UA133594U - Спосіб отримання рекомбінантних штамів дріжджів candida famata з підвищеним рівнем синтезу вітаміну в2 (рибофлавіну) - Google Patents
Спосіб отримання рекомбінантних штамів дріжджів candida famata з підвищеним рівнем синтезу вітаміну в2 (рибофлавіну) Download PDFInfo
- Publication number
- UA133594U UA133594U UAU201811789U UAU201811789U UA133594U UA 133594 U UA133594 U UA 133594U UA U201811789 U UAU201811789 U UA U201811789U UA U201811789 U UAU201811789 U UA U201811789U UA 133594 U UA133594 U UA 133594U
- Authority
- UA
- Ukraine
- Prior art keywords
- riboflavin
- yeast
- recombinant strains
- synthesis
- gene
- Prior art date
Links
- AUNGANRZJHBGPY-SCRDCRAPSA-N Riboflavin Chemical compound OC[C@@H](O)[C@@H](O)[C@@H](O)CN1C=2C=C(C)C(C)=CC=2N=C2C1=NC(=O)NC2=O AUNGANRZJHBGPY-SCRDCRAPSA-N 0.000 title claims abstract description 107
- AUNGANRZJHBGPY-UHFFFAOYSA-N D-Lyxoflavin Natural products OCC(O)C(O)C(O)CN1C=2C=C(C)C(C)=CC=2N=C2C1=NC(=O)NC2=O AUNGANRZJHBGPY-UHFFFAOYSA-N 0.000 title claims abstract description 55
- 229960002477 riboflavin Drugs 0.000 title claims abstract description 55
- 235000019192 riboflavin Nutrition 0.000 title claims abstract description 52
- 239000002151 riboflavin Substances 0.000 title claims abstract description 52
- 240000004808 Saccharomyces cerevisiae Species 0.000 title claims abstract description 25
- 238000000034 method Methods 0.000 title claims abstract description 14
- 230000015572 biosynthetic process Effects 0.000 title claims abstract description 13
- 238000003786 synthesis reaction Methods 0.000 title claims abstract description 11
- 229930003471 Vitamin B2 Natural products 0.000 title abstract description 3
- 235000019164 vitamin B2 Nutrition 0.000 title abstract description 3
- 239000011716 vitamin B2 Substances 0.000 title abstract description 3
- 241000235036 Debaryomyces hansenii Species 0.000 title abstract 4
- 230000029142 excretion Effects 0.000 claims abstract description 6
- 238000004519 manufacturing process Methods 0.000 claims abstract description 6
- 102000002508 Peptide Elongation Factors Human genes 0.000 claims abstract description 3
- 108010068204 Peptide Elongation Factors Proteins 0.000 claims abstract description 3
- 108090000623 proteins and genes Proteins 0.000 claims description 30
- 239000013612 plasmid Substances 0.000 claims description 15
- 229940088594 vitamin Drugs 0.000 claims description 7
- 229930003231 vitamin Natural products 0.000 claims description 7
- 235000013343 vitamin Nutrition 0.000 claims description 7
- 239000011782 vitamin Substances 0.000 claims description 7
- 150000003722 vitamin derivatives Chemical class 0.000 claims description 7
- 238000013519 translation Methods 0.000 claims description 3
- 102100022595 Broad substrate specificity ATP-binding cassette transporter ABCG2 Human genes 0.000 abstract 2
- 101000823298 Homo sapiens Broad substrate specificity ATP-binding cassette transporter ABCG2 Proteins 0.000 abstract 2
- 108010024682 Core Binding Factor Alpha 1 Subunit Proteins 0.000 abstract 1
- 101100034382 Meyerozyma guilliermondii (strain ATCC 6260 / CBS 566 / DSM 6381 / JCM 1539 / NBRC 10279 / NRRL Y-324) RIB5 gene Proteins 0.000 abstract 1
- 101150059964 RIB7 gene Proteins 0.000 abstract 1
- 101100010928 Saccharolobus solfataricus (strain ATCC 35092 / DSM 1617 / JCM 11322 / P2) tuf gene Proteins 0.000 abstract 1
- 101150001810 TEAD1 gene Proteins 0.000 abstract 1
- 101150074253 TEF1 gene Proteins 0.000 abstract 1
- 102100029898 Transcriptional enhancer factor TEF-1 Human genes 0.000 abstract 1
- 239000002609 medium Substances 0.000 description 8
- LFQSCWFLJHTTHZ-UHFFFAOYSA-N Ethanol Chemical compound CCO LFQSCWFLJHTTHZ-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 6
- 239000001963 growth medium Substances 0.000 description 5
- 238000003752 polymerase chain reaction Methods 0.000 description 5
- 239000012634 fragment Substances 0.000 description 4
- 102220201851 rs143406017 Human genes 0.000 description 4
- QRBLKGHRWFGINE-UGWAGOLRSA-N 2-[2-[2-[[2-[[4-[[2-[[6-amino-2-[3-amino-1-[(2,3-diamino-3-oxopropyl)amino]-3-oxopropyl]-5-methylpyrimidine-4-carbonyl]amino]-3-[(2r,3s,4s,5s,6s)-3-[(2s,3r,4r,5s)-4-carbamoyl-3,4,5-trihydroxy-6-(hydroxymethyl)oxan-2-yl]oxy-4,5-dihydroxy-6-(hydroxymethyl)- Chemical compound N=1C(C=2SC=C(N=2)C(N)=O)CSC=1CCNC(=O)C(C(C)=O)NC(=O)C(C)C(O)C(C)NC(=O)C(C(O[C@H]1[C@@]([C@@H](O)[C@H](O)[C@H](CO)O1)(C)O[C@H]1[C@@H]([C@](O)([C@@H](O)C(CO)O1)C(N)=O)O)C=1NC=NC=1)NC(=O)C1=NC(C(CC(N)=O)NCC(N)C(N)=O)=NC(N)=C1C QRBLKGHRWFGINE-UGWAGOLRSA-N 0.000 description 3
- 239000002028 Biomass Substances 0.000 description 3
- 235000010469 Glycine max Nutrition 0.000 description 3
- LTQCLFMNABRKSH-UHFFFAOYSA-N Phleomycin Natural products N=1C(C=2SC=C(N=2)C(N)=O)CSC=1CCNC(=O)C(C(O)C)NC(=O)C(C)C(O)C(C)NC(=O)C(C(OC1C(C(O)C(O)C(CO)O1)OC1C(C(OC(N)=O)C(O)C(CO)O1)O)C=1NC=NC=1)NC(=O)C1=NC(C(CC(N)=O)NCC(N)C(N)=O)=NC(N)=C1C LTQCLFMNABRKSH-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 3
- 108010035235 Phleomycins Proteins 0.000 description 3
- 230000003486 flavinogenic effect Effects 0.000 description 3
- 239000000203 mixture Substances 0.000 description 3
- 239000000047 product Substances 0.000 description 3
- 239000006152 selective media Substances 0.000 description 3
- 230000009466 transformation Effects 0.000 description 3
- 244000068988 Glycine max Species 0.000 description 2
- 241001465754 Metazoa Species 0.000 description 2
- 229930003270 Vitamin B Natural products 0.000 description 2
- 238000004458 analytical method Methods 0.000 description 2
- 238000010276 construction Methods 0.000 description 2
- 238000004520 electroporation Methods 0.000 description 2
- 238000000855 fermentation Methods 0.000 description 2
- 230000004151 fermentation Effects 0.000 description 2
- 238000002955 isolation Methods 0.000 description 2
- 239000008267 milk Substances 0.000 description 2
- 210000004080 milk Anatomy 0.000 description 2
- 235000013336 milk Nutrition 0.000 description 2
- 230000008569 process Effects 0.000 description 2
- 102000004169 proteins and genes Human genes 0.000 description 2
- 108091008146 restriction endonucleases Proteins 0.000 description 2
- 238000012360 testing method Methods 0.000 description 2
- 235000019156 vitamin B Nutrition 0.000 description 2
- 239000011720 vitamin B Substances 0.000 description 2
- 229920001817 Agar Polymers 0.000 description 1
- 101100412417 Arabidopsis thaliana REM5 gene Proteins 0.000 description 1
- 241000894006 Bacteria Species 0.000 description 1
- 101000858029 Bos taurus Coxsackievirus and adenovirus receptor homolog Proteins 0.000 description 1
- OKTJSMMVPCPJKN-UHFFFAOYSA-N Carbon Chemical compound [C] OKTJSMMVPCPJKN-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 108010078791 Carrier Proteins Proteins 0.000 description 1
- 241001274613 Corvus frugilegus Species 0.000 description 1
- 229920000742 Cotton Polymers 0.000 description 1
- WQZGKKKJIJFFOK-GASJEMHNSA-N Glucose Natural products OC[C@H]1OC(O)[C@H](O)[C@@H](O)[C@@H]1O WQZGKKKJIJFFOK-GASJEMHNSA-N 0.000 description 1
- 239000001888 Peptone Substances 0.000 description 1
- 108010080698 Peptones Proteins 0.000 description 1
- CDBYLPFSWZWCQE-UHFFFAOYSA-L Sodium Carbonate Chemical compound [Na+].[Na+].[O-]C([O-])=O CDBYLPFSWZWCQE-UHFFFAOYSA-L 0.000 description 1
- CZMRCDWAGMRECN-UGDNZRGBSA-N Sucrose Chemical compound O[C@H]1[C@H](O)[C@@H](CO)O[C@@]1(CO)O[C@@H]1[C@H](O)[C@@H](O)[C@H](O)[C@@H](CO)O1 CZMRCDWAGMRECN-UGDNZRGBSA-N 0.000 description 1
- 229930006000 Sucrose Natural products 0.000 description 1
- 240000000038 Ziziphus mauritiana Species 0.000 description 1
- 235000006545 Ziziphus mauritiana Nutrition 0.000 description 1
- 238000009825 accumulation Methods 0.000 description 1
- 239000008272 agar Substances 0.000 description 1
- 239000011543 agarose gel Substances 0.000 description 1
- 229960000723 ampicillin Drugs 0.000 description 1
- AVKUERGKIZMTKX-NJBDSQKTSA-N ampicillin Chemical compound C1([C@@H](N)C(=O)N[C@H]2[C@H]3SC([C@@H](N3C2=O)C(O)=O)(C)C)=CC=CC=C1 AVKUERGKIZMTKX-NJBDSQKTSA-N 0.000 description 1
- 230000003321 amplification Effects 0.000 description 1
- 239000003674 animal food additive Substances 0.000 description 1
- 239000003242 anti bacterial agent Substances 0.000 description 1
- 229940088710 antibiotic agent Drugs 0.000 description 1
- 230000001580 bacterial effect Effects 0.000 description 1
- 230000008901 benefit Effects 0.000 description 1
- 238000013452 biotechnological production Methods 0.000 description 1
- 229940041514 candida albicans extract Drugs 0.000 description 1
- 229910052799 carbon Inorganic materials 0.000 description 1
- 238000005119 centrifugation Methods 0.000 description 1
- 230000008859 change Effects 0.000 description 1
- 238000006243 chemical reaction Methods 0.000 description 1
- 238000010367 cloning Methods 0.000 description 1
- 238000010586 diagram Methods 0.000 description 1
- 239000012153 distilled water Substances 0.000 description 1
- 238000001962 electrophoresis Methods 0.000 description 1
- 239000012467 final product Substances 0.000 description 1
- 235000013305 food Nutrition 0.000 description 1
- 235000013373 food additive Nutrition 0.000 description 1
- 239000002778 food additive Substances 0.000 description 1
- 230000002068 genetic effect Effects 0.000 description 1
- 239000008103 glucose Substances 0.000 description 1
- 238000011534 incubation Methods 0.000 description 1
- 239000007788 liquid Substances 0.000 description 1
- 210000005075 mammary gland Anatomy 0.000 description 1
- 239000003550 marker Substances 0.000 description 1
- 239000000463 material Substances 0.000 description 1
- 229940126601 medicinal product Drugs 0.000 description 1
- 230000000813 microbial effect Effects 0.000 description 1
- 244000005700 microbiome Species 0.000 description 1
- 239000007003 mineral medium Substances 0.000 description 1
- 238000003199 nucleic acid amplification method Methods 0.000 description 1
- 235000015097 nutrients Nutrition 0.000 description 1
- 235000019319 peptone Nutrition 0.000 description 1
- 238000002360 preparation method Methods 0.000 description 1
- 230000009467 reduction Effects 0.000 description 1
- 238000011160 research Methods 0.000 description 1
- 230000028327 secretion Effects 0.000 description 1
- 241000894007 species Species 0.000 description 1
- 239000005720 sucrose Substances 0.000 description 1
- 238000012546 transfer Methods 0.000 description 1
- 239000002699 waste material Substances 0.000 description 1
- XLYOFNOQVPJJNP-UHFFFAOYSA-N water Chemical compound O XLYOFNOQVPJJNP-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 239000012138 yeast extract Substances 0.000 description 1
Landscapes
- Preparation Of Compounds By Using Micro-Organisms (AREA)
- Micro-Organisms Or Cultivation Processes Thereof (AREA)
Abstract
Спосіб отримання рекомбінантних штамів дріжджів Candida famata з підвищеним рівнем синтезу вітаміну В2 (рибофлавіну) характеризується тим, що в геном штаму С famata - стабільного надсинтетика рибофлавіну, що містить по дві копії генів SEF1, RIBl і RIB7, додатково вводять плазміду, яка містить гомолог гена BCRP (breast cancer resistance protein), що кодує систему екскреції рибофлавіну, генетично близького до С famata виду дріжджів Debaryomyces hansenii під контролем сильного промотора фактора елонгації трансляції - TEF1 дріжджів D. hansenii, що забезпечує посилення виходу рибофлавіну з клітин, та отримують рекомбінантні штами з вищою в 1,3-1,5 раза продукцією рибофлавіну, в порівнянні з реципієнтним штамом.
Description
Спосіб отримання рекомбінантних штамів дріжджів Сапаїда Татаїа з підвищеним рівнем синтезу вітаміну Вг (рибофлавіну)
Корисна модель належить до галузі біотехнології і є способом отримання ефективного продуцента рибофлавіну (РФ) дріжджів Сапаїда їатаїа за рахунок посилення екскреції цього вітаміну в культуральне середовище. РФ застосовується як лікарський препарат, а також як кормова і харчова добавка, оскільки в організмі людини і тварин він не утворюється. У даний час вітамін В» отримують, використовуючи мікробний синтез. Продуцентами РФ є цвілеві гриби
АвПпбруа доззурії та Егетоїйесіит азнбуї, рекомбінантні штами бактерій Васійи5 5и,ибійв, а також дріжджі Сапаїда гатаїйа, які дають приблизно однаковий вихід кінцевого продукту (11.
Перевагою дріжджів є їх здатність рости на простих живильних середовищах, напівпродуктах та відходах харчової промисловості при температурі 30-37 "С. Описано штами
С. Ттатаїйа, які утворюють 3,8 г Рф/л |2І, 10 г Рф/л |З), а також С Татайа АТОСС 20849, який синтезує 2,5 г Рф/л, а в 450-літровому ферментері за спеціально підібраних умов продукція РФ цим штамом після 200 годин ферментації становить 21 г/л І4Її. Однак, недоліком описаних штамів С Татаїйа, як продуцентів РФ, г їх генетична нестабільність, що приводить до утворення під час ферментації штамів, нездатних до надсинтезу вітаміну Во, тому доводиться зупиняти процес та міняти культуру дріжджів у ферментерах. Це знижує рентабельність процесу біотехнологічного одержання РФ.
Отримано штами С їатаїа - продуценти Рф з високою стабільністю за ознакою "надсинтез
РФ" |5, 6), які нагромаджують при вирощуванні в колбах у простому цукрово-мінеральному середовищі більше 1 г Рф/л, в оптимізованих умовах при вирощуванні у ферментері сконструйований штам С. Татагїа, що містить по дві копії генів БЕРІ, А1В1, В187, утворював до 16 г Рф/л І6Ї. Однак продукція РФ цим штамом є нижчою, порівняно з найкращим нестабільним продуцентом РФ |4|.
Здатність мікроорганізмів акумулювати РФ в культуральному середовищі свідчить про те, що вони активно секретують цей вітамін. Посилення виходу РФ з клітини може привести до підвищення флавіногенної активності та нагромадження його у культуральному середовищі.
Найбільш близьким до запропонованого способу є отримання РФ за допомогою стабільного надсинтетика С.Татаїга, що містить по дві копії генів ФЕН, ВІВ, ВІВ?7 б). Недоліком описаного
Зо надсинтетика є нижча, в порівнянні з найкращим нестабільним дріжджовим продуцентом РФ |4|, продуктивність біосинтезу РФ.
В основу корисної моделі поставлена задача підвищити синтез РФ шляхом конструювання рекомбінантних штамів дріжджів С. Татайїа з посиленою експресією дріжджового гомолога білка- транспортера РФ ссавців ВСАР (Бгеазі сапсег гезізіапсе ргоїєїп), який у лактуючих самок забезпечує вихід РФ з клітин молочної залози в молоко, а у рекомбінантних дріжджів забезпечує екскрецію РФ до культурального середовища.
Поставлена задача вирішується тим, що в геном штаму С. їатаїа - стабільного надсинтетика РФ, що містить по дві копії генів ЕЕ, ВІВ! і ВІВ7, згідно з корисною моделлю додатково вводять плазміду, яка містить гомолог гену ВСАР, що кодує систему екскреції РФ, генетично близького до С. Татайїа виду дріжджів Рерагуотусез катеті під контролем сильного промотора фактора елонгації трансляції - ТЕРІ дріжджів О. Натепії, що забезпечує посилення виходу РФ з клітин.
У запропонованому способі використовуються методи: полімеразна ланцюгова реакція (ПЛР), конструювання рекомбінантної плазміди, виділення плазміди з Еб5бсПегіспіа «соїї, рестрикційний аналіз, електрофорез в агарозному гелі, трансформація Е. соїї методом електропорації, описані в (7). Трансформацію С Татаїа проводять, як описано в |8). Виділення сумарної ДНК з трансформантів С. Татайа проводять як для 5. сегемізіає ІФ). Вміст РФ визначають флюориметрично на приладі Тигпег Оцапіесй бідна! Рійег 109510-33.
Спосіб отримання рекомбінантних штамів дріжджів С. Татайїа з підвищеним рівнем синтезу вітаміну Вг2 (рибофлавіну) ілюструється графічними матеріалами: На Фіг. 1 зображена лінійна схема плазміди рОС57 ТЕРРІ ВСАР бБіє (4.0 т.п.н.), де відкриту рамку трансляції гена Біе еарпуіососсив ацтеив позначено товстою сірою лінією; промотор гена ТЕНЕІ1 - товстим білим відрізком; бактерійна послідовність РОС57 - тонкою лінією; товстим чорним відрізком позначено гомолог гена ВСАР Оебагуотусев ПНапзепії; скорочення сайтів рестрикції: Ніпап; Ватні; Рі; засі, ЕсоВІ. На Фіг. 2 зображено продуктивність флавіногенезу реципієнтного штаму С Татаїа
Мо 91 та отриманих рекомбінантних штамів, що містять додатковий ген ВСРР, де на осі абсцис позначено номери штамів, а на осі ординат продуктивність флавіногенезу (кількість утвореного
РФ в перерахунку на мг біомаси). Час вирощування З доби. На Фіг. З зображено продуктивність флавіногенезу реципієнтного штаму С. Татаїа Мо 91 та отриманих рекомбінантних штамів іг47 і бо ї48, що містять ген ВСАВР, вирощених у середовищах різного складу, де на осі абсцис позначено номери штамів та назва середовища, а на осі ординат - продуктивність флавіногенезу (кількість утвореного РФ в перерахунку на мг біомаси). Час вирощування З доби.
Пропонований спосіб отримання рекомбінантних штамів дріжджів С Татайа з підвищеним рівнем синтезу вітаміну Вг (рибофлавіну) здійснюють кількома етапами: Етап 1. Конструювання плазміди, то містить ген ВСАР
Ген ВСВР у тварин кодує білок, який відповідає за виділення РФ у молоко. Гомолог цього гена знайдено у дріжджів Ріспіа дийенптопаїй та встановлено його участь в екскреції РФ (10).
Оскільки геном дріжджів С. Татаїа не секвеновано, ми використовуємо ген ВСАР генетично близького виду Оерагуотусев Папзепії з секвенованим геномом. Для конструювання плазміди, що містить ген екскретази ВСЕР, як плазміду-носій, використовують дріжджову інтегративну плазміду рОС57 із клонованими в її склад промотором і термінатором ТЕРЕТ 0. Напзепії та маркерним геном іє 5. ацтеив, білковий продукт якого забезпечує резистентність до флеоміцину. Ген екскретази ВСАР виділяють із геномної ДНК 0. Напзепії і ампліфікують за допомогою ПЛР. Праймери, які використовують у реакції, містять послідовності сайтів рестрикції
Ватні та Ра (ЕХЕРУ: сдасасАтТССаїдаїаїсіаіаадіаасссаа, ЕїхВему: ааастаСАсісасшсісаасшааассаас, розмір продукту ПЛР 1857 п.н.) необхідні для подальшого клонування цього фрагменту у плазміду. Для перевірки наявності гена екскретази ВСВР у сконструйованій плазміді проводять рестрикційний аналіз, з використанням різних комбінацій ферментів рестрикції, зокрема: ЕсоВМ / Ніпанп (розмір фрагментів: 6078, 665), ЕсоНМ / Має! (розмір фрагментів 3658, 3085), ЕсоНМУ / Хпої (розмір фрагментів 4612, 2131).
Отриману плазміду позначено як риС57 ТЕР! ВСАР Біе (Фіг 1). Цю плазміду використовують для трансформації стабільного флавіногенного штаму дріжджів С Татаїа Мо 91
І6Ї попередньо здійснивши її лінеаризацію за допомогою рестрикційного ферменту ХпоЇ.
Етап 2. Одержання рекомбінантних штамів С. тТатаїйа з додатковою копією гена ВСАР
Для отримання рекомбінантних штамів з підвищеним рівнем синтезу вітаміну В»е зі стабільного надсинтетика РФ ГГ. їатаа Мо 91 |6| його трансформують плазмідою рОС57 ТЕР ВСВАР іє (Фіг. 1), що містить ген ВСВР, за допомогою електропорації. Після трансформації клітини висівають на селективне УРО середовище, що містить антибіотики ампіцилін (100 мг/л) та флеоміцин (20 мг/л). Колонії, здатні рости на селективному середовищі,
Зо з'являються після З днів інкубації з частотою приблизно 50 трансформантів на 1 мкг плазмідної
ДНК. Трансформовані клітини стабілізують культивуванням у неселективному середовищі протягом 15-17 генерацій з наступним перенесенням на селективне середовище з флеоміцином. Наявність гену ВСВАР в геномі підтверджують за допомогою методу ПЛР.
Перевіряють здатність до надсинтезу РФ в отриманих трансформантів. Отримані трансформанти нагромаджують в культуральному середовищі більше РФ, ніж реципієнтний штам С.їатаїйа Мо 91. Продуктивність синтезу РФ отриманими рекомбінантними штамами у 1,4- 4,3 рази вища порівняно з реципієнтним штамом Мо 91(Фіг. 2).
Етап 3. Перевірка здатності до надсинтезу РФ рекомбінантними штамами С.атаїйа, що містять додатковий ген ВСВР.
Для перевірки здатності до синтезу РФ штами С їатаїа вирощують у чашці Петрі на агаризованому багатому середовищі МРО (2095 глюкози, 10 95 пептону, 5 дріжджового екстракту) при 30 "С протягом 1 доби. Отриману культуру висівають в колби (300 мл) з 30 мл середовища УРО, витримують протягом 1-4 діб на круговій качалці (швидкість обертання 200 об./хв) при 28 "С після чого визначають вміст РФ в культуральній рідині. Результати досліджень наведено в Табл. 1.
Таблиця 1
Динаміка продукування РФ штамами С.атага, що містять ген ВСЕР, та реципієнтним штамом С.Татаїа Ме 91, вирощеними у середовищі ХРО
Час росту, діб 1 81,152,1 164,328,2 60,952,1 2 169,228,46 281,4ж12,4 120,14 8
З 1289,15541 1669,0278,4 1054 25474 4 1435,2-64,6 1694,25281,3 1292,25262,0
Як видно з Табл. 1, обидва рекомбінантні штами з введеним геном ВСВАР (Щп47 і іг48) утворюють більше РФ, ніж реципієнтний штам С Татайїа Ме91. Продуктивність флавіногенезу (кількість утвореного РФ в перерахунку на одиницю біомаси) штамів, що містять ген ВСАР, вирощених у середовищах різного складу, зображено на Фіг. 3. Як видно з Фіг. 3, продуктивність флавіногенезу штамів з введеним геном ВСАР у всіх використаних середовищах на 3 добу вирощування у 1,3-1,5 раза вища, порівняно з реципієнтним штамом С їТатаїа Мо 91.
Етап 4. Перевірка стабільності рекомбінантних штамів С, Татаїа, що містять додатковий ген
ВСАР
Для перевірки стабільності штами висівають на чашки з середовищем МРО, через 1 добу засівають у 20 мл цього ж середовища в колби об'ємом 100 мл. Після вирощування протягом 1,5 доби клітини осаджують центрифугуванням, двічі промивають стерильною дистильованою водою і висівають на синтетичне середовище Беркгольдера, що містить 1 95 етанол як джерело вуглецю, в кількості 15 х 105 клітин на чашку. Через 10-14 днів підраховують кількість колоній на чашці і розраховують частоту реверсії. Відсутність росту на середовищі з етанолом (Табл. 2) свідчить, що сконструйовані штами іг47 і іг48, що містять ген ВСВРР, характеризуються такою ж високою стабільністю, як і реципієнтний штам С. Татаїйа Мо 91.
Введення додаткової копії гена ВСАР у надсинтетик РФ С. Татайа Мо 91 приводить до підвищення флавіногенної активності та не знижує стабільності за ознакою "надсинтез РФ".
Таблиця 2
Ріст штамів С Татаїйа Мо 91 та рекомбінантних штамів іг47, 148 на середовищі з сахарозою та етанолом
Штами дріжджів С їТатайа з підвищеним рівнем синтезу РФ, отримані за допомогою запропонованого способу, можуть бути використані у виробництві для отримання вітаміну В2.
Джерела інформації: 1. Тантапп К.Р. єї а. Місгобіо!. апа ВіоїєсНнпої. - 2000. - Мої. 53, Мо 5-Р. 509-516. 2. Патент США М/О 88/09822. МПК С12М 15/01, С12М 15/04, С12Р 25/00, С12В8 1/72. опубл 15.12.1988. 3. Патент США Мо 5164303, МПК С12М 1/165, С12Р 25/00. опубл. 17.11. 1992. 4. Патент США Мо 5231007, МПК С12М 1/16, С12М 15/00, С12Р 25/00, опубл. 27.07.1993. 5. Патент України на винахід Мо 90741, МПК С12М 1/19, С12Р. 25/00,опубл. 25.05.2010.
Бюлетень Ме 10. 6. Отуїгик К. еї аї. дхоштпаї ої Віоїесппоіоду. - 2014. Мої. 172. - Р. 11-17. 7.Затргоок у., Еййївип Е.
Е., Мапіаїїз Т. МоіІєсшіаг Сіопіпд: А І арогаїюгу Мапиаї. Соїа 5Зргіпд Натбог І абогаїюгу, Сода 5ргіпд
Нарог, Мем Могк, 1989. 8. МогопоувкКу А.А. єї аЇ. РЕМ5 Уєаві Незеагси. - 2002. - Мої. 2. - Р. 381-388. 9. Масн А., Ріск Н., РпНіїрзеп Р. Іп: МоІесціаг Сепеїїйсв ої Уєаві. А Ргасіїса! Арргоасп (оппвюп,
У.В., ЕЯ.), ІВІ. Ргезв, Охіога. - 1994. - Р. 1-16. 10. ВогеїзкКу вї а. 27" Іптетайопа! Сопієгепсе оп Увазі Сепеїйс5 апа Моїесшаг Віоіоду. Наїу, 13-17 Зеріетбрег 2015. Арзігасі роок. 5. 212.
Claims (2)
- ФОРМУЛА КОРИСНОЇ МОДЕЛІ Спосіб отримання рекомбінантних штамів дріжджів Сапаїда гатаїйа з підвищеним рівнем синтезу вітаміну Вг (рибофлавіну), який відрізняється тим, що в геном штаму С Татаїйа - стабільного надсинтетика рибофлавіну, що містить по дві копії генів ФЕН, ВІВІ ії ВІВ7, додатково вводять плазміду, яка містить гомолог гена ВСВР (Бгеавзі сапсег гезівіапсе ргоїєїп), що кодує систему екскреції рибофлавіну, генетично близького до С Татаїйа виду дріжджів Оебагуотусев Напзепії під контролем сильного промотора фактора елонгації трансляції - ТЕЕТ дріжджів 0. Напзепії, що забезпечує посилення виходу рибофлавіну з клітин, та отримують рекомбінантні штами з вищою в 1,3-1,5 раза продукцією рибофлавіну, в порівнянні з реципієнтним штамом.ІЩТЕНІ б. Єхтеідхе ПЛ, Вів 5а Ба ові Фіг: 1 КО І Ме щ--о з я о Кен З У Я ЦесохохФіг.
- 2 Еу я а я кт с т 83 135 ТЗ З Шезме Е виш Я се СередовищеФіг. З Міністерство економічного розвитку і торгівлі України, вул. М. Грушевського, 12/2, м. Київ, 01008, Україна
Priority Applications (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| UAU201811789U UA133594U (uk) | 2018-11-29 | 2018-11-29 | Спосіб отримання рекомбінантних штамів дріжджів candida famata з підвищеним рівнем синтезу вітаміну в2 (рибофлавіну) |
Applications Claiming Priority (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| UAU201811789U UA133594U (uk) | 2018-11-29 | 2018-11-29 | Спосіб отримання рекомбінантних штамів дріжджів candida famata з підвищеним рівнем синтезу вітаміну в2 (рибофлавіну) |
Publications (1)
| Publication Number | Publication Date |
|---|---|
| UA133594U true UA133594U (uk) | 2019-04-10 |
Family
ID=66043066
Family Applications (1)
| Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
|---|---|---|---|
| UAU201811789U UA133594U (uk) | 2018-11-29 | 2018-11-29 | Спосіб отримання рекомбінантних штамів дріжджів candida famata з підвищеним рівнем синтезу вітаміну в2 (рибофлавіну) |
Country Status (1)
| Country | Link |
|---|---|
| UA (1) | UA133594U (uk) |
-
2018
- 2018-11-29 UA UAU201811789U patent/UA133594U/uk unknown
Similar Documents
| Publication | Publication Date | Title |
|---|---|---|
| KR102132132B1 (ko) | 재조합 인간 콜라겐 생산 수준을 향상시키는 발효 공법 | |
| CN105229154A (zh) | 组成型启动子 | |
| CN103923869A (zh) | 一种产n-乙酰神经氨酸的枯草芽孢杆菌基因工程菌及其构建方法和应用 | |
| CN108048373B (zh) | 一株枯草芽孢杆菌ah1005及其应用 | |
| CN106957805B (zh) | 一种具有抑菌效果的芽孢杆菌GBacillus-9菌株及其分离方法和应用 | |
| CN105368766B (zh) | 一株生产戊二胺的基因工程菌及其制备戊二胺的方法 | |
| CN107916283B (zh) | 一种烟酰胺的生产工艺 | |
| CN101948794A (zh) | 产植物类黄酮合成相关酶的工程乳酸菌及其构建和应用 | |
| CN106434510A (zh) | 一株发酵产l‑天冬氨酸的基因工程菌 | |
| CN113930347A (zh) | 一种能够合成褪黑素的绿色木霉工程菌及其构建方法与应用 | |
| Liu et al. | Scale high-cell-density fermentation of Pichia pastoris | |
| CN116751731B (zh) | 一种大规模质粒生产的发酵工艺 | |
| CN103834605B (zh) | 一种阿维菌素产生菌及其制备方法和应用 | |
| EP3483280B1 (en) | A fermentation method for producing gellan gum | |
| RU2687137C1 (ru) | Штамм гетеротрофных бактерий Klebsiella pneumonia - ассоциант для получения микробной белковой массы | |
| UA133594U (uk) | Спосіб отримання рекомбінантних штамів дріжджів candida famata з підвищеним рівнем синтезу вітаміну в2 (рибофлавіну) | |
| CN114107299B (zh) | 一种用于靶向敲除鸭cGAS基因的sgRNA及其应用 | |
| CN105907778B (zh) | 褐黄孢链霉菌重组表达质粒及工程菌与应用 | |
| CN111534471B (zh) | 一种粘细菌培养基及培养方法 | |
| RU2745093C1 (ru) | Штамм метанокисляющих бактерий Methylococcus capsulatus BF19-07 - продуцент для получения микробной белковой массы | |
| CN109554321B (zh) | 一种高产脂肽的基因工程菌及其应用 | |
| CN107937314B (zh) | 一种耐氧耐酸耐高糖的产酸丙酸杆菌及其应用 | |
| RU2650669C1 (ru) | Штамм Schizosaccharomyces pombe - продуцент молочной кислоты | |
| CN115895987B (zh) | 一种提高果糖软骨素产量的重组菌株及其构建方法 | |
| CN110791509B (zh) | 片球菌素优化表达序列、表达载体及其制作方法和菌株 |