TWI835736B - 合成二氧化矽奈米粒子之方法及藉由該方法所獲得的二氧化矽奈米粒子 - Google Patents

合成二氧化矽奈米粒子之方法及藉由該方法所獲得的二氧化矽奈米粒子 Download PDF

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Abstract

本發明係關於一種合成適用於診斷及/或治療的超小二氧化矽奈米粒子之方法。更特定地，一種用於合成二氧化矽奈米粒子之方法，前述方法包含將在生理學pH下帶負電的的至少一種矽烷與在生理學pH下為中性的至少一種矽烷、及/或在生理學pH下帶正電的至少一種矽烷混合，其中：中性矽烷與帶負電的矽烷之莫耳比率A係定義如下：0
Figure 107119836-A0202-11-0001-65
A
Figure 107119836-A0202-11-0001-66
6，帶正電的矽烷與帶負電的矽烷之莫耳比率B係定義如下：0
Figure 107119836-A0202-11-0001-67
B
Figure 107119836-A0202-11-0001-68
5，中性及帶正電的矽烷與帶負電的矽烷之莫耳比率C係定義如下：0<C

Description

合成二氧化矽奈米粒子之方法及藉由該方法所獲得的二氧化矽奈米粒子
本發明係關於一種合成尤其適用於診斷及/或治療的超小二氧化矽奈米粒子之方法。本發明亦關於所獲得的超小二氧化矽奈米粒子。
癌症為世界許多國家的主要死亡原因。當今，有三種治療癌症的主要方法，該等方法為外科手術、化學療法及放射療法。後者暗示使用離子化輻射來毀壞腫瘤中之癌細胞。然而，放射療法之重要副作用為照射亦會破壞包圍腫瘤之正常組織。雖然已在設計射束形狀及治療計劃方面得到很多技術進步，但這種副作用仍限制放射療法之治療窗口。已引入兩個主要策略來克服這種副作用：使用諸如質子、中子或重離子之不同粒子來替代習知光子，及/或使用輻射敏化劑來局部地增強腫瘤內的遞送劑量。後者為對可充當有效敏化劑的新材料之研究打開了大門。
在對抗癌症的戰鬥中的另一先決條件為精確地定位腫瘤。當前，存在若干可用於此目的的成像技術，包括磁共振造影(magnetic resonance image；MRI)、X射線電腦斷層掃描攝影術(X-ray computed tomography；X-ray CT)、由單光子發射電腦斷層掃描攝影術(single photon emission computed tomography；SPECT)及正電子發射斷層攝影術(positron emission tomography；PET)組成的閃爍圖術(scintigraphy)、光學成像及超音波成像。該些技術亦需要作為探針或對比度增強劑之新材料來改良影像之品質。此外，每一技術具有其自身的優點及缺點；因此，達成高解析度及靈敏度兩者的所謂多模態成像的互補技術之組合為現行的研究領域。
近年來，奈米技術之出現為開發用於現代醫學，尤其癌症治療的新的解決方案提供巨大的機遇。這樣產生了一個稱為奈米醫學之快速興起的領域，其中最有前景的研究方向之一係開發作為新類型的治療劑或用於成像的新類型的探針或對比劑的奈米材料。此係歸因於奈米粒子可提供的許多新穎優點，諸如：-基於奈米粒子之化學設計來保護、遞送及釋放大量活性分子至一些特定位點的能力；-僅在一個奈米粒子中組合不同元件之可能性，該等元件如活性分子、官能化基團或成像探針； -由於EPR效應「增強的滲透性及滯留(Enhanced Permeability and Retention)」而特異地靶向癌腫瘤之能力，此EPR效應係奈米粒子在腫瘤中而非正常組織中累積之趨向；-奈米材料的藉由其奈米尺度尺寸誘導的光學、熱、磁性及電子性質。
在不同類型之奈米粒子中，含有金屬之奈米粒子吸引了眾多關注。這種類型的奈米粒子允許利用金屬之若干有價值的性質，諸如：高Z金屬之輻射敏化能力，該等高Z金屬例如Au(Z=79)、Pt(Z=78)、Hf(Z=72)、Gd(Z=64)；或用於MRI成像的釓(Gd)之順磁性質；或核粒子發射，例如用於閃爍圖術成像之64Cu、68Ga、99Tc、89Zr、111In，用於居里療法(curie therapy)之90Y或177Lu。已在文獻中描述若干實例。詳言之，二氧化矽奈米粒子已被作為用於不同金屬之奈米載體加以密集研究。其為安全的且易於合成及官能化。另外，在許多情況下，其不會干擾金屬與外部刺激之間的相互作用，該等外部刺激例如放射粒子、光束等等。
專利申請案WO2007124131描述利用螯合劑，亦即DTTA、DTPA官能化的二氧化矽奈米粒子，且其係用於診所中供螯合作為對比劑之Gd3+。該些奈米粒子之流體動力學直徑(hydrodynamic diameter；DH)為約40nm。然而， 近期，許多研究已證實，具有不及10nm的DH之超小尺寸被推薦用於奈米粒子以使其得以經由尿自身體快速地及完全地排除。此將防止如Gd3+之金屬的長期毒性，Gd3+在作為嚴重副作用的腎源性全身性纖維化方面是有名的。此外，最小化粒徑產生較大的表面且因此產生Gd螯合之高得多的裝載速率。
然而，仍難以合成此尺寸的奈米粒子，亦即，具有超小DH，例如不及15nm，較佳地不及10nm之奈米粒子。
專利申請案WO2011135101 A2描述一種基於Gd之二氧化矽奈米粒子，其亦稱為AGuIX®，其顯示用作治療診斷劑之有前景的結果。此奈米粒子包含利用如DOTAGA之螯合劑官能化的聚矽氧烷網狀結構且具有小於5nm之DH。粒子上之大部分螯合劑(通常多於50%)與Gd3+形成錯合物。此奈米粒子為用於使用MRI進行腫瘤偵測之極有效對比劑。此外，所有其組分亦即聚矽氧烷、DOTAGA之Gd3+錯合物係已知對人類為安全的。AGuIX®經由腎清除率快速地自人體消除，從而有助於防止Gd3+在器官中之沉積，且因此防止稱為腎源性全身性纖維化之嚴重長期併發症。
然而，此奈米粒子之合成並不如圖1所提出經由多步驟合成進行一般直接。首先，將小的1至3nm的氧化釓核 心在二乙二醇(diethylene glycol；DEG)中合成。隨後，藉由烷氧基矽烷之水解及縮合反應將此核心用聚有機矽氧烷(polyorganosiloxane)之層塗佈。接著，將此層用DOTAGA酐官能化。之後，將奈米粒子轉移至水中以便將核心溶解且釋放Gd3+離子，將該等Gd3+離子藉由DOTAGA螯合。在聚矽氧烷層之碎裂之後，獲得奈米粒子。此由上而下方法已得以充分研究，然而，這是耗時的，耗費溶劑及耗費原材料的。此外，其暗示合成後的低產率及改變或添加不同金屬之困難。
因此，合乎需要的是開發一種較容易的方法來合成此種奈米粒子，從而可克服當前合成之局限。詳言之，將亦為合乎需要的是開發一鍋合成(one-pot synthesis)方法，從而賦能超小及穩定的二氧化矽奈米粒子之生產。此外，將亦為合乎需要的是，此新方法賦能具有空螯合劑之高裝載速率的奈米粒子之合成，該等螯合劑可隨後取決於應用藉由不同的金屬螯合。
本揭示內容之第一態樣係關於一種用於合成二氧化矽奈米粒子之方法，該方法包含將在生理學pH下帶負電的至少一種矽烷與以下者混合：- 在生理學pH下為中性的至少一種矽烷；及/或- 在生理學pH下帶正電的至少一種矽烷； 其中：- 中性矽烷與帶負電的矽烷之莫耳比率A係定義如下：0
Figure 107119836-A0202-12-0006-75
A
Figure 107119836-A0202-12-0006-76
6，較佳地0.5
Figure 107119836-A0202-12-0006-77
A
Figure 107119836-A0202-12-0006-78
2；- 帶正電的矽烷與帶負電的矽烷之莫耳比率B係定義如下：0
Figure 107119836-A0202-12-0006-79
B
Figure 107119836-A0202-12-0006-80
5，較佳地0.25
Figure 107119836-A0202-12-0006-81
B
Figure 107119836-A0202-12-0006-82
3；- 中性及帶正電的矽烷與帶負電的矽烷之莫耳比率C係定義如下：0<C
Figure 107119836-A0202-12-0006-83
8，較佳地1
Figure 107119836-A0202-12-0006-84
C
Figure 107119836-A0202-12-0006-85
4。
本揭示內容之另一態樣係關於一種二氧化矽奈米粒子，其具有在0.5nm與15nm之間，例如在0.5nm與10nm之間的流體動力學平均直徑，包含用螯合劑接枝的聚有機矽氧烷基質，該等螯合劑不含金屬離子且係以至少0.1μmol/mg奈米粒子，較佳地在0.5μmol/mg與2μmol/mg之間的含量存在。例如，在一個特定實施例中，螯合劑為DOTAGA且螯合劑之含量包含0.5μmol/mg與2μmol/mg的含量。
圖1顯示如WO2011135101 A2中所報導的奈米粒子之合成之反應方案。
圖2顯示根據實例1的奈米粒子之DLS圖表(圖2-A)及ζ電位(圖2-B)。
圖3顯示CEST、TANED及根據實例1的奈米粒子在D2O中之1H-NMR光譜。
圖4顯示根據實例1的奈米粒子於D2O中之2D-NMR(DOSY)光譜。
圖5顯示根據實例1的奈米粒子之固態29Si-NMR光譜。
圖6顯示根據實例2、步驟1.a的APTES-DOTAGA之合成之反應方案。
圖7顯示根據實例2、步驟1.b的APTES-DOTAGA之合成之反應方案。
圖8顯示根據實例2、步驟1.b的40μM EuCl3及100μM DOTAGA之混合物在395nm激發之發射光譜(圖8-A)及APTES-DOTAGA合成混合物在594nm(圓形)及616nm(正方形)(圖8-B)之滴定曲線。圖8-C顯示根據實例2、步驟1.b的DOTAGA之IR光譜。圖8-D顯示根據實例2、步驟1.b的APTES-DOTAGA之反應混合物之IR光譜。
圖9顯示根據實例2、步驟2的奈米粒子之自下而上合成之反應方案：策略a(實線箭頭)及策略b(虛線箭頭)。
圖10顯示在與Gd3+螯合之前，根據實例2、步驟2.a的UCHSNP-1奈米粒子之DLS圖表。
圖11顯示根據實例2、步驟2.a的在395nm激發的UCHSNP樣本在594nm(圓形)及616nm(正方形)下之滴定曲線。
圖12顯示根據實例2、步驟2.a的UCHSNP-1之NMR光譜：NMR-DOSY光譜(圖12-A)；UCHSNP-1在127g/l下之1H NMR光譜(圖12-B)；NMR-DOSY光譜(圖12-C)；UCHSNP-1@Lu在127g/l下之1H NMR光譜(圖12-D)及粒子上的APTES及APTES-DOTAGA官能基上的H1、H2及H3之位置(圖12-E)。
圖13顯示根據實例2、步驟2.a的UCHSNP@Gd-1在與Gd3+螯合之後自冷凍乾燥粉末再分散的DLS圖表及ζ電位。
圖14顯示根據實例2、步驟2.b的UCHSNP@Gd-2奈米粒子在濃縮之前的DLS圖表。
圖15顯示根據實例2、步驟2.b的UCHSNP@Gd-2在純化之後自冷凍乾燥粉末再分散的DLS圖表及ζ電位。
圖16顯示根據實例2、步驟2.b的在395nm激發的UCHSNP@Gd-2樣本在594nm(圓形)及616nm(正方形)下之滴定曲線。
圖17顯示根據實例3的藉由調整矽烷之比率進行奈米粒子之一鍋合成及尺寸控制之反應方案。
圖18顯示根據實例3的混合物的在APTES與DOTAGA酐之間的反應之後的Eu滴定曲線(圖18-A)及相同混合物在pH 9下暴露隔夜的Eu滴定曲線(圖18-B)。
圖19顯示根據實例3的在利用起始矽烷之不同比率的情況下奈米粒子之DLS圖表。
圖20顯示根據實例3的UCHSNP-3(圖20-A)、UCHSNP-4(圖20-B)、UCHSNP-5(圖20-C)及UCHSNP-6(圖20-D)之Eu滴定曲線。
圖21顯示根據實例4的在合成期間在不同步驟處的UCHSNP-7之DLS圖表：APTES+DOTAGA酐於DEG中(虛線，正方形)、APTES+DOTAGA酐+TEOS於DEG中(虛線，向上三角形)、APTES+DOTAGA+TEOS於H2O中(虛線，向下三角形)、APTES+DOTAGA+TEOS於H2O中經由0.2 μm膜過濾(直線，圓形)(圖21-A)；純化之後(圖21-B)。
圖22顯示根據實例4的UCHSNP-7奈米粒子之Eu滴定曲線。
圖23顯示根據實例4的UCHSNP-7@M之DLS圖表(M：Gd(正方形)、Tb(圓形)、Ho(向上三角形)及Bi(向下三角形))。
圖24-A顯示根據實例4的UCHSNP-7在不同pH下的ζ電位之完全曲線。圖24-B顯示根據實例4的UCHSNP-7@Gd、UCHSNP-7@Tb、UCHSNP-7@Ho及UCHSNP-7@Bi在pH 6.6下之ζ電位。
圖25-A顯示根據實例4的UCHSNP-7、UCHSNP-7@Gd、UCHSNP-7@Tb、UCHSNP-7@Ho及UCHSNP-7@Bi之UV-可見光吸收光譜。圖25-B顯示根據實例4的UCHSNP-7、UCHSNP-7@Ho及HoCl3在以50mM於HCl 0.1mM中之UV-可見光吸收光譜。圖25-C顯示根據實例4的UCHSNP-7@Gd之UV-可見光激發及發射光譜。圖25-D顯示根據實例4的UCHSNP-7@Tb之UV-可見光激發及發射光譜。
圖26顯示根據實例4的UCHSNP-7、UCHSNP-7@Gd、 UCHSNP-7@Tb、UCHSNP-7@Ho及UCHSNP-7@Bi之IR光譜。
圖27-A顯示根據實例5的在UCHSNP@Gd-2之注射前(左)及注射後(右，直至6h)的腫瘤組織(白色箭頭)之MRI橫截面。圖27-B顯示根據實例5的在UCHSNP@Gd-2之注射之後腫瘤組織中之動態MRI訊號增強。圖27-C顯示根據實例5的在UCHSNP@Gd-2之注射之後肝中之動態MRI訊號增強。
[合成二氧化矽奈米粒子之方法]
在第一態樣中，本揭示內容係關於一種用於合成二氧化矽奈米粒子之方法，該方法包含將在生理學pH下帶負電的至少一種矽烷與以下者混合：- 在生理學pH下為中性的至少一種矽烷；及/或- 在生理學pH下帶正電的至少一種矽烷；其中：- 中性矽烷與帶負電的矽烷之莫耳比率A係定義如下：0
Figure 107119836-A0202-12-0011-86
A
Figure 107119836-A0202-12-0011-87
6，較佳地0.5
Figure 107119836-A0202-12-0011-88
A
Figure 107119836-A0202-12-0011-89
2；- 帶正電的矽烷與帶負電的矽烷之莫耳比率B係定義如下：0
Figure 107119836-A0202-12-0011-90
B
Figure 107119836-A0202-12-0011-91
5，較佳地0.25
Figure 107119836-A0202-12-0011-92
B
Figure 107119836-A0202-12-0011-93
3；中性及帶正電的矽烷與帶負電的矽烷之莫耳比率C係定義如下：0<C
Figure 107119836-A0202-12-0011-94
8，較佳地1
Figure 107119836-A0202-12-0011-95
C
Figure 107119836-A0202-12-0011-96
4。
如本文所使用，術語「二氧化矽奈米粒子(silica nanoparticles)」係指來源於矽烷前驅物之聚合的奈米粒子。較佳地，該等奈米粒子包含聚有機矽氧烷。該等奈米粒子可進一步包含另外的化合物，包括有機分子。後文將描述如藉由該方法獲得的二氧化矽奈米粒子之特定實施例。
如本文所使用，術語「生理學pH(physiological pH)」係考慮為7.4。
如本文所使用，術語「矽烷(silane)」係指在矽原子上具有4個取代基之化合物。在較佳實施例中，矽烷係在烷氧基矽烷、羥基矽烷、及其混合物之中選擇。可用於該方法的矽烷之實例為正矽酸四乙酯(Si(OC2H5)4，亦稱為TEOS)、正矽酸甲酯(Si(OCH3)4，亦稱為TMOS)、胺基丙基三乙氧基矽烷(H2N(CH2)3-Si(OC2H5)3，亦稱為APTES)、APTES-DOTAGA、N-(三甲氧基矽烷丙基)乙二胺三乙酸三鈉鹽((CH3O)3Si-(CH2)3N(CH2COONa)(CH2)2N(CH2COONa)2，亦稱為TANED)及羧基乙基矽烷三醇鈉鹽((HO)3Si-(CH2)2COONa，亦稱為CEST)。如本文所使用，術語矽烷亦包括含有螯合金屬陽離子之任何矽烷化合物。如本文所使用，術語矽烷亦包括由如下文描述的任何官能 化劑至矽烷前驅物之共價接枝產生的任何矽烷化合物；官能化劑包括例如螢光團、藥物、有機聚合物或靶向配位體。
如本文所使用，術語「烷氧基矽烷」係指式(I)化合物：RnSi(ORi)4-n (I)
其中：-R為有機基團；-Ri為C1-C12烷基，較佳地C1-C6烷基；-n為0、1、2、或3。
根據一實施例，n為0或1。
如本文所使用，術語「羥基矽烷」係指式(II)化合物：RnSi(OH)4-n (II)
其中：-R為有機基團；-n為0、1、2、或3。
根據一實施例，n為0或1。
如本文所使用，術語「有機基團」係指經由Si-C鍵連接至矽原子的有機取代基團，不管官能類型如何。有機取代基團之實例包括而不限於烷基胺。
如本文所使用，術語「C1-C12烷基」係指具有1至12個碳原子之直鏈或支鏈烷基官能基。適合的烷基包括甲基、乙基、正丙基、異丙基、正丁基、異丁基、第二丁基及第三丁基、戊基及其異構物(例如，正戊基、異戊基)、及己基及其異構物(例如正己基、異己基)。
根據該方法之特定實施例，奈米粒子具有在0.5nm與15nm之間，較佳地在0.5nm與10nm之間的平均流體動力學直徑。
在該方法之特定實施例中，矽烷(例如自烷氧基矽烷、羥基矽烷、及其混合物之選擇)可表示試劑之總重量之至少80重量%、85重量%或90重量%，該試劑為用於合成奈米粒子之反應中的起始化合物。
反應可在如醇或水溶液之質子溶劑中執行。在一個特定實施例中，僅水係用作反應之溶劑。在其他實施例中，反應係在醇或醇之混合物中執行。可用於該方法中之醇包括乙醇、正丙醇、異丙醇、正丁醇、第三丁醇、正戊醇、乙二醇及二乙二醇。
反應較佳地在膠體溶液中執行。此賦能對奈米粒子之直徑的較好控制。典型地，反應不經由典型的溶膠-凝膠方法執行以避免3次互連凝膠形成。
與先前技術相對的當前方法之一個優點在於：其可作為一鍋合成執行，亦即，無需中間產物之任何分離或純化步驟。
另一優點在於，特定比率A、B及C之設計賦能對二氧化矽奈米粒子之表面電荷及尺寸之控制，尤其，對於具有包含在0.5nm與15nm之間的平均流體動力學直徑之穩定奈米粒子之生產如此。詳言之，為將奈米粒子之尺寸減少至低於10nm，較佳具有例如低於2且更佳地低於1.5之比率A。
根據該方法之一實施例，該帶負電的矽烷包括或基本上由包含至少一個、兩個、或更多個帶負電的羧酸官能之矽烷組成。具有羧酸官能的帶負電的矽烷之實例包括而不限於：N-(三甲氧基矽烷丙基)乙二胺三乙酸三鈉鹽((CH3O)3Si-(CH2)3N(CH2COONa)(CH2)2N(CH2COONa)2，亦稱為TANED)及羧基乙基矽烷三醇鈉鹽((HO)3Si-(CH2)2COONa，亦稱為CEST)。
根據該方法之另一實施例，該帶負電的矽烷包括或基本上由包含至少一種螯合劑之矽烷組成。螯合劑可帶有負電荷，例如羧酸官能。
螯合劑可含有一些螯合金屬陽離子。
螯合劑可選自聚胺基聚羧酸，包括而不限於：- DOTA(1,4,7,10-四氮雜環十二烷-N,N’,N”,N'''-四乙酸)、DOTAGA(2-(4,7,10-三(羧基甲基)-1,4,7,10-四氮雜環十二烷-1-基)戊烷二酸)、下式(III)之DO3A-吡啶：
Figure 107119836-A0202-12-0016-62
 - DTPA(二伸乙基三胺五乙酸)、CHX-DTPA(反-環己基-二伸乙基三胺五乙酸)、側氧基-Do3A(1-氧雜-4,7,10-三氮雜環十二烷-4,7,10-三乙酸)、SCN-Bz-DTPA(對異氰硫基苄基-DTPA)、1 B3M(1-(對異氰硫基苄基)-3-甲基-DTPA)、MX-DTPA(1-(2)-甲基-4-異氰酸基苄基-DTPA)；- EDTA(2,2',2",2'''-(乙烷-1,2-二基二氮基)四乙酸)；- EGTA(乙二醇-雙(2-胺基乙基醚)-N,N,N',N'-四乙酸)、BAPTA(1,2-雙(鄰胺基苯氧基)乙烷-N,N,N',N'-四乙酸)；- NOTA(1,4,7-三氮雜環壬烷-1,4,7-三乙酸)；- PCTA(3,6,9,15-四氮雜雙環[9.3.1.]十五-1(15),11,13-三烯-3,6,9-三乙酸)；- 下式(IV)之TMPAC：
Figure 107119836-A0202-12-0017-3
 - 及其混合物。
根據該方法之實施例，混合步驟可進一步包括在生理學pH下為中性的矽烷，該中性矽烷可包含螯合劑。包含在中性矽烷中之螯合劑可在例如卟啉、氯、1,10-啡啉、聯吡啶及三聯吡啶之中選擇。
根據該方法之實施例，藉由該方法獲得的奈米粒子包含多於0.1μmol/mg之螯合劑。例如，藉由該方法獲得的奈米粒子可包含多於0.5μmol/mg之螯合劑，或在0.1μmol/mg與5μmol/mg之間的螯合劑，或在0.5μmol/mg與2μmol/mg之間的螯合劑。
根據該方法之特定實施例，該方法包括使用具有不含金屬離子之螯合劑的矽烷。例如，該等試劑之總螯合劑之小於5mol%、1mol%或0.1mol%與金屬離子形成錯合物。在此情況下，如藉由該方法獲得的具有游離螯合劑之奈米粒子可在第二步驟中取決於所要應用藉由所關注的金屬離子來螯合。
替代地，該方法包括使用具有螯合有金屬離子之螯合劑的矽烷。例如，該等試劑之總螯合劑之多於50mol%、70mol%或90mol%與金屬離子形成錯合物。在此情況下，如藉由該方法獲得的奈米粒子具有螯合的金屬離子且可直接使用而無需進一步添加金屬離子。
可藉由螯合劑螯合的金屬離子包括鹼金屬離子及其放射性同位素、過渡金屬離子及其放射性同位素、後過渡金屬離子及其放射性同位素、稀土金屬離子及其放射性同位素、及其混合物。
過渡金屬包括Hf、Cu、Pt、Au、Tc、Y、Mn、Ru、Fe、Zr、及其混合物。
後過渡金屬包括Bi、Ga、In及其混合物。
稀土金屬包括鑭系元素，諸如Gd、Dy、Eu、Tb、Nd、Yb、Er、Ho、Lu或其混合物，且更佳地為Gd。放射性核種將例如選自Ac、Th、Pa、Np、U及Pu。
Gd、Dy、Mn及Fe例如適用於產生在MRI中用作對比劑之奈米粒子。
Eu、Tb、Nd、Yb及Er例如適用於用作螢光劑之奈米粒子。
Ho、Bi、Y及Lu例如適用於用作居里治療劑之奈米粒子。
Lu、Yb、Gd、Bi、Hf及Ho例如適用於用作輻射敏化劑之奈米粒子。
Cu、Ga、Tc、Y、In及Zr例如適用於用作用於閃爍圖術之探針的奈米粒子。
根據該方法之特定實施例，如藉由該方法獲得的奈米粒子包含相較於奈米粒子之總重量多於10重量%之金屬離子，例如多於15重量%或在10重量%與20重量%之間的金屬離子。此含量可藉由對冷凍乾燥粉末之元素分析來測定。
根據該方法之特定實施例，如藉由該方法獲得的奈米粒子包含多於0.1μmol/mg之金屬離子，例如多於0.25μmol/mg或在0.1μmol/mg與1.5μmol/mg之間的金屬離子。
根據實施例，混合步驟包含至少一種帶正電的矽烷， 該帶正電的矽烷包含至少一個帶正電的胺基官能(amino function)。具有胺基官能的帶正電的矽烷之實例包括而不限於：APTES。
在該方法之特定實施例中，該等奈米粒子之合成引起聚有機矽氧烷網狀結構經由矽氧烷橋Si-O-Si之形成的產生。該些矽氧烷橋接係藉由羥基矽烷之縮合及水之脫去來獲得。若烷氧基矽烷用於本揭示內容之方法，則反應係在水溶液中執行以便首先使烷氧基矽烷水解成羥基矽烷。在此情況下，奈米粒子具有聚有機矽氧烷基質。
根據特定實施例，根據本揭示內容之方法包含將在生理學pH下帶負電且包含選自聚胺基聚羧酸之至少一種螯合劑的至少一種羥基矽烷或烷氧基矽烷與以下者混合：- 在生理學pH下為中性的至少一種羥基矽烷或烷氧基矽烷；及/或- 在生理學pH下帶正電且包含胺基官能之至少一種羥基矽烷或烷氧基矽烷；其中：- 中性矽烷與帶負電的矽烷之莫耳比率A係定義如下：0
Figure 107119836-A0202-12-0020-97
A
Figure 107119836-A0202-12-0020-98
6，較佳地0.5
Figure 107119836-A0202-12-0020-99
A
Figure 107119836-A0202-12-0020-100
2；- 帶正電的矽烷與帶負電的矽烷之莫耳比率B係定義如下：0
Figure 107119836-A0202-12-0020-101
B
Figure 107119836-A0202-12-0020-102
5，較佳地0.25
Figure 107119836-A0202-12-0020-103
B
Figure 107119836-A0202-12-0020-104
3； - 中性及帶正電的矽烷與帶負電的矽烷之莫耳比率C係定義如下0<C
Figure 107119836-A0202-12-0021-105
8，較佳地1
Figure 107119836-A0202-12-0021-106
C
Figure 107119836-A0202-12-0021-107
4。
根據特定實施例，根據本揭示內容之方法包含將在生理學pH下帶負電的至少一種烷氧基矽烷與以下者混合，該烷氧基矽烷係自APTES-DOTAGA、TANED、CEST及其混合物之中選擇：- 在生理學pH下為中性的至少一種烷氧基矽烷，該烷氧基矽烷係自TMOS、TEOS及其混合物之中選擇；及/或- 在生理學pH下帶正電的APTES；其中：- 中性矽烷與帶負電的矽烷之莫耳比率A係定義如下：0
Figure 107119836-A0202-12-0021-108
A
Figure 107119836-A0202-12-0021-109
6，較佳地0.5
Figure 107119836-A0202-12-0021-110
A
Figure 107119836-A0202-12-0021-111
2；- 帶正電的矽烷與帶負電的矽烷之莫耳比率B係定義如下：0
Figure 107119836-A0202-12-0021-112
B
Figure 107119836-A0202-12-0021-113
5，較佳地0.25
Figure 107119836-A0202-12-0021-114
B
Figure 107119836-A0202-12-0021-115
3；- 中性及帶正電的矽烷與帶負電的矽烷之莫耳比率C係定義如下0<C
Figure 107119836-A0202-12-0021-116
8，較佳地1
Figure 107119836-A0202-12-0021-117
C
Figure 107119836-A0202-12-0021-118
4。
根據特定實施例，根據本揭示內容之方法包含將在生理學pH下帶負電的APTES-DOTAGA與以下者混合：- 在生理學pH下為中性的至少一種烷氧基矽烷，該烷氧基矽烷係自TMOS、TEOS及其混合物之中選擇；及/或 - 在生理學pH下帶正電的APTES；其中：- 中性矽烷與帶負電的矽烷之莫耳比率A係定義如下：0
Figure 107119836-A0202-12-0022-119
A
Figure 107119836-A0202-12-0022-120
6，較佳地0.5
Figure 107119836-A0202-12-0022-121
A
Figure 107119836-A0202-12-0022-122
2；- 帶正電的矽烷與帶負電的矽烷之莫耳比率B係定義如下：0
Figure 107119836-A0202-12-0022-123
B
Figure 107119836-A0202-12-0022-124
5，較佳地0.25
Figure 107119836-A0202-12-0022-125
B
Figure 107119836-A0202-12-0022-126
3；- 中性及帶正電的矽烷與帶負電的矽烷之莫耳比率C係定義如下0<C
Figure 107119836-A0202-12-0022-127
8，較佳地1
Figure 107119836-A0202-12-0022-128
C
Figure 107119836-A0202-12-0022-129
4。
官能化劑
如藉由該方法獲得的奈米粒子可有利地用特定有機分子官能化，例如用於治療或成像中之特定醫學應用。
因此，在該方法之特定實施例中，混合步驟可用包含至少一種官能化劑之至少一種矽烷來執行。
如本文所使用，術語「官能化劑」係指經由共價共軛連接至矽烷的有機分子以達所獲得奈米粒子之特定官能化。此種官能化劑包括而不限於螢光團、藥物、有機聚合物或靶向配位體。
因此，在該方法之特定實施例中，混合步驟可用包含至少一種螢光團之至少一種矽烷來執行。較佳地，包含螢光團之矽烷與中性矽烷之莫耳比率D係定義如下：0.001
Figure 107119836-A0202-12-0022-130
D
Figure 107119836-A0202-12-0023-131
0.2。
包含螢光團之此種矽烷可藉由具有反應性部分之螢光化合物與二氧化矽前驅物之共價共軛以獲得螢光二氧化矽前驅物且隨後使螢光二氧化矽前驅物與矽烷反應來獲得，該矽烷諸如四烷氧基矽烷，最優為包含至少一種螢光團之矽烷。可使用的螢光化合物包括而不限於Cy5、Cy5.5、Cy7、螢光異硫氰酸鹽(fluorescein isothiocyanate；FITC)、四甲基玫瑰紅異硫氰酸鹽、X-玫瑰紅、Alexa、bodipy螢光染料、CW800及靛氰綠(indocyanine green；ICG)。
根據另一實施例，混合步驟包含至少一種包含至少一個藥物部分之矽烷。較佳地，包含藥物之矽烷與中性矽烷之莫耳比率E係定義如下：0.1
Figure 107119836-A0202-12-0023-132
E
Figure 107119836-A0202-12-0023-133
5。根據特定實施例，奈米粒子包含相較於奈米粒子之總重量在0.5重量%與50重量%之間的藥物部分，例如，在2重量%與10重量%之間的藥物部分。
包含藥物部分之此種矽烷亦可藉由首先例如如文獻所述製備用於抗體-藥物-共軛物之連接基-藥物部分，且隨後藉由連接基-藥物部分共價共軛至至少一種矽烷以形成包含至少一個藥物部分之該矽烷來獲得。連接基之實例包括可分裂的連接基，諸如對胺基苄基氧基羰基(aminobenzyloxycarbonyl；PABC)基團。
可用於製備含有藥物部分之矽烷的藥物之實例包括而不限於小分子藥物及例如化療藥物，諸如烷基化劑、蒽環類、紫杉烷、HDAC抑制劑、拓樸異構酶I或II之抑制劑、激酶抑制劑、核苷酸類似物及前驅物類似物。可用於製備含有藥物部分之矽烷的藥物之特定實例包括而不限於放線菌素、全反式微甲酸(acide rétinoique all-trans)、阿紮胞苷(azacitidine)、硫唑嘌呤(azathioprine)、博來黴素(bléomycine)、硼替佐米(bortezomib)、卡鉑帝(carboplatine)、卡培他濱(capecitabine)、順鉑(cisplatine)、瘤克寧(chlorambucil)、環磷酸醯胺(cyclophosphamide)、阿糖胞苷(cytarabine)、柔紅黴素(daunorubicine)、多西他賽(docetaxel,)、去氧氟尿苷(doxifluridine)、阿黴素(doxorubicine)、表柔比星(epirubicine)、埃博黴素(epothilone)、依託泊苷(etoposide)、氟尿嘧啶(fluorouracil)、吉西他濱(gemcitabine)、羥基脲I(hydroxyurea I)、達柔比星(darubicine)、伊馬替尼(imatinib)、抗癌妥(irinotecane)、二氯甲二乙胺(mechlorethamine)、巰基嘌呤(mercaptopurine)、胺甲喋呤(methotrexate)、米托蒽醌(mitoxantrone)、奧沙利鉑(oxaliplatine)、紫杉醇、愛寧達(pemetrexed)、替尼泊甙(teniposide)、巰鳥嘌呤(tioguanine)、托普樂肯(topotecan)、戊柔比星(valrubicin)、威羅菲尼(vemurafenib)、長春鹼(vinblastine)、長春新鹼(vincristine)、長春地辛(vindesine)、來那度胺(lenalidomide)、依魯替尼(ibrutinib)、阿比特龍(abiratérone)、厄洛替尼(erlotinib)、依維 莫司(everolimus)、尼羅替尼(nilotinib)、舒尼替尼(sunitinib)、索拉非尼(sorafénib)、戈舍瑞林(goserelin)、奈達鉑(nedaplatine)、洛鉑(laboplatine)、七鉑(heptaplatine)、及其混合物。
根據另一實施例，混合步驟包含至少一種包含至少一個靶向配位體之矽烷。
如本文所使用，靶向配位體為連接至矽烷的分子，其貢獻於將奈米粒子活體內靶向至特定細胞組分。此種配位體可活體內靶向特定器官、組織或細胞類型，例如用於特定醫學或診斷應用。
此種靶向配位體可例如為肽、蛋白質、糖(例如凝集素)、生物聚合物、合成聚合物、抗原、抗體、適配體及奈米抗體。靶向配位體之實例包括而不限於Herceptin(曲妥珠單抗)、Rituxan(利妥昔單抗)、CD19抗體、哌加他尼(pepaptanib)、A10適配體、cRGD肽、ATWLPPR肽、VAP、Lyp-1、運鐵蛋白、LFRH、葉酸、半乳糖、或ASGPR靶向配位體、生物素、甘露糖。
根據另一實施例，混合步驟包含至少一種包含至少一種有機聚合物之矽烷。
此種有機聚合物可例如為聚乙二醇(polyethyleneglycol；PEG)、聚乳酸酯、聚乳酸、糖、脂質、麩胺酸(polyglumatic acid；PGA)、聚乙醇酸、聚(乳酸共聚乙醇酸)(poly(lactic-co-glycolic acid)；PLGA)、聚乙酸乙烯酯(polyvinyl acetate；PVA)及其組合。
已證實，與先前技術方法相對，當前方法賦能生產超小及穩定的奈米粒子而無需使用穩定有機聚合物。因此，在一個特定實施例中，本揭示內容之方法不包括接枝至矽烷之任何有機聚合物。
二氧化矽奈米粒子
本發明亦關於如藉由如上文所述的方法獲得的二氧化矽奈米粒子。
典型地，藉由該方法獲得的二氧化矽奈米粒子有利地具有在0.5nm與15nm之間、例如在1nm與10nm之間、或在1nm與5nm之間、或在2nm與7nm之間的平均流體動力學直徑。熟練技藝人士將能夠根據本揭示內容之教示調適如該方法中定義的特定比率A、B及C以獲得二氧化矽奈米粒子之所要的尺寸。
如本文所使用，術語「平均流體動力學直徑」意欲指粒子之流體動力學直徑之調和平均數。用於量測此參數的 方法係藉由光子相關圖譜法，該方法亦描述在標準ISO 13321：1996中。
如藉由該方法獲得的二氧化矽奈米粒子可進一步包含共價連接的螢光化合物、螯合劑(具有或不具有金屬)、藥物部分、靶向配位體、或有機聚合物。在特定實施例中，如藉由該方法獲得的此種二氧化矽奈米粒子具有作為藉由螯合劑螯合的金屬離子的Eu、Cu、Gd、Tb、Ho、Bi、或其混合物。在特定實施例中，如藉由該方法獲得的此種二氧化矽奈米粒子具有作為藉由螯合劑螯合的金屬離子的Gd。在特定實施例中，如藉由該方法獲得的此種二氧化矽奈米粒子具有作為藉由螯合劑螯合的金屬離子的Bi、Hf、或其混合物。在特定實施例中，如藉由該方法獲得的此種二氧化矽奈米粒子具有作為藉由螯合劑螯合的金屬離子的Lu、Y、Cu、Zr、In、Ga、或其混合物。在特定實施例中，如藉由該方法獲得的此種二氧化矽奈米粒子具有作為藉由螯合劑螯合的金屬離子的稀土金屬離子。
在特定實施例中，如藉由該方法獲得的奈米粒子不包含結晶核心，如可例如在具有核心-殼層結構之奈米粒子中所發現的。例如，如藉由當前方法獲得的奈米粒子不包含金屬、氧化物、硫化物、氟化物或碳化物之結晶核心。
在本發明一個實施例中，奈米粒子不包含金屬核心， 諸如Gd氧化物核心，無論是否結晶。根據一實施例，二氧化矽奈米粒子不包含聚乙二醇(PEG)殼層。
本揭示內容亦關於具有在0.5nm與15nm之間的平均流體動力學直徑之二氧化矽奈米粒子，其包含用螯合劑接枝的聚有機矽氧烷基質，該等螯合劑不含金屬離子且係以至少0.1μmol/mg奈米粒子，較佳地在0.5μmol/mg與2μmol/mg之間的含量存在。例如，在一個特定實施例中，螯合劑為DOTAGA且螯合劑之含量包含在0.5與2之間。
不含金屬離子的螯合劑之含量可藉由HPLC測定，或藉由例如直接用銪或用釓並與二甲酚橙組合進行滴定來測定。
[二氧化矽奈米粒子之用途]
根據本揭示內容之奈米粒子可較佳地作為治療診斷劑用於治療或診斷方法中。
例如，奈米粒子可用作治療劑，諸如用於放射療法或中子療法之敏化劑或放射源、用於光動力療法(photodynamic therapy；PDT)之藥劑、或用於治療分子(諸如化療劑)之遞送劑。
奈米粒子亦可有利地用作多模態成像劑，其可充當磁 共振造影(MRI)中、或利用單光子發射電腦斷層掃描攝影術(SPECT)或正電子發射斷層攝影術(PET)之閃爍圖術中、或藉由螢光的光學成像中、或X射線電腦斷層掃描攝影術(X-ray CT)中或組合彼等技術之至少兩者的多模態成像中的對比劑。
具有游離螯合劑的奈米粒子可進一步用作身體內毒性金屬之螯合劑，例如Hg、Pb、Al、Cd或Cr之螯合劑。
具有游離螯合劑之奈米粒子可進一步用於調節金屬體內環境恆定，尤其用於調節內源性金屬，如Fe、Cu、Zn、或Mn，或調節外源性金屬，如Hg、Pb、Al、Cd或Cr。
本揭示內容因此關於一種醫藥組合物，其包含如藉由上文所定義方法獲得的治療有效量之二氧化矽奈米粒子與醫藥學上可接受的媒劑的組合。
本揭示內容進一步關於一種在人類或動物中成像之方法，其包含以下步驟：(i)投與如藉由本揭示內容獲得的奈米粒子以作為T1 MRI對比劑；(ii)使用適當的MRI序列捕獲影像。
本揭示內容進一步關於一種藉由放射療法治療有需要 之患者的方法，其包含以下步驟：(i)投與如藉由本揭示內容獲得的奈米粒子以作為用於放射療法之敏化劑；(ii)照射該患者進行放射療法。
對於此種特定應用，本揭示內容之奈米粒子較佳地包括Gd作為螯合至螯合劑之輻射敏化劑。
[實例]
材料及方法
材料
鹽酸(HCl，37%)係自VWR Chemicals BDH Prolabo(法國)購買。氫氧化鈉團塊(NaOH，
Figure 107119836-A0202-12-0030-134
98%)係自Sigma-Aldrich Chemicals(法國)購買。製備在2M至10-4M的不同濃度下的鹽酸及氫氧化鈉於水中之溶液以調整溶液之pH。二氯化銪六水合物(EuCl3．6H2O，99.9%)、氯化鑥六水合物(LuCl3．6H2O，99.9%)、氯化鋱六水合物(TbCl3．6H2O，99.9%)、氯化鈥六水合物(HoCl3．6H2O，99.9%)、正矽酸四乙酯(Si(OC2H5)4，TEOS，98%)、胺基丙基三乙氧基矽烷(H2N(CH2)3-Si(OC2H5)3，APTES，99%)、用於矽烷前驅物之合成的無水DMSO、用於NMR實驗之氧化氘D2O、用於製備pH 5之緩衝液的冰乙酸、Eriochrome®黑T(Eriochrome® Black T；EBT)及用於錯合計量法之pH 10的氨緩衝溶液皆係自Sigma-Aldrich Chemicals(法國)購 買。N-(三甲氧基矽烷丙基)乙二胺三乙酸三鈉鹽((CH3O)3Si-(CH2)3N(CH2COONa)(CH2)2N(CH2COONa)2，TANED，45%於水中)及羧基乙基矽烷三醇鈉鹽((HO)3Si-(CH2)2COONa，CEST，25%於水中)係自ABCR GmbH(德國)購買。1,4,7,10-四氮雜環十二烷-1-戊二酐-4,7,10-三乙酸(DOTAGA酐)係藉由Chematech(法國)提供。氯化釓六水合物(GdCl3．6H2O，99.999%)係自Metall Rare Earth Limited(中國)購買。Milli-Q水(ρ>18MΩ)係用作水源。Vivaspin®濃縮器及Vivaflow® 200卡盒(MWCO=3kDa or 5kDa)係自Sartorius Stedim Biotech(法國)購買。
方法
動態光散射(dynamic light scattering；DLS)及ζ電位
藉由利用來自Malvern Instruments之Zetasizer Nano-S(633nm He-Ne雷射器)的DLS量測奈米粒子之流體動力學直徑分佈。利用單次使用的PMMA光析管(Carl Roth GmbH，德國)對0.5-1ml之溶液進行量測。藉由裝置最佳化衰減器及位置。為測定ζ電位，將冷凍乾燥粉末再分散於水中以達成100mg/ml溶液且在含有5mM NaCl之水溶液中稀釋至10-18mg/ml且剛好在每一量測之前調整至所要的pH。ζ電位量測值係在20℃下於DTS 1061折疊毛細管單元(Malvern Instruments Ltd，美國)內記錄。ζ電位(ζ)係基於斯莫盧霍夫斯基方程式ν=(εε0ζ/η)ζ由電泳移動率自動地計算，其中ν為所量測的電泳移動率，η為黏度，ε 為電解溶液之介電常數，ε0
Figure 107119836-A0202-12-0032-135
8.854 x 10-12C2N-1m-2為真空介電係數。將冷凍乾燥粉末再分散於水中以達成100mg/ml溶液且在含有5mM NaCl之水溶液中稀釋至10mg/ml且剛好在每一量測之前調整至所要的pH。
層析法
方法1：奈米粒子之純度之測定及奈米粒子上之游離DOTAGA之定量
梯度HPLC分析係藉由使用Shimadzu Prominence系列UFLC系統進行，該系統具有CBM-20A控制器匯流排模組、LC-20AD泵、CTO-20A管柱烘箱、及SPD-20A UV-vis偵測器。偵測波長係設定在295nm，其中對於表徵空奈米粒子而言，僅有機螯合劑可高度吸收，或設定在700nm，其中對於表徵併入銅之奈米粒子而言，DOTAGA之銅錯合物特定地吸收。當表徵併入釓之奈米粒子時，添加FR-20A螢光偵測器(λex=274nm，λem=312nm)來偵測來自Gd錯合物之螢光訊號。管柱溫度係維持在30℃下。梯度LC溶析係利用兩個移動相來進行：(A)Milli-Q水/TFA 99.9：0.1 v/v及(B)乙腈(CH3CN)/TFA 99.9：0.1 v/v。每一次，將20μL之量的樣本裝載至注入閥且以1mL/min之流動速率注入至Jupiter C4管柱(150mm×4.60mm，5μm，300Å，Phenomenex)中。隨後，溶析係程式化如下：7min內1%之溶劑B以溶析反應物及片段，隨後15min內自1%至90%之梯度以溶析奈米粒子。歷經7min維持B之濃度。隨後， 溶劑B之濃度歷經1min減少至1%且在8min期間維持以使系統再平衡以用於新的分析。在每一樣本之量測之前，在相同條件下藉由注入Milli-Q水來獲得基線。純度係藉由將粒子之峰部下的面積除以粒子及反應物之峰部下的總面積來計算。此方法亦係用於使用Cu2+作為探針來定量奈米粒子上游離DOTAGA之含量。將過量之CuSO4添加至螯合二氧化矽奈米粒子之超小雜合物之溶液(ultrasmall hybrid chelating silica nanoparticle；UCHSNP)中，其pH已調整為小於或等於3。錯合可能或許減少溶液之pH。因此，pH應經再調整以在3下穩定，之後在80℃下培養至少2h。700nm的可見光偵測器係用於特定地偵測銅錯合物之吸收，該等銅錯合物為游離的或接枝在奈米粒子上。藉由在不同濃度(對Cu2+而言4mM-32mM，及對DOTAGA(Cu2+)而言0.1mM-15mM)下比較峰面積與其校準曲線來測定Cu2+及DOTAGA(Cu2+)之濃度。游離的Cu2+及DOTAGA(Cu2+)之總濃度可相加來與引入量進行驗證。游離DOTAGA之含量(mol/g)可由其莫耳濃度(mol/L)及所分析樣本之質量濃度(mg/L)計算。
方法2：在APTES-DOTAGA自DOTAGA酐合成之後對APTES-DOTAGA之鑑別
藉由使用與方法1所述相同的系統來進行等度HPLC分析。在此種情況下，螢光偵測器(λex=274nm，λem=312nm)為主要偵測器以偵測來自Gd錯合物之螢光訊號。將移動 相以100%(A)及0%(B)固定以減慢Gd3+、APTES-DOTAGA(Gd3+)及DOTAGA(Gd3+)之溶析以及清楚地將其分離。以與方法1相同之方式引入樣本。將流量維持10min以溶析所有預期峰。之後，溶劑B逐漸地升高至100%以洗滌樣本中或來自管柱之溶劑中的累積雜質。隨後，溶劑B之濃度歷經1min減少至0%且在15min期間維持以使系統再平衡以用於新的分析。在每一樣本之量測之前，以與在先方法相同之方式獲得基線。將合成之產物溶於水中且與GdCl3混合以達成在pH約6下分別對合成混合物及Gd3+而言5g/l及10mM之最終濃度，且在37℃下培養15h持續時間以允許錯合。在分析之後，收集溶析物以供藉由質譜法(mass spectrometry；MS)研究。將溶析溶液冷凍乾燥以移除溶劑及過量的TFA。將冷凍乾燥粉末以高於冷凍乾燥之前兩倍的濃度再分散於水中以確保樣本對於MS分析而言濃縮充分。pH 6之GdCl3 10mM及pH 5的DOTAGA(Gd3+)mM加GdCl3 1mM之混合物的樣本在相同條件下用HPLC分析以鑑別歷經滯留時間(tR)的Gd3+及DOTAGA(Gd3+)之峰。
方法3：在矽烷前驅物APTES-DOTAGA自DOTAGA酐合成之後對矽烷前驅物APTES-DOTAGA之量之定量
藉由使用與方法2相同的系統及對螢光偵測器之設定來進行等度HPLC分析。以相同方式引入樣本。然而，使用BDS-HYPERSIL-C18管柱(250mm×4.60mm，5μm， ThermoFisher Scientific)替代C4管柱來增加對小分子之分離容量。此外，將移動相固定在99%(A)及1%(B)替代100%之(A)以避免峰之tR之輕微波動。後者係歸因於「疏水性崩潰」，因為溶劑足夠疏水以濕潤靜止相之表面。將流量維持25min以溶析所有預期峰。之後，將溶劑B逐漸地升高至100%以用於如上文的相同目的。隨後，將系統在新的分析之前再平衡。在每一樣本之量測之前，以相同之方式獲得基線。合成之產物係溶於pH 5的乙酸鹽緩衝液中。向此溶液添加pH 4的GdCl3 50mM之溶液來分別對合成混合物及Gd3+達成57.8mg/L及0.2mM之最終濃度。此溶液係在80℃下培養48h之持續時間以允許完成錯合。最終溶液為透明的，但進行經由0.2μm膜之過濾來確保大的灰塵粒子不會阻擋HPLC管柱。pH 4之GdCl3 1mM及pH 5.7的DOTAGA(Gd3+)0.05mM之混合物的樣本在相同條件下分析以鑑別歷經tR的Gd3+及DOTAGA(Gd3+)之峰。DOTAGA(Gd3+)之濃度係藉由在不同濃度(0.01mM-0.15mM)下比較其峰面積與其校準曲線來測定。APTES-DOTAGA(Gd3+)之濃度係間接地藉由自藉由使用Eu磷光之滴定測定的APTES-DOTAGA及DOTAGA之總濃度減去DOTAGA(Gd3+)之濃度來測定。未反應的DOTAGA及APTES-DOTAGA之含量(mol/g)可由其莫耳濃度(mol/L)及所分析合成混合物之質量濃度(mg/L)計算。
質譜法(MS)
MS用於在HPLC層析譜中鑑別APTES-DOTAGA(Gd3+)及DOTAGA(Gd3+)之峰。質譜係在飛行時間質譜儀micrOTOF-Q II(Bruker Daltonics，德國)上以負模式記錄。
1 H核磁共振(nuclear magnetic resonance；NMR)及擴散排序譜(diffusion ordered spectroscopy；DOSY)
所有實驗係在298K無自旋情況下於配備5mm BBFO及BBI探針之Bruker Avance III 500MHz分光計上執行。冷凍乾燥二氧化矽奈米粒子係分散在D2O中。
對於1H NMR擴散實驗而言，使用標準ledbpgp2s序列。擴散延遲d20係設定至100ms，且雙極脈衝p30經調整來獲得全滿強度下95%之衰減，典型地在2ms至4ms範圍內。在擴散維度上獲取32或64個點。將利用標準dosy2d命令、DynamicCenter及NMRnotebook程式獲得的處理資料進行比較，用NMRnotebook獲得最佳結果，其提供良好的資料擬合，甚至當在相同化學位移下混合若干訊號時亦如此。
所報告的流體動力學直徑(hydrodynamic diameter；DH)係簡單地由擴散係數(D)利用熟知的斯托克斯-愛因斯坦公式：DH=kBT/3πηD導出，其中kB為波茲曼常數，T為絕對溫度，且η為溶劑之黏度(對D2O而言，在298K下為1.13cP)。
固態 29 Si NMR光譜學
固態29Si NMR實驗係在具有MAS 4mm雙倍H/X探針之Bruker Avance 500WB上，在10kHz之MAS速率、在99.34MHz之光譜頻率下執行。高功率去耦MAS脈衝序列係用於得到定量光譜，其中脈衝寬度為4μs(相應於90°脈衝)，在1200次獲取掃描期間的重複延遲為240s。光譜分析係藉由DMFit軟體執行。訊號可反卷積成對應於六個不同矽環境的六個貢獻值。存在兩個主要類型：CSi(OSi)nO3-n及Si(OSi)mO4-m，通常分別標記為Tn(三級及Qm(四級)。Tn物質係由有機三烷氧基矽烷形成，諸如CEST、APTES、TANED或APTES-DOTAGA且Qm係由諸如TEOS之四烷氧基矽烷形成。
藉由Eu磷光之滴定
藉由Eu磷光之滴定為主要方法，用以精確地定量APTES-DOTAGA之合成混合物中及冷凍乾燥最終粉末中的螯合劑之含量(mol/g)。將合成混合物或冷凍乾燥粉末再分散於水中。在pH 5的乙酸鹽緩衝液中製備具有某一量之此溶液及增加量之EuCl3的一系列樣本。在量測之前，在80℃下將該些系列之樣本培養48h。磷光量測係使用Varian Cary Eclipse螢光分光光度計在解析時間模式中進行。對於單一讀取量測而言，參數係設置如下：激發波長在395nm，發射波長在594nm及616nm，其為Eu3+離子 之特性激發及發射，激發裂縫10nm，發射裂縫10nm，延遲時間0.2ms，總衰變時間0.02s，平均化時間5s，閘時間5ms，閃爍數為1，激發過濾器335-620nm，發射過濾器550-1100nm，高壓。對於掃描發射光譜而言，使用具有解析度1nm之相似參數，只不過平均化時間縮減為1s以加速量測。當發光強度不再隨Eu3+之添加量線性地增加時，測定端點。
弛緩率量測
在37℃下，在1.4T(60MHz)下，在Bruker® minispec mq60NMR分析器(Brucker，美國)上執行弛緩率量測。樣本係在特定Gd3+濃度(mM)下量測，由ICP-OES或元素分析量測。量測縱向弛緩時間T1及橫向弛緩時間T2(s)。隨後，弛緩率ri(s-1.mM-1)(i=1,2)係根據下式獲得：
Figure 107119836-A0202-12-0038-4
元素分析
藉由FILAB SAS.，Dijon，法國進行元素分析且賦能對粉末樣本之Gd、C、N及Si含量之測定。
感應耦合電漿-光發射光譜術(Inductively coupled plasma-optical emission spectrometry；ICP-OES)
對奈米粒子中金屬之準確濃度的測定係藉由感應耦合電漿-光發射光譜術(ICP-OES)(具有Varian 710-ES分光計，美國)來執行。DLS量測之後的溶液再用於此量測。在80℃下，在4-5mL之王水(67%的HNO3與37%的HCl混合(1/2；v/v))中消化所估計濃度下之粒子於金屬(Gd、Tb、Ho或Bi)中之10ppm溶液達3h。隨後，將混合物用HNO35%(v/v)以精確地50mL稀釋至所估計的100、200及400ppb。在分析之前，將該些溶液經由0.2μm膜過濾。校準樣本係由用HNO3 5%(w/w)連續稀釋的1000ppm Gd、Tb、Ho及Bi標準溶液製備。針對量測的選定波長對Gd樣本為342.246、335.048、336.224nm；對Tb樣本為350.914、367.636、387.417nm；對Ho樣本為345.600、339.895、341.644nm及對Bi樣本為223.061nm。結果為在不同的選定波長下在推定的100、200及400ppb之三個樣本之平均值。
UV-可見光光譜學
UV-可見光光譜係用Varian Cary 50分光光度計(美國)記錄。UCHSNP-7及UCHSNP-7@Ho之溶液係在5g/L下量測；UCHSNP-7、UCHSNP-7@M(M：Gd、Tb、Ho、Bi)之溶液係在0.06g/L下量測
紅外光譜學(Infrared spectroscopy；IR)
紅外光譜係用IRAffnity-1 Shimadzu執行。透射率模 式係與Happ-Genzel切趾法功能、30次掃描、在400cm-1與4000cm-1之間的範圍內的4cm-1解析度一起使用。溶液之pH在冷凍乾燥之前調整至2。對所獲得的粉末記錄光譜。
[實例1：使用TANED、CEST及TEOS在水中合成超小二氧化矽奈米粒子]
將TANED(8.22ml,8mmol)及CEST(5.57ml,8mmol)添加於水(63ml)中且在室溫下攪拌15分鐘。隨後，將TEOS(5.57ml,16mmol)添加至上述溶液。將其在室溫下攪拌隔夜以使溶液變成均質的。之後，藉由添加幾滴處於適當濃度的HCl將溶液之pH自10.5減少至7.4。將溶液保持攪拌24小時之持續時間，之後自pH 7.4再調整至pH 4.5。將溶液攪拌6小時之持續時間，之後放入烘箱中且在80℃下保持靜止一晚。將少量溶液經由0.2μm膜過濾且藉由動態光散射(DLS)及高效液相層析法(High Performance Liquid Chromatography；HPLC)分析。隨後，藉由經由VivaspinTM(MWCO=3kDa)過濾來純化完整溶液，其10-4M HCl溶液作為溶劑。將溶液引入20mL Vivaspin管中，且離心直至剩餘一半體積(純化速率21=2)。將此步驟藉由用10-3M的鹽酸溶液填充管並再次離心來重複若干次，直至由HPLC層析譜計算的純度達到
Figure 107119836-A0202-12-0040-136
90%(通常，28=256純化速率)。隨後，將溶液經由0.2μm膜過濾以移除最大的雜質。最終，將溶液冷凍乾燥用於長期儲存。
就流體動力學尺寸、ζ電位及組合物而言表徵所獲得的粒子。圖2-A顯示藉由DLS量測的最終粒子之尺寸分佈。平均尺寸為大約4.6nm，其中標準偏差為1.1nm。圖2-B顯示藉由整合在相同儀器中的雷射都卜勒流速學量測的隨pH變化的ζ電位。量測係在pH8處停止，此歸因於聚矽氧烷在鹼性pH下減少的穩定性。最終粒子如所預期具有負表面電荷。pH 7的ζ電位為-25.8mV。
根據方法1執行HPLC分析。基於在295nm處之吸收的最終奈米粒子之純度為92.4%。
圖3顯示CEST、TANED及最終奈米粒子在D2O中之1H核磁共振(NMR)光譜。此結果顯示CEST及TANED併入最終奈米粒子中。圖4顯示藉由對在D2O中的最終奈米粒子之樣本應用擴散排序譜(DOSY)技術而產生的2D NMR光譜。此技術允許吾等量測與每一1H訊號關聯的擴散係數(DH)。在圖4中，x軸顯示化學位移(ppm)，其中發現了先前在1D 1H光譜中觀察到的所有1H峰。y軸顯示DH之值。隨後，由擴散係數，吾等可計算得到該些1H峰之物質的流體動力學直徑。存在3個DH值，其可指派至來自奈米粒子之一種及兩種類型之游離水解矽烷。因此，可由光譜得出一些結論。首先，兩個預期的官能基已良好地接枝在粒子上。其次，純化粒子具有穩定的接枝官能， 其帶有極少的游離水解矽烷。最終，粒子之流體動力學直徑為大致5.0nm，其係根據由DLS量測的結果。
藉由將僅來自CEST之1H峰的面積與來自CEST及TANED兩者的所有1H峰之總面積比較，可計算樣本中CEST之量與TANED之量之間的比率。在此實例中，結果為CEST/TANED=1.30。表1及圖5顯示由固態29Si NMR光譜學產生。首先，45%之Si(T2及T3)係來自有機矽烷，亦即，TANED及CEST。藉由將此值與自比較1H峰之面積獲得的結果比較，吾等可計算25.45%係來自CEST且19.55%係來自TANED。隨後，剩餘55%之Si(Q2、Q3及Q4)係來自TEOS。
根據上述結果，吾等可建立所有組合物之莫耳比率如下，TANED：CEST：TEOS=1.00：1.30：2.81。此外，吾等亦可由此比率計算TANED之含量為大約0.784μmol/mg。
TANED之含量亦可藉由用EBT(或NET)作為顏色指示劑的比色法來定量。將冷凍乾燥粉末再分散於水中以達成48mg/ml溶液(A)。用5mM CaCl2之溶液滴定100μl 之A、10μl作為顏色指示劑之EBT及10ml之氨緩衝液之溶液。在此實例中，結果為大約0.855μmol/mg。
[實例2：使用巨環-螯合劑-官能化矽烷(APTES-DOTAGA)及胺基矽烷(APTES)在水中合成螯合二氧化矽奈米粒子之超小雜合物(UCHSNP)]
在此實例中，合成係分成兩個步驟。首先，合成商業上仍不可生產的矽烷前驅物APTES-DOTAGA。隨後，根據實例1中提出的方法合成螯合用巨環螯合劑DOTAGA官能化的二氧化矽奈米粒子之超小雜合物(UCHSNP)。
步驟1：巨環-螯合劑-官能化矽烷(APTES-DOTAGA)之合成
APTES-DOTAGA可由2種不同方法合成：經由APTES與丁基受HBTU(2-(1H-苯并三唑-1-基)-1,1,3,3-四甲基脲陽離子六氟磷酸鹽)保護的DOTAGA上之活化羧基之間的反應，步驟1a，或經由APTES與DOTAGA酐之間的反應，步驟1b。
步驟1a：由丁基受保護之DOTAGA合成巨環-螯合劑-官能化矽烷(APTES-DOTAGA)
APTES-DOTAGA可由第三丁基受保護之DOTAGA合成，該第三丁基受保護之DOTAGA係經由肽偶合而偶合至APTES。此繼之以中間物之去保護以得到最終化合物。反 應方案在圖6中呈現。
將1g之(t-Bu)4DOTAGA、0.6g之HBTU及0.2g之HOBt稱重至100ml圓底燒瓶中，向其添加28mL之DCM(dichloromethane；二氯甲烷)，繼之以添加1.3ml之DIPEA。將混合物攪拌15min，之後，將0.3g之APTES注入至反應混合物中。將溶液在室溫下保持攪拌隔夜。
將反應混合物使用DCM稀釋三倍至90ml，繼之以在分液漏斗中用80-90ml之棕檬酸溶液(pH 3)萃取反應溶液。將分離的有機相用80-90ml之5% w/v NaHCO3進一步萃取，最後繼之以用蒸餾水萃取。上述萃取賦能移除偶合試劑/未反應的APTES/外來水溶性組分。將分離的有機相經MgSO4(5g)乾燥5min且連續過濾以得到清透濾液。在30℃下使用ROTAVAPOR蒸發濾液以得到褐色黏性殘餘物(中間物)。使用HRMS驗證中間物形成。C44H85N5O12Si之m/z：計算值：926.5856，觀測值：926.5849(M+Na)+。
1H NMR(500MHz,CDCl3)δ 0.4-0.7(m,2H),0.7-0.8(m,1H),1.0(dd,J=9.0,6.7Hz,1H),1.1-1.2(m,9H),1.3-1.5(m,32H),1.5(p,J=7.8Hz,2H),1.7(d,1H),1.9-2.1(m,1H),2.1-2.3(m,1H),2.4-3.4(m,29H),3.5-3.7(m,1H),3.7-3.8(m,4H)。
13C NMR(126MHz,CDCl3)δ 7.5,7.8,18.3,20.4,23.5,25.9,26.8,27.8,27.8,27.9,27.9,27.9,28.2,28.3,29.7,33.0,38.6,42.1,47.6,49.8,58.4,63.6,80.8,82.3,171.1,173.2。
將上述殘餘物與20ml之濃HCl混合且攪拌40min，繼之以在35℃下使用旋轉蒸發器移除過量的算以得到固體殘餘物。殘基係進一步溶於約10ml之水中且經受循環蒸發以移除游離酸。將所獲得的濃縮物溶於10ml水中，且立即在氮中冷凍並冷凍乾燥以得到淺褐色粉末1.11g。C22H41N5O12Si之m/z：計算值：618.2413，獲得值：618.2425(M+Na)+。
1H NMR(500MHz，氧化氘)δ 0.5-0.8(m,2H),1.2-1.3(m,1H),1.4-1.6(m,1H),1.6-1.8(m,1H),1.8-2.2(m,1H),2.3-4.5(m,26H)。
步驟1b：由DOTAGA酐合成巨環-螯合劑-官能化矽烷(APTES-DOTAGA)
亦可由DOTAGA酐合成矽烷前驅物APTES-DOTAGA。反應方案在圖7中呈現。
在典型實例中，將9.375g(16.36mmol)之DOTAGA酐放入1L圓底燒瓶。隨後，快速地添加494mL之無水 DMSO及1.933ml(8.16mmol)之APTES。DOTAGA酐係過量使用以確保所有APTES將反應。此允許在下一步中對最終粒子之組合物之精確控制。將反應置於氬氣氛之下且加熱至75℃達15-20h之持續時間。產物係形成為白色沉澱物。產物係藉由將其轉移至5L之丙酮且在4℃下保持48h來完全沉澱。將沉澱物經由濾紙等級42過濾。大約2-3L的丙酮係用於洗滌沉澱物以移除DMSO。將剩餘丙酮藉由在37℃下蒸發隔夜來移除。
在純化之後，將沉澱物溶於水中且根據方法2藉由HPLC分析。藉由將合成混合物之層析譜與GdCl3及GdCl3及DOTAGA(Gd3+)之混合物的層析譜疊加，可鑑別峰。亦執行MS分析以便確認反應產物之結構。MS光譜在594、475、296.5及237 M/Z處顯示4個主峰，此與所建議產物之模擬光譜一致且指示單電荷離子及雙電荷離子之共同存在。
合成混合物中的APTES-DOTAGA之含量(mol/g)係間接地經由藉由比色法及藉由Eu的磷光滴定測定的總APTES-DOTAGA及未反應DOTAGA之含量及根據層析法之方法3測定的未反應DOTAGA之含量來測定。
對於比色法，將200μl之合成混合物以8.815mg/L及25μL之EBT(NET)添加至10mL的pH 10的氨緩衝液。 此溶液係用CaCl2 5mM滴定。端點體積為600μl，其得出總DOTAGA之含量為1.70μmol/mg。藉由使用此結果，在pH 5的乙酸鹽緩衝液中製備44.075mg/L的合成混合物及增加濃度之Eu3+(0μM-140μM)之一系列樣本以更精確地測定總DOTAGA之含量。在磷光量測之前，在80℃下將該些樣本培養48h。圖8-A顯示在40μM下DOTAGA(Eu3+)之發射光譜。發現在594nm及616nm處的兩個發射峰。圖8-B分別顯示在594nm(圓形)及616nm(正方形)下的滴定曲線。總DOTAGA之含量係測定為1.475μmol/mg。此結果為更精確的，因為比色法趨向於過高估計結果，此歸因於辨別顏色開始改變時的點之困難。
使用HPLC分析及校準曲線計算DOTAGA(Gd3+)之濃度。未反應DOTAGA之含量係自此結果推出。未反應的DOTAGA之計算含量為0.745μmol/mg。
根據上文結果，預期產物APTES-DOTAGA之含量可推斷為0.730μmol/mg。此暗示幾乎所有的APTES已與過量之DOTAGA反應形成APTES-DOTAGA且無APTES剩餘在混合物中。計算顯示反應之產率為99%且整個方法亦即反應及過濾之分離產率為79%。
紅外線(IR)光譜學亦用於表徵APTES-DOTAGA。將DOTAGA及APTES-DOTAGA之反應混合物溶於水中且調 整至pH 2以使羧基質子化。這使得C=O醯胺於1677cm-1處之峰與C=O羧基於1713cm-1處之峰區分開。在80℃下將2種溶液乾燥4天。利用乾粉獲取IR光譜。
圖8-C顯示DOTAGA粉末及APTES-DOTAGA反應混合物之IR光譜。一些重要的峰之指派顯示在下文表2中。1677.0cm-1處的峰之出現，及1712.7cm-1處的峰強度之減少為醯胺鍵之形成的指示。
步驟2：由APTES-DOTAGA合成UCHSNP
可使用兩個策略來由APTES-DOTAGA合成UCHSNP：a)APTES-DOTAGA矽烷可用直接從開始就用於合成 在表面上具有游離螯合劑之粒子(UCHSNP)，隨後該些UCHSNP將與Gd3+錯合以形成最終產物(UCHSNP@Gd-1)；或b)APTES-DOTAGA矽烷可與Gd3+錯合，之後為水解-縮合方法以產生具有錯合螯合物之最終粒子(UCHSNP@Gd-2)。
在圖9中概述了兩個策略。
步驟2a：由空的APTES-DOTAGA合成UCHSNP@Gd-1
將200ml之水添加至由步驟1a或步驟1b合成的產物，在任一情況下，該產物含有2.228mmol之APTES-DOTAGA。藉由添加具有適當濃度的NaOH溶液將溶液之pH自大約3調整至9。將溶液攪拌1-2h以溶解並釋放APTES-DOTAGA成單體形式。隨後，將TEOS(1015.4μL,4.457mmol)及APTES(526.7μL,2.228mmol)逐一添加至上述溶液。pH應在必要時返回9，因為APTES之添加稍微增加pH。添加水來分別達成APTES-DOTAGA、TEOS及APTES的在10mM、20mM及10mM下之最終濃度。在25℃下將反應混合物攪拌隔夜以使溶液變成均質的，從而暗示所有乙氧基矽烷得以水解。隨後，藉由添加幾滴處於適當濃度的HCl將pH自9減少至7。將溶液在25℃下保持攪拌2h，之後自pH 7再調整至pH 4.5。將溶液在25℃下再多攪拌1-2h之持續時間，之後在80℃下加熱且在 油浴中輕柔地攪拌隔夜(15-20h)。將少量溶液(1mL)經由0.2μm膜過濾且藉由DLS及HPLC(根據方法1)分析。對於HPLC分析，製備兩個類型之樣本。首先，將過濾的溶液快速地稀釋2倍以剛好在注入至HPLC系統之前具有5g/L之理論濃度。在295nm下跟隨到訊號，其為AGuIX粒子之典型吸收。其次，將200μL之過濾的溶液與5μL之CuSO4 506mM混合，此相較於溶液中螯合劑之理論濃度為過量之量。將此溶液在80℃下培養2h。驗證培養之後的pH且將其維持在3.23，其足夠低以避免Cu(OH)2形成。之後，將溶液快速地稀釋以剛好在注入至HPLC系統之前具有5g/L之理論濃度。在700nm下跟隨到訊號，其為銅及其DOTAGA錯合物之特定吸收峰。
藉由經由VivaspinTM(MWCO=3kDa)之超濾將溶液濃縮至10mL。再次，重複HPLC分析。將不具有銅及錯合之銅的2個樣本稀釋以剛好在注入至HPLC系統之前具有5g/L之理論濃度，以便與先前結果比較。
隨後，進一步利用超濾將溶液純化。若前驅物為與未反應的DOTAGA之混合物，則溶液之pH應藉由在純化之前添加HCl溶液來調整至2。此步驟將DOTAGA去質子化且將其自靜電連接至新形成粒子之表面上的胺基釋放。將溶液離心直至剩餘一半體積(純化速率21=2)。將此步驟藉由用10-4M的鹽酸(HCl)溶液(或在pH 2下進行過濾的情況 下，10-2M的HCl溶液)填充管並再次離心來重複若干次，直至由HPLC層析譜計算的純度達到
Figure 107119836-A0202-12-0051-137
90%(通常，210=1024純化速率)。隨後，將溶液經由0.2μm膜過濾以移除灰塵。最終，將溶液冷凍乾燥用於長期儲存。獲得706mg之冷凍乾燥粉末。
圖10顯示形成的UCHSNP-1之DH分佈。粒子具有大約4.6±1.6nm之DH。HPLC分析證實在純化之後，奈米粒子為純的且與DOTAGA良好接枝在表面上。後者藉由在700nm處之層析譜指示。
最終奈米粒子(UCHSNP-1)中DOTAGA之含量係藉由兩種方法來定量：1)用銅的HPLC分析(使用方法1)、及2)用Eu磷光之滴定。
對於第一方法，在pH 3下製備含有142.8g/L之UCHSNP-1及200mM之CuSO4的混合物且在80℃下培養2h。直接在注入至HPLC系統中之前在10-3M的HCl溶液中將溶液稀釋20倍。HPLC層析譜顯示併入金屬之奈米粒子及游離的銅錯合APTES-DOTAGA之存在。併入金屬之奈米粒子的Rt長於初始的空奈米粒子。此可藉由因錯合誘導的表面電荷或離子化狀態之改變來解釋。更重要地，奈米粒子峰之形狀顯示在錯合之後的均質分佈。所有銅物質之總濃度為10.03mM，此精確地等於理論上引入的量。 根據結果，吾等可得出樣本中DOTAGA之總濃度且推斷其含量為約0.72μmol/mg。
對於藉由Eu滴定，在pH 5的乙酸鹽緩衝液中製備44.08mg/L之UCHSNP-1及0μM至140μM之EuCl3的一系列樣本。在量測之前，在80℃下將該些樣本培養48h。圖11顯示在DOTAGA(Eu3+)錯合物之2個特定發射波長下的滴定曲線。結果為0.79μmol/mg。
UCHSNP@Lu-1
為評估UCHSNP-1之直徑，APTES-DOTAGA及APTES在其表面上之存在及比率，自空的UCHSNP-1及與抗磁性鑭系元素離子亦即Lu3+錯合的UCHSNP-1(UCHSNP@Lu-1)收集1H NMR及NMR DOSY光譜。
對於空的UCHSNP-1樣本，將冷凍乾燥粉末再分散於水中。將溶液之pH調整至7.4，之後添加水以具有在DOTAGA中127g/L或100mM之最終濃度。將溶液冷凍乾燥且在相同濃度下再分散於D2O中。隨後，將470-500μl之樣本添加至NMR管以供量測。
對於UCHSNP@Lu-1樣本，將冷凍乾燥粉末再分散於水中。使用由Eu滴定計算的DOTAGA之含量，緩慢地添加32.5μl的1.98M之LuCl3(莫耳比率DOTAGA：Lu=1：0.9) 溶液4次。在每一次之間，藉由在下一次添加之前添加具有適當濃度的NaOH溶液將pH小心地增加至4-5。在4次添加之後，pH處於5。將此溶液在80℃下培養48h。最終，將pH增加至7.4且添加水以具有在DOTAGA中127g/L或100mM之最終濃度。將溶液冷凍乾燥且在相同濃度下再分散於D2O中。隨後，將470-500μl之樣本添加至NMR管以供量測。
圖12顯示UCHSNP-1之NMR光譜。首先，圖12-A顯示D2O中之2D NMR DOSY光譜。大多數質子似乎具有54.4μm2/s之相同擴散係數(D)。結果指示預期的官能基亦即APTES-DOTAGA及APTES良好地接枝在相同粒子上。其次，存在一些游離的水解矽烷，其具有快得多的係數(194.5μm2/s)。用UCHSNP-1@Lu發現類似的光譜(圖12-C)。主要產物仍具有大約56μm2/s之D。其與一些其他較小的具有更快D(410及214μm2/s)之物質共存。主要粒子之流體動力學直徑可由愛因斯坦方程式計算，對UCHSNP-1及UCHSNP-1@Lu分別為大約7.0nm及6.8nm。溶液之黏度係未知的且可顯著地高於在此濃度下的純D2O。因此，所計算的DH可為被稍微過高估計。在任何情況下，其保持小於10nm且係根據由DLS量測之結果。圖12-B及D顯示UCHSNP-1及UCHSNP-1@Lu之1D 1H光譜之峰積分。大多數1H峰係彼此疊加，此歸因於DOTAGA之複合1H光譜，此可在別處得到確認。幸好，DOTAGA 在小於1ppm之區域處不具有1H峰，在該區域中，可發現在位置處的碳之1H之峰，其最接近於APTES及APTES-DOTAGA之Si(圖12-E)。因此，藉由將來自彼等碳1之1H峰之面積與所有1H峰之總面積比較，吾等可得出樣本中APTES之量相對APTES-DOTAGA之量之間的比率。在這兩個樣本中，結果分別為1.35及1.12。
UCHSNP@Gd-1
為賦能UCHSNP-1以具有MRI對比度增強及輻射敏化性質，將Gd3+錯合在粒子上。在典型實例中，將333mg UCHSNP-1之冷凍乾燥粉末再分散於水中。緩慢地添加36μL的2.188M之GdCl3(莫耳比率DOTAGA：Gd=1：0.9)溶液3次。在每一次之間，藉由在下一次添加之前添加具有適當濃度的NaOH溶液將pH小心地增加至4-5。在3次添加之後，pH處於5。將此溶液在80℃下培養48h。在培養之後，維持pH。利用5個純化速率將此溶液藉由切向過濾(MWCO=3kDa)純化以去除任何游離的Gd3+。溶液之純度係藉由HPLC評估(方法1)。將純化溶液(約1ml)用10-2M的HCl溶液稀釋52倍以剛好在注入至HPLC系統之前具有在DOTAGA中5g/L之理論濃度。
併入Gd3+之奈米粒子之Rt長於併入Cu2+之奈米粒子及初始的空奈米粒子。此可再次藉由因錯合誘導的表面電荷或離子化狀態之改變來解釋，因為DOTAGA(Gd3+)具有 與金屬配位的所有四個羧酸基團，而DOTAGA(Cu2+)具有兩個游離的羧酸基團。更重要地，在併入銅之奈米粒子的情況下，奈米粒子峰之形狀顯示在錯合之後的均質分佈。
HPLC層析譜顯示奈米粒子為純的。溶液之純度係在295nm處由層析譜評估且幾乎為100%。
接著，將溶液之pH增加至7.4且將溶液經由0.2μm膜過濾以在冷凍乾燥之前移除灰塵。在此實例中，獲得250mg UCHSNP@Gd-1之粉末。
將冷凍乾燥粉末之樣本再分散於水中以驗證流體動力學直徑(DH)、表面電荷及弛緩率(r1及r2)。圖13顯示UCHSNP@Gd-1之DH之分佈直方圖，該DH為5.7±1.3nm。表面電荷藉由ζ電位值來反映，在pH 6.65下其為-5.8mV，且在pH 7.34下其為-8.2mV。隨後，執行元素分析以揭示粒子之化學組成。根據此結果，Gd之含量為0.60μmol/mg(表3)。接著，量測在100g/l(60.4mM於Gd中)下的UCHSNP@Gd-1於水中之溶液的弛緩時間(T1及T2)以在37℃及1.4T下得到r1=21.4(s-1.mM-1)及r2=34.1(s-1.mM-1)。
步驟2b：由錯合APTES-DOTAGA(Gd 3+ )合成UCHSNP@Gd-2
將200ml之水添加至2.333mmol的自步驟1a或步驟1b合成的APTES-DOTAGA。藉由添加具有適當濃度的NaOH溶液將溶液之pH調整至4。添加1.938mL的2.188M之GdCl3(莫耳比率(APTES-DOTAGA+DOTAGA)：Gd=1：0.9)溶液3次。在每一次之間，藉由在下一次添加之前添加具有適當濃度的NaOH溶液將pH小心地增加至4-5。在3次添加之後，pH處於5。將此溶液在80℃下培養。驗證pH且每24h之後將pH再調整至5。在48h之培養之後，將pH穩定地維持在5。
隨後，將此溶液之pH調整至9且將溶液攪拌1-2h以溶解並釋放APTES-DOTAGA(Gd3+)成單體形式。隨後，將TEOS(1015.4μL,4.457mmol)及APTES(526.7μL,2.228mmol)逐一添加至上述溶液。pH應在必要時返回9，因為APTES之添加稍微增加pH。添加水來分別達成APTES-DOTAGA(Gd3+)、APTES-DOTAGA、TEOS及APTES的在9mM、20mM及10mM下之最終理論濃度。在25℃下將反應混合物攪拌隔夜以使溶液變成均質的，從而暗示所有乙氧基矽烷得以水解。隨後，藉由添加幾滴處於適當濃度的HCl將pH自9減少至7。將溶液在25℃下保持攪拌2h，之後自pH 7再調整至pH 4.5。將溶液在25℃下再多攪拌1-2h之持續時間，之後在80℃下加熱且在油浴中輕柔地攪拌隔夜(15-20h)。將少量溶液經由0.2μm膜過濾且藉由DLS及HPLC(根據方法1)分析。對於HPLC分 析，將過濾的溶液快速地稀釋2倍以剛好在注入至HPLC系統之前具有5g/L之理論濃度。在295nm下跟隨到訊號。另外，螢光偵測器(λex=274nm,λem=312nm)亦用於定性地偵測Gd錯合物之存在。
隨後，藉由VivaspinTM(MWCO=3kDa)將溶液濃縮至10ml。再次，重複HPLC分析。將樣本稀釋以剛好在注入至HPLC系統之前具有5g/L之理論濃度，以便與先前結果比較。
隨後，進一步利用超濾將溶液純化。若前驅物為與未反應的DOTAGA之混合物，則溶液之pH應藉由在純化之前添加HCl溶液來調整至2。進行純化直至由HPLC層析譜計算的純度達到
Figure 107119836-A0202-12-0057-138
90%(10純化速率)。隨後，溶液之pH在冷凍乾燥之前增加至7.4。將其經由0.2μm膜過濾以移除灰塵及大的粒子，之後凍乾用於長期儲存。在此實例中，獲得716mg UCHSNP@Gd-2之粉末。
圖14顯示形成的UCHSNP@Gd-2之DH分佈。粒子具有大約3.9±1.3nm之DH。
HPLC層析譜顯示在純化之後，奈米粒子為純的且與DOTAGA良好接枝在表面上。峰之形狀顯示在錯合之後的均質分佈。溶液之純度係在295nm處由層析譜評估且為 96.8%。
將冷凍乾燥粉末之樣本再分散於水中以驗證在冷凍乾燥之後的DH、表面電荷及弛緩率(r1及r2)。圖15顯示UCHSNP@Gd-2之DH之分佈直方圖，該DH為2.8±0.7nm。表面電荷藉由ζ電位值來反映，在pH 7.4下其為-35.6mV。隨後，亦執行元素分析以揭示粒子之化學組成。根據此結果，Gd之含量為0.60μmol/mg(表3)。根據自此結果推定的組合物之比率，UCHSNP@Gd-2在其結構中具有較少的APTES及較多的游離DOTAGA，從而解釋了用該些奈米粒子量測的更負的ζ電位。
藉由用Eu之另一滴定驗證UCHSNP@Gd-2上游離DOTAGA之含量(圖16)。結果顯示至少0.20μmol/mg之DOTAGA或24.1%可有效地與在0.94μmol/mg DOTAGA之總含量中的金屬反應。此高於UCHSNP@Gd-1(10%)的情況。藉由元素分析暗示的總APTES-DOTAGA之含量始終高於藉由滴定估計的值10%，從而指示兩種奈米粒子中之一些DOTAGA不可接近金屬。
UCHSNP@Gd-2中游離的DOTAGA之較高量可歸因於解錯合，該解錯合在將反應混合物在pH 9下攪拌隔夜以水解TEOS時加速。UCHSNP@Gd-2相較於UCHSNP@Gd-1中的APTES之較低量可藉由APTES-DOTAGA及 APTES-DOTAGA(Gd3+)之電荷的差異來解釋。在pH 4.5下，游離形式之DOTAGA為-2或-3，而錯合形式始終處於-1。可能地，錯合形式具有較弱的電荷排斥，從而使得其比游離形式更好地準備與胺基矽烷競爭來得到藉由TEOS產生的聚矽氧烷表面上的位置。
接著，量測在100g/l(63.0mM於Gd中)下的UCHSNP@Gd-2於水中之溶液的弛緩時間(T1及T2)以在37℃及1.4T下得到r1=18.5(s-1.mM-1)及r2=28.7(s-1.mM-1)。
表4概述UCHSNP、UCHSNP@Gd-1及UCHSNP@Gd-2之特性及性質。
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表4.UCHSNP、UCHSNP@Gd-1及UCHSNP@Gd-2之特性及性質。
[實例3：合成具有不同尺寸之UCHSNP]
合成可進一步藉由將APTES-DOTAGA之合成及聚矽氧烷粒子之合成組合成一鍋方案來簡化。此外，粒子之尺寸可藉由在配方(圖17)中改變矽烷前驅物之比率來控制。
將8g之DOTAGA酐(13.96mmol)放入100mL圓底燒 瓶中，向其快速地添加31.6mL之無水DMSO及3.300mL之APTES(13.96mmol)。將反應在氬氣氛下攪拌且加熱至75℃達15-20h之持續時間。不同於第二實例，產物歸因於過度的使DOTAGA之羧基離子化的APTES之存在而為可溶性的。使混合物冷卻降至室溫，之後添加663mL之超純水。溶劑中之DMSO之最終百分比應小於5%以便不溶解用於不一步驟的切向過濾膜。取少量樣本來藉由Eu滴定及藉由之前引入的Gd3+所探測的HPLC之組合定量所產生的APTES-DOTAGA之量。
藉由添加NaOH溶液將溶液之pH調整至9且將混合物攪拌1h以良好地釋放APTES-DOTAGA成單體形式。隨後，將溶液分離成4個體積。將增加量之TEOS及水如表5所示添加至每一體積以確保所有樣本中的總矽烷濃度為20mM。驗證最終溶液之pH且必要時再調整至9。將該些溶液在25℃下攪拌隔夜。表6顯示所使用的不同矽烷之間的比率A、B及C。
利用UCHSNP-3，其中不添加TEOS之樣本，取少量樣本驗證在暴露於鹼性pH隔夜之後的APTES-DOTAGA之量。圖18顯示2樣本的Eu滴定之結果：(A)暴露於鹼性pH隔夜之前及(B)暴露於鹼性pH隔夜之後。亦執行HPLC分析。表7概述該些測試之結果。
明顯的是，對pH 9之暴露既不影響DOTAGA結構亦不影響APTES-DOTAGA之醯胺鍵。DOTAGA峰之間的輕微變化可歸因於室溫中之差異。最終，根據該結果，大約70%之DOTAGA酐已反應。據此，吾等可重新計算如表5所示的奈米粒子之4個樣本中組合物之精確量。
次日，將4個溶液之pH再調整至7。將其攪拌1h，之後將其pH再調整至4.5。將溶液再攪拌一小時，之後將其加熱至40℃隔夜。取1mL之該些溶液用於DLS量測(圖19-A)。來自UCHSNP-3之訊號太弱以致不具有可靠值，從而暗示產生極小奈米粒子及/或奈米粒子之稀釋濃度。其他3個樣本顯示奈米粒子尺寸對TEOS之所添加量的明顯 依賴性。UCHSNP-4、5及6之DH分別為5.2、75及13.6nm。
藉由Vivaspin(MWCO=3kDa)濃縮該些溶液至適當體積，其中APTES-DOTAGA之理論濃度達到200mM。隨後，將溶液之pH調整至2以自其與新形成的奈米粒子之表面上的胺之靜電相互作用釋放未反應的DOTAGA及APTES-DOTAGA。在此pH下使用HCl 10-2M作為洗滌溶劑藉由Vivaspin純化溶液達64純化速率。剛好在注入至HPLC以供利用295nm處之UV吸收進行分析之前將每一純化溶液之小樣本在10-2M的HCl中稀釋40倍。配方中添加的TEOS越多，奈米粒子之滯留時間越慢。此間接地顯示奈米粒子尺寸與TEOS之量的依賴性，因為較高的tR通常暗示較大的奈米粒子。資料係概括在表8中。
在純化之後，將溶液經由0.2μm膜過濾以移除灰塵及其他大的粒子，之後凍乾用於長期儲存。
將少量的4個樣本以100g 100g/L再分散於水中。因 為溶液之pH在冷凍乾雜之前不做調整，所以在再分散之後，其pH保持在大約2。UCHSNP-6之粉末不能再次在此pH下分散於水。在DLS中量測之前，用10-2M的HCl將該些母液快速地稀釋至10g/L。
將另一系列樣本以150g/L再分散。添加NaOH溶液來將樣本中和至pH 7。在此條件不，有可能再分散UCHSNP-6。取決於樣本，添加或不添加水來獲得大約80-100g/L之最終濃度。類似地，在DLS中量測之前，用水將該些母液快速地稀釋至10g/L。
圖19-B顯示在pH 2下3個樣本UCHSNP-3、4、5之流體動力學直徑分佈。同時，圖19-C顯示在pH 7下獲得的4個樣本之結果。總之，其明顯地顯示在配方中增加TEOS的同時NP尺寸之增加。資料係概括在表9中。
在pH 2下UCHSNP-6不可再分散的事實可能歸因於 其藉由較大的尺寸、TEOS之較高比率及圍繞其的APTES-DOTAGA及APTES之較低密度保護層解釋的較低的膠體穩定性。值得一提的是，在此pH下，DOTAGA之4個羧基都被質子化。因此，粒子之間的排斥僅依賴於APTES之胺基之正電荷，然而，該排斥相當短，且為DOTAGA之障礙效應。此解釋了在pH 7下UCHSNP-6為何可再分散而不出問題的原因。在此情況下，DOTAGA之2個羧基經去質子化且增加排斥力總量。在pH 7下之結果極類似於純化之前的值(圖19-A)，從而暗示在程序期間大多數粒子保持完整。在pH 7下之直徑比在pH 2下之直徑稍大。可能地，此係歸因於每一粒子上的去質子化DOTAGA之間的排斥，此使得其更多地外展。簡言之，此結果顯示藉由使矽氧烷網狀結構產生劑TEOS，及有機矽烷APTES-DOTAGA及APTES之比率變化，吾等可控制NP之尺寸。在此實例中，在比率TEOS：(APTES-DOTAGA+APTES)1：1下，奈米粒子尺寸超過6nm，此為快速腎清除之建議極限。在比率1.51下，其尺寸將超出10nm，更特定地達到14nm。
每一樣本之DOTAGA含量係藉由如圖20所示的Eu滴定測定。吾等清楚地看到如所預期當配方中TEOS增加時，DOTAGA含量減少。有趣地，吾等放入越多TEOS，最後的APTES-DOTAGA之產率越高。據推斷，矽酸與有機矽醇之間的矽氧烷鍵比有機矽醇自身之間的矽氧烷鍵 強。另外，胺基矽烷，尤其是諸如APTES的具有短碳鏈的胺基矽烷，係已知為具有相當低的水解穩定性。
奈米粒子UCHSNP-3、UCHSNP-4、UCHSNP-5及UCHSNP-6亦藉由弛緩測定法及元素分析來表徵。表10概述UCHSNP-3、UCHSNP-4、UCHSNP-5及UCHSNP-6之性質及特性。
[實例4：二乙二醇中之UCHSNP(UCHSNP-7)之一鍋中等規模合成及其對不同金屬之錯合]
將6.187ml之APTES(26.17mmol)添加在含有90ml之二乙二醇(diethylene glycol；DEG)的200ml玻璃瓶中。將溶液在RT下攪拌1h，之後添加10g DOTAGA酐(17.45mmol)。將混合物在RT下攪拌6天以允許完全反應。產物為精細懸浮液。取少量樣本且在水中稀釋10倍以量測在DLS中之DH。
將7.952ml之TEOS(34.90mmol)添加至懸浮液。將此混合物攪拌1h。取少量樣本且在水中稀釋10倍以量測在DLS中之DH。隨後添加900ml之超純水。溶劑中之DEG之最終百分比應小於10%以便不溶解用於下一步驟的切向過濾膜。將混合物加熱至50℃且保持攪拌18h以允許TEOS之完全水解。取少量樣本來分別藉由DLS及HPLC分析新形成粒子之流體動力學尺寸及層析譜。
將溶液藉由Vivaflow卡盒(MWCO=5kDa)濃縮至200ml。隨後，將溶液之pH調整至2以破壞未反應的DOTAGA及APTES-DOTAGA與新形成奈米粒子之表面上的胺之間的離子相互作用。將溶液在此pH下藉由Vivaflow純化達50純化速率，其中水係作為洗滌溶劑(200ml-1 L-200ml-1L-100ml)。在純化之後，將溶液藉由添加數滴NaOH 1M溶液中和至pH 7.4且經由0.2μm膜過濾以移除灰塵及其他大的粒子，之後凍乾用於長期儲存。將純化溶液之小樣本剛好在藉由DLS分析之前於水中稀釋10倍，或在藉由 HPLC使用在295nm處之UV吸附分析之前於TFA 0.1%之水溶液中稀釋10倍。
圖21-A顯示在合成期間在不同步驟處的DLS圖表：APTES+DOTAGA酐之混合物於DEG中(虛線，正方形)、相同混合物添加TEOS之後(虛線，向上三角形)、混合物在水中稀釋之後且加熱隔夜(虛線，向下三角形)、相同混合物經由0.2μm膜過濾之後(實線，圓形)。圖21-B顯示在藉由Vivaflow純化之後粒子之DLS圖表。DEG中之樣本首先在水中稀釋10倍且過濾以獲得均質溶液而非初始懸浮液。如表11中所概述，UCHSNP-7之DH在合成方法期間改變。在添加TEOS之前，藉由前2個樣本之小DH值(0.9nm及1.1nm)指示無粒子產生。在引入並水解TEOS之後，其開始產生超小核心，在該等核心上，其他有機矽烷亦即APTES及APTES-DOTAGA現可更穩定地接枝。最終粒子具有大約4nm之DH。
在純化之後，粒子具有幾乎相同的tR及稍微較低的峰寬度，此可簡單地藉由物理吸收矽烷之移除來解釋。純度 到達98%。此外，反應及純化之產率可粗略地自純化之後粒子之峰面積與純化之前粒子及反應物之總峰面積之間的比率估算，從而得到大約40%。為更定量的察看，將資料概述在表12中。
UCHSNP-7之DOTAGA含量係藉由如圖22所示的Eu滴定測定。結果(約0.8μmol/mg)係根據先前實例中在具有類似DH之粒子中發現的結果。將此結果與所產生粒子之總重量(5.388g)組合，吾等可得出製程之產率，其相較於DOTAGA之引入數量為大約24.7%。奈米粒子UCHSNP-7亦藉由NMR、ζ電位測定法、弛緩測定法及元素分析來表徵。表13概述UCHSNP-7之性質及特性且表14顯示在不同pH下UCHSNP-7之ζ電位。UCHSNP-7的在不同pH下之ζ電位之完全曲線在圖24-A中呈現。
[UCHSNP-7與不同金屬(Gd、Ho、Tb及Bi)之錯合]
將283mg的含有227μmol DOTAGA之UCHSNP-7之冷凍乾燥粉末再分散於水中以具有大約200mM之DOTAGA的濃度。藉由添加具有適當濃度的NaOH溶液將溶液之pH調整至5.5。緩慢地添加98.5μl的2.188M之GdCl3溶液(莫耳比率DOTAGA：Gd=1：0.95)3次，同時將溶液在70℃下在加熱板上加熱並攪拌以加速錯合。在每一次之間，藉由在下一次添加之前緩慢地添加NaOH溶液將pH小心地增加至5-5.5。在3次添加之後，添加水來獲得100mM DOTAGA之濃度及大約5-5.5的pH。將此溶液在80℃下在油浴中攪拌18h。在培養之後，pH維持在大約5.5。利用16個純化速率將此溶液用水作為溶劑藉由切向 過濾(MWCO=3kDa)純化以去除任何游離的Gd3+。最終，將溶液藉由添加幾滴NaOH溶液中和至pH 7且經由0.2μm膜過濾以移除灰塵及其他大的粒子，之後凍乾用於長期儲存。剛好在藉由DLS分析之前將純化溶液之小樣本在水中稀釋10倍。
替代地使用500mM的431μl之HoCl3或TbCl3溶液來應用類似的方案。
對於Bi粒子，歸因於氫氧化鉍之極有限溶解度，使用於HCl 6M中的250mM的817μl之BiCl3溶液。奈米粒子溶液必須在70℃下加熱，之後進行任何添加來增加Bi3+之溶解度及錯合之速度。不能維持此條件可誘導氫氧化鉍沉澱物之形成。需要10M的NaOH溶液來中和溶液至pH 5-5.5，且在添加之每一步驟之間，將溶液在油浴中於80℃下加熱1h。方案之剩餘部分為類似的。
圖23顯示UCHSNP-7@M(M：Gd、Tb、Ho或Bi)之DLS圖表。結果定量地呈現於表15中。所有4種粒子具有大約6nm之流體動力學直徑。結果係根據實例1，其中UCHSNP@Gd-1亦具有約6nm之DH。
在藉由HPLC分析(方法1)之前，將Bi粒子(UCHSNP-7@Bi)之純化溶液在TFA 0.1%之水溶液中稀釋15倍。
在tR=15.7min處發現奈米粒子之峰，其極類似於UCHSNP@Gd-1。峰之形狀亦顯示在錯合之後的均質分佈。粒子之純度極高(97.4%)。此層析譜經正規化至與UCHSNP-7相同的高度以比較滯留時間(tR)及峰寬度(FWHM)。錯合粒子之2個值皆高於空粒子之值。結果概述於表16中。
奈米粒子UCHSNP-7@Gd、UCHSNP-7@Tb、UCHSNP-7@Ho及UCHSNP-7@Bi亦藉由ζ電位測定法、弛緩測定法、ICP-EOS、UV-可見光光譜學及紅外光譜來表徵。表17概述UCHSNP-7之性質及特性。在pH 6.6下奈米粒子之ζ電位顯示在圖24-B中。奈米粒子之UV-可見光光譜係顯示於圖25中。UCHSNP-7@Bi之樣本顯示在309nm處的強烈峰，其對DOTA(Bi3+)錯合物為典型的。UCHSNP-7@Ho之UV-VIS光譜顯示Ho3+之若干吸收峰。IR光譜係顯示在圖26中。其證實金屬之存在。
實例5：活體內磁共振造影(MRI)實驗
將三隻BALB/c小鼠用結腸惡性腫瘤(CT26)細胞在兩個側腹進行皮下接種。
將UCHSNP@Gd-2冷凍乾燥粉末以100mM(以Gd計)分散在生理學血清中。將此濃溶液在血清中稀釋至20mM，之後以200μmol(以Gd計)每kg之劑量靜脈內注射至小鼠。
使用7T MRI系統300WB微成像分光計獲取注射之前 (對比劑前)及注射之後(對比劑後)之影像，該分光計具有1H 40mm線圈、Paravision 5.11軟體(Bruker，德國)。藉由調整異氟烷濃度(1.5%)連續地監視呼吸率。使用Intragate Flash多切片對運動自由人造物記錄動態對比度增強(Dynamic contrast enhanced；DCE)序列，其中TR=100ms，TE=4ms，回轉角=80°。重複數係設定至15且重構之時框數為1。選擇3cm x 3cm之視野(field-of-view；FOV)及256 x 256之矩陣，具有1mm厚度之4個切片，在平面內得到117μm x 117μm之空間解析度。總掃描時間為大約3min 14sec。最終，加長版本的Intragate Flash多切片序列係用於動態追蹤以在40min之掃描時間內獲得相同的時間解析度。在對比劑後執行2-3min掃描3-6小時以作為追蹤。
監視腫瘤及肝中之若干感興趣區域(regions of interest；ROI)且將粒子注射前及粒子注射後的ROI之MRI強度繪圖。每一組織區域中訊號之組織增強級別係計算為(St-S0)/S0，其中St為在注射之後的每一時間點量測的訊號強度，且S0為注射之前的訊號強度。
圖27-A顯示如所預期的MRI橫截面，其中腫瘤區域加以突顯。對比劑前影像及對比劑後影像之比較清楚地揭示在腫瘤區域處由粒子所引起的較高亮度。對比劑增強係表示為相較於對比劑前影像的增強百分比。在腫瘤組織 中，UCHSNP@Gd-2顯示在注射後30分鐘具有最大增強之攝入期(訊號增加35%)及延長的清除期，其中半衰期為3小時，從而證明EPR(增強滲透性及滯留)效應(參見圖27-B)。在肝中，增強之峰(訊號之90%增加)在粒子注射後6分鐘觀察到繼之以清除期(參見圖27-C)。在注射後40min之後，訊號處於最大強度之一半，從而指示肝臟半衰期為大約30分鐘。在血流循環之後，利用經由肝中血管網路的補充暫時性目測觀察，粒子係自腎皮層排除至膀胱，如先前所示作為超小奈米粒子排除。
此成像研究證明UCHSNP@Gd-2在腫瘤及肝組織中歷經完整觀察期顯示出對比度增強，而對巨分子劑沒有觀察到典型的肝累積。因此，其改良成像性質而無非所欲的肝吸收。同時，在腫瘤中的相對長的滯留時間打開了朝向腫瘤組織之載體化(vectorization)的前景。

Claims (23)

  1. 一種用於合成二氧化矽奈米粒子之方法，前述方法包含將在生理學pH下帶負電的至少一種矽烷與以下者混合之步驟：在生理學pH下為中性的至少一種矽烷；及/或在生理學pH下帶正電的至少一種矽烷；其中：中性矽烷與帶負電的矽烷之莫耳比率A係定義如下：0
    Figure 107119836-A0305-02-0079-7
    A
    Figure 107119836-A0305-02-0079-8
    6；帶正電的矽烷與帶負電的矽烷之莫耳比率B係定義如下：0
    Figure 107119836-A0305-02-0079-9
    B
    Figure 107119836-A0305-02-0079-10
    5；中性及帶正電的矽烷與帶負電的矽烷之莫耳比率C係定義如下：0<C
    Figure 107119836-A0305-02-0079-12
    8，其中分散於水中的前述二氧化矽奈米粒子具有在0.5nm與15nm之間的平均流體動力學直徑。
  2. 如請求項1所記載之方法，其中前述矽烷係選自烷氧基矽烷、羥基矽烷、及其混合物之試劑。
  3. 如請求項2所記載之方法，其中前述矽烷表示前述試劑之總重量之至少80重量%、85重量%或90重量%。
  4. 如請求項1或2所記載之方法，其中前述混合步驟係在質子溶劑中執行。
  5. 如請求項1或2所記載之方法，其中前述方法為不具有中間產物之任何分離或純化步驟的一鍋合成。
  6. 如請求項1或2所記載之方法，其中前述二氧化矽奈米粒子不包含結晶核心。
  7. 如請求項1或2所記載之方法，其中前述帶負電的矽烷包括或基本上由包含至少一個、兩個、或更多個帶負電的羧酸官能之矽烷組成。
  8. 如請求項1所記載之方法，其中前述帶負電的矽烷包括或基本上由包含至少一種螯合劑的矽烷組成。
  9. 如請求項8所記載之方法，其中前述螯合劑係選自聚胺基聚羧酸，包括：DOTA(1,4,7,10-四氮雜環十二烷-N,N’,N”,N’’’-四乙酸)、DOTAGA(2-(4,7,10-三(羧基甲基)-1,4,7,10-四氮雜環十二烷-1-基)戊烷二酸)、下式(III)之DO3A-吡啶：
    Figure 107119836-A0305-02-0080-2
     DTPA(二伸乙基三胺五乙酸)、CHX-DTPA(反-環己基-二伸乙基三胺五乙酸)、側氧基-Do3A(1-氧雜-4,7,10-三氮雜環十二烷-4,7,10-三乙酸)、SCN-Bz-DTPA(對異氰硫基苄基-DTPA)、1 B3M(1-(對異氰硫基苄基)-3-甲基-DTPA)、MX-DTPA(1-(2)-甲基-4-異氰酸基苄基-DTPA)；EDTA(2,2',2",2'''-(乙烷-1,2-二基二氮基)四乙酸)； EGTA(乙二醇-雙(2-胺基乙基醚)-N,N,N',N'-四乙酸)、BAPTA(1,2-雙(鄰胺基苯氧基)乙烷-N,N,N',N'-四乙酸)；NOTA(1,4,7-三氮雜環壬烷-1,4,7-三乙酸)；PCTA(3,6,9,15-四氮雜雙環[9.3.1.]十五-1(15),11,13-三烯-3,6,9-三乙酸)；下式(IV)之TMPAC：
    Figure 107119836-A0305-02-0081-6
     及其混合物。
  10. 如請求項8或9所記載之方法，其中前述螯合劑不含金屬離子。
  11. 如請求項8或9所記載之方法，其中前述螯合劑螯合金屬離子，包括鹼金屬離子及其放射性同位素、過渡金屬離子及其放射性同位素、後過渡金屬離子及其放射性同位素、稀土金屬離子及其放射性同位素、及其混合物。
  12. 如請求項1或2所記載之方法，其中前述帶正電的矽烷包括具有一個帶正電的胺基官能之至少一矽烷。
  13. 如請求項1或2所記載之方法，其中前述混合步驟進一步包括混合至少一種包含至少一種螢光團之矽烷， 包含螢光團之矽烷與中性矽烷之莫耳比率D係定義如下：0.001
    Figure 107119836-A0305-02-0082-13
    D
    Figure 107119836-A0305-02-0082-14
    0.2。
  14. 如請求項1或2所記載之方法，其中前述混合步驟進一步包括混合至少一種包含至少一個藥物部分之矽烷，包含藥物之矽烷與中性矽烷之莫耳比率E係定義如下：0.1
    Figure 107119836-A0305-02-0082-15
    E
    Figure 107119836-A0305-02-0082-16
    5。
  15. 如請求項14所記載之方法，其中前述二氧化矽奈米粒子包含相較於前述二氧化矽奈米粒子之總重量在0.5重量%與50重量%之間的藥物部分。
  16. 如請求項1或2所記載之方法，其中前述中性矽烷與帶負電的矽烷之莫耳比率A係定義如下：0.5
    Figure 107119836-A0305-02-0082-17
    A
    Figure 107119836-A0305-02-0082-18
    2。
  17. 如請求項1或2所記載之方法，其中前述帶正電的矽烷與帶負電的矽烷之莫耳比率B係定義如下：0.25
    Figure 107119836-A0305-02-0082-19
    B
    Figure 107119836-A0305-02-0082-20
    3。
  18. 如請求項1或2所記載之方法，其中前述中性及帶正電的矽烷與帶負電的矽烷之莫耳比率C係定義如下：1<C
    Figure 107119836-A0305-02-0082-21
    4。
  19. 一種藉由如請求項1至18中任一項所記載之方法所獲得的二氧化矽奈米粒子。
  20. 一種具有在0.5nm與15nm之間的平均流體動力學直徑之分散於水中的二氧化矽奈米粒子，其包含用螯合劑接枝的聚有機矽氧烷基質，前述螯合劑係(i)不含金屬離子且(ii)係以每奈米粒子至少0.1μmol/mg奈米粒子的含量存在。
  21. 如請求項19或20所記載之二氧化矽奈米粒子，其中前述二氧化矽奈米粒子係用於人類診斷及/或治療。
  22. 如請求項19或20所記載之二氧化矽奈米粒子，其中前述二氧化矽奈米粒子係用於與放射療法組合。
  23. 如請求項19或20所記載之二氧化矽奈米粒子，其中前述二氧化矽奈米粒子係用作成像中之對比劑。
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