CN105636980B

CN105636980B - 肽

Info

Publication number: CN105636980B
Application number: CN201480053788.0A
Authority: CN
Inventors: D.赖斯
Original assignee: Apitope International NV
Current assignee: Baimingxinkang Biotechnology (Zhejiang) Co.,Ltd.
Priority date: 2013-08-06
Filing date: 2014-08-06
Publication date: 2021-05-04
Anticipated expiration: 2034-08-06
Also published as: LT3030259T; MY177371A; JP6476181B2; MX2016001744A; KR102431507B1; EP3030259B1; EP3030259A2; US9938329B2; GB201314052D0; SG11201600895SA; PT3030259T; RS57196B1; WO2015019302A3; BR112016002572A2; RU2676149C2; ZA201600729B; HUE038569T2; ES2664045T3; AU2014304108A1; PH12016500218A1

Abstract

本发明提供至少部分可衍生于人促甲状腺激素受体(TSHR)的肽，该肽能够在不进一步抗原处理的情况下在体外结合MHC分子并被呈递至T细胞。本发明还涉及这些肽用于阻止或抑制格雷夫氏病(Graves’Disease)中活化性自身抗体的形成的用途。

Description

肽

发明领域

本发明涉及肽，该肽的至少一部分衍生于促甲状腺激素受体(TSHR)。这些肽可以用于格雷夫斯病(Graves Disease,GD)的预防和/或治疗。

发明背景

格雷夫氏病特征是活动过度的甲状腺，其导致产生过多量的甲状腺激素和甲状腺的肿大(甲状腺肿)。导致的甲状腺功能亢进的状态可能导致一大批的神经心理和身体症状。GD是甲状腺功能亢进的最普遍的原因(所有病例的60-90％)，并通常在中年期间呈现自身，但也出现于儿童，青少年，以及老年中。它影响高达2％的女性人群，且在女性中比在男性中常见五倍到十倍之间。儿童GD在美国影响着约6,000名儿童，且在欧洲影响着6,000名。GD也是严重甲状腺功能亢进的最普遍原因，其与较轻度形式的甲状腺功能亢进相比，伴随更多的临床体征和症状以及实验室异常。

存在与GD相关的较强的遗传成分。最近没有对GD的群体研究，但是确实存在几项对甲状腺功能亢进的准群体(quasi population)研究，并且因此关于GD的发生率和流行率(prevalence)的所有评估是近似的。甲状腺功能亢进的发生率在26:100,000至93:100,000变化，而总体流行率估算为1.3％，其中42％的病例是明显的，而62％是亚临床的(subclinical)。

约30-50％患有GD的人也会患有格雷夫氏病眼病(Graves’opthalmopathy，GO)，一只或两只眼睛的突起。许多GO的病例是轻度且自身限性的(self-limiting)，然而，20％的病例具有显著/中度到严重的疾病，其中至少一半需要类固醇，并且3-5％的GO患者具有痛苦的，威胁视力的疾病，伴随着甲状腺机能障碍性视神经病变(dysthyroid opticneuropathy,DON)。由于眼睑晚上不能闭合，眼睛的微微移动可能导致角膜的严重干燥。视神经的压力增大可能导致视野缺损和视力下降。GO还可能与胫前粘液性水肿(pretibialmyxedemia)有关。

GD的症状和体征实际上都来自于甲状腺功能亢进的直接和间接效应，其中主要的例外是GO，甲状腺肿和胫前粘液性水肿。甲状腺功能亢进的症状可以包括失眠，手抖(handtremor)，活动过度，脱发(hair loss)，出汗过多(excessive sweating)，热不耐受性(heatintolerance)和食欲增加但体重减轻(weight loss despite increased appetite)。其它体征最普遍的是弥漫性肿大的(通常是对称的)无压痛的甲状腺，睑后退(lid lag)，由于格雷夫氏眼病的过度流泪，心脏心律失常和高血压。甲状腺毒性患者可以经历行为和个性的变化，例如精神病，焦虑和抑郁。在较轻度的甲状腺功能亢进中，患者可以经历较不太明显的表现，例如焦虑，烦乱不安(restlessness)，易怒(irritability)和情绪不稳定(emotional lability)。

目前，对于GD没有可用的疗法，因此目前的治疗涉及靶向呈现的症状。对于GD存在三种治疗形式，口服抗甲状腺药物(ATDS)，放射性碘(RAI)和甲状腺切除术。后两种方法导致甲状腺激素的终生补充。使用放线性碘的疗法在美国是最普遍的治疗，而在欧洲，日本和世界上大多数其它国家，ATDS是一线治疗。

ATD疗法与一些罕见的副作用有关，并具有50-60％的缓解率(remission rate)。越来越多的认识到RAI可能促进或恶化活动性GO，而在美国使用ATD治疗的患者的数量在增长中。

由于每种治疗选项的不同成效，如果第一种尝试的治疗被证明不是完全成功，那么患者通常进行多于一种方法。复发或随后的甲状腺功能减退的风险是巨大的，对于GD可用治疗的一般效力低于期望。因此，对于GD的可替换疗法存在需要，所述疗法在治疗GD和减轻或减少所述疾病的症状方面有效。

附图简述

图1：DR3小鼠中RNB-5的免疫原性。使用RNB-5引发(prime)小鼠(N＝2雄性；N＝2雌性)，并且在10天后，使用不同浓度的肽培养LN细胞(每种性别合并的)和脾细胞，并测量细胞增殖。刺激指数(SI)代表肽刺激的培养物的胸苷掺入比未刺激培养物的胸苷掺入的比率。F，雌性；M，雄性；LN，淋巴结。

图2：鉴定RNB-5中的apitopes。使用RNB-5/CFA免疫DR3小鼠并生成杂交瘤。使用5x10⁴个新鲜的(黑色柱)或固定的(白色柱)VAVY细胞和25μg/mL抗原(RNB-5或RNB-5巢式肽(nested peptide))培养5x10⁴个TSHR特异性杂交瘤细胞。示出了代表性的克隆。48小时后，测量抗原诱导的IL-2产生。该图表代表了重复测量的平均值，且结果代表2次独立的实验。APC，抗原呈递细胞。

图3：鉴定RNB-5中的apitopes。使用TSHR/CFA免疫DR4小鼠并生成杂交瘤。使用5x10⁴个新鲜的(黑色柱)或固定的(白色柱)BM14细胞和25μg/mL抗原(TSHR，RNB-5或RNB-5巢式肽)培养5x10⁴个TSHR特异性杂交瘤细胞。示出了代表性的克隆。48小时后，测量抗原诱导的IL-2产生。该图表代表了重复测量的平均值。APC，抗原呈递细胞。

图4A：鉴定RNB-4中的apitopes。使用TSHR-CFA免疫DR4小鼠并生成杂交瘤。使用5x10⁴个新鲜的(黑色柱)或固定的(白色柱)BM14细胞和25μg/mL抗原(TSHR，RNB-4或RNB-4巢式肽)培养5x10⁴个TSHR特异性杂交瘤细胞。示出了代表性的克隆。48小时后，测量抗原诱导的IL-2产生并作为OD值示出。该图表代表了重复测量的平均值，且结果代表3次独立的实验。APC，抗原呈递细胞。

图4B：鉴定RNB-4中的apitopes。使用TSHR/CFA免疫DR4小鼠并生成杂交瘤。使用5x10⁴个新鲜的(黑色柱)或固定的(白色柱)BM14细胞和抗原(25μg/mL RNB-4的TSHR，或100μg/mL RNB-4巢式肽)培养5x10⁴个TSHR特异性杂交瘤细胞。48小时后，测量抗原诱导的IL-2产生并作为OD值示出。

图5：离体耐受化(tolerisation)方案。A，在第-8，-6和-4天，小鼠在颈部背面皮下注射100μg肽(高剂量方案)。在第0天，小鼠在尾根部皮下注射RNB-5/CFA。B，在第-15，-13和-11天，小鼠在颈部后面皮下注射0.1μg,1μg和10μg肽，接着在第-8，-6和-4天3次注射100μg肽(剂量递增方案)。在第0天，小鼠在尾根部皮下注射TSHR/CFA或肽/CFA。对于两种日程表，在免疫10天后处死小鼠以测量TSHR再刺激后LN细胞和脾细胞的增殖。

图6：RNB-5apitopes的离体耐受诱导。根据高剂量日程表(A-B)或剂量递增方案(C-F)使用RNB-5apitopes预处理小鼠。数据代表PBS处理的小鼠(黑线)和肽处理的小鼠(红线)的SI值的平均值±SEM。图A，B，C，E和F代表在DR3小鼠中进行的实验，图D代表在DR4小鼠中进行的实验。使用2因素ANOVA测量对T细胞增殖的总体处理效果，并将p值写入图中。使用Bonferroni事后检验且在图中标明显著性差异(*p<0.05；**p<0.01；***p<0.001)。SI，刺激指数；LN，淋巴结。

图7：RNB-9apitopes的离体耐受诱导。根据剂量递增日程表使用RNB-9B(A，C)或RNB-9C(B，D)预处理DR3小鼠。数据代表PBS处理的小鼠(黑线)和肽处理的小鼠(红线)的SI值的平均值±SEM。使用2因素ANOVA测量对T细胞增殖的总体处理效果，并将p值写入图中。使用Bonferroni事后检验且在图中标明显著性差异(*p<0.05；**p<0.01；***p<0.001)。SI，刺激指数；LN，淋巴结。

图8：通过ELISA测量的TSHR抗体水平(总IgG)。使用佐剂中的50μg TSHR一次(组A+B)或两次(组C)免疫小鼠。每组以平均值±SEM示出OD值。

图9：LacZ-Ad和Ad-TSHR-Ad免疫小鼠中的血清T4水平。示出的数据是第一次免疫之前(A)，之后4周(B)和之后10周(C)来自不同组小鼠的个体值。对于每个组，表明了甲状腺功能亢进的数量相对于总数。当它们的T4水平超过LacZ-Ad免疫的小鼠中血清T4值的平均值+2SD时，认为小鼠为甲状腺功能亢进。在第4周或第10周，TSHR-Ad和LacZ-Ad注射的小鼠之间平均T4水平没有显著差异。单因素ANOVA，Bonferroni事后检验；p<0.05认为显著差异。

图10：LacZ-Ad和TSHR-Ad免疫小鼠中的抗TSHR抗体水平(总IgG，ELISA)。示出的数据是第一次免疫之前(A)，之后4周(B)和10周后(C)来自不同组的小鼠的个体值。使用单因素ANOVA和Bonferroni事后检验进行统计学分析。在图中表明了显著差异(*p<0.05；**p<0.01)。

图11：从使用TSHR/CFA免疫的HLA-DR3或HLA-DR4小鼠中分离的TSHR-和RNB-5特异性杂交瘤克隆对RNB-5修饰的肽的响应。在测定IL-2产生之前，使用新鲜APC和25μg/mL抗原培养杂交瘤克隆(以不同颜色表示)48小时。在RNB-5D-GKK或RNB-5D-KKK中心区域中氨基酸的置换，阻碍了杂交瘤克隆的识别，表明那些氨基酸在表位区域中是重要的。

图12：从使用TSHR/CFA免疫的HLA-DR3或HLA-DR4小鼠中分离的TSHR-和RNB-5特异性杂交瘤克隆对RNB-5D修饰的肽的响应。在测定IL-2产生之前，使用新鲜APC(实心柱)或固定的APC(空心柱)和25μg/mL抗原培养杂交瘤克隆(以不同颜色表示)48小时。

图13：从使用TSHR/CFA免疫的HLA-DR3或HLA-DR4小鼠中分离的TSHR和RNB-5特异性杂交瘤克隆对RNB-5D修饰的肽的响应。在测定IL-2产生之前，使用新鲜APC和25μg/mL抗原培养杂交瘤克隆(以不同颜色表示)48小时。

图14：从使用TSHR/CFA免疫的HLA-DR3或HLA-DR4小鼠中分离的TSHR-和RNB-5特异性杂交瘤克隆对RNB-5D修饰的肽的响应。在测定IL-2产生之前，使用固定的APC和25μg/mL抗原培养杂交瘤克隆(以不同颜色表示)48小时。

图15：从使用TSHR/CFA免疫的HLA-DR3或HLA-DR4小鼠中分离的TSHR和RNB-5特异性杂交瘤克隆对RNB-5D修饰的肽的响应。在测定IL-2产生之前，使用新鲜的和固定的APC和25μg/mL抗原培养杂交瘤克隆(以不同颜色表示)48小时。

图16：根据剂量递增日程表，RNB 4K-GKK在DR4小鼠中的离体耐受诱导。使用2因素ANOVA测量对T细胞增殖的总体处理效果，并将p值写入图中。使用Bonferroni事后检验且在图中标明显著性差异(*p<0.05；**p<0.01；***p<0.001)。对于PBS处理的(黑线)和肽处理的小鼠(红线)，数据代表平均值±SEM。SI，刺激指数；LN，淋巴结。

图17：通过从格雷夫氏病患者生成的T细胞系的反应性，鉴定RNB12区域。通过使用RNB12刺激从格雷夫氏病患者分离的PBMC达12天生成T细胞系。在额外的12天的再刺激周期后，测试RNB12特异性T细胞对RNB12区域中个别巢式肽的识别。SI，刺激指数。

图18：使用从健康供体生成的RNB12特异性TCL鉴定RNB12区域中的apitopes。使用BM13，一种在肽的存在下表达人MHC II类分子的人细胞系培养RNB12特异性T细胞。黑柱代表在新鲜的，但是经辐射的BM14细胞存在下的刺激，而白柱表示存在固定的APC(见材料和方法)。通过向所述培养物添加3H-胸苷，收集并冷冻培养物上清。对所述上清分析IFNgamma(A)以确定增殖T细胞响应(B)。TCL，T细胞系；APC，抗原提呈细胞；MHC II类：主要组织相容性复合物II类；SI，刺激指数；OD：光密度。

图19：根据剂量递增日程表，由RNB5D修饰的肽在DR3小鼠中离体耐受诱导的例子。使用2因素ANOVA测量对T细胞增殖的总体处理效果，并将p值写入图中。(*p<0.05；**p<0.01；***p<0.001)。对于PBS处理的(黑线)和肽处理的小鼠(红线)，数据代表平均值±SEM。SI，刺激指数。A:RNB5D-K1；B:RNB5D-K3；C:RNB5D-K16。

图20：图表显示了RNB5D修饰的肽的apitopes状态。从使用TSHR/CFA免疫的HLA-DR3和HLA-DR4小鼠分离的TSHR和RNB-5特异性杂交瘤克隆对RNB-5D修饰的肽的响应的例子。在测定IL-2产生之前，使用新鲜APC(黑色柱)或固定的APC(白色柱)和25μg/mL抗原培养杂交瘤克隆48小时。

发明简述

本发明人已经鉴定了一些衍生于TSHR的肽，其可用于GD的预防和/或治疗。

在第一个方面，本发明提供肽，其能够在体外结合MHC分子并在没有抗原处理的情况下被呈递给T细胞，且其包含以下促甲状腺激素受体(TSHR)肽的全部或一部分：

所述肽可以选自以下TSHR肽和其衍生物：

所述肽可以包含RNB 5A,5B,5C,5D,5E,5F,4J,4K,9A,9B,9C,9D,12A或12B序列，或其变体，其中一个或多个氨基酸已经被另一种氨基酸，如K取代，其已经在一个或两个末端经修饰，例如通过引入“GKK”或“KKK”序列。

所述肽可以包含RNB-5D序列或其变体，其中一个或多个氨基酸已经被另一种氨基酸，如K取代，其已经在一个或两个末端经修饰，例如通过引入“GKK”或“KKK”序列。

本发明还提供肽，其包含以下序列：

KK-(G/K)-aa1-(RNB-5D肽)-aa2-aa3-Z-(G/K)-KK

其中aa1为无氨基酸，I，K或T；

RNB-5D为YVSIDVTLQQLE，或其变体，其中一个或多个氨基酸被K取代；

aa2为无氨基酸，S或K；

aa2为无氨基酸，H或K；

其能够在体外结合MHC分子并在没有抗原处理的情况下被呈递给T细胞。

在这一实施方案中，RNB-5D可以是YVSIDVTLQQLE，或其变体，其中一个或多个氨基酸被K取代。

所述肽可以选自下组，其都经鉴定为apitopes(表1)：KKGIYVSIDVTLQQLESHGKK(SEQ ID No 12),KKGKYVSIDVTLQQLESHGKK(SEQ ID No 22),KKGIKVSIDVTLQQLESHGKK(SEQID No 23),KKGIYKSIDVTLQQLESHGKK(SEQ ID No 24),KKGIYVSIDVKLQQLESHGKK(SEQ ID No25),KKGIYVSIDVTLQKLESHGKK(SEQ ID No 26),KKGIYVSIDVTLQQKESHGKK(SEQ ID No 27),KKGIYVSIDVTLQQLKSHGKK(SEQ ID No 28),KKGIYVSIDVTLQQLEKHGKK(SEQ ID No 29),KKGIYVSIDVTLQQLESKGKK(SEQ ID No 30),KKGYVSIDVTLQQLEGKK(SEQ ID No 31),KKGYVSIDVKLQQLEGKK(SEQ ID No 32),KKGYVSIDVTLQKLEGKK(SEQ ID No 33),KKGYVSIDVTLQQKEGKK(SEQ ID No 34),KKGYVSIDVKLQKKEGKK(SEQ ID No 35),KKGIYVSIDVTLQQLEGKK(SEQ ID No 36),KKGIYVSIDVKLQQLEGKK(SEQ ID No 37),KKGIYVSIDVTLQKLEGKK(SEQ ID No 38),KKGIYVSIDVTLQQKEGKK(SEQ ID No 39),KKGIYVSIDVKLQKKEGKK(SEQ ID No 40),KKGTYVSIDVTLQQLEGKK(SEQ ID No 41),KKGTYVSIDVKLQQLEGKK(SEQ ID No 42),KKGTYVSIDVTLQKLEGKK(SEQ ID No 43),KKGTYVSIDVTLQQKEGKK(SEQ ID No 44),KKGTYVSIDVKLQKKEGKK(SEQ ID No 45),KKKIYVSIDVTLQQLESHKKK(SEQ ID No 21),KKKKYVSIDVTLQQLESHKKK(SEQ ID No 46),KKKIKVSIDVTLQQLESHKKK(SEQ ID No 47),KKKIYKSIDVTLQQLESHKKK(SEQ ID No 48),KKKIYVKIDVTLQQLESHKKK(SEQ ID No 49),KKKIYVSIDVKLQQLESHKKK(SEQ ID No 50),KKKIYVSIDVTLKQLESHKKK(SEQ ID No 51),KKKIYVSIDVTLQKLESHKKK(SEQ ID No 52),KKKIYVSIDVTLQQKESHKKK(SEQ ID No 53),KKKIYVSIDVTLQQLKSHKKK(SEQ ID No 54),KKKIYVSIDVTLQQLEKHKKK(SEQ ID No 55),KKKIYVSIDVTLQQLESKKKK(SEQ ID No 56),KKKYVSIDVTLQQLEKKK(SEQ ID No 57),KKKYVSIDVKLQQLEKKK(SEQ ID No 58),KKKYVSIDVTLQKLEKKK(SEQ ID No 59),KKKYVSIDVTLQQKEKKK(SEQ ID No 60),KKKYVSIDVKLQKKEKKK(SEQ ID No.61)。

所述肽可以选自下组，其都鉴定为apitopes并具有改进的溶解性：KKGKYVSIDVTLQQLESHGKK(SEQ ID No.22),KKGIYKSIDVTLQQLESHGKK(SEQ ID No.24),KKGYVSIDVTLQQLEGKK(SEQ ID No.31),KKGYVSIDVKLQQLEGKK(SEQ ID No.32),KKGYVSIDVTLQKLEGKK(SEQ ID No.33),KKGYVSIDVTLQQKEGKK(SEQ ID No.34),KKGYVSIDVKLQKKEGKK(SEQ ID No.35),KKGIYVSIDVKLQKKEGKK(SEQ ID No.40),KKGTYVSIDVKLQQLEGKK(SEQ ID No.42),KKGTYVSIDVKLQKKEGKK(SEQ ID No.45),KKKKYVSIDVTLQQLESHKKK(SEQ ID No.46),KKKIYKSIDVTLQQLESHKKK(SEQ ID No.48),KKKIYVKIDVTLQQLESHKKK(SEQ ID No.49),KKKYVSIDVTLQQLEKKK(SEQ ID No.57),KKKYVSIDVKLQQLEKKK(SEQ ID No.58),KKKYVSIDVTLQQKEKKK(SEQ ID No.60),KKKYVSIDVKLQKKEKKK(SEQ ID No.61)

所述肽可以选自下组，其都鉴定为apitopes并具有最佳的溶解性：KKGIYKSIDVTLQQLESHGKK(SEQ ID No.24),KKGYVSIDVKLQQLEGKK(SEQ ID No 32),KKGYVSIDVTLQKLEGKK(SEQ ID No.33),KKGYVSIDVTLQQKEGKK(SEQ ID No.34),KKGYVSIDVKLQKKEGKK(SEQ ID No.35),KKGTYVSIDVKLQQLEGKK(SEQ Id No.42),KKGTYVSIDVKLQKKEGKK(SEQ ID No.45),KKKKYVSIDVTLQQLESHKKK(SEQ ID No.46),KKKIYKSIDVTLQQLESHKKK(SEQ ID No.48),KKKYVSIDVTLQQLEKKK(SEQ ID No.57),KKKYVSIDVTLQQKEKKK(SEQ ID No.60)。

以下肽是特别令人感兴趣的：KKGYVSIDVTLQKLEGKK(SEQ ID No.32),KKGYVSIDVKLQKKEGKK(SEQ ID No.34),KKKKYVSIDVTLQQLESHKKK(SEQ ID No.46),KKKIYKSIDVTLQQLESHKKK(SEQ ID No.48),KKKYVSIDVTLQQLEKKK(SEQ ID No.57),KKKYVSIDVTLQQKEKKK(SEQ ID No.60)。

在第二个方面，本发明提供包含多个肽的组合物，包括根据本发明的第一个方面的一个或多个肽。

在第三个方面，本发明提供根据本发明的第一个方面的肽，或根据本发明的第二个方面的组合物，用于抑制或阻止TSHR自身抗体的体内产生。

在第四个方面，本发明提供根据本发明的第一个方面的肽，或根据本发明的第二个方面的组合物，用于在受试者中治疗和/或预防格雷夫氏病。

在第五个方面，本发明提供根据本发明的第一个方面的肽，或根据本发明的第二个方面的组合物，在制造用于抑制或阻止TSHR自身抗体的体内产生的药物中的用途。

在第六个方面，本发明提供根据本发明的第一个方面的肽，或根据本发明的第二个方面的组合物，在制造用于治疗和/或预防格雷夫氏病的药物中的用途。

在第七个方面，本发明提供用于在受试者中抑制或阻止TSHR自身抗体的产生的方法，其包括向所述受试者施用根据本发明的第一个方面的肽，或根据本发明的第二个方面的组合物的步骤。

在第八个方面，本发明提供用于在受试者中治疗格雷夫氏病的方法，其包括向所述受试者施用根据本发明的第一个方面的肽，或根据本发明的第二个方面的组合物的步骤。

所述受试者可以是HLA-DR3或HLA-DR4。

发明详述

肽

在第一个方面，本发明涉及肽。

术语“肽”用在正常意义下表示通常通过相邻氨基酸的α-氨基和羧基基团之间的肽键彼此相连的一系列残基(通常是L-氨基酸)。所述术语包括修饰的肽和合成的肽类似物。

本发明的肽可以使用化学方法(Peptide Chemistry,A practicalTextbook.Mikos Bodansky,Springer-Verlag,Berlin.)制造。例如，肽可以通过固相技术(Roberge JY等，(1995)Science 269:202-204)合成，从树脂上切下，并通过制备用高效液相色谱法(例如Creighton(1983)Proteins Structures And Molecular Principles,WHFreeman and Co,New York NY)纯化。可以实现自动化合成，例如，依照制造商提供的说明书使用43 1A肽合成器(Perkin Elmer)进行。

或者，所述肽可以通过重组手段，或通过从较长的多肽切割生成。例如，可以从促甲状腺素受体蛋白切割获得所述肽，其可以接着修饰一个末端或两个末端。肽的构成可以通过氨基酸分析或测序(例如Edman降解程序)来确认。

为了实践目的，所述肽可以显示各种其它特性。例如，重要的是，肽在体内足够稳定从而是治疗上有用的。所述肽的体内半衰期可以为至少10分钟、30分钟、4小时、或24小时。

所述肽可以也表现出良好的体内生物利用度。肽可以维持体内构象，使其能够与细胞表面的MHC分子结合而没有无过多阻碍。

Apitopes

在适应性免疫反应中，T淋巴细胞能够识别蛋白抗原的内部表位。抗原呈递细胞(APC)摄取蛋白质抗原并将其降解为短的肽片段。肽可以结合细胞内的主要组织相容性复合体(MHC)I类或II类分子，并被携带到细胞表面。当与MHC分子一起被呈递到细胞表面时，所述肽可以被T细胞识别(通过T细胞受体(TCR))，在这种情况下所述肽是T细胞表位。

因此，表位是可衍生于抗原的肽，其能够结合MHC I类或II类分子的肽结合沟，并被T细胞识别。

最小表位是可衍生于表位的最短片段，其能够结合MHC I类或II类分子的肽结合沟，并被T细胞识别。对于给定的免疫原性区，通常可能产生起表位作用的重叠肽的“巢式集合(nested set)”，它们全部包含最小表位，但在其侧翼区上不同。

出于同样的原因，对于特定的MHC分子:T细胞联合，可能通过测量对截短肽的响应鉴定最小表位。例如，如果对重叠库中包含残基1-15的肽获得响应，可以使用在两端截短的组(即1-14、1-13、1-12等，以及2-15、3-15、4-15等)来鉴定最小表位。

本发明的发明人之前已经确定了肽在没有进一步处理的情况下结合MHC I或II类分子并被呈递给T细胞的能力和肽在体内诱导耐受性的能力之间有联系(WO 02/16410)。如果肽太长以至于在不进一步处理(例如修剪)的情况下不能结合MHC分子的肽结合沟，或以不适当的构象结合，则其在体内将不会是致耐受性的。另一方面，如果所述肽的大小和构象适合于直接结合MHC肽结合沟，并被呈递给T细胞，则这种肽可以预测为对于诱导耐受性是有用的。

因此，可能通过研究肽在没有进一步抗原处理的情况下能否在体外结合MHC I或II类分子并被呈递给T细胞来研究肽的致耐受性能力。

本发明所述的肽是apitopes(抗原处理非依赖性表位，Antigen Processing-Independent epiTOPES)，因为其能够在不进一步抗原处理的情况下结合MHC分子并刺激来自TSHR特异性T细胞的应答。根据描述于WO 02/16410的基于规则的方法，可以预测这种apitopes引起对TSHR的耐受性。

本发明的肽可以是任何长度，其能够在不进一步处理的情况下结合MHC I或II类分子。典型地，本发明的所述肽能够结合MHC II类。

结合MHC I类分子的肽的长度通常为7到13，更通常8到10个氨基酸。肽的结合在其两端通过肽主链和所有MHC I类分子的肽结合沟中的不变位点中的原子之间的接触稳定。在沟的两端有不变位点，其结合肽的氨基和羧基端。肽长度的变化通过所述肽主链中通常在允许柔性的脯氨酸或甘氨酸残基的扭结来适应。

结合MHC II类分子的肽通常为长度8到20氨基酸，更通常长度10到17个氨基酸长，并可以更长(例如多达40个氨基酸)。这些肽沿着(与MHC I类肽结合沟不同)在两端开口的MHC II肽结合沟的伸展构象展开。所述肽主要通过主链原子与作为肽结合沟衬里(line)的保守残基的接触保持在适当位置。

本发明的肽可以包含8至30个氨基酸，例如8至25个氨基酸，8至20个氨基酸，8至15个氨基酸，或8至12个氨基酸。

部分

本发明的肽可以包含全部或部分的TSHR衍生的肽，所述TSHR衍生的肽示于SEQ IDNO:1-3。

术语“部分”指代衍生于SEQ ID NO:1-3并且至少含有所述肽的最小表位的肽。

这样的肽可以包含一个或多个突变，通常是所述TSHR衍生的序列中的氨基酸取代。可以用氨基酸取代氨基酸，如甘氨酸，赖氨酸或谷氨酸。所述肽可以包含来自TSHR衍生的序列的高达三个，高达两个或一个氨基酸取代。

这样的肽在一个或两个末端可以包含氨基酸，其不能衍生于TSHR序列。例如，所述肽在一个或两个末端可以具有一个或多个甘氨酸和/或赖氨酸和/或谷氨酸残基。例如，另外的氨基酸可以包含在一个或两个末端的甘氨酸或赖氨酸间隔物(spacer)，接着是氨基酸对KK，KE，EK或EE。

例如，所述肽可以具有以下式：

KKG-TSHR衍生部分-GKK

所述肽(包括非TSHR衍生的氨基酸)必须是apitope，即能够在没有抗原加工的情况下在体外结合MHC分子并呈递到T细胞。

促甲状腺激素受体(TSHR)

GD是一种由靶向一级自身抗原(primary auto-antigen)，促甲状腺激素受体(TSHR)的自身反应性T和B淋巴细胞引起的自身免疫疾病。

TSHR是甲状腺中甲状腺滤泡细胞上的G蛋白偶联受体，其在结合其抗体促甲状腺激素后通过cAMP信号级联刺激甲状腺素(T4)和三碘甲腺原氨酸(tri iodothyronine)(T3)的产生。一经APC对TSHR的内在化，降解并呈递，T细胞变得活化，并与自身反应性B细胞相互作用，其进而产生针对TSHR的刺激性激动性自身抗体(stimulating agonistic auto-antibodies)。该甲状腺刺激性免疫球蛋白结合与TSH相同的受体袋，活化TSHR介导的信号转导并导致从甲状腺产生过多的甲状腺激素和甲状腺生长。

TSHR，也称为促甲状腺素受体，主要表达于甲状腺上皮细胞上。

该TSHR完全抗体(holoreceptor)具有764个残基并包含与TSH结合的N端胞外域，螺旋(serpentine)(或跨膜域)和C末端胞内域。

TSHR包含具有高度保守的Cys残基的大的胞外域(418个氨基酸)，所述Cys残基促进胞外域的三级结构形成，其在配体结合和无活性受体构象中是重要的。所述胞外域包含超过一半的总体氨基酸长度，并且足以用于高亲和力配体结合。当转运到细胞表面后，该受体分子经历分子内切割，导致残基316和366之间50个氨基酸序列的去除。结果是该受体包含两个亚基，包含胞外配体结合域的α亚基和包含跨膜域和短的C末端序列的β亚基，它们通过二硫键结合到一起。在接下来的步骤中，该α亚基脱落，导致细胞膜上过多的除去了配体结合域的β亚基。

在循环TSH与TSHR结合后，G蛋白信号级联活化腺苷酸环化酶和细胞内cAMP水平升高。cAMP活化甲状腺细胞的所有功能方面，包括碘泵送，甲状腺球蛋白合成，碘化，内吞作用和蛋白水解，甲状腺过氧化物酶活性和激素释放。

成熟TSHR的氨基酸序列如下给出(SEQ ID No.21)。

1 mrpadllqlv llldlprdlg gmgcssppce chqeedfrvt ckdiqripsl ppstqtlkli

61 ethlrtipsh afsnlpnisr iyvsidvtlq qleshsfynl skvthieirn trnltyidpd

121 alkelpllkf lgifntglkm fpdltkvyst diffileitd npymtsipvn afqglcnetl

181 tlklynngft svqgyafngt kldavylnkn kyltvidkda fggvysgpsl ldvsqtsvta

241 lpskglehlk eliarntwtl kklplslsfl hltradlsyp shccafknqk kirgileslm

301 cnessmqslr qrksvnalns plhqeyeenl gdsivgykek skfqdthnna hyyvffeeqe

361 deiigfgqel knpqeetlqa fdshydytic gdsedmvctp ksdefnpced imgykflriv

421 vwfvsllall gnvfvllill tshyklnvpr flmcnlafad fcmgmyllli asvdlythse

481 yynhaidwqt gpgcntagff tvfaselsvy tltvitlerw yaitfamrld rkirlrhaca

541 imvggwvccf llallplvgi ssyakvsicl pmdtetplal ayivfvltln ivafvivccc

601 yvkiyitvrn pqynpgdkdt kiakrmavli ftdficmapi sfyalsailn kplitvsnsk

661 illvlfypln scanpflyai ftkafqrdvf illskfgick rqaqayrgqr vppknstdiq

721 vqkvthdmrq glhnmedvye lienshltpk kqgqiseeym qtvl

本发明的肽至少部分地可衍生于TSHR。所述肽或其部分可以可衍生于TSHR的64-92,78-106,107-135,136-164或201-229区域。所述肽或部分可以可衍生于所述抗原的片段，其通过抗原呈递细胞对抗原的天然处理生成。

TSHR的64-92区域(RN_4)具有以下序列：

LRTIPSHAFSNLPNISRIYVSIDVTLQQL(SEQ ID No 2)

所述肽可以包含来自以下肽的最小表位：

TSHR 73-87(RNB_4J):SNLPNISRIYVSIDV(SEQ ID No 15)

TSHR 73-87(RNB_4J-GKK):KKGSNLPNISRIYVSIDVGKK(SEQ ID No 16)

所述肽可以包含来自以下肽的最小表位：

TSHR 74-88(RNB_4K):NLPNISRIYVSIDVT(SEQ ID No.62)

TSHR 74-88(RNB_4K-GKK):KKGNLPNISRIYVSIDVTGKK(SEQ ID No.63)

TSHR的78-106区域(RN_5)具有以下序列：

ISRIYVSIDVTLQQLESHSFYNLSKVTHI(SEQ ID No 1)

所述肽可以包含来自以下肽的最小表位：TSHR 78-92(RNB_5A),79-93(RNB_5B),80-94(RNB_5C),81-95(RNB_5D),82-96(RNB_5E)和83-97(RNB_5F)。

TSHR78-92,79-93,80-94,81-95,82-96和83-97的序列为：

TSHR的136-164区域(RN_9)具有以下序列：

TGLKMFPDLTKVYSTDIFFILEITDNPYM (SEQ ID No 3)

所述肽可以包含来自以下肽的最小表位：TSHR 136-150(RNB_9A),137-151(RNB_9B),138-152(RNB_9C)和139-153(RNB_9D)。

TSHR136-150,137-151,138-152和139-153的序列为：

TSHR的180-207区域(RNB_12)具有以下序列：

LTLKLYNNGFTSVQGYAFNGTKLDAVYL(SEQ ID No 64)

所述肽可以包含来自下表的肽之一的最小表位：

所述肽可以包含来自以下肽之一的最小表位：

TSHR 180-194(RNB_12A):LTLKLYNNGFTSVQG(SEQ ID No.65)

TSHR 180-194(RNB_12B):TLKLYNNGFTSVQGY(SEQ ID No.66)

TSHR 180-194(RNB_12B-KKK):KKKTLKLYNNGFTSVQGYKKK(SEQ ID No.67).

本发明还提供包含以下序列的肽：

KK-(G/K)-aa1-(RNB-5D肽)-aa2-aa3-Z-(G/K)-KK

其中aa1为无氨基酸，I，K或T；

RNB-5D肽是YVSIDVTLQQLE，或其变体，其中一个或多个氨基酸被替换为K，

aa2为无氨基酸，S或K

aa3为无氨基酸，H或K

其在没有抗原处理的情况下在体外能够结合MHC分子并被呈递给T细胞。

在这一实施方案中，所述RNB-5D肽可以是YVSIDVTLQQLE，或其变体，其中一个两个或三个氨基酸被替换为K。

所述肽可以选自下组，其全部经鉴定为apitopes(表1)：KKGIYVSIDVTLQQLESHGKK(SEQ ID No 12),KKGKYVSIDVTLQQLESHGKK(SEQ ID No 22),KKGIKVSIDVTLQQLESHGKK(SEQID No 23),KKGIYKSIDVTLQQLESHGKK(SEQ ID No 24),KKGIYVSIDVKLQQLESHGKK(SEQ ID No25),KKGIYVSIDVTLQKLESHGKK(SEQ ID No 26),KKGIYVSIDVTLQQKESHGKK(SEQ ID No 27),KKGIYVSIDVTLQQLKSHGKK(SEQ ID No 28),KKGIYVSIDVTLQQLEKHGKK(SEQ ID No 29),KKGIYVSIDVTLQQLESKGKK(SEQ ID No 30),KKGYVSIDVTLQQLEGKK(SEQ ID No 31),KKGYVSIDVKLQQLEGKK(SEQ ID No 32),KKGYVSIDVTLQKLEGKK(SEQ ID No 33),KKGYVSIDVTLQQKEGKK(SEQ ID No 34),KKGYVSIDVKLQKKEGKK(SEQ ID No 35),KKGIYVSIDVTLQQLEGKK(SEQ ID No 36),KKGIYVSIDVKLQQLEGKK(SEQ ID No 37),KKGIYVSIDVTLQKLEGKK(SEQ ID No 38),KKGIYVSIDVTLQQKEGKK(SEQ ID No 39),KKGIYVSIDVKLQKKEGKK(SEQ ID No 40),KKGTYVSIDVTLQQLEGKK(SEQ ID No 41),KKGTYVSIDVKLQQLEGKK(SEQ ID No 42),KKGTYVSIDVTLQKLEGKK(SEQ ID No 43),KKGTYVSIDVTLQQKEGKK(SEQ ID No 44),KKGTYVSIDVKLQKKEGKK(SEQ ID No 45),KKKIYVSIDVTLQQLESHKKK(SEQ ID No 21),KKKKYVSIDVTLQQLESHKKK(SEQ ID No 46),KKKIKVSIDVTLQQLESHKKK(SEQ ID No 47),KKKIYKSIDVTLQQLESHKKK(SEQ ID No 48),KKKIYVKIDVTLQQLESHKKK(SEQ ID No 49),KKKIYVSIDVKLQQLESHKKK(SEQ ID No 50),KKKIYVSIDVTLKQLESHKKK(SEQ ID No 51),KKKIYVSIDVTLQKLESHKKK(SEQ ID No 52),KKKIYVSIDVTLQQKESHKKK(SEQ ID No 53),KKKIYVSIDVTLQQLKSHKKK(SEQ ID No 54),KKKIYVSIDVTLQQLEKHKKK(SEQ ID No 55),KKKIYVSIDVTLQQLESKKKK(SEQ ID No 56),KKKYVSIDVTLQQLEKKK(SEQ ID No 57),KKKYVSIDVKLQQLEKKK(SEQ ID No 58),KKKYVSIDVTLQKLEKKK(SEQ ID No 59),KKKYVSIDVTLQQKEKKK(SEQ ID No 60),KKKYVSIDVKLQKKEKKK(SEQ ID No.61)。

所述肽可以选自下组，其全部经鉴定为apitopes并具有改进的溶解度：

KKGKYVSIDVTLQQLESHGKK(SEQ ID No.22),KKGIYKSIDVTLQQLESHGKK(SEQ IDNo.24),KKGYVSIDVTLQQLEGKK(SEQ ID No.31),KKGYVSIDVKLQQLEGKK(SEQ ID No.32),KKGYVSIDVTLQ KLEGKK(SEQ ID No.33),KKGYVSIDVTLQQKEGKK(SEQ ID No.34),KKGYVSIDVKLQKKEGKK(SEQ ID No.35),KKGIYVSIDVKLQKKEGKK(SEQ ID No.40),KKGTYVSIDVKLQQLEGKK(SEQ ID No.42),KKGTYVSIDVKLQKKEGKK(SEQ ID No.45),KKKKYVSIDVTLQQLESHKKK(SEQ ID No.46),KKKIYKSIDVTLQQLESHKKK(SEQ ID No.48),KKKIYVKIDVTLQQLESHKKK(SEQ ID No.49),KKKYVSIDVTLQQLEKKK(SEQ ID No.57),KKKYVSIDVKLQQLEKKK(SEQ ID No.58),KKKYVSIDVTLQQKEKKK(SEQ ID No.60),KKKYVSIDVKLQKKEKKK(SEQ ID No.61)。

所述肽可以选自下组，其全部经鉴定为apitopes并具有最优的溶解度：KKGIYKSIDVTLQQLESHGKK(SEQ ID No.24),KKGYVSIDVKLQQLEGKK(SEQ ID No 32),KKGYVSIDVTLQKLEGKK(SEQ ID No.33),KKGYVSIDVTLQQKEGKK(SEQ ID No.34),KKGYVSIDVKLQKKEGKK(SEQ ID No.35),KKGTYVSIDVKLQQLEGKK(SEQ Id No.42),KKGTYVSIDVKLQKKEGKK(SEQ ID No.45),KKKKYVSIDVTLQQLESHKKK(SEQ ID No.46),KKKIYKSIDVTLQQLESHKKK(SEQ ID No.48),KKKYVSIDVTLQQLEKKK(SEQ ID No.57),KKKYVSIDVTLQQKEKKK(SEQ ID No.60)。

以下肽特别感兴趣：KKGYVSIDVTLQKLEGKK(SEQ ID No.32),KKGYVSIDVKLQKKEGKK(SEQ ID No.34),KKKKYVSIDVTLQQLESHKKK(SEQ ID No.46),KKKIYKSIDVTLQQLESHKKK(SEQID No.48),KKKYVSIDVTLQQLEKKK(SEQ ID No.57),KKKYVSIDVTLQQKEKKK(SEQ ID No.60)。

耐受性

在针对任意抗原，不论是自身抗原还是外源抗原，T细胞表位在适应性免疫应答中扮演着中心角色。已经通过实验模型的使用证明了T细胞表位在超敏感性疾病(包括变态反应，自身免疫性疾病和移植排斥)中扮演的中心角色。可以通过注射合成的肽(基于T细胞表位的结构)与佐剂的组合诱导炎性或变应性疾病。

比较而言，已经显示了可能通过施用可溶形式的肽表位来诱导对特定抗原的免疫原性耐受性。可溶性肽抗原的施用已被证明为是一种在实验性自身免疫性脑脊髓炎(EAE：一种多发性硬化症(MS)的模型)(Metzler和Wraith(1993)Int.Immunol.5:1159-1165；Liu和Wraith(1995)Int.Immunol.7:1255-1263；Anderton和Wraith(1998)Eur.J.Immunol.28:1251-1261)；以及关节炎、糖尿病和葡萄膜视网膜的实验模型(综述于Anderton和Wraith(1998)同上)中抑制疾病的有效手段。这也被证明是在EAE中治疗正在进行的疾病的一种手段(Anderton和Wraith(1998)同上)。

耐受性是对抗原不应答。对自身抗原的耐受性是免疫系统的一个重要特征，当失去这点时，可导致自身免疫性疾病。适应性免疫系统必须保持响应大量的传染源的能力，同时避免其自身组织中含有的自身抗原的自身免疫攻击。这在很大程度上受不成熟的T淋巴细胞对胸腺中凋亡细胞死亡的敏感性控制(中枢性耐受性)。然而，不是所有的自身抗原都能在胸腺中检测到，因此自身反应性的胸腺细胞的死亡仍然不完全。因而，也存在这样的机制，通过该机制，外周组织中成熟的自身反应性T淋巴细胞获得耐受性(外周耐受性)。Anderton等人(1999)(Immunological Reviews 169:123-137)给出了对中枢和外周耐受性机制的综述。

目前认为GD由TSHR刺激性自身抗体引起，其结合并活化TSHR，从而刺激甲状腺激素的合成和分泌，以及甲状腺的生长。本发明的肽能够诱导对TSHR的耐受，使得当施用到受试者时，它们可以恢复对TSHR自身蛋白的耐受并减少病原性免疫应答。

耐受性可源自或特征在于在至少一部分CD4+T细胞中诱导无反应性。为了活化T细胞，肽必须与能够向T细胞传递两种信号的“专门”APC缔合。第一信号(信号1)通过APC细胞表面上的MHC-肽复合体来递送，并通过TCR被T细胞接收。第二信号(信号2)通过APC表面上的共同刺激分子(如CD80和CD86)来递送，并被T细胞表面上的CD28接收。人们认为，当T细胞在缺乏信号2的情况下接收信号1时，其并未被活化，并且事实上变得无反应性。无反应性的T细胞对随后的抗原性攻击是难控制的(refractory)，并且能够抑制其它免疫应答。无反应性的T细胞被认为牵涉介导T细胞耐受性。

在它们能与MHC分子一起被呈递之前需要加工的肽不诱导耐受性，因为它们必须被成熟的抗原呈递细胞处理。成熟的抗原呈递细胞(如巨噬细胞、B细胞和树突细胞)能够进行抗原加工，但也能够向T细胞递送信号1和2两者，导致T细胞活化。另一方面，apitope能够结合未成熟的APC上的II类MHC。因而，它们无需共同刺激就被呈递给T细胞，导致T细胞无反应性和耐受性。

当然，apitope也能结合成熟APC细胞表面处的MHC分子。然而，免疫系统含有比成熟的APC更丰富的不成熟APC(已经提出少于10％的树突细胞被活化，Summers等人(2001)Am.J.Pathol.159:285-295)。因此，apitope的默认状态为无反应性/耐受性，而非活化。

已显示当耐受性通过肽吸入诱导时，抗原特异性的CD4+T细胞增殖的能力降低。同时，由这些细胞产生的IL-2、IFN-γ和IL-4的生成被下调，但IL-10的生成增加。已显示，对处于肽诱导的耐受性状态中的小鼠中的IL-10进行中和完全恢复了对疾病的易感性。已提出，调控细胞的群体持续保持在产生IL-10并且介导免疫调节的能耐受状态(Burkhart等人(1999)Int.Immunol.11:1625-1634)。

可以通过本领域的已知技术查看下列各项的水平的降低在体内监控对TSHR的耐受性的诱导：

(i)TSHR自身抗体；

(ii)TSHR特异性的CD4+T细胞；和/或

(iii)能够分泌TSHR自身抗体的B细胞。

因此，耐受性的诱导也可以通过各种技术监控，包括：

(a)在CD4+T细胞中诱导无反应力(其可以通过使用抗原在体外后续激发来检测)。

(b)CD4+T细胞群的改变，包括

(i)增殖的减少；

(ii)IL-2、IFN-γ和IL-4产生的下调；以及

(iii)IL-10产生的增加。

如本文使用的，术语“致耐受的”表示能够诱导耐受性。

组合物

本发明也涉及组合物，如包含根据本发明的第一或第二个方面的一种或多种肽的药学组合物。

所述肽可以包含多种肽，例如，两种、三种、四种、五种或六种肽。

本发明的组合物可以用于预防性或治疗性用途。

当用于预防性用途施用时，所述组合物可以减少或阻止对TSHR的免疫应答的产生。免疫应答的水平小于在尚未使用所述组合物治疗患者时会获得的水平。术语“减少”指示观察到免疫应答的部分减少，如在尚未使用所述组合物治疗患者时已经观察到的应答(或在未治疗的患者中在相同时间段内观察到的应答)的50％、70％、80％或90％减少。术语“预防”指示没有观察到可感知的对TSHR的免疫应答。

当用于治疗性用途施用时，所述组合物可以抑制已经在进行的对TSHR的免疫应答。术语“抑制”指示与肽治疗之前的水平相比，或与尚未给予治疗在相同时间点时观察到的水平相比正在进行的免疫应答水平的降低。

使用本发明所述组合物的治疗可以导致以下任意项或所有项的水平降低：

(i)TSHR自身抗体；

(ii)TSHR特异性的CD4+T细胞；和/或

(iii)分泌TSHR自身抗体的B细胞。

所有这些因子的检测可以使用本领域已知技术，例如ELISA、流式细胞术等实施。

使用本发明所述组合物的治疗也可以或备选可以导致TSHR特异性的CD4+T细胞的无反应力。无反应力可以通过例如在体外用TSHR的后续激发检测。

当存在两种或更多种apitope时，药物组合物可为试剂盒形式，其中一些或每种apitope均单独提供以用于同时给药、单独给药或顺序给药。

或者(或另外)，如果药物组合物(或其任何部分)以多剂量形式给药，则每一剂量可以单独包装。

同样，在本发明的药物组合物中，每种apitope可与任何合适的一种或多种粘合剂、润滑剂、悬浮剂、包被剂或助溶剂混合。

制剂

所述组合物可以制备为可注射液(作为液体溶液或悬浮液)；也可以制备成注射前适于在液体中溶解或悬浮的固体形式。也可以乳化制剂，或在脂质体中包囊肽。活性成分可以与赋形剂混合，所述赋形剂是药学上可接受的并且与所述活性成分相容。适合的赋形剂是例如水、盐水(例如磷酸盐缓冲盐水)、右旋糖、甘油、乙醇等及其组合。

另外，如果需要，组合物可以包含少量的辅助物质，例如润湿或乳化剂和/或pH缓冲试剂。缓冲盐包括磷酸盐、柠檬酸盐、乙酸盐、氢氯酸和/或可以使用氢氧化钠进行pH调节。对于稳定化，可以使用二糖，如蔗糖或海藻糖。

如果所述组合物包含多种肽，那么所述肽的相对比率可以大约相等。或者，每种肽的相对比例可以是改变的，例如，以将致耐受性应答聚焦于特定的自身反应性T细胞子集，或如果发现一种肽比其它肽在特定的HLA类型中更好起作用。

配制后，所述组合物可以掺入到无菌的容器中，其然后被密封并储存于低温，例如4℃或它可以被冻干。

便利地，组合物被制备为冻干(冷冻干燥)粉。冻干允许以稳定形式长期储存。冻干步骤是本领域众所周知的，见例如http://www.devicelink.com/ivdt/archive/97/01/006.html。在冷冻干燥前通常使用膨胀剂(bulking agent)，例如甘露醇、右旋糖苷或甘氨酸。

组合物可以通过方便的方式施用，例如通过口服、静脉内(在水溶性的情况中)、肌肉内、皮下、舌下、鼻内、皮内或栓剂途径或植入(例如使用缓慢释放分子)。

组合物可以有利地通过鼻内、皮下或皮内途径施用。

本发明的所述肽和组合物可以用于治疗人类受试者。所述受试者可以患有GD。所述受试者可以具有TSHR自身抗体。

受试者可以是与有形成抑制性抗THSR自身抗体的倾向相关的HLA单倍型(haplotype)。受试者可以表达HLA-DR3或HLA-DR4。确定个体HLA单倍型的方法是本领域已知的。

典型地，内科医师将确定最适合用于个体受试者的实际剂量，并且它随着具体患者的年龄、体重和反应而变化。

在一个优选的实施方案中，可以遵循“剂量递增”方案，其中以上升浓度对患者给予多剂量。例如，已经在针对蜂毒液变态反应的免疫治疗应用中对磷脂酶A2肽应用这种方法(Müller等，(1998)J.Allergy Clin Immunol.101:747-754和Akdis等，(1998)J.Clin.Invest.102:98-106)。

试剂盒

便利地，如果所述组合物包含多种肽，那么它们可以以混合的组合物或混合物的形式一起施用。然而，可以存在着如下的情况，其中优选以试剂盒的形式分开提供所述肽，用于同时、单独、序贯或联合施用。

所述试剂盒也可以包含混合和/或施用手段(例如用于鼻内施用的蒸发器(vapouriser)，或用于皮下/皮内剂量给药的注射器或针)。所述试剂盒也可以包含使用说明书。

本发明所述的药物组合物或试剂盒可以用于治疗和/或预防疾病。

具体地，所述组合物/试剂盒可以用于治疗和/或预防GD。

实施例

实施例1-选择HLA-DE3TSHR肽

为了鉴定TSHR中的重要表位区，将TSHR的ECD(AA20-418)分为28个重叠的、28-30个氨基酸(28-30聚体)的肽，其重叠15个氨基酸，如下文所示。

接着，通过使用200μg的在CFA中乳化的3种肽的合并物免疫HLA-DRB1*0301转基因小鼠(DR3小鼠)评估了所有肽的免疫原性。10天后，分离LN细胞和脾细胞并在体外使用10-25μg/mL相应的单独肽刺激。基于刺激指数(SI；肽刺激的细胞3H-胸苷掺入(每分钟计数)除以非刺激的细胞的3H-胸苷掺入)，发现肽RNB-5和RNB-9为高免疫原性(SI＞10)。

图1示出了从RNB-5免疫的小鼠分离的LN和脾细胞在体外对RNB-5刺激强烈反应。

此处描述的所有实施例将集中于肽RNB-5。

实施例2-鉴定RNB-5中的apitope

为了确定RNB-5中的准确的表位位置，使用标准F-moc化学合成了跨越RNB-5的15聚体重叠肽的组。每个肽移动1个氨基酸，如以下所示：

首先，使用从DR3小鼠生成的杂交瘤分析肽。对TSHR和RNB-5特异性的杂交瘤表明对新鲜和固定的VAVY细胞两者呈递的RNB-5A-F起反应。图2中示出了代表性克隆的抗原诱导的IL-2产生。

为了测定这些15聚体肽结合HLA-DR分子的能力，使用了2种软件工具：NetMHCII(http://www.cbs.dtu.dk/services/NetMHCII)和Immune Epitope DataBase(http://tools.immuneepitope.org/analyze/html/mhc_II_binding.html)。使用这两种方法，鉴定了巢式肽RNB-5A直到RNB-5F为对HLA-DRB1*0301和HLA-DRB1*0401分子两者的强结合物。

尽管人类中的GD与HLA-DRB1*0301单倍型是强烈相关的，但是在GD患者中也经常发生HLA-DRB1*0401单倍型。由于RNB-5A至5F肽经预测结合HLA-DRB1*0401分子，测试了RNB-5在DR4小鼠中体内产生免疫应答的能力。从RNB-5/CFA免疫的DR4小鼠分离的LN细胞和脾细胞当使用RNB-5巢式肽刺激时显示强免疫应答。另外，DR3小鼠中生成的RNB-5特异性杂交瘤当由BM14细胞(HLA-DRB1*0401)呈递时响应RNB-5巢式肽。因此，通过使用TSHR/CFA免疫DR4小鼠生成了新的杂交瘤。选择了对TSHR蛋白和RNB-5肽两者特异性的杂交瘤以鉴定RNB-5中的apitopes。肽RNB5A至5F再次鉴定为apitopes(图3)。通过在C-和N末端上添加氨基酸GKK修饰RNB-5DEF巢式肽。当由新鲜和固定的APC两者呈递时，TSHR-和RNB特异性的杂交瘤也对这些修饰的肽起反应。总的来说，这些数据强调了这一区域对于具有HLA-DRB1*0301或HLA-DRB1*0401单倍型的GD患者感兴趣。

显示了通过使用TSHD/CFA免疫DR4小鼠生成的TSHR特异性杂交瘤的一部分结合RNB-4而不是RNB-5，提示在TSHR中其它免疫原性区域的存在。选择了RNB-4特异性杂交瘤来鉴定RNB-4中的apitopes。鉴定了肽RNB-4J为apitope(图4)。所述RNB-4巢式肽序列示于下表。

命名修饰的序列

RNB_4J-GKK KKGSNLPNISRIYVSIDVGKK

RNB_4K-GKK KKGNLPNISRIYVSIDVTGKK

也调查了RNB-5D修饰的肽的apitope状态(图20)。

除了RNB-4和RNB-5apitopes外，计算机(in silico)预测软件工具还鉴定了肽RNB-9A至9D为HLA-DRB1*0301分子的强结合剂。所述肽序列示于下表。

测试了使用TSHR/CFA免疫的HLA-DR3或HLA-DR4小鼠分离的TSHR和RNB-5特异性杂交瘤克隆对RNB-5D修饰的肽的反应。该结果示于图11至15中。

实施例3-离体耐受性测定

为了评价RNB-5apitopes诱导耐受的能力，首先在健康的HLA-DRB1*0301或HLA-DRB1*0401小鼠中离体研究了这些apitopes抑制免疫应答的能力。如方法小节所述，根据高剂量或剂量递增方案使用不同的RNB-5apitopes预处理小鼠。该研究表明在DR3和DR4小鼠两者中，使用RNB-5apitopes预处理显著降低了TSHR诱导的T细胞增殖(图6A-D)。通过在C-和N-末端添加氨基酸‘GKK’修饰RNB-5DEF巢式肽。使用这些修饰的apitopes的预处理也显著降低了TSHR诱导的T细胞增殖(图6E-F)。

预测RNB-9A至9D强烈结合HLA-DRB1*0301分子，并且还研究了它们诱导特异性免疫耐受的能力。根据剂量递增日程表，使用RNB-9A至9D预处理DR3小鼠。RNB-9B和9C预处理导致LN和脾细胞两者中TSHR诱导的T细胞增殖的显著降低(图7)。

还显示肽RNB 4K-GKK在DR4小鼠中显著降低了TSHR诱导的T细胞增殖。

RNB-5D修饰的肽也显著降低TSHR诱导的T细胞增殖。图19中示出了使用RNB5D-K1,RNB5D-K3和RNB5D-K16的代表性实验。

实施例4-用于GD的动物模型

为了研究RNB-5apitopes降低小鼠中GD样症状的能力，开发了两种不同的GD动物模型。

第一，使用TSHE/CFA免疫C57/B16小鼠以诱导抗TSHR抗体产生。为了研究增强免疫(boost immunization)是否将进一步增加抗TSHR抗体水平，4周后一组小鼠接受TSHR/IFA的二次免疫。免疫后2周，免疫一次的小鼠的血清中抗TSHR抗体水平达到平台水平。二次免疫导致抗TSHR抗体水平的强烈增加(图8)。

第二，使用LacZ-Ad或TSHR-Ad病毒颗粒注射Balb/c小鼠以诱导甲状腺功能亢进，其由抗TSHR抗体对甲状腺的作用所致。在腺病毒载体的第一次注射前，之后4周和之后10周，在所有小鼠的血清中测量T4激素水平和总IgG抗TSHR抗体滴度(图9)。使用10¹⁰TSHR-Ad病毒颗粒免疫小鼠在第一次免疫后4周和10周测量时分别在3/7和1/7的小鼠中诱导了甲状腺功能亢进。这表明在实验期间2只小鼠中的T4水平正常化(normalized)。使用10¹¹TSHR-Ad病毒颗粒免疫小鼠在第一次免疫后4周和10周时都在1/6的小鼠中诱导甲状腺功能亢进。这里，在4周时甲状腺功能亢进的一只小鼠在10周时具有正常的T4水平，而另一只小鼠的T4水平在4和10周之间强烈升高。测量抗TSHR抗体水平作为总IgG值，而不测定它们对TSHR的刺激或阻断效应(图10)。使用TSHR-Ad病毒颗粒免疫小鼠清楚地诱导抗TSHR抗体产生。使用10¹⁰或10¹¹TSHR-Ad病毒颗粒免疫的小鼠比LacZ-Ad免疫的小鼠产生明显多的抗体。在10¹⁰TSHR-Ad和10¹¹TSHR-Ad免疫的小鼠之间抗TSHR抗体水平没有差异。在总IgG抗TSHR抗体水平和T4水平之间没有发现相关性。

这些动物模型用于研究RNB-5apitopes在体内是否能减轻GD样症状。

实施例5-鉴定RNB12区中的apitopes

RNB12以及巢式肽在小鼠中不是免疫原性的。因此通过从格雷夫氏病患者产生的T细胞系的反应性鉴定该区域。图17示出了从这样的T细胞系得到的结果。

RNB12和修饰的肽RNB12-KKK确认为apitopes(图18)。

材料和方法

小鼠

HLA-DRB1*0301转基因小鼠(DR3小鼠)繁育和保持于Mayo Clinic的免疫遗传学小鼠群体(Immunogenetics mouse colony of Mayo Clinic)。从Gunter Hammerling(GermanCancer Research Center,Heidelberg,Germany)获得了HLA DR3-tg建立者小鼠。简单的说，将pUC中的HLA DRA基因组克隆的6-kb NdeI片段和cos 4.1的含有B基因的24-kbClaIxSalI片段共注射到来自与C57BL/6雄性交配的(C57BL/6xDBA/2)-F1供体的受精卵中。将转基因小鼠繁育到I-Ab敲除小鼠上。将DR3小鼠繁育到C57BL/10背景上持续10代。这些DR3小鼠表达HLA-DRB1*0301分子而不表达小鼠MHC-II分子。

DR4小鼠品系最初由Lars Fugger et al创建(PNAS 1994；volume91:6151-6155)，其中将HLA-DRA*0101/HLA-DRB1*0101和mCD3-huCD4c/g构建物共显微注射到来自(DBA/1xA.CA)F1交配的胚胎中，且将活胚胎转移到假孕的雌性(Balb/c x 129)F1以发育到成年(term)。接着，将后代繁育到IA-b敲除C57BL/6遗传背景(AB0小鼠)，其缺乏小鼠MHC II二类分子表达。因此，在这些DR4小鼠中表达的唯一MHC II类分子是人HLADR4分子。

动物研究由哈瑟尔特大学(Hasselt University)的“动物实验伦理委员会批准”(ECD)并使用最高护理标准在无病原体的设施中进行。

肽

由GL Biochem Ltd(Shanghai,China)合成肽，并将其在-80℃下储存于二甲基亚砜(DMSO,Sigma-Aldrich,Saint Louis,MA)中。

结合HLA-DRB1*0301的肽的研究

NetMHCII 2.2服务器

NetMHCII 2.2服务器使用人工神经元网络预测肽与HLA-DRB1*0301的结合。预测值以nM IC50值给出。在输出中标明强结合肽和弱结合肽。高亲和性结合肽具有低于50nM的IC50值，而弱结合肽具有低于500nM的IC50值。结果以预测评分呈现，该评分如下计算：1-log50000(aff)。网址：http://www.cbs.dtu.dk/services/NetMHCII。

免疫表位数据库(IEDB)：共识法(consensus method)

对于每种肽，通过将该肽的评分与选自SWISSPROT数据库中500万种随机的15聚体的评分相比产生四种方法(ARB、组合文库、SMM_比对和Sturniolo)中的每一种的百分位数等级。小编号的百分位数等级指示较高的亲和性。然后使用四种方法中的中值百分位数等级产生共识法的等级。网址：http://tools.immuneepitope.org/analyze/html/mhc_II_binding.html。

确定长肽的免疫原性

引发

DR3小鼠在尾根部皮下注射100μl在PBS中的抗原(Lonza,Verviers,Belgium)(100μl/注射)，所述抗原使用完全弗氏佐剂((CFA；BD Benelux,Erembodegem,Belgium，含有4mg/ml结核分枝杆菌(MTb,BD Benelux))乳化。取决于实验，使用RNB肽或全长TSHR-289蛋白作为抗原。对照动物在相同时间注射仅PBS/CFA。

细胞培养

在免疫后10天，收集引流淋巴结和脾。分离LN细胞和脾细胞并将其在96孔平底板中在X-vivo 15培养基(补充有谷氨酰胺、青霉素和链霉素；Lonza,Verviers,Belgium)中培养。为了研究抗原诱导的细胞增殖，将0.5x10⁶个细胞/孔(200μl/孔)与不同的抗原浓度(0-25μg/ml)或12.5μg/ml纯化的蛋白衍生物(PPD；引发对照；Statens serum institut,Copenhagen,Denmark)培养72小时。增殖测定和细胞因子分析

72小时后，收获60μl的细胞上清液并冷冻。向细胞添加20μL/孔氚化胸苷(PerkinElmer,Zaventem,Belgium)以获得最终浓度为1μCi/孔。在37℃下培育细胞，且16小时后将板冷冻。收获解冻的板并用β计数器(Wallac 1450MicroBeta TriLux LiquidScintillation Counter)读数以评价细胞增殖。用小鼠Th1/Th2 10plex FlowCytomixMultiplex(Bender MedSystems,Vienna,Austria)分析融化的上清液以测量抗原诱导的细胞因子产生。

产生RNB-5特异性杂交瘤

引发和T细胞系建立

在第0天，在小鼠尾根部皮下注射100μg抗原/CFA(DR3小鼠注射RNB-5；DR4小鼠注射TSHR)。使用PBS/CFA免疫对照小鼠。

在第10天，取出引流LN和脾，并生成单细胞悬液。一些细胞用于测量抗原诱导的细胞增殖，如上文所述。将剩下的脾细胞和LN细胞混合，并使用负性纯化试剂盒(未碰触过的CD4⁺T细胞；Miltenyi,Leiden,The Netherlands)分离CD4⁺T细胞。接着将CD4⁺T细胞与抗原(25μg/ml RNB-5或0.5μg/ml TSHR-289蛋白)和来自DR3小鼠(APC:CD4⁺T细胞比例1:1；5x10⁶细胞/ml)的辐射过的脾细胞(3000rad)一起培养。在X-vivo 15培养基中培养细胞，以避免胎牛血清(FCS)诱导的细胞活化。在第4天，向细胞中加入20U/ml的重组人IL-2(R&D,Abingdon,United Kingdom)。在第7天，通过Ficoll密度梯度分离(Histopaque 1083,Sigma-Aldrich)除去死细胞收获活细胞。接着如上文所述再刺激细胞，并将APC:CD4⁺T细胞的比例改变为2:1。在第9天，收获活细胞且它们中的一些用于融合。剩下的CD4+T细胞留下培养，且在第10天添加IL-2。在第14天，收获活细胞，在APC的存在下使用抗原再刺激(APC:CD4+T细胞的比例为3:1)，并在第16天用于第二次融合。

融合

将1x10⁷BW5147细胞(Health Protection Agency Culture Collections,Salisbury,UK)和5x10⁶CD4⁺T细胞混合于50ml管中，并在37℃的无血清培养基中清洗。离心后，轻柔地重悬细胞沉淀。历时45秒加入1ml的37℃的聚乙二醇(PEG，40％-50％的溶液，Sigma-Aldrich)，将细胞保持于小的37℃水浴中。细胞在37℃孵育45秒。接着，在涡旋的同时历时30秒加入1ml的37℃的无血清培养基，接着连续地加入2，3，4，10和30ml。非常缓慢倒转试管，并在37℃下培育4分钟。然后在室温(RT)下以1300rpm对细胞离心5分钟，没有暂停(brake)。移除上清液，并且缓慢加入50ml的RT无血清培养基以避免取出细胞团粒。使用完全培养基重复清洗步骤。最后，将细胞再悬浮于具有10％-FCS的RT完全培养基中，并以不同细胞密度铺板于96孔平底板中(100μl/孔)。48小时后，细胞培养于1x次黄嘌呤-氨基喋呤-胸苷(HAT，Sigma-Aldrich)培养基中并在约6天后检测到杂交瘤细胞的生长。将克隆保持在HAT培养基中直至其稳定，然后通过次黄嘌呤-胸苷(HT，Sigma-Aldrich)培养基断绝(wean)为完全RPMI培养基。将克隆定期冷冻于冷冻培养基(90％FCS+10％DMSO)中。

评估克隆的抗原特异性

使用5x10⁴VAVY或BM14细胞(分别为表达HLA-DRB1*0301或HLA-DRB1*0401的人细胞系；International Histocompatibility Working group,Seattle,USA)和抗原(10-25μg/ml)培养杂交瘤细胞。48小时后，通过酶联免疫吸附测定(ELISA)测量抗原诱导的IL-2产生。

IL-2ELISA

于4℃用50μl/孔纯化的大鼠的抗小鼠IL-2捕获Ab(BD Biosciences,Oxford,UK)包被96孔板(Immunosorb 96孔,Fisher Scientific,Erembodegem,Belgium)过夜，在碳酸盐缓冲液中以1:250稀释。在用PBS-0.05％Tween清洗2次后，使用10％FCS/PBS在室温封闭孔1小时。接着，将孔与50μl的细胞培养上清液或IL-2标准品(BD Biosciences,Belgium,Erembodegem)在RT下温育2小时。使用50μl/孔的在10％FCS/PBS中稀释为1:1000的生物素大鼠抗小鼠IL2(BD Biosciences)在室温下孵育孔1小时，接着使用50μl/孔的在PBS中稀释为1:1000的extravidin过氧化物酶(Sigma-Aldrich)在RT下温育30分钟。为了检测抗体结合，加入50μl/孔的TMB底物溶液(Perbio Science,Erembodegem,Belgium)。11分钟后，使用50μl/孔的2M H₂SO₄终止颜色反应。测量450nm(630nm ref)的光密度(OD)(Tecan Benelux,Mechelen,Belgium)。

不依赖于抗原加工的呈递系统

对抗原特异性克隆测定它们对15聚体肽(RNB-5A至5O)的反应性，其由固定的或非固定的VAVY或BM14细胞(＝APCs)呈递。将来自各克隆的5x10⁵个细胞与25μg/ml肽和5x10⁴个固定的或新鲜的APC一起培养。为了固定APC，使用0.5％低聚甲醛(Merck,Darmstadt,Germany)(pH7)在室温孵育细胞5分钟。通过添加0.4M的甘氨酸(Sigma-Aldrich)终止固定反应并在RPMI-10％FCS中清洗细胞。另外，测量了对人TSHR-289蛋白(Chesapeake-PERL,Savage,Maryland,USA)的反应性以鉴定隐蔽表位。在48小时后，通过ELISA测量抗原诱导的IL-2生成。

评估RNB-5apitope的溶解度

通过Anabiotec(Zwijnaarde,Belgium)分析了肽的溶解度。简短地说，通过添加PBS pH 7.0±0.1以两种不同的目标浓度(1mg/ml和4mg/ml)溶解肽样品。所述肽溶液在室温孵育至少16小时。在离心之前和之后，在320和360nm测量浊度。通过使用280和205nm的吸光度及通过HPLC-UV测定肽浓度。

以20mg/ml的储液浓度将肽溶于DMSO。在PBS中制备目标浓度4，2和1mg/mL的稀释系列。所述肽溶液在室温孵育16-17小时以允许形成任意沉淀。通过视觉观察对浊度评分并使用Nanodrop设备在205nm，280nm和320nm测量吸光度。以14800rpm离心肽溶液10分钟并重复视觉观察和吸光度测量。使用以下式计算肽浓度：

使用RNB-5apitope处理的耐受性诱导

在第-8，-6和-4天(高剂量日程表)，DR3小鼠在颈部背面皮下注射RNB-515聚体肽(100μg/注射)或PBS(图5)。或者，在第-15，-13和-11天，小鼠分别注射0.1μg,1μg和10μg肽，接着在第-8，-6和-4天3次注射100μg肽(剂量递增日程表)。在第0天，小鼠在尾根部皮下注射100μg抗原/CFA(RNB-5肽或TSHR-289蛋白)。免疫后10天，收获引流LN和脾。如上文所述进行增殖测定和细胞因子测量。

用于GD的动物模型

使用TSHR A-亚基腺病毒免疫小鼠

表达人TSHR A-亚基(氨基酸残基1-289，A-亚基Ad)的腺病毒和表达β-半乳糖苷酶的对照腺病毒(LacZ-Ad)购自Viraquest(North Liberty,IA,USA)。六周龄的雌性Balb/cJOlaHsd小鼠(Harlan Laboratories,Venray,The Netherlands)在大腿肌肉中肌肉内注射TSHR-Ad(10¹⁰或10¹¹个颗粒)或LacZ-Ad(10¹⁰个颗粒)。所有小鼠使用同一批次腺病毒同时免疫。小鼠以每三周的间隔在三个时机(第0，21和42天)注射并在第一次免疫之前和第二次免疫之后一周抽血。在第三次注射后4周(第10周)对所有小鼠实施安乐死以获得血液和甲状腺。

使用TSHR/CFA免疫小鼠

使用50μg TSHR-289蛋白在尾根部皮下攻击雌性六周龄的C57/Bl6JOlaHsd小鼠(Harlan Laboratories)(每组8只小鼠)，所述蛋白乳化于具有4mg/ml MTb的CFA中(50μl)。在第0天(免疫前)，7，21，35，49，63(A组)，第0，14，28，42，56天(B组)或第0，21，28，42，56天(C组)对小鼠尾部取血。C组小鼠在第4周接受使用不完全弗氏佐剂(IFA)中乳化的50μgTSHR-289蛋白的增强免疫。第一次免疫后10周，对所有小鼠实施安乐死并通过心脏穿刺取血。

TSHR抗体

使用ELISA测量针对纯化的TSHR-289蛋白(Chesapeake-Perl)的抗TSHR抗体(IgG类型)。96-孔板(半区96孔,Fisher Scientific)使用50μl/孔在PBS中的TSHR-289蛋白(0.5μg/ml)在室温包被过夜。在使用PBS-0.05％Tween清洗后，孔使用溶于PBS的1％BSA(w/v)在室温封闭1小时并使用测试血清孵育(重复等分试样，1:50稀释)。小鼠抗-TSHR抗体(A9,Abcam,Cambridge,UK)用作阳性对照。接着使用缀合有辣根过氧化物酶的山羊抗小鼠IgG(Abcam)检测抗体结合，并使用TMB形成信号。以450nm在读板仪(Tecan Benelux)中测量光密度(OD)。

血清甲状腺素和甲状腺组织学

使用CBI小鼠/大鼠甲状腺素ELISA试剂盒(Calbiotech,Spring Valley,CA,USA)根据制造商的说明在未稀释的小鼠血清(10μl)中测量总甲状腺素(T4)。从试剂盒中的标准品计算T4值并表示为μg/dl。将甲状腺固定于10％的中性缓冲的福尔马林(pH 7.5)中，处理成切片并使用苏木素和曙红染色。观察切片的病理学变化(肥大，上皮细胞的细胞过多(hypercellularity)和淋巴细胞的浸润)并计分(KWS Biotest,Bristol,UK)。

表1

来自人PBMC的T细胞系(实施例5)

分离了(Histopaque-1077,Sigma-Aldrich)来自健康供体或格雷夫氏病患者的外周血单核细胞(PBMC)，并以等分试样中冷冻。在第0天，细胞解冻，且在6孔板(Greiner Bio-one)中添加的具有5％AB血清(Sigma Aldrich)的补充(10mM HEPES,50U/ml青霉素/链霉素和4mM L-谷氨酰胺(Lonza))RPMI1640(Lonza)中将10⁶PBMC/ml与20ug/ml肽一起培养，并在37C和5％CO2中孵育。7天后，添加rhIL-2(R&D Systems)至终浓度20U/ml。在第12天，收获细胞，清洗并以10⁶的浓度放回培养+6孔板中的2x 10⁶新鲜解冻的经辐射的自体PBMC/ml，其使用5-10ug/ml肽和20U/ml的rhIL-2刺激。在第15，18和21天，添加另外的rhIL-2至终浓度为20u/ml。

在第24天收获细胞，清洗，且2x10⁴个细胞和10⁵个经辐射的自体PBMC和表达MHC clII类分子的VAVY/BM14/MG4R人细胞系(International Histocompatibility Workinggroup,Seattle,US)在96孔圆底板中培养，在补充性RPMI 1640+5％AB血清中在浓度为5-50ug/ml的不同抗原(肽，蛋白)的存在下培养。所述培养物培养48小时，其中在最后18小时添加0.5uCI/孔的3H-胸苷(Perkin Elmer)。在所述平板被冷冻并收获细胞后，使用β计数器(Wallac1450Microbeta Trilux)读取以评估增殖。在添加3H-胸苷之前，取出60ul/孔细胞培养上清用于细胞因子分析。

IFN gamma ELISA

通过使用人IFN-gamma Duoset试剂盒，R&D Systems遵循制造商的说明，评估来自TCL培养物的上清的IFN gamma含量。在450nm测量光密度(Tecan Benelux)。

以上说明书中提到的所有出版物通过提述并入本文。对本发明所述方法和系统的各种修改和改变在不背离本发明的范围和主旨的前提下对于本领域技术人员来说是明显的。虽然已经结合特定优选的实施方式描述了本发明，但应理解所要求保护的发明不应当过分局限于所述具体实施方式。对于分子生物学，免疫学或相关领域的技术人员来说是明显的用于实施本发明的所述模式的各种修改意图在所附权利要求书的范围内。

Claims

1.一种肽，其能够在没有抗原处理的情况下在体外结合MHC分子并且被呈递至T细胞，其选自以下促甲状腺激素受体(TSHR)肽：

RNB_5D-GKK：KKGIYVSIDVTLQQLESHGKK (SEQ ID No 12)

RNB_5D-KKK：KKKIYVSIDVTLQQLESHKKK (SEQ ID No.21)

RNB_5E-GKK：KKGYVSIDVTLQQLESHSGKK (SEQ ID No 13)

RNB_5A：ISRIYVSIDVTLQQL (SEQ ID No 6)

RNB_5B：SRIYVSIDVTLQQLE (SEQ ID No 7)

RNB_5C：RIYVSIDVTLQQLES (SEQ ID No 8)

RNB_5D：IYVSIDVTLQQLESH (SEQ ID No 9)

RNB_5E：YVSIDVTLQQLESHS (SEQ ID No 10)

RNB_5F：VSIDVTLQQLESHSF (SEQ ID No 11)

RNB_5F-GKK：KKGVSIDVTLQQLESHSFGKK (SEQ ID No 14)

RNB_4J-GKK：KKGSNLPNISRIYVSIDVGKK (SEQ ID No 16)

RNB_4J：SNLPNISRIYVSIDV (SEQ ID No 15)

RNB_4K：NLPNISRIYVSIDVT (SEQ ID No.62)

RNB_4K-GKK：KKGNLPNISRIYVSIDVTGKK (SEQ ID No.63)

RNB_9B：GLKMFPDLTKVYSTD (SEQ ID No 18)

RNB_9A：TGLKMFPDLTKVYST (SEQ ID No 17)

RNB_9C：LKMFPDLTKVYSTDI (SEQ ID No 19)

RNB_9D：KMFPDLTKVYSTDIF (SEQ ID No 20)

RNB_12A：LTLKLYNNGFTSVQG (SEQ ID No.65)

RNB_12B：TLKLYNNGFTSVQGY (SEQ ID No.66)

RNB_12B-KKK：KKK TLKLYNNGFTSVQGYKKK (SEQ ID No.67)。

2.一种肽，其选自下组：

KKGIYVSIDVTLQQLESHGKK(SEQ ID No 12)，

KKGKYVSIDVTLQQLESHGKK(SEQ ID No 22)，

KKGIKVSIDVTLQQLESHGKK(SEQ ID No 23)，

KKGIYKSIDVTLQQLESHGKK(SEQ ID No 24)，

KKGIYVSIDVKLQQLESHGKK(SEQ ID No 25)，

KKGIYVSIDVTLQKLESHGKK(SEQ ID No 26),

KKGIYVSIDVTLQQKESHGKK(SEQ ID No 27),

KKGIYVSIDVTLQQLKSHGKK(SEQ ID No 28),

KKGIYVSIDVTLQQLEKHGKK(SEQ ID No 29),

KKGIYVSIDVTLQQLESKGKK(SEQ ID No 30),

KKGYVSIDVTLQQLEGKK(SEQ ID No 31),

KKGYVSIDVKLQQLEGKK(SEQ ID No 32),

KKGYVSIDVTLQKLEGKK(SEQ ID No 33),

KKGYVSIDVTLQQKEGKK(SEQ ID No 34),

KKGYVSIDVKLQKKEGKK(SEQ ID No 35),

KKGIYVSIDVTLQQLEGKK(SEQ ID No 36),

KKGIYVSIDVKLQQLEGKK(SEQ ID No 37),

KKGIYVSIDVTLQKLEGKK(SEQ ID No 38),

KKGIYVSIDVTLQQKEGKK(SEQ ID No 39),

KKGIYVSIDVKLQKKEGKK(SEQ ID No 40),

KKGTYVSIDVTLQQLEGKK(SEQ ID No 41),

KKGTYVSIDVKLQQLEGKK(SEQ ID No 42),

KKGTYVSIDVTLQKLEGKK(SEQ ID No 43),

KKGTYVSIDVTLQQKEGKK(SEQ ID No 44),

KKGTYVSIDVKLQKKEGKK(SEQ ID No 45),

KKKIYVSIDVTLQQLESHKKK(SEQ ID No 21),

KKKKYVSIDVTLQQLESHKKK(SEQ ID No 46),

KKKIKVSIDVTLQQLESHKKK(SEQ ID No 47),

KKKIYKSIDVTLQQLESHKKK(SEQ ID No 48),

KKKIYVKIDVTLQQLESHKKK(SEQ ID No 49),

KKKIYVSIDVKLQQLESHKKK(SEQ ID No 50),

KKKIYVSIDVTLKQLESHKKK(SEQ ID No 51),

KKKIYVSIDVTLQKLESHKKK(SEQ ID No 52),

KKKIYVSIDVTLQQKESHKKK(SEQ ID No 53),

KKKIYVSIDVTLQQLKSHKKK(SEQ ID No 54),

KKKIYVSIDVTLQQLEKHKKK(SEQ ID No 55),

KKKIYVSIDVTLQQLESKKKK(SEQ ID No 56),

KKKYVSIDVTLQQLEKKK(SEQ ID No 57),

KKKYVSIDVKLQQLEKKK(SEQ ID No 58),

KKKYVSIDVTLQKLEKKK(SEQ ID No 59),

KKKYVSIDVTLQQKEKKK(SEQ ID No 60),

KKKYVSIDVKLQKKEKKK(SEQ ID No.61)。

3.根据权利要求2的肽，其中所述肽选自下组：

KKGKYVSIDVTLQQLESHGKK(SEQ ID No.22),

KKGIYKSIDVTLQQLESHGKK(SEQ ID No.24),

KKGYVSIDVTLQQLEGKK(SEQ ID No.31),

KKGYVSIDVKLQQLEGKK(SEQ ID No.32),

KKGYVSIDVTLQKLEGKK(SEQ ID No.33),

KKGYVSIDVTLQQKEGKK(SEQ ID No.34),

KKGYVSIDVKLQKKEGKK(SEQ ID No.35),

KKGIYVSIDVKLQKKEGKK(SEQ ID No.40),

KKGTYVSIDVKLQQLEGKK(SEQ ID No.42),

KKGTYVSIDVKLQKKEGKK(SEQ ID No.45),

KKKKYVSIDVTLQQLESHKKK(SEQ ID No.46),

KKKIYKSIDVTLQQLESHKKK(SEQ ID No.48),

KKKIYVKIDVTLQQLESHKKK(SEQ ID No.49),

KKKYVSIDVTLQQLEKKK(SEQ ID No.57),

KKKYVSIDVKLQQLEKKK(SEQ ID No.58),

KKKYVSIDVTLQQKEKKK(SEQ ID No.60),

KKKYVSIDVKLQKKEKKK(SEQ ID No.61)。

4.根据权利要求3的肽，其中所述肽选自下组：

KKGIYKSIDVTLQQLESHGKK(SEQ ID No.24),

KKGYVSIDVKLQQLEGKK(SEQ ID No 32),

KKGYVSIDVTLQKLEGKK(SEQ ID No.33),

KKGYVSIDVTLQQKEGKK(SEQ ID No.34),

KKGYVSIDVKLQKKEGKK(SEQ ID No.35),

KKGTYVSIDVKLQQLEGKK(SEQ Id No.42),

KKGTYVSIDVKLQKKEGKK(SEQ ID No.45),

KKKKYVSIDVTLQQLESHKKK(SEQ ID No.46),

KKKIYKSIDVTLQQLESHKKK(SEQ ID No.48),

KKKYVSIDVTLQQLEKKK(SEQ ID No.57),

KKKYVSIDVTLQQKEKKK(SEQ ID No.60)。

5.根据权利要求4的肽，其中所述肽选自下组：

KKGYVSIDVTLQKLEGKK(SEQ ID No.32),

KKGYVSIDVKLQKKEGKK(SEQ ID No.34),

KKKKYVSIDVTLQQLESHKKK(SEQ ID No.46),

KKKIYKSIDVTLQQLESHKKK(SEQ ID No.48),

KKKYVSIDVTLQQLEKKK(SEQ ID No.57),

KKKYVSIDVTLQQKEKKK(SEQ ID No.60)。

6.一种包含多种肽的组合物，其包含根据权利要求1至5中任一项的一个或多个肽。

7.根据权利要求1至5任一项的肽或根据权利要求6的组合物在制造用于在受试者中抑制或阻止TSHR自身抗体的体内产生的药物中的用途。

8.根据权利要求1至5任一项的肽或根据权利要求6的组合物在制造用于在受试者中治疗和/或预防格雷夫氏病的药物中的用途。

9.根据权利要求7或8的用途，其中所述受试者表达HLA-DR3。

10.根据权利要求7或8的用途，其中所述受试者表达HLA-DR4。