UA120746C2 - Пептид, який здатний до зв'язування з молекулою мнс in vitro - Google Patents
Пептид, який здатний до зв'язування з молекулою мнс in vitro Download PDFInfo
- Publication number
- UA120746C2 UA120746C2 UAA201602098A UAA201602098A UA120746C2 UA 120746 C2 UA120746 C2 UA 120746C2 UA A201602098 A UAA201602098 A UA A201602098A UA A201602098 A UAA201602098 A UA A201602098A UA 120746 C2 UA120746 C2 UA 120746C2
- Authority
- UA
- Ukraine
- Prior art keywords
- peptide
- zeo
- ttgr
- bek
- shi
- Prior art date
Links
- 108090000765 processed proteins & peptides Proteins 0.000 title claims abstract description 299
- 102000004196 processed proteins & peptides Human genes 0.000 title claims abstract description 105
- 210000001744 T-lymphocyte Anatomy 0.000 claims abstract description 52
- 239000000203 mixture Substances 0.000 claims abstract description 39
- 238000004519 manufacturing process Methods 0.000 claims abstract description 38
- 238000011282 treatment Methods 0.000 claims abstract description 24
- 208000015023 Graves' disease Diseases 0.000 claims abstract description 20
- 208000023328 Basedow disease Diseases 0.000 claims abstract description 19
- 230000001363 autoimmune Effects 0.000 claims abstract description 15
- 230000030741 antigen processing and presentation Effects 0.000 claims abstract description 11
- 230000002265 prevention Effects 0.000 claims abstract description 10
- 238000000034 method Methods 0.000 claims description 24
- 102000003911 Thyrotropin Receptors Human genes 0.000 claims description 10
- 108090000253 Thyrotropin Receptors Proteins 0.000 claims description 10
- 229910052740 iodine Inorganic materials 0.000 claims description 8
- 210000000952 spleen Anatomy 0.000 claims description 8
- 229940126601 medicinal product Drugs 0.000 claims description 6
- 230000035755 proliferation Effects 0.000 claims description 5
- 230000009471 action Effects 0.000 claims description 3
- 241000251468 Actinopterygii Species 0.000 claims 1
- 235000003913 Coccoloba uvifera Nutrition 0.000 claims 1
- 241001580017 Jana Species 0.000 claims 1
- 108010016766 KK 3 Proteins 0.000 claims 1
- 241001482237 Pica Species 0.000 claims 1
- 240000008976 Pterocarpus marsupium Species 0.000 claims 1
- 241001021910 Rhizomys sumatrensis Species 0.000 claims 1
- 241000159610 Roya <green alga> Species 0.000 claims 1
- ATJFFYVFTNAWJD-UHFFFAOYSA-N Tin Chemical compound [Sn] ATJFFYVFTNAWJD-UHFFFAOYSA-N 0.000 claims 1
- 235000021022 fresh fruits Nutrition 0.000 claims 1
- 230000035939 shock Effects 0.000 claims 1
- 235000013311 vegetables Nutrition 0.000 claims 1
- 102000011923 Thyrotropin Human genes 0.000 abstract description 7
- 108010061174 Thyrotropin Proteins 0.000 abstract description 7
- 230000002401 inhibitory effect Effects 0.000 abstract description 3
- 239000003814 drug Substances 0.000 abstract 1
- 238000000338 in vitro Methods 0.000 abstract 1
- 238000001727 in vivo Methods 0.000 abstract 1
- 241000699670 Mus sp. Species 0.000 description 89
- 210000004027 cell Anatomy 0.000 description 57
- 108091007433 antigens Proteins 0.000 description 49
- 102000036639 antigens Human genes 0.000 description 49
- 239000000427 antigen Substances 0.000 description 48
- 150000001413 amino acids Chemical class 0.000 description 43
- 235000001014 amino acid Nutrition 0.000 description 42
- 210000004408 hybridoma Anatomy 0.000 description 33
- 230000003053 immunization Effects 0.000 description 24
- 238000002649 immunization Methods 0.000 description 23
- 210000000612 antigen-presenting cell Anatomy 0.000 description 22
- 108700018351 Major Histocompatibility Complex Proteins 0.000 description 17
- 230000020382 suppression by virus of host antigen processing and presentation of peptide antigen via MHC class I Effects 0.000 description 16
- 206010020850 Hyperthyroidism Diseases 0.000 description 15
- 238000006243 chemical reaction Methods 0.000 description 14
- 210000001685 thyroid gland Anatomy 0.000 description 14
- 230000001965 increasing effect Effects 0.000 description 13
- 230000000638 stimulation Effects 0.000 description 12
- IAZDPXIOMUYVGZ-UHFFFAOYSA-N Dimethylsulphoxide Chemical compound CS(C)=O IAZDPXIOMUYVGZ-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 11
- DHMQDGOQFOQNFH-UHFFFAOYSA-N Glycine Chemical compound NCC(O)=O DHMQDGOQFOQNFH-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 10
- 230000006052 T cell proliferation Effects 0.000 description 10
- 235000018102 proteins Nutrition 0.000 description 10
- 102000004169 proteins and genes Human genes 0.000 description 10
- 108090000623 proteins and genes Proteins 0.000 description 10
- 102000043129 MHC class I family Human genes 0.000 description 9
- 108091054437 MHC class I family Proteins 0.000 description 9
- 230000000694 effects Effects 0.000 description 9
- 230000028993 immune response Effects 0.000 description 9
- 238000002347 injection Methods 0.000 description 9
- 239000007924 injection Substances 0.000 description 9
- 210000002966 serum Anatomy 0.000 description 9
- 210000004988 splenocyte Anatomy 0.000 description 9
- 101100460719 Mus musculus Noto gene Proteins 0.000 description 8
- 101100187345 Xenopus laevis noto gene Proteins 0.000 description 8
- 201000010099 disease Diseases 0.000 description 8
- 208000037265 diseases, disorders, signs and symptoms Diseases 0.000 description 8
- 238000012545 processing Methods 0.000 description 8
- 208000024891 symptom Diseases 0.000 description 8
- 229940104230 thymidine Drugs 0.000 description 8
- 238000002474 experimental method Methods 0.000 description 7
- 210000001165 lymph node Anatomy 0.000 description 7
- 239000002609 medium Substances 0.000 description 7
- 239000002245 particle Substances 0.000 description 7
- XUIIKFGFIJCVMT-GFCCVEGCSA-N D-thyroxine Chemical compound IC1=CC(C[C@@H](N)C(O)=O)=CC(I)=C1OC1=CC(I)=C(O)C(I)=C1 XUIIKFGFIJCVMT-GFCCVEGCSA-N 0.000 description 6
- 102000043131 MHC class II family Human genes 0.000 description 6
- 108091054438 MHC class II family Proteins 0.000 description 6
- 108700023707 TUG1 Proteins 0.000 description 6
- IQFYYKKMVGJFEH-XLPZGREQSA-N Thymidine Chemical compound O=C1NC(=O)C(C)=CN1[C@@H]1O[C@H](CO)[C@@H](O)C1 IQFYYKKMVGJFEH-XLPZGREQSA-N 0.000 description 6
- 108020003175 receptors Proteins 0.000 description 6
- 102000005962 receptors Human genes 0.000 description 6
- 239000004471 Glycine Substances 0.000 description 5
- 241000699666 Mus <mouse, genus> Species 0.000 description 5
- 238000004458 analytical method Methods 0.000 description 5
- 239000003086 colorant Substances 0.000 description 5
- 239000012634 fragment Substances 0.000 description 5
- 238000005259 measurement Methods 0.000 description 5
- 239000008194 pharmaceutical composition Substances 0.000 description 5
- 239000000243 solution Substances 0.000 description 5
- 239000006228 supernatant Substances 0.000 description 5
- 241001465754 Metazoa Species 0.000 description 4
- AUYYCJSJGJYCDS-LBPRGKRZSA-N Thyrolar Chemical class IC1=CC(C[C@H](N)C(O)=O)=CC(I)=C1OC1=CC=C(O)C(I)=C1 AUYYCJSJGJYCDS-LBPRGKRZSA-N 0.000 description 4
- 239000002671 adjuvant Substances 0.000 description 4
- 210000003719 b-lymphocyte Anatomy 0.000 description 4
- 230000015572 biosynthetic process Effects 0.000 description 4
- 102000054766 genetic haplotypes Human genes 0.000 description 4
- 230000002163 immunogen Effects 0.000 description 4
- 230000005847 immunogenicity Effects 0.000 description 4
- 230000006698 induction Effects 0.000 description 4
- KDXKERNSBIXSRK-UHFFFAOYSA-N lysine Chemical compound NCCCCC(N)C(O)=O KDXKERNSBIXSRK-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 4
- 210000003126 m-cell Anatomy 0.000 description 4
- 230000003287 optical effect Effects 0.000 description 4
- 210000003819 peripheral blood mononuclear cell Anatomy 0.000 description 4
- 230000009257 reactivity Effects 0.000 description 4
- 230000009467 reduction Effects 0.000 description 4
- 230000004044 response Effects 0.000 description 4
- UCSJYZPVAKXKNQ-HZYVHMACSA-N streptomycin Chemical compound CN[C@H]1[C@H](O)[C@@H](O)[C@H](CO)O[C@H]1O[C@@H]1[C@](C=O)(O)[C@H](C)O[C@H]1O[C@@H]1[C@@H](NC(N)=N)[C@H](O)[C@@H](NC(N)=N)[C@H](O)[C@H]1O UCSJYZPVAKXKNQ-HZYVHMACSA-N 0.000 description 4
- 238000012360 testing method Methods 0.000 description 4
- 239000005495 thyroid hormone Substances 0.000 description 4
- 229940036555 thyroid hormone Drugs 0.000 description 4
- 229940034208 thyroxine Drugs 0.000 description 4
- XUIIKFGFIJCVMT-UHFFFAOYSA-N thyroxine-binding globulin Natural products IC1=CC(CC([NH3+])C([O-])=O)=CC(I)=C1OC1=CC(I)=C(O)C(I)=C1 XUIIKFGFIJCVMT-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 4
- 241000701161 unidentified adenovirus Species 0.000 description 4
- 230000003612 virological effect Effects 0.000 description 4
- ZCYVEMRRCGMTRW-UHFFFAOYSA-N 7553-56-2 Chemical compound [I] ZCYVEMRRCGMTRW-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 3
- 208000023275 Autoimmune disease Diseases 0.000 description 3
- DWRXFEITVBNRMK-UHFFFAOYSA-N Beta-D-1-Arabinofuranosylthymine Natural products O=C1NC(=O)C(C)=CN1C1C(O)C(O)C(CO)O1 DWRXFEITVBNRMK-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 3
- 102000004127 Cytokines Human genes 0.000 description 3
- 108090000695 Cytokines Proteins 0.000 description 3
- 206010011968 Decreased immune responsiveness Diseases 0.000 description 3
- LFQSCWFLJHTTHZ-UHFFFAOYSA-N Ethanol Chemical compound CCO LFQSCWFLJHTTHZ-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 3
- PEDCQBHIVMGVHV-UHFFFAOYSA-N Glycerine Chemical compound OCC(O)CO PEDCQBHIVMGVHV-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 3
- 239000004472 Lysine Substances 0.000 description 3
- 241001529936 Murinae Species 0.000 description 3
- 241000699660 Mus musculus Species 0.000 description 3
- HEMHJVSKTPXQMS-UHFFFAOYSA-M Sodium hydroxide Chemical compound [OH-].[Na+] HEMHJVSKTPXQMS-UHFFFAOYSA-M 0.000 description 3
- 208000026935 allergic disease Diseases 0.000 description 3
- 238000010171 animal model Methods 0.000 description 3
- IQFYYKKMVGJFEH-UHFFFAOYSA-N beta-L-thymidine Natural products O=C1NC(=O)C(C)=CN1C1OC(CO)C(O)C1 IQFYYKKMVGJFEH-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 3
- 210000004369 blood Anatomy 0.000 description 3
- 239000008280 blood Substances 0.000 description 3
- 238000004113 cell culture Methods 0.000 description 3
- 230000004663 cell proliferation Effects 0.000 description 3
- 238000003776 cleavage reaction Methods 0.000 description 3
- 101150006611 emb-5 gene Proteins 0.000 description 3
- 238000004108 freeze drying Methods 0.000 description 3
- 210000005260 human cell Anatomy 0.000 description 3
- 238000010348 incorporation Methods 0.000 description 3
- 230000001939 inductive effect Effects 0.000 description 3
- 239000011630 iodine Substances 0.000 description 3
- 239000003446 ligand Substances 0.000 description 3
- 108091005601 modified peptides Proteins 0.000 description 3
- 230000002093 peripheral effect Effects 0.000 description 3
- 230000037452 priming Effects 0.000 description 3
- 230000007017 scission Effects 0.000 description 3
- 230000004936 stimulating effect Effects 0.000 description 3
- 239000000126 substance Substances 0.000 description 3
- 238000006467 substitution reaction Methods 0.000 description 3
- 238000003786 synthesis reaction Methods 0.000 description 3
- 239000003826 tablet Substances 0.000 description 3
- 230000003614 tolerogenic effect Effects 0.000 description 3
- 238000011830 transgenic mouse model Methods 0.000 description 3
- 238000007492 two-way ANOVA Methods 0.000 description 3
- XLYOFNOQVPJJNP-UHFFFAOYSA-N water Substances O XLYOFNOQVPJJNP-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 3
- 201000004569 Blindness Diseases 0.000 description 2
- 238000010152 Bonferroni least significant difference Methods 0.000 description 2
- 101100310222 Caenorhabditis briggsae she-1 gene Proteins 0.000 description 2
- 101100256965 Caenorhabditis elegans sip-1 gene Proteins 0.000 description 2
- 102100037355 Chromosome alignment-maintaining phosphoprotein 1 Human genes 0.000 description 2
- 206010060742 Endocrine ophthalmopathy Diseases 0.000 description 2
- WSFSSNUMVMOOMR-UHFFFAOYSA-N Formaldehyde Chemical compound O=C WSFSSNUMVMOOMR-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 206010018498 Goitre Diseases 0.000 description 2
- WZUVPPKBWHMQCE-UHFFFAOYSA-N Haematoxylin Chemical compound C12=CC(O)=C(O)C=C2CC2(O)C1C1=CC=C(O)C(O)=C1OC2 WZUVPPKBWHMQCE-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 108010027412 Histocompatibility Antigens Class II Proteins 0.000 description 2
- 102000018713 Histocompatibility Antigens Class II Human genes 0.000 description 2
- 241000282412 Homo Species 0.000 description 2
- 101000741320 Homo sapiens Cathelicidin antimicrobial peptide Proteins 0.000 description 2
- 101000880066 Homo sapiens Chromosome alignment-maintaining phosphoprotein 1 Proteins 0.000 description 2
- VEXZGXHMUGYJMC-UHFFFAOYSA-N Hydrochloric acid Chemical compound Cl VEXZGXHMUGYJMC-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 206010020751 Hypersensitivity Diseases 0.000 description 2
- 206010028665 Myxoedema Diseases 0.000 description 2
- 229930182555 Penicillin Natural products 0.000 description 2
- JGSARLDLIJGVTE-MBNYWOFBSA-N Penicillin G Chemical compound N([C@H]1[C@H]2SC([C@@H](N2C1=O)C(O)=O)(C)C)C(=O)CC1=CC=CC=C1 JGSARLDLIJGVTE-MBNYWOFBSA-N 0.000 description 2
- 108091008874 T cell receptors Proteins 0.000 description 2
- 102000016266 T-Cell Antigen Receptors Human genes 0.000 description 2
- 241000876472 Umma Species 0.000 description 2
- 238000002835 absorbance Methods 0.000 description 2
- 230000004913 activation Effects 0.000 description 2
- 239000004480 active ingredient Substances 0.000 description 2
- 230000033289 adaptive immune response Effects 0.000 description 2
- 238000013459 approach Methods 0.000 description 2
- 210000004899 c-terminal region Anatomy 0.000 description 2
- 125000003178 carboxy group Chemical group [H]OC(*)=O 0.000 description 2
- 238000005119 centrifugation Methods 0.000 description 2
- 239000012228 culture supernatant Substances 0.000 description 2
- 210000004443 dendritic cell Anatomy 0.000 description 2
- 210000002257 embryonic structure Anatomy 0.000 description 2
- 210000002919 epithelial cell Anatomy 0.000 description 2
- 210000000744 eyelid Anatomy 0.000 description 2
- 230000004927 fusion Effects 0.000 description 2
- 201000003872 goiter Diseases 0.000 description 2
- 229940088597 hormone Drugs 0.000 description 2
- 239000005556 hormone Substances 0.000 description 2
- 229910052739 hydrogen Inorganic materials 0.000 description 2
- 208000013403 hyperactivity Diseases 0.000 description 2
- 210000000987 immune system Anatomy 0.000 description 2
- 108020001756 ligand binding domains Proteins 0.000 description 2
- 239000007788 liquid Substances 0.000 description 2
- 239000000463 material Substances 0.000 description 2
- 230000007246 mechanism Effects 0.000 description 2
- 230000001404 mediated effect Effects 0.000 description 2
- 238000002156 mixing Methods 0.000 description 2
- 238000012986 modification Methods 0.000 description 2
- 230000004048 modification Effects 0.000 description 2
- 208000003786 myxedema Diseases 0.000 description 2
- 239000008188 pellet Substances 0.000 description 2
- 229940049954 penicillin Drugs 0.000 description 2
- 210000005259 peripheral blood Anatomy 0.000 description 2
- 239000011886 peripheral blood Substances 0.000 description 2
- 239000000546 pharmaceutical excipient Substances 0.000 description 2
- 230000002285 radioactive effect Effects 0.000 description 2
- 230000028327 secretion Effects 0.000 description 2
- 230000019491 signal transduction Effects 0.000 description 2
- 229960005322 streptomycin Drugs 0.000 description 2
- 238000007920 subcutaneous administration Methods 0.000 description 2
- 230000001225 therapeutic effect Effects 0.000 description 2
- 210000001541 thymus gland Anatomy 0.000 description 2
- 102000015486 thyroid-stimulating hormone receptor activity proteins Human genes 0.000 description 2
- 108040006218 thyroid-stimulating hormone receptor activity proteins Proteins 0.000 description 2
- 210000001519 tissue Anatomy 0.000 description 2
- 238000011277 treatment modality Methods 0.000 description 2
- 238000007473 univariate analysis Methods 0.000 description 2
- 230000004393 visual impairment Effects 0.000 description 2
- 238000005406 washing Methods 0.000 description 2
- HDTRYLNUVZCQOY-UHFFFAOYSA-N α-D-glucopyranosyl-α-D-glucopyranoside Natural products OC1C(O)C(O)C(CO)OC1OC1C(O)C(O)C(O)C(CO)O1 HDTRYLNUVZCQOY-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- QPILHXCDZYWYLQ-UHFFFAOYSA-N 2-nonyl-1,3-dioxolane Chemical compound CCCCCCCCCC1OCCO1 QPILHXCDZYWYLQ-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- UAIUNKRWKOVEES-UHFFFAOYSA-N 3,3',5,5'-tetramethylbenzidine Chemical compound CC1=C(N)C(C)=CC(C=2C=C(C)C(N)=C(C)C=2)=C1 UAIUNKRWKOVEES-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- HYCKBFLTZGORKA-HNPMAXIBSA-N 3,7-dihydropurin-6-one;1-[(2r,4s,5r)-4-hydroxy-5-(hydroxymethyl)oxolan-2-yl]-5-methylpyrimidine-2,4-dione Chemical compound O=C1NC=NC2=C1NC=N2.O=C1NC(=O)C(C)=CN1[C@@H]1O[C@H](CO)[C@@H](O)C1 HYCKBFLTZGORKA-HNPMAXIBSA-N 0.000 description 1
- 206010054196 Affect lability Diseases 0.000 description 1
- 201000004384 Alopecia Diseases 0.000 description 1
- 208000019901 Anxiety disease Diseases 0.000 description 1
- 208000032116 Autoimmune Experimental Encephalomyelitis Diseases 0.000 description 1
- 101150076489 B gene Proteins 0.000 description 1
- 108091003079 Bovine Serum Albumin Proteins 0.000 description 1
- 101710117545 C protein Proteins 0.000 description 1
- 108010075254 C-Peptide Proteins 0.000 description 1
- 241000283707 Capra Species 0.000 description 1
- BVKZGUZCCUSVTD-UHFFFAOYSA-L Carbonate Chemical compound [O-]C([O-])=O BVKZGUZCCUSVTD-UHFFFAOYSA-L 0.000 description 1
- FBPFZTCFMRRESA-KVTDHHQDSA-N D-Mannitol Chemical compound OC[C@@H](O)[C@@H](O)[C@H](O)[C@H](O)CO FBPFZTCFMRRESA-KVTDHHQDSA-N 0.000 description 1
- 229920002307 Dextran Polymers 0.000 description 1
- 238000002965 ELISA Methods 0.000 description 1
- 206010017533 Fungal infection Diseases 0.000 description 1
- WQZGKKKJIJFFOK-GASJEMHNSA-N Glucose Natural products OC[C@H]1OC(O)[C@H](O)[C@@H](O)[C@@H]1O WQZGKKKJIJFFOK-GASJEMHNSA-N 0.000 description 1
- WHUUTDBJXJRKMK-UHFFFAOYSA-N Glutamic acid Natural products OC(=O)C(N)CCC(O)=O WHUUTDBJXJRKMK-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 208000003807 Graves Disease Diseases 0.000 description 1
- 101000851593 Homo sapiens Separin Proteins 0.000 description 1
- 108010001336 Horseradish Peroxidase Proteins 0.000 description 1
- 206010020772 Hypertension Diseases 0.000 description 1
- 206010020880 Hypertrophy Diseases 0.000 description 1
- 108060003951 Immunoglobulin Proteins 0.000 description 1
- 108010036012 Iodide peroxidase Proteins 0.000 description 1
- 206010022998 Irritability Diseases 0.000 description 1
- ONIBWKKTOPOVIA-BYPYZUCNSA-N L-Proline Chemical compound OC(=O)[C@@H]1CCCN1 ONIBWKKTOPOVIA-BYPYZUCNSA-N 0.000 description 1
- WHUUTDBJXJRKMK-VKHMYHEASA-N L-glutamic acid Chemical compound OC(=O)[C@@H](N)CCC(O)=O WHUUTDBJXJRKMK-VKHMYHEASA-N 0.000 description 1
- ZDXPYRJPNDTMRX-VKHMYHEASA-N L-glutamine Chemical compound OC(=O)[C@@H](N)CCC(N)=O ZDXPYRJPNDTMRX-VKHMYHEASA-N 0.000 description 1
- KDXKERNSBIXSRK-YFKPBYRVSA-N L-lysine Chemical compound NCCCC[C@H](N)C(O)=O KDXKERNSBIXSRK-YFKPBYRVSA-N 0.000 description 1
- 206010023644 Lacrimation increased Diseases 0.000 description 1
- 102100037611 Lysophospholipase Human genes 0.000 description 1
- 229930195725 Mannitol Natural products 0.000 description 1
- 101800001775 Nuclear inclusion protein A Proteins 0.000 description 1
- 206010061323 Optic neuropathy Diseases 0.000 description 1
- 240000007594 Oryza sativa Species 0.000 description 1
- 235000007164 Oryza sativa Nutrition 0.000 description 1
- 229910019142 PO4 Inorganic materials 0.000 description 1
- 229930040373 Paraformaldehyde Natural products 0.000 description 1
- 108010033276 Peptide Fragments Proteins 0.000 description 1
- 102000007079 Peptide Fragments Human genes 0.000 description 1
- 102000003992 Peroxidases Human genes 0.000 description 1
- 206010034719 Personality change Diseases 0.000 description 1
- 108010058864 Phospholipases A2 Proteins 0.000 description 1
- 239000002202 Polyethylene glycol Substances 0.000 description 1
- ONIBWKKTOPOVIA-UHFFFAOYSA-N Proline Natural products OC(=O)C1CCCN1 ONIBWKKTOPOVIA-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 208000001431 Psychomotor Agitation Diseases 0.000 description 1
- 208000028017 Psychotic disease Diseases 0.000 description 1
- 206010038743 Restlessness Diseases 0.000 description 1
- 102100036750 Separin Human genes 0.000 description 1
- 208000032023 Signs and Symptoms Diseases 0.000 description 1
- 208000013738 Sleep Initiation and Maintenance disease Diseases 0.000 description 1
- FAPWRFPIFSIZLT-UHFFFAOYSA-M Sodium chloride Chemical compound [Na+].[Cl-] FAPWRFPIFSIZLT-UHFFFAOYSA-M 0.000 description 1
- 229930006000 Sucrose Natural products 0.000 description 1
- CZMRCDWAGMRECN-UGDNZRGBSA-N Sucrose Chemical compound O[C@H]1[C@H](O)[C@@H](CO)O[C@@]1(CO)O[C@@H]1[C@H](O)[C@@H](O)[C@H](O)[C@@H](CO)O1 CZMRCDWAGMRECN-UGDNZRGBSA-N 0.000 description 1
- 230000006044 T cell activation Effects 0.000 description 1
- 230000017274 T cell anergy Effects 0.000 description 1
- 206010057040 Temperature intolerance Diseases 0.000 description 1
- 108010034949 Thyroglobulin Proteins 0.000 description 1
- 102000009843 Thyroglobulin Human genes 0.000 description 1
- 102000014267 Thyroid peroxidases Human genes 0.000 description 1
- 206010052779 Transplant rejections Diseases 0.000 description 1
- HDTRYLNUVZCQOY-WSWWMNSNSA-N Trehalose Natural products O[C@@H]1[C@@H](O)[C@@H](O)[C@@H](CO)O[C@@H]1O[C@@H]1[C@H](O)[C@@H](O)[C@@H](O)[C@@H](CO)O1 HDTRYLNUVZCQOY-WSWWMNSNSA-N 0.000 description 1
- 206010044565 Tremor Diseases 0.000 description 1
- YZCKVEUIGOORGS-NJFSPNSNSA-N Tritium Chemical compound [3H] YZCKVEUIGOORGS-NJFSPNSNSA-N 0.000 description 1
- 241000700605 Viruses Species 0.000 description 1
- 206010047555 Visual field defect Diseases 0.000 description 1
- 230000005856 abnormality Effects 0.000 description 1
- 238000011481 absorbance measurement Methods 0.000 description 1
- 150000001242 acetic acid derivatives Chemical class 0.000 description 1
- 230000003213 activating effect Effects 0.000 description 1
- 210000005006 adaptive immune system Anatomy 0.000 description 1
- 102000030621 adenylate cyclase Human genes 0.000 description 1
- 108060000200 adenylate cyclase Proteins 0.000 description 1
- 238000013019 agitation Methods 0.000 description 1
- 230000001270 agonistic effect Effects 0.000 description 1
- 230000007815 allergy Effects 0.000 description 1
- HDTRYLNUVZCQOY-LIZSDCNHSA-N alpha,alpha-trehalose Chemical compound O[C@@H]1[C@@H](O)[C@H](O)[C@@H](CO)O[C@@H]1O[C@@H]1[C@H](O)[C@@H](O)[C@H](O)[C@@H](CO)O1 HDTRYLNUVZCQOY-LIZSDCNHSA-N 0.000 description 1
- WYTGDNHDOZPMIW-RCBQFDQVSA-N alstonine Natural products C1=CC2=C3C=CC=CC3=NC2=C2N1C[C@H]1[C@H](C)OC=C(C(=O)OC)[C@H]1C2 WYTGDNHDOZPMIW-RCBQFDQVSA-N 0.000 description 1
- 125000000539 amino acid group Chemical group 0.000 description 1
- 239000003708 ampul Substances 0.000 description 1
- 238000000540 analysis of variance Methods 0.000 description 1
- 239000003200 antithyroid agent Substances 0.000 description 1
- 229940043671 antithyroid preparations Drugs 0.000 description 1
- 230000036506 anxiety Effects 0.000 description 1
- 230000006907 apoptotic process Effects 0.000 description 1
- 206010003119 arrhythmia Diseases 0.000 description 1
- 206010003246 arthritis Diseases 0.000 description 1
- 238000013528 artificial neural network Methods 0.000 description 1
- 230000006470 autoimmune attack Effects 0.000 description 1
- 239000003659 bee venom Substances 0.000 description 1
- 230000003542 behavioural effect Effects 0.000 description 1
- 238000005452 bending Methods 0.000 description 1
- WQZGKKKJIJFFOK-VFUOTHLCSA-N beta-D-glucose Chemical compound OC[C@H]1O[C@@H](O)[C@H](O)[C@@H](O)[C@@H]1O WQZGKKKJIJFFOK-VFUOTHLCSA-N 0.000 description 1
- 239000011230 binding agent Substances 0.000 description 1
- 230000000903 blocking effect Effects 0.000 description 1
- 239000000872 buffer Substances 0.000 description 1
- 239000000337 buffer salt Substances 0.000 description 1
- 239000004067 bulking agent Substances 0.000 description 1
- 244000309464 bull Species 0.000 description 1
- 230000011496 cAMP-mediated signaling Effects 0.000 description 1
- 238000012754 cardiac puncture Methods 0.000 description 1
- 210000000170 cell membrane Anatomy 0.000 description 1
- 238000001516 cell proliferation assay Methods 0.000 description 1
- 239000006285 cell suspension Substances 0.000 description 1
- 239000003795 chemical substances by application Substances 0.000 description 1
- 150000001860 citric acid derivatives Chemical class 0.000 description 1
- 239000011248 coating agent Substances 0.000 description 1
- 238000004891 communication Methods 0.000 description 1
- 238000005094 computer simulation Methods 0.000 description 1
- 239000012141 concentrate Substances 0.000 description 1
- 238000010276 construction Methods 0.000 description 1
- 210000004087 cornea Anatomy 0.000 description 1
- 230000004940 costimulation Effects 0.000 description 1
- 230000000139 costimulatory effect Effects 0.000 description 1
- 230000016396 cytokine production Effects 0.000 description 1
- 230000034994 death Effects 0.000 description 1
- 230000007423 decrease Effects 0.000 description 1
- 238000011161 development Methods 0.000 description 1
- 239000008121 dextrose Substances 0.000 description 1
- 206010012601 diabetes mellitus Diseases 0.000 description 1
- 230000029087 digestion Effects 0.000 description 1
- 238000010790 dilution Methods 0.000 description 1
- 239000012895 dilution Substances 0.000 description 1
- LOKCTEFSRHRXRJ-UHFFFAOYSA-I dipotassium trisodium dihydrogen phosphate hydrogen phosphate dichloride Chemical compound P(=O)(O)(O)[O-].[K+].P(=O)(O)([O-])[O-].[Na+].[Na+].[Cl-].[K+].[Cl-].[Na+] LOKCTEFSRHRXRJ-UHFFFAOYSA-I 0.000 description 1
- 150000002016 disaccharides Chemical class 0.000 description 1
- 230000006806 disease prevention Effects 0.000 description 1
- 238000004090 dissolution Methods 0.000 description 1
- 239000002552 dosage form Substances 0.000 description 1
- 235000013601 eggs Nutrition 0.000 description 1
- 230000001804 emulsifying effect Effects 0.000 description 1
- 230000012202 endocytosis Effects 0.000 description 1
- 238000005516 engineering process Methods 0.000 description 1
- YQGOJNYOYNNSMM-UHFFFAOYSA-N eosin Chemical compound [Na+].OC(=O)C1=CC=CC=C1C1=C2C=C(Br)C(=O)C(Br)=C2OC2=C(Br)C(O)=C(Br)C=C21 YQGOJNYOYNNSMM-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 238000011156 evaluation Methods 0.000 description 1
- 208000001936 exophthalmos Diseases 0.000 description 1
- 208000012997 experimental autoimmune encephalomyelitis Diseases 0.000 description 1
- 239000012894 fetal calf serum Substances 0.000 description 1
- 238000000684 flow cytometry Methods 0.000 description 1
- 230000003325 follicular Effects 0.000 description 1
- 238000007710 freezing Methods 0.000 description 1
- 230000008014 freezing Effects 0.000 description 1
- 239000012595 freezing medium Substances 0.000 description 1
- 208000024386 fungal infectious disease Diseases 0.000 description 1
- 235000013922 glutamic acid Nutrition 0.000 description 1
- 239000004220 glutamic acid Substances 0.000 description 1
- 125000000291 glutamic acid group Chemical group N[C@@H](CCC(O)=O)C(=O)* 0.000 description 1
- ZDXPYRJPNDTMRX-UHFFFAOYSA-N glutamine Natural products OC(=O)C(N)CCC(N)=O ZDXPYRJPNDTMRX-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 229960002743 glutamine Drugs 0.000 description 1
- 125000003630 glycyl group Chemical group [H]N([H])C([H])([H])C(*)=O 0.000 description 1
- 208000024963 hair loss Diseases 0.000 description 1
- 230000003676 hair loss Effects 0.000 description 1
- 108091008039 hormone receptors Proteins 0.000 description 1
- 230000009610 hypersensitivity Effects 0.000 description 1
- 208000003532 hypothyroidism Diseases 0.000 description 1
- 230000002989 hypothyroidism Effects 0.000 description 1
- 230000008105 immune reaction Effects 0.000 description 1
- 230000003832 immune regulation Effects 0.000 description 1
- 230000006058 immune tolerance Effects 0.000 description 1
- 230000002998 immunogenetic effect Effects 0.000 description 1
- 102000018358 immunoglobulin Human genes 0.000 description 1
- 229940072221 immunoglobulins Drugs 0.000 description 1
- 230000001024 immunotherapeutic effect Effects 0.000 description 1
- 239000007943 implant Substances 0.000 description 1
- 206010021654 increased appetite Diseases 0.000 description 1
- 238000011534 incubation Methods 0.000 description 1
- 239000012678 infectious agent Substances 0.000 description 1
- 230000008595 infiltration Effects 0.000 description 1
- 238000001764 infiltration Methods 0.000 description 1
- 208000027866 inflammatory disease Diseases 0.000 description 1
- 230000002757 inflammatory effect Effects 0.000 description 1
- 230000005764 inhibitory process Effects 0.000 description 1
- 206010022437 insomnia Diseases 0.000 description 1
- 230000003834 intracellular effect Effects 0.000 description 1
- 230000037041 intracellular level Effects 0.000 description 1
- 238000007918 intramuscular administration Methods 0.000 description 1
- 238000001990 intravenous administration Methods 0.000 description 1
- 230000026045 iodination Effects 0.000 description 1
- 238000006192 iodination reaction Methods 0.000 description 1
- FZWBNHMXJMCXLU-BLAUPYHCSA-N isomaltotriose Chemical compound O[C@@H]1[C@@H](O)[C@H](O)[C@@H](CO)O[C@@H]1OC[C@@H]1[C@@H](O)[C@H](O)[C@@H](O)[C@@H](OC[C@@H](O)[C@@H](O)[C@H](O)[C@@H](O)C=O)O1 FZWBNHMXJMCXLU-BLAUPYHCSA-N 0.000 description 1
- 238000011813 knockout mouse model Methods 0.000 description 1
- 230000004317 lacrimation Effects 0.000 description 1
- 239000002502 liposome Substances 0.000 description 1
- 239000006193 liquid solution Substances 0.000 description 1
- 239000006194 liquid suspension Substances 0.000 description 1
- 210000004698 lymphocyte Anatomy 0.000 description 1
- 210000002540 macrophage Anatomy 0.000 description 1
- 239000000594 mannitol Substances 0.000 description 1
- 235000010355 mannitol Nutrition 0.000 description 1
- 210000001616 monocyte Anatomy 0.000 description 1
- 201000006417 multiple sclerosis Diseases 0.000 description 1
- 210000003205 muscle Anatomy 0.000 description 1
- 230000035772 mutation Effects 0.000 description 1
- 230000001537 neural effect Effects 0.000 description 1
- 230000007935 neutral effect Effects 0.000 description 1
- 238000006386 neutralization reaction Methods 0.000 description 1
- 210000001328 optic nerve Anatomy 0.000 description 1
- 208000020911 optic nerve disease Diseases 0.000 description 1
- 239000006179 pH buffering agent Substances 0.000 description 1
- 229920002866 paraformaldehyde Polymers 0.000 description 1
- 230000001717 pathogenic effect Effects 0.000 description 1
- 231100000915 pathological change Toxicity 0.000 description 1
- 230000036285 pathological change Effects 0.000 description 1
- 108040007629 peroxidase activity proteins Proteins 0.000 description 1
- 235000021317 phosphate Nutrition 0.000 description 1
- 239000002953 phosphate buffered saline Substances 0.000 description 1
- 150000003013 phosphoric acid derivatives Chemical class 0.000 description 1
- 229920001223 polyethylene glycol Polymers 0.000 description 1
- 229920001184 polypeptide Polymers 0.000 description 1
- 229920000136 polysorbate Polymers 0.000 description 1
- 239000013641 positive control Substances 0.000 description 1
- 239000000843 powder Substances 0.000 description 1
- 239000002244 precipitate Substances 0.000 description 1
- 238000002360 preparation method Methods 0.000 description 1
- 230000002062 proliferating effect Effects 0.000 description 1
- 230000000069 prophylactic effect Effects 0.000 description 1
- 230000017854 proteolysis Effects 0.000 description 1
- 238000005086 pumping Methods 0.000 description 1
- 238000000746 purification Methods 0.000 description 1
- 238000010188 recombinant method Methods 0.000 description 1
- 230000001105 regulatory effect Effects 0.000 description 1
- 238000011160 research Methods 0.000 description 1
- 235000009566 rice Nutrition 0.000 description 1
- 230000003248 secreting effect Effects 0.000 description 1
- 230000035945 sensitivity Effects 0.000 description 1
- 238000000926 separation method Methods 0.000 description 1
- 238000012163 sequencing technique Methods 0.000 description 1
- 238000013207 serial dilution Methods 0.000 description 1
- 239000012679 serum free medium Substances 0.000 description 1
- 239000011780 sodium chloride Substances 0.000 description 1
- 239000007787 solid Substances 0.000 description 1
- 238000010532 solid phase synthesis reaction Methods 0.000 description 1
- 239000002904 solvent Substances 0.000 description 1
- 230000006641 stabilisation Effects 0.000 description 1
- 238000011105 stabilization Methods 0.000 description 1
- 238000010186 staining Methods 0.000 description 1
- 238000007619 statistical method Methods 0.000 description 1
- 150000003431 steroids Chemical class 0.000 description 1
- 239000005720 sucrose Substances 0.000 description 1
- 239000000829 suppository Substances 0.000 description 1
- 239000000375 suspending agent Substances 0.000 description 1
- 239000000725 suspension Substances 0.000 description 1
- 230000035900 sweating Effects 0.000 description 1
- 238000002560 therapeutic procedure Methods 0.000 description 1
- 229960002175 thyroglobulin Drugs 0.000 description 1
- 231100000399 thyrotoxic Toxicity 0.000 description 1
- 230000001897 thyrotoxic effect Effects 0.000 description 1
- 238000012546 transfer Methods 0.000 description 1
- 238000009966 trimming Methods 0.000 description 1
- 229910052722 tritium Inorganic materials 0.000 description 1
- 210000000689 upper leg Anatomy 0.000 description 1
- 239000006200 vaporizer Substances 0.000 description 1
- 239000013598 vector Substances 0.000 description 1
- 208000034280 venom allergy Diseases 0.000 description 1
- 230000000007 visual effect Effects 0.000 description 1
- 230000004580 weight loss Effects 0.000 description 1
- 238000009736 wetting Methods 0.000 description 1
Classifications
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C07—ORGANIC CHEMISTRY
- C07K—PEPTIDES
- C07K14/00—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof
- C07K14/435—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof from animals; from humans
- C07K14/46—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof from animals; from humans from vertebrates
- C07K14/47—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof from animals; from humans from vertebrates from mammals
-
- A—HUMAN NECESSITIES
- A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
- A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
- A61K39/00—Medicinal preparations containing antigens or antibodies
- A61K39/0005—Vertebrate antigens
-
- A—HUMAN NECESSITIES
- A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
- A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
- A61P37/00—Drugs for immunological or allergic disorders
-
- A—HUMAN NECESSITIES
- A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
- A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
- A61P5/00—Drugs for disorders of the endocrine system
- A61P5/14—Drugs for disorders of the endocrine system of the thyroid hormones, e.g. T3, T4
-
- A—HUMAN NECESSITIES
- A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
- A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
- A61P5/00—Drugs for disorders of the endocrine system
- A61P5/14—Drugs for disorders of the endocrine system of the thyroid hormones, e.g. T3, T4
- A61P5/16—Drugs for disorders of the endocrine system of the thyroid hormones, e.g. T3, T4 for decreasing, blocking or antagonising the activity of the thyroid hormones
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C07—ORGANIC CHEMISTRY
- C07K—PEPTIDES
- C07K14/00—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof
- C07K14/435—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof from animals; from humans
- C07K14/705—Receptors; Cell surface antigens; Cell surface determinants
- C07K14/72—Receptors; Cell surface antigens; Cell surface determinants for hormones
- C07K14/723—G protein coupled receptor, e.g. TSHR-thyrotropin-receptor, LH/hCG receptor, FSH receptor
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C07—ORGANIC CHEMISTRY
- C07K—PEPTIDES
- C07K7/00—Peptides having 5 to 20 amino acids in a fully defined sequence; Derivatives thereof
- C07K7/04—Linear peptides containing only normal peptide links
- C07K7/08—Linear peptides containing only normal peptide links having 12 to 20 amino acids
-
- A—HUMAN NECESSITIES
- A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
- A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
- A61K38/00—Medicinal preparations containing peptides
Landscapes
- Health & Medical Sciences (AREA)
- Chemical & Material Sciences (AREA)
- Life Sciences & Earth Sciences (AREA)
- Organic Chemistry (AREA)
- Medicinal Chemistry (AREA)
- General Health & Medical Sciences (AREA)
- Immunology (AREA)
- Proteomics, Peptides & Aminoacids (AREA)
- Molecular Biology (AREA)
- Genetics & Genomics (AREA)
- Biophysics (AREA)
- Biochemistry (AREA)
- Veterinary Medicine (AREA)
- Pharmacology & Pharmacy (AREA)
- Public Health (AREA)
- Animal Behavior & Ethology (AREA)
- Toxicology (AREA)
- Gastroenterology & Hepatology (AREA)
- Zoology (AREA)
- Endocrinology (AREA)
- Epidemiology (AREA)
- Mycology (AREA)
- Cell Biology (AREA)
- Microbiology (AREA)
- Engineering & Computer Science (AREA)
- Bioinformatics & Cheminformatics (AREA)
- General Chemical & Material Sciences (AREA)
- Chemical Kinetics & Catalysis (AREA)
- Nuclear Medicine, Radiotherapy & Molecular Imaging (AREA)
- Diabetes (AREA)
- Peptides Or Proteins (AREA)
- Medicines That Contain Protein Lipid Enzymes And Other Medicines (AREA)
Abstract
Винахід стосується пептиду, який вибирають з пептидів рецептора тиреотропного гормону (ТТГР), та який здатний до зв'язування з молекулою MHC in vitro і може бути представлений T-клітинам без процесингу антигену: Винахід також стосується композиції, яка включає множину пептидів, застосування пептиду для виготовлення лікарського засобу для пригнічення або запобігання продукуванню ТТГР аутоімунних антитіл in vivo, та застосування пептиду в лікуванні і/або профілактиці хвороби Грейвса у суб'єкта.
Description
ГАЛУЗЬ ТЕХНІКИ, ДО ЯКОЇ НАЛЕЖИТЬ ВИНАХІД
Даний винахід стосується пептидів, щонайменше частина яких одержана з рецептора гормону, що стимулює діяльність щитовидної залози (тут і далі тиреотропного гормону) (ТТГР).
Зазначені пептиди можуть бути корисні для профілактики і/або лікування хвороби Грейвса (ХГ).
ВІДОМИЙ РІВЕНЬ ТЕХНІКИ
Хвороба Грейвса характеризується гіперактивністю щитовидної залози, результатом якої є продукування надлишкової кількості тиреоїдного гормону і збільшення щитовидної залози (зоб).
Виникаючий стан гіпертиреоїдизму може стати причиною широкого кола нейрофізіологічних і фізичних симптомів. Хвороба Грейвса є найбільш загальним випадком гіпертиреоїдизму (60- 90 95 із усіх випадків) і звичайно виявляє себе в середньому віці, але також зустрічається у дітей, підлітків і осіб похилого віку. Вона уражає аж до 2 95 жіночого населення і зустрічається в п'ять-десять разів частіше у жінок, ніж у чоловіків. Педіатрична хвороба Грейвса уражає близько 6000 дітей у США і 6000 дітей у Європі. ХГ є також найбільш частою причиною важкого гіпертиреоїдизму, що супроводжується більш вираженими клінічними ознаками і симптомами і лабораторними аномаліями в порівнянні з менш важкими формами гіпертиреоїдизму.
З хворобою Грейвса пов'язаний сильний спадковий компонент. На даний час не існує популяційних досліджень відносно ХГ, однак існує декілька квазіпопуляційних досліджень гіпертиреоїдизму, і усі вони лише приблизно оцінюють частоту виникнення і переважання хвороби Грейвса. Число випадків гіпертиреоїдизму варіюється від 26:100000 до 93:100000 і повне їх переважання оцінюють як 1,3 9о, причому 42 95 випадків є клінічно вираженими і 62 95 є субклінічними.
Близько 30-50 95 людей із ХГ також будуть страждати офтальмопатією Грейвса (ОГ), екзофтальмом одного або обох очей. Множина випадків ОГ є помірними і локальними, однак у 20 95 випадків являють собою суттєве/помірне до важкого захворювання, причому щонайменше половина з них вимагає використання стероїдів, і 3-5 9о з пацієнтів з ОГ мають захворювання з больовим синдромом, що загрожує втратою зору, з дистиреоїдною оптичною невропатією (ДОН). Випинання очей може стати причиною сильної сухості рогівки, оскільки віка очей не здатні закриватися вночі. Підвищений тиск очного нерва може привести до дефектів зорового поля і до втрати зору. ОГ також може бути пов'язана з обмеженою мікседемою шкіри.
Зо Усі симптоми й ознаки ХГ віртуально виникають із прямих і непрямих ефектів гіпертиреоїдизму, причому основними виключеннями є ОГ, зоб і обмежена мікседема шкіри.
Симптоми гіпертиреоїдизму можуть включати безсоння, тремор рук, гіперактивність, випадання волосся, надлишкову пітливість, непереносимість тепла і втрату маси, незважаючи на підвищений апетит. Додатковими ознаками найчастіше є дифузно збільшена (звичайно симетрично) нечутлива щитовидна залоза, ретракція верхнього віка, надлишкова сльозоточивість, викликана офтальмопатією Грейвса, серцева аритмія і гіпертонія.
Тиреотоксичні пацієнти можуть мати поведінкові і персональні зміни, такі як психози, збудження і депресія. У випадку помірного гіпертиреоїдизму пацієнти можуть мати менш очевидні прояви, наприклад тривогу, занепокоєння, дратівливість і емоційну лабільність.
На даний час не існує способів лікування ХГ, і існуючі на даний час способи лікування, тому, спрямовані на виявлені симптоми. Існують три способи лікування ХГ: оральні антитиреоїдні лікарські засоби (АТЛЗ), радіоактивний йод (РАЙ) і видалення щитовидної залози. Два останніх підходи приводять до необхідності протягом життя додатково приймати тиреоїдні гормони. У
Сполучених Штатах найбільше часто використовують лікування радіоактивним йодом, тоді як у
Європі, Японії й у більшості інших країн застосовують у першу чергу АТЛЗ.
АТЛЗ-терапія пов'язана з деякими рідкими побічними ефектами, і відсоток пацієнтів з клінічною ремісією досягає 50-60 95.
Росте розуміння того, що метод РАЙ може викликати або ускладнити активну ОГ, і число пацієнтів, яких лікують АТЛЗ, у Сполучених Штатах зростає.
Через змінні успіхи кожного зі способів лікування, пацієнтів часто піддають більше ніж одному способу лікування, якщо не доведено, що перші спроби лікування виявилися повністю успішними. Ризик рецидиву і наступного гіпотиреоїдизму є суттєвим, і загальна ефективність доступних способів лікування ХГ далека від бажаної. Таким чином, існує необхідність в альтернативних способах лікування ХГ, які були б ефективні при лікуванні ХГ і ослабляли б або зменшували симптоми захворювання.
ОПИС КРЕСЛЕНЬ
Фіг. 1. Імуногенність КМВ-5 у ОКЗ-мишей. Мишей (М-2 самці; М-2 самки) примують КМВ-5, і через 10 днів І М-клітини (об'єднані по гендерній ознаці) і спленоцити культивують з різними концентраціями пептиду і вимірюють Т-клітинну проліферацію. Індекси стимуляції (ІС) являють собою відношення включення тимідину в стимульованій пептидом культурі до включення тимідину в нестимульованій культурі. Е - самки; М - самці; ЇМ - лімфатичні вузли.
Фіг. 2. Ідентифікація апітопів у КМВ-5. ЮАЗ-мишей імунізують КМВ-5/СЕА і створюють гібридоми. 5х107 ТТГР-специфічних гібридомних клітин культивують з 5х107 свіжими (зафарбовані прямокутники) або фіксованими (порожні прямокутники) МАМУ-клітинами і 25 мкг/мл антигену (КМВ-5 або КМВ-5 вкладені пептиди). Показано представницькі клони. Через 48 годин вимірюють продукування антигеніндукованих 1-2. Графік зображує середнє з дублікатних вимірювань, і результати представлені 3 2 незалежних експериментів. АПК - антигенпредставляючі клітини.
Фіг. 3. Ідентифікація апітопів у КМВ-5. ОН4-мишей імунізують ТТГР/СЕА і створюють гібридоми. 5х102 ТТГР-специфічних гібридомних клітин культивують з 5х107 свіжими (зафарбовані прямокутники) або фіксованими (порожні прямокутники) ВМ14-клітинами і 25 мкг/мл антигену (ТТГР, КМВ-5 або ЕМВ-5 вкладені пептиди). Зображено представницькі клони.
Через 48 годин вимірюють продукування антигеніндукованих 1-2. Графік являє собою середнє з дублікатних вимірювань. АПК - антигенпредставляючі клітини.
Фіг. 4А. Ідентифікація апітопів у КМВ-4. ЮОВ4-мишей імунізують ТТГР/СЕА їі створюють гібридоми. 5х107 ТТГР-специфічних гібридомних клітин культивують з 5х107 свіжими (зафарбовані прямокутники) або фіксованими (порожні прямокутники) ВМ14-клітинами і 25 мкг/мл антигену (ТТГР, КМВ-4 або КЕМВ-4 вкладеного пептиду). Зображено представницькі клони. Через 48 годин вимірюють продукування антигеніндукованих ІЇ-2 і представляють як значення ОО. Графік являє собою середнє з дублікатних вимірювань, і результати представляють З незалежні вимірювання. АПК - антигенпредставляючі клітини.
Фіг. 48. Ідентифікація апітопів у КМВ-4. ЮОВ4-мишей імунізують ТТГР/СЕА їі створюють гібридоми. 5х107 ТТГР-специфічних гібридомних клітин культивують з 5х107 свіжими (зафарбовані прямокутники) або фіксованими (порожні прямокутники) ВМ14-клітинами й антигеном (25 ТТГР із КМВ-4; 100 мл КМВ-4 вкладеного пептиду). Через 48 годин вимірюють продукування антигеніндукованих 1ІІ--2 і представляють як ОО-значення.
Фіг. 5. Протокол ех мімо толеризації. А) Мишам підшкірно вводять у потиличну частину шиї 100 мкг пептиду в дні -8, -6 і -4 (схема високих доз). У день 0, мишам підшкірно вводять у основу
Зо хвоста КМВ-5/СЕА. В) Мишам підшкірно вводять у потиличну частину шиї 0,1 мкг, 1 мкг і 10 мкг пептиду в дні -15, -13 і -11, з наступними трьома ін'єкціями 100 мкг пептиду в дні -8, -6 і -4 (схема збільшуваних доз). У день 0, мишам підшкірно вводять у основу хвоста ТТГР/СЕА або пептид/СЕА. В обох схемах мишей умертвляють через 10 днів після імунізації для вимірювання проліферації І М-клітин і спленоцитів після повторної стимуляції ТТ ГР.
Фіг. 6. Ех мімо толерантність, індукована ВМВ-5-апітопами. Мишей попередньо обробляють, використовуючи КМВ-5-апітопи за схемою високих доз (А-В) або за схемою збільшуваних доз (С-РЕ). Результати представляють як середнє-5ЗЕМ значення ІС для РВЗ-оброблених мишей (чорні ліні) і для оброблених пептидом мишей (червоні лінії). Графіки А, В, С, Е і ЕЕ представляють результати експериментів, здійснених на ОКЗ-мишах, графік ЮО представляє експеримент, здійснений на ОК4-мишах. Двофакторний дисперсійний аналіз АМОМА використовують для визначення ефектів повної обробки відносно Т-клітинної проліферації, і на графіках зазначені р-значення. Використовують пост-хок тестування Бонферроні, і значимі відмінності зазначені на графіках Ср«0,05; ""р«0,01; и ра«0,001). 51 - індекс стимуляції; ЇМ - лімфатичні вузли.
Фіг. 7. Індукування ех мімо толерантності з використанням КМВ-9-пептидів. БІбС-мишей попередньо обробляють згідно зі схемою збільшуваних доз, використовуючи КМВ-9В (А, С) або
ВМВ-9С (В, 0). Результати представляють як середнє-5ЕМ зі значень ІС для РВ5-оброблених мишей (чорні лінії) і оброблених пептидом мишей (червоні лінії). Двофакторний дисперсійний аналіз АМОМА використовують для визначення впливу повних ефектів обробки відносно Т- клітинної проліферації, і р-величини зазначені на графіках. Використовують пост-хок тестування
Бонферроні, і значимі відмінності зазначені на графіках (р«0,05; рек 01; и ра«0,001). 51 - індекс стимуляції; І.М - лімфатичні вузли.
Фіг. 8. Рівні ТТГР антитіл (повний ІдС), визначені за допомогою ЕГІЗА. Мишей імунізують один раз (група АВ) або двічі (група С), використовуючи 50 мкг ТТГР в ад'юванті. ОЮ-значення представлені для групи як середнє-5ЕМ.
Фіг. 9. Рівні сироватки 74 у Іаси-Аа ії Аа-ТТГР-ДЯ імунізованих мишей. Результати представлені як індивідуальні значення для мишей з різних груп до (А), через 4 тижні після (В) і через 10 тижнів після (С) першої імунізації. Зазначено число гіпертиреоїдних особин відносно повного числа для кожної групи. Мишей визнають хворими гіпертиреоїдизмом, коли у них рівні бо Т4 перевищують середнєв25О для значень Т4 у сироватці у Гас2-да імунізованих мишей.
Середні рівні Т4 суттєво не відрізняються для мишей, яким вводять ТТГР-Аа і І ас2-Аа через 4 або 10 тижнів. Однофакторний дисперсійний аналіз АМОМА, пост-хок тестування Бонферроні, р-0,05 визнають значною відмінністю.
Фіг. 10. Рівні анти-ТТГР антитіл (повний ІДС, ЕГІБА) у І ас2-АйЯ і ТТГР-АЙ імунізованих мишей. Результати представлені як індивідуальні значення для мишей з різних груп до (А), через 4 тижні після (В) і через 10 тижнів після (С) першої імунізації. Статистичний аналіз здійснюють, використовуючи однофакторний дисперсійний аналіз АМОМА і пост-хок тестування
Бонферроні. Значимі відмінності зазначені на графіках (р«0,05; "ра«к0,01).
Фіг. 11. Реакція ТТГР- і ЕМВ-5-специфічних гібридомних клонів, виділених з НІ А-ОВ83- або
НІГ А-ОН4-мишей, імунізованих ТТГР/СЕА, на ЕМВ-5О0-модифіковані пептиди. Гібридомні клони (представлені різними кольорами) культивують зі свіжими АПК і 25 мкг/мл антигену протягом 48 годин до визначення продукування 1-2. Заміна амінокислот у центральних ділянках КМВ-50-
СКК або ЕМВ-50-ККК хамперами розпізнавання гібридомними клонами свідчить про те, що зазначені амінокислоти є важливими в епітопній ділянці.
Фіг. 12. Реакція ТТГР- і ЕМВ-5-специфічних гібридомних клонів, виділених з НГ А-ОВ83- або
НІГ А-ОН4-мишей, імунізованих ТТГР/СЕА, на ЕМВ-5О0-модифіковані пептиди. Гібридомні клони (представлені різними кольорами) культивують зі свіжими (зафарбовані прямокутники) або фіксованими (порожні прямокутники) АПК і 25 мкг/мл антигену протягом 48 годин до визначення продукування 1-2.
Фіг. 13. Реакція ТТГР- і ЕМВ-5-специфічних гібридомних клонів, виділених з НГ А-ОВ83- або
НІГ А-ОН4-мишей, імунізованих ТТГР/СЕА, на ЕМВ-5О0-модифіковані пептиди. Гібридомні клони (представлені різними кольорами) культивують зі свіжими АПК і 25 мкг/мл антигену протягом 48 годин до визначення продукування ІІ--2.
Фіг. 14. Реакція ТТГР- і ЕМВ-5-специфічних гібридомних клонів, виділених з НГ А-ОВ83- або
НІГ А-ОН4-мишей, імунізованих ТТГР/СЕА, на ЕМВ-5О0-модифіковані пептиди. Гібридомні клони (представлені різними кольорами) культивують з фіксованими АПК ії 25 мкг/мл антигену протягом 48 годин до визначення продукування 1/--2.
Фіг. 15. Реакція ТТГР- і ЕМВ-5-специфічних гібридомних клонів, виділених з НГ А-ОВ83- або
НІГ А-ОН4-мишей, імунізованих ТТГР/СЕА, на ЕМВ-5О0-модифіковані пептиди. Гібридомні клони
Зо (представлені різними кольорами) культивують зі свіжими і фіксованими АПК ї 25 мкг/мл антигену протягом 48 годин до визначення продукування 1-2.
Фіг. 16. Ех мімо індукування толерантності з використанням ЕМВ4АК-ОКК у ОК4-мишей згідно зі схемою збільшення дози. Двофакторний дисперсійний аналіз АМОМА використовують для визначення впливу повних ефектів обробки на Т-клітинну проліферацію, і р-значення представлені на графіках. Використовують пост-хок тестування Бонферроні, і значимі відмінності зазначені на графіках (р«0,05; "р«е0,01; ира«0,001) Результати являють собою середнєє5ЕМ для РВЗ-оброблених (чорні лінії) і оброблених пептидом мишей (червоні лінії). І - індекс стимуляції; ІМ - лімфатичні вузли.
Фіг. 17. Ідентифікація КМВ12-ділянки по реактивності Т-клітинної лінії, одержаної від пацієнтів із хворобою Грейвса. Т-клітинну лінію створюють шляхом стимуляції виділених МКПК (РВМСОСз-мононуклеарних клітин периферичної крові) від пацієнта з хворобою Грейвса з використанням КМВ12 протягом 12 днів. Після додаткового циклу повторного стимулювання в 12 днів, КМВ12-специфічні Т-клітини тестують відносно розпізнавання індивідуальних вкладених пептидів у КМВ12 ділянці. 5І - індекс стимуляції.
Фіг. 18. Ідентифікація апітопів у КМВ12-ділянці з використанням КМВ12-специфічних ТС, одержаних від здорового донора. КМВ12-специфічні Т-клітини культивують з ВМ14, людською клітинною лінією, експресуючою людські молекули МНС класу І у присутності пептиду.
Зафарбовані прямокутники являють собою стимуляцію в присутності свіжих, але опромінених
ВМІ14-клітин, і порожні прямокутники - у присутності фіксованих АПК (див. розділ матеріали і методи). Перед додаванням до культур ЗН-тимідину, надосадову культуральну рідину збирають і заморожують. Надосадову рідину аналізують на присутність ІЕМ-гамма (А) для підтвердження проліферативної реакції (В) Т-клітин. ТСІ -Т-клітинна лінія; АПК - антигенпредставляючі клітини;
МНС клас ІІ - головний комплекс гістосумісності класу ІЇ; 5І - індекс стимуляції; ОО - оптична густина.
Фіг. 19. Приклади ех мімо толерантності, індукованої КМВ5О-модифікованими пептидами у
ОАЗ-мишей згідно зі схемою збільшуваних доз. Двофакторний дисперсійний аналіз АМОМА використовують для вимірювання впливу повних ефектів обробки на Т-клітинну проліферацію, і р-значення зазначені на графіках ("р«0,05; "р«б001; и р«0001; и хра«0,0001). Результати представляють середнє-5ЕМ для РВ5 оброблених (чорні лінії) і пептидом оброблених мишей бо (червоні лінії). 5І - індекс стимуляції. А: ВМВ5О-КІ1; В: ВМВ5О-КЗ; С: ВМВ5О-К16.
Фіг. 20. Графік, що ілюструє статуси апітопів КЕМВ-50-модифікованих пептидів. Приклад реакції ТТГР- ії КМВ-5-специфічних гібридомних клонів, виділених з НІГ А-ОВЗ3- і НГ А-ОВ4-мишей, імунізованих ТТГР/СЕРА, на ЕМВ-50-модифіковані пептиди. Гібридомні клони культивують зі свіжими (зафарбовані прямокутники) і фіксованими (порожні прямокутники) АПК їі 25 мкг/мл антигену протягом 48 годин до визначення продукування ЇЇ -2.
УЗАГАЛЬНЕННЯ АСПЕКТІВ ДАНОГО ВИНАХОДУ
Автори даного винаходу ідентифікували ряд пептидів, одержаних із ТТГР, що є ефективними для профілактики і/або лікування ХГ.
У першому аспекті в даному винаході запропонований пептид, який здатний до зв'язування з молекулами МНС іп міїго і може бути представлений Т-клітинам без процесингу антигену і який включає всі або частину з наступних пептидів рецепторів тиреотропного гормону (ТТГР):
ВМВ 5: І5ВІМУБІОМТІ ОСІ ЕЗНЗЕУМІ ЗКУТНІ (ЗЕО І МО: 1),
ВМВ 4: АТІРЗНАЕЗМІ РМІЗВІМУМ5ІОЮОМТІ ОЇ. (5ЕО ІЮ МО: 2),
ВМВ 9: ТаїЇ КМЕРОСТКУМЗТОІЕРІГЕІТОМРУМ (5ЕО ІО МО: 3), вМВ 12: 1 ТІК УММагтМОсмМАРМаИаткІ вАММІ (ЗЕО І МО: 64).
Зазначений пептид можна вибрати з наступних ТІ ГР-пептидів і їх похідних: вМмв 50-акк: ККаімУБІЮМТІ ФО ЕЗНОИКК (5ЕО І МО: 12), вМВ 50-ККК: КККІМУБІЮОМТІ СОЇ ЕЗНККК (ЗЕО ІО МО: 21),
АМВ 5Б-аКК: ККамМУ5ІОМТІ ОО ЕЗНЗОКК (5ЕО ІЮ МО: 13),
ВАМВ 5А: ІЗВІМУБІЮОМТІ СО (ЗЕО ІО МО: 6), вАМВ 58: БВІММ5ІОМТІ ОО Е (ЗЕО І МО: 7),
АМВ 5С: ВІММБІОМТ ОО Е5 (ЗЕО ІО МО: 8), вАМВ 50: ІММБІОМТІ ОО ЕЗН (ЗЕО І МО: 9),
ВАМВ 5Е: УМБІОМТІ ОО ЕЗН5 (ЗЕО І МО: 10),
ВАМВ 5Е: МБІОМТІ ОО ЕЗН5Е (ЗЕО І МО: 11), вАМВ 5БР-аКК: ККамМ5ІОМТІ ОО ЕЗНЗЕОКК (ЗЕО І МО: 14), вМв 4уУ-акк: кКазмі РМІЗВІМУ5БІЮМИКК (ЗЕО ІО МО: 16),
ВМВ 4: МІ РМІБАІМУБІОЮМ (ЗЕО ІЮ МО: 15),
ВМВ 4К: МІ РМІЗАІМУБІЮМТ (ЗЕО І МО: 62),
Зо вм 4К-акк: ККОаМІ РМІЗВІМУБІЮУТОаКК (5ЕО ІО МО: 63),
ВМВ 9А: Та КМЕРОЇІТКУУ5Т (5ЕО ІЮ МО: 17), вВМВ 98: ДІ КМЕРОЇТКМУ5ТО (5ЕО ІЮ МО: 18), вАМВ 9С: І КМЕРОЇТКМУ5ЗТОІ (5ЕО ІО МО: 19), вАМВ 90: КМЕРОІТКМУУ5ЗТОІЕ (ЗЕО ІО МО: 20), вВМВ 12А:ІТІ КІ МММаЕТМОс (ЗЕО ІЮ МО: 65), вМв 128: ТІ Кі МММчагтМОам (5ЕО І МО: 66), вМВ 128-ККК: КККТІ КІ УММа ЕТ ЗМОСУККК (5ЕО І МО: 67).
Пептид може включати ЕМВ5БА, 58, 5С, 50, 5Е, 5Е, 4), АК, 9А, 98, 9С, 90, 12А або 28 послідовності або їх варіанти, у яких одна або більше з амінокислот були замінені іншою амінокислотою, такою як К, що була модифікована по одному або по обох кінцях, наприклад, шляхом введення "СКК" або "ККК" послідовностей.
Пептид може включати КМВ-5О0 послідовність або її варіант, у якій одна або більше з амінокислот були замінені іншою амінокислотою, такою як К, що була модифікована по одному або по обох кінцях, наприклад, шляхом введення "СКК" або "ККК" послідовностей.
У даному винаході також запропонований пептид, що включає послідовність:
КК-(сук)-ааІ--АМВ-5О0-пептид)-ааг-ааЗз-27-(С/К)-КК, де аа! не є амінокислотою, І, К або Т;
ВМВ-5О-пептид являє собою УМ5ІЮОМТІ ОО Е, або його варіант, у якому одна або більше з амінокислот була замінена К,
БО аа2 не є амінокислотою, 5 або К; ааз не є амінокислотою, Н або К, який здатний до зв'язування з молекулою МНС іп міїго і може бути представлений Т-клітинам без процесингу антигену.
У зазначеному варіанті ЕМВ-5О0-пептид може бути УМ5ЗІЮОМТІ ОО Е, або його варіантом, у якому одна, дві або три амінокислоти замінені на К.
Пептид можна вибрати з наступної групи, у якій усі члени ідентифіковані як апітопи (Таблиця 1):
ККИаіМУІОМТІ ОСІ ЕЗНОКК (5ЕО ІЮ МО: 12), ККаКМУ5ІОМТІ ОО ЕЗНОКК (5ЕО І МО: 22), ККОІКУБІОМТІ ОО ЕЗБНОКК (5ЕО ІЮ МО: 23), ККСОІМК5БІОМТІ ОО ЕЗБНОКК (ЗЕО ІЮО МО: 60 24), ККОІМУ5ІСУКІ ОО ЕЗНОИКК (5ЕО ІЮ МО: 25), ККОІМУМБІОМТІ ОК ЕЗНОаКК(ЗЕО І МО: 26),
ККаіїМуУІОМТ ООКЕЗНОКК (5ЕО ІЮ МО: 27), ККОІМУБІОЮОМТІ ОСІ К5НОКК (5ЕО ІО МО: 28),
ККаіМУБІОМТІ ОСІ ЕКНОКК (ЗЕО ІЮ МО: 29), ККОІМУ5БІОМТІ ОСІ ЕЗКОКК (5ЕО І МО: 30),
ККамУБІОМТ ОСІ ЕСКК (5ЕБО 10 МО: 31), ККОаМУБІОУКІ ОСІ БСКК (5ЕБО 10 МО: 32),
ККамУБІОМТ ОКІ ЕСКК (5ЕБЕО 10 МО: 33) ККОаУМ5ІОМТ ООКЕСКК (5ЕБО ІО МО: 34),
ККаТмУБІЮОУКІ ОККЕСКК (5ЕБЕО ІО МО: 35), ККОІМУБІОМТ ОСІ БЕОКК (БО 10 МО: 36),
ККОІМУБІОМКІ ОСІ БЕСКК (5ЕБЕО 10 МО: 37), ККОІМУ5БІОМТ ОКІБЕСКК (5ЕБО 10 МО: 38),
ККОаІМУБІОМТІ ООКЕСКК (5ЕБЕО І МО: 39), ККОІМУБІОУК ОККЕСКК (5ЕБО 10 МО: 40),
ККатуУвІОМТ ОСІ ЕСКК (5ЕБО І МО: 41), ККаТУУБІОУКІ ОС ЕСКК (5ЕБО 10 МО: 42),
ККатуУвІОМТ ОК ЕСКК (5ЕБО ІО МО: 43), ККатТУУБІОМТ ООКЕСКК (5ЕБО ІО МО: 44),
ККаТатуувІСУКГ ОККЕСКК (5ЕО І МО: 45), КККІММ5БІОМТІ ОСІ ЕЗНККК (5ЕО ІО МО: 21),
ККККУМБІОМТІ ОСІ ЕЗНККК (ЗЕО 10 МО: 46), КККІКУ5БІОМТІ ОСІ ЕЗНККК (5ЕО І МО: 47),
КККІУКБІОМТІ ОО ЕЗНККК (ЗЕО ІЮ МО: 48), КККІМУКІОМТІ ОСІ ЕЗНККК (5ЕО ІО МО: 49),
КККІУМ5БІОУКІ ОСІ ЕЗНККК (5ЕО ІО МО: 50), КККІМУБІЮМТІ КО ЕЗНККК (ЗЕО ІО МО: 51),
КККІММБІОМТ ОК ЕЗНККК (5ЕО ІО МО: 52), КККІМУБІОМТ ООКЕЗНККК (5ЕО ІО МО: 53),
КККІУМБІОМТ ОСІ КЗНККК (ЗЕО ІЮО МО: 54), КККІМУБІЮОМТІ ОСІ ЕКНККК (5ЕО ІО МО: 55),
КККІУМБІОМТ ОСІ ЕЗКККК (5ЕБЕО ІО МО: 56), КККМУБІОМТ ОСІ ЕККК (5ЕБЕО І МО: 57),
КККУМБІОУКІ ОСІ ЕККК (5ЕБЕО 10 МО: 58), КККМУБІОМТ ОК ЕККК (БО 10 МО: 59),
КККУМУБІОМТІ ООКЕККК (5ЕО І МО: 60), КККУУБІЮОУКІ ОККЕККК (5ЕО ІО МО: 61).
Пептид можна вибрати з наступної групи, у якій усі члени ідентифіковані як апітопи і мають підвищену розчинність:
ККаТкмУмМ5БІОМТ ОО ЕЗНОКК (ЗЕО І МО: 22), ККОІМКБІОМТІ ОСІ ЕЗНОКК (ЗЕО І МО: 24), ККаМУБІЮОМТ ОСІ ЕСКК (5ЕО ІО МО: 31), ККОУУМ5ІОУКГ ОО ЕСКК (5ЕБО ІО МО: 32),
ККамУБІОМТ ОКІ ЕСКК (5ЕБЕО 10 МО: 33) ККОаУМ5ІОМТ ООКЕСКК (5ЕБО ІО МО: 34),
ККамУБІОУКІ ОККЕСКК (5ЕБО 10 МО: 35), ККОІМУ5БІОУК ОККЕОКК (5ЕБО ІО МО: 40),
ККаТатуУвІСУК ОО! ЕСКК (5ЕО 10 МО: 42), ККаТУМ5ІОУКГОККЕОКК (5ЕБО ІО МО: 45),
ККККУМБІОМТІ ОСІ ЕЗНККК (ЗЕО 10 МО: 46), КККІУК5ІОМТІ ОСІ ЕЗНККК (5ЕО І МО: 48),
КККІУУКІОМТ ОСІ ЕЗНККК (5ЕО 10 МО: 49), КККУУБІОМТ ОСІ ЕККК (ЗЕБО ІО МО: 57),
КККУМБІОУКІ ОСІ ЕККК (5ЕБО 10 МО: 58), КККУМ5ІОМТ ООКЕККК (5ЕБО 10 МО: 60),
КККУМБІБСУКІ ОККЕККК (5ЕО ІО МО: 61).
Зо Пептид можна вибрати з наступної групи, у якій усі члени ідентифіковані як апітопи і мають найкращу розчинність:
ККИїМКОІЮМТІ ОСІ ЕЗНОКК (5ЕО І МО: 24), ККОМУБІОМКІ ОСІ ЄСКК (5ЕО ІО МО: 32),
ККамУБІОМТ ОКІ ЕСКК (5ЕБЕО 10 МО: 33) ККОаУМ5ІОМТ ООКЕСКК (5ЕБО ІО МО: 34),
ККамУБІЮОУКІ ОККЕСКК (5ЕБО ІО МО: 35), ККатТМУ5БІОУКГ ОО БЕОКК (5ЕБО 10 МО: 42),
ККатумувІСУКІГ ОККЕСКК (5ЕБО ІО МО: 45), ККККУУ5БІОМТІ ОСІ ЕЗНККК (5ЕБО ІО МО: 46),
КККІУКБІОМТ ОСІ ЕЗНККК (5ЕО 10 МО: 48), КККУУБІОМТ ОСІ ЕККК (ЗЕБО ІО МО: 57),
КККУМ5ІОМТІ ООКЕККК (5ЕО І МО: 60).
Наступні пептиди становлять особливий інтерес:
ККамУБІОМТ ОКІ ЕСКК (5ЕБО ІО МО: 32), ККаМУБІОУМКІ ОККЕСКК (ЗЕБО 10 МО: 34),
ККККУМБІОМТІ ОСІ ЕЗНККК (ЗЕО 10 МО: 46), КККІУК5ІОМТІ ОСІ ЕЗНККК (5ЕО І МО: 48),
КККУМ5ІОМТІ ОО ЕККК (ЗЕО ІЮ МО: 57), КККУУМБІОЮОМТІ ООКЕККК (ЗЕО І МО: 60).
В другому аспекті в даному винаході запропонована композиція, яка включає множину пептидів, включаючи один або більше з пептидів відповідно до першого аспекту даного винаходу.
У третьому аспекті в даному винаході запропонований пептид відповідно до першого аспекту даного винаходу або композиція відповідно до другого аспекту даного винаходу для застосування в пригніченні або запобіганні продукуванню ТТГР аутоімунних антитіл іп мімо.
У четвертому аспекті в даному винаході запропонований пептид відповідно до першого аспекту даного винаходу або композиція відповідно до другого аспекту даного винаходу для застосування в лікуванні і/або профілактиці хвороби Грейвса у суб'єкта.
У п'ятому аспекті в даному винаході запропоноване застосування пептиду відповідно до першого аспекту даного винаходу або композиції відповідно до другого аспекту даного винаходу для виготовлення лікарських засобів для пригнічення або запобігання продукуванню ТТГР аутоїмунних антитіл іп мімо.
У шостому аспекті в даному винаході запропоноване застосування пептиду відповідно до першого аспекту даного винаходу або композиції відповідно до другого аспекту даного винаходу для виготовлення лікарського засобу для лікування і/або профілактики хвороби Грейвса.
У сьомому аспекті в даному винаході запропонований спосіб пригнічення або запобігання продукуванню ТТГР аутоімунних антитіл у суб'єкта, який включає стадію введення зазначеному суб'єкту пептиду відповідно до першого аспекту даного винаходу або композиції відповідно до другого аспекту даного винаходу.
У восьмому аспекті в даному винаході запропонований спосіб лікування хвороби Грейвса у суб'єкта, який включає стадію введення зазначеному суб'єкту пептиду відповідно до першого аспекту даного винаходу або композиції відповідно до другого аспекту даного винаходу.
Суб'єктом може бути НІГ А-ОКЗ або НІ А-ОВА.
ДОКЛАДНИЙ ОПИС ПЕРЕВАЖНОГО ВАРІАНТА ВИНАХОДУ
ПЕПТИДИ
У першому аспекті даний винахід стосується пептидів.
Термін "пептид" використовують у звичайному розумінні для позначення ряду залишків, звичайно І -амінокислот, з'єднаних один з одним звичайно пептидними зв'язками між а-аміно- і карбоксильними групами сусідніх амінокислот. Термін включає модифіковані пептиди і синтетичні пептидні аналоги.
Пептиди даного винаходу можна одержати, використовуючи хімічні методи (Рерііде
Спетівігу, А ргасіїса! ТехіроокК. Мікоз ВодапеКу, бргіпдег-Мепад, Вегійп). Наприклад, пептиди можна синтезувати, використовуючи твердофазні методики (Кобегде .).У. еї аї. (1995), Зсієпсе, 269: 202-204) віддеплюючи від смоли й очищаючи за допомогою препаративної високоефективної рідинної хроматографії (е.9д., Стеідйіоп (1983), Ргоївіп5 ігисійге5 апа
МоїІесшіаг Ргіпсіріе5, Н Егеетап апа Со, Мем МоїкК МУ). Автоматизований синтез можна здійснити, наприклад, використовуючи пептидний синтезатор АВІ 431 рерііде Зупіпезі2ег (Регкіп
ЕІтег) відповідно до інструкцій виготовлювача.
Альтернативно, пептид можна одержати, використовуючи рекомбінантні методики або шляхом розщеплення більш довгих поліпептидів. Наприклад, пептид можна одержати, розщеплюючи білок рецептора тиреотропіну, після чого можна модифікувати один або обидва його кінці. Склад пептиду можна підтвердити, використовуючи амінокислотний аналіз або секвенування (наприклад, процедуру розщеплення по Едману).
Для практичних цілей існують різні інші характеристики, які може демонструвати пептид.
Наприклад, для того, щоб пептид був терапевтично корисний, важливо, щоб він був достатньо стабільний іп мімо. Термін напівжиття пептиду іп мімо може бути щонайменше 10 хвилин, 30 хвилин, 4 години або 24 години.
Пептид може також демонструвати високу біодоступність іп мімо. Пептид може зберігати конформацію іп мімо, що забезпечує його зв'язування з молекулами МНС на клітинній поверхні без відповідних ускладнень.
АПІТОПИ
При адаптивній імунній реакції Т-лімфоцити здатні розпізнавати внутрішні епітопи білкового антигену. Антигенпредставляючі клітини (АПК) захоплюють білкові антигени і розщеплюють їх на короткі пептидні фрагменти. Пептид може зв'язуватися з молекулами головного комплексу гістосумісності (МНС) класу І або ІЇ усередині клітини і може бути перенесений на клітинну поверхню. Якщо антиген представлений на клітинній поверхні в зв'язку з молекулою МНС, такий пептид може бути розпізнаний Т-клітиною (через Т-клітинний рецептор (ТСЕ)), і в такому випадку зазначений пептид є Т-клітинним епітопом.
Таким чином, епітоп являє собою пептид, одержаний з антигену, що здатний до зв'язування з пептидзв'язувальною борозенкою молекули МНС класу І або ІІ ї розпізнається Т-клітиною.
Мінімальний епітоп являє собою найбільш короткий фрагмент, одержуваний з епітопа, що здатний до зв'язування з пептидзв'язувальною борозенкою молекули МНС класу І або І! і розпізнається Т-клітиною. Для конкретної імуногенної ділянки звичайно можливо створити "вкладений набір" пептидів, що перекриваються, які діють як епітопи, причому усі вони містять мінімальний епітоп, але відрізняються своїми фланкуючими ділянками.
Таким же способом можна ідентифікувати мінімальний епітоп для конкретної комбінації
МНС молекула: Т-клітина, вимірюючи реакцію на усічені пептиди. Наприклад, якщо виникає реакція на пептид, який включає залишки 1-15 у бібліотеці, що перекривається, набори, що усічені з обох кінців (тобто 1-14, 1-13, 1-12іт. д. і 2-15, 3-15, 4-15 і т. д.), можна використовувати для ідентифікації мінімального епітопа.
Автори даного винаходу раніше визначили, що існує зв'язок між здатністю пептиду до зв'язування з молекулами МНС класу І або ІІ і представлення Т-клітинам без додаткового процесингу і здатністю пептидів індукувати толерантність іп мімо (УМО 02/16410). Якщо пептид занадто довгий, щоб зв'язуватися з борозенкою пептидного зв'язування молекул МНС без додаткового процесингу (наприклад, тримінгу) або зв'язується в невідповідній конформації, тоді він не є толерогенним іп мімо. Якщо, з іншого боку, пептид має придатний розмір і конформацію бо для безпосереднього зв'язування з борозенкою зв'язування МНС пептиду і представлення Т-
клітинам, тоді можна передбачати, що такий пептид може бути корисний для індукування толерантності.
Таким чином, можна досліджувати толерогенну здатність пептиду, досліджуючи можливість його зв'язування з молекулами МНС класу І або ІІ і можливість його представлення Т-клітинам без додаткового процесингу антигену іп міїго.
Пептиди даного винаходу являють собою апітопи (епітопи, незалежні від процесингу антигену) у тому, що вони здатні до зв'язування з молекулами МНС і здатні стимулювати реакції
ТТГР-специфічних Т-клітин без додаткового процесингу антигену. Можна передбачати, що такі апітопи викликають толерантність до ТТГР, якщо додержуватися правил способу, розкритого в
МО 02/16410.
Пептид даного винаходу може бути будь-якої довжини, якщо здатний до зв'язування з молекулою МНС класу І або ІЇ без додаткового процесингу. Звичайно пептид даного винаходу здатний до зв'язування з МНС класу ІІ.
Пептиди, які зв'язуються з молекулами МНС класу І, звичайно бувають довжиною від 7 до 13, частіше від 8 до 10 амінокислот. Зв'язування пептиду стабілізується по двох його кінцях шляхом контактування між атомами основного ланцюга пептиду й інваріантними сайтами в пептидзв'язувальних борозенках усіх молекул МНС класу І. Існують інваріантні сайти з обох кінців борозенки, що зв'язують аміно- і карбоксикінці пептиду. Варіації довжини пептиду пристосовуються за рахунок згинання кістякового ланцюга пептиду, часто по пролінових або гліцинових залишках, що забезпечують гнучкість.
Пептиди, які зв'язуються з молекулами МНС класу ІІ, звичайно бувають довжиною від 8 до 20 амінокислот, частіше від 10 до 17 амінокислот і можуть бути довше (наприклад, аж до 40 амінокислот). Такі пептиди розташовані у витягнутій конформації уздовж борозенок зв'язування пептидів МНС класу Ії, які (на відміну від борозенок зв'язування пептидів МНС класу І) відкриті з обох кінців. Пептиди зберігаються на місці головним чином за рахунок контактів атомів основного ланцюга з консервативними залишками, що вистилають борозенки зв'язування пептидів.
Пептиди даного винаходу можуть включати від 8 до 30 амінокислот, наприклад від 8 до 25 амінокислот, від 8 до 20 амінокислот, від 8 до 5 амінокислот або від 8 до 12 амінокислот.
Коо) ЧАСТИНА
Пептиди даного винаходу можуть включати всі або частину ТТГР-одержаних пептидів, представлених як послідовності 5ЕО ІЮ МО: 1-3.
Термін "частина" стосується пептиду, який одержаний з 5БО ІЮ МО: 1-3 їі містить щонайменше мінімальний епітоп пептиду.
Такий пептид може включати одну або більше з мутацій, звичайно амінокислотних заміщень усередині ТТГР-одержаної послідовності. Така амінокислота може заміщати такі амінокислоти як гліцин, лізин або глутамова кислота. Пептид може включати аж до трьох, аж до двох або одне амінокислотне заміщення з ТТГР-одержаної послідовності.
Такий пептид може включати по одному або по обох кінцях амінокислоти, що не одержують із ТТГР послідовності. Наприклад, пептид може мати один або більше із залишків гліцину і/або лізину, і/або глутамової кислоти по одному або по обох кінцях. Наприклад, додаткові амінокислоти можуть включати гліциновий або лізиновий спейсер, після якого ідуть пари амінокислот КК, КЕ, ЕК або ЕЕ по одному або по обох кінцях.
Наприклад, такий пептид може мати наступну формулу:
ККа-ТТГР-одержана частина-СКК.
Пептид, що включає не-ТТГР-одержані амінокислоти, повинен бути апітопом, тобто повинен бути здатний до зв'язування з молекулою МНС іп міїго і здатний бути представленим Т-клітині без процесингу антигену.
РЕЦЕПТОР ТИРЕОТРОПНОГО ГОРМОНУ (ТТГР)
ХГ являє собою аутоїмунне захворювання, викликане аутореактивними Т- і В-лімфоцитами, спрямованими в основному на аутоантиген, рецептор тиреотропного гормону (ТТГР).
ТТГР являє собою с-білок, зв'язаний з рецептором фолікулярних клітин щитовидної залози, що стимулює продукування тироксину (Т4) і трийодотироніну (Т3) за рахунок САМР сигнального каскаду після зв'язування його ліганду, тиреоїдстимулюючого гормону (Т5Н). Після інтерналізації, розщеплення і презентації ТТГР за рахунок АПК, Т-клітини стають активованими і взаємодіють з аутореактивними В-клітинами, що у свою чергу викликає стимуляцію агоністичних аутоїмунних антитіл, спрямованих проти ТТГР. Тиреоїдстимулюючі імуноглобуліни зв'язуються з тими ж самими рецепторними карманами, що і ТЗН, активуючи опосередкований ТТГР сигнал трансдукції і приводячи до продукування надлишку тиреоїдного гормону щитовидною залозою і бо до росту щитовидної залози.
ТТГР, також відомий як рецептор тиреотропіну, експресується, головним чином, на епітеліальних клітинах щитовидної залози.
ТТГР холорецептор містить 764 залишків і включає М-кінцевий позаклітинних домен, з яким зв'язуються ТЗН, серпентин (або трансмембранний домен) і С-кінцевий внутрішньоклітинний домен.
ТТГР включає великий позаклітинний домен (418 амінокислот) з висококонсервативними
Сувз-залишками, що полегшує утворення третинної структури позаклітинного домену, що може бути важливим як для зв'язування ліганду, так і для неактивної конформації рецептора. Такий позаклітинний домен включає більше половини довжини білка і є достатнім для зв'язування ліганду з високою афінністю. Після перенесення на поверхню клітини рецепторна молекула піддається внутрішньомолекулярному розщепленню, що приводить до видалення послідовності, яка містить 50 амінокислот, розташованої між залишками 316 і 366. В результаті зазначений рецептор включає дві субодиниці, причому субодиниця « включає позаклітинний лігандзв'язувальний домен і субодиниця ВД включає трансмембранний домен і коротку С-кінцеву послідовність, зв'язані разом дисульфідними зв'язками. На наступних стадіях субодиницю а видаляють, що приводить до надлишку лігандзв'язувального домену, позбавленого субодиниць
В, на клітинній мембрані.
Після зв'язування циркулюючого ТЗН із ТТГР, сигнальний каскад (С-білка активує аденілілциклазу, і внутрішньоклітинні рівні САМР підвищуються. САМР активує усі функціональні аспекти тиреоїдної клітини, включаючи накачування йоду, синтез тиреоглобуліну, йодування, ендоцитоз і протеоліз, активність тиреоїдної пероксидази і виділення гормону.
Амінокислотна послідовність зрілого ТТГР представлена нижче (ЗЕО ІЮ МО: 21). 1 тградіїдім Шаїргад дтдс55ррсе спдевеатии сКаїдгірвзі рроднкії 61 ешпіпірвн аїзпірпівг іумзідміа діезпетуп! 5Кміпівіт їпПуїара 121 аїкеїріїк? днптдіКт транкмуві айіена прутівірмип агддіспеї! 181 ЧКІуппдії зухддуаттді КідамуїпКп КуїмакКаа гддмузорзі Ідиздіб5міа 241 Ірзкаїенік еіїатімі! ККІрівІбтІ пигадієур 5пссаїкпак Кігайевіт 301 спезб5табвіг ди"к5упаіпз ріпдеуєепі дазімдукек зкідатптпа пуууПееде 361 авеідгодде! Кпрдеейда їазнуауїйс дазедтусір Кзаєїпрсед ітдукПкім
Зо 421 умм5Наі!! дпмімінІ їпуКкІпмрг Ятспіагад їстдту!Пі азмаукгзе 481 уупнаіджаї драспіадії мМазеївму ШУШепм уайаттиа /Кійтаса 541 ітуддмиссі Паїїрімаі ззуакКмвіс! ртагтеїріа! ауїмімНп імаїмімссс 601 ууКіуймит раупрдакаї КіаКптамії патістарі втуаїзайп Кріймбп5кК 661 Шмітуріп зсапріуаї ЯКаїдкамі пеКІдіскК гдадаугдаг хррКпзідід 721 макмпатга діпптедмуеє ІПепзпПрк кдоддізевут дімі.
Пептид даного винаходу щонайменше частково одержують із ТТГР. Зазначений пептид або його частину можна одержати з ділянок 64-92, 78-106, 107-135, 136-164 або 201-229 ТТГР.
Зазначений пептид або його частину можна одержати з фрагмента антигену, що утворюється в результаті природного процесингу антигену антигенпредставляючими клітинами.
Ділянка 64-92 ТТГР (КМВ 4) має наступну послідовність:
ІГАТАЗНАЕЗМІ РМІБВІМУБІЮМТІ СО. (5ЕО ІЮ МО: 2).
Пептид може включати мінімальний епітоп з наступного пептиду:
ТТГР 73-87 (ВМВ 4): БМІ РМІЗВІММ5ІЮМ (ЗЕО ІЮ МО: 15),
ТТГР 73-87 (ВМВ 4уУ-2КК): ККаЗМІ РМІЗВІМУБІЮМОИКК (ЗЕО ІО МО: 16).
Пептид може включати мінімальний епітоп з наступного пептиду:
ТТГР 74-88 (ВМВ 4К): МІ РМІБВІМУМ5ІОЮМТ (5ЕО ІО МО: 62),
ТТГР 74-88 (ВМВ 4К-аКкК): ККОМІ РМІЗВІМУБІЮМТИКК (5ЕО І МО: 63).
Ділянка 78-106 ТТГР (КМВ 5) має наступну послідовність:
ІЗВІММ5БІОМТІ ОО ЕЗНЗЕМУМІ ЗКУТНІ (ЗЕО ІЮ МО: 1).
Пептид може включати мінімальний епітоп з наступних пептидів: ТТГР 78-92 (АМВ 5А), 79- 93 (ВМВ 58), 80-94 (АВМВ 5С), 81-95 (АМВ 50), 82-96 (АМВ 5Е) і 83-97 (АМВ 5Б).
Послідовності ТТГР 78-92, 79-93, 80-94, 81-95, 82-96 і 83-97 є наступними:
ТТГР 78-92 (ВМВ 5А): ІЗВІМУ5ІЮОМТІ ОО (5ЕО ІЮ МО: 6),
ТТГР 79-93 (ВМВ 58): 5ВІМУБІЮОМТІ ОО Е (5ЕО ІО МО: 7),
ТТГР 80-94 (ВМВ 50): ВІМУБІЮМТІ ОО Е5 (ЗЕО ІО МО: 8),
ТТГР 81-95 (ВМВ 50): ІМУБІЮОМТІ СО ЕЗН (ЗЕО І МО: 9),
ТТГР 82-96 (ВМВ 5Е): УМ5ІОМТІ ОО ЕЗН5 (ЗЕО І МО: 10),
ТТГР 83-97 (ВМВ 5Е): М5ІОМТІ ОО ЕЗН5ЗЕ (5ЕО ІЮ МО: 11),
ТТГР 81-95 (ВМВ 50-СКК): ККОИЇМУМ5ІОМТІ ОО ЕЗНОИКК (ЗЕО І МО: 12), (510) ТТГР 81-95 (ВМВ. 50-ККК):КККІММ5ІОМТІ ОО ЕЗНККК(ЗЕО ІЮ МО: 21),
ТТГР 82-96 (ВМВ 5Е-ЯКК): ККаМУБІЮОМТІ ОЇ ЕЗНЗОКК (5ЕО ІО МО: 13),
ТТГР 83-97 (ВМВ 5Б-СКК): ККОМ5ІОМТІ ОСІ ЕЗНЗЕОКК (ЗЕО І МО: 14).
Пептид даного винаходу щонайменше частково одержують із ТТГР. Зазначений пептид або його частину можна одержати з ділянок 64-92, 78-106, 107-135, 136-164 або 201-229 ТТГР.
Зазначений пептид або його частину можна одержати з фрагмента антигену, що утворюється в результаті природного процесингу антигену антигенпредставляючими клітинами.
Ділянка 64-92 ТТГР (КМВ 4) має наступну послідовність:
ІГАТЯЗНАЕЗМІ РМІБВІММБІЮМТІ ОО. (ЗЕО ІЮ МО: 2).
Пептид може включати мінімальний епітоп з наступного пептиду:
ТТГР 73-87 (ВМВ 4): БМІ РМІЗВІММ5ІЮМ (5ЕО ІО МО: 15),
ТТГР 73-87 (ВМВ 42-СКК): ККаОЗМІ РМІЗВІМУБІЮМОИКК (ЗЕО ІО МО: 16).
Пептид може включати мінімальний епітоп з наступного пептиду:
ТТГР 74-88 (ВМВ 4К): МІ РМІБВІМУМ5ІОЮМТ (5ЕО ІО МО: 62),
ТТГР 74-88 (ВМВ 4К-ОаКкК): ККОМІ РМІЗВІМУБІЮБУТИКК (5ЕО І МО: 63).
Ділянка 78-106 ТТГР (КМВ. 5) має наступну послідовність:
ІЗВІММБІОМТІ ОО ЕЗНЗЕМУМІ ЗКУТНІ (5ЕО ІЮ МО: 1).
Пептид може включати мінімальний епітоп з наступних пептидів: ТТГР 78-92 (АМВ 5А), 79- 93 (ВМВ 58), 80-94 (АВМВ 5С), 81-95 (АМВ 50), 82-96 (АМВ 5Е) і 83-97 (АМВ 5Б).
Послідовності ТТГР 78-92, 79-93, 80-94, 81-95, 82-96 і 83-97 є наступними:
ТТГР 136-150 (АМВ 9А): ТОЇ КМЕРОЇ ТКМУ5Т (5ЕО ІЮ МО: 17),
ТТГР 137-151 (АМВ 98): СІ КМЕРОТКМУ5ТО (ЗЕО ІО МО: 18),
ТТГР 138-152 (АМВ 90): КМЕРОЇТКМУУ5ЗТОІ (5ЕО І МО: 19),
ТТГР 139-153 (АВМВ 90): КМЕРОЇТКМУ5ЗТОІЕ (5ЕО ІО МО: 20).
Ділянка 80-207 ТТГР (КМВ 12) має наступну послідовність:
ГЛ. КУММагтоУОсамМАЕМИаткІ бАММІ (5ЕО І МО: 64).
Зазначений пептид може включати мінімальний епітоп з одного з пептидів, представлених у наступній таблиці. 11111111 Б5БОЮМО 11111111 в/0 | тіксучмаєт5УЮСву, | о вв 11111161 ІКкіУММОєТ5МОвУА.Ї | -/: 68 11111101 | КОУММОаРєТ5УОбУАє | во 11111111 | СММОРТ5УОбУАєМ | - 7 11111111 УММОєТ5УОСУАєМа | 7л 11111111 | ММОРТ5УМОбУАєМат | -:( 72 11111 но111 1 Маєт5МОбУАєМатК | - 7 11111111 ОєТ5МООМАєМОТКІ | -( 74 11111111 вТ5МОВУАєМаТКІЮ | 75 1111111 ко111111|11Т5МООМАЕМОТКІСА. ЇЇ | 76 11111111 БМООУАЕМОТКІрАМ | 77 11111111 м011 | МООУАРМаТкІсАМУЇ | - 78 щЖ гФ
Зазначений пептид може включати мінімальний епітоп з одного з наступних пептидів:
ТТГР 180-194 (АМВ 12А): І ТІ КГ МММИагТМОа (5ЕО І МО: 65),
ТТГР 180-194 (АМВ 128): ТІ КІ МММОаРТЗМУОСИМ (5ЕО ІО МО: 66),
ТТГР 180-194 (АМВ 128-ККК): КККТІ КІ УММа ЕТ ЗМО, УККК (5ЕО ІЮ МО: 67).
У даному винаході також запропонований пептид, що включає послідовність: кК-(с/К)-агаІ--АМВ-50-пептид)-ааг-ааз-2-((с/К)-КК, де аа! не є амінокислотою, І, К або Т;
ВМВ-5О-пептид являє собою УМ5ІОМТІ ОО Е, або його варіант, у якому одна або більше з амінокислот була замінена на К, аа? не є амінокислотою, 5 або К; ааз не є амінокислотою, Н або К, який здатний до зв'язування з молекулою МНС іп міго і здатний бути представлений Т- клітині без процесингу антигену.
У розглянутому варіанті, ЕМВ-50-пептид може бути УУ5ІЮОМТІ ОО Е, або його варіантом, де одна, дві або три амінокислоти замінені на К.
Зазначений пептид можна вибрати з наступної групи, у якій усі члени ідентифіковані як апітопи (Таблиця 1):
ККИаіМУІОМТІ ОСІ ЕЗНОКК (5ЕО ІЮ МО: 12), ККаКМУ5ІОМТІ ОО ЕЗНОКК (5ЕО І МО: 22), ККОІКУБІОМТІ ОО ЕЗБНОКК (5ЕО ІЮ МО: 23), ККСОІМК5БІОМТІ ОО ЕЗБНОКК (ЗЕО ІЮО МО: 24), ККОІМУ5ІСУКІ ОО ЕЗНОИКК (5ЕО ІЮ МО: 25), ККОІМУБІОМТІ ОК ЕЗНОаКК(ЗЕО І МО: 26),
ККаіїМуУБІОМТІ ООКЕЗНОКК (5ЕО ІЮ МО: 27), ККОІМУБІОЮОМТІ ОСІ К5НОКК (5ЕО ІО МО: 28),
ККаіїМУБІОМТІ ОСІ ЕКНОКК (5ЕО ІЮ МО: 29), ККОІМУ5ІОМТІ ОСІ ЕЗКОКК (5ЕО І МО: 30),
ККамУБІОМТ ОСІ ЕСКК (5ЕБО 10 МО: 31) ККОамМУБІОУКІ ОСІ БСКК (5ЕБО 10 МО: 32),
ККамУБІОМТ ОКІ ЕСКК (5ЕБЕО 10 МО: 33) ККОаМУМ5ІОМТ ООКЕСКК (5ЕБО ІО МО: 34),
ККамУБІЮОУКІ ОККЕСКК (5ЕБЕО 10 МО: 35), ККОІМУБІОМТ ОСІ БОКК (БО 10 МО: 36),
ККОІМУБІОМКІ ОСІ БЕСКК (5ЕБЕО 10 МО: 37), ККОІМУ5БІОМТ ОКІЕСКК (5ЕБО 10 МО: 38),
ККОаІМУБІОМТІ ООКЕСКК (5ЕБЕО І МО: 39), ККОІМУБІОУК ОККЕСКК (5ЕБО 10 МО: 40),
ККатуУвІОМТ ОСІ ЕСКК (5ЕБО ІО МО: 41), ККаТУУБІОУКІ ОС ЕСКК (5ЕБО ІО МО: 42),
ККатуУвІОМТ ОК ЕСКК (5ЕБО ІО МО: 43), ККаТтУУБІОМТ ООКЕСКК (5ЕБО ІО МО: 44),
ККаТатуувІСУКГ ОККЕСКК (5ЕО І МО: 45), КККІММ5БІОМТІ ОСІ ЕЗНККК (5ЕО ІО МО: 21),
ККККУМБІОМТІ ОСІ ЕЗНККК (ЗЕО 10 МО: 46), КККІКУБІОМТІ ОСІ ЕЗНККК (5ЕО І МО: 47),
КККІУКБІОМТІ ОО ЕЗНККК (ЗЕО 10 МО: 48), КККІМУКІОМТІ ОСІ ЕЗНККК (5ЕО ІО МО: 49),
КККІУМ5БІОУКІ ОСІ ЕЗНККК (5ЕО ІО МО: 50), КККІМУБІЮОМТІ КО ЕЗНККК (ЗЕО ІО МО: 51),
КККІММБІОМТ ОК ЕЗНККК (5ЕО ІО МО: 52), КККІМУБІОМТ ООКЕЗНККК (5ЕО ІО МО: 53),
КККІУМБІОМТ ОСІ КЗНККК (ЗЕО ІЮО МО: 54), КККІМУБІЮОМТІ ОСІ ЕКНККК (5ЕО ІО МО: 55),
КККІУМБІОМТ ОСІ ЕЗКККК (5ЕБЕО ІО МО: 56), КККМУБІОМТ ОСІ ЕККК (5ЕБО І МО: 57),
КККУМБІОУКІ ОСІ ЕККК (5ЕБЕО 10 МО: 58), КККМУБІОМТ ОК ЕККК (БО 10 МО: 59),
КККУМУБІОМТІ ООКЕККК (5ЕО І МО: 60), КККУУБІЮОУКІ ОККЕККК (5ЕО ІО МО: 61).
Зазначений пептид можна вибрати з наступної групи, у якій усі члени ідентифіковані як апітопи і мають підвищену розчинність:
ККаТкмУмМ5БІОМТ ОО ЕЗНОКК (ЗЕО І МО: 22), ККОІМКБІОМТІ ОСІ ЕЗНОКК (5ЕО І МО: 24), ККаМУБІЮОМТ ОСІ ЕСКК (ЗЕО ІО МО: 31), ККаУУ5ІОУКГ ОО ЕСКК (5ЕБО ІО МО: 32),
ККамУБІОМТ ОКІ ЕСКК (5ЕБЕО 10 МО: 33) ККОаМУМ5ІОМТ ООКЕСКК (5ЕБО ІО МО: 34),
ККамУБІОУКІ ОККЕСКК (5ЕБО 10 МО: 35), ККОІМУ5БІОУК ОККЕОКК (5ЕБО ІО МО: 40),
ККаТатуУвІСУК ОО! ЕСКК (5ЕО 10 МО: 42), ККатуУмМ5БІОУКГОККЕОКК (5ЕБО ІЮО МО: 45),
ККККУМБІОМТІ ОСІ ЕЗНККК (ЗЕО 10 МО: 46), КККІУК5ІОМТІ ОСІ ЕЗНККК (5ЕО І МО: 48),
Коо) КККІУУКІОМТ ОСІ ЕЗНККК (5ЕО 10 МО: 49), КККУМУБІОМТ ОСІ ЕККК (ЗЕБО 10 МО: 57),
КККУМБІОУКІ ОСІ ЕККК (5ЕБО 10 МО: 58) КККУМ5ІОМТ ООКЕККК (5ЕБО ІО МО: 60),
КККУМБІБСУКІ ОККЕККК (5ЕО ІО МО: 61).
Зазначений пептид можна вибрати з наступної групи, у якій усі члени ідентифіковані як апітопи і мають найбільш високу розчинність:
ККИїМКОІЮМТІ ОСІ ЕЗНОКК (5ЕО І МО: 24), ККаМУБІОМКІ ОСІ ЄСКК (5ЕО ІО МО: 32),
ККамУБІОМТ ОКІ ЕСКК (5ЕБЕО 10 МО: 33) ККОаМУМ5ІОМТ ООКЕСКК (5ЕБО ІО МО: 34),
ККамУБІЮОУКІ ОККЕСКК (5ЕБО ІО МО: 35), ККатТМУ5БІОУК ОО БЕОКК (5ЕБО 10 МО: 42),
ККатумувІСУКІГ ОККЕСКК (5ЕБО ІО МО: 45), ККККУУ5БІОМТІ ОСІ ЕЗНККК (5ЕБО ІО МО: 46),
КККІУКБІОМТ ОСІ ЕЗНККК (5ЕО 10 МО: 48), КККУУБІОМТ ОСТ ЕККК (ЗЕБО 10 МО: 57),
КККУМ5ІОМТІ ООКЕККК (5ЕО І МО: 60).
Наступні пептиди становлять найбільший інтерес:
ККамУБІОМТ ОКІ ЕСКК (5ЕБО ІО МО: 32), ККаМУБІОУМКІ ОККЕСКК (ЗЕБО 10 МО: 34),
ККККУМБІОМТІ ОСІ ЕЗНККК (ЗЕО 10 МО: 46), КККІУК5ІОМТІ ОСІ ЕЗНККК (5ЕО І МО: 48),
КККУМ5ІОМТІ ОО ЕККК (ЗЕО ІЮ МО: 57), КККУУМБІОЮОМТІ ООКЕККК (ЗЕО І МО: 60).
ТОЛЕРАНТНІСТЬ
Т-клітинні епітопи відіграють центральну роль в адаптивних імунних реакціях на будь-який антиген, незалежно від того, свій він або чужий. Центральна роль, яку грають Т-клітинні епітопи в захворюваннях, пов'язаних з гіперчутливістю (які включають алергію, аутоїмунні захворювання і відторгнення трансплантатів), була продемонстрована з використанням експериментальних моделей. Існує можливість викликати запальні або алергічні захворювання шляхом ін'єкцій синтетичних пептидів (основаних на структурі Т-клітинних епітопів) у комбінації з ад'ювантом.
Навпаки, була продемонстрована можливість індукування імуногенної толерантності відносно конкретних антигенів шляхом введення пептидних епітопів у розчинній формі. Було продемонстроване введення розчинних пептидних антигенів як ефективних засобів інгібування захворювань при експериментальному аутоїмунному енцефаломієліті (ЕАЕ - модель розсіяного склерозу (М5)) (Меїлег апа Умгайй (1993), Іпї. Іттипої. 5:1159-1165; іш апа Мугайн (1995), пі.
Ітітипої. 7:11255-1263; Апаейоп апа Мугайнй (1998), Бик. У. ІттипоїЇ. 28:1251-1261); ї в експериментальних моделях артриту, діабету й увеоретиніту (огляд Апдепоп апа Уугайп (1998), див. вище). Введення пептидних антигенів було також продемонстроване як засіб лікування при бо перебігу захворювання у ЕАЕ (Апдепоп апа Уугайй (1998), див. вище).
Толерантність являє собою нездатність до реакції на антиген. Толерантність до "своїх" антигенів є суттєвою особливістю імунної системи і, якщо вона втрачена, може виникнути аутоїмунне захворювання. Адаптивна імунна система повинна зберігати здатність реагувати на величезну різноманітність інфекційних агентів і при цьому уникати аутоіїмунних атак своїх антигенів, що містяться у власних тканинах. Значною мірою це контролюється чутливістю незрілих Т-лімфоцитів до апоптотичної загибелі клітин у тимусі (центральна толерантність).
Однак не усі свої антигени визначаються в тимусі, і тому загибель аутореактивних тимоцитів залишається неповною. Існують також механізми, відповідно до яких толерантність може бути набута за рахунок зрілих аутореактивних Т-лімфоцитів у периферичних тканинах (периферична толерантність). Огляд механізмів центральної і периферичної толерантності наведений у
Апаепоп еї а!. (1999) (Іттипоіодіса! Немієму5, 169:123-137).
На даний час вважають, що ХГ викликається ТТГР-стимулюючими аутоіїмунними антитілами, що зв'язуються з ТТГР і активують їх, тим самим стимулюючи синтез і секрецію тиреоїдного гормону і ріст щитовидної залози.
Пептиди даного винаходу здатні індукувати толерантність до ТТГР, так що, будучи введені суб'єкту, вони можуть відновити толерантність до ТТГР свого білка і ослабити патогенну імунну реакцію.
Толерантність може виникнути в результаті або може характеризуватися індукуванням енергії в щонайменше частині СО4-Т-клітин. Щоб активувати Т-клітини, пептид повинен асоціюватися з "професійними" АПК, здатними передавати два сигнали до Т-клітин. Перший сигнал (сигнал 1) передається комплексом МНО-пептид на поверхні клітин АПК і сприймається
Т-клітинами за допомогою ТСК. Другий сигнал (сигнал 2) передається костимуляторними молекулами на клітинній поверхні АПК, такими як СО8О і СО86, і сприймається СО28 на поверхні Т-клітин. Вважають, що, якщо Т-клітини одержують сигнал за відсутності сигналу 2, вони не активуються й, у дійсності, стають анергічними. Анергічні Т-клітини несприйнятливі до наступної стимуляції антигеном і можуть бути здатні пригнічувати інші імунні реакції. Вважають, що анергічні Т-клітини залучені в опосередковану Т-клітинами толерантність.
Пептиди, які вимагають процесингу до того, як вони можуть бути представлені в сукупності з молекулами МНС, не індукують толерантність, оскільки вони повинні бути оброблені зрілими
Зо антигенпредставляючими клітинами. Зрілі антигенпредставляючі клітини (такі як макрофаги, В- клітини і дендритні клітини) здатні до процесингу антигену, але також і до передачі обох сигналів 1 і 2 до Т-клітин, що викликає активацію Т-клітин. Апітопи, з іншого боку, будуть здатні зв'язувати МНС класу ІІ з незрілими АПК. Таким чином, вони будуть представлені Т-клітинам без костимуляції, що приведе до анергічності Т-клітин і до толерантності.
Природно, апітопи також здатні зв'язуватися з молекулами МНС на клітинній поверхні зрілих
АПК. Однак імунна система містить набагато більшу кількість незрілих АПК, ніж зрілих АПК (передбачалося, що активується менше ніж 10 95 дендритних клітин, Зиттегз еї аї. (2001), Ат.
У. Раїної. 159:285-295). Неправильне положення відносно апітопа скоріше приведе до анергії/толерантності, ніж до активації.
Було показано, що, якщо толерантність індукують за допомогою інгаляції пептидами, здатність антигенспецифічних СО4-- Т-клітин до проліферації знижується. Також, продукування
І -2, ТЕМ-у і 1--4 такими клітинами знижується, але продукування 1-10 підвищується.
Було показано, що нейтралізація ІЇ/-10 у мишей у стані пептидіндукованої толерантності повністю відновлює сприйнятливість до захворювання. Було висловлене припущення, що в толерантному стані зберігається популяція регуляторних клітин, що продукують 1-10 і опосередковують імунну регуляцію (ВигкПаг! еї аї. (1999), Іпї. Іттипої. 11:1625-1634).
КОМПОЗИЦІЇ
Даний винахід також стосується композицій, таких як фармацевтичні композиції, які включають один або більше з пептидів відповідно до першого або другого аспектів даного винаходу. Такий пептид може включати множину пептидів, наприклад два, три, чотири, п'ять або шість пептидів. Композиції даного винаходу можуть бути призначені для профілактичного або терапевтичного використання. Якщо композицію вводять із профілактичною метою, така композиція може знижувати або запобігати виробленню імунної реакції на ТТГР. Рівень імунної реакції виявляється менше, ніж рівень у випадку, якби пацієнту не була введена композиція.
Термін "знижує" означає, що спостерігається часткове зниження імунної реакції, наприклад, таке як зниження реакції на 50 Фо, 70 95, 80 95 або 90 95, у порівнянні з тим, що спостерігалося б, якби пацієнту не ввели композицію (або спостерігалося б у не підданого обробці пацієнта за той же самий проміжок часу). Термін "запобігає" означає, що не спостерігається суттєвої імунної реакції на ТТГР.
Якщо композицію вводять для терапевтичного використання, композиція може пригнічувати вже існуючу імунну реакцію на ТТГР. Термін "пригнічує" указує на зниження рівня існуючої імунної реакції, у порівнянні з рівнем, що спостерігався до введення пептиду, або з рівнями, що спостерігалися б у той же момент часу, якби не був уведений пептид.
Введення композиції даного винаходу може стати причиною зниження рівня будь-якого або усіх з наступних: ї) ТТГР аутоімунних антитіл, ї) 04 .-Т-клітин, специфічних для ТТГР, ії) В-клітин, секретуючих ТТГР аутоімунні антитіла.
Визначення усіх факторів можна здійснити, використовуючи способи, добре відомі фахівцям у даній галузі, такі як ЕГІЗА, цитометрія в потоці і т. д.
Лікування композиціями даного винаходу може також або альтернативно стати причиною анергії в СО4-Т-клітинах, специфічних для ТТГР. Анергію можна визначити, наприклад, здійснюючи наступну імунізацію ТТГР іп міїго.
У випадку, якщо існують два або більше апітопів, фармацевтична композиція може бути у формі набору, у якому кожний або декілька з апітопів представлені окремо для одночасного, роздільного або послідовного введення.
Альтернативно (або на доповнення), якщо фармацевтична композиція (або будь-яка її частина) повинна бути введена у вигляді множини доз, кожна доза може бути упакована окремо.
Також, у фармацевтичних композиціях даного винаходу будь-який або кожен апітоп може бути в суміші з будь-яким придатним зв'язуючим(и), суспендуючим агентом (агентами), покривним агентом (агентами) або солюбілізуючим агентом (агентами).
ЛІКАРСЬКІ ФОРМИ
Композиції даного винаходу можна приготувати у вигляді композицій для ін'єкцій або у вигляді рідких розчинів або суспензій; можна також приготувати у вигляді твердих форм, придатних для розчинення або суспендування в рідинах перед ін'єкцією.
Лікарські форми можуть також бути емульговані або пептиди можуть бути інкапсульовані в ліпосоми.
Зо Активні інгредієнти можуть бути змішані з ексципієнтами, які є фармацевтично прийнятними і сумісними з активним інгредієнтом.
Придатними ексципієнтами є, наприклад, вода, сольовий розчин (наприклад, буферований фосфатом сольовий розчин), декстроза, гліцерин, етанол або т. п. і їх комбінації.
Крім того, при бажанні, композиції даного винаходу можуть містити невеликі кількості допоміжних речовин, таких як змочувальні або емульгуючі речовини і/або буферуючі рн речовини. Буферуючі солі, включаючи фосфати, цитрати, ацетати, хлористоводневу кислоту і/або гідроксид натрію, можуть бути використані для регулювання величини рн. Для стабілізації можуть бути використані дисахариди, такі як сахароза або трегалоза.
Якщо композиція включає множину пептидів, відносна кількість пептидів може бути приблизно рівною. Альтернативно, відносні кількості кожного з пептидів можуть змінюватися, наприклад, для того, щоб сфокусувати толерогенну реакцію на конкретному різновиді аутореактивних Т-клітин або у випадку, якщо виявлено, що один з пептидів функціонує краще інших у конкретних НІ А-типах.
Після приготування композиції даного винаходу можна помістити в стерильні контейнери, які потім запаюють і зберігають при низьких температурах, наприклад при 42С, або їх можна висушити заморожуванням.
Зручно приготовляти композиції у вигляді ліофілізованого (висушеного заморожуванням) порошку. Ліофілізація забезпечує тривалий термін зберігання в стабілізованій формі.
Процедури ліофілізації добре відомі фахівцям у даній галузі, див., наприклад, пОру/Лимли. а емісеїП ПК. сот/мамагспіме/97/01/006.пІті.
Збільшуючі об'єм речовини використовують перед сушінням виморожуванням, такі як маніт, декстран або гліцин.
Композиції даного винаходу можна вводити звичайними способами, таким як пероральний, внутрішньовенний (якщо вони водорозчинні), внутрішньом'язовий, підшкірний, сублінгвальний, трансназальний, черезшкірний або у вигляді супозиторіїв або за допомогою імплантацій (наприклад, використовуючи повільно вивільнювані молекули).
Композиції даного винаходу вигідно вводити інтраназально, підшкірно або черезшкірно.
Пептиди і композиції даного винаходу можна використовувати для лікування людей. Такими пацієнтами можуть бути пацієнти з хворобою Грейвса. Пацієнти можуть мати ТТГР аутоімунні бо антитіла.
Такі суб'єкти можуть мати НІ А-гаплотип, що пов'язаний зі схильністю до вироблення інгібіторних ТТГР аутоїмунних антитіл. Суб'єкт може експресувати НГА-ОМКЗ або НІ А-ОВА.
Способи визначення НІ А-гаплотипу у індивідуумів добре відомі фахівцям у даній галузі.
Звичайно лікар визначає реальні дози, що будуть найбільш придатними для індивідуального пацієнта, і такі дози будуть варіюватися залежно від віку, маси і реакції конкретного пацієнта.
У переважному варіанті може бути використана схема "збільшення доз", при якій пацієнту вводять множину доз у зростаючих концентраціях. Такий підхід використовують, наприклад, для пептидів фосфоліпази А2 у імунотерапевтичних застосуваннях проти алергії на бджолину отруту (Мійег еї аї. (1998), У. АПегду Сіїіп. Іттипої. 10:747-754, і АКкаїз еї аї. (1998), 9. Сііп. Іпмеві. 102:98-106).
НАБОРИ
Звичайно, якщо композиція включає множину пептидів, їх можна вводити спільно у формі змішаної композиції або коктейлю. Однак можуть виникнути обставини, при яких переважно надавати пептиди окремо у формі набору для одночасного, роздільного, послідовного або комбінованого введення.
Такі набори можуть також включати засоби змішування і/або введення (наприклад, випарник для інтраназального введення або шприци і голки для підшкірного/черезшкірного введення доз).
Такі набори можуть також включати інструкції для застосування.
Фармацевтичні композиції або набори даного винаходу можна використовувати для лікування і/або профілактики захворювань. Зокрема, композиції/набори даного винаходу можна використовувати для лікування і/або профілактики хвороби Грейвса.
ПРИКЛАДИ
Приклад 1. Селекція НЕ А-ОКЗ ТТГР-пептидів
Для визначення важливих ділянок у ТТГР, ЕСО ТТГР (АА2О-418) розділяють на 28 пептидів, що перекриваються, які містять 28-30 амінокислот (28-30-мер), що перекриваються 15 амінокислотами, як зображено нижче.
РІ, 59 7щ/я ло6бпох 05 Зе 164155 лоді 220221 г4аЯгіо 278); ЯК ЗОЗо5 333334 збаЗ лози 418 1 1283 | 85 1 7 | в | чі | 43 | з5 3 47 | л9 | 2 | 923 1 25 | 27 2151 6 1 в 1 61 5 | з | 6 | ля | 29 | 22 | м | в 34 Зв 5203 і2ці22. 154150 179180 годгОВ азврзо 263ра гацряг. З19520 завіз. З7лЗУВ 40бЕ 251 830
Св
Н Довжина . .
Н Довжина . .
Потім оцінюють імуногенність усіх пептидів шляхом імунізації ОСА-ОКВ170301 трансгенних мишей (ОКЗ-миші) 200 мкг пулу з З пептидів, емульгованих у СЕА. Через 10 днів виділяють І М- клітини і спленоцити і стимулюють іп мійго, використовуючи 10-25 мкг/мл відповідних індивідуальних пептидів. Було виявлено, у розрахунку на індекси стимуляції (ІС; включення ЗН- тимідину (імпульси на хвилину) стимульованих пептидом клітин ділене на значення для нестимульованих клітин), що пептиди ЕМВ-5 і КМВ-9 мають високу імуногенність (ІС»10).
Фіг. 1 демонструє, що ІМ (лімфатичні вузли) і спленоцити, виділені з КМВ-5-імунізованих мишей, сильно реагують на КМВ-5-стимуляцію іп міїго.
Усі розкриті далі приклади будуть сфокусовані на пептидах ЕМВ-5.
Приклад 2. Ідентифікація апітопів усередині КМВ-5
Для визначення точного положення епітопів усередині КМВ-5, синтезують панель 15-мерних пептидів, що перекриваються, які охоплюють КМВ-5, використовуючи стандартну Е-тос-хімію.
Кожен пептид заміняють 1 амінокислотою, як представлено далі. вМмв 50-акк вМв5о ккК
Спочатку пептиди аналізують, використовуючи гібридоми, створені на основі ОКЗ-мишей.
Показано, що гібридоми, специфічні для ТТГР і ЕМВ-5, реагують з КМВ-5А-Е, представленими як свіжими, так і фіксованими МАМУ-клітинами. Антигеніндуковане продукування 1-2 представницькими клонами зображено на фіг. 2.
Для визначення здатності зазначених 15-мерних пептидів зв'язуватися з НІА-ОВ молекулами, використовують 2 програми: МеїМНеЇїІ (пер/Лумлу.сЬз.аш.ак/вегиісевз/Меї Мне!) і базу даних імунних епітопів (Іттипе Еріюре РаїаВавзе) (пер/Лооівіттипееріїюоре.огд/апаІуле/піті/лтнс І! Біпаїпа.піті). Використовуючи обидва методи, вкладені пептиди ЕМВ-5А аж до КМВ-5Е ідентифікують як такі, що ефективно зв'язуються як з
НІГ А-ОКВІ170301, так і з НСА-ОКВ170401 молекулами.
Хоча ХГ у людей значною мірою пов'язана з НГ А-ОКВ170301 гаплотипом, НГА-ОНВ170401 гаплотип також часто зустрічається у пацієнтів із ХГ. Оскільки передбачено, що ЕМВ-5А до 5Е пептиди зв'язуються з НГА-ОКВ170401 молекулами, КМВ-5 тестують відносно їх здатності викликати імунну реакцію у ОК4-мишей іп мімо. І М-клітини і спленоцити, виділені з ЕМВ-5/СЕА- імунізованих ОН4-мишей, демонструють сильні імунні реакції при стимуляції КМВ-5 вкладеними пептидами. Крім того, ЕМВ-5-специфічні гібридоми, створені в ОКЗ-мишах, реагують на ЕМВ-5 вкладені пептиди, будучи представленими ВМ14-клітинами (НГА-ОКВ170401). Тому, нові гібридоми створюють шляхом імунізації ОК4-мишей ТТГР/СЕА. Гібридоми, специфічні як для
ТТГР-білка, так і для і КМВ-5-пептиду, відбирають для ідентифікації апітопів усередині КМВ-5.
Пептиди КМВ-5А до 5Е знову ідентифікують як апітопи (Фіг. 3). АВМВ-50ОЕРЕ вкладені пептиди модифікують, додаючи амінокислоти СЗКК з обох С- і М-кінців. ТТГР- і КЕМВ-5-специфічні гібридоми також реагують із зазначеними модифікованими пептидами, будучи представленими як свіжими, так і фіксованими АПК. Узяті разом, одержані результати підкреслюють те, що зазначена ділянка представляє інтерес для ХГ-пацієнтів НГА-ОКВ170301 або НІ А-ОАВ170401 гаплотипів.
Було показано, що частина ТТГР-специфічних гібридом, створених шляхом імунізації ОК4- мишей за допомогою ТТГР/СЕА, зв'язуються з ЕМВ-4 замість ВМВ-5, що вказує на присутність інших імуногенних ділянок усередині ТТГР. КМВ-4-специфічні гібридоми вибирають для ідентифікації апітопів усередині КМВ-4. Пептид КМВ-4.) ідентифікують як апітоп (Фіг. 4). АМВ-4 вкладені пептидні послідовності представлені в таблиці далі.
Досліджують також апітопний статус КМВ-5О0-модифікованих пептидів (Фіг. 20).
На доповненні до КМВ-4 і КМВ-5-апітопів, комп'ютерне програмне моделювання також показало, що пептиди ЕМВ-9А до 90 є сильними зв'язуючими з НІ А-О2В170301 молекулами. Їх пептидні послідовності представлені далі в таблиці.
Тестують реакції ТТГР- і ЕМВ-5-специфічних гібридомних клонів, виділених з НІ А-ОНЗ3- або
НГА-ОН4-мишей, імунізованих ТТГР/СЕА, з КМВ-5О0-модифікованими пептидами. Результати представлені на Фіг. 11 до 15.
Приклад 3. Аналіз толерантності ех мімо
Для оцінки здатності КМВ-5-апітопів індукувати толерантність, спочатку досліджують здатність зазначених апітопів інгібувати реакції у здорових НІ А-ОКВ170301 або НІ АОКВ170401 ех мімо. Мишей попередньо обробляють різними ЕМВ-5 апітопами згідно зі схемами високих доз або зростаючих доз, що розкрито в розділі спосіб. Дослідження показали, що попередня обробка КМВ-5 апітопами значно знижує ТТГР-індуковану Т-клітинну проліферацію, як у ОКЗ-, так і у ОК4-мишей (Фіг. бА-О0). ВМВ-50ОЕБЕ вкладені пептиди модифікують, додаючи амінокислоти
Зо "КК з обох С- і М-кінців. Обробка такими модифікованими апітопами до лікування також значно знижує ТТГР-індуковану Т-клітинну проліферацію (Фіг. бЕ-БЕ).
Було передбачено, що пептиди КЕМВ-9А до 90 ефективно зв'язуються з НІ А-ОАВ170301 молекулами, і їх здатність індукувати специфічну імунну толерантність також досліджували.
РАЗ-мишей попередньо обробляють КМВ-9А до 90 згідно зі схемою збільшення доз. Попередня обробка ЕМВ-9В і 9С викликає значне зниження ТТГР-індукованої Т-клітинної проліферації як в
ЇМ, так і в клітинах спленоцитів (Фіг. 7).
Було також показано, що пептид КМВ4К-СКК значно знижує ТТГР-індуковану Т-клітинну проліферацію у ОК4-мишей (Фіг. 16). АМВ-5О-модифіковані пептиди також значно знижують
ТТГР-індуковану Т-клітинну проліферацію.
Представницькі приклади експериментів з КМВ50-КтТ, АМВ50О-КЗ ії КМВ50-К16 представлені на Фіг. 19.
Приклад 4. Експериментальна модель ХГ на тваринах
Для дослідження здатності ЕМВ-5-апітопів зменшувати ХГ-подібні симптоми у мишей, були розроблені дві різні моделі ХГ на тваринах.
Спочатку С57/816-мишей імунізують ТТГР/СЕА для індукування вироблення анти-ТТГР антитіл. Для дослідження того, чи приведе бустерна імунізація до подальшого підвищення рівня анти-ТТГР антитіл, для однієї групи мишей проводять другу імунізацію ТТГР/ЛЕА через 4 тижні.
Рівні анти-ТТГР антитіл у сироватці мишей, імунізованих один раз, досягають рівня плато через 2 тижні після імунізації. Вторинна імунізація викликає суттєве підвищення рівнів анти-ТТГР антитіл (Фіг. 8).
По-друге, ВаЇІБ/с-мишам вводять ін'єкцією І аси-АЯй або ТТГР-Ай вірусні частинки для індукування гіпертиреоїдизму, викликаного дією анти-ТТГР антитіл на щитовидну залозу. Рівні
Т4-гормону і повний титр анти-ТТГР антитіл ЇдСс у сироватці всіх мишей вимірюють до, через 4 тижні після і через 10 тижнів після першої ін'єкції аденовірусних векторів (Фіг. 9). Імунізація мишей 1079 ТТГР-Аа вірусними частинками викликає гіпертиреоїдизм у 3/7 мишей і 1/7 мишей при вимірюваннях через 4 тижні і через 10 тижнів після першої імунізації, відповідно. Результати показали, що рівні Т4 у 2 мишей нормалізувалися протягом експерименту. Імунізація мишей 10" ТТГР-АЯ вірусними частинками індукувала гіпертиреоїдизм у 1/6 мишей, як через 4 тижні, так і через 10 тижнів після першої імунізації. Отже, одна миша з гіпертиреоїдизмом через 4 тижні мала нормальні рівні Т4 через 10 тижнів, тоді як рівні Т4 у інших мишей сильно підвищилися між 4 і 10 тижнями. Рівні анти-ТТГР антитіл вимірюють як повні значення ІдС, не визначаючи їх стимулюючий або блокуючий ефект відносно ТТГР (Фіг. 10). Імунізація мишей
ТТГР-Аа вірусними частинками чітко індукує продукування анти-ТТГР антитіл. Миші, імунізовані 1019 або 10" ТТГР-Аа вірусними частинками, продукують значно більше антитіл, ніж І ас:-да імунізовані миші. Рівні анти-ТТГР антитіл не відрізняються для 10'9-ТТГР-Аа і 10"7-ТТГР-АЯ
Зо імунізованих мишей. Не виявлено кореляції між повними рівнями ІдСї анти-ТТГР антитіл і рівнями Т4.
Описані моделі на тваринах використовують для дослідження того, чи можуть КМВ-5- апітопи зменшувати симптоми, подібні до симптомів ХГ іп мімо.
Приклад 5. Ідентифікація апітопів у ділянці КМВ12
КМВ12 також як вкладені пептиди не є імуногенними у мишей. Тому зазначену ділянку ідентифікують по реакційній здатності Т-клітинної лінії, одержаної від пацієнтів із хворобою
Грейвса. На Фіг. 17 представлені результати, одержані для такої Т-клітинної лінії.
Підтверджено, що КМВ12 і модифікований пептид КМВ12-К є апітопами (Фіг. 18).
Матеріали і методи
Миші
НГА-ОКВ170301 трансгенних мишей (ОКЗ-миші) вирощують і утримують у імуногенетичній мишачій колонії Мауо Сіїпіс. НГА ОКЗ3-4 мишей-засновників одержують від бипіег Натітегтпіпд (Септап Сапсег Везеагсі Сепіег, НеїдеІрегуд, Сегтапу). Коротко, 6-КЬ Маеї фрагмент НА ОКА геномного клону в рис і 24-КЬ СіІаїхЗа! фрагмент со5 4.1, що містить В-ген, спільно вводять у запліднені яйця (С57ВІ /Хх ОВА/2)-Е1 донорів, спарених з С57ВІ /б-самцями. Трансгенних мишей схрещують з І-АЮБ нокаутними мишами. ОКЗ-мишей схрещують з С57ВІ 10 фоновим генотипом протягом 10 поколінь. Такі ОКЗ-миші експресують молекули НГА-ОКВ17"0301, але не мишачі молекули МНО-1Ї.
Зазначений штам ОК4-мишей початково створюють за способом і аг ЕРиддег еї а). (РМАБ5 1994; моїште 91:6151-6155)5 у тому, що НГА-ЮОВА"0101/НІ А-ОКВ170101 ї тоО3-пиСОра4с/д конструкції спільно мікроін'єктгують в ембріони від (ОВА/Л(А.СА)Ж1 схрещування, і життєздатні ембріони переносять у псевдовагітних самок (ВаІБ/с(129)Е1 для розвитку до терміну. Одержане потомство пізніше схрещують з І-АБ нокаутним С57ВІ /6 фоновим генотипом (АВО мишії), у яких відсутня експресія мишачих молекул МНС класу ІЇ. Тому тільки молекули МНС класу Ії, експресовані такими ОК4-мишами, є людськими НІГ А ОКА молекулами.
Дослідження на тваринах були дозволені Єтичним комітетом для експериментів на тваринах (ЕСО) в університеті Наб5зей Опімегейу і здійснювалися відповідно до вищих стандартів догляду у віварії, що не містить патогенів.
Пептиди
Пептиди синтезовані в Сі Віоспет (4. (Зйпапдаії, Спіпа) і зберігаються в диметилсульфоксиді (ДМСО; 5ідпта-Айагісп, Вогпет, ВеїІдійт) при -8020.
Дослідження зв'язування пептидів з НГ А-0АВ170301
Сервер Ме Мне 2.2
Сервер МеМНеїІ 2.2 прогнозує зв'язування пептидів з НГА-ОКВІО301 з використанням штучних нейронних мереж. Передбачувані значення виражені в нМ ІК5О-значень. Пептиди, що мають сильну і слабку зв'язувальну здатність, зазначені у висновках. Пептиди, що мають високу зв'язувальну здатність, мають значення ІК5О нижче, ніж 50 нМ, і пептиди, що мають низьку зв'язувальну здатність, мають значення ІК5О нижче 500 нМ. Результати представлені як передбачувана оцінка, розрахована наступним чином: 1-ІодоОбО0О(ай). Адреса веб-сайту: пЕруЛумли.срві.аш.ак/зегмісе5з/чеї МН.
База даних імунних епітопів ЕОВ): метод консенсусу
Для кожного пептиду, перцентильний ранг для кожного з чотирьох методів (АКВ, комбінаторна бібліотека, підгонка і 5ішигпіоіо) створюють, порівнюючи оцінки пептидів з оцінками для п'яти мільйонів випадкових 15-мерів, вибраних з бази даних ЗУЛЗЗРКОТ. Нечисленний перцентильний ранг свідчить про високу спорідненість. Середній перцентильний ранг із чотирьох способів потім використовують для створення узгодженого способу. Адреса веб-сайту: пор/Лоо!ів.іттипеерйоре.огд/апаіуге/пітіитнс ІІ Біпаїпд.піті.
Визначення імуногенності довгих пептидів
Примування рАЗ-мишам підшкірно вводять у основу хвоста 100 мкг антигену в РВЗ (опа, Мегмівг5,
Веїдійт), емульгованого в повному ад'юванті Фрейнда (СЕА; ВО Вепеїих, Егетродедет,
Веїдійт), що містить 4 мг/мл Мусобасіегішт їирегсцозіз (МТЬ, ВО Вепеїсих)) (100 мкл/ін'єкцію).
Залежно від експерименту ЕМВ-пептиди або повної довжини ТТГР-289-білок використовують як антиген. Контрольним тваринам в той же самий час вводять тільки РВБ/СЕА.
Клітинна культура
Через десять днів після імунізації, дренуючі лімфатичні вузли (ІМ) і селезінку витягають. І М- клітини і спленоцити виділяють і культивують у Х-мімо 15 середовищі (доповненому глутаміном, пеніциліном і стрептоміцином; ІГоп7а) у 96-ямкових плоскодонних планшетах. Для дослідження
Зо антигеніндукованої клітинної проліферації, 0,5х106 клітин/'ямку культивують (200 мкл/ямку) протягом 72 годин з різними концентраціями антигену (0-25 мкг/мл) або з 12,5 мкг/мл очищеного білкового похідного (РРО; контроль примування; 5іагеп5 зегит іпбзійші, Сореппадеп, ОептакгкК).
Аналіз проліферації й аналіз цитокінів
Через 72 години, 60 мкл клітинної надосадової рідини збирають і заморожують. Потім до клітин додають 20 мкл/ямку міченого тритієм тимідину (РегКкіпЕІтег, 2амепіет, ВеїЇдійт) до одержання кінцевої концентрації 1 мкКюрі/ямку. Клітини інкубують при 372С, і через 16 годин планшети заморожують. Розморожені планшети збирають і зчитують, використовуючи |В- лічильник (УмаМйас 1450 Місгореба Тгйих Гіди сіпіШаноп Соцпіег) для оцінки клітинної проліферації. Розморожену надосадову рідину аналізують, використовуючи мишачі ТАИТН2 1Оріех РіожСутіх МийПйірієх (Вепдег Меазузіет5, Мієппа, Аи!Їзіга) для вимірювання антигеніндукованого продукування цитокінів.
Створення КМВ-5-специфічних гібридом
Примування і створення Т-клітинної лінії
У день 0, мишам підшкірно вводять шляхом ін'єкції в основу хвоста 100 мкг антиген/сЕА (АМВ-5 для ОКЗ-мишей; ТТГР для ОК4-мишей). Контрольних мишей імунізують РВБЗ/СЕА. На 10 день дренувальні ІМ і селезінки витягають і створюють одноклітинні суспензії. Деяку кількість клітин використовують для вимірювання антигеніндукованої клітинної проліферації, як розкрито вище. Спленоцити і І М-клітини, що залишилися, змішують, і СО4-Т-клітини виділяють, використовуючи набір для негативного очищення (незачеплені СО4--Т-клітини; Мінепуї, І еідеп,
Тпе Мефегіапа5з). Потім СО4--Т-клітини культивують разом з антигеном (5 мкг/мл ЕМВ-5 або 0,5 мкг/мл ТТГР-289-білка) і опроміненими спленоцитами (3000 рад) від ОКЗ-мишей (відношення
АПК:СО4-Т-клітини 1:1; 5х105 клітин/мл). Клітини культивують у Х-мімо 15 середовищі, щоб уникнути активації, індукованої фетальною телячою сироваткою (ЕС5). На 4 день до клітин додають 20 од./мл людських рекомбінантних 1-2 (КО, Абіпддоп, Опйей Кіпдаот). На 7 день живі клітини збирають, видаляючи мертві клітини, використовуючи поділ по градієнту щільності
Фіколла (Ніхіорадие 1083, Зідта-Аїагісп). Потім клітини повторно стимулюють, як розкрито вище, змінюючи співвідношення АПК:СО4 «Т-клітини на 2:1. На 9 день живі клітини збирають, і деяку кількість з них використовують для злиття. Інші СО4--Т-клітини залишають у культурі, і ІІ - 2 додають у день 10. У день 14 живі клітини збирають, повторно стимулюють антигеном у присутності АПК (відношення АПК:СО4-Т-клітини близько 3:1), і використовують для другого злиття в день 16.
Злиття 1х107 ВМУ5147-клітин (Неакй Ргоїесіоп Адепсу Сийиге СоПесійоп5, ЗаїїзБигу, ОК) ї 5х106
СбразТ-клітин змішують у 50-мл ампулі і промивають при 377С у середовищі, що не містить сироватки. Після центрифугування клітинний осад обережно суспендують знову. 1 мл 3726 поліетиленгліколю (РЕС; 40-5095 розчин, Зідта-АЇйгісй) додають протягом 45 секунд, зберігаючи клітини на невеликій водяній бані при 372С. Клітини інкубують при 372С протягом 45 секунд. Потім додають 1 мл 372С середовища, що не містить сироватки, протягом 30 сек., при обертанні, потім додають 2, 3, 4, 10 і 30 мл послідовно. Ампули перевертають дуже повільно і інкубують при 37С протягом 4 хвилин. Клітини центрифугують протягом 5 хвилин при швидкості 1300 об./хв. при кімнатній температурі (КТ) без перерви. Надосадову рідину видаляють, і 50 мл КТ середовища, що не містить сироватки, додають повільно, щоб уникнути перемішування з клітинним осадом. Стадію промивання повторюють, використовуючи повне середовище. І, нарешті, клітини знову суспендують у повному середовищі з 10 95-ЕС5 при КІ і поміщають при різних концентраціях у 96-ямкові плоскодонні планшети (100 мкл/ямку). Через 48 годин клітини культивують у 1хгіпоксантин-аміноптерин-тимідиновому (НАТ, з5ідта-Аїагіси) середовищі, і ріст гібридом визначають приблизно через б днів. Клони культивують у НАТ- середовищі доти, поки вони є стабільними, потім переносять з гіпоксантин-тимидинового (НТ,
Зідта-АїІдгісй) середовища в повне КРМІ-середовище. Як звичайно клони заморожують у заморожуючому середовищі (90 95 ЕСб5--10 96 ДМСО).
Оцінка антигенспецифічності клонів
Гібридомні клітини культивують з 5х107 МАМУ або ВМ14-клітинами (людські клітинні лінії, експресуючі НГА-ОКВ170301 або НІ А-ОКВ170401, відповідно; Іпіегпайопа! Нібіосотрайрійу
УМогкіпд Сгоир, бЗеаше, ОБА) і антигеном (10-25 мкг/мл). Через 48 годин вимірюють антигеніндуковане продукування 1Ї-2, використовуючи імуносорбентний ферментний аналіз (ЕБНІЗА).
ЕПЗА ІІ -2 9б-ямкові планшети (Іттипозогр 96 м/еїЇ, Різпег Зсієепійіс, Егетродедет, Веї|дит)
Зо покривають на ніч при 42С 50 мкл/ямку очищеного агента захоплення Ар щурячих антимишачих
І. -2 (ВО Віозсіепсе5, Охіога, ОК), розведеного 1:250 у карбонатному буфері. Після 2 промивань
РВ5Б-0,05 95 Твін, ямки блокують 10 95 ЕС5/РВЗ протягом 1 години при КТ. Потім ямки інкубують з 50 мкл/ямку надосадової рідини клітинної культури або ІІ -2-стандартом (ВО Віозсіепсев,
Веїдіит, Егетродедет) протягом 2 годин при КТ. Планшети інкубують з 50 мкл/ямку біотин- щурячими антимишачими 1І--2 (ВО Віозсіепсе5), розведеними 1:1000 у 0 956 ЕС5/РВ5, протягом 1 години при КТ, з наступним інкубуванням з 50 мкл/ямку екстравідинпероксидази (Зідта-Айагсн), розведеної 1:1000 у РВ5, протягом ЗО хвилин при КТ. Для визначення зв'язування антитіл, додають розчин 50 мкл/ямку ТМВ-субстрату (Регбіо 5сіепсе, Егетродедет, Веїдішт). Через 11 хвилин реакцію забарвлення зупиняють, використовуючи 50 мкл/ямку 2М Не»5О». Оптичну густину (ОГ) вимірюють на 450 нм (630 нм порівн.) (Тесап Вепеїих, Меспеїеп, ВеІдійт).
Незалежна від процесингу система презентації антигену
Антигенспецифічні клони тестують по їх реакційній здатності відносно 15-мерних пептидів (АМВ-5А до 50), представлених фіксованим або не фіксованим МАМУ- або ВМ14-клітинам (-АПК). 5х107 клітин з індивідуальних клонів культивують з 25 мкг/мл пептидів і 5х107 фіксованими або свіжими АПК. Для фіксації АПК клітини інкубують з 0,5 95 параформальдегідом (Мегск, Оагтеїааі, Сепгтапу) (рН 7) протягом 5 хвилин при КТ. Реакцію фіксації зупиняють, 0,4М гліцином (Зідта-Аїагісп) і промивають одержані клітини в КРМІ-10 96 ЕС5. Додатково вимірюють реакційну здатність відносно людського ТТГР-289-білка (Спезареаке-РЕВІ, Замаде, Магуїапа,
ОБА) для вимірювання криптичних епітопів. Через 48 годин вимірюють антигеніндуковане продукування ІІ--2 за допомогою ЕГІ5А.
Оцінка розчинності КМВ-5-епітопів
Розчинність пептидів аналізують, використовуючи Апабіоїгес (2м/і|паагає, Веїдійт). Коротко, зразки пептидів розчиняють у двох різних цільових концентраціях (І мг/мл і 4 мг/мл), додаючи
РВ5З, рН 7,0-0,1. Пептидні розчини інкубують при КТ протягом щонайменше 16 годин.
Каламутність вимірюють на 320 ї 360 нм, до і після центрифугування. Концентрацію пептидів визначають, використовуючи поглинання на 280 і 205 нм, і за даними ВЕРХ-УФ. Пептиди розчиняють у вихідній концентрації 20 мг/мл у ДМСО. Приготовляють серійні розведення до цільових концентрацій 4, 2 і 1 мг/мл у РВ5. Пептидні розчини інкубують при КТ протягом 16-17 годин, щоб утворився осад. Помутніння оцінюють візуально, і поглинання вимірюють на 205 нм, бо 280 нм і 320 нм, використовуючи пристрій Маподгор. Пептидні розчини центрифугують при
14800 об./хв. протягом 10 хвилин, і візуальну оцінку і вимірювання поглинання повторюють.
Розраховують концентрацію пептидів, використовуючи наступну формулу: концентрайй ак - Агво (немаєод)х Молекуляріа маса(Да) мл/ Коефіцієнтекстинціїє2во ХМ. см 4 )х І (см)
Індукування толерантності обробкою ЕМВ-5-апітопами рАЗ-мишам підшкірно ін'єктують у потиличну частину шиї КМВ-5 15-мерні пептиди (100 мкг/ін'єкцію) або РВЗ5 у дні -8, -6, -4 (схема високих доз) (Фіг. 5). Альтернативно, мишам вводять 0,1 мкг, 1 мкг і 10 мг пептидів у дні -15, -13 і -11, відповідно, потім вводять З ін'єкції 1 пептиду в дні -8, -6 і -4 (схема збільшуваних доз). У день 0 мишам підшкірно вводять ін'єкцією в основу хвоста 100 мкг антиген/СЕА (ЕМВ-5-пептид або ТТГР-289-білок). Через 10 днів після імунізації, збирають дренувальні І М і селезінки. Аналіз проліферації і вимірювання цитокінів здійснюють, як розкрито вище.
Модель ХГ на тваринах
Імунізація мишей ТТГР А-субодиничним аденовірусом
Аденовірус, експресуючий людські ТТГР А-субодиниці (амінокислотні залишки 1-289, А- субодиниця Аа) і контрольні аденовіруси (І ас2-Аа), експресуючі ВД-галактозидазу, закуповують у
Мігадцезі (Могій Гірепу, ІА, ОБА). Шеститижневим самкам Ваїр/сдОІаНзха-мишей (Нагіап
І арогафогієз, Мепгау, Тпе МеШегіапавз) внутрішньом'язово ін'єктують у стегновий м'яз ТТГР-Аа (100 або 107 частинок) або ІГас2-Ай (109 частинок). Усіх мишей імунізують одночасно, використовуючи одну і ту ж порцію вихідного аденовірусу. Мишам вводять ін'єкції три рази з тритижневими інтервалами (дні 0, 21 і 42), і кров відбирають до першої імунізації і через один тиждень після другої імунізації. Усіх мишей умертвляють через 4 тижні після третьої ін'єкції (10 тиждень) для одержання крові і щитовидних залоз.
Імунізація мишей ТТГР/СЕА
Шеститижневих самок С57/ВІБЮУОІаНза-мишей (Нагіап Іарогаїогіеє) (8 мишей у групі) підшкірно імунізують ін'єкціями в основу хвоста 50 мкг ТТГР-289-білка, емульгованого в СЕРА з 4 мг/мл МТЬ (50 мл). У мишей відбирають кров із хвоста в дні 0 (преімунно), 7, 21, 35, 49, 63 (група А), у дні 0, 14, 28, 42, 56 (група В) або в дні 0, 21, 28, 42, 56 (група С). Мишам групи С
Зо проводять бустерну імунізацію на 4 тиждень, використовуючи 50 мкг ТТГР-289-білка, емульгованого в неповному ад'юванті Фрейнда (ІРА). Через 10 тижнів після першої імунізації, усіх мишей умертвляють, і відбирають кров, використовуючи серцеву пункцію.
ТІГР антитіла
Анти-ТТГР антитіла (клас Ід) проти очищеного ТТГР-289-білка (СПпезареаке-Реїп) вимірюють, використовуючи ЕГІЗА. 9б-ямкові планшети (половину площі 9б-ямок, Різпег
Зсіепійіс) покривають на ніч при КТ 50 мкл/ямку ТТГР-289-білка в РВ5 (0,5 мкг/мл). Після промивання РВ5З-0,05 95 Твін, ямки блокують 1 95 ВЗА (мас./06.) у РВЗ протягом 1 години при
КТ, і інкубують з тестовою сироваткою (дублікатні аліквоти, 1:50 розведення). Мишачі анти-ТТГР антитіла (АЯ, Абеат, Сатрбгідде, ОК) використовують як позитивний контроль. Зв'язування антитіл визначають, використовуючи кон'югований з пероксидазою хрону козячий антимишачий
Ід: (Абеат), і сигнал виявляють, використовуючи ТМВ. Оптичну густину (00) вимірюють, використовуючи зчитувальний пристрій для планшетів на частоті 450 нм (Тесап Вепеїих).
Сироватковий тироксин і гістологія щитовидної залози
Повний тироксин (14) вимірюють у нерозбавленій мишачій сироватці (10 мкл), використовуючи набір СВІ мишачий/щурячий тироксин ЕГІЗА (СаїБіоїесй, Зргіпд МаїПеу, СА,
БА) відповідно до інструкцій виготовлювача. Значення Т4 розраховують, використовуючи стандарти, представлені в наборі, і виражають як мкг/дл. Щитовидні залози фіксують у 10 95 нейтральному буферованому формаліні (рН 7,5), розрізають на секції й забарвлюють гематоксиліном і еозином. Секції розглядають на предмет патологічних змін (гіпертрофія, гіперцелюлярність епітеліальних клітин і інфільтрація лімфоцитів) і проводять оцінку (КУУ5
Віоїеві, Вгівіо!, ОК).
Таблиця 1 вх с В с У
Пептид Послідовність Розчинність | гібридомами Апітоп реакція вМВв- окКк 04 |ККОамУКІрУТОСсЕЗНОККЇ | з | - | - фккамУЗКоУпоОсіЕЗНОКК | мо | - / - сб |ККаімУБІКМТОСОсЕБНОККЇ | мо | - / - 27 |ккамУвКлОсСіЕЗНОКК | мо | - / - 29 |ККаімУБІРМТКОСсЕЗНОКК.Ї | мо | - / - сто |КкКаімУБІОМТІКОсЕЗНОКК. | мо | - 71 - мі ЇККаіміЗІюАТОВЕРНОККЇ | 5 | - | - 50-ККК
КБ |КККкІМУЗКоОУпТООсЕЗНККК | Мо | - /! - кб |КККІМУВІКУТОССЕЗНКККЇ / | Мо | - ! -
К7 |КККІМУВІОКТОССЕЗНККК | Мо | - /! - ке |КККІМУВІОМТКОССЕЗНККК.Ї З | Мо | - ЇЇ -
50-ККК
Т-клітинні лінії людських РВМС (Приклад 5)
Моноцити периферичної крові (РВМС) здорових донорів або пацієнтів із хворобою Грейвса виділяють (Нізіорадце-1077, Бідпа-АїЇдгіс!) і заморожують аліквотами. У день 0, клітини розморожують, і 105 РВМС/мл культивують з 20 мкг/мл пептиду в доповненому (10 мМ НЕРЕЗ5, 50 од./мл пеніцилін/стрептоміцину і 4 мМ Г-глутаміну (Гопга)) КРМІ 1640 (Гопга) з 5 96 АВ сироваткою (5бідта Аїагісп), доданою в б-ямковий планшет (Сгеїпег Віо-опе), і інкубують при 3726 і 595 СО». Через 7 днів пп -2 (КО Зузіетв5) додають до кінцевої концентрації 20 од./мл.
На 12 день клітини збирають, промивають і знову повертають у культуру при концентрації 10542х106 нових розморожених опромінених аутологусних РВМС5/мл у 6 ямковому планшеті, стимульованих 5-10 мкг/мл пептиду і 20 од./мл гПІІ--2. У дні 15, 18 і 21 додають додатково гпІ/-2 до кінцевої концентрації 20 од./мл.
У день 24 клітини збирають, промивають і 2х107 культивують у 96-ямковому круглодонному планшеті (СеїЇєїаг, згеїпег Віо пе) з 105 опроміненими аутологусними РВМС і
МАМУ/ВМ14/МОАК людською клітинною лінією, експресуючою людські молекули МНС класу ЇЇ (Іпегпайопа! Ніз(осоптрайрійу Умогкіпд Сгоир, Зеаше, 05), у доповненому КРМІж5 95 АВ сироваткою в присутності різних антигенів (пептиди, білок) у концентраціях 5-50 мкг/мл.
Культури інкубують протягом 48 годин з 0,5 мкККюрі/ямку ЗН-тимідину (Регткіп ЕЇІтег), доданого в останні 18 годин. Після заморожування планшетів клітини збирають і зчитують значення, використовуючи ДВ-лічильник (УмМаїас 1450 Місгореба Тгйих) для оцінки проліферації. Перед додаванням ЗН-тимідину відбирають 60 мкл/ямку клітинних культур для аналізу цитокінів.
ЕИЗА ІЕМ-гамма
Надосадові рідини ТСІ -культур оцінюють по вмісту ІЕМ-гамма, використовуючи набір Нитап
ІЕМ-датта Юиозеї Кї, КО Зузіетв, відповідно до інструкцій виготовлювачів. Оптичну густину вимірюють на довжині хвилі 450 нм (Тесап Вепеих).
Усі публікації, згадані в наведеному вище описі, включені в опис по посиланню. Різні модифікації і варіації розкритих способів і систем даного винаходу будуть очевидні фахівцям у даній галузі, не виходячи за рамки обсягу і суті винаходу. Хоча даний винахід був розкритий у зв'язку з конкретними переважними варіантами, потрібно розуміти, що даний винахід у тому вигляді, як він заявлений, не слід несправедливо обмежувати такими конкретними варіантами.
У дійсності, різні модифікації розкритих способів здійснення винаходу, що очевидні фахівцям у молекулярній біології, імунології або споріднених областях, повинні бути включені в обсяг наведеної формули винаходу.
СПИСОК ПОСЛІДОВНОСТЕЙ
«1105 Аріборе Іпресгпасіопа1! МУ «1205 ПЕПТИДИ «1305 РІОО537РСТ «1405 РСТ/ІВ20О14/063739 «1415» 2014-08-06 «1505 со81314052.0 «1515 2013-08-06 «1605 134 «1705 Варіант патенту 3.5 «2105 1
«2115 29 «212» РЕТ «213» Ношто варієпь «4005 1
І1е Бек Агкуд І1е Тук УМаї бек І1е Авр Уаії ТПпг Гей сбіп сбіп Гей сіц 1 5 10 15 зек Нів бек РіПе Туг Авп Гей бек пув Уа1! ТПкг Нів Пе 20 25 «2105 2 «2115 29 «212» РЕТ «213» Ношто варієпь «4005 2
Тем Агуд ТЕ Іїе Рго бек Нів Аза РібБе бек Авп Гей Рго АБп І1е 5ег 1 5 10 15
Акуд Ії1е Тук Уаї бек І1е Авр Уа1і ТПг Гей сбіп сіп Гец 20 25 «2105 З «2115 29 «212» РЕТ «213» Ношто варієпь
Зо «4005 З
ТП б1у Гей Ппув Меє Рібе Рго Авр Гей ТПг Гуз Уаї Тук бек ТПг Авр 1 5 10 15
З5
І1е Ррбе Ре І1е їец бій І1ї1е ТБг АвБр АБп Рго Туг Меє 20 25 «2105 4 «2115 12 «212» РЕТ «213» Ношто варієпь «4005 4
Тук Уа1 Бек Іїе Авр Уа! ТПг Гей сіп біп Тец с1ц 1 5 10 «2105 Мм5 «2115» 764 «212» РЕТ «213» Ношто варієпь «4005 5
Меє Агуд Рго Аїа Ар Гей Гец біп Гей Уаї Ггец Іец Іец Авр Гей Рго 1 5 10 15
Акуд Авр Гец сіу біу Меє с1у Сув бек Бек Рго Рго Сув біц Сув Нів 60 20 25 30 біп б1п бій Авр Рпе Агуд Уа1 ТПг Сув пув Авр І1е сбіп Агд І1е Рго 35 40 45 зек Гей Рго Рго бек ТПг біп ТПг Гей пув Гей Іїе сій ТПг Нів Іей 50 з9 бо
Акуд ТЕ Іїе Рго бек Нів Аза Рібе бек АвБп Гей Рго АвБп І1їе бБег Аг4д 65 70 75 80
І1їе Тук Уаї бек І1е Авр Уаі ТБг Іїецй сбіп сбіп Гей бій бек Нів 5ег 85 90 95
Рпе Тукг Авп о Тец бек Гув Уаії ТПгЕ Ні І1е бій І1ї1е Агд АвБп ТПг Агд 100 105 110
Авп оГецй ТПг Туг І1е Авр Рго Авр Аїа Гей Ппув бій Гей Рго Іец Іей 115 120 125
Тпув Рпе Гей сіу Іїе Рпе Ап ТПг сіу Гей Ппув Меє Рібе Рго Авр Іей 130 135 140
ТПгЕ Ппув Уа1 Тук бек ТПг Авр І1е Рпе Робе І1е їец бій І1е ТПг Авр 145 150 155 160
АвБп оРго Тук Меє ТПг бек Іїе Рго Уаі Авп Аїа Робе сіп с1іу Геч Сув 165 170 175
Авп обі ТБ Гец ТП Тецй Гпув Гец Туг АБп Авп с1іу Рпе ТПг бек Уаї 180 185 190
Зо біп б1у Тук Аза Рпе Авп сіу ТПг Ппув Гей Авр Аїа Уаї Тукг Гей Авп 195 200 205
Тув Авп оГув Тук Гей ТпПг Уаі1 Іїе Авр Гпув Авр Аза Рібе сСіу сС1і1у Уаї 210 215 220
Тук Бек сіу Рго бек Гец Іец Авр Уаї бек біп ТПг бек Уаї ТПг Аїа 225 230 235 240
Пес Рго бек Ппув с1у Гей бій Нів Гей Ппув бій Гей І1е Аза Агд Авп 245 250 255
ТПЕ Тер ТПг Гей пуб пуб Тецй Рго Гей бек Гец бек РпПе Іец Нів Іецй 260 265 270
ТПгЕ Агуд Аза Авр Гец бек Тук Рго бек Нів Сув Сув Азї1а Рпе Гув Авп 275 280 285 біп гув Гпув Іїе Агуд с1іу Іїе Гей сі Бек Гешй Меє Сув Авп біц 5ег 290 295 300 зек Меє біп бек ІТец Агуд біп Агд Гу бек Уаі Авп Аїа Гей Авп бег 305 310 315 320
Рго Гей Нів біп сбіц Тук бій бій Авп Гей сб1іу Авр бек І1е Уа1 01Уу 325 330 335
Тук Ппув бій Ппув бек Ппув Робе сбіп Авр ТПг Нібв АвБп АБп Аза Нів Туг 340 345 350 60
Тук Уаі1і Рпе Рбе сіц біц біп сій Авр біц І1е І1е с1у Рпе сС1у сіп
355 3З6о 365 біц Гешп Гпув Авп Рго біп бій бі ТПг Гей сбіп Аза Рібе Авр бек Нів 370 375 380
Тук Авр Тук ТПг Іїе Сув б1у Авр бек біц Авр Меє Уаї Сув ТПг Рго 385 390 395 400
Ппув век Авр бій Рпе Авп Рго Сув бій Авр Іїе Меє сіу Тук Ггув РБПе 405 410 415
Тец Агуд І1е Уаі Уа1і Тер Рпе Уаії Бек Гей Гей Аза Гей Гец С1у Авп 420 425 430
Уа1ї1 Рре Уаї Гей Гей Іїе Гей Іїей ТПг бек Нів Тук Гув Гей Авп Уаї 435 440 445
Рго Акд РібПе Іїец Меє Сув Авп їец Аїа Рпе А1ї1а Авр Рпе Сув Меє Щ1У 450 455 460
Мен Тук гей гей Ггец І1їе Аза Бек Уа1і1 Авр Гец Туг ТПг Нів бек сі1ц 465 470 475 480
Тук Тук Авп Нів Аза І1е АвБр Тер сбіп ТПг б1іу Рго б1у Сув АБп ТПг 485 490 495
А1їа сі1у Ріпе Рбе ТПг Уаії Рпе Аїа бек бій Гей бек Уа1і Тук ТПг Ієц 500 505 510
Зо ТПгЕ Маії Іїе ТБг ІТей сбіц Агуд Тгр Туг Аїа І1ї1е ТПг Рпбе Аїа Меє Агд 515 520 525
Тец Авр Агуд Гпув Іїе Агд Гей Агуд Нів Аїа Сув Аза І1їе Меє Уаі с01У 530 535 540
З5 сб1у Тер Маї Сув Сув Рпе Гей Гей Аїа Гей Гей Рго Гец Уаї сС1у І1е 545 550 555 560 зек бек Туг Аїа пуб УМаї бек І1е Сув Гей Рго Меє Авр ТПг сій ТЕГ 565 570 575
Рго Гец Аїа Іїец Аза Тук І1їе Уаі! Рбпе Уаї Гей ТПг Гей А5п І1їе Уаї 580 585 590
А1їа Рпе Уаії Іїе Уаї Сув Сув Сув Тук Уа1! Гуз Іїе Тук І1е ТіПг Уаї 595 бо 605
Акуд АвпоРго біп Туг АвБп о Рго біу Авр Гув Авр ТПг пув І1е А1їа Гу 610 615 620
Акуд Меє Аїа Уаї Іецшц І1ї1е Рпе ТПг Авр Рпе І1е Сув Меє Аїа Рго І1е 625 630 635 640 зек Рпе Тут Аїа Іец бек Аза І1е ІТец АвБп о Гув Рго Гец І1е ТПг Уаї 645 650 655 зек Авп бек Тув І1е Іїецп Гей Уаії Іецй Рпе Туг Рго Гей Авп бек Сув 6бво 665 670 (516) А1Та Авп Ркго Рібе Гей Тук Аїа І1їе Рпе ТБг Гуз Аза Рбе сб1іп Агд Авр 675 68 685
Уаї Рпе Іїе Гей Гей бек пув Рпе сіу Іїе Сув Гув Агд бі1іп Аза сіп 690 695 700
А1тїа Тук Акуд біу біп Агуд Маі Рго Ркго пуб Авп бек ТПг АвБр І1е сіп 705 710 715 720
Ууаї біп пув Уа1і! ТПкг Нів Авр Меє Агкуд сіп сбіу Гец Ні АвБп Меє сіци 725 730 735
Авр Уа1 Тук біц Іїец І1е бій Авп бек Нів Гей ТПг Рго пуб пув біп 740 745 750 сбі1у бі1іп І1е Бек бій бі Тук Меє сіп ТПг Уаі1ї ГІец 755 760 «2105 6 «2115 15 «212» РЕТ «213» Ношто зарієпв «4005 6
І1е бек Агуд І1е Тук Уаї бек І1е Авр Уаї ТПг Гей сбіп сіп ГІец 1 в) 10 15 «2105 7 «2115 15 «212» РЕТ
Зо «213» Ното варієпз «4005 7 зек Агуд І1е Туг Уаії бек Іїе Авр Уа! ТПг Гей сбіп сбіп Гей с1іц
З5 1 в) 10 15 «2105 8 «2115 15 «212» РЕТ «213» Ношто зарієпв «4005 8
Акуд І1е Тук Уаії бек І1їе Авр Уа! ТПг Іецй біп сіп Гей сій б5ег 1 в) 10 15 «2105 19 «2115 15 «212» РЕТ «213» Ното варієпз «4005 9
ІТ1е Тук Уаї бек І1е Авр Уаі! ТПг Іец біп бі1іп Гей сій Бек Нів 1 в) 10 15 «2105 10 «2115 15 «212» РЕТ (516) «213» Ното варієпз
«4005 10
Тук Уа1 Бек Іїе Авр Уа! ТПг Іец біп сбіп Гей бій Бек Нів бег 1 5 10 15 «2105 11 «2115 15 «212» РЕТ «213» Ношто варієпь «4005 11
Уаї бек І1їе Авр Уа1 ТПг Гей біп біп Гей сіц бек Нів бек РБПе 1 5 10 15 «2105 12 «2115 21 «212» РЕТ «2135 Штучна послідовність «2205 «223» тТе5НЕ пептидний варіант «4005 12
Тпув Кпув б1у Іїе Тук Уа1 Бек Іїе Авр Уа1і ТПг Гей сіп сбіп Тец сій 1 5 10 15 зек Нів сі1у пув Гув
Зо 20 «2105 13 «2115 21 «212» РЕТ «2135 Штучна послідовність «2205 «223» тТе5НЕ пептидний варіант «4005 13
Тпув Кпув бі1у Тук Уаії Бек Іїе Авр Уаі ТПг Гей сбіп сіп Гец сіц 5ег 1 5 10 15
Нів бек с1у Ппув Тув 20 «2105 14 «2115 21 «2125 РЕТ «2135 Штучна послідовність «2205 «223» тТе5НЕ пептидний варіант «4005 14
Туз Кпув сіу Уаії Бек Іїе Авр Уаі ТПг Гей сбіп сбіп Гец біц бек Нів 1 5 10 15 60 зек Рпе с1і1у пув Гув
«2105 15 «2115 15 «2125 РЕТ «213» Ношто варієпь «4005 15 век Авп Гей Рго АБп о І1е бек Агуд І1їе Туг Уаї бек Іїе Авр Уаї1! 1 5 10 15 «2105 16 «2115 21 «212» РЕТ «2135 Штучна послідовність «220» «223» тТе5НЕ пептидний варіант «4005 16
Тпув Кпув біу Бек Авп Гей Рго АвБп Іїе Бек Агуд І1їе Тукг Уаї бек І1е 1 5 10 15
Авр Уа1 с1у Ппув ГПув 20 «2105 17
Зо «2115 15 «212» РЕТ «213» Ношто варієпь «4005 17
З5
ТП б1у Гей Ппув Месє Рібе Рго Авр Гец ТПг Туз Уаї Тук бек ТПг 1 5 10 15 «2105 18 «2115 15 «212» РЕТ «213» Ношто варієпь «4005 18 сб1у Гешп Ппув Меє Рпе Рго Авр Гей ТПг Ппув Уа1 Тук бек ТПг Авр 1 5 10 15 «2105 19 «2115 15 «212» РЕТ «213» Ношто варієпь «4005 19
Тецшп Гпув Меє Рпе Рго Авр Гей ТПг пуб Уа1 Тук бек ТіПг АвБр І1е 1 5 10 15 «2105 20 60 «2115 15 «212» РЕТ
«213» Ношто варієпь «4005 20 пув Меє Рре Рго Ар Тей ТПг Гуз Уаї Тук бек ТПг Авр І1е РБГе 1 5 10 15 «2105 21 «2115 21 «212» РЕТ «2135 Штучна послідовність «2205 «223» тТе5НЕ пептидний варіант «4005 21
Туз Кпув Гув Іїе Тук Уа1 Бек Іїе Авр Уа1і ТПг Гей сіп сбіп Тец сій 1 5 10 15 зек Нів пув пув ТГув 20 «2105 22 «2115 21 «212» РЕТ «2135 Штучна послідовність «2205
Зо «223» тТ85НВ пептидний варіант «4005 щД 22
Тпув Кпув б1у Ппув Тук Уа1 Бек Іїе Авр Уа1і ТПг Гей сіп сбіп Тец сій 1 в) 10 15 зек Нів сі1у пув Гув 20 «2105 23 «2115 21 «212» РЕТ «2135 Штучна послідовність «2205 «223» тТе5НЕ пептидний варіант «4005 23 пув Ппув б1у Іїе Ппув Уа1ї бек Іїе Авр Уа! ТПг Гей сбіп сбіп Гей сі 1 5 10 15 зек Нів сі1у пув Гув 20 «2105 24 «2115 21 «212» РЕТ «2135 Штучна послідовність 60 «2205
«223» тТе5НЕ пептидний варіант «4005 24 пув Ппув б1у Іїе Тук Пув бек І1їе Авр Уаі ТПг Іецй сбіп сбіп Гей сі 1 5 10 15 зек Нів сі1у пув Гув 20 «2105 25 «2115 21 «212» РЕТ «2135 Штучна послідовність «2205 «223» тТе5НЕ пептидний варіант «4005 25
Тпув Кпув б1у Іїе Тук Уа1 Бек Іїе Авр Уа1і Ппув Гей сіп біп Тец сій 1 5 10 15 зек Нів сі1у пув Гув 20 «2105 26 «2115 21 «212» РЕТ «2135 Штучна послідовність «2205 «223» тТе5НЕ пептидний варіант «4005 26
Тпув Кпув б1у Іїе Тук Уа1 Бек Іїе Авр Уа1і ТПг Гей сіп Пув ІТец бій 1 5 10 15 зек Нів с1у Пув Гув 20 «2105 27 «2115 21 «212» РЕТ «2135 Штучна послідовність «2205 «223» тТе5НЕ пептидний варіант «4005 Д 27
Тпув Кпув б1у Іїе Тук Уа1 Бек Іїе Авр Уаі ТПг Гей сіп біп Гпув б1іц 1 5 10 15 зек Нів сі1у пув Гув 20 «2105 28 бо «2115 21 «212» РЕТ
Зо
«2135 Штучна послідовність «223» тТе5НЕ пептидний варіант «4005 28
Туз Кпув с1у Іїе Тук Уа1 бек Іїе Авр Уа1 ТПг Ггец біп сіп Іецй Гув 1 5 10 15 зек Нів сі1у пув Гув 20 «2105 29 «2115 21 «212» РЕТ «2135 Штучна послідовність «2205 «223» тТе5НЕ пептидний варіант «4005 29
Тпув Кпув б1у Іїе Тук Уа1 Бек Іїе Авр Уа1і ТПг Гей сіп сбіп Тец сій 1 в) 10 15 пув Нів с1Уу Ппув Гув 20
Зо «2105 30 «2115 21 «212» РЕТ «2135 Штучна послідовність «2205 «223» тТе5НЕ пептидний варіант «4005 30 пув Ппув б1у Іїе Тук Уа1ї бек Іїе Авр Уа! ТПг Гей сбіп сб1іп Ге сі1ц 1 5 10 15 зек Мпув с1у пув Гув 20 «2105 31 «2115 18 «212» РЕТ «2135 Штучна послідовність «2205 «223» тТе5НЕ пептидний варіант «4005 31
Тпув Кпув бі1у Тук Уа1і Бек Іїе Авр Уаі ТПг Гей сбіп сіп Гец сбіц с1Уу 1 5 10 15
Тув Гув 60
«2105 32 «2115 18 «212» РЕТ «2135 Штучна послідовність «2205 «223» тТе5НЕ пептидний варіант «4005 32
Тпув Кпув бі1у Тук Уа1і Бек Іїе Авр Уаі Гпув Гей сбіп сіп Гец сбіц с1Уу 1 5 10 15
Тув Гув «2105 33 «2115 18 «212» РЕТ «2135 Штучна послідовність «2205 «223» тТе5НЕ пептидний варіант «4005 33
Тпув Кпув бі1у Тук Уа1і Бек Іїе Авр Уаі ТПг Гей сбіп пув Гец сбіц с1Уу 1 5 10 15
Зо пув Гув «2105 34 «2115 18 «2125 РЕТ «2135 Штучна послідовність «2205 «223» тТе5НЕ пептидний варіант «4005 34
Тпув Кпув бі1у Тук Уа1і Бек Іїе Авр Уаі ТПг Гей сбіп сіп ув біц с01Уу 1 5 10 15
Тув Гув «2105 35 «2115 18 «212» РЕТ «2135 Штучна послідовність «2205 «223» тТ85НВ пептидний варіант «4005 35
Тпув Кпув бі1у Тук Уа1і Бек Іїе Авр Уаі Ппув Гей біп пув пув біц с1Уу (516) 1 в) 10 15
Тув Гув «2105 36 «2115 19 «212» РЕТ «2135 Штучна послідовність «2205 «223» тТе5НЕ пептидний варіант «4005 36
Тпув Кпув б1у Іїе Тук Уа1 Бек Іїе Авр Уа1і ТПг Гей сіп сбіп Тец сій 1 в) 10 15 с1у Гув Гув «2105 37 «2115 19 «212» РЕТ «2135 Штучна послідовність «2205 «223» тТе5НЕ пептидний варіант «4005 37
Зо пув Ппув б1у Іїе Тук Уа1ї бек Іїе Авр Уаії Ппув Гей біп сб1іп Ге сі1ц 1 5 10 15 с1у Гув Гув
З5 «2105 38 «2115 19 «212» РЕТ «2135 Штучна послідовність «2205 «223» тТе5НЕ пептидний варіант «4005 38
Тпув Кпув б1у Іїе Тук Уа1 Бек Іїе Авр Уа1і ТПг Гей сіп Пув ІТец бій 1 5 10 15 с1у Гув Гув «2105 39 «2115 19 «212» РЕТ «2135 Штучна послідовність «2205 «223» тТе5НЕ пептидний варіант бо «4005 39
Тпув Кпув б1у Іїе Тук Уа1 Бек Іїе Авр Уаі ТПг Гей сіп біп Гпув б1іц 1 5 10 15 с1у Гув Гув «2105 40 «2115 19 «212» РЕТ «2135 Штучна послідовність «2205 «223» тТе5НЕ пептидний варіант «4005 40
Тпув Кпув б1у Іїе Тук Уа1 Бек Іїе Авр Уаі Ппув Гей сіп пув Гув с1и 1 5 10 15 с1у Ппув Гув «2105 41 «2115 19 «212» РЕТ «2135 Штучна послідовність «2205 «223» тТе5НЕ пептидний варіант
Зо «4005 41
Тпув Кпув б1у ТПг Тук Уа1 Бек Іїе Авр Уаі ТПг Ггец біп сб1п Теп Сс1ци 1 5 10 15
З5 с1у Гув Гув «2105 42 «2115 19 «212» РЕТ «2135 Штучна послідовність «2205 «223» тТе5НЕ пептидний варіант «4005 42
Тпув Кпув бі1у ТПг Тук Уа1 Бек Іїе Авр Уаї пуб Іец біп сб1п Теп с1ци 1 в) 10 15 с1у Гув Гув «2105 43 «2115 19 «212» РЕТ «2135 Штучна послідовність бо «2205 «223» тТе5НЕ пептидний варіант
«4005 43
Тпув Кпув бі1у ТПг Тук Уа1 Бек Іїе Авр Уа! ТПг Іец біп Гув Те с1ци 1 в) 10 15 с1у Гув Гув «2105 44 «2115 19 «212» РЕТ «2135 Штучна послідовність «2205 «223» тТе5НЕ пептидний варіант «4005 44 пув Ппув б1у ТПг Тук Уа1ї бек І1їе Авр Уа! ТПг Гей біп сб1іп Гуз сі1ц 1 5 10 15 с1у Гув Гув «2105 45 «2115 19 «212» РЕТ «2135 Штучна послідовність
Зо «2205 «223» тТе5НЕ пептидний варіант «4005 45
З5
Тпув Кпув бі1у ТПг Тук Уа1 Бек Іїе Авр Уа1і Ппув Гей сіп Пув пув б1іц 1 5 10 15 с1у Гув Гув 40 «2105 46 «2115 21 «212» РЕТ 45 «2135 Штучна послідовність «2205 «223» тТе5НЕ пептидний варіант 50 «4005 46
Туз Кпув Кпув Ппув Тук Уа1 Бек Іїе Авр Уа1і ТПг Гей сіп біп Тец сій 1 5 10 15 55 зек Нів Пув Пув Гув 20 «2105 47 «2115 21 бо «2125 РЕТ «2135 Штучна послідовність
«223» тТе5НЕ пептидний варіант «4005 47
Туз Кпув Гув Іїе Ппув Уа1 бек Іїе Авр Уа1і ТПг Гей сіп сбіп Тец сій 1 5 10 15 зек Нів Пув Пув Гув 20 «2105 48 «2115 21 «212» РЕТ «2135 Штучна послідовність «2205 «223» тТе5НЕ пептидний варіант «4005 48
Туз Кпув Гув Іїе Тук Ппув Бек Іїе Авр Уа1і ТПг Гей сіп біп Тец сій 1 5 10 15 зек Нів пув пув ТГув 20 «2105 149
Зо «2115 21 «212» РЕТ «2135 Штучна послідовність «2205 «223» тТ85НВ пептидний варіант «4005 49
Туз Кпув Гув Іїе Тук Уа1 Гпув Іїе Авр Уаі ТПг Гей сіп біп Тец сій 1 в) 10 15 зек Нів пув пув ТГув 20 «2105 50 «2115 21 «212» РЕТ «2135 Штучна послідовність «2205 «223» тТе5НЕ пептидний варіант «4005 50 пув Ппув Ппув Іїе Тук Уа1ї бек Іїе Авр Уаії Ппув Гей біп сб1іп Ге сі1ц 1 5 10 15 зек Нів пув пув ТГув 20 60 «2105 51
Зб
«2115 21 «212» РЕТ «2135 Штучна послідовність «2205 «223» тТе5НЕ пептидний варіант «4005 ч406м51 пув Ппув Ппув Іїе Тук Уа1ї бек Іїе Авр Уа! ТПг Гей пув біп Ге сі1ц 1 5 10 15 зек Нів пув пув ТГув 20 «2105 52 «2115 21 «212» РЕТ «2135 Штучна послідовність «2205 «223» тТе5НЕ пептидний варіант «4005 Д 52
Туз Кпув Гув Іїе Тук Уа1 Бек Іїе Авр Уа1і ТПг Гей сіп Пув ІТец бій 1 5 10 15 зек Нів пув пув ТГув
Зо 20 «2105 53 «2115 21 «212» РЕТ «2135 Штучна послідовність «2205 «223» тТе5НЕ пептидний варіант «4005 53
Туз Кпув Гув Іїе Тук Уа1 Бек Іїе Авр Уаі ТПг Гей сіп біп Гпув б1іц 1 5 10 15 зек Нів Пув Пув Гув 20 «2105 ч54 «2115 21 «2125 РЕТ «2135 Штучна послідовність «2205 «223» тТе5НЕ пептидний варіант «4005 54
Туз Кпув Кпув Іїе Тук Уа1 бек Іїе Авр Уа1і ТПг Іец біп сіп Гей Гув 1 5 10 15 60 зек Нів пув пув ТГув
«2105 щМО55 «2115 21 «2125 РЕТ «2135 Штучна послідовність «2205 «223» тТе5НЕ пептидний варіант «4005 5:55
Туз Кпув Гув Іїе Тук Уа1 Бек Іїе Авр Уа! ТіПг Іец біп сб1п Гей Сс1ци 1 5 10 15 пув Нів Ппув Ппув Гув «2105 56 20 «2115 21 «212» РЕТ «2135 Штучна послідовність «2205 «223» тТе5НЕ пептидний варіант «4005 МЯ56
Туз Кпув Гув Іїе Тук Уа1 Бек Іїе Авр Уа1і ТПг Гей сіп сбіп Тец сій
Зо 1 в) 10 15 зек Ггув пув Гув Гув 20 «2105 157 «2115 18 «212» РЕТ «2135 Штучна послідовність «2205 «223» тТе5НЕ пептидний варіант «4005 57 пув Ппув Ппув Тук Уаії бек І1їе Авр Уаї ТПг Гей сіп біп Тецп бі Гув 1 5 10 15
Тув Гув «2105 58 «2115 18 «212» РЕТ «2135 Штучна послідовність «2205 «223» тТе5НЕ пептидний варіант «4005 58 60
Туз Кпув Кпув Тук Уа1і Бек Іїе Авр Уаі Ппув Гей сбіп біп Тец б1іц Гув
1 5 10 15
Тув Гув «2105 59 «2115 18 «212» РЕТ «2135 Штучна послідовність «2205 «223» тТе5НЕ пептидний варіант «4005 59
Туз Кпув Кпув Тук Уа1і Бек Іїе Авр Уаі ТПг Гей сіп пув ІТец б1іц Гув 1 5 10 15
Тув Гув «2105 60 «2115 18 «212» РЕТ «2135 Штучна послідовність «2205 «223» тТе5НЕ пептидний варіант
Зо «4005 60
Туз Кпув Кпув Тук Уа1і Бек Іїе Авр Уаі ТПг Гей сбіп біп ув б1іц Гув 1 5 10 15 пув Гув «2105 61 «2115 18 «212» РЕТ «2135 Штучна послідовність «2205 «223» тТе5НЕ пептидний варіант «4005 61
Туз Кпув Кпув Тук Уа1і Бек Іїе Авр Уаі Ппув Гей сіп пув Гув б1іц Гув 1 5 10 15
Тув Гув «2105 562 «2115 15 «212» РЕТ «213» Ношто варієпь «4005 62 60
Авп оГецй Рго АвБп о І1е бек Агуд І1е Туг Уаії бек Іїе Авр Уа1 ТЕГ
1 5 10 15 «2105 563 «2115 21 «2125 РЕТ «2135 Штучна послідовність «220» «223» тТе5НЕ пептидний варіант «4005 63
Тпув Кпув б1у Авп Гей Рго Ап І1е бБег Агуд І1е Туг Уаії бек І1е Авр 1 5 10 15
Уаї ТпПгЕ с1у Ппув Гув «2105 64 20 «2115 28 «212» РЕТ «213» Ношто варієпь «4005 64
Тецп ТПпкг Гей пув Гей Туг Авп Авп сіу Рпе ТПг бек Уаі біп с1у Туг 1 5 10 15
Аза Рпе Авп сбіу ТПг Гув Гей Авр Аза Уаї Тукг Іец
Зо 20 25 «2105 65 «2115 15 «212» РЕТ «213» Ното варієпз «4005 65
Тецп ТПпкг Гей Ппув Гей Туг Авп Авп с1іу Рпе ТПг бек Уаї сбіп с01Уу 1 в) 10 15 «2105 6б66 «2115 15 «212» РЕТ «213» Ношто зарієпв «4005 66
ТПЕ гей пув Гей Туг Авп АвБп о сіу Рпе ТПг бек Уаі біп с1у Туг 1 в) 10 15 «2105 67 «2115 21 «212» РЕТ «213» Ното варієпз «4005 67
Туз Кпув Кпув ТпПг Гей Ппув Гей Туг Авп Авп сіу Ропе ТПг бек Уа1ї сіп 60 1 в) 10 15 сб1у Тук Ппув Пув Гув «2105 68 «2115 15 «212» РЕТ «213» Ношто варієпь «4005 68 теп Ггув Гей Туг Авп Авп сіу Рпе ТПг бек Уа1! сіп сіу Туг А1а 1 5 10 15 «2105 659 «2115 15 «212» РЕТ «213» Ношто варієпь «4005 69
Тув Гей Тук Авп Авп сіу Рібе ТПг бек Уаі1і сіп сіу Туг Аза РБПе 1 5 10 15 «2105 70 «2115 15 «212» РЕТ «213» Ношто варієпь «4005 70
Зо
Тецп Тук Авп Авп с1іу Рпе ТПг бек Уаі сбіп с1іу Туг Аїа Рпе Авп 1 5 10 15 «2105 71 «2115 15 «212» РЕТ «213» Ношто варієпь «4005 71
Тук Авп Авп о сіу РіПе ТПг бек Уа1 сіп сіу Ту Аї1а Рпбе АБп щ1У 1 5 10 15 «2105 72 «2115 15 «212» РЕТ «213» Ношто варієпь «4005 72
Авп о Авп осіу Роре ТПг бек Уаії біп сб1у Тук Аїа Рпе А5Бп с1у ТЕГ 1 5 10 15 «2105 73 «2115 15 «212» РЕТ «213» Ношто варієпь «4005 73 60
Ап осіу Рпе ТПг бек Уаі біп сіу Туг Аїа Рпе АБп с1іу ТПг Гув
А
1 5 10 15 «2105 74 «2115 15 «2125 РЕТ «213» Ношто варієпь «4005 74 сі1у Рре ТПг бек Уаі біп с1у Тук Аїа Рпбе Авп с1у ТПг ГПув Гей 1 5 10 15 «2105 175 «2115 15 «212» РЕТ «213» Ношто варієпь «4005 75
Рпе ТПг бек Уаії сбіп сіу Туг Аїа Рібе Авп о с1і1у ТПКг Гпув Течй Авр 1 5 10 15 «2105 76 «2115 15 «212» РЕТ «213» Ношто варієпь «4005 76
Зо ТПг Бек Уаі сбіп сб1у Тук Аза Рпбе Авп сіу ТПг Гуз Гей Авр Аїа 1 5 10 15 «2105 177 «2115 15 «2125 РЕТ «213» Ношто варієпь «4005 77 зек Уаі біп сб1у Ту Аїа Рбе Авп сбі1у ТПКг Ппув Гей Авр Аїа Уаї 1 5 10 15 «2105 78 «2115 15 «212» РЕТ «213» Ношто варієпь «4005 78
Уаї б1іп сіу Тук Аїа Рбе АвБп о сбіу ТПг Ппув Гей Авр Аїа Уаї Туг 1 5 10 15 «2105 79 «2115 29 «2125 РЕТ «213» Ношто варієпь «4005 79 (516) сіу бі1у Месє с1у Сув бек бек Ркго Рго Сув біц Сув Нів біп сбіц сі1ц 1 5 10 15
Авр Рпе Акуд Уаі ТПг Сув Гув Авр І1е біп Агуд І1е Рго 20 25 «2105 80 «2115 30 «212» РЕТ «213» Ношто варієпь «4005 80 бі бій Авр Рпе Агуд Уа1і ТПг Сув Ппув Авр І1їе сіп Агуд І1е Рго 5ег 1 5 10 15
Тем Рго Рго бек ТПг біп ТПг Тейп Гуз Гей Іїе сій Тік Нів «2105 81 «2115 30 20 «212» РЕТ «213» Ношто варієпь «4005 81 25 зек Гей Ркго Рго бек ТПг сіп ТПг Гей Гуз Тей І1е сій ТПг Нів Іецй 1 5 10 15
Акуд ТЕ Іїе Рго бек Нібв Аза Рібе бБег АвБп Тецй Рго АБп Пе 20 25 30
Зо «2105 82 «2115 29 «212» РЕТ «213» Ношто варієпь
З5 «4005 82 біц бек Нів Бек Рпе Туг Авп Гей бек пув Уа! ТПг Ні І1е сій Ше 1 5 10 15
Акуд Авп оТВг Агуд АвБп оТецй ТПг Туг І1е АБр Рго АБр Аїа 20 25 «2105 83 «2115 29 «212» РЕТ «213» Ношто варієпь «4005 83 бі І1е Акуд Авп ТПг Агуд Ап о Гей ТпПг Туг Іїе Авр Рго Авр Аїа Іей 1 5 10 15
Тпув бій Гей Рго Гей Гей Ппув Рпе Гей с1у Іїе Ропе Авп 20 25 «2105 84 «2115 29 «212» РЕТ (516) «213» Ното варієпз
«4005 84
Тешц Ггув біц Гей Рго Гей Гей Гпув Рпе Гей с1іу Іїе Робе Авп ТПг 01Уу 1 5 10 15
Тецшп Гпув Меє Рпе Рго Авр Гей ТПг пув Уа1і Тук Бек ТЕГ 20 25 «2105 85 «2115 30 «212» РЕТ «213» Ношто варієпь «4005 85
ТПгЕ Авр Іїе Рпе Рбе І1ї1е їецшц сій І1їе ТБг АвБр АвБп Рго Туг Меє ТПг 1 5 10 15 зек І1їе Рго Уаі АБп Аї1а Рпе сіп б1у Гей Сув АБп бій ТЕГ 20 25 30 «2105 86 «2115 28 «212» РЕТ «213» Ношто зарієпв «4005 86
ТПг Бек Іїе Рго Уаі Авп Аїа Рбе сіп сіу Гец Суб Авп бій ТПг Гей
Зо 1 в) 10 15
ТПЕ гей Гпув Гей Туг Авп АвБп о сіу РібПе ТПг бек Уаї 20 25 «2105 87 «2115 28 «212» РЕТ «213» Ношто варієпь «4005 87 біп б1у Тук Аза Рпе Авп сіу ТПг Ппув Гей Авр Аїа Уаї Тук Іеч Авп 1 5 10 15 пув Авп оПпув Тук Гей ТіПг Уаї І1їе Авр Гпу5 Авр Аїа 20 25 «2105 88 «2115 28 «2125 РЕТ «213» Ношто варієпь «4005 88
Авпопув Авп о Тув Туг Гей ТпПКг о Уаії Іїе Авр Гуз АвБр Аїа Рпе сС1іу с1Уу 1 5 10 15
Уаї Тук Бек с1іу Ркго Бек Гец Гей Авр Уаї бек біп 20 25 60 «2105 89
«2115 28 «212» РЕТ «213» Ношто варієпь «4005 89
Рпе сіу сіу Уа1ії Тук бек б1у Ркго бек ІТецй Гей Авр Уаі Бек біп ТПг 1 5 10 15 зек Уаі ТБг Аїа Гей Рго бек Ппув с1у Гїеч сій Нів 20 25 «2105 90 «2115 28 «212» РЕТ «213» Ношто варієпь «4005 90
ТПг Бек Уаії ТПг Аїа Гецй Рго бек Ппув с1у Гей бій Нів Ге Гпув с1и 1 5 10 15
Тец І1ї1е Аза Агуд Авп ТПг Тер ТпПс Гей пув Гпув ГІец 20 25 «2105 91 «2115 28 «212» РЕТ «213» Ношто варієпь
Зо «4005 191
Те гув бій Гей Іїе Аїа Агуд АБвп ТПг Тер ТБпг Гей пуб пуб Іецй Рго 1 5 10 15
З5
Тецп бек Гей бек Рпе Гей Нів Гей ТПг Агд А1а АБр 20 25 «2105 92 «2115 28 «212» РЕТ «213» Ношто варієпь «4005 192
Ркго Гей бек ТІец бек Рпе Гей Нів Іец ТПг Агуд Аза Авр Гей бек Туг 1 5 10 15
Ркго Бек Нів Сув Сув А1ї1а Рпе Гу АвБп обіп Ппув Гув 20 25 «2105 93 «2115 28 «212» РЕТ «213» Ното варієпз «4005 193
Тецп бек Тук Рго Бек Нів Сув Сув Аза Рпе пув Авп о біп Пув Тув І1е 60 1 в) 10 15
Акуд с1у І1е Гец біц бек Гей Меє Сув АБп бій 5бег 20 25 «2105 194 «2115 28 «212» РЕТ «213» Ношто варієпь «4005 94
І1е Акуд сіу І1е Іец бій бек Гец Меє Сув Авп біц бек бек Меє сіп 1 5 10 15 зек Гей Агуд біп Агд Гув бек Уаі АвБп Аза Гей Авп «2105 195 «2115 29 «212» РЕТ 20 «213» Ношто зарієпв «4005 95 зек Меє біп бек ІТец Агуд біп Агд Гу бек Уаі Авп Аїа Гей Авп бег 25 1 в) 10 15
Рго Гец Нів біп біц Тук бій біц Авп Тец б1у Авр 5ег 20 25
Зо «2105 196 «2115 29 «212» РЕТ «213» Ношто варієпь «4005 96 зек Рго Пец Ні біп бій Тук біц б1іц АвБп Гей с1у Авр Бек Ії1їе Уаї 1 5 10 15 сіу Тук Ппув біш Ппув бек Пув Рбе біп АвБр ТПг Нів Авп 20 25 «2105 137 «2115 29 «212» РЕТ «213» Ношто варієпь «4005 97
Іїе Уа1і с1у Тук Ппув біц Ппув бек Пув Рбе біп Авр ТПг Нів Авп Авп 1 5 10 15
А1їа Нів Тук Тук Уаі Рпе Рпе біц біц біп б1цп Авр с1іц 20 25 «2105 198 «2115 29 «212» РЕТ «213» Ношто варієпь 60 «4005 98
Ап Аза Нів Туг Тук УМаі Рпе Рбе біц бій біп сій АвБр бій І1е Іе 1 5 10 15 с1у Рпе б1у біп бій Гей Пув Авп Рго біп біц сій Тбг 20 25 «2105 199 «2115 29 «212» РЕТ «213» Ношто варієпь «4005 99
Іїе Іїе с1у Рпбе с1у біп сій Геп пув Авп Рго біп бій сій ТБбг ТІецй 1 5 10 15 біп Аза Рпе Авр Бек Нів Туг Авр Туг ТПг І1ї1е Сув 01У 20 «2105 100 «2115 29 «212» РЕТ «213» Ношто варієпь 25 «4005 100
Тец біп Аза Рпе Авр бек Нів Туг Авр Тукг ТПг І1е Сув б1у Авр 5ег 1 5 10 15
Зо бі Авр Меє Уаї Сув ТПкг Рго Ппув Бек Авр бій Ропе Авп 20 25 «2105 101 «2115 27 «212» РЕТ «213» Ношто варієпь «4005 101
Авр Бек біц Авр Меє Уаї Сув ТПг Рго Гув Бек Авр бій Рпе Авп Рго 1 5 10 15
Сув б1п Авр ІчІ1їе Меє сіу Тук Ппув РПпе Гей Аг4д 20 25 «2105 102 «2115 29 «212» РЕТ «213» Ното варієпз «4005 102
Тпув Тецп Авр Аїа Уа1і Тук Гей Авп Ппув Авп о Гпув Тук Гей ТПг Уаї І1е 1 в) 10 15
Авр Гув Авр Аза Рпе сбі1у б1і1у Уаї Туг бек б1у Рго 5бег 20 25 60 «2105 103 «2115 15
«212» РЕТ «213» Ношто варієпь «4005 103 зек І1їе Авр Уаі! ТПг Іеп біп біп Тїец бій бек Нів Бек Рпе Туг 1 5 10 15 «2105 104 «2115 15 «212» РЕТ «213» Ношто варієпь «400» 104
І1е Авр Уаї ТПг Іец бі1іп біп Тїец бій бек Нів Бек Рпе Тукг Авп 1 5 10 15 «2105 105 «2115 15 «212» РЕТ «213» Ношто варієпь «4005 105
Авр Уа1 ТБПг Ггец біп біп Гей біц бек Нів Бек Рпе Туг Авп Іей 1 5 10 15 «2105» 106
Зо «2115 15 «212» РЕТ «213» Ношто варієпь «400» 106
З5
Уаї ТпПг Гей біп біп Гей сіц Бек Нів бек Рпе Туг Авп ГІец б5ег 1 5 10 15 «2105 107 «2115 15 «212» РЕТ «213» Ношто варієпь «4005 107
ТПЕ Гей біп біп Гец біц бек Нів бек РПе Туг Авп Гецп бек Гув 1 5 10 15 «2105 108 «2115 15 «212» РЕТ «213» Ношто варієпь «400» 108
Тецп біп біп Гей бій бек Нів Бек Рпе Туг Авп Гец бек Тув Уаї 1 5 10 15 «2105 109 60 «2115 15 «212» РЕТ
«213» Ношто варієпь «4005 109 сіп біп Гецп бій бек Нів бек РібПе Туг Авп Гей бек пув Уаї ТіПг 1 5 10 15 «2105 110 «2115 15 «212» РЕТ «213» Ношто варієпь «4005 110 сіп Гей біц бек Нів бек РіПе Туг Авп Гей бек Ппув Уа1! Тік Нів 1 5 10 15 «2105 111 «2115 15 «212» РЕТ «213» Ношто варієпь «4005 111
Пес бій бек Нів бек РібПе Туг Авп Гей бек Ппув Уа1! ТПг Нів Пе 1 5 10 15 «2105 112 «2115 21
Зо «2125 РЕТ «2135 Штучна послідовність «220» «223» тТе5НЕ пептидний варіант
З5 «4005 112
Тпув Кпув б1у Іїе Тук Уа1 Гпув Іїе Авр Уа1і ТПг Гей сіп біп Тец сій 1 5 10 15 зек Нів сі1у пув Гув 20 «2105 113 «2115 21 «212» РЕТ «2135 Штучна послідовність «220» «223» тТ85НВ пептидний варіант «4005 113
Тпув Кпув б1у Іїе Тук Уа1 Бек Ппув Авр Уаі ТПг Гей сіп біп Тец сій 1 в) 10 15 зек Нів сі1у пув Гув 20 60 «2105 114 «2115 21
«212» РЕТ «2135 Штучна послідовність «2205 «223» тТе5НЕ пептидний варіант «4005 114
Тпув Кпув б1у Іїе Тук Уа1 Бек Іїе Ппув Уа1і ТПг Гей сіп біп Тец с1ц 1 в) 10 15 зек Нів сі1у пув Гув 20 «2105» 115 «2115 21 «212» РЕТ «2135 Штучна послідовність «2205 «223» тТе5НЕ пептидний варіант «4005 115 пув Ппув б1у Іїе Тук Уа1ї бек Іїе Авр Ппув ТПг Гей біп сб1іп Ге сі1ц 1 5 10 15 зек Нів сі1у пув Гув 20
Зо «210» 116 «2115 21 «212» РЕТ «2135 Штучна послідовність
З5 «2205 «223» тТе5НЕ пептидний варіант «400» 116
Тпув Кпув б1у Іїе Тук Уа1 Бек Іїе Авр Уа1і ТПг Ппув біп біп Тец сій 1 5 10 15 зек Нів сі1у пув Гув 20 «2105 117 «2115 21 «212» РЕТ «2135 Штучна послідовність «2205 «223» тТе5НЕ пептидний варіант «4005 117
Тпув Кпув б1у Іїе Тук Уа1 Бек Іїе Авр Уа1і ТПг Гей пув біп Тец бій 1 5 10 15 (516) зек Нів с1у Пув Гув 20
«210» 118 «2115 21 «212» РЕТ «2135 Штучна послідовність «2205 «223» тТе5НЕ пептидний варіант «400» 118
Туз Кпув Гув Іїе Тук Уа1 Бек Гпув Авр Уаі ТПг Гей сіп сіп Те Сс1ци 1 5 10 15 зек Нів Пув Пув Гув «2105 119 «2115 21 20 «212» РЕТ «2135 Штучна послідовність «2205 «223» тТе5НЕ пептидний варіант «4005 119
Туз Кпув Гув Іїе Тук Уа1 Бек Іїе пув Уаії ТБПг Іец біп сб1п Теп Сс1ци 1 5 10 15
Зо зек Нів пув пув ТГув 20 «2105 120 «2115 21 «212» РЕТ «2135 Штучна послідовність «2205 «223» тТе5НЕ пептидний варіант «4005 120
Туз Кпув Гув Іїе Тук Уа1 Бек Іїе Авр Гпув ТПг Гей сіп біп Тец сій 1 в) 10 15 зек Нів пув пув ТГув 20 «2105 121 «2115 21 «212» РЕТ «2135 Штучна послідовність «2205 «223» тТе5НЕ пептидний варіант «4005 121 (516) пув Ппув Ппув Іїе Тук Уа1ї бек Іїе Авр Уаі ТПг Ппув біп сб1іп Ге сі1ц 1 5 10 15 зек Нів пув пув ТГув «2105 122 «2115 15 «212» РЕТ «213» Ношто варієпь «4005 122
Тец Агкуд ТПг о І1їе Рго Бек Нів Аза Рпе бек Авп Гей Рго АБп І1е 1 5 10 15 «2105 123 «2115 15 «212» РЕТ «213» Ношто варієпь «4005 123
Акуд ТЕ І1ї1е Рго бек Нів Аза Рібе бек АвБп Гей Рго АБп І1е 5ег 1 5 10 15 «2105 124 «2115 15 «212» РЕТ «213» Ношто варієпь
Зо «4005 124
ТПгЕ Іїе Ркго бек Нів Аза Рібе бек Авп Гец Рго АБп І1е бег Аг4д 1 5 10 15
З5 «2105 125 «2115 15 «212» РЕТ «213» Ношто варієпь «4005 125
ІТ1е Рго бек Ні Аза Рпе бБег АвБп о Тецй Рго АБп І1їе бБег Агд Іе 1 5 10 15 «2105» 126 «2115 15 «212» РЕТ «213» Ношто варієпь «4005 126
Ркго Бек Нів Аза Ріпе бек АвБп о Тецй Рго АБп І1їе бБег Агуд І1е Туг 1 5 10 15 «2105 127 «2115 15 «212» РЕТ «213» Ношто варієпь 60 «4005 127 зек Нів Аза РіПе бек Авп Гей Рго АБп о І1е Бек Агуд І1їіе Тук Уаї 1 5 10 15 «2105 128 «2115 15 «212» РЕТ «213» Ношто варієпь «4005 128
Нів Аїа Рпе бек Авп о Гец Рго Авп І1е бБег Агуд І1е Тук Уаї 5ег 1 5 10 15 «2105 129 «2115 15 «212» РЕТ «213» Ношто варієпь «4005 129
Аза Рпе бек Авп о ТГец Рго АБп о І1е бБег Агуд І1е Тук Уаі бек Ше 1 5 10 15 «2105 130 «2115 15 «212» РЕТ «213» Ношто варієпь «4005 130
Зо
Рпе бек Авп о Тец Рго АБп о І1їе Бек Агуд Іїе Тукг Уаї бек І1е Авр 1 5 10 15 «2105 131 «2115 15 «212» РЕТ «213» Ношто варієпь «4005 131
Тецп Рго АвБп І1їе Бек Агуд Іїе Туг Уаі Бек Іїе Авр Уаї ТіПг Іей 1 5 10 15 «2105 132 «2115 15 «212» РЕТ «213» Ношто варієпь «4005 132
Рго Авп о І1е бБег Агуд І1е Туг Уаії бек І1їе Авр Уа1і ТПг Гец сіп 1 5 10 15 «2105 133 «2115 15 «212» РЕТ «213» Ношто варієпь «4005 133 60
Авп отІ1е бек Агуд І1е Тук Уаї бек І1е Авр Уаі ТПг Гей сіп сіп
1 5 10 15 «2105 134 «2115 21 «2125 РЕТ «2135 Штучна послідовність «220» «223» тТе5НЕ пептидний варіант «4005 134
Тпув Кпув б1у Іїе Тук Гей бек Іїе Авр Аїа ТПг Гей сіп Агд Іец бій 1 5 10 15
Рго Нів с1і1у пув ТГув
Claims (18)
1. Пептид, який здатний до зв'язування з молекулою МНС /лп уйго і може бути представлений Т- клітинам без процесингу антигену, який вибирають з наступних пептидів рецептора тиреотропного гормону (ТТГР): вМВ 50-ОКК: ККОІММ5ІОМТООГЕЗНОКК (ЗЕО ІЮ МО: 12), вМВ 50-ККК: КККІУУБІОМТСООГЕЗНККК (ЗЕО ІЮО МО: 21), АМВ 5Б-ЯИКК: ККОМУЗІОМТІ ОО ЕЗНЗОКК (5ЕО ІЮ МО: 13),
ЕМВ. 5А: ІЗКІУМБІЮМТІ ОО (5ЕО ІО МО: 6),
КМВ. 58: ЗКІУУ5ІОМТІ ОО Е (ЗЕО ІЮО МО: 7), КМВ 5сС: КІММ5БІОМТСООГЕЗ (5ЕО ІО МО: 8), Зо КМВ. 50: ІММ5БІОМТСООГЕЗН (5ЕО ІО МО: 9), АМВ 4К-ОКК: ККОМІСРМІЗАУУБІЮМТОКК (ЗЕО ІЮО МО: 63), АМВ 98: СГКМЕРОСТКМУЗТО (5ЕО ІЮ МО: 18), КМ 9сС: ГКМЕРОСТКМУ5ЗТОІ (5ЕО ІЮ МО: 19), вМВ 128-ККК: КИКТ КІУММОЕТМОСУККК (5ЕО І МО: 67).
2. Пептид, який здатний до зв'язування з молекулою МНС /лп уйго і може бути представлений Т- клітинам без процесингу антигену, який відрізняється тим, що пептид вибирають з наступної групи: ККОІУМБІОМТІ ФО ЕБНОКК (5ЕО ІО МО: 12), ККОКУМ5ІОМТІ СОГГЕЗНОКК (5ЕО ІЮ МО: 22), ККОІКМ5БІОМТІ ФО ЕБНОКК (5ЕО ІО МО: 23), ККОІУКБІОМТІ ФО ЕБНОКК (5ЕО ІО МО: 24), ККОІУМБІОМКІ ОО ЕЗНОКК (5ЕО ІО МО: 25), ККОІУМБІОМТ ОКГЕЗНОКК (5ЕО ІЮО МО: 26), ККОІУМБІОМТ ООКЕЗНОКК (5ЕО ІЮО МО: 27), ККОІУМБІЮОМТІ СОЇ КЗНОКК (ЗЕО ІО МО: 28), ККОІУМБІОМТІ ФО ЕКНОКК (5ЕО ІО МО: 29), ККОІУМ5ІОЮОМТІ ФО ЕБКОКК (5ЕО ІЮ МО: 30), ККОУМ5ІОЮОМТ СО ЕСКК (5ЕО ІО МО: 31), ККамуУБІВУКІ СО ЕСКК (5ЕО І МО: 32), ККОУМБІОМТГ ОК ЕСКК (5ЕО ІО МО: 33), ККОУМ5БІОМТ СООКЕСКК (5ЕО ІЮО МО: 34), ККОУМ5БІЮОМКІОККЕСКК (5ЕО ІЮ МО: 35), ККОІУМБІОЮОМТІ СОЇ ЕСКК (5ЕО ІЮ МО: 36), ККОІУМБІОМКІ ОО ЕСКК (5ЕО ІЮО МО: 37), ККОІУМБІОМТ ОКГЕСКК (5ЕО ІО МО: 38), ККаіїМУІОМТІ СООКЕСКК (ЗЕО ІЮ МО: 39), ККОІУМБІОМКГОККЕСКК (5ЕО ІЮ МО: 40), ККОТУМ5ІОЮОМТІ СО ЕСКК (ЗЕО ІЮ МО: 41), ККОТУМ5ІОМКІГ СОГЕСКК (ЗЕО ІО МО: 42), 60 ККОТУМ5ІЮОМТ ОК ЕСКК (5ЕО ІЮО МО: 43), ККОТУМ5ІЮМТІ СООКЕСКК (5ЕО ІО МО: 44),
ККОТУМ5ІОМУКГОККЕСКК (5ЕО ІО МО: 45), КККІУУМБІОМТІ ОО ЕЗНККК (5ЕО ІЮО МО: 21), ККККУМ5ІЮМТІ ОО ЕЗНККК (ЗЕО ІО МО: 46), КККІКМБІОМТІ СОЇ ЕЗНККК (5ЕО ІЮО МО: 47), КККІУКВІОМТІ ОО ЕЗНККК (5ЕО ІЮО МО: 48), КККІЖУУКІОМТІООГЕЗНККК (5ЕО ІЮО МО: 49), КККІУУМБІОМКГООЇ ЕЗНККК (ЗЕО ІО МО: 50), КККІММ5ІЮМТІ КОГГЕЗНККК (5ЕО ІО МО: 51), КККІМУМБІОМТГОКГЕЗНККК (5ЕО ІО МО: 52), КККІУУМБІОМТ ООКЕЗНККК (ЗЕО ІО МО: 53), КККІУУМБІОМТІ СОЇ К5НККК (5ЕО ІЮО МО: 54), КККІУУМБІОМТООГЕКНККК (5ЕО ІЮО МО: 55), КККІУУМБІОМТІООГЕЗКККК (ЗЕО ІО МО: 56), КККУМ5ІОМТІ ОО ЕККК (5ЕО І МО: 57), КККУМ5ІЮМУКІ СО ЕККК (ЗЕО ІО МО: 58), КККУМ5ІЮОМТГОКГЕККК (5ЕО ІЮО МО: 59), КККУМІЮМТ СООКЕККК (ЗЕО ІО МО: 60), КККУМУ5ІОЮУКІГ ОККЕККК (ЗЕО ІЮО МО: 61).
3. Пептид за п. 2, який відрізняється тим, що пептид вибирають із групи, що складається 3: ККакУмМ5ІОМТІ СОЇ ЕЗНОКК (5ЕО І МО: 22), ККОІУКБІОМТІ ФО ЕЗНОКК (5ЕО ІЮО МО: 24), ККОУМ5ІЮМТІ СО ЕСКК (5ЕО ІЮО МО: 31), ККОМУМ5ІОЮМКІ ФОГЕСКК (ЗЕО ІЮО МО: 32), ККОУМ5ІЮМТІ ОКІ ЕСКК (ЗЕО ІО МО: 33), ККОМУМУ5ІОМТІ ООКЕСКК (5ЕО ІО МО: 34), ККОМУМУ5ІОЮМКІ ОККЕСКК (ЗЕО ІЮО МО: 35), ККОІММ5ІОМКІ ОККЕСКК (5ЕО ІЮО МО: 40), ККОТУМ5ІЮОМКІ СО ЕСКК (ЗЕО ІО МО: 42), ККОТУМ5ІОУКІГОККЕСКК (ЗЕО ІО МО: 45), Зо ККККУМ5ІЮМТІ ОО ЕЗНККК (ЗЕО ІО МО: 46), КККІУКВІОМТІ ОО ЕЗНККК (5ЕО ІЮО МО: 48), КККІЖУУКІОМТІООГЕЗНККК (5ЕО ІЮО МО: 49), КККУМ5ІОМТІ ОО ЕККК (5ЕО ІО МО: 57), КККУМ5ІЮМУКІ СО ЕККК (ЗЕО ІО МО: 58), КККУМІЮМТ СООКЕККК (ЗЕО ІО МО: 60), КККУМУ5ІОЮУКІГ ОККЕККК (ЗЕО ІЮО МО: 61).
4. Пептид за п. 3, який відрізняється тим, що пептид вибирають із групи, що складається з: ККОІУКБІОМТІ ФО ЕЗНОКК (5ЕО ІЮО МО: 24), ККОМУМ5ІОЮМКІ ФОГЕСКК (ЗЕО ІЮО МО: 32), ККОУМ5ІЮМТІ ОКІ ЕСКК (ЗЕО ІО МО: 33), ККОМУМУ5ІОМТІ ООКЕСКК (5ЕО ІО МО: 34), ККОМУМУ5ІОЮМКІ ОККЕСКК (ЗЕО ІЮО МО: 35), ККОТУМ5ІЮОМКІ СО ЕСКК (ЗЕО ІО МО: 42), ККОТУМ5ІОУКІГОККЕСКК (ЗЕО ІО МО: 45), ККККУМ5ІЮМТІ СОЇ ЕЗНККК (ЗЕО ІЮ МО: 46), КККІУКВІОМТІ ОО ЕЗНККК (5ЕО ІЮО МО: 48), КККУМІЮМТІ СОЇ ЕККК (5ЕО ІЮО МО: 57), КККУМІЮМТ СООКЕККК (ЗЕО ІО МО: 60).
5. Пептид за п. 4, де зазначений пептид вибирають із групи, що складається з: ККОУМ5ІЮМТІ ОКІ ЕСКК (ЗЕО ІО МО: 32), кКкамуУБІВУКІ ОККЕСКК (ЗЕО І МО: 34), ККККУМ5ІЮМТІ ОО ЕЗНККК (ЗЕО ІО МО: 46), КККІУКВІОМТІ ОО ЕЗНККК (5ЕО ІЮО МО: 48), КККУМІЮМТІ СОЇ ЕККК (5ЕО ІЮО МО: 57), КККУМІЮМТ СООКЕККК (ЗЕО ІО МО: 60).
6. Композиція, яка включає множину пептидів, включаючи один або більше з пептидів за будь- яким із попередніх пунктів.
7. Пептид за будь-яким із пп. 1-5 для застосування в пригніченні або попередженні продукування ТТГР аутоімунних антитіл /л мУ//о.
8. Пептид за будь-яким із пп. 1-5 для застосування в лікуванні і/або профілактиці хвороби Грейвса у суб'єкта.
9. Застосування пептиду за будь-яким із пп. 1-5 для виготовлення лікарського засобу для пригнічення або запобігання продукуванню ТТГР аутоімунних антитіл /л у//о.
10. Застосування пептиду за будь-яким із пп. 1-5 для виготовлення лікарського засобу для лікування і/або профілактики хвороби Грейвса.
11. Композиція за п. б для застосування в пригніченні або попередженні продукування ТТГР аутоїмунних антитіл /л у//о.
12. Композиція за п. б для застосування в лікуванні і/або профілактиці хвороби Грейвса у суб'єкта.
13. Застосування композиції за п. 6 для виготовлення лікарського засобу для пригнічення або попередження продукуванню ТТГР аутоімунних антитіл /л У/Мо.
14. Застосування композиції за п. б для виготовлення лікарського засобу для лікування і/або профілактики хвороби Грейвса.
15. Спосіб пригнічення або запобігання продукуванню ТТГР аутоімунних антитіл у суб'єкта, який включає стадію введення суб'єкту пептиду за будь-яким із пп. 1-5 або композиції за п. 6.
16. Спосіб лікування хвороби Грейвса у суб'єкта, який включає стадію введення суб'єкту пептиду за будь-яким із пп. 1-5 або композиції за п. 6.
17. Спосіб за будь-яким із пп. 15 або 16, де суб'єктом є НІ А-ОВ3.
18. Спосіб за будь-яким із пп. 15 або 16, де суб'єктом є НІ А-ОНА.
я КЕ 100-ї Кон ма у. ж о) 10 25 Концентранія ЕМЧН-5 (мкг/мл) Селевнка 8 «а во | «Ве гг ш р т МІ о 10 55 Концентрація КУБ. МКМ)
Фіг. 1 п. КлонЯЯ ю шсвок Ан що. КОН ЗО нарсеєкЕАНК ох і КПНФКОВИНАНК о ше сп Янковваю АНК Ж со у Ж че о. 1 з: В - до зов ї де аа Ї Ка ! НЕК з і и ЕЕ Н ; Ж дія БРВ дб, ев | Шен Н ЕВ В: Ж ЖІ Н х х Ж: : Не і ; | -- ШО ві ! НЕ Ж ТЕ ШЩЕН. ! Я Я» аю покла о они ни він ще ДЕ кв ще «рей р трете С о и Я вазони ЕС Бовнгвовве вого ши ж ЕЕ А З С ЕУ св В В а ЕЕ г г г КЕ ян 144 мод джен поні шо зуУц зав Клон 144 жив СЕК РАІ Кло З вжсвркі АПК і «і Собмкеова МК в ки аксоввані МИК МАВКА м Е шо Е шо т е і : ЕЕ ШЕ а вес ; з 1 т ві - 1 Ж Щі же ща. М. Я в і ЩІ й ж Я ЩЕ ЩІ очи я З р Н Щі: (Я їх - НЕЗН Ї сх Б ЩЕ ЯКЕ », 1 во жа » НЕ ЯК ЩО Ж З з-д ЯКЕ: -й ЕЕ Ж ОН Я кт Я ВІК в, ЕН НЕ Ж ТИН НН НН х а шо З шою Ох ше Ов в Ж ве ше м в ю ЕГО ши ж ши я кріг, 2 Шрі ЗК г. го «во ки ее 35 засів АЦЕ «859.4 Клон 233 макс вія мк реко их М сІтефікоовані ДНК і ппхфікеовані АНЕ. Е КИфФІКсовані йо де» ЗДА ст Р, Е Ї ! жом хе Ї і І її Я зво Мей ої У Ж КО ї Боовей і Б ЕЕ ВЕ. ' І Ж ї Я І З и
ШІ. Її ії ІЇ ії ри ОК о а ЗВИК КО ВВ усонпогираотуолеюму столом рот яке е Зх : ж жо Ж шочоь ов З Ж р жа «ЗНОВУ ЕЕ ЕКВЕККЕКЕЕКИ З ВЕСЕЛКИ БЕВШВЕССЕОСОЦВВОвак а и, п С ох ЖЖ ох пика ВЕ Ех ПУ БУ Ся а МЕТУ Її я х 5. піл яке Кпон 379 зав свіжі АНК яке Клон 440 мив Свіжа АНК В ве края і тт Вікуччняці ДР : Кл евіксозвуві МК ; Утлфааенані АК з» Ве сла і ; Е- тихі Її Е вві І
Я. Но КЕНЕ, ! п: З І Н НЕ ЯН ї З й бере ососо о ож оооодосотрооюрогюросю? осоосо р ооюре рани ша МА НАВАЛИ КК НИ ВАННЯ ЕК ЕК ее я ЮИ ЕВ З у ще ше ву є до й фо а до ї5 Фо КО С У УФ о м Би шк ВЕВТЕСОВЕООСОвОеви ЕТО а ККУ У ЯК я ТЕБЕ шов В я Ж ЕКЗ дДег фіг. З
А. Клон 164 й шко се ши Свіжі АК З пт біксовані АЙЕ і ях - о ва І вв . паз Я ! 24 : Кк ; а ТК доб це ее Ж КУТ вх З о Ж чт жа о шок: заказ Уч У РЕВЕ 2 ж в НКУ
З
В. Кпон 164 Кпон 455 ши свіжі АлК яшисежі АК 14 п фисеовані АК З Пуломнксован АНІК ! ке ї щ- : с І
Се. ! : сне. ї ж БК | ' Її о-ви й. Йо -Й М рз-нвут з я ин с хват ; кою Завелью о Ко ак ою Ж Середнс ей як а ЦЕ Середнє Ж и оо КИ, Я о Я
Фіг. 4
А ВМВ-5/СЕА Е ! ; | АМВ-ЗСВА ММК ЛЕТИ основу хвоста ДЯ До Де До ДІЮ у Куплвтнвують спленоннтн ОМ У з дні Аваліз проліферації В Кількість вдестидів ін'єктованих підшкірно ТОНК/СЕА іме іме о ме 100 МК в основу хвоста ДА5 ДЯДЯ ДЯ Де ДЯ До ДІ КультивуУють спденоцитн М я дналіз проліферації
Фіг. 5 бо
А Седезінка В ім ІН ; й ! зх ж РВЕ --- РВЕ Е їз рем 1 зе ВН БЕ - вевох тк ВНа ЗЕ 4 : " ; и 5 ов 48 І чи М Концентрація ТТ Р (мкг/мл) Концентрація ТТГ Р (мкг/мл) С Селезінка. о ІМ а що - РеЗ жк зо -- ячв5О , ак жк хи ик хіх Ми к ви ! вейдюї , ; що | що о юю д--4 зо Я ; -К 8 : г 2 ща 5 с-Я Кіз. й я 3 8 ББЯ Ковиєнтраця ТІГР (вкг/мл) Кошкцентуація ТТГР (мкг/мл) Е Е ІМ Селезінка й Ж рі ж жккж я РЕ жкк ке РН яке НВ ЯОКК 45 -е- ЯМИ ББ-ОКА 4 осв " ре р ш ' і во ра як у рен - Е яви й -ї " р-н а міни я ' 5 суне й а З 2 З З 54 З Ке КО Концентрація ТІГР (мкг/мл) Концентрація ТТГ (мкг/мл)
Фіг. 6
А ІМ В ІМ щі жк о-- РЕ що я 00о-н РВЕ з -ке ВНЦВЗВ | -- ВНВ о ро 4 і ож 4 рай й і р і й я а вл р А Ко ! р ре ; я м й т г ! ей пен й ие й ? 8 гу З х КК 8 ща я Я за Ь т пут егрт сла В з сем Концентрація ТТГ Р (мкг/мл) Концентрація ГГ Р (мкг/мл) Селезінка І г Не Сезенпнка ва зюож жо вав те -- ВВЕ ! --е ДМВ ей -к ВН ЯК "і «вн І ; - 1 вові І-ї в! ле Я КУ уд Ї ї Ж -й к Ку і Ж я і 8 є? плн х шви Ж он жд рес І «7 РУ пн вання В щі ї 5 то В за в У за Концентрація ТПЕГР Смкгумл) Концентрація ТІГР (мкг/мл)
Фіг. 7 Анти-ТЗНК АБ
4. . «е«і руна А з | «яру В ' | Ж оо яеГрупа С
Се. Й пе ' В 2 4 й а то Час тижні!
Фіг. 8
А 3 г ВО я В, «Дн «ЖИ іа «і В як ж іч я хх і т й кВ я й зи 18 ск ж 16 в за ШИ Ще я 0-0 - ен ШИ; ж за ве | к У ПОМ І ж М К Щ «В жи щік жк я «ЕЕ я С 35 ЕН во "пе жк р | / Я я осв ЗЕ в. х і х Є ; ; 5 ве» я В с «Ж ай ай" Я ке
Фіг. 9
А вх т 154 о 124 ва. вої , де з с як ут ї ї « а е щк : «я й В « з кино ; нини м "я ь Кк че Щ я Ов -е : 2 Е 28 роя Ж г Ва са шк жкакККкККККю д па К я е і -Е а С ж й Е й я ВИШ Ез ЩІ - ва и й й фран ення Я Ки є ке «ее
Фіг. 10 кУувааКК З | 1 й : ка що й і Кк. є ЕЕ В я В З о 34 ії й ши шк Я6 ши г ЩО р-оюо БЙ ІК ши а НН :
- о. ше й и шви З І ш І ше | Ії ше що і. | ші ЕЕ п ншши ее В ЗОМ з 7 ВУ МЕ ЯНА З М НК 14 Енн і й ше Ії. 53 НО ши ЕІ йо Віники КЕ ЗИ ВМ Кн кро нс ук кокс іроюнню кн вк інн й НИ ЗУ ЯВИ КК. ще й Шк ши же ще я Ь ШИ С: г ше НН ШЕ ІН У а 2 6.88 5 5 88558 555555 в й і | ; а що зи зи ВИ ши ші ши ше шле и ши е з ее М повер яр, я. ме го) т я що я ча Мо і щ я щі в в ві ЖЖ г і» З д ї ж ж В - ж з Ма щ ж в ж я : Ж ш Кк й Ж са чек з Н ії ї В : і ль ЧЕН, ді ше З Б щ т Па о ви 48 Я ї ! Е ЗОН ОБЕРЕ не: ОМ І й шо | вкоОзо -е г ши ши я І 324 й шш шій жі ше Е Ж 3 ї і ; ТК КО КТ: В . ; ху Я і й | Е ї З і В Тк 86 Я Б В З ! ! ВЕЕВК МІВ КІ НЕ ЯК ; ші її пшшше ши ШІ . ЕЕ, ще 253 Я ЯН Я Е з і і ОО КН Я БУКВ Х В ВН сш щ шщ | шщ НЕ о, І ШІ. шк 375 маш й пн имя МА А Кн Я Ше ож З ж в м В т є ж в ж ж в вк ж М, х, ше о а ни Нр в НЕ НК ШЕ ЯКЕ щ ю ; ; і ре шин иа и и МИ ЩО з, 8 З, В, 2, у, В, 5 В, в в Б ВВ ї шо що шо ОО ОЙ щі У й ЕЕ ЕБ Є Б Б БЕ ЕБ ЕЕ 8 5 8882 Бо Ж і «вв ЕЕ
Фіг. 11
МВ ККК вк їй КЕ: чи 50 ! ї В щщ 88 Е г 4 ЕХ Ян я я 1855 З З В ЗНУ ТЕ « ШЕ ще ї Кс: ШК
З. 3 Я 5 зії 85 ії - ВЕ: ЗІ | ща Ту НЕ З НВ Б з ЕЕ як мифінрй
А. Я. і СА фіке. і ШЕ ЕЕ і др ВЕ і р і СО віко; і Н щ щ й 1 ЕВВ не З ; З ЕН Я ВН і Ві й у щш й щ жи ПЗ 186 фіке. їх ЕНН що ее ЕЕ Кк Ядке о п | Ше дя сз5фіко. ой ; інд | Сн ВМ ложе НЕК. 7233 вике. ші КОя їх Я Кай -к 379 і ЕЕ ; 5 в 1379 фіко, В В Я с є Мі ще
Фіг. 12 016-020, свіжі ер ях зак що й ! як 48 с ї ї ; ї Що ! 8 і : З і ї І ОК ! як ма ї НО Б ї. Нв | і ще 7 б | НО Кіш шк ! вк є ЩЕ ії Екшн. | в па ї 3 і Н 33 Б У Ж ск Я Я ох що 5 КК 3 З З ЗК її В ше с їй Кан Бен БУ ОНИ ЩЕ ва М дя я. | ВІКНІ вія БІШАЖІ як 187 : СЯ ; с ся КУ КУ як 25 що А ий Ге З іс Фо її я ЗІЗ З щ ви ЗЕ 4 ща 52 525 зв хе 353 КЕ КВІЖІ ще 379 Би ща ; ї зи 5 і Її хх З зо 45 х х ; ія ЗК З ЯК ЗУ | як Е я т | БІ КІ "ші що х В Ж | І УЗ і Ж Кк : І: ще 88 Е, ї з ЗА У ЗК З ЖК хек ЩЕ Я ХХ ві. й о Е о МЕНІ Ве ЩЕДЕ ШІ ще Ж: ; ї ІК НАХ 5 М З як КЕ ЯЕЖ ж х ЗКУ М 835 ХУ ШЕ | БЕТОН | І; ва Ася І З І НІ ОВ І І І В ж 187 з зу ся ся ак - а у Е й - « « г ях Го з 3 ї як За і і. рат. сої ща 53 КІБКОЇ, свіжі зді ЗАВ ще 83 Ко с К ї Її «а 5 В: з жа, й Нк ї Зх з. з В у як у Еш ше ж ше ще З ПІ як ї В БЕ В Е: З її щ- - ще ТК ї. Ж І | Е. В їй ШІ: БЕ То (2 | А ШЕ ЩЕ ША Ж її. ; : у ще 88 ши и іш кіш п шин ше хв ЖЕ ОО ЕВ З -к Ма х Бір НІЖ За НІ З З ОН МОНЕ Я ЩІ З шк ШІ БЕ Бі іш іш ІІ, ще 385 Ві нкнбнчклнн о. і На ЯН і і Я ож Я в 5 х ГУ З ся шк 2 шк ге « « Фе 8 - я Б шк За г їх З Го)
Фіг. 13
16-20, Фіксовані в За КУ М 40 ; З ящ в : ЩЕ ше ЕЕ ці іх ш і | як з мм у х я г. х. За х Її ї. у у - хз |і і я Б З ЗВ ШЕ В о : З у КЕ: З 3: 3 3 5 И мякі о | ШЕ ЩЕ ЩЕ В | БЩ па ЩІ ЕІ ЩЕ і і Зь 5 ! ща мо ж що в ЕХ ХЕ З ІЗ КІ ке і і З ; ЗК З ЩЕ С: ЩЕ ЗМК З х КЕ вену ; й 4, СОН. в Ки Я Ди ни їв ! 5 ще вк хх в сокхк щ щік Ку я сі Фк є в шк За Ж я як З ке я ЕВ) р зе що во ! Соодежокд нії ща ва (321-625, фіксовані шк за 4 ще 480 ! як Зв : хх і з ї и ! і в якос? 7 ЗХ 3 35 Зк: шк ш: ще Ї ! ї ж ЕВ В то - 5 З З ЯКУ: ЯЗ: З ! 1 ще 88 ав В Н. | Зв. й; В її Е ЗХ В ЗІ і ОЗ «з ЕВ сх зві й: ЗЕ З 1 В г ва це ся хх ТК З Їж хїх ї Щ: й 1 : о З ЕВ В о «З ща іа ЗК хі ї УКХ «Ж З КЕ КІ: я ЯК Й ак 5 я з Фе Я «Р шк 333 щу Ка «ее її в, се З хх вк 328 -- - с ; щ й . а а Е, Ух Я жа ух х К16-К20, фіксовані ев 4 я ще о
5. З за ї у ку. х . її З З шкі з зу 1 ши ШЕ ЩЕ гії ) вк 5 сх у ї У ж х 5 у з ж: с ні . Кіш ш кіш вве с і І і ЦЕ а Еш Х щк на і ЗЕ У хи ЕН КЗ ЖЕ ОО | З : :
Б. НО ЕЕ Н. ЩЕ яко пз. з ЗБ и ше шк щи ше ше ШЕ ЩЕ В ШЕ: ще з БЕН СН УНК БЕ зи З со ШЕ: ОЗ тв . й ек Ж ОК А Я ЖИ НИ З БК МАН. якої я си , ї я ; - КЗ З КЗ З зії "Я ше ее ее г ж є Ж Б ща з щ х ща за Б ща З) ше ж
Фіг.14
026-630, свіжі Ж щи 5 в | В | шк 29 а" | | ПЕ ШО! ! як 57 НІШІ КІ ЧИ т Нч М Він КЕ ця ІшЕ ЯИ І щЗ 197 г шани НЕ НЕ ІМ и РЕА ІЙ шк 35 є » Е СЯ г ф Ку х зав в и ч з га Є, е г Ж шк 53 щ шк 297 в. як 579 З шк 350 ще 440 026-030, фіксовані 4 вк 5о Я її Ж : це Ге Ша ш і . ІЩЕ. 1 шк за го : | Е. іш я. ви? їв Я у, Я КЕШ 72 . ше вні пшч ішшЕ іш ва Не ше ши ЩЕ Є і ' В І, 3 ж ТЕ ЩІ ІЕЕ г ши в. 197 (зак й ВТ ЕН Її ЩЕ Ал З СЯ пкакмо щи 35 ; Ж ; «ф й ді зе ке х ща М «а зах Ок Е Б ш «й є го Тс - Ес 4 шк 353 ЕХ шо? тя шк 379 с ш-г зо . ща Я
Фіг. 15 ЩЕ що --к ВНЗ І Шен -к ЯНВ ЯК-ОКК - -Нь о -ї ; ре - а Ж Шен зе з 2 й - в 84 4 5 ча Концентрація ТТГ Р (мкг/мл)
Фіг. 16
Т-клітинна лінія а З . | - і | ще БМ ше Ж ве сла ВК ча «- Індивідуальні пептиди
Фіг. 17 А В Е Б М Свіжі й як Кт фіксовані ЩЕ | ще о. ; й | п. Середнє фе й Середнє а цЯ Ж ся Кей Ки « вх КІ я ке Ком Ф Ф
Фіг. 18
Селезінка Селезінка -- РВЗ - РБ5 ж -а- КМВ5О-КІ ж як БНО ; ; ії б 8 ! - Я - Ж о о 0 ви 1 5 о 2 з З а зо Концпентрознія ТТГ (мкг/мл) Концентрація ТІГР (мкг/мл) Селезінка т - РАВ ЖЖЖЖ ж - НМВБОКІЄ Ж ся м ро. Й г ва 1 5 че Концентрація ТІГР (мкг/мл)
Фіг. 19
Applications Claiming Priority (2)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| GB201314052A GB201314052D0 (en) | 2013-08-06 | 2013-08-06 | Peptides |
| PCT/IB2014/063739 WO2015019302A2 (en) | 2013-08-06 | 2014-08-06 | Peptides |
Publications (1)
| Publication Number | Publication Date |
|---|---|
| UA120746C2 true UA120746C2 (uk) | 2020-02-10 |
Family
ID=49224229
Family Applications (1)
| Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
|---|---|---|---|
| UAA201602098A UA120746C2 (uk) | 2013-08-06 | 2014-08-06 | Пептид, який здатний до зв'язування з молекулою мнс in vitro |
Country Status (32)
| Country | Link |
|---|---|
| US (2) | US9938329B2 (uk) |
| EP (1) | EP3030259B1 (uk) |
| JP (1) | JP6476181B2 (uk) |
| KR (1) | KR102431507B1 (uk) |
| CN (1) | CN105636980B (uk) |
| AU (1) | AU2014304108B2 (uk) |
| BR (1) | BR112016002572A2 (uk) |
| CA (1) | CA2920321C (uk) |
| CY (1) | CY1120212T1 (uk) |
| DK (1) | DK3030259T3 (uk) |
| ES (1) | ES2664045T3 (uk) |
| GB (1) | GB201314052D0 (uk) |
| HK (1) | HK1219058A1 (uk) |
| HR (1) | HRP20180452T1 (uk) |
| HU (1) | HUE038569T2 (uk) |
| IL (1) | IL243892B (uk) |
| LT (1) | LT3030259T (uk) |
| MX (1) | MX369412B (uk) |
| MY (1) | MY177371A (uk) |
| NO (1) | NO3030259T3 (uk) |
| NZ (1) | NZ717350A (uk) |
| PE (1) | PE20160778A1 (uk) |
| PH (1) | PH12016500218A1 (uk) |
| PL (1) | PL3030259T3 (uk) |
| PT (1) | PT3030259T (uk) |
| RS (1) | RS57196B1 (uk) |
| RU (1) | RU2676149C2 (uk) |
| SG (1) | SG11201600895SA (uk) |
| SI (1) | SI3030259T1 (uk) |
| UA (1) | UA120746C2 (uk) |
| WO (1) | WO2015019302A2 (uk) |
| ZA (1) | ZA201600729B (uk) |
Families Citing this family (6)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| GB201314052D0 (en) * | 2013-08-06 | 2013-09-18 | Apitope Int Nv | Peptides |
| US10646589B2 (en) * | 2014-12-24 | 2020-05-12 | Apitope International Nv | Thyroid stimulating hormone receptor peptides and uses thereof |
| EP3565585A1 (en) * | 2017-01-04 | 2019-11-13 | Apitope International NV | Therapeutic method using tolerogenic peptides |
| EP3369743A1 (en) | 2017-03-01 | 2018-09-05 | advanceCOR GmbH | Cyclic peptides for the treatment of graves' disease |
| EP3622962A1 (en) * | 2018-09-14 | 2020-03-18 | advanceCOR GmbH | Short cyclic peptides for the treatment of graves' disease |
| GB201909774D0 (en) | 2019-07-08 | 2019-08-21 | Apitope Tech Bristol Limited | Method |
Family Cites Families (10)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| EP0433509B1 (en) * | 1989-12-14 | 1996-11-13 | B.R.A.H.M.S Diagnostica GmbH | Polypeptides having thyrotropin receptor activity, nucleic acid sequences coding for such receptors and polypeptides, and applications of these polypeptides |
| HU229377B1 (hu) | 2000-08-21 | 2013-11-28 | Apitope Technology Bristol Ltd | Tolerogén humán peptidek |
| GB0202399D0 (en) * | 2002-02-01 | 2002-03-20 | Univ Bristol | Peptide |
| FR2842812A1 (fr) | 2002-07-26 | 2004-01-30 | Pf Medicament | Procede de solubilisation de peptides hydrophobes et leur utilisation pour generer une reponse de type ctl antitumorale ou anti-infectueuse |
| JP2006188507A (ja) * | 2004-12-10 | 2006-07-20 | Tokyo Univ Of Agriculture & Technology | 蛋白質の溶解度向上方法 |
| EP1951753A2 (en) * | 2005-11-21 | 2008-08-06 | Dr. Fenning Biomed GmbH | Recombinant polypeptides and methods for detecting and/or quantifying autoantibodies against tsh receptor |
| RU2486201C2 (ru) | 2006-10-12 | 2013-06-27 | Дженентек, Инк. | Антитела к лимфотоксину-альфа |
| GB0723712D0 (en) | 2007-12-04 | 2008-01-16 | Apitope Technology Bristol Ltd | Peptides |
| GB0908515D0 (en) | 2009-05-18 | 2009-06-24 | Apitope Technology Bristol Ltd | Peptide |
| GB201314052D0 (en) * | 2013-08-06 | 2013-09-18 | Apitope Int Nv | Peptides |
-
2013
- 2013-08-06 GB GB201314052A patent/GB201314052D0/en not_active Ceased
-
2014
- 2014-08-06 SI SI201430666T patent/SI3030259T1/en unknown
- 2014-08-06 CA CA2920321A patent/CA2920321C/en active Active
- 2014-08-06 DK DK14772444.7T patent/DK3030259T3/en active
- 2014-08-06 PT PT147724447T patent/PT3030259T/pt unknown
- 2014-08-06 WO PCT/IB2014/063739 patent/WO2015019302A2/en active Application Filing
- 2014-08-06 CN CN201480053788.0A patent/CN105636980B/zh active Active
- 2014-08-06 MY MYPI2016000224A patent/MY177371A/en unknown
- 2014-08-06 UA UAA201602098A patent/UA120746C2/uk unknown
- 2014-08-06 EP EP14772444.7A patent/EP3030259B1/en active Active
- 2014-08-06 NO NO14772444A patent/NO3030259T3/no unknown
- 2014-08-06 RS RS20180316A patent/RS57196B1/sr unknown
- 2014-08-06 NZ NZ717350A patent/NZ717350A/en unknown
- 2014-08-06 MX MX2016001744A patent/MX369412B/es active IP Right Grant
- 2014-08-06 JP JP2016532780A patent/JP6476181B2/ja active Active
- 2014-08-06 US US14/910,372 patent/US9938329B2/en active Active
- 2014-08-06 AU AU2014304108A patent/AU2014304108B2/en active Active
- 2014-08-06 KR KR1020167005185A patent/KR102431507B1/ko active IP Right Grant
- 2014-08-06 LT LTEP14772444.7T patent/LT3030259T/lt unknown
- 2014-08-06 RU RU2016107873A patent/RU2676149C2/ru active
- 2014-08-06 ES ES14772444.7T patent/ES2664045T3/es active Active
- 2014-08-06 PE PE2016000223A patent/PE20160778A1/es unknown
- 2014-08-06 PL PL14772444T patent/PL3030259T3/pl unknown
- 2014-08-06 SG SG11201600895SA patent/SG11201600895SA/en unknown
- 2014-08-06 HU HUE14772444A patent/HUE038569T2/hu unknown
- 2014-08-06 BR BR112016002572A patent/BR112016002572A2/pt not_active IP Right Cessation
-
2016
- 2016-02-01 PH PH12016500218A patent/PH12016500218A1/en unknown
- 2016-02-01 IL IL24389216A patent/IL243892B/en active IP Right Grant
- 2016-02-02 ZA ZA2016/00729A patent/ZA201600729B/en unknown
- 2016-06-21 HK HK16107175.4A patent/HK1219058A1/zh unknown
-
2018
- 2018-02-23 US US15/903,379 patent/US10730919B2/en active Active
- 2018-03-16 HR HRP20180452TT patent/HRP20180452T1/hr unknown
- 2018-03-26 CY CY20181100337T patent/CY1120212T1/el unknown
Also Published As
Similar Documents
| Publication | Publication Date | Title |
|---|---|---|
| UA120746C2 (uk) | Пептид, який здатний до зв'язування з молекулою мнс in vitro | |
| US20240058442A1 (en) | Combinations of Modalities for the Treatment of Diabetes | |
| EA011450B1 (ru) | Гуманизированный иммуноглобулин, который специфически связывается с бета-амилоидным пептидом, и способы его применения | |
| TW200916114A (en) | Cdca1 peptide and pharmaceutical agent comprising the same | |
| JP2001508430A (ja) | 免疫抑制因子のエンドサイトーシスによる提示のための化合物、組成物及び方法 | |
| TW200916479A (en) | CDH3 peptide and medicinal agent comprising the same | |
| WO2006062094A1 (ja) | 新規癌抗原ペプチド及びその用途 | |
| EA019370B1 (ru) | Пептиды fviii и их применение для индукции толерантности у больных гемофилией | |
| PT2281455E (pt) | Composição contendo leishmânia lip2a | |
| TW201231065A (en) | FVIII peptides for immune tolerance induction and immunodiagnostics | |
| KR20140116054A (ko) | 다발성 경화증의 치료를 위한 ａｐｃ-매개 관용 유도 | |
| ES2663862T3 (es) | Modulación de inmunogenicidad de antígeno mediante la eliminación de epítopos reconocidos por linfocitos NKT | |
| Richert | Human T-cell recognition of myelin basic protein peptides | |
| US20230114037A1 (en) | Compositions and methods for prevention and treatment of immune deficiency and inflammation | |
| UA98356C2 (uk) | Композиція для лікування та профілактики розсіяного склерозу і/або оптичного невриту, пов'язаного з розсіяним склерозом | |
| CN101812126A (zh) | 一种新的hPEBP4蛋白来源的HLA-A2限制性表位多肽及其应用 | |
| CN115298195A (zh) | 一种包含s-阻遏蛋白肽的组合物 | |
| US20170198026A1 (en) | Compositions And Methods For Treating Tumors And Immune Based Inflammatory Diseases | |
| Autoimmunity | Conservation of Pathogenic TCR Homology | |
| NZ732987A (en) | Thyroid stimulating hormone receptor peptides and uses thereof | |
| MXPA00011511A (es) | Inducción de proteinas y peptidos antibioticos por proteina lait/scd14 | |
| EP2550009A1 (en) | Dendritic cell inhibitory proteins from ticks |