg Glu Gln Asp Gln 100 105 110 ATA AAA ACC AAA GAC AGA ACA CAA CAG AGA AAG ACG AAA AGA AGC ACC 384Ile Lys Thr Lys Asp Arg Thr Gln Gln Arg Lys Thr Lys Arg Ser Thr 115 120 125 AAT CGC AGG CGA AGC AAA AAC GAA AAA AAA AAA AAA AAG GAA TTC CGA 432Asn Arg Arg Arg Ser Lys Asn Glu Lys Lys Lys Lys Lys Glu Phe Arg 130 135 140 GAA CAA GAC CAG ATA AAA ACC AAA GAC AGA ACA CAA CAG AGA AAG ACG 480Glu Gln Asp Gln Ile Lys Thr Lys Asp Arg Thr Gln Gln Arg Lys Thr 145 150 155 160 AAA AGA AGC ACC AAT CGC AGG CGA AGC AAA AAC GAA AAA AAA AAA AAA 528Lys Arg Ser Thr Asn Arg Arg Arg Ser Lys Asn Glu Lys Lys Lys Lys 165 170 175 AAG GAA TTC 537Lys Glu Phe

【０１６３】配列番号：29 配列の長さ：40 配列の型：核酸鎖の数：一本鎖トポロジー：直鎖状配列の種類：他の核酸合成ＤＮＡ配列の特徴特徴を表す記号：unsure 存在位置：1..40 特徴を決定した方法：E 配列 AATTCCGAGA ACAGGACCAG ATAAAAACCA AGGACAGAAC 40

【０１６４】配列番号：30 配列の長さ：43 配列の型：核酸鎖の数：一本鎖トポロジー：直鎖状配列の種類：他の核酸合成ＤＮＡ配列の特徴特徴を表す記号：unsure 存在位置：1..43 特徴を決定した方法：E 配列 CTGTTGTGTT CTGTCCTTGG TTTTTATCTG GTCCTGTTCT CGG 43

【０１６５】配列番号：31 配列の長さ：38 配列の型：核酸鎖の数：一本鎖トポロジー：直鎖状配列の種類：他の核酸合成ＤＮＡ配列の特徴特徴を表す記号：unsure 存在位置：1..38 特徴を決定した方法：E 配列 ACAACAGAGA AAGACGAAAA GAAGTACTAA TCGCAGGC 38

【０１６６】配列番号：32 配列の長さ：36 配列の型：核酸鎖の数：一本鎖トポロジー：直鎖状配列の種類：他の核酸合成ＤＮＡ配列の特徴特徴を表す記号：unsure 存在位置：1..36 特徴を決定した方法：E 配列 GCTTCGCCTG CGATTAGTAC TTCTTTTCGT CTTTCT 36

【０１６７】配列番号：33 配列の長さ：30 配列の型：核酸鎖の数：一本鎖トポロジー：直鎖状配列の種類：他の核酸合成ＤＮＡ配列の特徴特徴を表す記号：unsure 存在位置：1..30 特徴を決定した方法：E 配列 GAAGCAAAAA CGAAAAAAAG AAAAAAAAGG 30

【０１６８】配列番号：34 配列の長さ：29 配列の型：核酸鎖の数：一本鎖トポロジー：直鎖状配列の種類：他の核酸合成ＤＮＡ配列の特徴特徴を表す記号：unsure 存在位置：1..29 特徴を決定した方法：E 配列 AATTCCTTTT TTTTCTTTTT TTCGTTTTT 29

【０１６９】配列番号：35 配列の長さ：15 配列の型：核酸鎖の数：一本鎖トポロジー：直鎖状配列の種類：他の核酸合成ＤＮＡ配列の特徴特徴を表す記号：unsure 存在位置：1..15 特徴を決定した方法：E 配列 GAAGCAAAAA CGAAG 15

【０１７０】配列番号：36 配列の長さ：14 配列の型：核酸鎖の数：一本鎖トポロジー：直鎖状配列の種類：他の核酸合成ＤＮＡ配列の特徴特徴を表す記号：unsure 存在位置：1..14 特徴を決定した方法：E 配列 AATTCTTCGT TTTT 14

【０１７１】配列番号：37 配列の長さ：112 配列の型：核酸鎖の数：二本鎖トポロジー：直鎖状配列の種類：他の核酸配列表29,30,31,32,33,34から
形成されるＤＮＡ断片配列の特徴特徴を表す記号：CDS 存在位置：1..112 特徴を決定した方法：E 配列 AATTCCGAGAACAGGACCAGATAAAAACCAAGGACAGAACACAACAGAGAAAGACGAAA GGCTCTTGTCCTGGTCTATTTTTGGTTCCTGTCTTGTGTTGTCTCTTTCTGCTTT 59 EcoRI AGAAGTACTAATCGCAGGCGAAGCAAAAACGAAAAAAAGAAAAAAAAGG TCTTCATGATTAGCGTCCGCTTCGTTTTTGCTTTTTTTCTTTTTTTTCCTTAA 112 EcoRI

【０１７２】配列番号：38 配列の長さ：97 配列の型：核酸鎖の数：二本鎖トポロジー：直鎖状配列の種類：他の核酸配列表29,30,31,32,35,36から
形成されるＤＮＡ断片配列の特徴特徴を表す記号：CDS 存在位置：1..97 特徴を決定した方法：E 配列 AATTCCGAGAACAGGACCAGATAAAAACCAAGGACAGAACACAACAGAGAAAGACGAAA GGCTCTTGTCCTGGTCTATTTTTGGTTCCTGTCTTGTGTTGTCTCTTTCTGCTTT 59 EcoRI AGAAGTACTAATCGCAGGCGAAGCAAAAACGAAG TCTTCATGATTAGCGTCCGCTTCGTTTTTGCTTCTTAA 97 EcoRI

【０１７３】配列番号：39 配列の長さ：429 配列の型：核酸鎖の数：二本鎖トポロジー：直鎖状配列の種類：他の核酸配列表29,30,31,32,33,34から
形成されるＤＮＡ断片を配列表24のＤＮＡ断片中に組み
込んだもの配列の特徴特徴を表す記号：CDS 存在位置：1..429 特徴を決定した方法：E 特徴を表す記号：peptide 存在位置：1..143 特徴を決定した方法：E 配列 ATG ATA GAA AAC CAA CGG CTC TTC AAC ATC GCG GTC AGT CGG GTG CAA 48 Met Ile Glu Asn Gln Arg Leu Phe Asn Ile Ala Val Ser Arg Val Gln 5 10 15 CAT CTC CAC CTA TTG GCT CAG AAA ATG TTC AAT GAC TTT GAC GGT ACC 96 His Leu His Leu Leu Ala Gln Lys Met Phe Asn Asp Phe Asp Gly Thr 20 25 30 CTG TTG CCT GAT GAA CGC AGA CAG CTG AAC AAG ATA TTC CTG CTG GAC 144 Leu Leu Pro Asp Glu Arg Arg Gln Leu Asn Lys Ile Phe Leu Leu Asp 35 40 45 TTC TGT AAC TCT GAC TCC ATC GTG AGC CCA GTC GAC AAG CAC GAG ACT 192 Phe Cys Asn Ser Asp Ser Ile Val Ser Pro Val Asp Lys His Glu Thr 50 55 60 CAG AAG AGT TCA GTC CTG AAG CTG CTC CAC ATT TCT TTC CGT CTG ATT 240 Gln Lys Ser Ser Val Leu Lys Leu Leu His Ile Ser Phe Arg Leu Ile 65 70 75 80 GAA TCC TGG GAG TAC CCT AGC CAG ACC CTG ATC ATC TCC AAC AGC CTA 288 Glu Ser Trp Glu Tyr Pro Ser Gln Thr Leu Ile Ile Ser Asn Ser Leu 85 90 95 ATG GTC AGA AAC GCC AAC CAG ATC ATG GAA TTC CGA GAA CAG GAC CAG 336 Met Val Arg Asn Ala Asn Gln Ile Met Glu Phe Arg Glu Gln Asp Gln 100 105 110 ATA AAA ACC AAG GAC AGA ACA CAA CAG AGA AAG ACG AAA AGA AGT ACT 384Ile Lys Thr Lys Asp Arg Thr Gln Gln Arg Lys Thr Lys Arg Ser Thr 115 120 125 AAT CGC AGG CGA AGC AAA AAC GAA AAA AAG AAA AAA AAG GAA TTC 429Asn Arg Arg Arg Ser Lys Asn Glu Lys Lys Lys Lys Lys Glu Phe 130 135 140

【０１７４】配列番号：40 配列の長さ：414 配列の型：核酸鎖の数：二本鎖トポロジー：直鎖状配列の種類：他の核酸配列表29,30,31,32,35,36から
形成されるＤＮＡ断片を配列表24のＤＮＡ断片中に組み
込んだもの配列の特徴特徴を表す記号：CDS 存在位置：1..414 特徴を決定した方法：E 特徴を表す記号：peptide 存在位置：1..138 特徴を決定した方法：E 配列 ATG ATA GAA AAC CAA CGG CTC TTC AAC ATC GCG GTC AGT CGG GTG CAA 48 Met Ile Glu Asn Gln Arg Leu Phe Asn Ile Ala Val Ser Arg Val Gln 5 10 15 CAT CTC CAC CTA TTG GCT CAG AAA ATG TTC AAT GAC TTT GAC GGT ACC 96 His Leu His Leu Leu Ala Gln Lys Met Phe Asn Asp Phe Asp Gly Thr 20 25 30 CTG TTG CCT GAT GAA CGC AGA CAG CTG AAC AAG ATA TTC CTG CTG GAC 144 Leu Leu Pro Asp Glu Arg Arg Gln Leu Asn Lys Ile Phe Leu Leu Asp 35 40 45 TTC TGT AAC TCT GAC TCC ATC GTG AGC CCA GTC GAC AAG CAC GAG ACT 192 Phe Cys Asn Ser Asp Ser Ile Val Ser Pro Val Asp Lys His Glu Thr 50 55 60 CAG AAG AGT TCA GTC CTG AAG CTG CTC CAC ATT TCT TTC CGT CTG ATT 240 Gln Lys Ser Ser Val Leu Lys Leu Leu His Ile Ser Phe Arg Leu Ile 65 70 75 80 GAA TCC TGG GAG TAC CCT AGC CAG ACC CTG ATC ATC TCC AAC AGC CTA 288 Glu Ser Trp Glu Tyr Pro Ser Gln Thr Leu Ile Ile Ser Asn Ser Leu 85 90 95 ATG GTC AGA AAC GCC AAC CAG ATC ATG GAA TTC CGA GAA CAG GAC CAG 336 Met Val Arg Asn Ala Asn Gln Ile Met Glu Phe Arg Glu Gln Asp Gln 100 105 110 ATA AAA ACC AAG GAC AGA ACA CAA CAG AGA AAG ACG AAA AGA AGT ACT 384Ile Lys Thr Lys Asp Arg Thr Gln Gln Arg Lys Thr Lys Arg Ser Thr 115 120 125 AAT CGC AGG CGA AGC AAA AAC GAA GAA TTC 414Asn Arg Arg Arg Ser Lys Asn Glu Glu Phe 130 135

【０１７５】配列番号：41 配列の長さ：114 配列の型：核酸鎖の数：二本鎖トポロジー：直鎖状配列の種類：他の核酸配列番号2のＤＮＡ塩基配列の
一部を他の塩基配列に置換したもの配列の特徴特徴を表す記号：CDS 存在位置：1..114 特徴を決定した方法：E 特徴を表す記号：peptide 存在位置：1..38 特徴を決定した方法：E 配列 GAA TTC CGA GAA CAG GAC CAG ATA AAA ACC AAG GAC AGA ACA CAA CAG 48 Glu Phe Arg Glu Gln Asp Gln Ile Lys Thr Lys Asp Arg Thr Gln Gln 5 10 15 AGA AAG ACG AAA AGA AGT ACT AAT CGC AGG CGA AGC AAA AAC GAA AAA 96 Arg Lys Thr Lys Arg Ser Thr Asn Arg Arg Arg Ser Lys Asn Glu Lys 20 25 30 AAG AAA AAA AAG GAA TTC 114 Lys Lys Lys Lys Glu Phe 35

【０１７６】配列番号：42 配列の長さ：99 配列の型：核酸鎖の数：二本鎖トポロジー：直鎖状配列の種類：他の核酸配列番号2のＤＮＡ塩基配列の
一部を他の塩基配列に置換し且つ一部を欠失させたもの配列の特徴特徴を表す記号：CDS 存在位置：1..99 特徴を決定した方法：E 特徴を表す記号：peptide 存在位置：1..33 特徴を決定した方法：E 配列 GAA TTC CGA GAA CAG GAC CAG ATA AAA ACC AAG GAC AGA ACA CAA CAG 48 Glu Phe Arg Glu Gln Asp Gln Ile Lys Thr Lys Asp Arg Thr Gln Gln 5 10 15 AGA AAG ACG AAA AGA AGT ACT AAT CGC AGG CGA AGC AAA AAC GAA GAA 96 Arg Lys Thr Lys Arg Ser Thr Asn Arg Arg Arg Ser Lys Asn Glu Glu 20 25 30 TTC 99 Phe

【図面の簡単な説明】

【図１】プラスミドpSGHE1の造成工程。

【図２】〃 pSGHEC−2 の造成工程。

【図３】〃 pSGHEC−14の造成工程。

【図４】〃 pSGHEC−18の造成工程。

【図５】〃 pSGHEC−18S の造成工程。

【図６】〃 pSGHEC−1414の造成工程。

【図７】プラスミドpSGHE1, pSGHEC−2, pSGHEC −1
4, pSGHEC−18S およびpSGHEC−1414を導入した大腸菌
が生産する融合抗原ポリペプチドのSDS −ポリアクリル
アミドゲル電気泳動の結果。

【図８】プラスミドpSGHEC−14A の造成工程。

【図９】〃 pSGHEC−14B の造成工程。

【図10】プラスミドpSGHEC−14A およびpSGHEC−14B
を導入した大腸菌が生産する融合抗原ポリペプチドのSD
S −ポリアクリルアミドゲル電気泳動の結果。

───────────────────────────────────────────────────── フロントページの続き (51)Int.Cl.⁵ 識別記号庁内整理番号ＦＩ技術表示箇所Ｃ１２Ｎ 15/70 Ｃ１２Ｐ 21/02 Ｃ 8214−4ＢＣ１２Ｑ 1/68 Ｚ 8114−4ＢＧ０１Ｎ 33/569 Ｌ 9015−2Ｊ 33/576 Ｚ 9015−2Ｊ // Ａ６１Ｋ 39/00 Ｚ 8413−4ＣＣ１２Ｎ 15/51 (Ｃ１２Ｎ 1/21 Ｃ１２Ｒ 1:19） (Ｃ１２Ｐ 21/02 Ｃ１２Ｒ 1:19）Ｃ０７Ｋ 99:00 (72)発明者関根進フランス国パリ 75015 リユプラメ 14 (72)発明者杉本整治東京都町田市中町３−９−10 (72)発明者好田肇神奈川県相模原市磯部９−18 (72)発明者森秀治静岡県駿東郡長泉町下土狩1188 (72)発明者有馬暉勝岡山県岡山市一宮196−29

Claims

【特許請求の範囲】

【請求項１】Ｃ型肝炎関連抗原に由来する抗原ポリペ
プチド（以下Ｃ型肝炎関連抗原ポリペプチドと略記す
る）の少なくとも１つと、該抗原ポリペプチドとは異種
のポリペプチド（以下異種ポリペプチドと略記する）の
少なくとも１つとが融合した融合抗原ポリペプチド。
【請求項２】異種ポリペプチドがシロザケ成長ホルモ
ンのポリペプチドまたはその一部であり、かつヒト血清
中の抗体と特異的に反応しないものである請求項１記載
の融合抗原ポリペプチド。
【請求項３】Ｃ型肝炎関連抗原ポリペプチドが配列番
号１−３，４１および42から選ばれる配列を有するポリ
ペプチドである請求項１記載の融合抗原ポリペプチド。
【請求項４】Ｃ型肝炎関連抗原ポリペプチドとシロザ
ケ成長ホルモンのポリペプチドとがメチオニンを介して
結合した形のポリペプチドである請求項１記載の融合抗
原ポリペプチド。
【請求項５】Ｃ型肝炎関連抗原ポリペプチドをコード
するＤＮＡの少なくとも１つと異種ポリペプチドをコー
ドするＤＮＡの少なくとも１つとが組み込まれた組換え
体プラスミド。
【請求項６】異種ポリペプチドがシロザケ成長ホルモ
ンのポリペプチドまたはその一部であり、かつヒト血清
中の抗体と特異的に反応しないものである請求項５記載
の組換え体プラスミド。
【請求項７】Ｃ型肝炎関連抗原ポリペプチドをコード
するＤＮＡが配列番号１−３，４１および４２から選ば
れる配列を有するＤＮＡである請求項５記載の組換え体
プラスミド。
【請求項８】Ｃ型肝炎関連抗原ポリペプチドとシロザ
ケ成長ホルモンのポリペプチドとがメチオニンを介して
結合したポリペプチドをコードするＤＮＡが組み込まれ
た組換え体プラスミド。
【請求項９】プラスミドpSGHEC−２、pSGHEC−１４、
pSGHEC−１８、pSGHEC−１８Ｓ、pSGHEC−１４１４、pS
GHEC−１４ＡおよびpSGHEC−１４Ｂから選ばれる請求項
５記載の組換え体プラスミド。
【請求項10】５−９から選ばれる請求項記載の組換え
体プラスミドを保有する微生物を培地に培養し、培養物
中に融合抗原ポリペプチドを生成蓄積させ、該培養物か
ら融合抗原ポリペプチドを採取することを特徴とする融
合抗原ポリペプチドの製造法。
【請求項11】微生物がエッシェリヒア・コリに属する
請求項１０記載の製造法。
【請求項12】Ｃ型肝炎関連抗原ポリペプチドとシロザ
ケ成長ホルモンのポリペプチドとがメチオニンを介して
融合した融合抗原ポリペプチドを抗原物質として用いる
免疫学的方法により試料中の抗Ｃ型肝炎ウイルス（ＨＣ
Ｖ）抗体を検出する抗ＨＣＶ抗体の検出法。
【請求項13】免疫学的方法が、ラジオ・イムノアッセ
イ，エンザイム・イムノアッセイ，フルオレッセンス・
イムノアッセイ，逆受身凝集反応，フィトヘマトアグリ
チネーション，パーティクルアグリチネーション，レー
ザーネフロメトリー，ウエスタン・ブロッティングおよ
び免疫溶血反応（赤血球またはリポソームを用いる方
法）から選ばれる請求項１２記載の検出法。
【請求項14】固相にコーティングされた抗原物質を用
いる請求項１３記載の検出法。
【請求項15】固相が、合成樹脂、ガラス製のチュー
ブ、ガラス製のビーズまたはガラス製のマイクロタイタ
ープレイトである請求項１４記載の検出法。