WO1991006567A1 - M-csf derivative, expression vector of said derivative, product of transformation by said vector, and production of them - Google Patents

M-csf derivative, expression vector of said derivative, product of transformation by said vector, and production of them Download PDF

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WO1991006567A1
WO1991006567A1 PCT/JP1990/001439 JP9001439W WO9106567A1 WO 1991006567 A1 WO1991006567 A1 WO 1991006567A1 JP 9001439 W JP9001439 W JP 9001439W WO 9106567 A1 WO9106567 A1 WO 9106567A1
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ser
leu
val
trp
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Application number
PCT/JP1990/001439
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English (en)
French (fr)
Inventor
Masayuki Takahashi
Satoru Nakai
Tsutomu Nishida
Masaaki Takano
Yasuyo Sekiguchi
Kazuya Yamanishi
Yasukazu Omoto
Hiroyuki Ichikawa
Yoshikatsu Hirai
Original Assignee
Otsuka Pharmaceutical Co., Ltd.
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Publication date
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    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K14/00—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
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    • C07K14/435—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof from animals; from humans
    • C07K14/52—Cytokines; Lymphokines; Interferons
    • C07K14/53—Colony-stimulating factor [CSF]
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K38/00—Medicinal preparations containing peptides

Definitions

  • M—CSF derivative vector for expressing the derivative, transformant transformed with the vector, and method for producing the same
  • the present invention relates to a human colony-stimulating factor (CSF) useful as a medicament, particularly a derivative of recombinant human CSF, an expression vector of the derivative, and a vector transformed with the vector. And a method for producing the same.
  • CSF human colony-stimulating factor
  • CSF is known to stimulate the proliferation and differentiation of granulocyte progenitor cells and macrophage progenitor cells, and such CSF has a G-type having specificity for granulocyte formation.
  • G-CSF M-type specific for macrophage formation (M-CSF) and GM-type that promotes both granulocyte and macrophage formation (GM-CSF) is known.
  • Multi-CSF ulti-CSF; IL-3 is also known as a CSF acting on pluripotent stem cells.
  • CSF is thought to reduce leukocyte depletion, a common drawback during cancer chemotherapy and radiation therapy, and clinical studies have been conducted from this viewpoint.
  • CSF has an action of promoting the function of leukocytes [Lopez, AF et al., J. Immunol., 131, 2983 (1983); (Handam, E. et al.), 122, 1134 (1979), and Vadas, MA et al., 130, 795 (1983)], suggesting that various infectious diseases can be prevented. And its effectiveness as a therapeutic agent has been confirmed. Furthermore, CSF has a differentiation-inducing effect r, and sotcalf et al. (Metcalf, D. et al., Int.
  • AGR-ON is a cultured cell line derived from human leukemia T cells, which can always produce large amounts of CSF in a homogeneous state.
  • the present inventors have further refined the CSF produced by the AGR-ON, and as a result, have developed a method for obtaining the CSF in a pure form easily and with a high yield.
  • the structural and biochemical characteristics of the CSF used were elucidated, and the invention relating to CSF as a substance was completed (see Japanese Patent Application Laid-Open No. 62-169799).
  • the present inventors have transformed the gene encoding the CSF, the vector containing the gene, and the vector for producing the CSF by a genetic engineering technique.
  • the COS cell expression system, the E. coli secretion expression system, and the CHO cell expression system were developed, respectively, and a patent application was filed for an invention relating to this system (see Japanese Patent Application Laid-Open No. Hei 10-17676).
  • a main object of the present invention is to provide a technique for producing a biologically active derivative of human M-CSF by utilizing a genetic engineering technique, and a novel technique which is obtained by the technique and is particularly useful as a medicine.
  • Human M Dermat Endothelial growth factor
  • the amino acid primary sequence represented by the following formula (1) has a C-terminal in any of the regions from Thr at position 151 to position V & 1 at position 52, Biologically active recombinant human M_CSF derivative, characterized by having an amino acid primary sequence which may have Met added to the N-terminus or N-terminal Val deleted, especially From the 1st position Val to the 182nd position Ala, from the 1st position Val to the 21st position Po, and from the 1st position Val to the 25th position of the amino acid primary sequence represented by the formula (1)
  • the human M-CSF derivative of the present invention has M-CSF activity, and based on its biological activity, as described above, for example, as a drug for preventing and treating diseases associated with leukopenia or pathological conditions, It is useful in the pharmaceutical field as an aid for bone marrow transplantation, as an agent for preventing and treating various infectious diseases, and as an anticancer agent.
  • the human M-CSF derivative of the present invention is a recombinant M-CSF derivative obtained using E. coli as a host by genetic engineering techniques. It is useful in.
  • the derivatives of the present invention have a half-life in blood equivalent to that of M-CSF expressed in animal cells and having a molecular weight of about 8500 [shown in Reference Example 1 described below].
  • the M-CSF derivative expressed in E. coli having M-CSF activity has a long half-life in blood in the body, and is more effective than M-CSF expressed in animal cells. In addition, it can be easily and uniformly manufactured at low cost.
  • the human M-CSF derivative of the present invention uses a gene encoding the human M-CSF derivative to express the gene in a host cell.
  • the recombinant M-CSF derivative of the present invention is produced by preparing a recombinant DNA, introducing it into a host cell, transforming the transformed DNA, and culturing the transformed strain.
  • the gene may be any of various human cells having the ability to produce M-CSF, more specifically and advantageously the above-mentioned AGR-ON [human having characteristics described in Japanese Patent Application Laid-Open No. 59-169489].
  • Extraction procedures for the isolation of mRNA include, for example, the Guanidinium / Hot Phenol method, T. Maniatis, E.F.Fritsch and J, Sambrook, Molecular Cloning, pl94-195 (Cold Spring Harbor Laboratory), 1982] and guanidium Z cesium chloride method
  • Conversion to cDNA that is, the synthesis of the target gene, is performed, for example, by the talented gamberg method. Okayamaand P. Berg, Molecular and Cellular Biology, vol.3, p280 (1983)] —Hoffman method [V. Gubler and B. J. Hoffman, Gene, vol. 25, P263-269 (1983)], etc., and a transformation method by introducing the DNA thus obtained into host cells;
  • the selection of a strain having the desired M-CSF cDNA from the transformant can be carried out by any conventional method. The details of these methods are as disclosed in the above-mentioned Japanese Patent Application Laid-Open No. 1104176.
  • M-CSF gene used in the present invention those described in the publication can be advantageously used.
  • the above gene can also be produced by chemical synthesis of nucleic acids according to a conventional method such as the phosphite triester method [Nature, 31, 105 (1984)].
  • various operations and means such as enzymatic treatment for the purpose of partial chemical synthesis of DNA, cleavage, deletion, addition or binding of DNA, DNA isolation, purification or duplication, and selection are performed.
  • the isolation and purification of the above DNA can be performed by agarose gel electrophoresis or the like, and the modification of a part of the codon of the nucleic acid sequence is cytosolic? ⁇ Ichiyu Genesis (Site-Specific .Mutagenesis)
  • the determination and confirmation of the DNA sequence of the target gene obtained according to the above method can be performed, for example, by the Maxam-Gilbert chemical modification method, Meth. Enzym., 65, 499-560 (1980)) or Didoxynucleotide chain termination using M13 phage
  • the human M-CSF derivative of the present invention can be easily produced and obtained in large quantities by the gene recombination technique using the gene obtained above.
  • the method comprises the steps of:
  • (DNA) is indispensable, and can be basically performed according to a general gene recombination technique (see, for example, Molecular Cloning, T. Maniatis et al., Cold Spring Harbor Laboratory (1982)).
  • a recombinant DNA capable of expressing the gene of the present invention in a host cell may be prepared, introduced into a host cell, transformed, and the transformed strain may be cultured.
  • any of eukaryotes and prokaryotes can be used, and Escherichia coli / Bacillus subtilis is often used as a prokaryotic host.
  • a plasmid that can be replicated in the host bacterium is used.
  • a promoter and an SD (Shin * and-Dalgarno) sequence, as well as an initiation codon (eg, ATG) necessary for the initiation of protein synthesis are placed upstream of the gene so that the gene can be expressed.
  • the provided expression plasmid can be used.
  • Escherichia coli K12 strain or the like is often used as Escherichia coli as the host bacterium, and pBR322 is generally used as a vector.
  • the strain is not limited thereto, and any of various known strains and vectors can be used.
  • the promoter for example, a trip phan (trp) promoter, an lpp promoter, a lac promoter, a PL promoter and the like can be used.
  • the target gene can be expressed.
  • One preferred method for producing the human M-CSF derivative of the present invention using the above gene is a 2-cistron method using a prokaryote such as Escherichia coli as a host cell. Examples of the method for expressing the target protein can be exemplified. This method is a gene expression system consisting of two consecutive cistrons, and according to this method, a desired human M-CSF derivative can be stably produced and accumulated in a host cell in a large amount.
  • the production of the human M-CSF derivative of the present invention according to the 2-cistron method will be described in detail.
  • a suitable polypeptide as a first cistron is used.
  • Code An expression plasmid containing two cistrons of the gene to be expressed and the gene of the present invention as a second cistron is prepared.
  • the plasmid also has a promoter and an SD sequence for expression of the gene located upstream of the first cistron, and a second cis downstream of and upstream of the second cistron.
  • Synthetic linker containing the SD sequence for the expression of the tron, the stop codon of the first cistron, and the start codon of the second cistron in this order. is important.
  • the gene for the above-mentioned yeast cistron may be a synthetic gene or a gene derived from a natural product.
  • the polypeptide is hydrophobic and is different from the derivative of the present invention. It is preferred that they have sufficiently separated molecular weights.
  • the first cistron encodes such a polypeptide. Specific examples thereof include genes coding for IL-2, IFN- ⁇ - ⁇ , -r, and the like, and fragments thereof.
  • trp promoter Isseki one, tac promoter, p L promoter, p D flop port motor, IPP Promoter, OmpA promoter, lac promoter, etc., particularly preferably the trp promoter.
  • a sequence of 3 to 9 base pairs capable of forming a hydrogen bond with the 3 'end, for example, GGAG, AGGA and the like can be exemplified.
  • a plasmid containing the M-CSF gene is first cleaved with an appropriate restriction enzyme, and a fragment containing the M-CSF gene is isolated and purified according to a conventional method.
  • Linker is synthesized according to a conventional method, for example, using a DNA synthesizer, etc.
  • a piece is ligated to the upstream side of the M-CSF gene using T4 DNA ligase or the like, and the obtained DNA fragment is then inserted into a predetermined position of a plasmid capable of expressing the first cistron.
  • the method can be exemplified.
  • the DNA fragment is converted into an appropriate protein expression system.
  • the expression plasmid suitable for the desired 2 • cistronic method can also be obtained by a method of incorporating the plasmid into a plasmid having the following expression.
  • a desired transformant By introducing the plasmid obtained above into an appropriate host cell and transforming it, a desired transformant can be obtained by the 2-cistron method, and according to the use of the transformant, In addition, a protein relating to fast cistron and a desired human M-CSF derivative relating to second cistron can be separately expressed. These can be analyzed and confirmed by ordinary methods such as SDS-PAGE and Western plotting, and can be separated and purified by various methods described below.
  • the desired transformant thus obtained can be cultured according to a conventional method, and the culture produces and accumulates a human M-CSF derivative.
  • the medium used for the culture various media commonly used according to the host cells used are appropriately selected and used. it can.
  • LB medium, E medium, M9 medium, M63 medium, etc. can be used for culture of a transformant using E. coli or the like as a host cell.
  • Various carbon sources, nitrogen sources, inorganic salts, vitamins, natural product extracts, bioactive substances and the like can be added.
  • the culture conditions for the transformant conditions suitable for the growth of the host cell can be used.
  • the pH is about 5 to 8, preferably 7 or near, and the temperature is about 20 to 4 3.
  • C ⁇ Preferably, 37 ° C or around can be adopted.
  • the desired human M-CSF derivative of the present invention is produced and accumulated in the cells of the transformant.
  • the method can be separated and purified by various separation operations utilizing its physical properties, chemical properties, and the like.
  • Specific examples of the method include ordinary reconstitution treatment, treatment with a protein precipitant, centrifugation, osmotic shock, ultrasonic crushing, ultrafiltration, molecular sieve chromatography ( Gel chromatography), adsorption chromatography, ion exchange chromatography, affinity chromatography, high-performance liquid chromatography (HPLC), etc.
  • Examples of such methods include chromatographic methods, dialysis methods, combinations of these methods, and the like.
  • the human M-CSF derivative of the present invention obtained in this manner has a N-terminal amino acid depending on the gene used for its production, the type of expression system for expressing the gene, and the like.
  • the Met residue corresponding to the start codon may be added to the N-terminus during the expression of the derivative of the present invention, although the amino acid sequence and molecular weight may be slightly different. They have common points.
  • the human M-CSF derivative obtained above can be used as various pharmaceuticals based on its biological activity.
  • the human M-CSF derivative of the present invention is prepared in the form of a pharmacological composition containing an effective amount thereof together with an ordinary non-toxic pharmaceutically acceptable carrier. It is administered by various administration routes according to.
  • a liquid form for example, a solution, suspension, emulsion or the like is usually employed, which is generally administered orally, intravenously, subcutaneously, intradermally, or intramuscularly.
  • the derivative of the present invention is not limited to the form and administration route, and can be prepared into various preparation forms suitable for other commonly used oral and parenteral administrations, and the addition of a suitable carrier before use.
  • the dosage of the above preparation is appropriately determined depending on the desired pharmacological effect, type of disease, age of the patient, sex, degree of disease, etc., and is not particularly limited. It may be administered once or several times a day in an amount of about 0.01 to 1 mgZkgZ protein day.
  • Reference Example 1 a production example of a human M-CSF derivative expressed in CH 0 cells used in Examples for reference will be given as Reference Example 1, and then a production method of the human M-CSF derivative of the present invention will be described.
  • Reference Example 2 Examples of the method for producing a raw material plasmid and the production of M-CSF derived therefrom are described as Reference Example 2, and the production examples of the derivative of the present invention, its characteristics, and the like are described as Examples, and the present invention is described. Further details will be described.
  • each human M-CSF derivative is defined as follows.
  • E. coli M-produced in an expression vector containing an amino acid from Val 1 to Thr 151 in the amino acid sequence represented by formula (1) represented by formula (1)
  • the CSF molecule is referred to as "E. coli [3-153] M-CSF”.
  • a CSF molecule produced by an expression vector containing an amino acid sequence from Val at position 1 to Pro at position 212 is referred to as "E. coli [3-214] M-CSF ".
  • the CH 0 cells obtained in Reference Example 1 were used as hosts, and a mature human M-CSF consisting of 32 amino acid sequences and 52 amino acid sequences was used as a host.
  • the M-CSF derivative produced by an expression vector encoding a protein is called "CH0 [-32-522] M-CSF" Call.
  • the numbers in curly brackets are based on the fact that the N-terminal region of M-CSF produced in CH0 cells has a structure in which two more residues (Glu-Glu) are added upstream of Val at position 1 in the formula.
  • the CSF activity of the sample obtained in each example shall be measured by the following method.
  • Fetal bovine serum (FCS) 20: ⁇ The solution obtained by mixing medium 30 and double concentration 1 medium 20 ⁇ is kept at 37 ° C, and the 23.3 is preliminarily added to 50 Mix with 1% agar solution (manufactured by Difco) kept at 37 ° C and keep at 37 ° C
  • the number of colonies thus generated is counted using a stereo microscope. And as an indicator of CSF activity.
  • UZ ⁇ As the unit of CSF activity (UZ ⁇ ), a value calculated from the above number of colonies according to the following equation (a) was used.
  • the target protein was detected according to the Western blotting method. The western blotting is performed using a transfer blot cell manufactured by Biorad, and the transferred nitrocellulose membrane is blocked with PBS containing 1% skim milk, and then subjected to M-CSF.
  • the detection of the M—CSF band was The reaction was carried out by reacting a trocel mouth membrane with a 4-chloro-1-naphthalate solution as a chromogenic substrate.
  • the above-mentioned CH0 cell culture supernatant 69.3 9. was concentrated by ultra-superconcentration. After obtaining 5% to 65% saturated ammonium sulfate precipitation fraction, dissolve in distilled water and
  • a column (5 x 25 cm) packed with about 500 Con A- Sepharose gel was applied to a 20 mM sodium phosphate buffer solution containing 0.15 M NaC (p H After equilibration in 4), apply the above sample solution, wash well with the same buffer, and then use the same buffer containing 0.5 M methyl-like D-mannoside. Elution was performed. All the eluate was concentrated by ultrafiltration using a YM-110 membrane, and the buffer was replaced with 2 OmM sodium phosphate buffer (pH 7.4). The sample was subjected to anion-exchange high-performance liquid chromatography in seven times.
  • Eluent B 40 mM sodium phosphate buffer containing 0.1 M NaC ⁇ (pH 7.4)
  • the target M—CSF was eluted in the fraction N ⁇ ⁇ 20-38 (0.1 & to 0.25-M a. C.
  • the active fraction After being pooled, it was concentrated by ultrafiltration (using a YM-10 membrane) and purified as follows: (3) Gel furnace over-high-speed liquid mouth chromatography
  • the reduced sample 12 ⁇ obtained in the above (3) was purified in eight times under the following conditions.
  • the above concentrate was mixed with an equal volume of 20 mM sodium phosphate buffer (pH 7.4) containing 80% saturated ammonium sulfate before injection into the column, and then subjected to chromatography. did.
  • M-CSF varied slightly depending on the sample used and the experiment, but fraction Nos. 5 to 8 (32% to 34% ⁇ -propanol) Detected in two consecutive fractions between the two.
  • the fractionation was performed in a tube previously containing 0.8 M sodium phosphate per tube.
  • the M-CSF fraction was centrifuged and concentrated to dryness in each tube using a concentrator (manufactured by Tomy Seie), and
  • Prestin Domer As a molecular weight marker, Prestin Domer
  • the molecular weight under non-reducing conditions (2-ME-state) is about 6500
  • amino acid sequence of the N-terminal region of CHO [-32-52 2] M—CSF obtained in (5) above was determined using a gas-phase sequencer (manufactured by Applied Biosystems). .
  • the 50 mM Tris-HCl containing 7.0 M guanidine hydrochloride was added to the M-CSF fraction obtained by the above operation (1).
  • the M—CSF obtained above was purified as follows. (3-D gel super high speed liquid chromatography
  • the centrifuged supernatant obtained in (2) above is concentrated using an ultrafiltration device (Amicon, membrane: YM-10 membrane, Amicon), and the concentrated solution is concentrated to 0%. After passing through a 45 / zm Millipore filter, the gel furnace was subjected to super high speed liquid chromatography under the following conditions. Column: TSK gel G 3 0 0 0 SW (manufactured 6 0 cm x 2 5 mraI ' D. N DOO one source one company)
  • the elution positions of the gel standard HPLC standard protein (Olien Yeast Co., Ltd.), namely, glutamate dehydrogenase (molecular weight 290,000), lactate dehydrogenase (molecular weight) Judging from 142,000), enolase (molecular weight, 670,000) and adenylate kinase (molecular weight, 324,000), the molecular weight of M-CSF is 32,000. It was estimated to be 0 0 0.
  • the active portion was separated, and the solvent was exchanged with 40 mM sodium borate (pH 8.0) using the above-mentioned ultrafiltration device.
  • Eluent A 40 mM sodium borate buffer containing 5% methanol (pH 8.0)
  • Eluent B Contains l. 0 M NaC and 5% methanol
  • Plasmid P trp IL-2X- -CSF101 was digested with restriction enzymes BstEII and Sail to obtain a 4.7 kb DNA fragment (I) containing IL-12 and M-CSF DNA.
  • polypeptides are coded in a transcription unit under the control of the Escherichia coli tryptophan "promoter.
  • One is a polyamino acid 65-amino acid composed of a methionine for translation initiation, 60 amino acids at the end of human IL-12 amino acid, and 4 amino acids encoded by a synthetic DNA linker.
  • base is a Petit de
  • the other one is the translation start of the Met and the formula (1) of a Mi acid sequence represented by Kuraia Mi Roh acid (v al) from 5 2 0 place a Mi Roh ⁇ (Val ) CSF derivatives with 520 amino acids It is a polypeptide consisting of
  • a human CSF derivative of the amino acid sequence of the formula (1) with the amino acid at the 1-position ( Val ) to the amino acid at the 18-position (Ala) from the amino acid at the 18-position (Ala) It encodes a polypeptide consisting of
  • E. coli HB101 having the desired plasmid P trp IL-2X-M-CSF203 was obtained by transforming one of the competent cells.
  • Plasmid P trp IL-2X-M-CSF201 was digested with restriction enzymes Sphl and Sail to obtain an approximately 5.1 kb Sphl-Sall DNA fragment. Both ends of this DNA fragment were synthesized oligodeoxynucleotides, "5'-CAGTGATAAG-3 'and 5'-TCGACTTATCACTGCATG-
  • the resulting plasmid P tr P IL-2X-M -CSF 205 is E. coli preparative Ributofa emissions transfer under promoter one dominant Yuni' DOO in In the second cistron, Met for translation initiation and 300 amino acids from amino acid (Val) at position 1 to amino acid (Gin) at position 300 of the amino acid sequence of formula (1).
  • Polypeptide consisting of human and CSF derivative with amino acid is encoded.
  • Plasmid P trp IL-2X-M-CSF201 was digested with restriction enzymes Kpnl and Sail to obtain a Kpnl-Sall DNA fragment of about 5.2 kb. Both ends of this DNA fragment were ligated with T4 DNA ligase using synthetic oligodeoxynucleotides [5'_CGCCTGATMG_3, t5'-TCGACTTATCAGGCGGT AC-3 '], and these were transformed into E. coli HB101 competent cells. Conversion yielded E. coli HB101 with the desired plasmid P trp IL-2X- -CSF206.
  • the resulting plasmid, P trp IL-2X-M-CSF206, is located on the second cytostron in the transcription unit under the control of the Escherichia coli tryptophan promoter, and the translation initiation Met and the expression (1) Polyamino acid sequence from amino acid 1 (Val) to amino acid 33 (Ala) at amino acid position 1 (Ala) Coded for peptide.
  • Each plasmid obtained in the above (1) to (6) was transformed into E. coli SG21058 CJ-Bacteriol., 164, 1124-1135 (1985).
  • Transformants [E. coli SG21058 / ptrp IL-2X-M-CSF 201, E. coli SG21058 / ptrp IL-2X- -CSF 202, E. coli SG21058 / p trp IL-2X-M-CSF 203, E. coli SG21058 / p trp IL-2X-M- CSF 204, E. coli SG21058 / p trp IL-2X-M- CSF 205 and E. coli SG21058 / p trp IL-2X-M-CSF 206;].
  • Western blotting is carried out using a Nokiolad trans-blot cell, and a trans-fed nitrocellulose membrane containing 1% bovine serum albumin. After blocking with PBS ", the cells were reacted with an anti-heron antiserum against M-CSF, and further reacted with a peroxidase-labeled goat anti-animal antibody (manufactured by Biorad). Detection was performed by reacting the thus obtained nitrose cellulose membrane with a chromogenic substrate, 4-chloro-11-naphthol solution.
  • the M-CSF coded for the second cistron was E- coli SG21058 / ptrp IL-2X-M-CSF 202— E. coli SG21058 / ptrp IL-2X-M-CSF 203, E. coli SG21058 / p trp IL-2X-M-CSF 204, E. coli SG21058 / p trp IL-2X-M-CSF205 and E. coli SG21058 / p trp IL-2X-M-CSF 206, Each was detected at the expected molecular weight position.
  • Escherichia coli SG21058 holding the plasmid P trp IL-2X- -CSF203 obtained in (3) above was added to 50 g (wet weight) of 50 mM Tris-HCl buffer (50 mM). pH 7.0) was added to bring the total amount to 10, and the mixture was thoroughly stirred. Next, 4 mg of lysozyme 4 was added, followed by 0.14 MEDTA 8 3 ⁇ 4 ⁇ . After agitation treatment with C for 15 minutes, sonication (200 KHz, 2 minutes, 200 W) is performed, and then 10000 rotations CT / JP90 / 01439
  • Eluent A 50 mM sodium phosphate containing 30% saturated ammonium sulfate
  • M-CSF activity was eluted in fractions of fractions 40 to 42 (saturated ammonium sulfate concentration of 8 to 6%).
  • the active portion was separated, and the solvent was exchanged with 50 mM sodium phosphate (pH 7.4) using the above-mentioned ultrafiltration apparatus, and the DEAE-5 PW ion exchange was performed under the following conditions. High-speed liquid mouth A matrix was performed.
  • Eluent B 50 mM sodium phosphate buffer containing 1.0 M NaC ( ⁇ 7.4)
  • P trp IL-2X-M-CSF109 two types of polypeptides are coded in the transcription unit under the control of the Escherichia coli tributophan promoter.
  • One of them is a polypeptide of 65 amino acids consisting of Met for translation initiation, 60 amino acids at the end of human IL-2 amino acid, and 4 amino acids generated by a synthetic linker DNA sequence.
  • the other is the Met for translation initiation and the amino acid sequence represented by formula (1) from the amino acid at position 2 (Ser) to the amino acid at position 151 ( T hr). It is a polypeptide consisting of 150 amino acids.
  • Plasmid P trp IL-2X-M-CSF109 was digested with restriction enzymes BstEII and Sail to obtain a DNA fragment of about 1.5 kb.
  • restriction enzymes BstEII and Sail was cut with plasmid P tr P IL-2X-M -CSF 202 similarly restriction enzyme BstEII and Seal, to obtain a DNA fragment of about 3. 3 kb.
  • the above DNA fragments are ligated using T4 DNA ligase and transformed into a competent cell of Escherichia coli HB101 to have the desired plasmid P trp IL-2X- -CSF402. E. coli HB101 was obtained.
  • the plasmid P trp IL-2X-M-CSF402 obtained in this manner contains the translation initiation Met and expression in the second cistron in the transcription unit under the control of the E. coli triptophan promoter. From the amino acid sequence (Ser) at position 2 to the amino acid at position 182 (Ala) in the amino acid sequence of (1), the human and the amino acids at position 181
  • Plasmid P trp IL-2X-M-CSF109 was digested with BstEII and Seal to obtain a DNA fragment of about 1.5 kb.
  • the plasmid P trp IL.-2X- -CSF203 was similarly cut with the restriction enzymes BstEII and Seal to obtain a DNA fragment of about 3.4 kb / O.
  • the above two DNA fragments are ligated using T4 DNA ligase and transformed into a competent cell of Escherichia coli HB101 to have a desired plasmid P trp IL-2X-M-CSF403. E. coli HB101 was obtained.
  • Plasmid P trp IL-2X-M-CSF109 was digested with BstEII and Seal to obtain a DNA fragment of about 1.5 kb.
  • the plasmid P trp IL-2X-M-CSF20 was similarly cleaved with the restriction enzymes BstEII and Seal to obtain a DNA fragment of about 3.5 kt .
  • Brasmid P trp IL-2X-M-CSF404 is located in the second cistron in the transcription unit under the control of the Escherichia coli tryptophan promoter, and the translation initiation Met and the expression (1 ) Of the amino acid sequence from amino acid 2 (Ser) to amino acid 25 (Gly) in the amino acid sequence
  • the plasmid P trp IL-2X-M-CSF109 was digested with BstEII and Seal to obtain a DNA fragment of about 1.5 kb.
  • the above two DNA fragments are ligated using T4 DNA ligase, and this is transformed into a competent cell of Escherichia coli HB101 to obtain E. coli having the desired plasmid P trp IL-2X-M-CSF405. HB101 was obtained.
  • the plasmid P trp IL-2X-M-CSF405 obtained in this way is expressed in the second cistron in the transcription unit under the control of the Escherichia coli tryptophan promoter by the Met and the expression of translation initiation.
  • the human amino acid sequence with the 299 amino acid is expressed in the second cistron in the transcription unit under the control of the Escherichia coli tryptophan promoter by the Met and the expression of translation initiation.
  • Plasmid P trp IL-2X-M-CSF109 was digested with BstEII and Seal to obtain a DNA fragment of about 1.5 kb.
  • the plasmid P trp IL-2X-M-CSF206 was similarly digested with the restriction enzymes BstEII and Seal to obtain a DNA fragment of about 3.7 kb.
  • E. coli HB101 was obtained.
  • the amino acid sequence of (1) is composed of a polyamino acid sequence from amino acid (Ser) to amino acid (Ala) 332 to amino acid (Ala). Coded peptide.
  • E. coli SG21058 strain [J-Bacteriol., 164, 1124-1135 (1985)] by a transformation method.
  • Transformants E. coli SG21058 / p trp IL-2X-M-CSF 109, E. coli SG21058 / p trp IL-2X-M-CSF 402, E. coli SG21058 / p trp IL-2X-M, respectively -CSF 403, E. coli SG21058 / p trp IL-2X-M-CSF 404, E. coli SG21058 / p trp IL-2X-M-CSF 405 and E. coli SG21058 / p trp IL-2X-M-CSF Named 406:].
  • transformants were transformed into LB medium containing 50 gZ ⁇ of ampicillin (T. Maniatis, E.F.Fritsch and J.
  • the M-CSF coded for the second cistron was E. coli SG21058 / ptrp IL-2X-M-CSF109 and E. coli SG21058 / ptrp IL-2X-M-CSF. 402, E. coli SG21058 / p trp IL-2X-M-CSF 403, E. coli S621058 / p trp IL-2X-M-CSF404, E. coli SG21058 / p trp IL-2X-M-CSF405 and E In E. coli SG21058 / p trp IL-2X--CSF 406, it was detected at the position of the expected molecular weight, respectively.
  • Escherichia coli SG21058 holding the plasmid P trp IL-2X-M-CSF109 obtained in (1) above was added to 7.5 g (wet weight) of Escherichia coli SG 210508 in 5 OmM Tris-HCl buffer ( pH 7.0) was added to bring the total amount to 10, and the mixture was thoroughly stirred. Next, 6 mg of lysozyme 2 mg, followed by 0.14 MEDTA 4 were added, and the mixture was stirred with 4 for 15 minutes, followed by sonication (20 KHz, The mixture was centrifuged at 100 rpm for 20 minutes and centrifuged at 100 rpm for 20 minutes to obtain a precipitate.
  • the centrifuged supernatant obtained in the above (2) was purified as follows. (3-D hydrophobic high performance liquid mouth chromatography
  • the M-CSF activity was eluted in the fraction with an ammonium sulfate concentration of 11 to 6%.
  • the active portion was separated, and the solvent was exchanged with 40 mM sodium phosphate (pH 7.4) in the above-mentioned ultra-filtration furnace.
  • Eluent B 50 mM sodium phosphate buffer (pH 7.4) containing 1.0 M NaC
  • N-terminal amino acid sequence of [4-153] -M-CSF was determined using a gas-phase sequencer (Applied * Biosystems).
  • E. coli harboring plasmid P trp IL-2X- -CSF101 To 7.5 g (wet weight) of SG21058 strain, 1.0 ⁇ of 50 mM Tris-HCl buffer (pH 7.0) was added, followed by sufficient stirring. Next, add 4 mg / ⁇ of lysozyme and EDTA to a final concentration of 10 mM, stir at 4 ° C for 15 minutes, and sonicate (20 KHz, 10 minutes,
  • the centrifuged supernatant obtained in the above (2) was purified as follows.
  • Eluent A 40 mM sodium phosphate buffer containing 30% saturated ammonium sulfate (pH 7.4)
  • the M—CSF activity was eluted in the fraction with an ammonium sulfate concentration of 6 to 3%.
  • the active portion was separated and subjected to solvent exchange with 40 mM sodium phosphate (pH 7.4) in an ultrafilter.
  • Eluent B 40 mM sodium phosphate buffer (pH 7.4) containing 1.0 M NaC ⁇
  • the separation was carried out by first separating normal rabbit herb serum 100 ⁇ that was diluted 400-fold with 0.1% BSAZPBS / 0.05% thimerosal, and anti-heron Ig similarly diluted 40-fold.
  • G serum 1 0 0 ⁇ , and 2 0 0 ⁇ PBS to 1 2.
  • 5% polyethylene glycol were dissolve the added and reacted for 3 0 min 4 e C, centrifuged at 1 5 min 3 0 0 0 rpm Then, decantation is performed to obtain a sediment which is a conjugate of the labeled M-CSF and the antibody. Sediment is gamma counter 1 After counting for one minute, a standard curve was created from the standard solution. The sample number containing the M-CSF derivative of the present invention was sampled, and the above operation was repeated to measure the number of counts. Plot above to determine the concentration of M-CSF in the sample.
  • the unit in the table is ng /.
  • the half-life in blood of CSF is found to be 46.2 minutes and 53.0 minutes, respectively.
  • the polyclonal antibody against M-CSF used in the above RIA has the following properties.
  • the polyclonal antibody used in the present invention was prepared by the following method.
  • One of the three antibodies obtained was named OCT511 and stored at 180.
  • the polyclonal antibody 0CT511 used for measuring the blood half-life of the derivative of the present invention has the following properties.
  • the antibody titer of OCT511 was 800 2 Neutralizing activity
  • Neutralizing activity was determined by the colony assay using mouse bone marrow cells.
  • the neutralizing activity of 0CT511 was determined to be CH0 [-32-522] -M-CSF per OCT511. 1-2 X
  • This 0CT511 does not cross mouse CSF (culture supernatant of L-Cell) and human GM-CSF (Amersham) at all, and furthermore, human IL-1 ⁇ (JP-A-63-164899). No. 1), IL-1; 5 (see JP-A-63-152398), IL-12 (Amersham), and TNF- ⁇ (Amersham) did not cross at all.

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Description

明 細 書
M— C S F誘導体、 該誘導体発現ベク ター、 該べクターで形質転換された形質転換体及び 之等の製造方法
技 術 分 野
本発明は、 医薬と して有用なヒ トのコロニー刺激因子 (Colony-Stimulating Factor 、 C S F ) 殊に組換え 型ヒ ト Μ— C S Fの誘導体、 該誘導体の発現べクタ一、 該ベクターで形質転換された形質転換体、 及び之等の製 造方法に関する。
従 来 の 技 術
一般に、 造血細胞の増殖、 分化には特定の増殖及び分 化因子が必要とされており、 最終的に成熟した各種の血 球、 例えば赤血球、 顆粒球、 マクロファージ、 好酸球、 血小板、 リ ンパ球等になるまでの間には、 数多く の分化, 増殖因子が関与している 〔三浦恭定著、 血液幹細胞、 中 外医学社、 1 9 8 3年〕 。 之等の中で顆粒球系前駆細胞 及びマク ロファージ系前駆細胞の増殖、 分化を刺激する ものと して C S Fが知られており、 かかる C S Fには、 顆粒球の形成に特異性を有する G型 （G - C S F ) 、 マ ク ロファージの形成に特異的な M型 （M— C S F ) 及び 顆粒球とマク ロファージの両方の形成を促進する G M型 (GM- C S F) が知られている。 また更に多能性幹細 胞に作用する C S Fと してマルチ C S F ( ulti-CSF； I L— 3 ) も知られている。
上記 C S Fは、 その生物活性に基づき、 癌化学療法及 び放射線療法時の共通した欠点である白血球の減少を軽 減させるものと考えられ、 この観点から臨床研究が行な われている。
また、 上記 C S Fは白血球の機能を促進させる作用を 有することが知られており 〔口ペッ ツら（Lopez, A. F. et al . ) , J. Immunol . , 131， 2983 (1983)、 ハン々 'ムら (Handam, E. et al.) ,同 122, 1134 (1979)及びバダスら (Vadas, M. A. et al.) ,同 130, 795 (1983) 〕 、 このこ とから、 種々の感染症の予防及び治療薬と しての有効性 が確認されている。 更に、 C S Fはその分化誘導作用 r 、ソ 卜カーフら（Metcalf , D. et al .， Int . J.
Cancedr,_30 773 (1982) 〕 に基づき、 骨髄性白血病の 治療剤と して有効性が認められている。
しかして、 C S Fは例えば胎児細胞、 脾細胞等の培養 液、 人尿、 種々の株化培養細胞の培養液等にその活性が 認められ、 該活性画分と して分離、 利用されているが、 いずれの起源のものも該起源に由来する類似した多量の 夾雑物質等の混在及び C S F自体の濃度の低さが障害と なり、 その製造面で問題を残して.おり、 均質性、 収量、 操作等の面から、 医薬品と しての C S Fを産業的に継続 して得る手段は、 未だ見出されていない。
本発明者らは、 先に C S Fを常時均質な状態で多量産 生することのできる、 ヒ ト白血病 T細胞由来の培養株化 細胞である 「A G R— O N」 を確立し、 該細胞に係わる 発明を特許出願した （特開昭 5 9— 1 6 9 4 8 9号公報 参照） 。 また本発明者らは、 上記 A G R— O Nの産生す る C S Fにっき更にその精製を重ねた結果、 該 C S Fを 純粋な形で簡単にしかも高収率で収得する方法を開発し、 かく して得られる C S Fの構造的特徵及び生化学的特徴 を解明し、 物質と しての C S Fに係わる発明を完成した (特開昭 6 2— 1 6 9 7 9 9号公報参照） 。
更に、 本発明者らは上記 C S Fを遺伝子工学的手法に より製造するための該 C S Fをコー ドする遺伝子、 該遺 伝子を含むベクター、 該ベク ターで形質転換された
C O S細胞発現系、 大腸菌分泌発現系及び C H 0細胞発 現系をそれぞれ開発し、 之等に係わる発明を特許出願し た （特開平 1 — 1 0 4 1 7 6号公報参照） 。
. 本発明の主な目的は、 遺伝子工学的手法を利用して、 ヒ ト M— C S Fの生物活性な誘導体を製造する技術及び 該技術により得られ、 殊に医薬と してより有用な新規な ヒ ト M— C S F誘導体を提供するこ とにある。
発 明 の 開 示
本発明によれば、 下式 （ 1 ) で表わされるア ミ ノ酸一 次配列の 1 5 1位 Thr から 5 2 0位 V&1 までの領域のい ずれかに C末端を有し、 該配列の N末端に Met を付加さ れるか又は N末端 Val を欠失されることのあるア ミ ノ酸 一次配列を有することを特徵とする、 生物活性な組換え 型ヒ ト M_ C S F誘導体、 殊に下式 （ 1 ) で表わされる ァ ミ ノ酸一次配列の 1位 Val から 1 8 2位 Ala まで、 1 位 Val から 2 1 2位 P o まで、 1位 Val から 2 5 6位
Gly まで、 1位 Val から 3 0 0位 Gin まで、 1位 VaJL か ら 3 3 2位 Ala まで及び 1位 Val から 5 2 0位 Val まで、 のいずれかのア ミ ノ酸一次配列を有するか或は 2位 Ser から 1 5 1位 Thr まで、 2位 Ser から 1 8 2位 Ala まで、 2位 Ser から 2 1 2位 P o まで、 2位 Ser から 2 5 6位 Gly まで、 2位 Ser から 3 0 0位 Gin まで及び 2位 Ser から 3 3 2位 Ala まで、 のいずれかのァ ミ ノ酸一次配列 を有し且つ之等それぞれのア ミ ノ酸配列の N末端に更に Met を付加されるこ とのあるア ミ ノ酸一次配列を有する、 生物活性な組換え型ヒ ト M— C S F誘導体が提供される。 式 （ 1 ) ：
Val - Ser - Glu - Tyr - Cvs- Ser - His - Met - lie - Gly - Ser - Glv - His- Leu - Gin - Ser - Leu - Gin - Arg -！ ieu - 1 le - Asp - Ser - Gin - Met-Glu-Thr-Ser-Cys-Gln-Ile-Thr-Phe-Glu-Phe-Val- Asp-G ln-Glu-Gl n-Leu-Lys- Asp-Pro- Val-Cys -Tyr- Leu- Lys-Lys-Ala-Phe-Leu-Leu-Val -Gin-Asp- I le-Met-Glu- Asp-Thr-Met-Arg-Phe-Arg-Asp-Asn-Thr-Pro-Asn-Ala- I le - Ala - 1 le - Val - Gin - Leu - Gin - Glu - Leu - Ser - Leu - Arg -
Leu-Lys-Ser-Cys-Phe-Thr-Lys-Asp-Tyr-Glu-Glu-His- Asp - Lys- Ala - Cys - Val - Arg - Thr - Phe - Tyr - Glu - Thr - Pro -
Leu-Gln-Leu-Leu-Glu-Lys-Val-Lys-Asn-Val-Phe-Asn-
Glu - Thr - Lys - Asn - Leu - Leu - Asp - Lys - Asp - Trp - Asn - 1 le -
Phe - Ser - Lys - Asn—Cys - Asn - Asn - Ser - Phe - Ala - Glu - Cys - Ser - Ser - Gin - Asp - Val - Val-Thr - Lys- Pro - Asp - Cys - Asn - Cys - Leu - Tyr - Pro—Lys - Ala - 1 le— Pro - Ser - Ser - Asp— Pro -
Ala-Ser-Val-Ser-Pro-His-Gln-Pro-Leu-Ala-Pro-Ser-
Met-Ala-Pro-Val-Ala-Gly-Leu-Thr-Trp-Glu-Asp-Ser-
Glu-Gly-Thr-Glu-Gly-Ser-Ser-Leu-Leu-Pro-Gly-Glu- Gln-Pro-Leu-His-Thr-Val-Asp-Pro-Gly-Ser-Ala-Lys- Gln-Arg-Pro-Pro-Arg-Ser-Thr-Cys-Gln-Ser-Phe-Glu-
Pro-Pro-Glu-Thr-Pro-Val-Val-Lys-Asp-Ser-Thr-Ile-
Gly - Gly - Ser - Pro - Gin - Pro - Arg - Pro - Ser— Val - Gly - Ala -
Phe - Asn - Pro - Gly - Met - Glu - Asp— I le - Leu - Asp - Ser— Ala-
Met - Gly - Thr - Asn - Trp - Val - Pro - Glu - Glu - Ala— Ser - Gly - Glu-Ala-Ser-Glu- I le-Pro-Val-Pro-Gln-Gly-Thr-Glu- Leu - Ser - Pro - Ser - Arg - Pro - Gly-Gly - Gly - Ser- Met - G in - Thr-Glu-Pro-Ala-Arg-Pro-Ser-Asn-Phe-Leu-Ser-Al a- Ser - Ser - Pro - Leu - Pro - Ala - Ser - Ala - Lys - G ly - G in - Gin - Pro-Al a-Asp-Val -Thr-Gly-Thr-Ala-Leu-Pro-Arg-Val - Gly-Pro-Val-Arg-Pro-Thr-Gly-Gln-Asp-Trp-Asn-Hi s- Thr-Pro-Gln-Lys-T r-Asp-His-Pro-ser-Al a-Leu-Leu- Arg - Asp - Pro - Pro - Glu - Pro - Gly - Ser - Pro - Arg- I le - Ser - Ser - Pro - Arg - Pro - Gin - GJLy - Leu - Ser - Asn - Pro - Ser- Thr - Leu - Ser - Ma- Gin - Pro - Gin - Leu - Ser - Arg - Ser - Hi s - Ser - Ser-Gly-Ser-Va l-Leu-Pro-Leu-Gly-Glu-Leu-G lu-Gly- Arg-Arg-Ser-Thr-Arg-Asp-Arg-Arg-Ser-Pro-Ala-Glu- Pro - Glu - Gly - Gly - Pro- Ala - Ser - Glu - G ly - Al a - Al a-Arg - Pro-Leu-Pro- Arg-Phe-Asn-Ser-Val-Pro-Leu-Thr-Asp- Thr-Gly-Hi s-Glu-Arg-Gln-Ser-Glu-Gly-Ser-Ser-Ser- Pro-Gln-Leu-Gln-Glu-Ser-Val-Phe-His-Leu-Leu-Val- Pro - Ser - Val - 1 le - Leu - VaJL— Leu - Leu - Ala - Val - Gly - Gly - Leu-Leu-Phe-Tyr-Arg-Trp-Arg-Arg-Arg-Ser-Hi s-Gln- Glu-Pro-Glii-Arg-Ala-Asp-Ser-Pro-Leu-G lu-Gln-Pro- Glu-Gly - Ser - Pro - Leu - Thr - Gin - Asp - Asp-Arg - Gin - Val - G lu-Leu-Pro-Va l
本明細書において、 ペプチ ド及びア ミ ノ酸の表示は、 I U P A Cにより採択されているァ ミ ノ酸命名法におけ る略号乃至当該分野で慣用されているそれに従う ものと し、 D N A塩基配列及び核酸の表示も同様とする。
本発明のヒ ト M— C S F誘導体は M— C S F活性を有 しており、 その生物活性に基づいて、 前記した如く例え ば白血球減少を伴う疾病も しく は病態の予防及び治療薬 と して、 骨髄移植の捕助剤と して、 各種感染症の予防及 び治療薬と して、 更に抗ガン剤等と して、 それぞれ医薬 分野で有用である。 殊に本発明のヒ ト M— C S F誘導体 は、 遺伝子工学的手法により、 大腸菌（E . co l i ) を宿主 と して得られる組換え型 M— C S F誘導体であり、 その 均質性より特に上記分野において有用である。
加えて、 本発明誘導体中には、 血中半減期が動物細胞 で発現させた約 8 5 0 0 0の分子量を有する M— C S F 〔後記参考例 1 に示す〕 と同等の長さを有するものがあ る。 即ち、 M— C S F活性を有する之等の E . co l i で発 現させた M— C S F誘導体は、 体内での血中半減期が長 く、 しかも動物細胞で発現させた M— C S Fに比べて、 低コス トで容易にしかも均一な物質と して製造すること ができる。
本発明ヒ ト M— C S F誘導体は、 これをコー ドする遺 伝子を用い、 該遺伝子が宿主細胞中で発現されるような 組換え D NAを作成し、 これを宿主細胞に導入して形質 転換し、 該形質転換株を培養するこ とによ り製造される, 上記本発明ヒ ト M— C S F誘導体の製造に用いられる 遺伝子は、 M— C S F産生能を有する'各種のヒ ト細胞、 より具体的且つ有利には前記 A G R— O N [特開昭 5 9 - 1 6 9 4 8 9号公報記載の特性を有する ヒ ト白血病 T 細胞由来のヒ ト培養株化細胞、 アメ リ カ ン · タイプ · 力 ルチヤ ー ' コ レク シ ョン （A T C C) に 「A T C C受託 No. C R L— 8 1 9 9」 と して受託] より分離された mRNAから調製できる。 該 A G R— O Nからの
m R N Aの分離のための抽出操作は、 例えばグァニジゥ ム / フ エ ノ ーノレ法 (Guanidinium / Hot Phenol method, T. Maniatis , E. F .Fritsch and J, Sambrook , Molecular Cloning, pl94-195 (Cold Spring Harbor Laboratory) , 1982 〕 やグァニジゥム Z塩化セシウム法
[Guanidinium / Cesium Chloride method, T.
Maniatis , E . F . Fritsch and J. Sambrook , Molecular Cloning , pl96 (Cold Spring Harbor Laboratory) , 1982] 等に従い実施でき、 精製された m R N Aの
c D N Aへの変換、 即ち目的遺伝子の合成は例えば才力 ャマ ーバーゲ法 ΓΗ . Okayamaand P. Berg , Molecular and Cellular Biology, vol .3, p280 (1983) 〕 ゃグブラ —ホフマ ン法 [V. Gubler and B . J. Hoffman, Gene, vol.25, P263-269 (1983) 〕 等に従い実施でき、 かく し て得られる D N Aの宿主細胞への導入による形質転換法 及び形質転換体からの目的の M— C S F c D NAを有す る株の選出は、 いずれも通常の方法に従い行なう こ とが できる。 之等の詳細は前記特開平 1一 1 04 1 7 6号公 報に示される通りである。
本発明に用いられる上記 M— C S F遺伝子と しても、 該公報記載のものを有利に利用できる。
尚、 上記遺伝子は例えばホスファイ ト ト リエステル 法 〔Nature， 31, 105 (1984)) 等の常法に従い核酸の化 学合成等により製造することもできる。 之等の方法にお いて一部 D N Aの化学合成や DNA鎖の切断、 削除、 付 加乃至は結合を目的とする酵素処理や D N Aの単離、 精 製乃至複製、 選別等の各種操作乃至手段は、 いずれも常 法に従う こ とができる。 例えば上記 D N Aの単離精製は- ァガロースゲル電気泳動法等に従う ことができ、 核酸配 列のコ ドンの一部の改変は、 サイ トースぺシフィ ッ ク ？ τ一夕 ジェネシス (Site-Specific .Mutagenesis)
(Proc. Natl . Acad. Sci . , 81, 5662 - 5666 (1984)〕 等 に従う ことができる。 尚、 上記において所望のァ ミ ノ酸 に対応する遗伝暗号の選択は、 特に限定されるものでは 9
1 0
なく、 利用する宿主細胞のコ ドン使用頻度等を考慮して- 常法に従い決定するこ とができる。 また、 上記方法に従 い得られる目的遺伝子の D N A配列の決定及び確認は、 例えばマキサム -ギルバー ト（Maxam-Gilbert) の化学修 飾法 Meth . Enzym. , 65, 499-560 (1980)〕 や M l 3フ ァージを用いるジデォキシヌ ク レオチ ド鎖終結法
fMessing, J. and Vieira, J. , Gene, 19 269-276
(1982)〕 等により行ない得る。
本発明ヒ ト M— C S F誘導体は、 上記で得られる遣伝 子を利用して、 遺伝子組換え技術により容易に且つ大量 に製造、 収得できる。 該方法は、 上記特定の遺伝子
(D N A) の利用を必須と して、 基本的には一般的な遺 伝子組換え技術に従い行ない得る （Molecular Cloning, T . Maniatis et al . , Cold Spring Harbor Laboratory (1982)等参照〕 。
より詳細には、 本発明遺伝子が宿主細胞中で発現でき るような組換え D N Aを作成し、 これを宿主細胞に導入 して形質転換し、 該形質転換株を培養すればよい。
こ こで宿主細胞と しては、 真核生物及び原核生物のい ずれをも使用でき、 原核生物の宿主と しては大腸菌ゃ枯 草菌が一般によく用いられる。 本発明では例えば該宿主 菌中で複製可能なプラス ミ ドベク ターを用い、 このべク 夕一中に M— C S F遺伝子が発現できるように、 該遺伝 子の上流にプロモーター及び S D (シャイ ン * アン ド · ダルガーノ） 配列、 更に蛋白合成開始に必要な開始コ ド ン （例えば ATG)を付与した発現プラス ミ ドを使用できる。 上記宿主菌と しての大腸菌と しては、 ェシエリ ヒアコ リ (Escherichia coli) K 1 2株等がよく 用いられ、 べク ターと しては一般に p B R 3 2 2が用いられるが、 之等 に限定されず公知の各種の菌株及びベクターをいずれも 利用でき る。 プロモーターと しては、 例えば ト リ プ ト フ ァ ン（trp) プロモーター、 lpp プロモーター、 lac プロ モーター、 P L プロモータ一等を使用でき、 いずれの場 合も目的遺伝子を発現させ得る。
上記遺伝子を利用して本発明ヒ ト M— C S F誘導体を 製造するための一つの好ま しい方法と しては、 宿主細胞 と して大腸菌等の原核生物を用い、 2 · シス ト ロ ン法に より 目的蛋白を発現させる方法を例示できる。 この方法 は連続する二つのシス ト ロ ンよ り なる遺伝子発現システ ムであり、 これによれば目的とするヒ ト M— C S F誘導 体を宿主細胞内に安定して且つ多量に生産蓄積できる。
該 2 · シス ト ロ ン法に従う本発明ヒ ト M— C S F誘導 体の製造につき詳述すれば、 まずフ ァ ース ト シス ト ロ ン (first cistron) と しての適当なポリべプチ ドをコ一 ド する遺伝子とセカ ン ドシス ト ロ ン（second c i stron )と し ての本発明遣伝子との、 二つのシス ト ロ ンを含む発現プ ラス ミ ドを作成する。 該プラスミ ドはまたファース ト シ ス ト ロ ンの上流に該遺伝子の発現のためのプロモーター 及び S D配列が配置されていると共に、 その下流で且つ セカ ン ドシス ト ロ ンの上流に、 セカ ン ドシス ト ロ ンの発 現のための S D配列とフ ァ ース ト シス ト ロ ンの終止コ ド ンとセカン ドシス トロンの開始コ ドンとを、 この順序で 含む合成リ ンカーが配置されていることが重要である。
上記フアース ト シス トロ ンの遣伝子と しては、 宿主に より これが発現され得るものである限り、 合成遣伝子で も天然物由来のものでもよく、 その発現により本発明ヒ ト M— C S F誘導体とは異なるポリべプチ ドが同一系内 に生産され、 引続き該ポリペプチ ドの分離が必要となる こ とを考慮すれば、 該ポリべプチ ドは疎水性であり且つ 本発明誘導体とは充分に離れた分子量を有するものであ るのがよい。 上記ファース ト シス トロンは、 かかるポリ ペプチ ドをコー ドするものであるのが望ま しい。 その具 体例と しては例えば I L— 2、 I F N - α — β、 - r 等をコー ドする遺伝子及びそれらの断片であり、 約 5 0 〜 1 0 0のァ ミ ノ酸残基をコ一 ドするものを例示できる 上記フ アース ト シス ト ロ ンの上流に配置させるプロモ 一夕一及び S D配列と しては、 夫々従来公知の各種のも のを使用でき、 プロモータ一と しては例えば trp プロモ 一夕一、 tac プロモーター、 p L プロモーター、 p D プ 口モーター、 IPP プロモーター、 OmpAプロモーター、 lac プロモーター等を、 特に好ま しく は trp プロモ一夕
―、 P L プロモータ一、 P R プロモータ一等を例示でき る。 また S D配列と しては原核細胞の 1 6 S r R N Aの
3 ' 末端と水素結合を形成できる 3〜 9塩基対の配列、 例えば GGAG、 AGGA等を例示できる。
また上記フ ァース ト シス ト ロ ンとセカ ン ドシス ト ロ ン との間に介在させる合成リ ンカーにおける開始コ ドン及 び終止コ ドンは、 天然界に存在するすべてのものでよい c 之等はそれぞれ完全な形、 例えば TGA 及び ATG 等と して 利用される必要はなく、 両者の一部オーバーラ ップした 形、 例えば TGATG 、 TAATG 等と して利用すること もでき る。 上記 2 · シス ト ロン法に利用される発現ブラス ミ ド の構築は、 通常の方法に従い実施できる。
特に好ま しい一つの方法によれば、 まず M— C S F遺 伝子を含むプラス ミ ドを適当な制限酵素で切断し、 M— C S F遺伝子を含む断片を常法に従い単離精製する一方 上記した合成リ ンカ一を常法に従い、 例えば D N Aシン セサイザ一等を用いて合成し、 これを上記で得られた断 TJP9001439
1 4
片の M— C S F遺伝子の上流側に、 T 4 D N Aリガーゼ 等を用いて連結させ、 次いで得られる D N A断片を、 フ アース ト シス ト ロ ンを含みこれを発現可能なプラスミ ド の所定位置に組込む方法を例示できる。 また上記方法に より得られるセカン ドシス トロ ンと合成リ ンカ一とを連 結された D N A断片の上流に、 予めフ ァース ト シス トロ ンを連結させた後、 該 D N A断片を適当な蛋白質発現系 を有するプラスミ ドに組込む方法によっても、 所望の 2 • シス ト ロ ン法に好適な発現プラス ミ ドを収得できる。 上記で得られるプラスミ ドを適当な宿主細胞に導入し てこれを形質転換させることにより、 2 · シス ト ロ ン法 による所望の形質転換体を収得でき、 該形質転換体の利 用によれば、 フ ァ ース ト シス ト ロ ンに係わる蛋白質とセ カ ン ドシス トロンに係わる所望のヒ ト M— C S F誘導体 とを夫々別個に発現させ得る。 之等は通常の方法例えば S D S— P A G Eやウェスタ ンプロッティ ング法等によ り解析、 確認でき、 また後記する各種の方法により夫々 分離、 精製できる。
かく して得られる所望の形質転換体は、 常法に従い培 養でき、 該培養により ヒ ト M— C S F誘導体が生産、 蓄 積される。 該培養に用いられる培地と しては、 採用した 宿主細胞に応じて慣用される各種のものを適宜選択使用 できる。 宿主細胞と して大腸菌等を利用した形質転換体 の培養には例えば L B培地、 E培地、 M 9培地、 M 6 3 培地等を使用でき、 之等培地には更に必要に応じ通常公 知の各種の炭素源、 窒素源、 無機塩、 ビタ ミ ン類、 天然 物抽出物、 生理活性物質等を添加できる。
上記形質転換体の培養条件と しては、 宿主細胞の生育 に適した条件を採用でき、 大腸菌の場合は例えば p H約 5〜 8、 好ま しく は 7又はその付近、 温度約 2 0〜 4 3 。Cヽ 好ま しく は 3 7 °C又はその付近を採用できる。
上記により、 形質転換体の細胞内に目的とする本発明 ヒ ト M— C S F誘導体が生産、 蓄積される。
これはその物理学的性質、 化学的性質等を利用した各 種の分離操作により分離精製できる。 該方法と しては、 具体的には通常の再構成処理、 蛋白沈澱剤による処理、 遠心分離、 浸透圧ショ ッ ク法、 超音波破碎、 限外炉過、 分子篩ク ロマ ト グラ フィ ー （ゲル炉過） 、 吸着ク ロマ ト グラ フィ ー、 イオ ン交換ク ロマ ト グラフィ ー、 ァフィ 二 ティ ク ロマ ト グラフ ィ ー、 高速液体ク 口マ ト グラ フ ィ ー ( H P L C ) 等の各種液体ク ロマ ト グラ フ ィ ー、 透析法、 之等の組合せ等を例示でき、 かかる分離精製操作の採用 により、 実施例に示すごと く容易に高収率、 高純度で、 所望のヒ ト M— C S F誘導体を工業的規模で製造できる。 かく して得られる本発明ヒ ト M— C S F誘導体は、 そ の製造のために利用される遣伝子ゃ該遺伝子の発現のた めの発現系の種類等に応じ、 その N —末端ア ミ ノ酸配列 や分子量等を若干異にし、 殊に本発明誘導体の発現の過 程で開始コ ドンに対応する Met 残基が N末端に付加され るこ とがあり得るが、 いずれも C S F活性を有する点に ついては共通している。
上記で得られる ヒ ト M— C S F誘導体は、 その有する 生物活性に基づき各種医薬品と して利用できる。 本発明 ヒ ト M— C S F誘導体は、 これを医薬と して用いるに当 り、 その有効量を薬理的に許容される通常の無毒性担体 と共に含有する薬理組成物の形態に調製され、 該形態に 応じた各種投与経路で投与される。 製剤形態と しては、 液伏形態例えば溶液、 懸濁液、 乳濁液等が通常採用され 之等は一般に経口、 静脈内、 皮下、 皮内、 筋肉内投与さ れるが、 特に之等の形態及び投与経路に限定されず、 本 発明誘導体は、 他の通常採用される経口、 非経口投与等 に適した各種の製剤形態に調製することもでき、 また使 用前に適当な担体の添加により液状となし得る乾燥品と することもできる。 上記製剤の投与量は、 所望の薬理効 果、 疾病の種類、 患者の年齢、 性別、 疾患の程度等に応 じて適宜決定され、 特に限定はないが、 通常有効成分が 蛋白量と して約 0. 0 0 1〜 1 mgZkgZ日となる量で 1 日に 1回乃至数回に分けて投与すればよい。
実 施 例
以下、 参考のために実施例で使用する C H 0細胞で発 現されたヒ ト M— C S F誘導体の製造例を参考例 1と し て挙げ、 次いで本発明のヒ ト M— C S F誘導体の製造の ための原料プラス ミ ド作製法及びそれに由来する M— C S Fの製造例を参考例 2と して挙げ、 更に本発明誘導 体の製造例、 その特徴等を実施例と して挙げ、 本発明を 更に詳述する。
尚、 各実施例では各ヒ ト M— C S F誘導体を次のよう に定義する。 例えば E. coli をホス トと して式 （ 1) で 表わされるァ ミ ノ酸配列の 1位 Val から 1 5 1位 Thr ま でのァ ミ ノ酸を含む発現ベクターにて産生された M— C S F分子を" E. coli [3-153] M-CSF " と呼び、 同様 に 1位 Val から 2 1 2位 Pro までのァ ミ ノ酸配列を含む 発現ベクターにて産生されたものを" E. coli [3-214] M-CSF " と呼ぶ。 また参考例 1で得られる C H 0細胞を ホス トと して、 3 2個のア ミ ノ酸配列よりなるシグナル ペプチ ド及び 5 2 2個のア ミ ノ酸配列よりなる成熟ヒ ト M— C S F蛋白質をコ一 ドする発現ベクターにより産生 される M— C S F誘導体は" CH0 [-32-522] M-CSF " と 呼ぶ。 中括弧内の番号は C H 0細胞で産生されてく る M 一 C S Fの N末端域が式中 1位の Val の上流に更に 2残 基 （Glu- Glu ) 付加した構造をとつていることによる。
また各例で得られる試料の C S F活性は以下の方法に より測定されるものとする。
< C S Fの活性測定法〉
牛胎児血清 （F C S ) 2 0：^、 —培地 3 0 及び 2 倍濃度 一培地 2 0 ^を混和して得られる溶液を 3 7 °C にて保温し、 その 2 3 . 3 を予め 5 0 °Cに保温した 1 %寒天 （ディ フコ社製） 溶液 1 0 3^と混合して 3 7 °Cに 保温する
—方 B A L B Z C系マウス大腿骨より採取した骨髄細 胞 （B M C ) を、 ハンクス液で 2回洗浄後、 α —培地に て細胞濃度が 1 0 7 個 となるように調製し、 その 1 ^を上記 3 7 °Cに保温してある寒天培地に加え、 よく混 和した後、 3 7 °Cに保温し、 次いでその 0 . 5 を、 予 め 5 0 ^ の供試.試料を入れたゥヱル （ティ ッ シュカル チヤ 一ク ラスター 1 2、 コスター社製） に加えて手早く 混和して室温に放置する。 各ゥエルの寒天が固化するの を待って炭酸ガスイ ンキュベーターに移し、 更に 3 7。C で 7 日間培養する。
かく して生じたコロニー数を実体顕微鏡を用いて計測 し、 C S F活性の指標とする。 また C S F活性の単位 (UZ^) は、 上記コロニー数より、 次式（a) に従って 算出した値を用いた。
CSF活性単位 (U/ri) = (コロニ -数） X (希釈倍率） ÷1. 5 (a) 尚、 上記で生じるコロニーは、 形態学的及び酵素化学 的観察の結果、 殆んどすべてがマク ロファージコ ロニー であった。
参考例 1
C H 0 [- 3 2 - 5 2 2 ] M— C S Fの製造
1 %の牛胎児血清含有 0 P T I — ME M (ギブコ社製） 中にてマイクロキヤ リ ア一培養した C H 0細胞ク ロー ン No.2 , 3 - 8 〔特開平 1 一 1 0 4 1 7 6号公報参照〕 の培養上清液を用いて、 以下の精製工程により 目的の均 質な C H 0 [- 3 2 - 5 2 2 ] M— C S Fを得た。 尚、 以下の工程において目的蛋白はウェス夕 ンブロ ッティ ン グ法に従い検出した。 該ウエスタ ンプロ ッティ ングは、 バイオラ ッ ド社の トラ ンスブロ ッ トセルを用いて行ない、 トラ ンスフ ァーされたニ ト ロセルロース膜を 1 %スキム ミ ルク含有 P B S - にてブロ ッキング後、 M— C S Fに 対するゥサギ抗血清と反応させ、 更にパーォキシダーゼ 標識ャギ抗ゥサギ抗体 （パイオラ ッ ド社製） を反応させ た。 M— C S Fのバン ドの検出は、 かく して得られた二 トロセル口ース膜と発色基質である 4—ク ロロー 1 ーナ フ ト一ル液とを反応させるこ とによ り行なった。
(1) Con A ーセフ ァ ロースク ロマ トグラフ ィ ー
上記 C H 0細胞培養上清液 6 9. 3 ·^を限外^過濃縮 して得られた濃縮^ 8 4 23? 中の 6 5 0 を出発物質と して、 硫安分画法にて 3 5 %〜 6 5 %飽和硫安沈殿画分 を得た後、 蒸留水にて溶解し （ 1 1 2 0^) サンプルと
—方、 約 5 0 0 の Con A —セフ ァ ロ一スゲルを充填 したカラム （ 5 X 2 5 cm) を 0. 1 5 M N a C 含有 2 0 mMリ ン酸ナ ト リ ウム緩衝液 （p H 7. 4) にて平 衡化した後、 上記サンプル溶液をアプライ し、 同緩衝液 にて充分に洗浄後、 0. 5 Mメチル一 な — D—マンノ シ ドを含む同緩衝液にて溶出を行なった。 全溶出液を YM 一 1 0膜を用いた限外^過により濃縮後、 2 O mMリ ン 酸ナ ト リ ウム緩衝液 （p H 7. 4) に緩衝液を交換した 後、 以下の条件で 7回に分けて陰イオン交換高速液体ク ロマ トグラフィ 一に供した。
(2) 陰イオン交換高速液体ク 口マ ト グラ フィ ー
カラム ： T S Kゲル D E A E— 5 PW ( 2 1. 5画 ID
X 1 5 cm, トーソ一社製）
溶出液 A ： 4 O mMリ ン酸ナ ト リ ウム緩衝液 （p H 7. 4 )
溶出液 B : l . 0 M N a C ^含有 40 mMリ ン酸ナ ト リ ゥ厶緩衝液 （P H 7. 4)
流 速 ： 3. 0 ^/分
フ ラ ク シ ョ ン容積 ： 6» /チューブノ2分
濃度勾配 時間 （分） B %
0 0
1 0 0
2 0 1 0
9 5 3 0
0 0 0 0
1 0 00
1 5 0
1 3 0 0
上記溶出の結果、 目的の M— C S Fはフ ラ ク シ ョ ン N ©■ 2 0 - 3 8 ( 0. 1 &〜 0. 2 5- M a. C. に 溶出された。 該活性画分をプールした後、 限外^過にて 濃縮 （YM— 1 0膜使用） し、 以下の精製を行なった。 (3) ゲル炉過高速液体ク 口マ トグラフィ ー
上記 (2)で得た濃縮サンプルを 5回に分けて以下の条件 でゲル炉過高速液体ク ロマ トグラフィ 一を行なった。 カ ラ ム ： T S Kゲル G 3 0 0 0 SWG (2 1. 5醒 1 D x 6 0 cm、 トーソ一社製）
溶離液 ： 0. 3 M N a C 含有 5 0 mMリ ン酸ナ ト リ ゥム緩衝液 （p H 7. 4)
流 速 ： 3. 0 分
フラク シ ョ ン容積 ： 6a^Zチューブノ2分
上記ゲル^過高速液体ク ロマ 卜グラフィ 一の結果、 M - C S Fはフラクショ ン No.2 0〜 2 7にかけて検出さ れたが、 その中のフラクショ ン No.2 4〜 2 7をプール した後、 限外^過濃縮し、 以下の精製に供した。
(4) T S Kゲル Ether — 5 PW高速液体クロマ トグラフ ィ 一
上記 (3)で得た瀵縮サンプル 1 2 ^を 8回に分けて以下 の条件で精製した。
尚、 上記濃縮液は力ラム注入前に等量の 8 0 %飽和硫 安含有 2 0 mMリ ン酸ナ ト リ ウム緩衝液 （p H 7. 4 ) と混合した後、 クロマ トグラフィ ーに供した。
カラム ： T S Kゲル Ether— 5 P (7. 5 mralDx η 5
•mm、 トーソ一社製）
溶離液 A ： 2 0 mMリ ン酸ナ ト リ ウム緩衝液
( p H 7. 4 )
溶離液 B ： 4 0 %飽和硫安含有 2 0 mMリ ン酸ナ ト リ ウ ム緩衝液 （ Ρ Η 7. 4) 流 速 ： 1. 03^ノ分
フ ラ ク ショ ン容積 ： 2 πΙΙ/チュ一づ / 2分
濃度勾配 時間 （分） Β %
0 0 0
5 0 0
6 5 0
8 0 0
8 5 0 0
1 0 0 1 0 0
上記ク ロマ トグラフィ 一の結果、 M— C S Fはフラク シ ヨ ン Νο· 1 5〜： L 8 ( 2 2 %〜 1 7 %飽和硫安濃度） に検出されたが、 之等のフラク シヨ ンについてフラク シ ヨ ン毎にプールした後、 夫々のプールについて 3〜 4回 に分けて逆相高速液体ク ロマ トグラフィ 一を行なった。 (5) T S Κゲルフヱニル— 5 P WR Ρ逆相高速液体ク ロ マ トグラフィ ー
カラム ： T S Kゲルフエニル一 5 P WR P ( 7. 5 mralD
X 7 5 rara、 トーソ一社製）
溶離液 A ： 0. 1 % T F A
溶離液 B ： n—プロパノ ール ： 1 % T F A ( 9 ： 1 ) 流 速 ： 0. 8 ^ノ分
フ ラ ク シ ョ ン容積 ： 1. 6；^/チューブ / 2分 67
PCT/JP90/01439
2 4
度勾配 時間 （分） B %
0 0
5 0
1 0 2 5
5 0 4 5
6 0 0 0
7 0 0 0
7 5 0
9 5 0
上記ク 口マ トグラフィ 一の結果、 M— C S Fは用いる サンプルの相違により、 また実験により多少変動したが、 フラ ク ショ ン No.5〜 8 ( 3 2 %〜 3 4 % η—プロパノ ール） の間の連続する 2本のフラク ショ ンに検出された。
尚、 分画は予めチューブ当り の 0. 8 Mリ ン酸ニナ ト リ ウムを入れたチューブにて行なった。 M— C S F画分はコ ンセン ト レーター （ト ミ ー精ェ社製） に て各チューブ毎に遠心濃縮乾固した後、 チューブ当り
5 0 0 £の蒸留水を用いて溶解し実験に供した。
(6) C H O [— 3 2 — 5 2 2] M— C S Fの S D S—
P A G E
レム リ の方 (； Laemmli , U. K. , Nature , 277 , 680 (1970)〕 に従い、 上記 )で得られた' C Η 0 [- 3 2 - 5 2 2 ] M— C S Fを、 レム リ のサンプルバッ フ ァ ー
[2—メルカプ トエタノ ールを含むもの （ 2— ME+ ) 及び含まないもの （ 2— ME -) の両者] の夫々 と混合 した後、 9 5 °Cで 1 0分間加熱処理後、 ミニスラブゲル
(ゲル濃度 1 5 %) を用いて S D S— P A G Eを行なつ た。 分子量マーカーと してはプレスティ ン ドマー力一
(バイオラ ッ ド社製） を用い、 染色はシルバースティ ン
(和光純薬社製） にて行なった。
その結果、 非還元条件下 （ 2— M E —状態） での分子 量は約 8 5 0 0 0を主成分と して、 6 2 0 0 0〜
1 1 5 0 0 0にかけて、 また還元条件 （ 2— M E+ 状態） では 4 3 0 0 0を主成分と して 3 9 0 0 0〜 4 6 0 0 0 にかけて、 夫々スメアー したバン ドと して検出された。 (7) C H O [- 3 2 - 5 2 2 ] M- C S Fの N末端域ァ ミ ノ酸配列
上記 (5)で得られた C H O [- 3 2 - 5 2 2 ] M— C S Fの N末端域ァ ミ ノ酸配列を、 気相シークェンサ一 （ァ プライ ドバイオシステムズ社製） を用いて決定した。
その結果、 N端 1 0個のア ミ ノ酸配列と して次の配列 が確認された。 尚、 サイ クル 7におけるア ミ ノ酸 （χ') は同定し得ず、 遣伝子構造から Cys であると推定した。
Glu-Glu-Val-Ser-Glu-Tvr-X '一 Ser - His - Met - 参考例 2
① プラス ミ ド P trp IL - 2X-M-CSF101の作製
プラス ミ ド pcDM- CSF11-185 [M - C S F遣伝子
( 2 c M l l c D N A、 約 2. 5 kb) を保有するプラス ミ ド pcDM - CSF11から作製した （特開平 1— 1 0 4 1 7 6 号公報参照） ] を、 制限酵素 Seal及び BamHI で消化して Scal-BamHI D NA断片 （約 4 5 0 bP) をァガロースゲ ル電気泳動にて単離精製した。 次いで得られた D N A断 片の Seal切断端に下記合成リ ンカー （A) を T 4 D N A リガ—ゼにより連結させ、 Sca.I切断端側に制限酵素 Xbal の切断端を有する xbal - BamHlD N A断片 （約 4 8 0 bp) を得た。
合成リ ンカ一 （A) :
2nd SD ter 5 '-CTA GAA CGG AGG ACT CAT T6ATG GTA TCA GAA T-3 '
TT GCC TCC TGA GTA ACTAC CAT AGT CTT A
Xbal start Seal
(Box) かく して得られた D N A断片を、 ヒ 卜 I L一 2発現プ ラス ミ ド p trp IL-2D8厶 （特開昭 6 3— 1 2 9 5 8号公 報参照） の Xbal、 BamHI 切断部位に揷入して、 所望のプ ラス ミ ド p trp IL- 2X-M-CSF101を得た。 該プラス ミ ドをェシヱ リ ヒア · リ HB101 株に トラ ン スフ オームさせた形質転換体は、 「Escherichia coli HBlOl/ptrp IL-2X-M-CSF101 」 なる名称で、 1 9 8 8年
1 2月 2 6日に工業技術院微生物工業技術研究所に微ェ 研条寄第 22 2 6号 （E. coli [3-153] F E R M B P—
2 2 2 6 ) と して寄託された。
② E. coli [3-153] M— C S Fの分離、 精製
(1) 大腸菌からの M— C S F画分の調製
上記①で得たプラス ミ ド p trp IL-2X-M-CSF 101 を保 持する大腸菌 S G 2 1 0 5 8株 1. 5 g (湿重量） に、 0. 5 Mショ糖を含む 5 0 mMト リ ス塩酸緩衝液 （ p H 7. 0) 5 0 を加え、 充分に撹拌した。 次にリ ゾチ一 ム 2 mgノ^を 63^、 続けて 0. 1 4M E D TA 4^を 加え、 4eCで 1 5分間撹拌処理し、 処理後、 1 0 0 0 0 回転 Z分で 2 0分間遠心分離を行なった。
上清はすて、 沈渣を同緩衝液 （0. 5Mショ糖を含む 5 0 τηΜト リ ス塩酸、 ρ Η 7. 0) にて洗净し、 同じ く 1 0 0 0 0回転 分で 2 0分間遠心操作を行なつて、 沈 渣と してスフエロプラス トを得た。 次いで、 これに 5 0 mMト リ ス塩酸 （p H 7. 0) 5 0 を加えて懸濁させ 超音波処理を 2 0 KH z、 1 0分間行ない、 その後 1 0 0 0 0回転ノ分で 2 0分間遠心分離し、 同緩衝液 (50 mMト リ ス塩酸、 p H 7. 0) にて洗浄後、 同条 件で再度遠心分離し、 沈渣と して M— C S F画分を得た c
(2) M— C S F画分から M— C S Fの再構成
上記 （1 ) の操作により得られた M— C S F画分に、 7. 0 M塩酸グァニジンを含む 5 0 mMト リ ス塩酸
( p H 7. 0) を加え、 4°Cで 1時間スターラ 一にて撹拌して溶解させた。 この溶解液を、 予め 1 0 mMト リス塩酸 （ p H 8. 5 ) 3 0 0 ^の入つたビーカ 一 （スターラーにて撹拌） 中に徐々に滴下し、 滴下終了 後、 1 OmMト リ ス塩酸 （p H 8. 5 ) に対して 4でで 充分に透析を行ない、 その後、 1 0 0 00回転 Z分で 2 0分間遠心分離して、 沈澱を除去して上清を得た。
かく して得られた上清中には、 再構成した M— C S F が存在している。
( 3 ) M— C S Fの精製
上記で得た M— C S Fの精製を以下の通り行なった。 (3-D ゲル 過高速液体ク 口マ トグラフィ ー
上記 （ 2 ) で得た遠心上清を限外^過器 （ア ミ コ ン社 製、 メ ンブラン ： YM— 1 0膜、 ア ミ コ ン社製） を用い て濃縮し、 濃縮液を 0. 45 /zmミ リ ポア一フィ ルタ一 に通した後、 以下の条件でゲル炉過高速液体クロマ トグ ラ フィ 一を行なった。 カラム ： T S Kゲル G 3 0 0 0 SW ( 6 0 cm x 2 5 mraI 'D.N ト一ソ一社製）
溶出液 ： 0. 3 M N a C 含有 5 0 mMリ ン酸ナ ト リ ゥム緩衝液 （P H 6. 8)
流 速 ： 3. 0 分
フラ ク シ ョ ン容積 ：
Figure imgf000031_0001
チューブ Z 2分
上記において、 ゲル^過 H P L C用標準蛋白 （オ リエ ン夕ル酵母社製） の各溶出位置、 即ちグルタメ一 ト · デ ハイ ドロゲナーゼ （分子量 2 9 0 0 0 0 ) 、 ラクテー ト * デハイ ドロゲナーゼ （分子量 1 4 2 0 0 0 ) 、 ェノ ラ ーゼ （分子量 6 7 0 0 0) 及びアデ二レー ト · キナーゼ (分子量 3 2 0 0 0 ) から判断して、 M— C S Fの分子 量は 3 2 0 0 0 と推定された。
上記活性部分を分取し、 上記限外伊過器にて 4 0 mM ホウ酸ナ ト リ ウム （ p H 8. 0 ) に対して溶媒交換を行 なった。
(3-2) T S Kゲル D E A E— 5 PWイオン交換高速液 体クロマ トグラフィ ー
上記（3-1) で得た活性溶出画分を、 以下の条件で T S Kゲル D E A E— 5 PWィォン交換高速液体ク ロマ トグラフィ 一にかけた o
カラム ： T S Kゲル D E A E— 5 PW ( 7. 5 mml -D. x 7 5腿、 トーソ一社製）
溶離液 A : 5 %メ タノ一ル含有 4 0 mMホウ酸ナ ト リ ウ ム緩衝液 （P H 8. 0)
溶離液 B : l . 0 M N a C 及び 5 %メ タノール含有
4 0 mMホウ酸ナ ト リ ウム緩衝液 （ p H 8. 0 ) 流 速 ： 1. 0 分
フラ ク シ ョ ン容積 ： 1. 0 チューブ/分
濃度勾配 ： 時間 （分） ％ B
0 0
7 0
4 2 3 0
4 7 1 0 0
5 2 1 0 0
5 7 0
6 2 0
上記 T S Kゲル D E A E— 5 PWィォン交換高速液体 ク ロマ 卜 グラフィ 一の結果 （溶出パターン） より、 フラ ク シヨ ン Νο· 4 2〜 4 3 ( 0. 2 3〜 0. 2 5 Μ
N a C ^濃度） に認められる ピークが M— C S Fに相当 し、 該ピークを集め大腸菌から精製 M— C S Fを得た。 実施例 1
(1) p trp IL-2X-M-CSF 201 の作製 プラス ミ ド P trp IL-2X- -CSF 101 を制限酵素 BstEII と Sailで切断し、 I L一 2及び M— C S F D N A部分を 含む 4. 7kbの D N A断片 （ I ) を得た。
—方、 プラスミ ド PCDM-CSF11を制限酵素 EcoRI で切断 後、 切断部分を D N Aポリ メ ラーゼ Iのク レノー断片を 用いて平滑末端と した後、 Sailリ ンカ一 （5' - pGGTCGACC
OH3') (ニューイ ングラ ン ドバイオラボ社製） を連結さ せた。 これを制限酵素 Sail及び BstEIIで切断して、 約
1. 1 kbの BstEII- Sail D N A断片 （Π ) を得た。
上記 D N A断片 （ I ) と （Π) とを T 4 D N A リガ一 ゼで連結し、 これを大腸菌 HB101 のコンビテン トセルに 形質転換して、 所望のプラス ミ ド P trp IL-2X- -CSF 201 を有する大腸菌 HB101 を得た。
得られたプラス ミ ド P trp IL-2X-M-CSF 201 は、 大腸 菌 ト リブ ト " ア ンプロモーター支配下の転写ユニッ ト内 に、 2種のポリペプチ ドがコー ドされている。 その一つ は翻訳開始のメ チォニン、 ヒ ト I L一 2ァ ミ ノ末端側 6 0ァ ミ ノ酸及び合成 D N A リ ンカ一にコー ドされる 4 ア ミ ノ酸からなる 6 5ア ミ ノ酸のポリべプチ ドであり、 他の一つは翻訳開始の Met と式 （ 1 ) で表わされるア ミ ノ酸配列の 1位ァ ミ ノ酸（val) から 5 2 0位ア ミ ノ ^ (Val) までの 5 2 0ア ミ ノ酸とのヒ 卜 Μ · C S F誘導体 からなるポリべプチ ドである。
かかる 2 · シス ト ロ ン（two-cistron) 発現システムに おいて、 セカン ドシス トロン（2nd cistron) の翻訳は、 合成 D N Aリ ンカーに置かれた第 2の S D配列にリ ボソ ームが結合することにより開始される。
(2) p trp IL-2X-M-CSF 202 の作製
プラス ミ ド P trp IL-2X-M-CSF 201 を制限酵素 Ncolと
Sailで切断して、 約 4. 8 kbの Ncol-Sall D N A断片を 得た。 この D N A断片の両端を合成オリ ゴデォキシヌ ク レオチ ド 「5' - CATGGCCTGATAAG - 3'と 5'-TCGACTTATCAGGC -
3'] を用いて T 4 D N Aリガーゼにより連結し、 これを 大腸菌 HB101 のコ ン ビテン トセルに形質転換して、 所望 のプラスミ ド P trp IL-2X-M-CSF 202 を有する大腸菌 HB101 を得た。
得られたプラス ミ ド P trp IL-2X-M-CSF 202 は、 大腸 菌 ト リ ブ ト フ ァ ンプロモータ一支配下の転写ュニッ 卜内 のセカ ン ドシス ト ロ ンに、 翻訳開始の Met と式 （ 1 ) の ァ ミ ノ酸配列の 1位ア ミ ノ酸（Val) から 1 8 2位ァミ ノ 酸（Ala) までの 1 8 2ア ミ ノ酸とのヒ ト Μ · C S F誘導 体からなるポリペプチ ドをコー ドしている。
(3) p trp IL-2X-M-CSF 203 の作製
ザラス ？ ド p trp IL-2X- -CSF 201 を制限酵素 BamHI と Sailで切断して、 約 4. 9 kbの BamHI- SallD N A断片 を得た。 この D N A断片の両端を合成オリ ゴデォキシヌ ク レオチ ド [5'- GATCCATGATAAG-3' と 5 ' - TCGACTTATCATG
-3' ] を用いて T 4 D N Aリガーゼにより ¾結し、 これ を大腸菌 1。1 のコ ンビテン トセルに形質転換して、 所 望のブラスミ ド P trp IL-2X-M-CSF 203 を有する大腸菌 HB101 を得た。
得られたプラス ミ ド P trp IL-2X-M-CSF 203 は、 大腸 菌 ト リ ブトフ ァ ンプロモータ一支配下の転写ュニッ ト内 のセカ ン ドシス ト ロ ンに、 翻訳開始の Met と式 （1) の ァ ミ ノ酸配列の 1位ア ミ ノ酸（Val) から 2 1 2位ァ ミ ノ 酸（Pro) までの 2 1 2ア ミ ノ酸とのヒ ト M · C S F誘導 体からなるポリべプチ ドをコ一 ドしている。
上記プラス ミ ド P rP IL-2X-M-CSF 203 を保有する大 腸菌 HB101 株は 「Escherichia coli HB ΙΟΙ/ptrpIL· - 2X - M-CSF203J なる表示で、 平成 1年 1 0月 1 8日に工業技 術院微生物工業技術研究所に微ェ研菌寄第 1 1 0 5 3号 (F E RM P— 1 1 0 5 3 ) と して寄託された。
(4) p trp IL-2X-M-CSF 20 の作製 .
プラス ミ ド P trp IL-2X-M-CSF 201 を制限酵素 Smalと Sailで切断して、 約 5. 0 kbの Smal-Sall D N A断片を 得た。 この D N A断片の両端を合成オ リ ゴデォキシヌ ク レオチ ド [ 5 * -GGGTGATAAG-31 ^ 5 ' -TCGACTTATCACCC-3 ' ] を用いて T 4 D N Aリガーゼにより連結し、 これを大腸 菌 HB101 のコ ンビテン トセルに形質転換して、 所望のプ ラスミ ド P trp IL-2X-M-CSF 20 を有する大腸菌 HB101 を得た。
得られたプラスミ ド P trp IL-2X-M-CSF 20 は、 大腸 菌 ト リ ブトファ ンプロモーター支配下の転写ュニッ ト内 のセカ ン ドシス ト ロ ンに、 翻訳開始の Met と式 （ 1 ) の ァ ミ ノ酸配列の 1位アミ ノ酸（Val) から 2 5 6位ァ ミ ノ 酸（Gly) までの 2 5 6ア ミ ノ酸とのヒ 卜 M ' C S F誘導 体からなるポリぺプチ ドをコ一 ドしている。
(5) p trp IL-2X- -CSF 205 の作製
プラス ミ ド P trp IL-2X-M-CSF 201 を制限酵素 Sphlと Sailで切断して、 約 5. 1 kbの Sphl-Sall D N A断片を 得た。 この D N A断片の両端を合成オリ ゴデォキシヌ ク レオチ ド、 「5 ' - CAGTGATAAG - 3'と 5 ' - TCGACTTATCACTGCATG -
3'] を用いて T 4 D N Aリガーゼにより連結し、 これを 大腸菌 HB101 のコ ンビテン トセルに形質転換して、 所望 のプラス ミ ド P trp IL-2X- -CSF 205 を有する大腸菌 HB101 を得た。
得られたプラスミ ド P trP IL-2X-M-CSF 205 は、 大腸 菌 ト リブトファ ンプロモータ一支配下の転写ュニッ ト内 のセカン ドシス ト ロンに、 翻訳開始の Met と式 （ 1 ) の ァ ミ ノ酸配列の 1位ア ミ ノ酸（Val) から 3 0 0位ァ ミ ノ 酸（Gin) までの 3 0 0ア ミ ノ酸とのヒ ト Μ · C S F誘導 体からなるポリべプチ ドをコ一 ドしている。
(6) P trp IL-2X-M-CSF 206 の作製
プラス ミ ド P trp IL-2X-M-CSF 201 を制限酵素 Kpnlと Sailで切断して、 約 5. 2kbの Kpnl-Sall D N A断片を 得た。 この D N A断片の両端を合成オ リ ゴデォキシヌ ク レオチ ド [5'_CGCCTGATMG_3， t 5 ' -TCGACTTATCAGGCGGT AC-3' ] を用いて T 4 D N Aリガーゼにより連結し、 こ れを大腸菌 HB101 のコ ンビテン トセルに形質転換して、 所望のプラス ミ ド P trp IL-2X- -CSF 206 を有する大腸 菌 HB101 を得た。
得られたプラスミ ド P trp IL-2X-M-CSF 206 は、 大腸 菌 ト リブ トフ ァ ンプロモーター支配下の転写ュニッ ト内 のセカ ン ドシス ト ロ ンに、 翻訳開始の Met と式 （ 1 ) の ァ ミ ノ酸配列の 1位ア ミ ノ酸（Val) から 3 3 2位ァ ミ ノ 酸（Ala) までの 3 3 2ア ミ ノ酸とのヒ ト M ' C S F誘導 体からなるポリべプチ ドをコ一 ドしている。
(7) .M— C S F誘導体の発現
上記 (1)〜(6)で得た各プラス ミ ドを、 大腸菌 S G 2 1 0 5 8株 C J- Bacteriol . , 164, 1124-1135 (1985)， に形 質転換法により導入して、 形質転換体 [夫々 E. coli SG 21058 /p trp IL-2X-M- CSF 201 、 E. coli SG21058 /p trp IL-2X- -CSF 202、 E. coli SG21058 /p trp IL-2X - M - CSF 203 、 E. coli SG21058 /p trp IL-2X-M- CSF 204 、 E. coli SG21058 /p trp IL-2X-M- CSF 205 及び E. coli SG21058 /p trp IL-2X-M- CSF 206 と命名する；] を得た。
之等の形質転換体を、 5 0 gノ^のアンピシ リ ンを 含む L B培地 ^T. Maniatis, E.F.Fritsch and J.
Sambrook , Molecular Cloning , A Laborat iry Manual , p440 (1982) , Cold Spring Harbor Laboratory) 中で、
3 7。Cで一晚培養後、 その培養液 0. 5 » を、 1 %カザ ミ ノ酸、 5 /z gZ 塩酸チア ミ ン、 2 0 z g_ ^L— シ スティ ン及び 5 0 g アンピシ リ ンを加え、 ダルコ ース濃度を 0. 4 %に調整した M 9培地 （同上文献参照） 5 0 ^に添加し、 3 7でで 8時間振盪培養後、 遠心
( 5 0 0 Orpm ) して菌体を回収し、 生産された蛋白質 を S D S— P A G E及びウェスタ ンプロ ッティ ング法に より解析した。
ウェスタ ンプロ ッ ティ ングは、 ノくィオラ ッ ド社の ト ラ ンスブロ ッ トセルを用いて行ない、 ト ラ ンスフ ァ 一され たニ ト ロセルロース膜を 1 %牛血清アルブミ ン含有 P B S " にてブロ ッキング後、 M— C S Fに対するゥサ ギ抗血清と反応させ、 更にパーォキシダーゼ標識ャギ抗 ゥサギ抗体 （バイオラ ッ ド社製） を反応させた。 M— C S Fのバン ドの検出は、 かく して得られたニ トロセル ロース膜と発色基質である 4一クロロー 1一ナフ トール 液とを反応させるこ とにより行なった。
その結果、 セカ ン ドシス ト ロ ンにコー ドされている M 一 C S Fは、 E- coli SG21058 /p trp IL-2X-M-CSF 202— E. coli SG21058 /p trp IL-2X-M- CSF 203 、 E. coli SG21058 /p trp IL-2X-M- CSF 204 、 E. coli SG21058 /p trp IL - 2X - M-CSF205 及び E. coli SG21058 /p trp IL-2X-M-CSF 206 において、 夫々予想される分子量の位 置に検出された。
(8) M— C S F誘導体 （E.coli[3-214]-M-CSF ) の分離、 精製
上記 (3)で得たプラス ミ ド P trp IL-2X- -CSF 203 を保 持する大腸菌 S G 2 1 0 5 8株 1 0 g (湿重量） に、 5 0 mMト リ ス塩酸緩衝液 （ p H 7. 0 ) を加え全量を 1 0 と し、 充分に撹拌した。 次にリ ゾチーム 6 mgZ ^を 4 、 続けて 0. 1 4 M E D T A 8 ¾^を加え、 4 。Cで 1 5分間撹拌処理後、 超音波処理 （ 2 0 0 K H z、 2分間、 2 0 0W) を行ない、 更に 1 0 0 0 0回転ノ分 CT/JP90/01439
3 8
で 2 0分間遠心分離を行なった。 得られた沈渣を 2 % ト リ ト ン X— 1 0 0を含む 5 O mM ト リス塩酸緩衝液
( P H 7. 0 ) にて充分洗浄後、 同条件で再度遠心分離 を行なって、 沈渣と して M— C S F画分を得た。
かく して得られた M— C S F画分に、 7. 0 M塩酸グ ァニジン及び 5 O mMメルカプトエタノールを含む 5 0 mM ト リ ス塩酸 （p H 7. 0 ) 2 0 を加え、 室温で 4 時間撹拌して蛋白質を還元、 変性及び溶解させた。 この 溶解液を 0. 5 mM還元型グルタチオ ン、 0. I mM酸 化型グルタチオン及び 2 M尿素を含む 5 O mM ト リ ス塩 酸 （ p H 8. 5 ) 2 0 0 0 の入ったビーカ一 （スター ラ一にて撹拌） 中に徐々に滴下して 1 0 0倍に希釈した, 滴下終了後、 4 °Cにて 2 日間以上放置し、 その後、
3 0 0 0回転 Z分で 3 0分間遠心分離を行ない、 沈澱を 除去して上清 2 Hを得た。
かく して得られた上清中には、 再構成した M— C S F が存在している。
上記で得た遠心上清の内の 1 を、 限外炉過器 （ァ ミ コン社製、 YM— 1 0膜 （ア ミ コン社製） 使用） を用い て濃縮し、 濃縮液を 1 0 0 0 0回転 分で 2 0分間遠心 分離し、 沈殿を除去して上清を得た。 この上清に更に硫 酸アンモニゥム （硫安） を 3 0 %飽和となる量で加え、 再度同様に遠心分離し、 以下の条件で竦水性相互作用ク ロマ トグラフィ 一を行なった。
カラム ： T S Kゲルフ エニル 5 PW (7. 5 mmiDx 7 5 mm、 トーソー社製）
溶出液 A ： 3 0 %飽和硫安含有 5 0 mMリ ン酸ナ ト リ ウ
ム緩衝液 （P H 7. 4 )
溶出液 B ： 5 0 mMリ ン酸ナ ト リ ウム緩衝液 （p H
7. 4 )
流 速 ： 1. 0 分
フラ ク シ ョ ン容積 ： 1 i /千ユーブ Z分
濃度勾配 時間 （分） %
0 0
7 0
4 0 0 0
4 5 0 0
5 0 0
6 0 0
上記の結果、 M— C S F活性はフラ ク シ ョ ン Νο· 4 0 〜 4 2 ( 8〜 6 %飽和硫安濃度） の画分に溶出された。 該活性部分を分取し、 上記限外^過器にて 5 0 mMリ ン 酸ナ ト リ ウム （p H 7. 4 ) に対して溶媒交換を行ない 以下の条件で D E A E— 5 PWィォン交換高速液体ク 口 マ トグラフィ 一を行なった。
カラム ： D E A E— 5 P W ( 7. 5腿 1' D. x 7 5 mm、 ト
一ソー社製）
溶離液 A ： 5 0 mMリ ン酸ナ ト リ ウム緩衝液 （p H
7. 4 )
溶離液 B : l . 0 M N a C 含有 5 0 mMリ ン酸ナ ト リ ゥム緩衝液 （Ρ Η 7. 4)
流 速 ： 1. 03? /分
フラ ク シ ョ ン容積 ： 1. 0 ^/チューブ Ζ分
濃度勾配 ： 時間 （分） ％ Β
0 0
7 0
4 2 3 0
4 7 1 0 0
5 2 1 0 0
5 7 0
6 2 0
上記 D E A E— 5 PWィォン交換高速液体ク ロマ トグ ラ フィ 一の結果 （溶出パターン） より、 フラ ク シ ョ ン No.3 1及び 3 2 ( 0. 1 8〜 0. 2 0 M N a C 濃 度） に認められる ピークが M— C S Fに相当し、 該ピー クを集めて、 本発明ヒ ト M— C S F誘導体を得た。 上記各精製工程での本発明ヒ ト M— C S F誘導体の活 性、 蛋白量、 比活性及び精製度を求めた結果を下記第 1 表に示す O
Figure imgf000043_0001
(9) M - C S F誘導体 （E.coli[3-214]-M-CSF ) の
S D S - P A G E
レム リの方法 CLaemmli ' υ· Κ. , Nature, 277 , 680 (1970)〕 に従い、 上記精製サンプルをレムリのサンプル バッ ファー [2— Μ Ε+ 及び 2— ME -] の夫々に溶解 し、 9 5 で 5分間加熱処理後、 マイ ク ロスラブゲルを 用いて電気泳動を行なった [装置 ： マリ ソル産業社製又 は第一化学薬品社製] 。 尚、 分子量マーカーと しては、 プレスティ ン ドマーカー （バイオラ ッ ド社製） を用い、 染色はクマシ一プリ リ アン 卜ブルー R— 2 5 0によった その結果、 E.coli[3-2: ]-M- CSF の分子量は、 2—
M E— 状態で約 5 2 5 0 0であり、 2— M E T 状態で約 2 6 9 0 0であり、 この位置に単一バン ドと して泳動さ 0
実施例 2
(1) プラス ミ ド P trp IL - 2X - M - CSF109の作製 プラスミ ド pcDM-CSFll-185 [M - C S F遣伝子
( ;i c M l l c D NA、 約 2. 5 kb) を保有するプラス ミ ド pcDM - CSF11から作製した （特開平 1 - 1 0 4 1 7 6 号公報参照） ] を、 制限酵素 Seal及び BamHI で消化して Scal-BamHI D N A断片 （約 4 5 0 bp) をァガロースゲ ル電気泳動にて単離精製した。
次いで得られた D N A断片の Seal切断端に下記合成リ ンカー （B) を T 4 D N A リガーゼにより連結させ、 Seal切断端側に制限酵素 Xbalの切断端を有する Xbal-Bam
HID N A断片 （約 4 8 0 bp) を得た。
合成リ ンカ一 （B) ：
2nd SD ter
5' - CTA GAA CGG AGG ACT CAT TGATG TCA GAA T - 3 '
TT GCC TCC TGA GTA ACTAC AGT CTT A start
(Box) かく して得られた D NA断片を、 ヒ ト I L一 2発現プ ラス ミ ド p trp IL-2D8A (特開昭 63— 1 29 5 8号公 報参照） の Xbal、 BamHI 切断部位に挿入して、 所望のプ ラス ミ ド P trp IL-2X-M-CSF109を得た。
得られたプラス ミ ド P trp IL-2X-M-CSF 109 は、 大腸 菌 ト リ ブ トフ ァ ンプロモータ一支配下の転写ュニッ ト内 に、 2種のポリペプチ ドがコー ドされている。 その一つ は翻訳開始の Met 、 ヒ ト I L— 2ァ ミ ノ末端側 6 0ア ミ ノ酸及び合成リ ンカー D NA配列により生じる 4ア ミ ノ 酸からなる 6 5アミ ノ酸のポリペプチ ドであり、 他の一 つは翻訳開始の Met と式 （ 1) で表わされるア ミ ノ酸配 列の 2位ア ミ ノ酸（Ser) から 1 5 1位アミ ノ酸（Thr) ま での 1 5 0ア ミ ノ酸とからなるポリべプチ ドである。 (2) P trp IL-2X-M-CSF 402 の作製
プラス ミ ド P trp IL-2X-M-CSF 109 を制限酵素 BstEII と Sailで切断して、 約 1. 5kbの DN A断片を得た。 一方、 プラスミ ド P trP IL-2X-M-CSF 202 を同様に制 限酵素 BstEII及び Sealで切断して、 約 3. 3 kbの D N A 断片を得た。
上記両 D NA断片を T 4 D N Aリガーゼを用いて連結 し、 これを大腸菌 HB101 のコ ン ビテン トセルに形質転換 して、 所望のプラス ミ ド P trp IL-2X- -CSF 402 を有す る大腸菌 HB101 を得た。
かく して得られたプラス ミ ド P trp IL-2X-M-CSF 402 は、 大腸菌 ト リプ卜ファ ンプロモーター支配下の転写ュ ニッ ト内のセカン ドシス ト ロ ンに、 翻訳開始の Met と式 ( 1 ) のァミ ノ酸配列の 2位アミ ノ酸（Ser) から 1 8 2 位ア ミ ノ酸（Ala) までの 1 8 1ア ミ ノ酸とのヒ ト Μ ·
C S F誘導体からなるポリべプチ ドをコ一 ドしている。 (3) p trp IL-2X- -CSF 403 の作製
プラス ミ ド P trp IL-2X-M-CSF 109 を制限酵素 BstEII と Sealで切断して、 約 1. 5kbの DN A断片を得た。 一方、 プラスミ ド P trp IL.-2X- -CSF 203 を同様に制 限酵素 BstEII及び Sealで切断して、 約 3. 4 kbの D N A 断片を得 /し O
上記両 D N A断片を T 4 D NAリガーゼを用いて連結 し、 これを大腸菌 HB101 のコ ン ビテン トセルに形質転換 して、 所望のプラス ミ ド P trp IL-2X-M-CSF 403 を有す る大腸菌 HB101 を得た。
かく して得られたプラス ミ ド P trp IL-2X-M-CSF 403 は、 大腸菌 ト リブトフ ァ ンプロモータ一支配下の転写ュ ニッ ト内のセカン ドシス トロ ンに、 翻訳開始の Met と式 ( 1 ) のァ ミ ノ酸配列の 2位ア ミ ノ酸（Ser) から 2 1 2 位ア ミ ノ酸（Pro) までの 2 1 1アミ ノ酸とのヒ ト M . C S F誘導体からなるポリべプチ ドをコ一 ドしている。
(4) p trp IL-2X- -CSF 404 の作
プラスミ ド P trp IL-2X-M-CSF 109 を制限酵素 BstEII と Sealで切断して、 約 1. 5kbの D N A断片を得た。
—方、 プラスミ ド P trp IL-2X-M-CSF 20 を同様に制 限酵素 BstEII及び Sealで切断して、 約 3. 5 ktの D N A 断片を得た。
上記両 D N A断片を T 4 D N Aリガーゼを用いて連結 し、 これを大腸菌 HB101 のコ ン ビテン トセルに形質転換 して、 所望のプラス ミ ド P trp IL-2X- -CSF 40 を有す る大腸 ¾ΗΒ101 を得た。
かく して得られたブラス ミ ド P trp IL-2X-M-CSF 404 は、 大腸菌 ト リブ トフ ァ ンプロモーター支配下の転写ュ ニッ ト内のセカン ドシス トロンに、 翻訳開始の Met と式 ( 1 ) のァ ミ ノ酸配列の 2位ア ミ ノ酸（Ser) から 2 5 6 位ア ミ ノ酸（Gly) までの 2 5 5ア ミ ノ酸とのヒ ト M ·
C S F誘導体からなるポリべプチ ドをコ一 ドしている。
(5) p trp IL-2X- -CSF 405 の作製
プラ スミ ド P trp IL-2X-M-CSF 109 を制限酵素 BstEII と Sealで切断して、 約 1. 5 kbの D N A断片を得た。
—方、 プラス ミ ド P trp IL-2X-M-CSF 205 を同様に制 限酵素 BstEII及び Sealで切断して、 約 3. 6 kbの D N A 断片を得た。
上記両 D N A断片を T 4 D N Aリガーゼを用いて連結 し、 これを大腸菌 HB101 のコ ンビテン 卜セルに形質転換 して、 所望のプラス ミ ド P trp IL-2X-M-CSF 405 を有す る大腸菌 HB101 を得た。
かく して得られたプラス ミ ド P trp IL-2X-M-CSF 405 は、 大腸菌 ト リブトフ ァ ンプロモーター支配下の転写ュ ニッ ト内のセカ ン ドシス ト ロ ンに、 翻訳開始の Met と式 ( 1 ) のア ミ ノ酸配列の 2位ア ミ ノ酸（Ser) から 3 0 0 位ア ミ ノ酸（Gin) までの 2 9 9ア ミ ノ酸との ヒ ト Μ ·
C S F誘導体からなるポリべプチ ドをコ一 ドしている。 (6) p trp IL-2X-M-CSF 406 の作
プラスミ ド P trp IL-2X-M-CSF 109 を制限酵素 BstEII と Sealで切断して、 約 1. 5 kbの D N A断片を得た。
—方、 プラスミ ド P trp IL-2X-M-CSF 206 を同様に制 限酵素 BstEII及び Sealで切断して、 約 3. 7 kbの D N A 断片を得た。
上記両 D N A断片を T 4 D NAリガーゼを用いて連結 し、 これを大腸菌 HB101 のコ ンビテン 卜セルに形質転換 して、 所望のプラス ミ ド P trp IL-2X-M-CSF 406 を有す る大腸菌 HB101 を得た。
かく して得られたブラス ミ ド P trp IL-2X- -CSF 406 は、 大腸菌 ト リ ブ トフ ァ ンプロモー夕一支配下の転写ュ ニッ ト内のセカ ン ドシス トロ ンに、 翻訳開始の Met と式
(1 ) のア ミ ノ酸配列の 2位ァ ミ ノ酸（Ser) から 3 32 位ア ミ ノ酸（Ala) までの 3 3 1ア ミ ノ酸とのヒ ト Μ · C S F誘導体からなるポリべプチ ドをコ一 ドしている。
(7) Μ - C S F誘導体の発現
上記 (1)〜(6)で得た各プラス ミ ドを、 大腸菌 S G 2 1 0 5 8株 [ J- Bacteriol. , 164, 1124-1135 (1985)〕 に形 質転換法により導入して、 形質転換体 [夫々 E. coli SG 21058 /p trp IL-2X-M- CSF 109 、 E. coli SG21058 /p trp IL - 2X - M - CSF 402、 E. coli SG21058 /p trp IL-2X - M- CSF 403 、 E. coli SG21058 /p trp IL-2X-M- CSF 404 、 E. coli SG21058 /p trp IL-2X-M- CSF 405 及び E. coli SG21058 /p trp IL-2X-M- CSF 406 と命名ォる：] を得た。
之等の形質転換体を、 5 0 gZ^のアンピシリ ンを 含む L B培地 (T. Maniatis, E.F.Fritsch and J.
Sambrook , Molecular Cloning, A Laborat iry Manual , p440 (1982) , Cold Spring Harbor Laboratory) 中" 7? 3 7でで一晚培養後、 その培養液 0. 5^を、 1 %カザ ミ ノ酸、 5 g 塩酸チア ミ ン、 2 0 gZa^ Lニシ スティ ン及び 5 0〃 g / アンピシリ ンを加え、 ダルコ —ス濃度を 0. 4 %に調整した M 9培地 （同上文献参照） 5 0^に添加し、 3 7 °Cで 8時間振盪培養後、 遠心
( 50 0 Orpm ) して菌体を回収し、 生産された蛋白質 を実施例 1の (7)と同様にして、 S D S— P A G E及びゥ エスタ ンブロッテイ ング法により解析した。
その結果、 セカ ン ドシス ト ロ ンにコー ドされている M — C S Fは、 E. coli SG21058 /p trp IL-2X-M-CSF 109、 E. coli SG21058 /p trp IL-2X-M- CSF 402 、 E . coli SG21058 /p trp IL-2X-M- CSF 403 、 E . coli S621058 /p trp IL-2X-M- CSF 404 、 E. coli SG21058 /p trp IL-2X-M - CSF405及び E. coli SG21058 /p trp IL-2X- - CSF 406 において、 夫々予想される分子量の位置に検出 された。
(8) M— C S F誘導体 （E.coli[4-153]- M-CSF ) の分離、 精製
(1) 大腸菌からの M— C S F画分の調製
上記 (1)で得たプラスミ ド P trp IL-2X-M-CSF 109 を保 持する大腸菌 S G 2 1 05 8株 7. 5 g (湿重量） に、 5 O mMト リ ス塩酸緩衝液 （p H 7. 0) を加え全量を 1 0 と し、 充分に撹拌した。 次にリ ゾチーム 2mgZ を 6 、 続けて 0. 1 4 M E D TA 4 を加え、 4 でで 1 5分間撹拌処理し、 超音波処理 （ 2 0 K H z、 1 0分間、 2 0 0W) を行ない、 更に 1 0 0 0 0回転ノ 分で 2 0分間遠心分離を行ない沈渣を得た。 これを更に 洗浄用緩衝液 （2 %ト リ ト ン X I 0 0を含む 5 0 mMト リ ス塩酸緩衝液、 P H 7. 0) にて洗浄後、 同条件で再 度遠心分離を行ない、 この操作を 2回繰返して、 M— C S F画分 （沈渣） を得た。
(2 ) M— C S F画分から M— C S Fの再構成
上記 （ 1 ) で得た M— C S F画分に、 7 M塩酸グァニ ジン及び 2 5 mM 2—メルカプ トエタノールを含む 5 0 mMト リ ス塩酸緩衝液 （P H 7. 0) 20 Wを加え、 室 温で 4時間以上撹拌して蛋白質を還元、 変性及び溶解さ せた。 この溶解液を予め 0. 5 mM還元型ダルタチオン 0. I mM酸化型グルタチオ ン及び 2 M尿素を含む 5 0 mMト リ ス塩酸緩衝液 （ p H 8. 5 ) 2 0 0 0 ^の入つ たビーカー （スターラーにて撹拌） 中に徐々に滴下し、 その後、 4°Cにて 2日間以上放置した。 次に溶液を 3 5 0 0回転 分で 3 0分間遠心分離を行ない、 沈澱を 除去して上清を得た。
かく して得られた上清中には、 再構成した M— C S F が存在している。
( 3 ) M— C S Fの精製
上記 （2) で得た遠心上清を以下の通り精製した。 (3-D 疎水性高速液体ク口マ トグラフィ ー
上記遠心上清を限外炉過器 （ア ミ コ ン社製、 メ ンブラ ン ： YM— 1 0膜 （ア ミ コン社製） 使用） を用いて濃縮 し、 濃縮液に硫酸ァンモニゥムを 3 0 %飽和溶液となる ように加え、 1 0 0 0 0回転 分で 2 0分間遠心分離し 沈殿を除去して上清を得た。 この上清を 0. 4 5 / mミ リ ポア一フィ ルターに通した後、 2回に分けて以下の条 件で疎水性相互作用ク 口マ トグラフィ ーを行なった。 カラム ： T S Kゲルフヱニル 5 PW ( 7. 5 mmlDx 7 5 mm、 トーソ一社製）
溶出液 A ： 3 0 %飽和硫安含有 4 O mMリ ン酸ナ ト リ ウ
ム緩衝液 （P H 7. 4)
溶出液 B ： 4 0 mMリ ン酸ナ ト リ ウム緩衝液 （p H
7. 4 )
流 速 ： 1. 0 ^ノ分
フラク シ ョ ン容積 ： 1 ^/チューブ Z分
濃度勾配 時間 （分） B%
0 0
7 0
4 0 0 0
4 5 0 0
5 0 0 上記の結果、 M— C S F活性は硫安濃度 1 1〜 6 %の 画分に溶出された。 該活性部分を分取し、 上記限外炉過 器にて 4 0 mMリ ン酸ナ ト リ ウム （p H 7. 4) に対し て溶媒交換を行なつた。
(3-2) 陰イオン交換高速液体ク ロマ ト グラ フ ィ ー
上記（3-1) で得た画分を 4回に分けて、 以下の条件で
D E A E— 5 PW陰ィォン交換高速液体クロマ トグラフ ィ 一を行なった。
カラム ： T S Kゲル D E A E— 5 PW ( 7. 5 mm I · ° · X
7 5 mm、 ト ーソ一社製）
溶離液 A ： 5 0 mMリ ン酸ナ ト リ ウム緩衝液 （ p H
7. 4 )
溶離液 B : l . 0 M N a C 含有 5 0 mMリ ン酸ナ ト リ ゥム緩衝液 （P H 7. 4 )
流 速 ： 1. 0 ノ分
フラク シ ョ ン容積 ： 1. 0^ノチューブノ分
濃度勾配 ： 時間 （分） ％ B
0 0
5 0
5 5 3 0
6 0 1 0 0
6 5 1 0 0 7 0 0
上記 D E A E— 5 PWィォン交換高速液体ク ロマ 卜グ ラ フィ 一の結果 （溶出パターン） よ り、 フラ ク シ ョ ン No.4 1及び 4 2 ( 0. 2 1〜 0. 2 2 M N a C ^濃 度） に認められる ピークが M— C S Fに相当し、 該ピー クを集めて、 精製された本発明ヒ ト M— C S F誘導体 (E.coli[4-153]-M-CSF ) を得た 0
(9) M— C S F誘導体 （E.coli[3-214]-M-CSF ) の N - 末端ァ ミ ノ酸配列の決定
上記 (8)の（3-2) で得られた M— C S F誘導体 （E.coli
[4-153]-M-CSF ) の N—末端ァ ミ ノ酸配列を、 気相シー クェンサー （アプライ ド * バイオシステムズ社製） を用 いて決定した。
その結果、 Ser-Glu-Tyr-Χ' -Ser© と Met-Ser-Glu- Tyr-X'-Serの配列とが、 約 7〜 8対 1の割合で認められ た。
尚、 上記配列中、 アミ ノ酸 （χ') は同定し得ず、 遣伝 子構造から Cys であると推定した。
θ) Μ— C S F誘導体 （E.coli[3-153]-M-CSF ) の改良 分離、 精製
( 1 ) 大腸菌からの M— C S F画分の調製
プラス ミ ド P trp IL-2X- -CSF 101 を保持する大腸菌 S G 2 1 0 5 8株 7. 5 g (湿重量） に、 5 0 mMト リ ス塩酸緩衝液 （p H 7. 0) 1. 0^を加えて充分に撹 拌した。 次にリ ゾチーム 4mg/^を 及び E D T Aを 最終濃度が 1 0 mMとなるように加え、 4 °Cで 1 5分間 撹拌処理し、 超音波処理 （2 0 KH z、 1 0分間、
2 0 0 W) を行ない、 更に l O O O O x g/分で 2 0分 間遠心分離を行ない沈渣を得た。 これを更に洗浄用緩衝 液 （2 %ト リ ト ン X 1 0 0を含む 5 0mMト リ ス塩酸、 p H 7. 0) にて洗浄後、 同条件で再度遠心分離を行な い、 この操作を 2回繰返して、 M— C S F画分 （沈渣） を得た。
(2) M— C S F画分から M— C S Fの再構成
上記 （ 1 ) で得た M— C S F画分に、 7 M塩酸グァニ ジン及び 2 5mM2—メルカプトエタノールを含む 5 0 mMト リ ス塩酸緩衝液 （p H 7. 0) 2 0^を加え、 室 温で 4時間以上撹拌して溶解させた。 この溶解液を予め 0. 5 mM還元型グルタチオ ン、 0. l'mM酸化型グル タチオン及び 2 M尿素を含む 5 O mMト リ ス塩酸緩衝液 ( ρ Η 8. 5 ) 2 0 0 0 * の入ったビーカー （スタ ーラ 一にて撹拌） 中に徐々に滴下し、 その後、 4。Cにて 2日 間以上放置した。 次に溶液を l O O O O x g,分で 3 0 分間遠心分離を行ない、 沈襻を除去して上清を得た。 かく して得られた上清中には、 再構成した M— C S F が存在している。
( 3 ) M— C S Fの精製
上記 （ 2 ) で得た遠心上清を以下の通り精製した。
(3-D イオン交換クロマ トグラフィ ーによる濃縮
予め 5 0 mM ト リ ス塩酸緩衝液 （p H 8. 5 ) で平衡 化しておいた Q A E—ゼ一夕 · プレップ 1 0 0 (フ アル マシア一 L B K社製） に上記 （2 ) で得た再構成液をか け、 次に上記緩衝液で充分洗浄後、 0. 5 M N a C β を含む上記緩衝液にて Μ— C S F画分の溶出を行なつす (3-2) 疎水性高速液体ク ロマ トグラフィ ー
上記で得られた画分に硫酸ァンモニゥムを 3 0 %飽和 溶液となるように加え、 1 0 0 0 0 X g Ζ分で 2 0分間 遠心分離し、 沈殿を除去して上清を得た。 この上清を 0. 4 5 m ミ リ ポア一フィ ルターに通した後、 以下の 条件で疎水性高速液体ク口マ トグラフィ ーを行なった。 カラム ： T S Kゲルフエニル 5 PW (2 1 , 5 mmlDx
1 5 0 、 ト ーソ一社製）
溶出液 A ： 3 0 %飽和硫安含有 4 0 mMリ ン酸ナ ト リ ウ ム緩衝液 （ p H 7. 4)
溶出液 B : 4 0 mMリ ン酸ナ ト リ ウム緩衝液 （ p H
7. 4 ) 流 速 ： 3. 0 ^ 分
フラク シ ョ ン容積 ： 3. 0 n&/千ューブ Z分
濃度勾配 時間 （分） B %
0 0
7 0
4 7 0 0
5 2 0 0
5 7 0
上記の結果、 M— C S F活性は硫安濃度 6〜 3 %の画 分に溶出された。 該活性部分を分取し、 限外 過器にて 4 0 mMリ ン酸ナ ト リ ウム （ p H 7. 4 ) に対して溶媒 交換を行なつた。
(3-3) 陰イオ ン交換高速液体クロマ トグラフィ ー
上記（3-2) で得た画分を、 以下の条件で陰イオ ン交換 高速液体ク ロマ トグラフィ 一にかけた。
カラム ： T S Kゲル D E A E — 5 P W ( 2 1. 5匪 1 ' D -
X 1 5 0■、 トーソ一社製）
溶離液 A ： 4 0 m Mリ ン酸ナ ト リ ウム緩衝液 （p H
7. 4 )
溶離液 B : l . 0 M N a C ^含有 4 0 m Mリ ン酸ナ ト リ ゥム緩衝液 （ p H 7. 4 )
流 速 ： 3. 0 分 フラク シ ョ ン容積 ： 3. 0 チュ一ブ Ζ分
濃度勾配 ： 時間 _(分） ％ Β
0 0
5 0
4 3 3 0
4 8 1 0 0
5 3 1 0 0
5 8 0
上記陰イオン交換高速液体ク 口マ トグラフ ィ —の結果 (溶出パターン） より、 フラク シ ョ ン ^^。' 3 5及び 3 6 ( 0. 2 8〜 0. 2 9 Μ N a C ·ί濃度） に認められる ピークが Μ— C S Fに相当し、 該ピークを集めて、 精製 された本発明ヒ ト Μ— C S F誘導体 （E.coli[3-l53]-M- CSF ) を得た。
〈本発明ヒ ト M— C S F誘導体の生物活性〉
(1) 血中半減期の測定
実施例で得た各ヒ ト M— C S F誘導体（E.coli[3_2l4] - M-CSF) 及び参考例 1 で得た CHO[-32-522]-M-CSFのそれ ぞれを M S A (マウス血清アルブミ ン） 含有生理食塩水
C 3 0 ^ /τη&) にて 2 0 g の濃度となるよ う に 希釈調整し、 之等を 1群 4匹からなる各群マウス
( B A L B Z c雄性、 7週齢） に 1匹当り 0. 2 5 ( 2 0 0 // g / k g ) の量で静脈内（i.v.)投与した。 投 与後、 経時的に血中 M— C S F量を R I Aにより求めた ( 該 R I Aによる血中半減期の測定は、 次の方法により 実施した。 即ち、 検体サンプル （血液） 又は標準 M— C S F (参考例 2で得た E. coli [3- 153] M-CSF) 溶液
1 0 β £ , N a 12。 I で標識した M— C S F (上記標 準 M— C S Fをョー ドゲン法により 125 I にて標識した もの） を 1 0 0 中に 1 0 0 0 0 cpm 含む溶液、 及び 抗 M— C S Fゥサギ血清 （後記する方法により得られる ポリ クローナル抗体 0 C T 5 1 1を、 0. 1 % B S A / P B S Z 0. 0 5 %チメ ロザールで 4 0 0 0 0倍希釈し たもの） 2 0 0 // の混合液を、 室温で 2 0時間又は 4 °Cで 4 8時間放置して、 抗原抗体反応を行なわせ、 反応 終了後、 標識 M— C S Fの結合物と非結合物を 2抗体法 にて分離する。 該分離は、 まず 0. 1 % B S A Z P B S / 0. 0 5 %チメ ロザールで 4 0 0倍に希釈した正常ゥ サギ血清 1 0 0 ^ と、 同様に 4 0倍に希釈した抗ゥサ ギ I g G血清 1 0 0 ^ 、 及び 2 0 0 ^ の P B S に溶 かした 1 2. 5 %ポリエチレングリ コールを加え、 3 0 分間 4 eCで反応させ、 1 5分間 3 0 0 0 rpm で遠心分離 し、 デカ ンテーシヨ ンして標識 M— C S F と抗体との結 合物である沈渣を得る。 沈渣はガンマ一カウンターで 1 分間カウン ト して標準溶液からスタ ンダー ドカーブを作 成し、 本発明 M— C S F誘導体を含有する検体サンプル にっき、 上記操作を操り返して同様にして測定したカウ ン ト数を、 上記スタ ンダー ドカーブ上にプロ ッ ト して、 該検体中の M— C S F濃度を求める。
かく して得られた結果を下記第 2表に示す。
第 2 表
Figure imgf000060_0001
尚表中単位は ng/ である。
上記表より E.coli[3-214]-M-CSF 及び CHO [- 32 - 522] - M
-CSFの血中半減期は、 それぞれ 4 6. 2分及び 5 3. 0 分であることが判る。 尚、 上記 R I Aにおいて用いた M— C S Fに対するポ リ ク ローナル抗体は次のような性質を有する。
1 ) 本発明で用いられるポリ ク ローナル抗体は以下の方 法により作製された。
ポリ ク ローナル抗体の作製は、 2. 5 kgから 3. 0 kg の雌のニュージラ ン ドホワイ ト種のゥサギに、 CH0[- 32- 522]-M-CSFの精製品 （P B Sに溶解） を一羽当り 2 0 β gを等量のフロイ ン トの完全アジュパン ト と共にゥサ ギの皮内に多点免疫し、 それ以降は同 2 0 ^ gをフロイ ン 卜の不完全ァジュバン ト と共に 1ヶ月おきに免疫し、 最初の免疫に合わせて合計 7回免疫した。 免疫終了後、 1週間後にゥサギより全採血して抗血清を得た。
得られた 3種の抗体の内の一つを O C T 5 1 1 と命名 し、 一 8 0でで保存した。
2 ) 本発明誘導体の血中半減期の測定に用いるポ リ ク ロ ーナル抗体 0 C T 5 1 1は以下の性質を有する。
① 抗体力価
CH0[- 32-522]-M-CSFを、 ョー ドゲン法にて 125 I を標 識してこの 125 I標識 CH0[-32-522]-M-CSF 1 0 kcpmの内 5 0 %と結合できる抗血清の希釈倍率を抗体価と した。
その結果、 O C T 5 1 1の抗体力価は 8 0 0 0 0であ た o ② 中和活性
マウスの骨髄細胞を使用したコロニーアツセィ法で中 和活性を求めた所、 0 C T 5 1 1の中和活性は、 O C T 5 1 1 1 当りで CH0 [- 32-522]-M-CSF を 1〜 2 X
1 06 単位が中和できた。
③ 交差反応性
この 0 C T 5 1 1はマウス C S F (L-Cellの培養上清） 及びヒ 卜 GM— C S F (アマシャ ム社） と全く交差せず、 更にヒ ト I L— 1 α (特開昭 63— 1 64899号公報 参照） 、 I L一 1 ;5 (特開昭 63 - 1 52 39 8号公報 参照） 、 I L一 2 (アマシャム社） 、 TNF— α (アマ シャム社） にも全く交差しなかった。

Claims

請 求 の 範 囲
下式で表わされるア ミ ノ酸配列中、 1 5 1位7 か ら 5 2 0位 Val の領域のいずれかに C末端を有し、 該 配列の N末端に Met が付加されるか又は N末端 Val が 欠失されることのあるア ミ ノ酸一次配列を有すること を特徵とする生物活性な組換え型ヒ ト M— C S F誘導 体。
Val-Ser-Glu-Tyr-Cys-Ser-His-Met-Ile-Gly-Ser-Gly- His-Leu-Gln-Ser-Leu-Gln-Arg-Leu-I le-Asp-Ser-Gln- Met-Glu-Thr-Ser-Cys-Gln-Ile-Thr-Phe-Glu-Phe-Val- Asp-Gln-G lu-Gln-Leu-Lys- Asp-Pro- Val- Cys-Ty r-Leu- Lys - Lys - Ala - Phe - Leu - Leu - Val - Gin - Asp - 1 JLe - Met - Glu - Asp-Thr-Met-Arg-Phe-Arg-Asp-Asn-Thr-Pro-Asn-Ala- I le-Ala-I le-Val-Gln-Leu-Gln-Glu-Leu-Ser-Leu-Arg- Leu-Lys-Ser-Cys-Phe-Thr-Lys-Asp-Tyr-Glu-Glu-His- Asp - Lys - Ala - Cys - Val - Arg - Thr - Phe - Tyr - Glu - Thr - Pro - Leu-Gln-Leu-Leu-Glu-Lys-Val-Lys-Asn-Val-Phe-Asn- Glu-Thr-Lys-Asn-Leu-Leu-Asp-Lys-Asp-Trp-Asn-I le- Phe-Ser-Lys-Asn-Cys-Asn-Asn-Ser-Phe-Ala-Glu-Cys- Ser-Ser-Gln-Asp-Val-Val-Thr-Lys-Pro-Asp-Cys-Asn- Cys - Leu - Tyr - Pro - Lys - Ala - 1 le - Pro - Ser - Ser - Asp - Pro - Al a - Ser- Val - Ser - Pro - His - Gin - Pro—Leu - Ala - Pro - Ser - 一 dsv - <ιΐίエ- ne -oユ - IBA-Jss - USY - aqd - SJV-OJ^ - τΐθτ; - 0ュ3
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6£fI0/06df/J3d Thr - Gly - His - Glu - Arg - Gin - Ser - Glu - Gly - Ser-Ser - Ser- Pro-Gln-Leu-Gln-Glu-Ser-Val-Phe-His-Leu-Leu-Val- Pro-Ser-Val-I le-Leu-Val -Leu-Leu- Ala-Val-Gly-G ly- Leu - Leu - Phe - Tyr - Arg - Trp - Arg - Arg - Arg - Ser - His - Gin - Glu - Pro - Gin - Arg - Ala - Asp - Ser -; Pro - Leu - Glu - Gin - Pro - Glu - Gly - Ser - Pro - I»eu - Thr - Gin - Asp - Asp - Arg - Gin - Val - Glu-Leu-Pro-Val
② 1位 Val から 1 8 2位 A1& までのア ミ ノ酸一次配列 を有する請求項①に記載の M— C S F誘導体。
③ 1位 Val から 2 1 2位 P o までのア ミ ノ酸一次配列 を有する請求項①に記載の M— C S F誘導体。
④ 1位 Val から 2 5 6位 Gly までのアミ ノ酸一次配列 を有する請求項①に記載の M— C S F誘導体。
⑤ 1位 Val から 3 00位 Gin までのアミ ノ酸一次配列 を有する請求項①に記載の M— C S F誘導体。
⑥ 1位 Val から 3 3 2位 Ala までのア ミ ノ酸一次配列 を有する請求項①に記載の M— C S F誘導体。
⑦ 1位 Val から 5 2 0位 Val までのア ミ ノ酸一次配列 を有する請求項①に記載の M— C S F誘導体。
⑧ 2位 Ser から 1 5 1位 Thr までのァ ミ ノ酸一次配列 を有する請求項①に記載の M— C S F誘導体。
⑨ 2位 Ser から 1 8 2位 Ala までのァ ミ ノ酸一次配列 を有する請求項①に記載の M— C S F誘導体。
⑩ 2位 Ser から 2 1 2位 Pro までのァミ ノ酸一次配列 を有する請求項①に記載の M— C S F誘導体。
⑪ 2位 Ser から 2 5 6位 Gly までのアミ ノ酸一次配列 を有する請求項①に記載の M— C S F誘導体。
⑫ 2位 Ser から 3 0 0位 Gin までのアミ ノ酸一次配列 を有する請求項①に記載の M— C S F誘導体。
© 2位 Ser から 3 3 2位 Ala までのア ミ ノ酸一次配列 を有する請求項①に記載の M— C S F誘導体。
⑭ 請求項②〜⑮に記載の M— C S F誘導体の発現べク ター。
p trp IL-2X-M-CSF 201 p trp IL-2X- -CSF 202 . p trp IL-2X- -CSF 203 、 p trp IL-2X- -CSF 204 、 p trp IL-2X-M-CSF 205 、 p trp IL-2X-M-CSF 206 、 p trp IL-2X- -CSF 109 、 p trp IL-2X- -CSF 402 、 p trp IL-2X-M-CSF 403 ゝ trp IL-2X-M-CSF 404 、 p trp IL-2X-M-CSF 405 及び p trp IL-2X-M-CSF 406 である請求項⑭に記載のべクタ一。
® 請求項 @に記載のベタターで形質転換された形質転 換体。
© E. coli SG21058 / p trp IL-2X- -CSF 201
E. coli SG21058 / p trp IL-2X- -CSF 202 E. coli SG21058 / p trp IL-2X-M-CSF 203 ヽ
E. coli SG21058 / p trp IL-2X-M-CSF 204 、
E. coli SG21058 / p trp IL-2X-M-CSF 205 、
E. coli SG21058 / p trp IL-2X-M-CSF 206 、
E. coli SG21058 / p trp IL-2X-M-CSF 109 、
E. coli S621058 / p trp IL-2X-M-CSF 402 、
E. coli SG21058 / p trp IL-2X-M-CSF 403 、
E. coli SG21058 / p trp IL-2X-M-CSF 404 、
E. coli SG21058 / p trp IL-2X-M-CSF 405 及び
E . coli SG21058 / p trp IL-2X-M-CSF 406 である請 求項⑩に記載の形質転換体。
⑩ 請求項 ®に記載の形質転換体を培養して、 発現され る M— C S Fを採取することを特徵とする請求項①に記 載の M— C S F誘導体の製造方法。
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