WO1988005816A1

WO1988005816A1 - Polypeptide

Info

Publication number: WO1988005816A1
Application number: PCT/JP1987/000058
Authority: WO
Inventors: Kiyoshi Yamauchi; Ryuya Horiuchi; Tadashi Yamamoto; Kumao Toyoshima
Original assignee: Takeda Chemical Industries, Ltd.
Priority date: 1987-01-28
Filing date: 1987-01-28
Publication date: 1988-08-11
Also published as: JPS6420086A; EP0277563A1

Description

明細

ポベプチ

技術分野

本発明はポリペプチドに関する。さらに詳しくは、本発明はプロティンジスルフィドイソメラーゼ活性を有するポリぺプチドに関する。

背景技術 .

ジスルフィド結合の形成がタンパク質の立体構造の保持やそれに伴う活性発現にきわめて重要であることは一般的に知られている。真核細胞ではジスルフィド結合は小胞体でタンパク焚翻訳と同時にしくは翻訳後直ちに形成される [ J. Biol. Chem. , 2 5 7 , 8 84 7 ( 1 9 8 2 )；, このジスルフィド結合は Jj! vi o で非酵素的に形成される力 J_n vivo よりも反応速度がおそく、しかも vitro での条件が in vivo を反映していないことから、 Anfinsen らは J_Q vivo ではジスルフィドインターチェンジプロテインというタンパク質がジスルフィド結合の形成に機能していると考えた [ J. Biol. Chem. , 2 3 8 ,

6 2 8 ( 1 9 6 3 )]。この考えは現在でも依然として仮説である力 in_ vitro において還元型ゃスクランブル型のリボヌクレアーゼ（とに不活性型）に作用して正しいジスルフィド結合の形成を促進し活性型とする酵素が種々の真核生物において発見され精製されている

Biochemistry. 2 0 , 6 5 94 ( 1 9 8 1 ); Biochem. J. , 2 1 3 ,

2 2 5 ( 1 9 8 3 ); Biochem. J . , 2_1 3_, 24 5 ( 1 9 8 3 ):。スク' ランブル型リボヌクレアーゼは変性条件下で還元再酸化処理を行い調製し/: ので、活性型リボヌクレアーゼが有する 4対のジスルフィド結合が自由に組み換えられて生成する種々の分子種の混合物であろ

Biochem. J.. 2 1 3 , 2 3 5 ( 1 9 8 3 , 不活性型リボヌクレア一ゼを活性型とする酵素に対してはプ C7チインジスルフィドイソメラ rf な用紙ーゼ（P D I .E C 5.3.4.1 )という名称が与えられており、分子量

5 2 0 0 0〜 6 2 0 0 0の同一なサブュニヅト 2個からなる二量体で等電点は 4.0〜 4.5である [ Trends in Biochem. Sci., 9_, 4 3 8 ( 1 9 8 4 ); Methods in Enzymol .， 1 0 7 , 2 8 1 ( 1 9 8 4 )]₀ なお、既知のプロテインジスルフィドレダクターゼ（=グルタチオンィンシュリントランスヒドロゲナ一ゼ， E C 1 .8.4.2) は PD I と同一分子であると考えられている [ Eur. J. Biochem., 3 2 , 2 7 ( 1 9 7 3 ) ； Biochemistry, 1 , 2 1 1 5 ( 1 9 7 δ )]_c

1 9 8 5年、 Edman らはラヅト肝 P D Iの相捕 D N Aのクローニング

10 に成功し、その全塩基配列を明らかにした [ Nature, 3 1 7 , 2 6 7

(I 9 8 5 )]。 ·ラト肝 P D Iは 4 8 9アミノ酸から構成され、さらにそのアミノ末端に 1 9ァミノ酸からなるシグナルぺプチドが付加されている。さらに、リボヌクレオチドレダクタ一ゼ反応など種々の酸化還元反応のコフアクターとして知られている大腸菌チォレドキシン [Eur. J. Biochem. , 6_, 4 7 5 ( 1 9 6 8 ): Pro. Nat 1. Acad. Sci. USA, 7 2 , 2 3 0 5 (1 9 7 5); Methods in Enzy ol. , 1 0 7 , 2 9 5

( 1 9 8 4 )]と柜同性のある領域をァミノ末端とカルボキシル末端近傍の 2箇所にもっていた。各領域には 2個の Cys を持った相同の配列 (Trp— Cys— Gly— His— Cys— Lys)が存在し、これがジスルフィドとスルフヒドリルの交換を通して P D I反応を触媒すると考えられている _c なお、大腸菌チォレドキシンが還元型およびスクランブル型リボヌクレアーゼを基質として P D I活性を示すことも最近報告されている： Pro. Natl. Acad. Sci. USA, 8 3. 7 6 4 3 ( 1 9 8 6 )]₀

P D Iの利用価値としては大腸菌で生産される組換え型タンバク赏の

リフォールディングへの適用が考えられろ , 近年の急速な遺伝子工学技術の進歩により真核生物のタンパク質が大腸菌で大量生産されるよ ό

ΞΠ ΐ一- 2 - - 1

一になつたが、この組換え型タンパク質は正しいジスルフィド結合を欠し、ていたり、誤つたジスルフィド桔合のかかり方をもっていたりす：" E B 0 Journal , 4 , 7 7 5 ( 1 9 8 5 ); in Genetic Engineerin g Vol. 4 (Williamson, R., ed pp. 1 2 7 ( 1 9 8 3 )]。従って、正しいジスルフィド結合を有する活性型の組換え型タンパク質を得るにはリフォールディングの操作が必要である。この操作は現在レドックスバ ' ファーなどを用いた酸化還元反応で化学的に行われているが、 in vivo で機能している可能性がある P D Iを利用した方が正しいジスルフィド锆合を特異的に形成できるであろう。特に多数のジスルフィド占

10 合を有する組換え型タンパク質にはきわめて有効であると考えられる。

また、 P D I 'をコ— ドする遗伝子を組換え体大腸菌に導入して大脇翻内で組換え型タンパク質に作用させること可能である。

従来法による P D Iの製造法では材料の入手が困難であり取得でき ^ P D Iの量も限られているため、純度の高い P D Iを大量生産できる技術の開発が望まれている _π ラッ卜旰 P D Iについては既にその遗 ί云子がクローニングされている「： ^aure, 3 1 7. 2 6 7 ( 1 9 8 5· )]力く、 P

D I遺伝子を大腸菌などで発現させ活性型の P D Iを精製取得した例：よ今までのところ報告されていない。また、他種の真核生物の P D Iをクローニングした例は今までのところ全く知られていない。

20 本発明者らは、甲状腺ホルモン Τ 3 ( 3.3 ' , 5— トリヨ一ドチロニン , 以下 Τ 3と略称する）と特異的に結合する夕ンぺク質（Τ 3 Binding Protein, 以下 T 3 B Pと略称する）の生物学的作用やタンパク化学的性質などについての研究も進てさた -, T 3 B Pは哺乳動物細胞細 !j 膜や細) 質に存在し、まに T 3 レセプターは細胞核に存在している二と力《 ¾ϋら .ている；：本 %明者ら：よ、ゥシ肝細胞膜から精製取 Uした T 313 Pに対する抗体の作成に成功し - Horiuchi , R. and Yama chi , Κ .

新了こな用紙 in Gじ nma Symposia on Endocrinology, 2 3 ( Center for Academic Publication Japan, Tokyo; 7XU Science Press , B¥. UtrechO pp .1 9 - 1 6 6 ( 1 9 8 6 )],遺 ί云子工学的手法を駆使して Τ 3 Β Ρタンパク質をコードする遗伝子をクローン化する努力を重ねてきた。その過程の中で、上 I己の抗 Τ 3 Β Ρ抗体をプローブとして得られたゥシ肝 Τ 3 Β Ρの c D X Αが、驚くべきことにゥシ P D I タンパク質をコードしている事実を発見した。

本発明者らは、この発見を契機として鋭意研究を重ねた锆果、本発明を完成するに至つた。

発明の開示

本発明は、 ①第 3図のアミノ酸配列を含有するポリぺプチド [以下、ヴシ P D I と略称する] (I ),②ゥシ P D Iをコードする塩基配列を含有する組み換え D N ③ D Α(Π )を含有すろベクターで形質転換された形質転換体、および④ D Ν Λ ( II )を含有するベクターで形質転換されに形質転換体を培養し、培養物中にゥシ P D 〖を生成蓄積せしめ、これを採取すことを特徵とするゥシ P D Iの製造法を提供する Λ - で一上 §己 D N A〔 Π )としては、第 3図のアミノ酸配列をコードする塩基配列を含有すろものであればいかなるものであってもよいが、たとえば第 4図の塩基配列を含有する D Αが好ましい

本発明の D Λ ,形質転換体および本発明の製造法におけるゥシ P D I としては、第 3図ァミノ酸配列で示される P D I ( I )をその一部として

本発明にお '：ナゥシ P D I >ポリぺプチドをコードする塩基配列を仃する D X Aを含有する現型ベクターは、とえば、 ( i ) ゥシ P D I をコードする R X Λ 分離し、 C \\ } 該 II N Λか 'ら単敏の相浦 D X A

ゴ-：二 - o 一

(cD XA)を、次いで二 SilD N Λを合成し、（iii) 該相捕 D .\ Aをファ一ジまたはブラスミドに組み込み、（ iv ) 得られた組み換えファージまはプラスミドで宿主を形質転換し、（V ) 得られた形質転換体を培養後、形¾転換体から適当な方法、たとえば抗 T 3 B P抗体を用いたィムノアッセィにより目的とする D N Aを含有するプラスミドを単離し、

(vi) そのプラスミ- ドから目的とするクローン化 D N Aを切り出し、

(vii) 該クローン化 D N Aをビークル中のプロモータ一の下流に連結する、ことにより製造することができる。

ゥシ P D Iをコードする R N Aは、種々のゥシ P D I産生細胞、例え

10 ばゥシ肝細胞から得ることができる。

ゥシ P D I產生細胞から R Aを調製する方法としては、グァニジンチオシァネート法 [ Chirg in, J . M. ， Biochemistry, 1 8 , 5 2 9 4 ( 1 9 7 9 )]などが挙げれる。 - このようにして得られた R Ν Αを铸型とし、逆転写酵素を用いて、た

、

クタ一としては、たとえば I I Young, R. , and Davis. R. ,

亲 Γたな用紙 Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 8_0 , 1 1 94 ( 1 9 8 3 ) Jなどが挙げられる力その他のものであって、宿主内で増殖できるものであればよい。

ブラスミドに cD M Aを組み込む方法としては、たとえば Maniatis, T. ら， Molecular Cloning, Cold Spring Harbor Laboratory, p.23 9 ( 1 9 8 2 )に記載の方法などが挙げられる。また、ファージ ' ベクターに cD N Aを組み込む方法としては、たとえば Hyiinh. T. V. らの方法二 DMA cloning, a practical approach, 1 , 4 9 (1 9 8 5 )：：などが挙げられる。このようにして得られたプラスミドゃファージ、ベクターは、適当な宿主たとえば大腸菌などに導入する。上記大腸菌例としては Escherichia coli K 1 2 DH 1 [ Proc. Natl. Acad. Sci. USA. 6 0 , 1 6 0 ( 1 9 6 8 )1, J L 03 [Nucl.

Acids. Res., . 3 0 9 ( 1 9 8 1 )] J A 2 2 1 [ J. Mol. Biol., - 2 0 , 5 1 7 ( 1 9 7 8 )j, HB 1 0 1 [ J. Mol. Biol.. 4__ ,

4 5 9 ( 1 9 6 9 )：, C 6 0 0 ί Genetics, 3 9 , 4 4 0 ( 1 9 54 )；などが挙げられる- 上記沽草菌としては、たとえば Bacil s subtilis M i I 1 4 [ Gene. 24 , 2 5 5 ( 1 9 8 3 )], 207 - 2 1 = j. Biochem. , 9 5 , 8 7 ( 1 9 84 )]などが挙げられる _c

プラスミドで宿主を形質転換する方法としては、たとえば Maniatis,

T.. つ， Molec lar Cloning, し old Spring Harbor し aboratoir. p.24 9 ( 1 9 8 2 )に記載の力 7レシゥムクロライド法あるいは力；レシゥムクロライド /ルビジウムクロライド法などが挙げふれる _c また、フマージ .ベクターは ,'-二とえば、增頒させた大腸菌にインビ卜 σパ .· ケージング法を fflいて導入することができる

このようにして得られた形質転換体中から自体公知の方法、たとえ ― I 一 . ばコロニー .ハイブリダィゼーシヨン法！: Gene. j_J]_. 6 3 ( 1 9 8 0 )：プラーク .ハイブリダィゼーシヨン [ Science, 1 9 6 , 1 8 0

( 1 9 7 7 )〕および D N A塩基配列决定法「― Proc. Nat 1. Acad. Sci. USA, 7 4 , 5 6 0 ( 1 9 7 7 ); Nucl . Acids Res. , _9_, 3 0 9

( 1 9 8 1 )]を用い、求めるクローンを選出する。

このようにして、クローン化されたゥシ P D Iをコードする塩基配列を含有する D N Aを有するベクターを保持する微生物が得られる。

後述の実施例 2で得られた Escherichia coli K 1 2 D Η 5 α/ Τ 3 Β Ρ - 2が保持するプラスミド ρΤ 3 Β Ρ— 2は、ゥシ P D I ( I ) をコードする塩基配列を含有する I〕 Ν Αを有する。該 D Ν Α中の、ゥシ P D I ( I )をコードする塩基配列は、 D N Aの一部分であると考えられる。該 D N Aの制限酵素切断位置を第 1図に示す。第 1図に示すように該 D Aは全長約 2 . 8 K bp であり、制限酵素 A at H , EcoR I , HincH , P viifl , S sp I により断片に切断される。

次に、該微生物からプラスミドゃファージ ·ベクターを単離する _c 該単離法としては、アルカリ法 [ Birmboim, II. C. ら， Nじ ci. Acids Res. , 丄， 1 5 1 3 ( 1 9 7 9 )，などが挙げられる _c

上記クローン化されたゥシ P D I をコードする塩基配列を含有する D N Aを有するブラスミドまたはファージ 'ベクタ一は目的によりそのまま、または所望により制限酵素で消化して使用することができる。

クローン化された遺伝子は、発現に適したビークル（べク夕一）中のプ口モータ一の下流に連結して発現型ベクターを得ることができる。

ベクターとして；'よ、上記大腸菌由来のプラスミド（例、 PB R 3 2 2 , PB R 3 2 5 ,pU C 1 2 , U C 1 3 ),枯草菌由来プラスミド（ί列、 pU B 1 1 0 , PT B δ , PC 1 9 4 ) .酵母由来プラスミド（例、 p S H 1 9 , p S H 1 5 ),あろいは λファージなどのパクテリオファージおよびレ卜

新た—な用紙

- 12

o 5 ウイ-ルス，ワクシニアウィルスなどの動物ウィルスなどが挙げられる = 該遺伝子はその 5 '末端に翻訳開始コドンとしての A T Gを有し、また 3 '末端には翻訳終止コドンとしての T A Λ， T G Aまたは T A Gを有していてもよい e さらに該遺伝子を発現させるにはその上流にプロモーターを接続する- 本発明で用いられるプロモーターとしては、遺伝子の発現に甩いる宿主に対して適切なプロモーターであればいかなるものでもよい。

また、形質転換する際の宿主が大腸菌である場合は、 trpプロモーター， iacプロモータ一， recプロモータ一， λ P【プロモーター， Ιρρプロ

10 モーターなどが、宿主が枯草菌である場合は、 S P 0 1 プロモータ一.

S P 0 2プロモーター， penPプロモーターなど、宿主が酵母である場合は、 P HO 5プロモーター， P GKプロモーター， GAPプロモータ一， AD Hプ αモーターなどが好ましい。とりわけ宿主が大腸菌でプ口モーターが _trpプロモータ—またはえプロモーターであること力 < 好ましい。

宿主が動物钿胞である場合には、 S V 4 0由来のプロモーター.レトロウィルスのプロモータ一などが挙げられ、とりわけ S V 4 0由来のプ口モータ一が好ましい。

このようにして作製された DNA(n)を含有するベクターを用いて、形質転換体を製造する- 宿主としては、大腸菌，估草菌，放線菌などの原核生物ゃ薛母，カビ，動物細胞などの真核生物が挙：' rられる ₌

上記大腸菌， t 草菌の具体例としては、前記しものと同様が挙げられる _::

上記酵母の具体例としては、たとえば Saccharomyces cerevisiae

~Λ,\ A II 2 2 , A H 2 2. R", A 8 7 - 1 1 A, D D - 5 Dなどが挙げりれ o

上記動物細胞の具体例としては、たとえば、サル細胞 C O S— 7 , Vero. チャイニーズハムスター細胞 C H 0 ,マウスし細胞などが挙げ上記大腸菌を形質転換するには、たとえば Proc. Natl. Acad.

Sci. USA, 6 9_, 2 1 1 0 ( 1 9 7 2 )や Gene' 1 7 , 1 0 7 ( 1 9 8 2 ) などに記載の方法に従って行われる。

枯草菌を形質転換するには、たとえば Mole Gen. Genet. , 1 6 8 , 1 1 1 ( 1 9 7 9 )などに記載の方法に従って行われる。

酵母を形質転換するには、たとえば Proc. Natl. Acad. Sci . USA, 7 5 , 1 9 2 9 ( 1 9 7 8 )に記載の方法に従って行われる。

動物細胞を形質転換するには、たとえば Virology, 5 2 , 4 5 6 ( 1 9 7 3 )に記載の方法に従って行われる。

このようにして、 D N A ( Π )を含有すろベクターで形質転換された形質転換体が得られる。

宿主が大腸菌.怙草菌，放線菌 .酵母，力ビであろ形質転換体を培養する際、培養に使用される培地としては液体培地が適当であり、その中には該形質転換体の成育に必要な炭素源，窒素源.無機物その他が含有せしめられる。炭素源としては、たとえばグルコース，デキストリン，可溶性澱扮，ショ糖など、窒素源としては、たとえばァンモニゥ厶塩類，硝酸塩類，コーンスティープ ' リカー，ペプトン，カゼイン，肉エキス，大豆粕ノくレィショ抽出液などの無機または有機物質 .無機物としては塩化カルシゥム，リン酸ニ水素ナトリウム，塩化マグネシゥムなどが挙げられる。

培地の pHは約 5〜 8が望ましい.：

宿主が大腸菌の場合、用いる培地は、たとえぱグル —ス，カザミ

たな用紙ノ酸を含む M9培地 [Miller, J. Exp. ol. Genet.. p.4 3 1 Cold

Spring Harbor Laboratory, New York, 1 9 7 2 が好ましい _c 培養は通常約 1 4 ~ 43てで約 3 ~ 24時間行い、必要により、通気ゃ攛拌を加えることもできる。

宿主が枯草菌の場合、培養は通常約 3 0~4 0°Cで約 6 24時間行い、必要により通気や攪拌を加えることもできる。

宿主が酵母である形質転換体を培養する際、培地としては、たとえば Bじ rkholder 最小培地 [ Bostian, . L. ら， Proc. Nat 1. Acad. Sci . USA, 7 7 , 4 5 0 5 ( 1 9 8 0 )]が挙げられる。培地の pHは約 5~8 に調整するのが好ましい。培養は通常約 20 °C~ 3 5 °Cで約 24 7 2 時間行い、必姜に応じて逼気ゃ擻拌を加える。

宿主が動物細胞である形質転換体を培養する際、培地としては、たとえば約 5 2 0 %の胎児牛血清を含む MEM培地 [ Science, 1 22 , 5 0 1 ( 1 9 5 2)],0^1£1^培地[ Virology, 8_, 3 9 6 ( 1 9 5 9)], R P I 1 64 0培地 [ J. Am. Med. Assoc. , 1 9 9 , δ 1 9

( 1 9 6 7 )1, 1 9 9培地 ['Proc. Soc. Exp. Biol. Med. , 73 , 1 ( 1 95 0 )]などが挙げられる。 PHは約 6 8であるのが好ましい _s 培養は通常約 3 ひて〜 4 0 で約 1 5 6 0時間行い、必要に応じて通気や攙拌を加える。

本発明の P D Γダンパク質は細胞内または細胞外に生成、蓄積する。細胞内 P D Iを培養物から抽出するに際しては、培養後公知の方法で細胞を集め、塩酸グァニジンや尿素などの蛋白変性剤を含む緩衝液やトラィトン X - 1 0 0などの界面活性剤を含む緩衝液中に細胞を懸謌させたのち、遠心分離により P D Iを含む上澄液を得ろ方法、あるいは超音波処理，リゾチームなどの酵素処理や凍結融解法によって細胞を破壊したのち、遠心分離により P D Iを含む上澄液を得る方法などを適宜用い得る。

これらの上澄液や細胞外に生成，蓄積した P D I を分離.精製するには自体公知の分離，精製法を適切に組み合わせて実施すればよい。これらの公知の分離，精製法としては、塩折や溶媒沈澱法などの溶解度の差を利用する法，透 1=斤法 ,限外ろ過法 'ゲルろ過法および S D S -ポリアクリルァミドゲル電気泳動法などの主として分子量の-差を利用する方法，ィォン交換ク口マトグラフィ一などの荷電の差を利用する方法，ァフィ二ティーク口マトグラフィ一などの特異的親和性を利用する方法.逆相高速液体ク口マトグラフィ一などの疎水性の差を利用する方法，等電点電気泳動法などの等電点の差を利用する方法などが挙げられる。特にゥシ P D I タンパク質は酸性タンぺク質であるため、ジェチルァミノェチル ( D E A E )セルロースやカルボキシメチル（ C M)セルロースなどのィォン交換クロマトグラフィーが該蛋白 Kの精製に有効である。

上記で得られる F D I蛋白質の活性（P D I活性）は、基質として還元型およびスクランブル型リボヌクレア一ゼを用いて活性型リボヌクレァ一ゼに変換する速度を測定することにより求められる： B i ochem . J . , 1 5 9 , 3 7 7 ( 1 9 7 6 ) ; Proc . Nai l . Acad . Sc i . USA , 8 3 ,

7 6 4 3 ( 1 9 8 6 )つ」。

本発明のゥシ p D I タンパク質は、任意の目的タンパ.ク質中に存在するスルフヒドリルぉよびジスルフィド間の交換反応を触媒して最も安定性が高い天然型のジスルフィド結合を形成する。さらに詳しくは、該タンパク質溶存酸素や酸化型グルタチォン（G S S G )—還元型グルタチオン（G S H )混合物の存在下て'、還元夕ンパク質に作用して天然型のジスルフィド結合を形成すろ反応を触、媒したり、既にジスルフィド钴合とりわけ非天然型のジスルフィド結合を有する酸化型タンパク質に作 fflして天然型のジスルフィド結合を再形成する反応を触媒する„

新たな用紙 δ 5

従って、分子中にジスルフィド锆合を有するタンバク質を遺伝子組換え技術を用いて製造するに際して、とりわけ組換え D M A ©宿主が大腸菌ゃ怙草菌などの原核細胞である場合に、そのタンパク分子中に天然型ジスルフィド結合を効率よく形成する目的でゥシ P D I タンパク Kを使用し得る。上記タンパク Kとしては、インターフェロン一 α インターフエロン一 ,インターフェロンーァ，インターロイキン一 1 ，インター口ィキン— 2 ， B細胞增殖园子（B G F ) , B細胞分化因子（B D F ) .マク口ファージ活性化因子（M A F ) ,リンホトキシン（ L T )， 8 瘍增殖因子（T N F )などのサイ卜力ィンゃ、トランスホーミンググ π—スファクター（T G F )，エリスロポェチン,上皮細胞增碴因子（E G F ) ,フイブ σブラスト増殖因子（F G F ) ィンスリン，ヒト成長ホルモンなどのぺプチドタンパクホルモンや、 Β型肝炎ウィルス抗原などの病原微生物抗原タンパク質や、ぺプチダ一ゼゃリゾチームなどの酵素や、ヒト血清アルブミン，免疫り口ブリンなどの血中タンパク成分が挙げられる。

ここで用いられる該 P D 1 夕ンパグ質は、精製タンパク Kでも部分精製タンパク質でもよく、細胞内や細胞外に生成，蓄¾する上記の目的タンパク質やその精製標品に該 P D I タンパク質を直接作用さ辻ればよい：該 P D 〖タンパク Kをコードする組換え D N Aを含有する宿主に、上記の目的タンパク質をコードォる組換え D K Aを二重に感染させた形質転0 換体を ¾いて反応させることもできる。 ―

明細書.請求の範囲および要約書で用いる記号の意義は第 1表に示すとおりである

>了 ,一第 1 ¾

D N Λ デォキシリボ核酸

c D A 相捕的デォキシリボ核酸

A アデ二ン

T チミン

G グァニン

C シ卜シン

R N A リボ核酸

m R A メッセンジャー R A dA T P デォキシアデノシン三リン酸 dT T P デォキシチミジン三リン酸 ' dG T P デォキシグアノシン三リン酸 d C T P デォキシシチジン三リン酸 AT P アデノシン三リン酸

E D T Λ エチレンジアミン四酢酸 S D S ドデシル硫酸ナトリウム G ly グリシン

A la ァラニン

V al バリン

し eし σイシン

I le イソ C7 イシン

S er セリン

T hr スレオニン

C s ンスティン

et メチォニン

G 1しグルタミン酸

新な用紙 Asp ：ァスパラギン酸

L ys ：リジン

Arg ：アルギニン

H is ：ヒスチジン

Phe ：フヱニルァラニン

Tyr ：チロシン

Trp ：トリブトファン

P ro ：プロリン

Asn ：ァスペラギン

G In ：グルタミンなお、本発明の P D I タンパク質においては、そのアミノ酸配列の一部（ 5 %程度まで）が修飾（付加除去，その他のアミノ酸への置換など）されていてもよい。

図面の簡単な説明

第 1図は実施例 2で得られた T 3 B P— 1および T 3 B P— 2中にク 'コ一ニングされた cD M Aの簡単な制限酵素地図を示す：

第 2図は実施例 2で得られた T 3 B P— 2中にクローニングされた c D Aの塩基配列およびその配列より推測されるアミノ酸配列を示す第 3図はゥシ P D Iのァミノ酸配列を示し、第 4図はゥシ P D Iをコ

—ドする塩基配列を示す _e

第 1図中、（ 1 )は T 3 B P— 1 にクローニングされた cD ' Aを、（ 2 ) は T 3 B P一 2にクローニングされた C D >： Aを示す。略号 A , E , H , P および Sはそれぞれ A at Iし E co R し H i nc II , P Vじ Πおよび S sp Iを示し、は翻訳領域を、^^ は L 1 1 由来の D.X Λを示 :：鼴精製 T 3 B Pタンパク質の卜リプテック ·ベプチド ' マヅビングにより得られたァミノ酸配列と一致する部分を示す。

¾明を実胞—4-るための最良の形態

実施例 1 ゥシ阡臓 mR N A由来の c D N Aライブラリーの作製

ゥシ肝臓より R Aをグァニジンイソチオシァネー卜法 [ Chirgwin. J. . ら， Biochemistry, U_， 5 2 9 4 ( 1 9 7 9 )」を用いて抽出した。この R N Aよりポリ（ A ) R M Aをオリゴ dTセルロースカラムクロマトグラフィ一により精製した「- Aviv と Leder, Proc. Natl. A-cad. Sci. USA, 6 9 , 1 4 0 8 ( 1 9 7 2 )]。

このポリ（A)R >J Aを鐯型として cD N Aを GuUer, U と Hoffman, B. J. の方法 [Gene, 2 5 , 2 6 3 ( 1 9 8 3 )]で精製し、次に IIい' nh,

T. V. らの方法 [ D N A Cloni ng I , a practical approch, 丄， 4 9 ( 1 9 8 5 )]に従って上記 c D N Aに E coR I リンカ一を付加したのち、 λ gt 1 1 の E coR I部位にクローニングし、 CD Ν Αライブラリ一を作製した。

実施例 2 ゥシ P D I c D X Aを含むプラスミドの単離とその塩基配列の決定

大腸菌 Y 1 0 9 6に実施例 1で得た gt 1 1の cD N Aライブラリ一を感染させのち、しブロスの軟寒天プレートにまいた。プラークが出現しはじめた時に、 I P T G (isopropylthiogaiactoside)を含むニトロセルロース膜をプレートの上にのせ、 3時間インキュベーションした _c 次に、二卜 σセルロース膜を：まずし、 T B S緩衝液（ 5 0 πιλ.'1 Tris.pH 7.9. 1 5 0 m.Vl Ν' a C i )で洗^し、つづいて 3 %ゼラチン溶液につけた。

このように処理しにニトロセル一ス膜を T 3結合蛋白質に対する抗 ft- Cam i - B L T ₃ R L llor iuchi . R. and Yamauchi , . , Guama

Symposia on Endocrinolog , 2 3. P . 1 4 9 ( 1 9 8 6 ):;に浸し、

新た-な用紙抗原抗体反応をさせた。次に、該膜を蒸留水と T B S緩衝液で洗浄した後、 2次抗体と反 1¾させ、発色— 4-る陽性クローン gt 1 1 T 3 B P - 1を選択した。 Agt l l T 3 B P— 1中の cl〕 N Aを EcoR Iで切り出し、プラスミド pU C 1 9 [Ge a. 3 3 , 1 0 3 (1 9 8 5)ュの Eco R I部位にリクローニングし、プラスミド pT 3 Β Ρ - iを作製した。該プラスミドに含まれる cD N A部分のうち、制限酵素 EcoR I一 Pvじ Π断片を D N Aプローブに甩'いて、 5 X 1 0⁵個の実施例 1 に記載の cD N Aライブラリ一を再度スクリ一ニングして、陽性のクローンを選択した

このようにして得られたクローン一つである λ gt 1 1 T 3 B P -

2から S ac I ― pn Iで cD Aを ¾り出し、プラスミド pU C 1 9の S ac I -Kpn I部位にリクローニングし、プラスミド PT 3 B P— 2を作製した。（なお、 λ gい 1 1 T 3 B P - 2にクローニングされた c D Aの 5 '末端側 EcoR I認識部位は破壌されていた）

E . col i D I-I 5 をプラスミド pT 3 B P— 2で形質転換させ、得られた組換え体 E . col i D II 5 / T 3 B P— 2よりプラスミド p T 3 B P— 2をアルカリ法 [Birnboim, H. C. and Doly, J., Xじ cl. ilcids Res. , 1 1 , 1 5 1 3 ( 1 9 7 9 )]によって油出精製した _c このプラスミドに含まれる cD X A部分は全長約 2.8 Kbpであり、その簡単な制限酵素地図を第 1図に示した- この cD X A部分の塩基配列をジデォキシヌクレオチド合成鎖停止法 [ essing, J. . ucl. Acids Res., _9_, 3 0 9 ( 1 9 8 Γ ):によつて決定した。決定された塩基配列より推測されるァミノ酸配列を第 2図に示した。

該ポリぺプチドのァミノ酸配列は、ラッ卜 P D Iのそれと 9 0 %以上の相同性を有している 7バ、甲状腺ホルモン锆合能仝有するチロキシン

、 y 結合グブリン（Τ β (； ) ,チキシン結合プレアルプミン（Τ Β Ρ Λ )や

C - - erbA蛋白質のアミノ酸配列との ft.l同性：ょ認められなかつに。

プラスミド pT 3 B P— 2を保持する Escherichia col i K 1 2 D Η δ a (Escherichia col i K 1 2 D II 5 a /pT 3 B P - 2 )は財団法人発酵研究所（ I F 0)に受託番号 I F 0 1 4 5 6 3として寄託されている。 - 産業上の利用可能性

本発明のゥシ P D I は蛋白質に存在するスルフヒドリルおよびジスルワイド間の交換反 RL;を触媒し、還元型蛋白質および非天然型のジスルフィド結合を有—4—る酸化型蛋白質からの天然型のジスルフィド結合を有 "- 蛋白質の再構築に使用できる。

新な用紙

Claims

- L8 - 請求の in 囲

3図のァミノ酸配列を含有するボリぺプチド。

3図のァミノ酸配列をコードする塩 S配列を含有する組み換え！;） 3図のアミノ酸配列をコードする塩基配列を含有するベクターで換された形質転換体。

3図のァ Ϊノ酸配列をコ一ドする塩基配列を含有するベクターで換された形質転換体を培養し、培養物中に該ァミノ酸配列を含有リペプチド仝生成蓄積せしめ、これを採取することを特徴とすペプチドの製造法-