UA98356C2 - Композиція для лікування та профілактики розсіяного склерозу і/або оптичного невриту, пов'язаного з розсіяним склерозом - Google Patents

Abstract

Винахід належить до композиції, яка містить такі пептиди основного білка мієліну: МВР 30-44, МВР 83-99, МВР 131-145 і МВР 140-154 та призначена для профілактики або лікування захворювання розсіяного склерозу і/або оптичного невриту, пов’язаного з розсіяним склерозом.

Description

Даний винахід стосується композиції, яка містить пептиди основного білка мієліну. Композицію можна використовувати для лікування розсіяного склерозу.

Розсіяний склероз

Розсіяний склероз (М5) є найбільш поширеним інвалідизуючим неврологічним захворюванням, що вражає молодих людей. Близько 85000 чоловік в Великобританії страждають на М5.

При розсіяному склерозі (М5), запалення нервової тканини призводить до втрати мієліну, жирової речовини, яка виступає як захисна ізоляція нервових волокон в головному і спинному мозку. Така втрата мієліну, або демієлінізація, залишає множинні області рубцевої тканини, або склерозу, вздовж нервових клітин. У результаті, склероз призводить до множинних неврологічних ознак і симптомів, зазвичай з рецидивами і ремісіями.

Звичайні симптоми М5 включають зниження або втрату зору, спотикання і нерівну ходу, невиразну мову, а також часте сечовипускання і нетримання сечі. Крім цього, МО може призводити до змін настрою і депресії, м'язових спазмів і важкого паралічу.

У даний час вважається, що М5 є аутоїмунним захворюванням, опосередкованим аутореактивними Т- клітинами.

Існуюче лікування М5, як правило, направлене на пригнічення імунної системи. Наприклад, один зі способів лікування включає трансплантацію кісткового мозку і введення цитостатиків і імуносупресивних лікарських засобів. Таке лікування ефективне для частини пацієнтів, але є таким, що дорого коштує і має досить високі ризики ускладнень. Крім того, застосування цитостатиків при лікуванні МО вважається спірним, тому що їх ефекти неясні, а можливі побічні ефекти є важкими.

Лікування інтерфероном-бета (ІЕМ) послаблює симптоми М5 у частини пацієнтів і, внаслідок цього, широко використовується. Однак, механізм дії інтерферону-бета неясний, а лікування ІЕМр ефективно не для всіх пацієнтів. Більш того лікування ІЕМр ускладняється формуванням анти-ІЕМр антитіл у більшості пацієнтів (Сіомаппопі, а3., Мипеспапцег, Р. Е., зга, і Оєїізепнаттаег, Р. (2002). Мешгаїївіпд апіроадієз Юю іпіепегоп Ббеїа дигіпа

Ше ігеаїтепі ої тиіріє зсіеговів. У Меиго! Меигозиго Резуспіайгу 73, 465-469).

У даний час не існує ефективного способу лікування М5. Лікування спрямоване лише на зменшення симптомів захворювання, зазвичай за рахунок загального пригнічення імунної системи. Таким чином, існує гостра необхідність в терапії, яка специфічно націлена на місцеву імунну відповідь, пов'язану з початком захворювання і його прогресуванням.

Синтетичні пептиди

Меїліег і МУгайй (Іпї. Іттипої. 5:1159-1165 (1993)) були першими дослідниками, які описали використання синтетичних пептидів для пригнічення аутоіїмунної відповіді на мишачій моделі з експериментальним аутоїмунним енцефаломієлітом (ЕАЕ), загальновідомої моделі МО іп мімо. У цьому дослідженні пептиди, одержані з МВР, вводили інтраназально, і було виявлено, що рівень супресії захворювання напряму пов'язаний з антигенною дією використаних пептидів.

Пізніше, в 1995, іш ії МУгтайй (Іпї. Іттипої. 7:1255-1263) показали, що також можна викликати супресію ЕАЕ у мишей шляхом внутрішньочеревинного введення розчинних пептидів, одержаних з МВР. У цьому дослідженні була досягнута супресія як ТП1, так і Тп2-відповіді, і було показано, що введення пептидів після початку імунної відповіді може призводити до пригнічення виникаючих імунних реакцій.

Однак було виявлено, що не всі пептиди, здатні діяти як Т-клітині епітопи, здатні викликати толерантність.

Пептид 89-101 основного білка мієліну (МВР) після імунізації являє собою імунодомінантний антиген і також є надто ефективним імуногеном як з точки зору праймування Т-клітинної реактивності, так і індукції ЕАЕ. Однак була показана неефективність цього пептиду для індукції толерантності при введенні в розчині (Апаепоп і

Мугаййп (1998) Єиг. У. Іттипої. 28:1251-1261).

Автори даного винаходу раніше показали, що існує зв'язок між здатністю пептиду зв'язуватися з молекулою МН І або ІІ класу і бути презентованим Т-клітині без додаткового процесинга антигену і його здатністю індукувати толерантність іп мімо. Можна очікувати, що пептиди, які не залежать від процесинга антигену (тобто не потребують додаткового процесинга антигену для того, щоб зв'язатися з МНС), будуть викликати толерантність іп мімо. Ці пептиди називають "апітопи", від Апіїдеп Ргосеззіпд Іпаерепаєпі ерітоРЕ5.

У МО 02/16410 описані наступні апітопи основного білка мієліну (МВР): 30-44, 80-94, 83-99, 81-95, 82-96, 83-97, 84-98, 110-124, 130-144, 131-145, 132-146 і 133-147.

У УМО 03/064464 як апітопи визначені наступні пептиди МВР: 134-148; 135-149; 136-150; 137-151; 138-152 і 140-154.

Автори даного винаходу виявили, що "коктейль" з чотирьох пептидів МВР, кожний з яких є апітопом, особливо ефективний для лікування М5. Вважають що, комбінація чотирьох пептидів може надавати синергічну дію.

У першому аспекті, таким чином, даний винахід належить до композиції, яка містить наступні пептиди основного білка мієліну:

МВР 30-44;

МВР 83-99;

МВР 131-145

МВР 140-154.

Композиція може складатися переважно з МВР 30-44, 83-99, 131-145 і 140-154.

Композицію можна використовувати для лікування або профілактики захворювання, зокрема, розсіяного склерозу.

Композицію можна використовувати для лікування або профілактики оптичного невриту, зокрема, оптичного невриту, зумовленого розсіяним склерозом.

У другому аспекті, даний винахід належить до способу лікування або профілактики розсіяного склерозу або оптичного невриту шляхом введення пацієнту композиції за першим аспектом винаходу.

У способі другого аспекту за винаходом композицію можна вводити, слідуючи протоколу із збільшенням дози.

Виявлено, що два пептиду в коктейлі зв'язуються з НІ А-0О6 (МВР 30-44 і 131-145), а два - з Н А-ЮОН2 (МВР 140-154 і 83-99). Комбіноване використання цих апітопів забезпечує більш широке охоплення різних гаплотипів головного комплексу гістосумісності (МНС), що спостерігаються у пацієнтів з М5, ніж при терапії одним пептидом.

Спосіб другого аспекту за винаходом може включати введення композиції НІГА-0О6 або НІА-ОЮВН2- позитивним пацієнтам.

У третьому аспекті, даний винахід належить до набору, який включає наступні пептиди основного білка мієліну:

МВР 30-44;

МВР 83-99;

МВР 131-145

МВР 140-154 для спільного, роздільного або послідовного введення.

Фігура 1: Презентація МВР 30-44 за допомогою НІ А-0О6 Т-клітинному клону М5 49:03

Фігура 2: Презентація МВР 130-144 за допомогою НІ А-0О6 Т-клітинному клону М5 17:А2

Фігура 3: Презентація МВР 139-153 за допомогою І-клітин, трансфекованих НІ А-ОНга і НІГ А-ОНВ2Б, Т- клітинному клону М5:19

Фігура 4: Проліферативна відповідь клітин лімфовузла після толеризації апітопом М5б

Фігура 5: Проліферація спленоцитів у відповідь на апітоп М57. Спленоцити одержані від мишей, яких лікували за допомогою інтраназального введення або РВ5, або апітопу М57 (83-99)

Фігура 6: Проліферація спленоцитів у відповідь на апітоп М57. Спленоцити одержані від мишей, яких лікували за допомогою підшкірного/черезшкірного введення або РВ5, або апітопу М57 (83-99)

Фігура 7: Вироблення ІРМр і І/-2 спленоцитами, одержаними від мишей, яких лікували за допомогою підшкірного/черезшкірного введення або РВ5, або апітопу М57 (83-99)

Фігура 8: Приклад таблиці Шеллена

Фігура 9: Відповіді РВМС пацієнтів на основний білок мієліну людини (МВР)

Фігура 10: Відповіді РВМС пацієнтів на АТХ-М5-1467

Фігура 11: Порівняння проліферативної відповіді Т-клітин на МВР до (візит 1) і після (візит 8) лікування з допомогою АТХ-М5-1467

Перший аспект винаходу належить до композиції, яка містить декілька пептидів основного білка мієліну.

Основний білок мієліну

Основний білок мієліну (МВР) являє собою білок масою 18,5 кДа, який може бути виділений з білої речовини головного мозку людини. Зрілий білок містить 170 амінокислот, і його послідовність широко доступна в літературі (дивись наприклад: Спои еї а). (1986) 9. Меигоспет. 46:47-53, фігура 1; Катнпої? еї аї. (1986), РМАБ5 83:4962-4966, фігура 2; патент США Ме 5817629, 5ЕО ІО МО: 1; Воїй еї аї. (1987), У. Мешгозсі. Нев. 17:321-328, фігура 4; Медемесаеку еї а. (2006), РЕВ5 І ецеге 580:545-552, фігура ЗВ).

Пептиди МВР

Термін "пептид" використовується в звичайному значенні і означає серію залишків, як правило, І- амінокислот, з'єднаних один з іншим зазвичай за допомогою пептидних зв'язків між «-аміно і карбоксильною групами сусідніх амінокислот. Термін включає модифіковану пептиди і синтетичні аналоги пептидів.

Пептиди, використані в композиції і наборі за даним винаходом, можуть бути одержані з використанням хімічних способів (Реріїде Спетізігу, А ргасіїса! Техіроок. Мікоз Водапвку, Зрііпдег- Мепіад, Вепіп.). Наприклад, пептиди можуть бути синтезовані твердофазними методами (НКобегде У еї а! (1995) бсіепсе 269: 202-204), гідролізовані на іонообмінній смолі і очищені за допомогою препаративної високоефективної рідинної хроматографії (наприклад, Стеідпюп (1983) Ргоїєїпе Біписішгез Апа Моїесціаг Рігіпсірієв, М/Н Егеетап і Со, Межм/

Ммоїк МУ). Автоматичний синтез може бути здійснений, наприклад, з використанням АВІ 43 1 А Реріїйде

Зупіпевзігег (РегїкКіп ЕІтег) відповідно до інструкцій виробника.

Пептид може альтернативно бути одержаний рекомбінантними методами або за допомогою вищеплення з більш довгого поліпептиду. Наприклад, пептид може бути одержаний вищепленням з повнорозмірного МВР.

Склад пептиду може бути підтверджений амінокислотним аналізом або секвенуванням (наприклад, методом деградації за Едманом).

Пептиди, використані в композиціях і наборах за даним винаходом, представлені нижче:

МВР 30-44:

Н-Рго-Аго-Ніз-Агд-Азр-ТАпг-Сс1у-Пе-І ен-Авр-Зег-Пе-с1Іу-Агд-Рпе-МНг

МВР 83-99:

Н-сСіш-Авзп-Рго-МаІ-МаІ-Ніз-Рне-РНе-Ї уз-Азп-Пе-МаІ-Тпг-Рго-Ага-Тнг-Рго-МН»

МВР 131-145:

Н-АІа-5ег-Авр-Туг-І увз-Зег-Аїа-Нів-І уз-Спу-РПпе-Ї уз-С1у-МаІ-Авр-МНг

МВР 140-154:

Н-Сіу-Рпе-Ї уз-Спіу-МаІ-Азр-АІа-СїІп-Сту- ГНі-Ї еи-зеї-І уз-Пе-РНе-МНег

Терміни "МВР 30-44", "МБР 83-99", "МВР 131-145" і "МВР 140-154" включають модифіковані пептиди.

Наприклад, пептиди можуть бути мутовані за допомогою амінокислотної вставки, делеції або заміни, за умови, що зберігається МНО-зв'язуюча специфічність немодифікованого пептиду разом з його здатністю бути презентованим Т-клітині. Пептид може мати, наприклад, 5, 4, 3, 2, 1 або 0 мутацій в порівнянні з немодифікованою послідовністю.

Альтернативно (або крім того) модифікації можуть бути проведені без зміни амінокислотної послідовності пептиду. Наприклад, можуть бути введені ЮО-амінокислоти або інші неприродні амінокислоти, звичайний амідний зв'язок може бути заміщений зв'язками складноефірного або алкільного кістяка, можуть бути включені

М- або С-алкільні замісники, модифікації бічного ланцюга і обмежувальні зв'язки, такі як дисульфідні місточки і зв'язки аміду бічного ланцюга або складноефірні. Такі зміни можуть давати кращу стабільність пептиду іп мімо і збільшувати біологічний час життя.

Модифікації епітопів можуть бути зроблені, основуючись на прогнозуванні для більш ефективної Т- клітинної індукції, одержаних з використанням програми "Реріїде Віпаїпуд Ргеадісіопв", розробленої К. Раїкег (МІН), яку можна знайти за адресою пПер:/Лумлу-рітав.аст. пін. дом/сді-біп/тоіріо/кеп раїкег сотроїопт (див. також Раїкег, К. С еї аї. 1994. ).Іттипої. 152:163).

Пептиди МВР можуть бути введені в композицію в нейтральній формі і в формі солі. Фармацевтично прийнятні солі включають кислі солі приєднання (утворені за допомогою вільних аміногруп пептиду) і ті, які утворені за допомогою неорганічних кислот, таких як, наприклад, хлористоводнева або фосфорна кислоти, або органічних кислот, такої як оцтова, щавлева, винна і малеїнова. Солі, утворені за допомогою вільних карбоксильних груп, можуть також бути похідними неорганічних основ, таких як, наприклад, гідроксиди натрію, калію, амонію, кальцію або заліза, і таких органічних основ, як ізопропіламін, триметиламін, 2- етиламіноетанол, гістидин і прокаїн.

Композиція

Композиція за даним винаходом може використовуватися для профілактичного або терапевтичного застосування.

Композиція може бути одержана у придатній для ін'єкції формі, у вигляді розчину рідини або суспензії; може також бути одержана у вигляді твердої форми, придатної для розчинення або суспендування в рідині перед ін'єкцією. Препарат може також бути у вигляді емульсії, або пептиди інкапсульовані в ліпосоми. Активні інгредієнти можуть бути змішані з ексципієнтами, які є фармацевтично прийнятними і сумісними з активним інгредієнтом. Зручними ексципієнтами є, наприклад, вода, фізіологічний розчин (наприклад, фосфатно- сольовий буфер), декстроза, гліцерин, етанол, або подібні ним, і їх поєднання.

Крім того, при бажанні, композиція може містити незначні кількості допоміжних речовин, таких як змочувальні або емульгувальні реагенти і/або рН-буферні речовини. Буферні солі включають фосфат, цитрат, ацетат. Хлористоводневу кислоту і/або гідроксид натрію можна використовувати для коректування рН. Для стабілізації можна використовувати дисахариди, такі як сахароза або трегалоза.

У композиції відносне співвідношення пептидів (МВР 30-44:МВР 83-99:МВР 131-145:МВР 140-154) може бути приблизно 1:1:1:11. Альтернативно, відносне співвідношення кожного пептиду може бути змінене, наприклад, для того, щоб сфокусуватися на толерогенній відповіді певної субпопуляції аутореактивних Т- клітин або, якщо виявлено, що один пептид працює краще, ніж інші у певних типів НІ А.

Після одержання, композиція може бути поміщена в стерильний контейнер, який потім запаюється і зберігається при низькій температурі, наприклад 42С, або композиція може бути висушена сублімацією.

Зручно, якщо композицію одержують у вигляді ліофілізованої (висушеної сублімацією) пудри. Ліофілізація забезпечує можливість довгострокового зберігання в стабілізованій формі. Методи ліофілізації добре відомі в даній галузі, дивись наприклад пир:/Лумли. демісеїПїпК.сот/мамагснпіме/97/01/006.пІті. Наповнювачі, такі як маніт, декстран або гліцин, широко використовуються перед ліофілізацією.

Композицію можна вводити зручним способом, таким як пероральний, внутрішньовенний (у випадку водорозчинної), внутрішньом'язовий, підшкірний, сублінгвальний, інтраназальний, черезшкірний або у вигляді супозиторіїв або імплантів (наприклад, з використанням молекул повільного вивільнення).

Композиція може переважно вводитися інтраназальним, підшкірним або черезшкірним шляхом.

Спосіб і фармацевтичну композицію за винаходом можна використовувати для лікування людини.

Зазвичай, лікуючий лікар визначає фактичну дозу, яка найбільш підходить для окремого пацієнта, і яка може варіювати залежно від віку, ваги і відповіді конкретного пацієнта.

У переважному варіанті здійснення можна слідувати протоколу «збільшення дози», коли сукупність доз дається пацієнту в зростаючій концентрації. Такий підхід був використаний, наприклад, для пептидів фосфоліпази А2 в імунотерапії алергії до бджолиної отрути (МиПег єї а! (1998) 9. АПегду Сіїп Іттипої. 101:747- 1754 і Акаїз єї а! (1998) . Сіїп. Іпмеві. 102:98-106).

Набори

Зручно, коли чотири пептиди МВР можна вводити разом в формі змішаної композиції або коктейлю. Однак в деяких випадках, при яких переважніше надавати пептиди роздільно у вигляді набору для спільного, роздільного, послідовного або комбінованого введення.

Наприклад, набір може включати чотири пептиди в роздільних контейнерах, або два контейнери, що містять по два пептиди кожний. Вміст контейнерів можна комбінувати або не комбінувати перед введенням.

Набір може також включати пристрої для змішування і/або для введення (наприклад, розпилювач для інтраназального введення; або шприц і голку для підшкірної/черезшкірної дози). Набір може також включати інструкції з використання.

Фармацевтичну композицію або набір за винаходом можна використовувати для лікування і/або профілактики захворювання.

Зокрема, композиціюлнабори можна використовувати для лікування і/або профілактики розсіяного склерозу і/або оптичного невриту.

Розсіяний склероз

Розсіяний склероз (М5) є найбільш поширеним неврологічним порушенням серед молодих людей (у віці від 20 до 40 років), вражаючи близько 385000 чоловік в Європі і 300000 в США. Це хронічне дегенеративне захворювання центральної нервової системи, при якому відбувається поступове осередкове руйнування мієліну у всіх областях головного і/або спинного мозку, що перешкоджає нервовому зв'язку і викликає м'язову слабкість, втрату координації, мовні і зорові порушення.

Через 10 років, приблизно половина пацієнтів, яким спочатку був поставлений діагноз оборотно- ремітуючий М5 (АВМ5), відмічає зниження частоти загострень, але посилення порушення функцій. Цей стан відомий як повторний прогресуючий М5 (5РМ5). За деякими оцінками, протягом 25 років приблизно у 9095 хворих АВМ5 переходить у вторинний прогресуючий тип. Як і АВАМ5, тяжкість вторинного прогресуючого М5 може змінюватися. Для деяких пацієнтів, зростання і прогресування порушення функцій відбувається поступово, у інших це трапляється більш швидко. В основному, однак, відновлення після загострень стає все менш і менш повним, симптоми мають тенденцію до посилення, і порушення функцій росте. Клінічно атаки стають менш вираженими, і є тенденція до зникнення ремісій, але велика частина тканини ЦНС в даний момент не зруйнована, і накопичення пошкоджень більш виражене на ЯМР.

Композицію за винаходом можна використовувати для лікування пацієнтів з МО, що недавно почався,

ААМ5 або 5РМ5.

Композиція за даним винаходом може послаблювати або поліпшувати один або декілька симптомів М5, які включають зниження або втрату зору, спотикання і нерівну ходу, невиразну мову, часте сечовипускання і нетримання сечі, зміни настрою і депресію. 5ХРМ5 може супроводжуватися м'язовими спазмами і важким паралічем.

Зокрема, композиція може поліпшувати оптичний неврит.

Оптичний неврит

Оптичний неврит (ОН) являє собою запалення з супутньою демієлінізацією оптичного нерва, обслуговуючого сітчатку ока. Це змінний стан, і може виявлятися будь-яким з наступних симптомів: нечіткість зору, втрата гостроти зору, часткова або повна втрата колірного зору, повна або часткова сліпота і біль за оком.

Оптичний неврит є одним з симптомів розсіяного склерозу, що найчастіше виявляються в даний час, і одним з найбільш поширених симптомів на початку розвитку М5. ОН може, однак, бути проявом іншого захворювання, а не М5, такого як ішемічна оптична невропатія.

У 7095 випадків ОН присутній унілатерально (тільки на одному оці).

Частіше за все, оптичний неврит спочатку вражає людей у віці від 15 до 50 років. Дослідження показують, що в цій віковій групі, більше ніж у 5095 пацієнтів розвивається розсіяний склероз протягом 15 років. Як і у випадку М5, у жінок імовірність появи ОН приблизно в два рази вище, ніж у чоловіків, і поширеність ОН у європеоїдів вище, ніж в інших расових групах.

Основними симптомами оптичного невриту є: "- Втрата гостроти зору (нечіткість зору). "- Очний біль. "« Дисхроматопсія (зниження колірного зору). - Рухові і звукові фосфени (зорові відчуття спалахів, викликані рухом очей з боку в бік або звуком). " Симптом Утхофа, погіршення симптомів з підвищенням температури або занепадом сил.

Лікування ОН за допомогою композиції за даним винаходом може запобігати, послаблювати або поліпшувати будь-який з цих симптомів. Для спостереження за прогресуванням ОН гострота зору може бути зручно виміряна з використанням таблиці Шеллена.

Приклади

Наступні приклади служать для ілюстрації даного винаходу, але не є обмежувальними. Винахід належить, зокрема, до специфічних варіантів здійснення, описаних в даних прикладах.

З метою прикладів, наступні назви можна використовувати для пептидів МВР:

Композиція чотирьох пептидів називається АТХ-М5-1467

Приклад 1 Ідентифікація обмежених за НІ А-0О6 Т-клітинних епітопів основного білку мієліну

Гени МНС класу ІІ передають сприйнятливість до розсіяного склерозу (Мерот і Еппісп (1991) Апп. ВАеу.

Ітітипої. 9: 493-525). Серед європеоїдів середньої і центральної Європи, Австралії і Північної Америки асоціація пов'язана з молекулою МНС НІ А-ОВ2 (ОАга (ОАВ5"01011 і ОВ2Ь (ОАВІ171501), Наїпез єї а! (1998)

Нитап Мої. (епеї. 7: 1229-1234). Хоча ЮВ2 і 006 алелі МНС знаходяться в різних локусах, існує значна нерівновага за зчепленням між цими двома алелями. Конкордантність між цими двома алелями складає 99905, набагато вище очікуваного, у випадку якби алелі були асоційовані випадковим чином. Таким чином, збільшується можливість того, що певні Т-клітинні епітопи, пов'язані з МО, можуть бути швидше обмежені за

НІ А-БОб, ніж за НІ А-ОН2.

Метою даного дослідження було встановити, чи презентуються Т-клітинні епітопи МВР людини за допомогою молекули НІГ А-0О6 Т-клітинним клонам, виділеним від НІ А-ОН2-позитивних пацієнтів з М5. Т- клітинну активацію вимірювали за допомогою Т-клітинної проліферації з використанням інкорпорації (ЗНІ- тимідину.

Пептидні антигени

Пептиди МВР 30-44, 130-144 і 139-153 були синтезовані з використанням І -амінокислот і стандартної БЕ- тос хімії на синтезаторі пептидів Арбітей АМ5 422.

Антигенпрезентуючі клітини

Як антигенпрезентуючі клітини були використані І-клітини, трансфековані НІ А-0О6, НІ А-ОВга або НІ А-

ОВ2Б, або клітини Мадаг (ЕАСС, Ропоп Юом/п, ОК), які експресують НІ А-0О, ОР і ОВ.

Т-клітинні клони

Т-клітинні клони М5 49:03 і М5 17:А2 були одержані від пацієнтів з М5, і клон М5:19 був одержаний від здорової людини. Всі три клони були виділені у ОН2-позитивних індивідуумів.

Аналіз презентації антигену

Антигенпрезентуючі клітини інкубували з різними концентраціями пептиду і відповідними Т-клітинами.

Проліферацію, і, таким чином, активацію Т-клітин вимірювали за допомогою інкорпорації (ЗНІ|-тимідину, і виражали у вигляді індексу стимуляції (51 - коректована кількість імпульсів на хвилину (ссрт) від культури, що містить пептиди/ссрт від культури без пептидів).

Результати

Коли пептид МВР 30-44 презентувався І-клітинами, трансфекованими НІ А-0О6, Т-клітинний клон М5 49:03 давав дуже сильну проліферативну відповідь (в 1,5 рази більше в порівнянні з контрольними клітинами

Мдаг) при найвищій концентрації пептиду (фігура 1). Коли МВБР 130-144 презентувався |І-клітинами, трансфекованими НГ А-0О6, ще більш сильна відповідь була індукована у М5 17:А2 Т-клітин (збільшення проліферації в 3,24 рази в порівнянні з контрольними клітинами Мааг - фігура 2).

Третій Т-клітинний клон М5:19, виділений від індивідуума з ОВ, відповів на основний епітоп МВР 140-154 і на серію 15-мірних пептидів, що перекриваються, які покривають цей регіон (138-156). Пептид 139-153 стимулював проліферацію Т-клітинного клону М5:19, коли він був презентований І-клітинами, трансфекованими НІ А-ОВга, але не у випадку І-клітин, трансфекованих НІ А-ОН2Б (фігура 3).

Висновок

Т-клітинні клони, виділені від НГ А-ОН2-позитивних індивідуумів, відповідають на обмежені за НІ А-0О6

МВР Т-клітинні епітопи. Це означає, що асоціація НІ А-ОВ2 з розсіяним склерозом не обмежується ОН2 МВР

Т-клітинними епітопами, але може бути також обмежена за 0Об.

У композиції МВР за даним винаходом, два пептиди зв'язуються з НІ А-0О6 (МВР 30-44 і 131-145) і два зв'язуються з НІ А-ОН2 (МВР 140-154 і 83-99). Таким чином, терапія пептидами з допомогою цих апітопів може бути направлена на НІ А-ОР2 або НІ А-0О06 індивідуумів.

Приклад 2 - Індукція толерантності з допомогою апітопу М56 у НІ А:ОВ2 трансгенної миші

Це дослідження було сплановане для того, щоб показати, що апітоп (апітоп М56б), коли він презентується молекулою МНС класу ІЇ, може викликати імунологічну толерантність на гуманізованій мишачій моделі розсіяного склерозу. Апітоп М56 є апітопом, вибраним з Т-клітинних епітопів МВР, являє собою МВР 140-154, презентується за допомогою МНС класу ІІ на антигенпрезентуючих клітинах, Її може стимулювати Т-клітини без процесинга (див. УУО 03/064464). Була використана мишача модель, трансгенна за молекулою МНС людини НІГ А:ОНВ2 (ОВВ 171501) (Мадзеп ес! а). (1999) Майшге Сепеїїсв 23:343-347).

Індукцію толерантності або зміни в популяції СО4- Т-клітин у миші після введення апітопу можна проконтролювати за зниженням Т-клітинної проліферації після стимуляції антигеном іп мімо.

Пептидний синтез

Апітоп М56 (пептид МВР 140-154) був синтезований з використанням І -амінокислот і стандартної Е-тос хімії на синтезаторі пептидів Арбітей АМ5 422.

Миші і індукція толерантності

У дослідженні були використані НГА:ОН2 трансгенні миші у віці 8-12 тижнів. У мишей викликали толерантність за допомогою попереднього введення 100 мкг апітопу Мб в 25 мкл фосфатно-сольового буфера (РВ5) або 25 мкл РВ5 в чистому вигляді, шляхом інтраназального введення на -8, -6 і -4 дні перед імунізацією на день 0.

Слідом за толеризацією, миші були імунізовані підшкірно 100 мкл емульсії, що містить рівні об'єми повного ад'юванту Фрейнда (СЕА), РВ5, що містить 200 мкг апітопу М56 і 400 мкг Мусобасієгішт Шшрегсцозів, вбитої нагріванням. Контрольна група мишей, попередньо толеризована за допомогою РВ5 інтраназально, була імунізована без пептиду.

Через 10 днів після підшкірної імунізації підколінні і пахові лімфовузли видаляли і оцінювали Т-клітинну активацію, аналізуючи проліферацію Т-клітин у відповідь на різні концентрації апітопу М56. Проліферацію вимірювали за допомогою інкорпорації (ЗНІ|-тимідину, і виражали у вигляді індексу стимуляції (5І - коректована кількість імпульсів на хвилину (ссрт) від культури, що містить пептиди/ссрт від культури без пептидів).

Результати

Миші групи А, які були толеризовані РВ5 і потім імунізовані апітопом М56б, відповіли на антигенну стимуляцію, коли вона була проведена повторно з апітопом М5б дозозалежним способом (фігура 4). Зі збільшенням концентрації пептиду 5! збільшився за медіаною від 2,5 до 10. Всі миші в цій групі продемонстрували, що введення РВ5 інтраназально не може викликати толерантність до апітопу М56.

Навпаки, інтраназальне попереднє введення апітопу М5б надає серйозний вплив на проліферативну відповідь лімфоцитів, стимульованих цим пептидом. Лімфоцити мишей з групи В були нездатні до відповіді значною будь-якою мірою, навіть при високій концентрації пептиду - 150 мкг/мл (медіана 51 - 3, фігура 4). Ці дані підтверджують, що апітоп М56 викликає толерантність у лімфоцитів від НГ А-ЮОВ2 мишей.

Лімфоцити, виділені у мишей, яким заздалегідь вводили РВ5 і імунізували РВ5 (Група С), не показали ніякої відповіді на апітоп Мб (фігура 4). Відсутність відповіді на пептид у Групи С підтверджує, що проліферативна відповідь, що спостерігається в групі А, дійсно була відповіддю на імунізацію апітопом М56.

Висновок

Ці дані підтверджують гіпотезу, що пептид МВР (апітоп М5б), який не потребує процесинга і зв'язується з молекулою МНС класу ІІ НІ А:ОВ2г, може викликати толерантність при введенні інтраназально.

Приклад З - Індукція толерантності за допомогою апітопу М5 7 (МВР 83-99) у мишей, трансгенних за двома генами (НГА Ор2 і Т-клітинний рецептор (МВР) 82-100)

Дане дослідження вивчає здатність апітопу М57 (пептиду МВР 83-99) викликати толерантність у мишей, трансгенних за двома генами і експресуючих НГА:Н2 разом з Т-клітинним рецептором для зв'язаного з

НГАЮВЗ пептиду основного білка мієліну (МВР) 82-100.

Спленоцити від даних тварин, трансгенних за двома генами, проліферують іп міо у відповідь на апітоп

М57. Зниження або зникнення іп міо відповіді спленоцитів на апітоп, вслід за його повторним введенням іп мімо, вказує на те, що стан толерантності досягнутий.

Викликати толерантність пробували з використанням як інтраназального, так і підшкірного/черезшкірного шляхів введення апітопу.

Індукція толерантності

Були використані групи з 6 або 7 порівнянних за віком (8-12 тижнів) і статтю мишей, трансгенних за двома генами. У першому експерименті одній групі вводили 10 разів інтраназально 100 мкг апітопу М57 в 25 мкл РВ5 через однакові інтервали протягом трьох тижнів. Контрольна група одержувала чистий РВ5. У другому експерименті таку ж кількість пептиду давали за допомогою підшкірного/черезшкірного введення в 100 мкл

РВ5. Контрольна група одержала такий же об'єм РВ5.

Аналіз проліферації

Через три дні після останнього введення пептиду або РВ5, видаляли селезінки і готували клітинні суспензії. Спленоцити інкубували з 0,5 або 5 мкг/мл апітопу М57, і оцінювали проліферацію за допомогою інкорпорації І|НІ-тимідину після 48, 72 і 96 годин культивування. Результати виражені у вигляді індексу стимуляції (5І - кількість імпульсів на хвилину (срт) від культури, що містить антиген/кількість імпульсів в хвилину без антигену).

Вимірювання цитокінів

У другому експерименті, де толерантність була індукована через підшкірний/черезшкірний шлях введення, збирали супернатанти клітинної культури спленоцитів через 48 і 72 години культивування і аналізували на наявність ІЕМ і інтерлейкіну-2 (ІІ -2) з використанням імуноферментного аналізу (ЕГ ІЗА).

Результати

У всіх трьох досліджених часових точках спленоцити мишей, яким вводився РВБ, як при інтраназальному, так і при підшкірному/черезшкірному шляхах введення, показали сильну проліферацію у відповідь на апітоп

М57; сила відповіді підвищувалася із збільшенням концентрації пептиду. Разюче зниження проліферації спостерігали в культурі спленоцитів мишей, що одержували апітоп М57 за допомогою обох шляхів введення.

Як показано на фігурі 5, після 72 годин середній 5І, що спостерігається в культурах, які містять 5 мкг/мл апітопу М57, був 17 у мишей, що одержували інтраназально апітоп М57. У відповідних культурах від контрольних мишей, що одержували РВ5, середній 5І, що спостерігається, був 89. Аналогічно, як показано на фігурі 6, введення апітопу М57 за допомогою підшкірного/черезшкірного шляху призвело до зниження 51 в середньому від 124 у тварин, що одержували РВ5, до 49 у тварин, що одержували апітоп М57.

Рівні ІЕМ ії 1-2, визначені в супернатантах культур після 48 часів культивування, показані на фігурі 7.

Видно, що повторне лікування пептидом іп мімо спричиняє вражаюче зниження секреції обох цитокінів, паралельно зі зниженням проліферативної відповіді.

Висновок

Дані результати показують, що толерантність до апітопу М57 може бути успішно викликана на мишачій моделі, створеній для імітації людської системи, і підтримують можливість його використання в терапії розсіяного склерозу. Крім того, його ефективність зберігається при введенні за допомогою підшкірного/черезшкірного шляху, тобто переважного шляху введення для людей.

Незважаючи на те, що ефективність апітопів МОб і М57 була показана іп мімо, в даний час не представляється можливим продемонструвати ефективність апітопів М51 і М54. Це пов'язано з невдачею відносно трансгенних мишей, що експресують молекулу НІ А-0О6. Миші, що експресують молекулу, були створені, але було виявлено, що вони не здатні виробляти СОЯ Т-клітини в тимусі, і не можуть, таким чином, підвищувати імунну відповідь на антиген в контексті НІ А-0О6.

Приклад 4 - Дослідження із збільшенням дози з композицією з чотирьох пептидів МВР

Комбінація з чотирьох пептидів (МВР 30-44, 131-145,140-154 і 83-99) була використана у відкритому дослідженні із збільшенням дози АТХ-М5-1467 у пацієнтів з повторним прогресуючим розсіяним склерозом.

У пацієнтів контролювали гостроту зору (тобто зниження оптичного невриту), імунологічний параметри і запалення в ЦНС через чотири тижні і через три місяці після прийому фінальної дози.

Приклад 4А - Контроль гостроти зору

Оптичний неврит (ОН) являє собою запалення з супутньою демієлінізацією оптичного нерва, обслуговуючого сітчатку ока.

Оптичний неврит є одним з симптомів розсіяного склерозу, що найчастіше виявляються в даний час, і одним з найбільш поширених симптомів на початку М5. Звичайні симптоми ОН включають: нечіткість зору, втрату гостроти зору, часткову або повну втрату колірного зору, повну або часткову сліпоту і біль за оком.

Був досліджений ефект лікування за допомогою АТХ-М5-1467 оптичного невриту, який розвинувся внаслідок нейрозапального процесу при М5. АТХ-М5-1467 давали згідно з протоколом збільшення дози, відміченим вище, потім через місяць після лікування перевіряли гостроту зору пацієнта з використанням стандартної таблиці Шеллена (фігура 8).

Результати показали клінічно значуще поліпшення гостроти зору через один місяць після лікування. Це було продемонстровано в аналізі дослідження гостроти зору при початковому скринінгу в порівнянні з подальшим тестом через один місяць. Початкові показники зору при скринінгу - 6/24 і 6/9 (на правом і лівому оку, відповідно) поліпшилися після лікування до 6/9 (праве око) і 616 (ліве око). Зір пацієнтів раніше залишався незмінним протягом останніх двох років.

Приклад 48 - Контроль імунологічний параметрів

Як пояснювалося вище, дія пептидної терапії з коктейлем, що містить апітоп"М пептиди з основного білка мієліну (АТХ-М5-1467), досліджували на пацієнтах з М5. Кожного пацієнта відбирали перед початком дослідження аж до 14 днів перед першою дозою (візит 1). Першу дозу в кількості 25 мкг АТХ-М5-1467 давали на візиті 2, 50 мкг на візиті З, 100 мкг на візиті 4, 400 мкг на візиті 5 і 800 мкг на візитах 6 і 7. Подальше обстеження проводили через один місяць і через три місяці подальшого спостереження (візити 8 і 9).

Наступна таблиця узагальнює протокол і показує кількість візитів в клініку, зроблені кожним пацієнтом, разом з дозою пептиду і зразком крові.

Таблиця 1

71111111 - 1111111 |Попереднійвізит. Зразоккровідля мунологя(5О мл) /-:/ /:// 776 | ..юЮюЮюЮюЮюИД800 |Зразоккровідляімунолоії(5бмл).д/-:/ (:/::://:С:(К//:

НИНІ ПИ іній іонні візиту 7

Зразки крові забирали на візиті 1, і візитах з З до 9, і тестували на імунну відповідь до різних антигенів, включаючи очищене білкове похідне (РРО) Мусобасіепйшйт Шшрегсцозіз, як позитивний контроль, очищений основний білок мієліну (МВР) людини і АТХ-М5-1467. Імунну відповідь оцінювали, враховуючи Т-клітинну проліферацію іп міо, секрецію цитокінів в супернатантах тканинної культури і вироблення РНК цитокінів.

Результати

Спостерігали значну відповідь на МВР, з піком проліферації до візиту З (фігура 9). Це корелювало з піком секреції інтерферону гамма. Важливо, однак, що рівень секреції інтерферону гамма знижувався після третього візиту і був на фоновому рівні до візиту 8. Рівні П/-10 не змінювалися суттєво до візиту 7, після якого відбувалося значне збільшення секреції даного цитокіну. Рівні 1-4, 1-5 ії ТМЕ альфа були близькі до фонових у відповідь на МВР у всіх часових точках.

Ніякої проліферативної відповіді або збільшеної цитокінової відповіді не спостерігали для АТХ-М5-1467 (фігура 10).

Висновок

Відповідь на МВР, що спостерігається до візиту 3, демонструє підвищену секрецію 1І-2 і інтерферону гамма, яка корелює з піком проліферації в даній часовій точці. Передбачається, що таке посилення відповіді зумовлено введенням пептидів.

Важливо, однак, що за тимчасовим збільшенням цитокінової секреції слідує повернення інтерферону гамма до початкових рівнів. Було також значне збільшення секреції ІІ -10 після другого введення АТХ-М5-1467 в найвищій дозі. Раніше було показано на тваринних моделях, що специфічна імунотерапія синтетичними пептидами ефективна і призводить до індукції регуляторних Т-клітин, що секретують 1-10. Під індукцією регуляторних Т-клітин, що секретують 1-10, у мишей, розуміється тимчасова відповідь на пептиди з секрецією інтерферону гамма на низькому рівні (ВиїКкНаї еї аї., 1999 Іпї Іттипої! 11: 1625-1634; Бипавіевді єї а!., 2003 )

Іттипої! 170:1240-1248). За цим іде зниження інтерферону гамма і супутнє збільшення 1І--10. Кінетика секреції цитокінів, виявлена після лікування за допомогою АТХ-М5-1467 фактично відтворює паттерн, що раніше спостерігався у експериментальних мишей, підтверджуючи, що АТХ-М5-1467 може індукувати регуляторні Т- клітини, що секретують ІІ -10.

Приклад 4С - Відповідь на МВР значно знижується внаслідок лікування за допомогою АТХ-М5-1467

Шість пацієнтів з повторним прогресуючим розсіяним склерозом (5РМ5) були внесені в список і завершили фазу клінічного випробування І/ЛІа, виконану за протоколом збільшення дози, викладеним в

Прикладі 48.

НІ А-генотипування показало, що шість пацієнтів демонструють широкий спектр гаплотипів НГА, включаючи 5 гаплотипів НІ А-ОВ15, асоційованих з М5. Широкий розподіл НІ А-ОАВІ у пацієнтів, залучених до даного дослідження, означає, що АТХ-М5-1467 буде безпечний і такий, що добре переноситься пацієнтами з

М5, незалежно від їх НІ А-ОВА генотипу.

Лікування пацієнтів з допомогою АТХ-М5-1467 не викликає вироблення антипептидних антитіл. Це вказує на те, що використання АТХ-М5-1467 безпечне і корелює з відсутністю ускладнень в місці ін'єкції або виявами алергії, пов'язаної з дослідженням.

Ретельний аналіз Т-клітинної відповіді показав, що: а) Лікування АТХ-М5-1467 не має неспецифічної імуносупресівної дії. Це ясно продемонстровано фактом збереження імунної відповіді на очищене білкове похідне, антиген з мікобактерії туберкульозу (дані не показані).

Б) Лікування АТХ-М5-1467, з використанням даного протоколу, не призводить до агресивної імунної відповіді на АТХ-М5-1467 або основний білок мієліну (дані не показані). с) порівняння Т-клітинної проліферативної відповіді до (візит 1) і після (візит 8) лікування АТХ-М5-1467 виявило значне зниження відповіді на основний білок мієліну (фігура 11). Всі три індивідууми, які відповідали на МВР при візиті 1, показали зниження відповіді на білок на візиті 8. Якщо брати всіх пацієнтів разом, то є вказівки на значне зниження відповіді на МВР від візиту 1 довізиту 8 (Р-0,0313).

Матеріали і Методи

Склади і дози

Кожний з чотирьох пептидів виробляють незалежно за контрактом з використанням твердофазного пептидного синтезу і очищений з використанням ВЕРХ. Пептиди зберігають в ліофілізованому вигляді.

АТХ-М5-1467 являє собою 1:1:1:1 суміш апітопів МБТ, М54, М56 і М57 в фосфатно-сольовому буфері для черезшкірного введення.

Дві концентрації АТХ-М5-1467, позначені АТХ-М5-1467А і АТХ-М5-14678В і утримуючі 4 мг/мл і 0,5 мг/мл пептиду, відповідно, були приготовані для того, щоб зробити можливим збільшення дози. Режим використовує п'ять ін'єкцій із збільшенням дози (загальна доза - 25, 50, 100, 400 і 800 мкг), які даються від 7 до 14 днів роздільно. Пацієнти потім одержують другу дозу 800 мкг в період від з 7 до 14 дня після першої дози в 800 мкг.

Після одержання всіх шести доз препарату, що досліджується, пацієнта оцінювали через чотири тижні і через З місяці після фінальної дози.

Перевірка гостроти зору

Використовували таблицю Шеллена стандартного розміру для перевірки на відстані б метрів з підсвічуванням позаду, пацієнт сидить на відстані 6 метрів (фігура 8).

Кожне око досліджували роздільно для найнижчої строчки в таблиці, яку пацієнт може прочитати.

Результати потім позначали як Гострота зору - б/(рядок, який пацієнт прочитав).

Імуноаналіз ї) Т-клітинна проліферація:

Кріоконсервовані РВМСО висаджують в 1 мл культур, що містять 1,5х106Є клітин в 0-МЕМ в 48-ямкові планшети для культивування тканин (Мипс Іпіегпайопаї, Совіаг, Согпіпд Іпс. Мем МогкК ОБА). Відповідь на МВР і пептидні антигени в різних концентраціях контролюють протягом періоду в 10 днів. Контрольна ямка не містить антиген. Після 20 годин або 2, 4, 6, 8 і 10 днів культивування, дві аліквоти клітинних суспензії по 100 мкл відбирають з кожної культури в 1 мл для вимірювання проліферації у відповідь на антиген за захопленням

ІГ'НІ тимідину. ії) Вимірювання секретованих цитокінів (1І--2 і І -4, 1-5, 1-10, ТМЕ-о і ТЕМ): Суютейіс Веаай Аттау аналіз:

Рівні цитокінів в супернатанті культури визначають з використанням Суїотеїйіс Веай Авзау (Весіоп

Біскепзоп Віозсієпсез, Сомієу, Охіога, ОК) згідно з інструкціями виробника. Після збору даних за зразками, з використанням БАС Саїїриї (ВО Віозсіеєпсе5), результати генеруються у вигляді графіків і таблиць за допомогою програмного забезпечення ВО СВА. Мінімальні рівні цитокінів, що піддаються кількісному визначенню, наступні: 1-2 і 1-4 - 2,6 пг/мл, 1-5 - 2,4 пг/мл, 11-10 ї ТМЕ-о; - 2,8 пг/мл, ТЕМ - 7,1 пг/мл.

Кількісна ПЛР в реальному часі для вимірювання РНК цитокінів (1-2, 1-10. ІЕМу ії ТМЕ-о)

Для аналізу ІІ -2, 11-10, ІЕМД і ТМЕ-с, проводили ПЛР в кінцевому обсязі 20 мкл, що містить кКДНК, ПЛР буфер, 6,25 мМ Мосі», 0,4 мМ суміш ОМТР, прямий і зворотний праймери (концентрації прямого праймеру: ІІ--2 - 300 нМ, 1-10 - 600 нМ, ІЄМу - 600 нМ, ТМЕ-о; - 600 нМ, концентрації зворотного праймера: ІІ -2 - 600 нМ, 1-10 - 900 НМ ІЕМ-у - 900 НМ, ТМЕ-о - 600 нМ), 200 нМ зонду ЕАМ-ТАМРА і 0,05 О/мкл Ріайпит Тад-полімерази (Іпмігодеп). Умови циклів представлені нижче: початкова денатурація при 947С протягом 30 с, потім 35 циклів по 15 з при 9470 і 1 хв при 6070. Для р-2 мікроглобуліну, суміш для ПЛР, описану вище, доповнювали 0,1 мкМ прямого і зворотного праймерів, З мМ Масі» і проводили кількісний аналіз з використанням 5УВА стгевєп (МоІесшаг Ргобрез Іпс., Х30О000 розведення початкового розчину). Після денатурації протягом 1 хв при 957С, ампліфікація продовжувалася 35 циклів - 15 з при 9470, 1 хв при 617С і 1 хв при 72760. ПЛР реакції і флуоресцентну детекцію одержаних ампліконів проводили на Оріїсоп 2 (Му) ВНезєагсі, БА). Початковий рівень флюоресценції встановлювали з використанням вимірювань від циклу 1 до циклу 10. Величини Сі розраховували, визначаючи точку, в якій флюоресценція в 8-10 разів перевищує стандартне відхилення від базового рівня. Зразки були продубльовані, і кількість піків розраховували за стандартною кривою для кожної

ДНК-мішені. Відмінності в кількості внесених піків РНК і синтезі КДНК коректувалися за допомогою нормалізації експресії цитокіну до експресії р-2 мікроглобуліну.

НГА типування

Аналіз експресії гена НІ А виконували за допомогою стандартної техніки конформаційного поліморфізму однониткової ДНК з використанням полімеразної ланцюгової реакції на ДНК, виділеної з лейкоцитів периферичної крові. НІ А-тип кожного пацієнта використовували для інтерпретації результатів імунологічних аналізів.

Аналіз сироваткових анти-пептидних антитіл 96-ямкові плашки покривають 1-10 мкг/мл кожного апітопу М51, М54, М56 або М57 при рН 9,6 протягом ночі при 47"Сб. Плашки промивають чотири рази фосфатно-сольовим буфером, рН 7,2, 0,0595 Тжеєп (РВ5-

Тмееп), і ямку блокують за допомогою 595 ЕС5 в РВ5 протягом 1 год при кімнатній температурі. Сироватку розводять 1:1100 в РВО-Гмеєп і інкубують в продубльованих ямках протягом однієї години при кімнатній температурі. Після 4 промивань козячі антитіла проти Ід людини, кон'юговані з пероксидазою хрону (5ідта) і розведених 1:12000 в РВ5, додавали в кожну ямка і інкубували плашки протягом однієї години при кімнатній температурі. Після 4 промивань 0,4 мг/мл о-фенілендіамін дигідрохлоридом (бідта) додавали 3095 пероксид водню і інкубували при кімнатній температурі протягом 15-20 хв. Фарбування зупиняли за допомогою 2,0 М

Н»5О» (50 мкл) і вимірювали величину оптичної густини (00) при 490 нм з допомогою спектрофотометра для зчитування планшетів з ЕГІ5А. Результати представлені у вигляді ОО для сироватки, розведеної 1:100.

ЯМР-сканування

Запалення в ЦНС досліджували ЯМР-скануванням з використанням контрастування з гадолінієм.

Досліджували об'єм і кількість бляшок, що збільшилися і порівнювали з початковим скануванням.

Різні модифікації і варіації описаних способів і методів за винаходом будуть ясні фахівцям в даній галузі в межах обсяг і суті винаходу. Хоча даний винахід описаний в зв'язку з конкретними переважними варіантами здійснення, потрібно розуміти, що заявлений винахід не обмежений даними конкретними варіантами здійснення. Дійсно, різні модифікації описаних способів здійснення винаходу, які загальновідомі фахівцям в галузі хімії або біології або в суміжних галузях, охоплюються даним винаходом. Всі публікації, згадані у вищевикладеному описі, включені в даний документ як посилання.

. СПИСОК. ПОСЛІДОВНОСТЕЙ . . ; «1102 Арісоре ТесппоіїочЧу (Вкгівсої); Біщшібей й «1902 КОМПОЗИЦІЯ «130» РОЗІбУТЕА «1405 вст/сВ?2008/003673 що окі415 2008-10-30 «150» сов 0721230.7 «1512 2007-10-31 , ! ' «1505 5Вв 0800962. 3 ! . | ! «15815 2008-01-18 | : ! «1602 4 Є «1702 Рабепсїп уєквзість 3.5 «юю» 1 ши «2112 15 : Я | ; «21228 РЕ «2135 Нощо заріапа «дах

Рго Аха Ніз Ака дер Ту біу її Бей АБр о бех ї116 біу Ах Рпе 1 5 10 5 «2105 2 | ! «в11ї1з 17 " «Р122 БЕТ «13» Ното варієпа «ох. біш.дяп Рхо Уаї Узі Нів Рпе Рне Пув Авпої1їе Уаї ТБбЕ Рго Аху ТЕ " ї : ! В й 10 : 15 : ко ше | - щі «2105 3 «ть 15 І «2122 вт ; й «21395 Ново варієйв І хай» 3. діа бек Авр о Тух Був бех Аза Бі ув біу Рбе був 51у чаї Авр

ОХ 5 15 15 «102 4. шк «21ї» 15 : : «2122 РЕТ : І у «13» Ното заріапе ни ер: Ми | І :

с1іу Ре туз біу Узі АкродДіа сій Сіу Тахо рей бег Був т1іє Ре а ще во | 10 15 3005 нен 1005 як -тж- Моаг 2004 Не ї хх я щюЮ- коді ! ро в й диню внии ще : й ке пен кишеня понининнния З мом ов ад ен синам о 10 20:50 45 що о Ми

ТЕрхіена МОР мем

Фіг. а. полин Ов

Й | й 150 їй в диня ! п7я ой ях 100. рин р т

Бо. шо джин

Ка ддкрокнкілжятя ВН ник мово є доль , -Н ж о ша кі 40 50 5 7 ня Сил Пертна МИ ЗОМ пику ше

Фіг. 2

0. чех хкізз 4 ! не Гм 130-153: пен й : ПОС ООИВиИ : : КОКО й

Пе : в : ! с ! х ЕХО зно : ПЕВНО :

Е з ПОКВОВ о

Мо ! оо :

Пе ; : і п '

ОК я о. : п вно По ее соди Аитиренпрезетунчі АТ нн є їх

Фіг

ВАК ІЕу тов ен є шик Я

МІД уУкОоВав Толеразовані Коанихль 204 , ;

У ре : ;

І рек

Я . 1 5 т

Ж ї

У З

В ж. НЯ ї-Я х

Н ; : « з ї 15 ! щи ; Я ! я з :

ЇЗ М - ' і й : : чу 5 тк ! х ' з 105 Ж жийї ї

З . ж є з ти : ! рони ! ж ж ; Ж ї і жо ? --к- : Я

Вк з ке Я Я гЄ они вк | з М нин

І х В. Ж

Ж х хх ї й Її; У в т з ой й сь рай а робка вати

З ся пп жін АТАКА я ОХ КВОТ ік трат хек лете тет НЕК Є ТІМ Асі КК КК ТЕ ОО ін кн Кот тОЧ не, же ща Са Кок же -- 3 ка ди що щ- са ри РУ кан Є с ди і -ій кВ с з З с.

ЩХ що ж чем Фф З пк зх ГЕ Б ях п ки 4 Ех їх їжея у їх Ек Го ща щу 53 св ше ше ше в и ВН о хе НН фо ОК Б фо Я Ж тд щі ; хх а шк т ; і п а ген у ТЗ о й до йо 5. У о ня й сли са м. й 7

Фіг. 4 :

син Рв5 1404 -- 83-89 120. щ ше і, вої / ге ВШ п в ї Ви Сон ен нн ши и ові й З й 5 В : Ковнентрація ВАХЮ мкрма

Фіг. 5 -щк ная МД дю --- 83-99 я 140. 3 я 100. кине ія вен во -Ш2 -4

ЯК онЕх ! ше Й

Од 3 Кі З 4 но в

Концентрація мкинчя

Фіг. о

! ! З Тварин, по одержували РАХ но Тварин. що одержувати 3-55

КО : . Е Й етрчх : .

Е й ОК :

Х оо - все - ОО : .

Й "КИ :

Е Е | ОО ше с - : СО ПИШИ

Її Ка СО В :

В. й ХО 5 й сх ох пк Е ДЯ

Концентровані 3 мкг ми : в

Е: З Жварниниа пз одержунали ЕВ

Тварини зно одержунцян 53-95 15065 і у Я : : : СВ я ов о гАЖе

ВХ хе ! | КО «по Ко й н зх 7

ГО Я р В

В ч й окон дя : я

Концентаця аа мем с п -

Фіг. у са

В д і :

РМТИНХ

ПАЯМЕОТ

: : : г | ща

МРНТАЕвЕХИи. г

ХОЕНРТХАН

: Кк :

БАХТЮННИОРІ

. фіг

Поенкверацшя . : !

Кл ; ІК ; А 2о0о0- 5о0о- ! чо: ї ВО т шої

А В А зво Н і: | 77 ВОКО: і Й /

Дисосо. г куми / Як Й і 3 5 АЮ. ох ї 504 Жов ж і

Шк Ки Я ух я ж іо енер утрені Бо 4 нн своя Денна ши и: зи КН сН тез ав а 1855678

Зразок крові і фіг. 9 2 Прошіфераді ! як Кв : | | ЕМ х ! хЯ 200003 вою ! 1803 й , зв 40003 во ж дня . вв

ЕТ з ко. но я ши т Во дів вв вс есвя пен нн нн Др ет Овес нн и с п Не: М НН 1954557 8 що Звазок ладні

: ший рент нн ко 10004. : ра К.. : Пе : щодо Ше: В й : жу НЕ: Й ще : ї вдо. т щ : | ще не й ї Й нн

Я ї .. зннннннн ян пит нене ян щХ - З х й ори сек оон

Ввиті інт й заваковни ранговни киизевні біховсвна охнОостОоре В фі

Claims (12)

1. Композиція, яка містить наступні пептиди основного білка мієліну: МВР 30-44; МВР 83-99; МВР 131-1451 МВР 140-154.

2. Композиція за п. 1, яка складається по суті з наступних пептидів основного білка мієліну: МВР 30-44; МВР 83-99; МВР 131-1451 МВР 140-154.

3. Композиція за пп. 1 або 2 для лікування або профілактики захворювання.

4. Композиція за пп. 1 або 2 для лікування або профілактики розсіяного склерозу.

5. Композиція за пп. 1 або 2 для лікування або профілактики оптичного невриту, пов'язаного з розсіяним склерозом.

б. Застосування композиції за пп. 1 або 2 для виготовлення лікарського засобу для лікування розсіяного склерозу.

7. Застосування композиції за пп. 1 або 2 для виготовлення лікарського засобу для лікування оптичного невриту, пов'язаного з розсіяним склерозом.

8. Спосіб лікування або профілактики розсіяного склерозу у пацієнта, що потребує цього, який включає стадію введення композиції за пп. 1 або 2 пацієнту.

9. Спосіб лікування або профілактики оптичного невриту, пов'язаного з розсіяним склерозом, у пацієнта, що потребує цього, і який включає стадію введення композиції за пп. 1 або 2 пацієнту.

10. Спосіб за пп. 8 або 9, в якому композицію вводять згідно з протоколом із збільшенням дози.

11. Спосіб за будь-яким з пп. 8-10, де композицію вводять НІА-02Об або НІА-ЮК2О- позитивним пацієнтам.

12. Набір, який включає наступні пептиди основного білка мієліну: МВР 30-44; МВР 83-99; МВР 131-1451 МВР 140-154 для спільного, роздільного або послідовного введення.