TWI820061B - 用於免疫組織化學的合成對照 - Google Patents
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Abstract
本發明係關於可用於例如免疫組織化學(IHC)的合成對照，以及與其相關的套組和製備方法。在一些實施例中，該等合成對照包括固體抗原/載體蛋白凝膠，其包含純化的抗原(例如，以已知量)和載體蛋白，例如白蛋白蛋白(例如，血清白蛋白蛋白)、蛋清蛋白或蛋清蛋白的混合物、明膠或聚離胺酸。在一些實施例中，在該固體抗原/載體蛋白凝膠中，該純化的抗原與該載體蛋白交聯。
Description
本發明係關於可用於例如免疫組織化學(IHC)的合成對照，以及與其相關的製備方法和用途。在一些實施例中，合成對照包括固體凝膠，其包含與載體蛋白交聯的純化抗原(例如，以已知量)，該載體蛋白例如血清白蛋白蛋白、蛋清蛋白或蛋清蛋白的混合物，或明膠。
IHC代表了研究和臨床應用的重要工具。在用於表徵蛋白質表達的許多技術中，IHC是提供關於表達水準以及例如細胞和/或組織層面的定位的資訊的少數幾種技術之一。因此，IHC是在研究中用於表徵所關注蛋白質的關鍵工具。IHC還已成為臨床中的重要診斷工具，例如，針對各種個性化醫療應用，將患者分類。作為一個實例，HercepTest™(Dako Denmark A/S)半定量HER2 IHC測定已被FDA批准用於評估HER2蛋白質狀態近20年。該測試允許臨床醫生識別腫瘤過度表達HER2的患者。雖然HER2在許多類型的癌症中過度表達，但已顯示25-30%的乳腺癌過度表達HER2，並且該標記與縮短的無疾病和總體存活相關。在這些患者中靶向HER2的療法(例如，抗HER2抗體治療)提供顯著改善的總體存活、反應率、反應持續時間和疾病進展時間。參見例如Slamon, D.J.等人 (2001)N Engl J Med
344:783-792。
為特定標靶建立可靠的IHC測定提出了多種挑戰。首先，必須識別對所關注的標靶具有特異性，並且不與其他標靶交叉反應的抗體。這需要以已知水準來表達標靶的適當的陽性和陰性對照，當標靶的表達未被表徵時，該等對照是難以識別的。
其次，即使可獲得抗體，也可能難以識別可靠、易於獲得且易於大量生產的陽性和陰性對照。組織樣品和細胞株(例如細胞聚合體)均用作IHC對照；但是，兩者都有很大的局限性。對於許多標靶，沒有合適的組織可利用。對於其他標靶，組織中的表達可能是可變的、未表徵的或者太弱而不能檢測。細胞株比組織樣品更容易獲得(儘管在工業規模上生長某些細胞株可能是困難的)，但是像在組織樣品中的表達一樣，細胞株中的表達可以是可變的、未表徵的或者太弱而不能檢測。人們可以設計細胞株以過度表達所關注的標靶，但是過度表達可以顯著高於實際組織中的表達並且可以導致不真實的亞細胞定位。在培養細胞群中，過度表達也可以是不均一的。細胞株可以分批生產，但這些細胞株可以快速耗盡，從而需要生產具有不同特徵的新批次。
已經嘗試了各種旨在建立標準化方法以產生IHC對照的方法。45年前，Brandtzaeg描述了一種製造「人造組織」樣品的方法：毫米大小的戊二醛固定兔血清塊，人免疫球蛋白組分或全血清可以擴散到其中(Brandtzaeg, P. (1972)Immunology
;22(1):177-183)。在接下來的十幾年中，這種一般技術得到了重新審視和擴展，取得了明顯的成功(Millar及Williams (1982)Histochem J.
14(4):609-620; Schipper及Tilders (1983)J Histochem Cytochem.
31(1):12-18; Valnes 等人 (1984)J Histochem Cytochem.
33(8):755-61; Valnes及Brandtzaeg (1985)Histochemistry
. 81(4):313-9)，但也被描述為易於發生不均勻和非特異性染色(Shi 等人 (2005) J Histochem Cytochem. 53(9):1167-1170)，並且在最近的實踐中幾乎沒有用。更廣泛使用的是具有靶蛋白的在不同程度上得到良好表徵的豐度的純系細胞株(Mohd Omar 等人( 2010)Acta Histochem.
112(6):519-28)。這些細胞株在許多環境中都是非常寶貴的，但是在單獨的亞純系、一個純系的不同傳代或甚至在一個培養群體中，細胞株對照可以顯示特定標靶的非常異質的表達，這使得創建均勻且可再現的標準的目標受挫。
Sompuram, S.R. 等人 (2002)Clin Chem
48:410-420描述了將肽直接點樣到載玻片上，或將肽偶聯到玻璃珠上(也參見Sompuram等人(2015)J. Histochem Cytochem
63:681-690)。但是，這種方法的實施帶來了技術挑戰。例如，由於技術人員很難看到肽被施加到玻璃上的斑點(它們在染色之前是不可見的)，因此為了覆蓋所有對照，許多載玻片用不足量的試劑染色，從而導致染色中的偽影(參見Bogen, S.A. 等人 (2009)Appl Immunohistochem Mol Morphol
17:239-246)。這些肽斑點也比實際組織切片薄得多，因此難以實現強烈的陽性對照染色。其他組試圖在溶菌酶溶液中混合所關注的標靶，其可以像福爾馬林固定的石蠟包埋的組織切片那樣製備(參見Fowler, C.B. 等人 (2007)Lab Invest
87:836-846)。他們指出，凝膠形成取決於蛋白質濃度和等電點(Fowler等人(2007)Lab Invest.
87(8):836-46.)。然而，這種方法對許多標靶例如肽不起作用，其可以從溶菌酶明膠中洩漏出來。還測試了瓊脂糖作為潛在的組織替代物。然而，分散在瓊脂糖中的肽不均勻。此外，對這些基於瓊脂糖的肽凝膠進行抗原修復(通常包括煮沸)，使瓊脂糖熔化並使其在載玻片上分離。
因此，需要一種方法，其提供可靠的陽性和陰性IHC對照，該等對照是敏感的、特異性的，並且可以適應廣泛的標靶，包括不存在合適的生物對照的標靶。這種方法還將提供用於確定抗體特異性的有用測定，這在篩選大量抗體以識別和驗證對所關注的標靶具有特異性的新抗體時特別有利，並且可用於優化IHC染色方案。
本文引用的所有參考文獻，包括專利申請案、專利公佈、非專利文獻和UniProtKB/Swiss-Prot登錄號，均整體以引用方式併入本文，如同每個單獨的參考文獻被具體和單獨地指出以引用方式併入一般。
為了滿足這些和其他要求，本文提供了用於產生固體抗原/載體蛋白凝膠的方法。根據標準IHC或電子顯微鏡(EM)處理方法(包括固定、切片、抗原修復等)，可以像組織樣品或其他生物樣品一樣處理這些固體凝膠。由於凝膠含有已知量的所關注抗原，因此可以使用它們來例如產生一系列具有已知濃度的抗原的凝膠，以對用特定抗體的染色進行標準化，或篩選特異性識別所關注抗原並適用於IHC/EM分析的抗體。認為這些方法提供了一種通用平台，其允許對任何所關注的抗原進行對照染色，從而使用已知濃度的抗原來模擬多種表達水準。
本發明的某些態樣涉及產生固體抗原/載體蛋白凝膠(例如，用於IHC或EM分析)的方法，其包括：(a)將純化的抗原與包含選自由以下組成之群的載體蛋白的液體溶液混合：白蛋白蛋白質(例如血清白蛋白蛋白質)，蛋清蛋白質或蛋清蛋白質混合物，以及明膠，以產生抗原/載體蛋白液體溶液；及(b)加熱抗原/載體蛋白液體溶液，以形成固體抗原/載體蛋白凝膠。在一些實施例中，該等方法包括：(a)將純化的抗原與包含選自由白蛋白蛋白質(例如血清白蛋白蛋白質)、蛋清蛋白質或蛋清蛋白質混合物、明膠和聚離胺酸組成之群的載體蛋白的液體溶液混合，產生抗原/載體蛋白液體溶液；及(b)加熱抗原/載體蛋白液體溶液，以形成固體抗原/載體蛋白凝膠。在一些實施例中，該等方法還包括在(b)之後：使固體抗原/載體蛋白凝膠脫水並將脫水的固體抗原/載體蛋白凝膠包埋在石蠟塊中。在一些實施例中，該等方法還包括在將脫水的固體抗原/載體蛋白凝膠包埋在石蠟塊中之後：將包含抗原/載體蛋白凝膠的核心從石蠟塊轉移至受體組織微陣列(TMA)塊。在一些實施例中，該等方法還包括在(b)之後：將固體抗原/載體蛋白凝膠在液體包埋介質中溫育並在包埋介質中冷凍固體抗原/載體蛋白凝膠。在一些實施例中，該等方法還包括在(b)之後：將固體抗原/載體蛋白凝膠包埋在塑性樹脂中。在一些實施例中，方法還包括在(b)之後：將固體抗原/載體蛋白凝膠切成一個或多個厚度為約30nm至約50μm的固體抗原/載體蛋白凝膠切片。在一些實施例中，將固體抗原/載體蛋白凝膠切成一個或多個固體抗原/載體蛋白凝膠切片，其厚度為約2μm至約30μm。在一些實施例中，將固體抗原/載體蛋白凝膠切成一個或多個固體抗原/載體蛋白凝膠切片，其厚度為約30nm至約100nm。在一些實施例中，該等方法在(b)之前還包括在抗原/載體蛋白液體溶液中包含固定劑。在一些實施例中，固定劑包含甲醛。在一些實施例中，抗原/載體蛋白液體溶液包含終濃度為至少約1%的甲醛。在一些實施例中，固定劑包括戊二醛、Davidson固定劑、Bouin固定劑、½強度Karnovski固定劑或鋅鹽。在一些實施例中，該等方法還包括使固體抗原/載體蛋白凝膠經受抗原修復。在一些實施例中，使固體抗原/載體蛋白凝膠經受抗原修復包括在液體溶液中加熱固體抗原/載體蛋白凝膠。在一些實施例中，方法還包括：在(b)之前，在抗原/載體蛋白液體溶液中包含固定劑；在(b)之後，使固體抗原/載體蛋白凝膠脫水；將脫水的固體抗原/載體蛋白凝膠包埋在石蠟塊中；將具有包埋的抗原/載體蛋白凝膠的石蠟塊切成一個或多個厚度在約30nm和約50μm之間的切片；使包埋的固體抗原/載體蛋白凝膠的一個或多個切片經受抗原修復；並且在抗原修復後，阻斷包埋的固體抗原/載體蛋白凝膠的一個或多個切片。在一些實施例中，該等方法還包括：在(b)之後，將固體抗原/載體蛋白凝膠在液體包埋介質中溫育；在包埋介質中冷凍固體抗原/載體蛋白凝膠；將冷凍的抗原/載體蛋白凝膠切成一個或多個厚度在約30nm和約50μm之間的切片；並阻斷冷凍抗原/載體蛋白凝膠的一個或多個切片。在一些實施例中，抗原是多肽抗原。在一些實施例中，抗原包含N-末端酪胺酸、C-末端半胱胺酸或兩者。在一些實施例中，該等方法還包括在(b)之前，使用半胱胺酸反應性試劑使抗原與載體蛋白(例如白蛋白、蛋清蛋白或蛋清蛋白的混合物或明膠)交聯。在一些實施例中，抗原包含非多肽抗原。在一些實施例中，載體蛋白是白蛋白蛋白，例如牛、山羊、馬或人血清白蛋白。在一些實施例中，載體蛋白是蛋清蛋白或蛋清蛋白的混合物。在一些實施例中，(a)中產生的抗原/載體蛋白液體溶液包含濃度大於或等於2%(w/v)的載體蛋白。在一些實施例中，(a)中產生的抗原/載體蛋白液體溶液包含終濃度小於或等於約25%(w/v)的載體蛋白。在一些實施例中，載體蛋白是明膠，並且該方法在(b)之後進一步包括冷卻加熱的抗原/載體蛋白液體溶液以形成固體抗原/載體蛋白凝膠。在一些實施例中，該方法還包括在冷卻加熱的抗原/載體蛋白液體溶液後：將固體抗原/載體蛋白凝膠與固定劑一起溫育以形成固定的抗原/載體蛋白凝膠；並使固定的抗原/載體蛋白凝膠脫水。在一些實施例中，(a)中產生的抗原/載體蛋白液體溶液包含濃度大於或等於約0.5%(w/v)的載體蛋白。在一些實施例中，將抗原/載體蛋白液體溶液在(b)中加熱至至少約65℃。在一些實施例中，將抗原/載體蛋白液體溶液在(b)中加熱至至少約65℃至少6分鐘。在一些實施例中，聚離胺酸以約14mg/mL的濃度存在於(a)中產生的抗原/載體蛋白液體溶液中。
本文進一步提供了藉由根據任一上述實施例的方法產生的固體抗原/載體蛋白凝膠。
本文進一步提供組織微陣列(TMA)，其包含至少第一固體抗原/載體蛋白凝膠，其藉由根據任一上述實施例的方法產生，和第二固體抗原/載體蛋白凝膠，其藉由根據任一上述實施例的方法產生。
本發明的某些態樣涉及用於抗原的免疫組織化學(IHC)染色的方法，包括：提供藉由上述實施例中任一個的方法產生的固體抗原/載體蛋白凝膠，其中固體抗原/載體蛋白凝膠包含抗原；提供樣品；使固體抗原/載體蛋白凝膠和樣品與特異性結合抗原的一級抗體接觸；在使固體抗原/載體蛋白凝膠和樣品與一級抗體接觸後，使固體抗原/載體蛋白凝膠和樣品與特異性結合一級抗體的二級抗體接觸，其中可檢測部分與二級抗體偶聯；從固體抗原/載體蛋白凝膠中檢測可檢測部分的信號；從樣品中檢測可檢測部分的信號，其中與從固體抗原/載體蛋白凝膠中檢測到的信號相比，檢測來自樣品的信號表明樣品中存在抗原。在一些實施例中，可檢測部分包含酶，並且其中檢測可檢測部分的信號包括將可檢測部分暴露於酶的顯色、螢光或化學發光受質，並在與酶反應時檢測來自受質的信號。在一些實施例中，可檢測部分包含螢光團、金屬粒子、金屬離子、放射性同位素、核酸、電化學發光報道分子或「量子點」(固態、半導體或碳基螢光奈米粒子)。在一些實施方案中，樣品是組織樣品。
本發明的某些態樣涉及用於抗原的對照免疫組織化學(IHC)染色的方法，包括：提供第一和第二固體抗原/載體蛋白凝膠，其中第一和第二固體抗原/載體蛋白凝膠中的每一個藉由上述實施例中任一項的方法產生，其中第一固體抗原/載體蛋白凝膠含有第一濃度的抗原，並且其中第二固體抗原/載體蛋白凝膠含有高於第一濃度的第二濃度的抗原；使第一和第二固體抗原/載體蛋白凝膠與特異性結合抗原的一級抗體接觸；在第一和第二固體抗原/載體蛋白凝膠與一級抗體接觸後，使第一和第二固體抗原/載體蛋白凝膠與特異性結合一級抗體的二級抗體接觸，其中可檢測部分與二級抗體偶聯；從第一固體抗原/載體蛋白凝膠中檢測可檢測部分的第一信號；從第二固體抗原/載體蛋白凝膠中檢測可檢測部分的第二信號，其中檢測到大於第一信號的第二信號表明抗原的對照IHC染色。在一些實施例中，可檢測部分包含酶，並且其中檢測可檢測部分的信號包括將可檢測部分暴露於酶的顯色、螢光或化學發光受質，並在與酶反應時檢測來自受質的信號。在一些實施例中，可檢測部分包含螢光團、金屬粒子、金屬離子、放射性同位素、核酸、電化學發光報道分子或「量子點」(固態、半導體或碳基螢光奈米粒子)。在一些實施例中，第一濃度為0nM，並且其中檢測到缺乏第一信號表明抗原的對照IHC染色。在一些實施例中，該等方法還包括：提供樣品；使樣品與一級抗體接觸；在使樣品與一級抗體接觸後，使樣品與二級抗體接觸，其中可檢測部分與二級抗體偶聯；從樣品中檢測可檢測部分的第三信號；並且將第三信號與第一和第二信號進行比較，其中相對於第一和第二信號的量的第三信號的量表示相對於第一和第二固體抗原/載體蛋白凝膠中抗原的量，樣品中抗原的豐度。
本發明的某些態樣涉及用二級抗體的對照免疫組織化學(IHC)染色的方法，包括：提供第一和第二固體抗原/載體蛋白凝膠，其中第一和第二固體抗原/載體蛋白凝膠中的每一個藉由上述實施例中任一項的方法產生，其中第一固體抗原/載體蛋白凝膠包含具有第一同種型的第一抗體，並且其中第二固體抗原/載體蛋白凝膠包含具有不同於第一同種型的第二同種型的第二抗體；使第一和第二固體抗原/載體蛋白凝膠與特異性結合第一同種型的二級抗體接觸，其中可檢測部分與二級抗體偶聯；從第一固體抗原/載體蛋白凝膠中檢測可檢測部分的信號；檢測到缺乏來自第二固體抗原/載體蛋白凝膠的可檢測部分的信號，其中檢測與第一固體抗原/載體蛋白凝膠相關的信號和缺乏與第二固體抗原/載體蛋白凝膠相關的信號表示用二級抗體進行對照染色。在一些實施例中，可檢測部分包含酶，並且其中檢測可檢測部分的信號包括將可檢測部分暴露於酶的顯色、螢光或化學發光受質，並在與酶反應時檢測來自受質的信號。在一些實施例中，可檢測部分包含螢光團、金屬粒子、金屬離子、放射性同位素、核酸、電化學發光報道分子或「量子點」(固態、半導體或碳基螢光奈米粒子)。
本發明的某些態樣涉及固體抗原/載體蛋白凝膠(例如，用於免疫組織化學(IHC)染色)，其包含與選自由白蛋白蛋白(例如血清白蛋白蛋白)、蛋清蛋白質或蛋清蛋白質的混合物和明膠組成之群的載體蛋白交聯的純化抗原。在一些實施例中，本發明涉及固體抗原/載體蛋白凝膠(例如，用於免疫組織化學(IHC)染色)，其包含與選自由白蛋白蛋白(例如血清白蛋白蛋白)、蛋清蛋白質或蛋清蛋白質的混合物、明膠和聚離胺酸組成之群的載體蛋白交聯的純化抗原。在一些實施例中，固體凝膠的厚度為約30nm至約50μm。在一些實施例中，固體凝膠的厚度為約2μm至約30μm。在一些實施例中，固體凝膠的厚度為約30nm至約100nm。在一些實施例中，將固體凝膠在包埋介質中冷凍。在一些實施例中，將固體凝膠包埋在石蠟中。在一些實施例中，將固體凝膠包埋在塑性樹脂中。在一些實施例中，將固體凝膠固定到固體受質上。在一些實施例中，固體凝膠已固定在固定劑中。在一些實施例中，固定劑包含甲醛。在一些實施例中，固定劑包含濃度為至少約1%的甲醛。在一些實施例中，固定劑包括戊二醛、Davidson固定劑、Bouin固定劑、½強度Karnovski固定劑或鋅鹽。在一些實施例中，固體凝膠已經進行抗原修復。在一些實施例中，抗原是多肽抗原。在一些實施例中，抗原包含N-末端酪胺酸、C-末端半胱胺酸或兩者。在一些實施例中，N-末端酪胺酸和/或C-末端半胱胺酸與載體蛋白交聯。在一些實施例中，抗原包含非多肽抗原。在一些實施例中，載體蛋白是白蛋白蛋白，例如牛、山羊、馬或人血清白蛋白。在一些實施例中，載體蛋白是蛋清蛋白或蛋清蛋白的混合物。在一些實施例中，固體凝膠包含濃度大於或等於2%的載體蛋白。在一些實施例中，固體凝膠包含濃度小於或等於約25%的載體蛋白。在一些實施例中，載體蛋白是明膠。在一些實施例中，固體凝膠包含濃度大於或等於0.5%的載體蛋白。在一些實施例中，固體凝膠含有濃度為至少約25nM的抗原。在一些實施例中，固體凝膠包含濃度為約14 mg/mL的聚離胺酸。
本發明的某些態樣涉及組織微陣列(TMA)，其包含至少第一和第二固體抗原/載體蛋白凝膠，其中第一和第二固體抗原/載體蛋白凝膠均包含與選自由白蛋白蛋白質、蛋清蛋白質或蛋清蛋白質混合物和明膠組成之群的載體蛋白交聯的純化抗原。在一些實施例中，本發明涉及組織微陣列(TMA)，其包含至少第一和第二固體抗原/載體蛋白凝膠，其中第一和第二固體抗原/載體蛋白凝膠均包含與選自由白蛋白蛋白、蛋清蛋白或蛋清蛋白的混合物、明膠和聚離胺酸組成之群的載體蛋白交聯的純化抗原。在一些實施例中，第一固體抗原/載體蛋白凝膠包含第一純化抗原，第二固體抗原/載體蛋白凝膠包含不同於第一純化抗原的第二純化抗原。在一些實施例中，第一固體抗原/載體蛋白凝膠包含第一濃度的第一純化抗原，第二固體抗原/載體蛋白凝膠包含不同於第一濃度的第二濃度的第一純化抗原。
本發明的某些態樣涉及用於抗原的免疫組織化學(IHC)染色的方法，其包括：提供根據上述實施例中任一項的固體抗原/載體蛋白凝膠，其中固體抗原/載體蛋白凝膠含有抗原；提供樣品；使固體抗原/載體蛋白凝膠和樣品與特異性結合抗原的一級抗體接觸；在使固體抗原/載體蛋白凝膠和樣品與一級抗體接觸後，使固體抗原/載體蛋白凝膠和樣品與特異性結合一級抗體的二級抗體接觸，其中可檢測部分與二級抗體偶聯；從固體抗原/載體蛋白凝膠中檢測可檢測部分的信號；從樣品中檢測可檢測部分的信號，其中與從固體抗原/載體蛋白凝膠中檢測到的信號相比，檢測來自樣品的信號表明樣品中存在抗原。在一些實施例中，可檢測部分包含酶，並且其中檢測可檢測部分的信號包括將可檢測部分暴露於酶的顯色、螢光或化學發光受質，並在與酶反應時檢測來自受質的信號。在一些實施例中，可檢測部分包含螢光團、金屬粒子、金屬離子、放射性同位素、核酸、電化學發光報道分子或「量子點」(固態、半導體或碳基螢光奈米粒子)。在一些實施方案中，樣品是組織樣品。
本發明的某些態樣涉及用於抗原的對照免疫組織化學(IHC)染色的方法，其包括：提供根據上述實施例中任一個的第一和第二固體抗原/載體蛋白凝膠，其中第一固體抗原/載體蛋白凝膠含有第一濃度的抗原，並且其中第二固體抗原/載體蛋白凝膠含有高於第一濃度的第二濃度的抗原；使第一和第二固體抗原/載體蛋白凝膠與特異性結合抗原的一級抗體接觸；在第一和第二固體抗原/載體蛋白凝膠與一級抗體接觸後，使第一和第二固體抗原/載體蛋白凝膠與特異性結合一級抗體的二級抗體接觸，其中可檢測部分與二級抗體偶聯；從第一固體抗原/載體蛋白凝膠中檢測可檢測部分的第一信號；從第二固體抗原/載體蛋白凝膠中檢測可檢測部分的第二信號，其中檢測到大於第一信號的第二信號表明抗原的對照IHC染色。在一些實施例中，可檢測部分包含酶，並且其中檢測可檢測部分的信號包括將可檢測部分暴露於酶的顯色、螢光或化學發光受質，並在與酶反應時檢測來自受質的信號。在一些實施例中，可檢測部分包含螢光團、金屬粒子、金屬離子、放射性同位素、核酸、電化學發光報道分子或「量子點」(固態、半導體或碳基螢光奈米粒子)。在一些實施例中，第一濃度為0nM，並且其中檢測到缺乏第一信號表明抗原的對照IHC染色。在一些實施例中，該等方法還包括：提供樣品；使樣品與一級抗體接觸；將樣品與一級抗體接觸後，使樣品與二級抗體接觸；從樣品中檢測可檢測部分的第三信號；並且將第三信號與第一和第二信號進行比較，其中相對於第一和第二信號的量的第三信號的量表示相對於第一和第二固體抗原/載體蛋白凝膠中抗原的量，樣品中抗原的豐度。
本發明的某些態樣涉及用二級抗體進行對照免疫組織化學(IHC)染色的方法，包括：提供根據上述任一實施例的第一和第二固體抗原/載體蛋白凝膠，其中第一固體抗原/載體蛋白凝膠包含具有第一同種型的第一抗體，並且其中第二固體抗原/載體蛋白凝膠包含具有不同於第一同種型的第二同種型的第二抗體；使第一和第二固體抗原/載體蛋白凝膠與特異性結合第一同種型的二級抗體接觸，其中可檢測部分與二級抗體偶聯；從第一固體抗原/載體蛋白凝膠中檢測可檢測部分的信號；檢測到缺乏來自第二固體抗原/載體蛋白凝膠的可檢測部分的信號，其中檢測與第一固體抗原/載體蛋白凝膠相關的信號和缺乏與第二固體抗原/載體蛋白凝膠相關的信號表示用二級抗體進行對照染色。在一些實施例中，可檢測部分包含酶，並且其中檢測可檢測部分的信號包括將可檢測部分暴露於酶的顯色、螢光或化學發光受質，並在與酶反應時檢測來自受質的信號。在一些實施例中，可檢測部分包含螢光團、金屬粒子、金屬離子、放射性同位素、核酸、電化學發光報道分子或「量子點」(固態、半導體或碳基螢光奈米粒子)。
本發明的某些態樣涉及套組(例如，用於抗原的對照免疫組織化學(IHC)染色)，其包含：第一固體凝膠，其包含與選自由白蛋白蛋白(例如，血清白蛋白蛋白)、蛋清蛋白或蛋清蛋白的混合物，和明膠組成之群的載體蛋白交聯的純化抗原，其中純化的抗原以第一濃度存在於第一固體凝膠中；和包含與載體蛋白交聯的純化抗原的第二固體凝膠，其中純化的抗原以不同於第一濃度的第二濃度存在於第二固體凝膠中。在一些實施例中，套組包含：第一固體凝膠，其包含與載體蛋白交聯的純化抗原，該載體蛋白選自由白蛋白蛋白(例如，血清白蛋白蛋白)、蛋清蛋白或蛋清蛋白的混合物、明膠和聚離胺酸組成之群，其中純化的抗原以第一濃度存在於第一固體凝膠中；和包含與載體蛋白交聯的純化抗原的第二固體凝膠，其中純化的抗原以不同於第一濃度的第二濃度存在於第二固體凝膠中。在一些實施例中，第一和第二固體凝膠各自被切成約30nm至約50μm的厚度。在一些實施例中，第一和第二固體凝膠固定到一個或多個固體受質上。在一些實施例中，套組還包含：包含載體蛋白的第三固體凝膠，其中第三固體凝膠不包含純化的抗原。在一些實施例中，將第三固體凝膠切成約30nm至約50μm的厚度。在一些實施例中，將第三固體凝膠固定到固體受質上。
應瞭解，本文所述的各個實施方案的一種、一些或所有特性可組合以形成本發明的其他實施方案。本發明的這些和其他態樣對於熟習此項技術者而言將變得顯而易見。藉由下面的詳細描述進一步描述本發明的這些和其他實施例。
相關申請的交叉引用
本申請案要求2017年12月6日提交的美國臨時申請案第62/595,434號和2018年9月12日提交的美國臨時申請案第62/730,422號的優先權，每個申請案的全部內容以引用方式併入本文。
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所有專利、申請、公佈的申請以及其它公佈以引用的方式全部併入。除非另外定義，否則本文使用的所有技術和科學術語都具有與由本發明所屬領域普通技術人員通常理解的含義相同的含義。
術語「多肽」或「蛋白質」在本文中可互換用於指代任何長度的胺基酸聚合物。所述聚合物可為直鏈型或分支型，其可包含經過修飾的胺基酸，並且其可由非胺基酸中斷。所述術語還涵蓋已經天然修飾或通過干預修飾的胺基酸聚合物；例如，二硫鍵形成、糖基化、脂質化、乙醯化、磷酸化，或任何其他操作或修飾，諸如與標記組分或毒素綴合。在定義內還包括，例如，含有胺基酸的一種或多種類似物(包括，例如，非天然胺基酸，等等)的多肽、以及本領域已知的其他修飾。本文使用的術語「多肽」和「蛋白質」特別包括抗體。
本文的術語「抗原」以最廣義使用，包括多肽和非多肽抗原的各種形式，包括但不限於小肽抗原、全長蛋白質抗原、碳水化合物抗原、脂質抗原和核酸抗原。
術語「抗體」在本文中是以最廣泛意義使用且涵蓋各種抗體結構，包括但不限於單克隆抗體、多克隆抗體、多特異性抗體(例如雙特異性抗體)和抗體片段，只要其展現所需抗原結合活性即可。術語「免疫球蛋白」(Ig)在本文可與抗體互換使用。
「純化的」抗原是指抗原的純度增加，使得其以比其在天然環境中存在的形式和/或在實驗室條件下最初產生和/或合成和/或擴增時更純的形式來存在。純度是一個相對的術語，並且不一定意味著絕對的純度。在一些實施例中，將抗原純化至至少90%、至少95%或至少99%的純度。 II. 固體抗原 / 載體蛋白凝膠和生產方法
本發明的某些態樣涉及固體抗原/載體蛋白凝膠，以及用於產生固體抗原/載體蛋白凝膠的方法。
在一些實施例中，本發明提供了固體抗原/載體蛋白凝膠，其包含純化的抗原和載體蛋白。在一些實施例中，載體蛋白選自白蛋白蛋白(例如血清白蛋白蛋白)、蛋清蛋白或蛋清蛋白的混合物、明膠和聚離胺酸。在一些實施例中，純化的抗原與載體蛋白交聯。如下所述，這些凝膠可用作例如IHC染色或EM成像分析的對照。
本發明證明多種類型的載體蛋白可用於固體抗原/載體蛋白凝膠中。在一些實施例中，載體蛋白是白蛋白蛋白。在一些實施例中，載體蛋白是血清白蛋白蛋白。在一些實施例中，血清白蛋白蛋白質是哺乳動物血清白蛋白蛋白質。血清白蛋白蛋白質的實例包括但不限於小鼠、大鼠、豚鼠、兔、豬、牛、山羊、綿羊、馬和人血清白蛋白。在一些實施例中，載體蛋白是蛋清蛋白。在一些實施例中，載體蛋白是兩種或更多種蛋清蛋白的混合物。在一些實施例中，載體蛋白是明膠。在一些實施例中，載體蛋白是聚離胺酸。
在一些實施例中，固體抗原/載體蛋白凝膠包含濃度大於或等於0.5%、1%、2%、5%、7%、10%、15%或20%(w/v)的載體蛋白。在一些實施例中，固體抗原/載體蛋白凝膠包含濃度小於或等於25%、20%、15%、10%、7%、5%、2%或1%(w/v)的載體蛋白。也就是說，固體抗原/載體蛋白凝膠可以包含一定濃度範圍的任何濃度的載體蛋白，該範圍的上限為25%、20%、15%、10%、7%、5%、2%或1%(w/v)，並且獨立選擇的下限為0.5%、1%、2%、5%、7%、10%、15%或20%(w/v)，其中下限小於上限。在一些實施例中，載體蛋白包含白蛋白蛋白(例如，血清白蛋白蛋白)，並且固體抗原/載體蛋白凝膠包含大於2%(w/v)的載體蛋白，例如，2%至25%(w/v)。在一些實施例中，載體蛋白包含蛋清蛋白或蛋清蛋白的混合物，並且固體抗原/載體蛋白凝膠包含大於2%(w/v)的載體蛋白，例如2%至25%(w/v)。在一些實施例中，載體蛋白包含明膠，並且固體抗原/載體蛋白凝膠包含大於0.5%(w/v)的載體蛋白，例如，0.5%至25%(w/v)或約10%(w/v)。
在一些實施例中，固體抗原/載體蛋白凝膠含有濃度為至少約25nM的抗原。在另一個實施例中，固體抗原/載體蛋白凝膠含有濃度為約25nM的抗原。在另一個實施例中，固體抗原/載體蛋白凝膠含有濃度為約15、20、25、30、35、40、50、60、75、80、90或100nM或更高的抗原。在另一個實施例中，固體抗原/載體蛋白凝膠含有濃度為至少約10nM、15nM、20nM或25nM至約100nM的抗原。如本文所述，本發明的固體抗原/載體蛋白凝膠可包含廣泛範圍濃度的抗原，這取決於例如檢測方法的靈敏度、凝膠的所需應用等。
在一個實施例中，該等方法包括兩種或更多種抗原/載體蛋白凝膠。在一個實施例中，使用兩種凝膠，其中每種凝膠視情況具有不同濃度的抗原。在另一個實施例中，使用三種凝膠，其中每種凝膠視情況具有不同濃度的抗原。實際上，包含不同濃度的抗原的多種凝膠可能是有用的，例如，作為IHC染色的對照以代表一系列抗原濃度。
在一些實施例中，抗原包含多肽抗原(例如，肽抗原或全長蛋白質抗原)。在一些實施例中，多肽抗原包含N-末端酪胺酸、C-末端半胱胺酸或兩者(例如，用於將抗原與載體蛋白化學交聯)。在一些實施例中，N-末端酪胺酸和/或C-末端半胱胺酸與載體蛋白交聯。例如，C-末端半胱胺酸可用於使抗原與載體蛋白交聯。多種半胱胺酸反應性試劑是本領域已知的，包括但不限於巰基反應性交聯劑反應性基團，例如鹵代乙醯基，馬來醯亞胺(例如，磺基-SMCC及其類似物)，氮丙啶，丙烯醯基，芳基化劑，乙烯基碸，吡啶基二硫化物，TNB-硫醇和二硫化物還原劑。
在一些實施例中，固體抗原/載體蛋白凝膠已用固定劑固定，例如，如下所述。在一些實施例中，固定劑是交聯固定劑(例如，基於醛的固定劑)。在一些實施例中，固定劑不是交聯固定劑(例如，沉澱性固定劑，例如Carnoy)。如本文所述，含有載體蛋白和抗原的固體凝膠可以藉由加熱或藉由向混合物中加入沉澱固定劑使載體蛋白和/或抗原變性和沉澱，從而使抗原固定在蛋白凝膠中來製備。對於一些抗原(特別是小分子大小的抗原)，將抗原與載體蛋白交聯(在藉由使載體蛋白變性來形成凝膠的過程中或之後)被認為有助於將抗原保留在凝膠中並且在所得到的切片中，例如，在包埋、切片和/或染色過程中。
在一些實施例中，抗原包含非多肽抗原。非多肽抗原的實例包括但不限於碳水化合物、脂質和核酸。
在一些實施例中，固體抗原/載體蛋白凝膠的厚度為約30nm至約50μm。固體抗原/載體蛋白凝膠的合適厚度可取決於例如應用。在一些實施例中，固體抗原/載體蛋白凝膠的厚度大於或等於約0.03、1、2、4、6、8、10、12、14、16、18、20、22、24、26 ，28、30、32、34、36、38、40、42、44、46或48μm。在一些實施例中，固體抗原/載體蛋白凝膠的厚度小於或等於約50、48、46、44、42、40、38、36、34、32、30、28、26、24、22、20、18、16、14、12、10、8、6、4、2或1μm。也就是說，固體抗原/載體蛋白凝膠的厚度可以具有50、48、46、44、42、40、38、36、34、32、30、28、26、24、22、20、18、16、14、12、10、8、6、4、2或1μm的上限以及0.03、1、2、4、6、8、10、12、14、16、18、20、22、24、26、28、30、32、34、36、38、40、42、44、46或48μm的獨立選擇的下限，其中下限小於上限。例如，用於IHC染色的固體抗原/載體蛋白凝膠可具有例如約2μm至約30μm的厚度，而用於EM的固體抗原/載體蛋白凝膠可具有例如約30nm和約50μm或約30nm和約100nm之間的厚度。用於將本發明的固體抗原/載體蛋白凝膠切片的方法描述如下。
在一些實施例中，固體抗原/載體蛋白凝膠已經進行抗原修復。用於抗原修復的示例性方法在下面更詳細地描述。
在一些實施例中，將固體抗原/載體蛋白凝膠包埋在本發明的介質中，例如石蠟(例如，包埋在石蠟塊中)；環氧樹脂，丙烯酸樹脂或塑性樹脂(例如EPON™樹脂，甲基丙烯酸酯，LR White樹脂，Araldite®，Spurr塑膠，LOWICRYL®等)；合成蠟；石蠟和塑性聚合物或共聚物合金的混合物；聚乙二醇；或GACH包埋介質(戊二醛 - 碳醯肼)。在一些實施例中，固體抗原/載體蛋白凝膠固定在固體受質上，包括但不限於載玻片(例如，用於IHC)、支撐物、網格或短柱(例如，用於EM)。
在一些實施例中，產生固體抗原/載體蛋白凝膠的方法包括將純化的抗原與包含載體蛋白的液體溶液混合以產生抗原/載體蛋白液體溶液並加熱抗原/載體蛋白液體溶液以形成固體抗原/載體蛋白凝膠。在一些實施例中，載體蛋白選自白蛋白蛋白(例如血清白蛋白蛋白)、蛋清蛋白或蛋清蛋白的混合物和明膠。
在一些實施例中，抗原/載體蛋白液體溶液包含濃度大於或等於0.5%、1%、2%、5%、7%、10%、15%或20%(w/v)的載體蛋白。在一些實施例中，抗原/載體蛋白液體溶液包含濃度小於或等於25%、20%、15%、10%、7%、5%、2%或1%(w/v)的載體蛋白。也就是說，抗原/載體蛋白液體溶液可以包含一定濃度範圍的任何濃度的載體蛋白，該範圍的上限為25%、20%、15%、10%、7%、5%、2%、或1%(w/v)，並且獨立選擇的下限為0.5%、1%、2%、5%、7%、10%、15%或20%(w/v)，其中下限小於上限。在一些實施例中，載體蛋白包含白蛋白蛋白(例如，血清白蛋白蛋白)，並且抗原/載體蛋白液體溶液包含大於2%(w/v)的載體蛋白，例如，在2%和25%(w/v)之間。在一些實施例中，載體蛋白包含蛋清蛋白或蛋清蛋白的混合物，並且抗原/載體蛋白液體溶液包含大於2%(w/v)的載體蛋白，例如，2%至25%(w/v)之間。在一些實施例中，載體蛋白包含明膠，並且抗原/載體蛋白液體溶液包含大於0.5%(w/v)的載體蛋白，例如，0.5%至25%(w/v)或約10%(w/v)。
在一些實施例中，本發明的方法包括(例如，在加熱抗原/載體蛋白液體溶液之前)使用半胱胺酸反應性試劑使抗原與載體蛋白交聯。多種半胱胺酸反應性試劑是本領域已知的，包括但不限於巰基反應性交聯劑反應性基團，例如鹵代乙醯基，馬來醯亞胺(例如，磺基-SMCC及其類似物)，氮丙啶，丙烯醯基，芳基化劑，乙烯基碸，吡啶基二硫化物，TNB-硫醇和二硫化物還原劑。
在一些實施例中，本發明的方法包括將抗原與載體蛋白固定。在一些實施例中，固定劑包含在抗原/載體蛋白液體溶液中。在一些實施例中，固定劑是交聯固定劑。在一些實施例中，固定劑是非交聯固定劑。合適的固定劑的實例包括但不限於甲醛，福爾馬林，多聚甲醛(PFA)，戊二醛，Davidson固定劑，Bouin固定劑，Karnovski固定劑(例如，½強度Karnovski固定劑)，Zenker溶液，Helly溶液，Carnoy溶液，Zinc福爾馬林，中性 - 緩衝福爾馬林(NBF)，高碘酸鹽 - 離胺酸 - 多聚甲醛(PLP)，Zamboni固定劑，二甲基亞碸酸鹽(DMS)，丙酮，醇類(如甲醇或乙醇)和鋅鹽(如乙酸鋅，氯化鋅，三氟乙酸鋅等)。在某些實施例中，固定劑包含甲醛(例如，濃度為至少約1%或至少約2%)。
在一些實施例中，使用選擇性化學將抗原與載體蛋白交聯，包括但不限於疊氮化物 - 炔加成。在一些實施例中，選擇性化學用於將非蛋白質抗原交聯至載體蛋白，例如碳水化合物或脂質抗原。
在一些實施例中，本發明的方法包括使固體抗原/載體蛋白凝膠脫水。適於脫水的化合物是本領域已知的，可包括例如醇如乙醇或甲醇。在一些實施例中，本發明的方法包括包埋固體抗原/載體蛋白凝膠。在一些實施例中，在脫水後將固體抗原/載體蛋白凝膠包埋。例如，在一些實施例中，藉由暴露於一系列增加或分級醇(例如，一系列增加的乙醇濃度)，然後用二甲苯來交換醇，並且用石蠟來交換二甲苯，使固體抗原/載體蛋白凝膠脫水。多種介質是本領域已知的並且可用於包埋，包括但不限於石蠟(例如，包埋在石蠟塊中)；環氧樹脂，丙烯酸樹脂或塑性樹脂(例如EPON™樹脂，甲基丙烯酸酯，LR White樹脂，Araldite®，Spurr塑膠，LOWICRYL®等)；合成蠟；石蠟和塑性聚合物或共聚物合金的混合物；聚乙二醇；或GACH包埋介質(戊二醛 - 碳醯肼)。
在一些實施例中，載體蛋白包含明膠，並且本發明的方法包括冷卻加熱的抗原/載體蛋白液體溶液以形成固體抗原/載體蛋白凝膠。在一些實施例中，該等方法還包括將固體抗原/載體蛋白凝膠與固定劑一起溫育並使固體抗原/載體蛋白凝膠脫水。在一些實施例中，抗原/載體蛋白液體溶液包含濃度大於或等於約0.5%(w/v)的載體蛋白。在一些實施例中，將抗原/載體蛋白液體溶液加熱至至少約65℃(例如，至少約6分鐘)。
在一些實施例中，載體蛋白包含聚離胺酸，例如濃度為約14 mg/mL。
在一些實施例中，本發明的方法包括將固體抗原/載體蛋白凝膠在包埋介質(例如，液體包埋介質)中溫育。多種包埋介質是本領域已知的，並且可以包括但不限於最佳切割溫度(OCT)化合物(例如，Tissue-Tek®
O.C.T.化合物或Tissue-plus®
O.C.T化合物)，PELCO®
冷凍包埋化合物，PolarStat™或PolarStat Plus™包埋介質，和組織冷凍介質或TFM™。這些包埋介質可含有例如水溶性二醇和樹脂；示例性包埋介質OCT化合物包括5-15%的聚乙烯醇和1-10%的聚乙二醇。在一些實施例中，本發明的方法包括冷凍固體抗原/載體蛋白凝膠(例如，在包埋介質中溫育固體抗原/載體蛋白凝膠之後)。在一些實施例中，本發明的方法包括冷凍未固定的固體抗原/載體蛋白凝膠(例如，不包括固定劑)，類似於冷凍的、未固定的新鮮組織樣品的製備。
在一些實施例中，本發明的方法包括將固體抗原/載體蛋白凝膠切片成一個或多個固體抗原/載體蛋白凝膠切片。在一些實施例中，一種或多種固體抗原/載體蛋白凝膠切片的厚度為約30nm至約50μm。在一些實施例中，一種或多種固體抗原/載體蛋白凝膠切片的厚度大於或等於約0.03、0.05、0.1、0.2、0.3、0.4、0.5、0.6、0.7、0.8、0.9、1、2、4、6、8、10、12、14、16、18、20、22、24、26、28、30、32、34、36、38、40、42、44、46或48μm。在一些實施例中，一種或多種固體抗原/載體蛋白凝膠切片的厚度小於或等於約50、48、46、44、42、40、38、36、34、32、30、28、26、24、22、20、18、16、14、12、10、8、6、4、2、1、0.9、0.8、0.7、0.6、0.5、0.4、0.3、0.2或0.1 μm。也就是說，一種或多種固體抗原/載體蛋白凝膠切片的厚度可以具有50、48、46、44、42、40、38、36、34、32、30、28、26、24、22、20、18、16、14、12、10、8、6、4、2、1、0.9、0.8、0.7、0.6、0.5、0.4、0.3、0.2或0.1 μm的上限和0.03、0.05、0.1、0.2、0.3、0.4、0.5、0.6、0.7、0.8、0.9、1、2、4、6、8、10、12、14、16、18、20、22、24、26、28、30、32、34、36、38、40、42、44、46或48μm的獨立選擇的下限，其中下限小於上限。例如，用於IHC染色的固體抗原/載體蛋白凝膠切片可具有例如約2μm至約30μm的厚度，而用於EM的固體抗原/載體蛋白凝膠切片可具有例如在約30nm和約50μm之間或在約30nm和約100nm之間的厚度。用於將本發明的固體抗原/載體蛋白凝膠切片的儀器是本領域已知的，並且可以包括但不限於切片機、低溫恆溫器(用於冷凍凝膠)、刀(例如，金剛石、玻璃或藍寶石)，以及類似物。在一些實施例中，在切片之前，將固體抗原/載體蛋白凝膠脫水、包埋、固定、冷凍或其組合。
在一些實施例中，本發明的方法包括使固體抗原/載體蛋白凝膠經受抗原修復。本領域已知多種抗原修復方法。在一些實施例中，使固體抗原/載體蛋白凝膠經受抗原修復包括在液體溶液中加熱固體抗原/載體蛋白凝膠(例如，熱誘導的表位修復)，例如藉由煮沸。在一些實施例中，液體溶液包含緩衝液，例如Tris/EDTA或檸檬酸鈉緩衝液。在一些實施例中，使固體抗原/載體蛋白凝膠經受抗原修復包括用一種或多種蛋白水解酶(例如胰蛋白酶、蛋白酶K、胃蛋白酶、無花果蛋白酶或鏈黴蛋白酶)或抗原修復試劑(例如鹽酸，甲酸、十二烷基硫酸鈉(SDS)、檸檬酸鹽緩衝液、EDTA、檸檬酸鹽-EDTA、Tris、Tris-EDTA、Tris-HCl、Tris緩衝鹽水或檸康酐)處理。關於抗原修復的其他描述，參見例如Shi, S.R. 等人 (2011)J. Histochem. Cytochem.
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在一些實施例中，本發明的方法包括阻斷固體抗原/載體蛋白凝膠。如本領域所知，阻斷(例如，在IHC染色之前)藉由阻止與特異性抗原:抗體相互作用無關的位點的結合來減少與抗原的非特異性相互作用。多種合適的阻斷試劑是本領域已知的，並且可以包括但不限於血清或蛋白質溶液(例如，包含血清白蛋白、明膠、脫脂奶粉等)。
在一些實施例中，本發明的方法包括固定固體抗原/載體蛋白凝膠(例如，藉由在抗原/載體蛋白液體溶液中包含固定劑)，使固體抗原/載體蛋白凝膠脫水，包埋脫水的固體抗原/載體蛋白凝膠，將具有包埋的固體抗原/載體蛋白凝膠的石蠟塊切成一個或多個切片，使一個或多個切片經受抗原修復，並在抗原修復後阻斷一個或多個切片。在其他實施例中，本發明的方法包括將固體抗原/載體蛋白凝膠在液體包埋介質中溫育，將固體抗原/載體蛋白凝膠在包埋介質中冷凍，將冷凍的抗原/載體蛋白凝膠切成一個或多個切片，並阻斷一個或多個切片。
本發明的其他態樣涉及組織微陣列(TMA)，其包含一種、兩種或更多種本發明的固體抗原/載體蛋白凝膠。例如，可以藉由製備本發明的固體抗原/載體蛋白凝膠(例如，如上所述，包埋在石蠟塊中)，衝壓包含固體抗原/載體蛋白凝膠的核心，並將核心轉移到受體TMA來製備本發明的TMA。在一些實施例中，核心的直徑為約1 mm。以下描述製備TMA的示例性方法，例如，藉由將核心從供體石蠟塊轉移至受體TMA塊，然後加熱(例如，在37℃過夜，然後在70℃下10分鐘)，冷卻和將受體TMA塊切片。在一些實施例中，TMA包括具有不同抗原的本發明的兩種或更多種固體抗原/載體蛋白凝膠。在一些實施例中，TMA包括兩種或更多種本發明的固體抗原/載體蛋白凝膠，其具有不同濃度的相同抗原。在一些實施例中，TMA還包含一種或多種取向參考，例如，包含用於識別的有色顏料。在一些實施例中，TMA是組織學載玻片上的TMA切片。不希望受理論束縛，認為本發明的固體抗原/載體蛋白凝膠特別有利於用於TMA，例如用於提供一系列表位濃度和/或類型。該範圍也可以在組織切片附近提供，從而為定量分析提供方便的參考。 III. 用於固體抗原 / 載體蛋白凝膠的用途
固體抗原/載體蛋白凝膠(例如，如以上部分II中描述和/或以下實施例中舉例說明)可用於多種應用，包括但不限於IHC或EM分析的對照。
在一些實施例中，用於抗原的對照免疫組織化學(IHC)染色的方法包括提供本發明的多種固體抗原/載體蛋白凝膠(例如，兩種或更多種，三種或更多種，四種或更多種，五種或更多種等)，代表不同濃度的所關注抗原。例如，該等方法可包括提供用不同濃度的純化抗原製備的兩種固體抗原/載體蛋白凝膠。在一些實施例中，該等方法包括使固體抗原/載體蛋白凝膠與特異性結合抗原並與可檢測部分偶合的一級抗體接觸。在其他實施例中，該等方法包括使固體抗原/載體蛋白凝膠與特異性結合抗原的一級抗體接觸，然後使固體抗原/載體蛋白凝膠與特異性結合一級抗原並偶合至可檢測部分的二級抗體接觸。在一些實施例中，該等方法還包括從多種固體抗原/載體蛋白凝膠中的一種或多種檢測可檢測部分的信號。然後可以檢測從多種固體抗原/載體蛋白凝膠中檢測到的信號量，並視情況與多種固體抗原/載體蛋白凝膠中每種中存在的抗原的量或濃度進行比較，以提供各種水準抗原的對照IHC染色。
在一些實施例中，抗原/載體蛋白凝膠之一不含抗原(例如，0nM)，並且來自該凝膠的IHC染色的可檢測信號的缺失表明樣品的陰性對照或背景IHC染色。在一些實施例中，該等方法還包括使樣品與特異性結合抗原並與可檢測部分偶合的一級抗體接觸，或與特異性結合抗原的一級抗體和特異性結合一級抗原並且與可檢測部分偶合的二級抗體接觸，並從樣品中檢測可檢測部分的信號。然後可以將從樣品中檢測到的信號量與從固體抗原/載體蛋白凝膠中檢測到的信號量進行比較，例如，將樣品中存在的抗原量與抗原/載體蛋白凝膠中存在的抗原的已知濃度或量進行比較。
在一些實施例中，用二級抗體進行對照免疫組織化學(IHC)染色的方法包括提供本發明的多種固體抗原/載體蛋白凝膠(例如，兩種或更多種，三種或更多種，四種或更多種，五種或更多種等)，代表不同的抗體同種型。例如，該等方法可包括提供由表示不同抗體同種型的抗體製備的兩種固體抗原/載體蛋白凝膠。在一些實施例中，方法包括使固體抗原/載體蛋白凝膠與特異性結合抗體同種型之一並與可檢測部分偶聯的二級抗體接觸。對於二級抗體的對照染色，可以從多種固體抗原/載體蛋白凝膠中檢測信號。在該實施例中，二級抗體特異性結合同源抗體同種型，並且從缺乏同源抗體同種型的凝膠中檢測到的任何信號表明背景染色。因此，檢測與含有同源抗體同種型的固體抗原/載體蛋白凝膠相關的信號和與缺乏同源抗體同種型的固體抗原/載體蛋白凝膠相關的信號的缺乏表明用二級抗體進行對照染色。
在一些實施例中，用於抗原的免疫組織化學(IHC)染色的方法包括提供一種或多種含有抗原的固體抗原/載體蛋白凝膠和樣品；使固體抗原/載體蛋白凝膠和樣品與特異性結合抗原並與可檢測部分偶合的一級抗體接觸，或使固體抗原/載體蛋白凝膠和樣品與特異性結合抗原的一級抗體接觸並使固體抗原/載體蛋白凝膠和樣品與特異性結合一級抗體並與可檢測部分偶合的二級抗體接觸；從固體抗原/載體蛋白凝膠中檢測可檢測部分的信號；從樣品中檢測可檢測部分的信號。因此，一種或多種固體抗原/載體蛋白凝膠可用作樣品的IHC染色的陽性對照。
在圖 1
中顯示了用於抗原的IHC染色的方法100的示例性流程圖，該抗原例如樣品和本發明的固體抗原/載體蛋白凝膠中的抗原(用作抗原樣品染色的對照)。在方框102處，收集組織以提供用於分析的樣品，和/或產生本發明的固體抗原/載體蛋白凝膠(例如，如以上部分II中所述)。在一些實施例中，固體抗原/載體蛋白凝膠含有所關注抗原(例如，純化的抗原)，其可以或可以不存在於樣品中。視情況，在方框104，固定樣品和/或固體抗原/載體蛋白凝膠(例如，如上文部分II中所述)。在一些實施例中，將固體抗原/載體蛋白凝膠與固定劑一起溫育。在其他實施例中，用於製備固體凝膠的抗原/載體蛋白液體溶液包含固定劑。視情況，在方框106處，包埋樣品和/或固體抗原/載體蛋白凝膠(例如，如以上部分II中所述)。作為方框104的任選替代方案，在方框106處，可以將樣品和/或固體抗原/載體蛋白凝膠在包埋介質中冷凍。視情況，在方框108處，對樣品和/或固體抗原/載體蛋白凝膠進行切片(例如，如以上部分II中所述)。視情況，在方框110，對樣品和/或固體抗原/載體蛋白凝膠進行抗原修復和阻斷(例如，如上文部分II所述)。
在一些實施例中，如方框112所示，使樣品和固體抗原/載體蛋白凝膠與特異性結合抗原的一級抗體接觸。在一些實施例中，一級抗體包含可檢測部分。在其他實施例中，如方框114所示，使樣品和固體抗原/載體蛋白凝膠與特異性結合一級抗體的二級抗體接觸。在一些實施例中，二級抗體包含與二級抗體偶聯的可檢測部分(在該實例中為生物素)。
在一些實施例中，從固體抗原/載體蛋白凝膠和/或樣品中檢測可檢測部分的信號。如下所述，考慮了多種可檢測部分。在該實例中，使用顯色檢測方法。在方框116處，使樣品和固體抗原/載體蛋白凝膠與結合二級抗體的酶複合物接觸(例如，結合生物素化二級抗體的鏈黴抗生物素蛋白偶聯的酶複合物)。在方框118處，使樣品和固體抗原/載體蛋白凝膠與顯色受質或顯色團溶液接觸，顯色受質或顯色團溶液在與酶複合物溫育後導致形成有色沉澱物，表明固體抗原/載體蛋白凝膠和樣品(如果存在抗原)中存在抗原。
在一些實施例中，藉由直接檢測，例如藉由將凝膠與特異性結合抗原並偶合至可檢測部分的抗體或其他抗原結合部分一起溫育，檢測本發明的固體抗原/載體蛋白凝膠中抗原的存在。在其他實施例中，藉由間接檢測，例如藉由將凝膠與特異性結合抗原的一級抗體或其他抗原結合部分和特異性結合一級抗體或其他抗原結合部分的二級抗體或其他抗原結合部分一起溫育，檢測本發明的固體抗原/載體蛋白凝膠中抗原的存在，其中二級抗體或其他抗原結合部分與可檢測部分偶合。
預期多種可檢測部分與本發明的固體抗原/載體蛋白凝膠一起使用。在一些實施例中，可檢測部分包含酶，例如辣根過氧化物酶(HRP)或鹼性磷酸酶(AP)。然後藉由將可檢測部分暴露於酶的顯色受質並在與酶反應時檢測來自顯色受質的信號(例如，如上文針對方框116和118所述)來檢測信號。顯色受質的實例包括但不限於3,3'-二胺基聯苯胺(DAB)，其藉由HRP轉化為棕色產物；和3-胺基-9-乙基咔唑(AEC)，其藉由AP轉化為紅色產物。或者，過氧化物酶可以化學活化與幾種報道分子之一(例如螢光分子)偶聯的酪胺部分；然後，活化的酪胺偶聯物可以共價偶合至樣品中的附近分子，在過氧化物酶的位置產生可檢測的信號。間接檢測也可與顯色染色一起使用。例如，生物素化的二級抗體可以與抗生物素蛋白或鏈黴抗生物素蛋白標記的酶複合物一起溫育，聚合物如葡聚糖可以與一種或多種二級抗體和一種或多種酶複合物偶合，或酶複合物可以直接聚合至二級抗體上。在一些實施例中，可檢測部分包含螢光團，例如螢光素(FITC)，羅丹明或其衍生物，TRITC，花菁(Cy3)，藻紅蛋白(R-PE)和CF™等。例如，螢光團可以與一級或二級抗體偶聯，或與酪胺部分偶聯，酪胺部分在被過氧化物酶活化後可以共價偶合到樣品上。在一些實施例中，可檢測部分包含金屬顆粒，例如金。例如，金顆粒可以與一級或二級抗體偶聯，並例如藉由免疫EM成像。在一些實施例中，可檢測部分包含放射性同位素，例如35
S、125
I或131
I，並且例如藉由放射免疫檢測來成像。例如，放射性同位素可以與一級或二級抗體偶聯。在一些實施例中，可檢測部分包含核酸，例如DNA或RNA。例如，核酸可以與一抗或二級抗體偶聯。一級或二級抗體可以與用質譜儀或質量流式細胞儀檢測的金屬離子偶合[a la
CYTOF和MIBI；參見Giesen等人Nat Methods. 2014年4月；11(4):417-22和Angelo等人，Nat Med. 2014年4月；20(4):436-42]。一級或二級抗體可以與藉由螢光成像可檢測的固態、半導體或碳基奈米粒子(例如「量子點」)偶合[參見Wu等人，Nat Biotechnol. 2003年1月；21(1):41-6]。一級或二級抗體可以與過氧化物酶如辣根過氧化物酶偶合，然後藉由與化學發光受質一起溫育來檢測。一級或二級抗體可以與電化學發光報道分子(例如，釕；參見Valenti等人，J Am Chem Soc. 2017年11月8日)偶合。 IV. 套組和製品
本發明的某些態樣涉及包含固體抗原/載體蛋白凝膠的套組或製品。
在一些實施例中，本發明的套組包含本發明的第一固體抗原/載體蛋白凝膠，其包含純化的抗原，和本發明的第二固體抗原/載體蛋白凝膠，其包含與第一固體抗原/載體蛋白凝膠的純化抗原濃度不同的濃度的純化抗原。
在一些實施例中，將第一和/或第二固體抗原/載體蛋白凝膠切片，例如，如以上部分II中所述。在一些實施例中，將第一和/或第二固體抗原/載體蛋白凝膠固定在固體受質上，例如，如上文部分II所述。
在一些實施例中，本發明的套組還包含本發明的第三固體抗原/載體蛋白凝膠，其不含純化的抗原(例如，用作陰性對照)。在一些實施例中，將第三固體抗原/載體蛋白凝膠切片，例如，如上文部分II中所述。在一些實施例中，將第三固體抗原/載體蛋白凝膠固定在固體受質上，例如，如上文部分II所述。
在一些實施例中，套組可以進一步包含使用套組的說明書，例如，根據上文部分III中描述的任何方法。
實施例
藉由參考以下實施例將更完全地理解本發明。然而，實施例不應解釋為限制本發明的範圍。應瞭解，本文所述的實施例和實施方案僅用於例示性目的，並且建議本領域的技術人員根據其進行各種修改或變化，並且它們將包括在本申請的精神和權限以及所附權利要求書的範圍內。實施例 1 ：驗證 BSA 凝膠作為 IHC 對照的平台方法
圖 1
顯示了組織樣品中IHC染色的示例性工作流程100。重要的是，IHC染色不僅表明標靶的表達水準，還表明其亞細胞和組織分佈。
以下示例描述了用於生成IHC對照的新平台方法，該等對照可適用於各種標靶。該方法使用人BCL2進行驗證，BCL2是可以識別3+陽性對照組織的標靶(例如，人類慢性淋巴細胞白血病腫瘤樣品在該測定中通常得分為3+)，但該等組織難以獲得或對於作為染色對照的常規使用而言，受到道德考慮因素的限制。使用小鼠和大鼠IgG和所關注的人蛋白也證明了該方法的通用性。
方法
在1.5 mL微量離心管中，將含有約0至10-4
M靶表位的約0-0.5mg抗原與0.5mL 25%BSA的PBS溶液混合。向管中加入0.5mL 37%甲醛。將管在85℃加熱10分鐘，然後在室溫下放置過夜，如果含有固定劑(例如福爾馬林)則固化。將所得凝膠從管中取出並置於10%中性緩衝福爾馬林(NBF)中。隨後，將凝膠藉由分級醇至二甲苯來脫水，用溫石蠟浸漬，包埋在石蠟塊中，在切片機上切片，並根據標準IHC方法，使用原代小鼠單株抗BCL2抗體124和辣根過氧化物酶(HRP)/ 3,3'-二胺基聯苯胺(DAB)顯色酶/受質系統來染色。
IF檢測試驗是在Ventana Discovery Ultra自動染色儀上開發的。切下含有靶BSA /肽樣品的4微米切片，脫石蠟並用CC1細胞調節溶液預處理。將原代小鼠單株抗BCL2抗體124在37℃溫育16分鐘，用OmniMAP抗小鼠HRP檢測系統檢測8分鐘，然後用Ventana Discovery Red 610檢測系統檢測16分鐘。
使用配備有20X 0.75NA物鏡和螢光模塊的Hamamatsu Nanozoomer-XR數位載玻片掃描儀以0.46微米/像素的掃描分辨率獲得全載玻片明場和免疫螢光影像。進行明場成像並用於聚焦。適用時，使用TRITC濾光片在1x曝光(3.4 ms光子收集)和1x增益下獲得免疫螢光信號。使用DAPI(2x曝光，6.8 ms光子收集，2x增益)和CFP濾光器(4x曝光，13.6 ms光子收集，2x增益)捕獲自發螢光。對於所有免疫螢光獲取，照射功率設定為50%。使用Matlab版本9.3進行影像分析。所關注區域(ROI)被手動標記(僅明場掃描)或使用自發螢光通道上的閾值處理和形態學過濾產生並轉移到TRITC通道上用於強度測量。平均灰度強度以8位深度計算。藉由對ROI內的所有像素吸光度或發射率值求和(藉由下面的相應自然對數公式計算)並歸一化為總ROI像素計數來計算平均光學吸光度(明場DAB標記的)或發射率(螢光標記的)。使用值1來近似估計所有零像素灰度強度值。明場像素吸光度= log(255 /像素灰度強度)。螢光像素發射率= log(像素灰度強度)。
對於驗證實驗，如上在微量離心管中產生BSA凝膠樣品，將其包埋在石蠟塊中，然後用於產生從石蠟塊切下的600微米直徑圓柱的組織微陣列，並使用標準組織微陣列技術重新包埋在陣列中。
對於BCL2實驗，使用包含序列Ac-YGSG GAAPAPGIFSSQPG
GSGC-醯胺(SEQ ID NO：1)的肽。加下劃線的胺基酸對應於UniProt登錄號P10415中的人BCL2序列的野生型(未突變的)胺基酸41-54。該肽還包括具有乙醯基-Y(酪胺酸)的胺基末端接頭序列(Ac-YGSG)(SEQ ID NO：6)，其允許與醛(例如甲醛)偶合，和具有C(半胱胺酸)-醯胺的羧基末端接頭序列(GSGC-醯胺)(SEQ ID NO：7)，其可與各種交聯劑反應，例如含有馬來醯亞胺、鹵代乙醯基或吡啶基二硫化物的化合物。
結果
如上所述製備BSA /肽凝膠。在產生凝膠之前將抗原(例如肽)與BSA在液體溶液中混合，使肽能夠均勻混合。得到的凝膠(圖 2A
)可以構造成任何所需的形狀(在該實施例中，凝膠以1.5mL微量離心管的形狀來產生)。凝膠也可以切片(圖 2B 和 2C
)並進行典型的IHC處理步驟，例如抗原修復、阻斷、一級/二級抗體溫育和檢測(例如，使用酶/受質方法)。例如，圖 2D
顯示了製備用於脫水和石蠟處理的切片凝膠部分，圖 2E
顯示了包埋在石蠟供體塊中的切片凝膠部分。圖 2F
顯示了由各種石蠟凝膠供體塊產生的TMA，以及含有用於取向參考的黑色和綠色顏料的核心。與交聯到溶菌酶相比，肽抗原能夠更有效地交聯到BSA，從而在IHC處理和檢測期間將抗原保留在BSA凝膠中。
為了檢查肽/BSA凝膠作為IHC對照的可行性，將不同濃度的BCL2肽混合到BSA凝膠中，然後根據標準IHC技術切片和製備。使用針對人BCL2蛋白的BCL2一級抗體(「CONFIRM抗bcl-2(124)小鼠單株一級抗體」BCL2，來自Ventana Medical Systems)，生物素化的二級抗體，抗生物素蛋白偶聯的HRP作為顯色報道分子和DAB作為顯色受質來檢測BCL2。如圖 3A
所示，從0到0.5mg/mL(2.5 * 10-4
M)連續增加BCL2水準導致IHC染色強度的分級增加。缺乏肽的陰性對照未引起染色，而BCL2肽在5x10-5
mg/mL(對應於25nM肽濃度)至0.5mg/mL(對應於2.5 * 10-4
M肽濃度) 的整個測試範圍內可溶解。重要的是，在不同的肽濃度下分別實現1+、2+和3+ BCL2染色水準。由於在易於獲得的組織樣品中通常難以發現一致且均勻的3+ BCL2染色，因此該替代方法提供了比測定不同類型組織更容易且更標準化的方式來獲得BCL2表達對照的梯度。
為了檢查染色的一致性，藉由如上所述將BCL2肽/BSA凝膠染色並使用MATLAB分析所得影像來進行六個獨立實驗。對於隨著肽濃度而變化的光密度(OD；圖 3B
)和影像強度(圖 3C
)的分析表明在各個實驗之間，染色是一致的。
還對BCL2肽/BSA凝膠進行定量免疫螢光染色。與使用顯色染色獲得的結果一樣，IF分析顯示隨著肽濃度而變化的染色強度的分級增加(圖 3D
)。光學發射率(圖 3H
)和信號強度(圖 3J
)的分析再次證明了染色的一致、分級增加。如所預期的，用初始對照一級抗體的陰性對照染色(圖 3F 、 3I 和 3K
)或凝膠的自發螢光(圖 3E 和 3G
)顯示強度沒有增加。
還檢查了二級抗體對照。使用驢抗小鼠二級抗體，容易檢測到包埋在BSA凝膠中的小鼠IgG，而大鼠IgG沒有給出可檢測的信號，如圖 4A
所示。類似地，使用驢抗大鼠二級抗體，容易檢測到包埋在BSA凝膠中的大鼠IgG，而小鼠IgG沒有給出可檢測的信號(圖 4B
)。這證實了BSA凝膠方法的特異性，證明二級抗體不與缺乏抗體標靶的肽/BSA凝膠非特異性結合。
為了檢查染色的特異性，合成了在抗BCL2純系124抗體表位中具有臨床相關單胺基酸取代的六種肽，如上所述包埋在BSA中並染色。如圖 4C
所示(並且見於圖 3D
、3H
和3J
)，這些突變顯示出對IHC染色的明顯影響(即，信號強度的不同程度的降低，取決於特定的胺基酸取代)，證明了量化特定胺基酸取代對染色強度的影響的實用性。
接下來，藉由針對所關注標靶的特異性檢測，篩選幾種未表徵的抗體來檢查肽/BSA凝膠平台的通用性。藉由IHC篩選從用人KSR2免疫的小鼠分離的二十七(27)個抗體純系，用於檢測陽性和陰性對照(圖 5A-5D
)。對於陰性對照，使用沒有添加其他蛋白質或肽的BSA凝膠。對於陽性對照，產生具有用於使小鼠免疫的人KSR2蛋白的BSA凝膠。正如預期的那樣，因為在單獨的過程中選擇用於結合未固定的人類靶蛋白的候選抗體純系，所以大多數抗體純系能夠檢測到蛋白質/BSA凝膠中的人類蛋白質(正如某些強度高於背景的DAB信號所證明)。然而，最適合用於IHC測定的抗體應該對陰性對照顯示很少或沒有可檢測的信號，同時顯示對於陽性對照的強染色。在測試的抗體中，純系5、6、7、11、12、15和23是最有希望的，因為這些給出了靶抗原的特異性染色與在陰性對照樣品中的非特異性染色的最高比率。相反，純系4、13、26和27顯示靶抗原的無效染色，而抗體10和20顯示陰性對照樣品的弱但顯著的非特異性染色。這些結果用於說明以下問題：並非所有能夠結合呈其未固定狀態的所關注標靶的抗體都適合用於IHC染色。本文中描述的肽對照試劑和方法可以幫助識別用於IHC應用的最合適的抗體。
總之，這些結果證明抗原/BSA凝膠方法提供了用於產生適用於許多靶抗原的IHC對照的穩健平台。該方法產生代表IHC染色梯度的對照，其與一定範圍的靶濃度相關，從而證明靶/BSA凝膠的定量潛力。與組織或細胞株的IHC對照不同，肽/BSA凝膠很容易在實驗室中根據需要產生、一致、可重複、廉價、通用和抗原特異性。二級抗體對照證明了該方法的特異性。此外，該方法非常適合於識別適合於所關注標靶的IHC分析的抗體，該過程通常篩選數百至數千種候選抗體以識別少數(例如2-5)先導以便進一步表徵。實施例 2 ：檢查凝膠形成的條件
以下實施例描述了測試一系列條件對凝膠形成的影響。
方法
為了評價BSA凝膠形成，將1mL PBS中的BSA溶液在25-85℃的溫度範圍內加熱。BSA/PBS溶液中不含甲醛。連續加熱溶液並在加熱條件下在不同時間點觀察液/固相。在以下BSA濃度下測試溶液：25%、20%、15%、10%、5%和2%。
為了評估製備凝膠的其他蛋白質來源，在PBS中產生以下25%的溶液：酪蛋白、乳白蛋白、大豆粉和脫脂奶粉。將500μL 37%甲醛與500μL的相應25%蛋白質/ PBS溶液混合，並在85℃下溫育10分鐘。
為了評價固定劑，將500μL固定劑與500μL含25%BSA的PBS溶液混合，並在85℃下溫育10分鐘。測試的固定劑包括：10%中性緩衝福爾馬林(NBF)、½強度Karnovski(戊二醛/多聚甲醛)、Methacarn、Carnoy液體和Bouin。
為了評估甲醛濃度，將500μL甲醛溶液與500μL 25%BSA的PBS溶液混合，並在85℃下溫育10分鐘。在以下濃度下測試甲醛溶液(濃度是指在用BSA溶液稀釋之前的原始濃度)：1%、2%、4.5%、9%和18%。具體地，將37%的原料甲醛溶液與蒸餾水混合，製得含有1%、2%、4.5%、9%或18%甲醛的500微升最終體積；然後將這些溶液(各自在單獨的微量離心管中)與相等體積(500微升)的25%BSA溶液混合並如上加熱。
結果
圖 6
說明了加熱溫度和時間對25%BSA凝膠形成的影響。即使在加熱過夜後，在25℃或45℃下加熱也不會導致任何凝膠形成。在55℃下，僅在加熱過夜後觀察到凝膠形成。然而，在65℃或85℃加熱後，分別在6和2分鐘內觀察到固體凝膠形成。這些結果證明了加熱溫度和時間對BSA凝膠形成的影響。
接下來，測試BSA濃度對凝膠形成的影響。將BSA以下列濃度溶解在PBS中：25%、20%、15%、10%、5%和2%。如圖 7
所示(25%BSA的結果顯示在圖 6
中)，在85℃加熱時觀察到所有濃度的凝膠形成。對於5%及以上的BSA濃度，在10分鐘內觀察到凝膠形成，而2%BSA溶液在20分鐘後形成凝膠。在45℃或55℃加熱後的任何時間都沒有觀察到凝膠形成。這些結果表明，在適當的加熱條件下，各種BSA濃度都可以產生BSA凝膠。
接下來，測試酪蛋白、乳白蛋白、大豆粉和脫脂奶粉形成凝膠的能力。如上所述，在與甲醛(最終濃度：18.5%)混合後，各自在PBS中以12.5%的最終濃度進行測試。在這些條件下，僅觀察到大豆粉形成凝膠，但所得固體不均勻。這些資料證明了血清白蛋白在促進凝膠形成中的獨特性質。
接下來，測試了各種固定劑形成BSA凝膠的能力，包括10%NBF、½強度的Karnovski(戊二醛/多聚甲醛)、Methacarn、Carnoy液體和Bouin。其中，10%NBF和Methacarn未能形成固體。Carnoy在它混合之前形成了固體。½ Karnovski和Bouin固定劑形成了透明固體。
還測試了甲醛濃度對凝膠形成的影響。除1%外，所有濃度的甲醛均能促進固體凝膠形成。這些結果顯示了固定劑對凝膠形成的影響。實施例 3 ：評估用於凝膠形成的其他受質
以下實施例描述了評估其他蛋白質形成適於IHC染色的凝膠的能力。
方法
對於BSA(以25%終濃度使用)、蛋清蛋白或蛋清蛋白混合物(以25%終濃度使用)、明膠(以10%終濃度使用)、乳白蛋白(以25%終濃度使用)、肝蛋白粉、大豆粉(以25%終濃度使用)、酪蛋白(以10%終濃度使用)和脫脂奶粉(以25%終濃度使用)針對產生適合用於IHC染色的固體凝膠的能力進行評估。將蛋白質溶液與37%甲醛混合並加熱至85℃持續10分鐘。
每種類型的凝膠在有或沒有0.1mg/mL正常兔IgG(DA1E)的情況下產生。切片用5μg/mL的驢抗兔生物素化二級抗體染色，然後進行ABC-HRP檢測。
對於明膠凝膠，將10%熔融明膠與0.1mg/mL正常兔IgG(DA1E)混合，然後在4℃冷卻1小時，轉移至10%NBF過夜，轉移至70%乙醇中2天，然後處理用於如組織一般進行IHC染色。對於乳白蛋白和肝蛋白粉凝膠，添加Histogel™以固化凝膠。對於酪蛋白凝膠，逐滴加入100mM NaOH以使pH達到8.0，同時根據需要攪拌以形成溶液。
對於使凝膠成像，在Hamamatsu Nanozoomer上掃描載玻片，並使用影像觀察軟體捕獲數位影像。
結果
測試另外的受質蛋白質形成適於IHC染色的凝膠的能力，例如，藉由形成允許IHC染色並黏附於玻璃IHC載玻片的均勻凝膠。如圖 8
所示，除了BSA之外，蛋清蛋白或蛋清蛋白的混合物和明膠形成了凝膠，該等凝膠展現特異性IHC染色(在這種情況下，在含有兔IgG抗體樣品的凝膠被抗兔二級抗體染色後)以及低非特異性染色(如在缺少兔IgG的凝膠用抗兔二級抗體染色後所見)。相反，由乳白蛋白、肝蛋白粉或大豆粉產生的凝膠不能產生均勻的凝膠(圖 9
)。由酪蛋白或脫脂奶粉產生的凝膠未能黏附到IHC載玻片上(圖 10
)。表A中提供了每種凝膠受質和由嘗試凝膠形成產生的材料的描述。表 A.
由各種受質製成的蛋白凝膠。
S =固體凝膠
L =液體
總之，BSA、蛋清蛋白和明膠提供了適合特定IHC染色的凝膠。其他蛋白質受質未能形成均勻的凝膠或在IHC處理過程中未能黏附到載玻片上。實施例 4 ：凝膠中抗原的檢測
使用與研究和臨床使用相關的概念證明應用(包括IHC測定校準和品質控制)進一步分析上述合成IHC對照概念。
方法肽和蛋白質
藉由New England Peptide(Gardner，MA)以＞ 95%純度合成肽。人BCL2蛋白(UniProt P10415)的胺基酸41-54在N-末端延伸四個胺基酸，包括乙醯化酪胺酸以促進與甲醛的交聯，以及間隔序列GSG。C-末端包括GSG間隔序列，接著是半胱胺酸-醯胺以促進與甲醛的交聯(Metz, B. 等人 (2004)J. Biol. Chem.
279:6235-6243); Toews, J. 等人, (2008)Anal. Chim. Acta
618:168-183)或巰基反應性試劑。整個22個胺基酸的肽序列是Ac-YGSGGAAPAPGIFSSQPGGSGC-醯胺(SEQ ID NO：1)。合成另外的肽，其含有來自人MYC蛋白(UniProt P01106)的序列：Ac-YGSGNRNYDLDYDSVQPYFYGSGC-醯胺(胺基酸9-24；SEQ ID NO：2)；Ac-YGSGDSVQPYFYCDEEENFYGSGC-醯胺(胺基酸17-32；SEQ ID NO：3)；Ac-YGSGQQQSELQPPAPSEDIWGSGC-醯胺(胺基酸35-50；SEQ ID NO：4)；Ac-YGSGFELLPTPPLSPSRRSGGSGC-醯胺(胺基酸53-68：SEQ ID NO：5)。合成具有來自人MCL1(UniProt Q07820)的第一外顯子的13個胺基酸的陰性對照肽，其具有與上述相同的N-和C-末端序列延伸。對於一些實驗，精胺酸、絲胺酸或酪胺酸取代了上述肽中的N-和C-末端胺基酸。將凍乾的肽溶於最小體積的蒸餾水、DMSO或二甲基甲醯胺中。RAS 2(KSR2；Uniprot Q6VAB6)蛋白的激酶抑制劑的C末端301個胺基酸(胺基酸650至950)表達為701個胺基酸的N-末端[His]6
標記的麥芽糖結合蛋白(胺基酸9-399)融合構建體。融合蛋白在Trichoplusia ni
Tni Pro昆蟲細胞(Expression Systems；Davis，CA)中表達為桿狀病毒構建體，然後藉由連續的鎳-次氮基三乙酸親和力、直鏈澱粉親和力和Sepharose S200尺寸排阻色譜法純化。純化的小鼠IgG1純系MOPC-31C(BD Pharmingen，San Jose，CA)，大鼠IgG1純系R3-34(BD Pharmingen，San Jose，CA)和兔IgG純系DA1E(Cell Signaling Technology，Danvers，MA)是商業上獲得的。牛血清白蛋白(BSA；Ultra Pure)購自Cell Signaling Technology(Danvers，MA)。食品級明膠和乾蛋清分別來自Knox(Oakbrook，IL)和Judees Gluten Free(Columbus，OH)。蛋白質基質凝膠
除非另有說明，將0.5 mL含有25%(w/v)BSA /磷酸鹽緩衝鹽水(PBS)中所需抗原的溶液在1.5 ml微量離心管中與相等體積的37%甲醛混合(Electron Microscopy Sciences；Hatfield, PA)，在85℃下加熱10分鐘以使溶液凝固，然後在室溫下固定過夜。最終試劑濃度為12.5%(1.8 mM)BSA和18.5%(6.2 M)甲醛。肽抗原在固定凝膠中的最終濃度為2.5×10-8
M至2.5×10-4
M。含有初始小鼠、大鼠和兔IgG的凝膠的終濃度為0.1 mg/ml(6.7×10-7
M)IgG。人[His]6
-MBP-KSR2融合蛋白的最終凝膠濃度為0.5 mg/ml(6.3×10-6
M)。
在替代性固定方案的測試中，使用不含福爾馬林的鋅固定劑(目錄號552658，BD Pharmingen；San Jose，CA)代替上述方案中的37%甲醛和NBF。在其他實驗中，PBS中25%BSA中的抗原藉由在85℃下在不存在甲醛的情況下加熱10分鐘而固化。然後將固化的凝膠轉移到10%中性緩衝福爾馬林(NBF；VWR International，LLC，Radnor，PA)，4%多聚甲醛(PFA；VWR International，LLC，Radnor，PA)或鋅固定劑中，在室溫下固定過夜。組織微陣列 (TMA) 構建
使用TMA Grand Master組織微陣列儀(3DHISTECH，Budapest，Hungary)構建組織微陣列(TMA)。從含有所需蛋白凝膠的供體石蠟塊中沖出雙重1 mm直徑的核心，然後轉移到受體石蠟塊上。將完成的受體TMA塊在37℃加熱過夜，然後在70℃加熱10分鐘，然後冷卻並切片。IHC 染色
使用的一級抗體是小鼠抗人BCL2純系124(Ventana Medical Systems；Tucson，AZ)，兔抗人BCL2純系EPR17509(Abcam；Cambridge，MA)，兔抗人BCL2純系SP66(Ventana Medical Systems，Tucson，AZ)，兔抗人BCL2純系E17(Abcam，Cambridge，MA)，兔抗人MYC純系Y69(Ventana Medical Systems，Tucson，AZ)和兔抗人MCL1純系SP143(Ventana Medical Systems，Tucson，AZ)。Fluidigm EPR17509-146
Nd抗體購自Fluidigm(South San Francisco，CA)。在Chempartner(Shanghai, China)產生一組27個針對[His]6
-MBP-人融合蛋白的小鼠雜交瘤抗體。生物素化的驢抗兔、大鼠和小鼠二級抗體購自Jackson Laboratories。染色方案細節總結在表1中。表 B.
IHC方案。
RTU =準備使用(供應商未揭示的抗體濃度)。
將四微米石蠟切片脫石蠟並在二甲苯和分級醇中再水合。在Ventana Benchmark XT，Ventana Discovery XT，Ventana Benchmark Ultra XT儀器(Ventana Medical Systems，Tucson，AZ)或Dako Universal自動染色機(Agilent，Santa Clara，CA)上進行染色。根據優化的抗體方案，用細胞調節溶液1(CC1)(Ventana Medical Systems，Tucson，AZ)或標靶修復溶液，pH6(即用型)(Dako-Agilent Technologies，Santa Clara，CA)預處理切片。將Ventana儀器上染色的載玻片用Ventana蘇木精和上藍試劑(Ventana Medical Systems，Tucson，AZ)複染4分鐘。在Dako Universal自動染色機上染色的載玻片在Mayer蘇木精(Rowley Biochemical，Danvers，MA)和Richard-Allen Scientific Bluing Reagent(Thermo Fisher Scientific，Waltham，MA)中複染1分鐘。在蓋玻片之前，將染色的切片在分級醇至二甲苯中脫水。用Prolong Gold封固劑(Life Technologies，Carlsbad，CA)蓋上免疫螢光載玻片。Fluidigm 染色程序
將切片在70℃下烘烤30分鐘，脫石蠟，在遞減EtOH系列中再水合，並用標靶修復溶液，pH6(Dako-Agilent Technologies，Santa Clara，CA)預處理，在10%驢血清，PBS中的3%BSA中阻斷30分鐘，然後與阻斷緩衝液中的146
Nd-EPR17509一起溫育。將載玻片在無蓋玻片的情況下於4℃在潮濕的密閉容器中溫育過夜，然後在PBS中漂洗3次，在2%戊二醛/ PBS中在20℃載玻片下後固定處理5分鐘，在ddH2
O中漂洗，在遞增EtOH系列中脫水，空氣中乾燥並在20℃下儲存直至成像。成像質譜分析
藉由在每個TMA核心中定義150平方微米的所關注消融區域(ROI)，在Fluidigm Hyperion成像質譜儀(South San Francisco，CA)中分析用146
Nd標記EPR17509染色的TMA核心。使用如下所述的抗體標準資料將每個ROI的積分離子計數轉換為抗體質量。
在PBS中的3%BSA中的10%驢血清中製備對照等分試樣的1、5和10微克/毫升146
Nd標記的EPR17509。將1微升每種抗體樣品點在載玻片上並空氣乾燥，然後在Hyperion機器中消融(UV雷射強度= 3)。每個抗體斑點的積分離子計數用於校準在染色的TMA核心的ROI中測量的離子計數。數位影像採集和分析
使用配備有20X 0.75 NA物鏡的Hamamatsu(Bridgewater，NJ)Nanozoomer-XR數位載玻片掃描儀以0.46微米/像素的掃描分辨率獲得全載玻片明場影像。明場成像以半自動批處理模式進行。在自動高分辨率全載玻片成像之前，為每張載玻片手動創建掃描區域和焦點。使用Nanozoomer-XR或3D Histech Pannoramic 250掃描儀(使用分辨率為0.33微米/像素的20X 0.8 NA物鏡)獲得免疫螢光全載玻片影像。在Nanozoomer-XR系統上，螢光模塊的照射功率設定為50%並且使用TRITC(1x曝光的抗體信號，3.4 ms光子收集，1x增益)，DAPI(2x曝光的自發螢光，6.8 ms光子收集，2x增益)和CFP濾光器(4x曝光的自發螢光，13.6 ms光子收集，2x增益)捕獲免疫螢光信號。使用CY5(10 ms曝光的抗體信號)，FITC(2 ms曝光的抗體信號)，DAPI(40 ms曝光的自發螢光)和CFP濾光器(200 ms曝光的自發螢光)進行Pannoramic 250系統的採集。使用Matlab版本9.3進行影像分析。手動創建和編輯明場影像上的所關注區域(ROI)以排除具有偽影或被撕裂的凝膠區域。使用手動顏色閾值排除ROI內的小孔或裂縫。當藉由閾值處理(在DAPI或CFP通道上)和形態學過濾從自發螢光影像獲得高於凝膠背景的足夠信號時，可以手動創建或自動生成免疫螢光影像的ROI。將ROI轉移到抗體-螢光染料通道中獲得的影像上以進行強度測量。對於明場和螢光影像，以8位深度計算平均灰度強度。繪製的平均明場像素強度的Y軸值表示255減去平均像素灰度強度。呈現數位載玻片掃描影像而不改變原始強度或對比度。使用ImageJ(版本1.52a；Wayne Rasband，imagej.nih.gov/ij)中的分析/繪圖輪廓功能評估在供體塊切片上繪製的線上的染色強度分佈定量。統計分析
使用Prism GraphPad(版本7)完成繪圖。針對載玻片背景校正的信號強度資料相對於配製的抗原濃度的log10
作圖。曲線擬合使用可變斜率4參數模型，該模型受到約束以使得擬合曲線的底部等於每個測定的無抗原核心的平均強度，在與每個圖相關聯的表中報告為「底部」。藉由軟體計算表中報告的其他參數[信號最大值，跨度，半最大信號的抗原濃度(ACHM)和Hill斜率]。
結果
如實施例1-3中所證明的，當摻入蛋白凝膠中時，編碼抗體靶表位的合成肽可以使用常規免疫組織化學和免疫螢光方法來檢測。當藉由顯色測定法評估時，含有靶肽的供體塊具有相對均一的抗原分佈(圖 11A-11D
)。可以構建含有一系列抗原濃度的所需抗原的組織微陣列(TMA)。圖 12A-12E
顯示由雙重核心組成的TMA，該等核心不含添加的肽，含有來自人MCL1蛋白的陰性對照肽的連續稀釋液，或編碼BCL2蛋白的胺基酸41-54的肽的稀釋液。該TMA的平行切片用四種抗BCL2抗體染色：純系124，其針對靶肽中使用的相同肽序列產生；SP66和E17，其均針對試劑中序列C末端的肽抗原產生(Adam, P. 等人 (2013)Human Pathology
44:1817-1826; www.abcam.com/bcl2-alpha-antibody-sp66-n-terminal-ab93884.html)；和EPR17509，其針對未揭示的BCL2肽抗原產生(www.abcam.com/BCL2-antibody-epr17509-hrp-ab209039.html)。使用顯色(所有抗體)和免疫螢光(僅用於純系124)方法將單獨的載玻片染色。
如所預期的，SP66和E17與該TMA的切片中的任何核心都沒有可檢測的反應(圖 13A 和 B
)。對於純系124和EPR17509，TMA核心中的信號隨著BCL2肽濃度的增加而增加(圖 12A-12C
)，與抗體和核心中的抗原之間的特異性相互作用一致。
數位影像量化允許更精確的資料評估(圖 12D
)。擬合曲線和圖 12E
中報道的相關參數量化了最小和最大信號強度，動態範圍，信號半最大值的抗原濃度(ACHM)，以及此範圍內的抗原濃度與信號強度曲線的陡度(Hill斜率)。在本文中測試的條件下，不含添加肽的核心中的非特異性信號是純系124顯色測定中最大可檢測信號的2.7%，比螢光純系124測定中的低1000倍，並且是EPR17509測定中的23%。另一方面，對於EPR17509，反映該測定的相對靈敏度的ACHM值比用於顯色純系124測定的ACHM低約8倍(即，更敏感)，並且比螢光純系124測定低50倍以上。免疫螢光純系124測定具有比任一顯色測定更陡峭50-75%的斜率，反映了檢測閾值和最大信號之間的較窄範圍的抗原濃度。
為了在重複測定中評估肽對照的再現性，使用新的供體石蠟塊構建第二BCL2肽TMA，新的供體石蠟塊被配製成具有與用於構建圖 12A-12E
中的TMA的石蠟塊相同的靶BCL2肽濃度。使用與圖 12A-12E
中使用的相同的抗BCL2純系124顯色IHC方案，在6個月的間隔中，在6個不同的日期，由兩個操作者對該第二TMA的重複切片進行染色。染色切片的定量數位影像分析顯示每個核心的信號強度是高度可再現的(圖 14A-14C
；還參見圖 3B 和 3C
)。
在平行實驗中，在有或沒有先前的抗原修復的情況下，純系124用於將含有BCL2肽的TMA染色。結果顯示抗原修復提高了信號強度約6倍，但染色不需要抗原修復(圖 15A-15C
)。實施例 5 ：凝膠基質中肽交聯的穩定性
不希望受理論束縛，認為可用於結合抗體的肽的濃度藉由三個參數從配製值降低：肽交聯至蛋白質基質的效率，肽的生物化學完整性和交聯肽對抗體的可接近性。甲醛旨在藉由與肽序列中包含的N-末端酪胺酸和C-末端半胱胺酸反應將BSA側鏈交聯至靶肽。據報道，在BCL2肽內部的胺基酸(A、F、G、I、P、Q、S)中，只有谷醯胺與甲醛反應(Metz，B. 等人(2004)J. Biol. Chem.
279:6235-6243)。
為了評估替代的N-和C-末端胺基酸對信號強度的影響，測試了BCL2肽的四種變體。N末端酪胺酸被絲胺酸取代，預期其與福爾馬林的反應性最低，或被精胺酸取代，據報道其反應性比酪胺酸高50%(Metz，B.等人 (2004)J. Biol. Chem.
279:6235-6243)。其他變體包括N-和C-末端的酪胺酸或精胺酸。製備含有每種肽的連續稀釋液的TMA核心，並如上進行染色。
結果顯示具有N-末端精胺酸的肽的顯著更高的信號(「R-C」，圖 16A-16C
)。該變體的ACHM是4.43×10-7
M肽，比原始Y-C變體的相應值低6倍。其他變體顯示出與原始Y-C變體類似(S-C)或更弱(R-R，Y-Y)的強度範圍。值得注意的是，在N-末端含有精胺酸或酪胺酸且在C-末端具有半胱胺酸的變體比在兩端具有精胺酸或酪胺酸的肽更強烈地反應。實施例 6 ：合成 IHC 對照的通用性
接下來，進行實驗以確定含有除BCL2之外的蛋白質的表位的肽是否會以類似的方式反應。據報道，抗MYC抗體Y69結合人MYC蛋白的N-末端100個胺基酸中的表位(www.abcam.com/c-MYC-antibody-y69-ab32072.html)。如上將來自該區域的候選表位摻入BSA凝膠中並測試Y69結合。
含有MYC胺基酸9-24的肽與抗體強烈反應，而其他肽僅弱反應(aa 17-32)或根本不反應(aa 35-50和aa 53-68)(圖 17A
)。構建TMA，其含有在前面描述的濃度範圍內的MYC aa 9-24肽和BCL2肽的雙重核心。使用抗BCL2純系124和抗MYC純系Y69的顯色檢測顯示出一系列信號強度，與非靶肽沒有交叉反應性(圖 17B 和 17C
)。所得資料的定量(圖 17D
)顯示MYC方案的ACHM比BCL2方案低4倍，具有相似的動態範圍和Hill斜率參數(圖 17E
)。
使用與抗BCL2和抗MYC一級抗體的適當檢測試劑連續溫育，對圖17A-17E
中使用的相同TMA進行雙重免疫螢光檢測(圖 18A-18C
)。定性結果(圖 18A 和 18B
)顯示預期的特異性，在任一種抗體和非靶肽之間沒有交叉反應性。用於代替抗原特異性一級抗體的同種型對照不產生信號。所得螢光資料的定量顯示相對於顯色方案，在測試條件下增加的Hill斜率參數和增加的重複變異性。
這些結果證實了在使用不同表位和檢測方案時，肽抗原作為IHC對照的廣泛適用性。實施例 7 ：檢測限 (LOD) 和再現性
獲得的定量資料允許確定純系124 BCL2 IHC測定的檢測限(LOD)和再現性。
圖 12A 、 14A-14C 、 15A 和 17B
中所示的實驗代表10個獨立的分析，每個分析具有不含靶肽(空白)和6個濃度的BCL2肽的雙重TMA核心。圖 19A 和 19B
以及表C總結了資料。對於每個實驗，在每個肽濃度下使用雙重TMA核心的平均值用於計算。值是針對載玻片的背景強度校正的TMA核心的像素強度(19.2+/- 0.5單位)。表 C.
BCL2純系124 IHC測定聚集資料
根據公認的臨床實驗室慣例(Armbruster和Pry，2008)，這些資料的空白限制(LOB；= 平均值空白
+ 1.645 x SD空白
)為8.0單位，檢測限(LOD；= LOB +1.645 x SD低陽性樣品
)是16個單位，對應於2.3×10-7
M肽。該濃度相當於每立方微米凝膠約140個分子的配製抗原密度。
與這些計算一致，對於具有增加的BCL2肽濃度的核心的資料的雙尾t檢驗比較的結果(表C)顯示具有2.5×10-8
M肽(低於計算的LOD)的核心與缺乏肽的核心沒有顯著差異，而具有2.5×10-7
M肽和更高(高於計算的LOD)的核心是在統計學上不同的相鄰核心。值得注意的是，儘管這些核心的主觀強度相似，但含有兩個最高肽濃度的核心中的信號在統計學上是不同的。實施例 8 ：使用合成的 IHC 對照進行抗體驗證
如上文實施例1中所述(參見圖 5A-5D
)，將另一種蛋白質摻入BSA凝膠中並用於評估由雜交瘤純系產生的抗體。在這種情況下，使用包含人KSR2的C末端301個胺基酸(即胺基酸650-950)的肽。上述結果表明，合成的IHC對照方法提供了一種有用的方法，用於識別適合所關注的標靶的IHC分析的抗體，該過程通常篩選數百至數千個候選抗體以識別少數(例如，2-5)先導用於進一步表徵。
進一步測試候選抗體對抗原的反應性，而無需事先抗原修復。對於每種抗體，需要抗原修復以獲得可檢測的反應性(圖 20A 和 20B
)。這與實施例4中描述的BCL2肽的結果形成對比，對於該肽，抗原修復改善了信號強度約6倍，但對於可檢測的反應性不是必需的(圖 15A-15C
)。
作為全長蛋白質的測試，製備摻入BSA凝膠中的兔、大鼠和小鼠全長免疫球蛋白(IgG；(0.1 mg/ml；6.7×10-7
M)並用作在檢測步驟中使用生物素化驢抗兔、抗大鼠和抗小鼠二級抗體的IHC測定的技術對照。結果顯示了抗兔、抗小鼠和抗大鼠二級抗體的預期信號和特異性(圖 21A 和 21B
)。如圖 21A 和 21B
所示，用驢抗兔IgG二級抗體檢測的所摻入兔IgG顯示136單位的像素強度。假設添加的兔IgG的定量保留，1立方微米(10-15
L)的該樣品含有6.7×10-22
莫耳，或約400個可檢測的兔IgG分子。實施例 9 ：測試製備凝膠的替代固定劑
因為一些表位藉由含福爾馬林的固定劑而變為非反應性，所以測試了市售的不含福爾馬林的鋅固定劑作為先前實驗中使用的37%甲醛的替代物。
在BSA凝膠中含有BCL2和MYC肽的供體塊用福爾馬林或鋅基固定劑固定，加熱至85℃(圖 22A-22C
)。對於BCL2和MYC肽，在加熱期間，與鋅固定相比，甲醛固定時的信號強約10倍。信號強度的損失與鋅存在下的加熱有關。
在沒有固定劑的情況下將BSA-抗原混合物加熱至85℃，然後在室溫下固定在各種固定劑(4%多聚甲醛、中性緩衝福爾馬林，不含福爾馬林的含鋅固定劑)中的替代方法產生與上述標準方案可比的信號(圖 23A 和 23B
)。這表明該技術可以適應各種固定劑，從而可能擴大可以使用的表位和抗體的範圍。實施例 10 ：成像質量細胞計數分析
在上面報道的實驗中，對於每個結合的抗體分子沉積的顯色團或螢光染料分子的數量是未知的，因此不能計算檢測到的表位的絕對濃度。為了避免這種限制，測試了使用基於Hyperion質譜的成像儀的更定量的直接檢測程序。
用146
Nd標記的抗BCL2抗體EPR 17509將BCL2肽TMA的切片染色，然後藉由紫外雷射消融和定量質譜來分析。定量的TMA樣品通常是150平方微米×4微米厚的面積，含有9×104
立方微米。結果顯示分級信號隨著靶中BCL2肽濃度的增加而增加(圖 24A-24C
)。不含肽的核心或含有陰性對照MCL1肽的核心中的EPR17509抗體信號小於最大信號的3%。
藉由分析直接點在載玻片上的已知量的146
Nd標記的抗體來確定測量的離子計數和抗體濃度之間的相關性。得到的校準資料(表D)顯示檢測到的每146
Nd離子約340個抗體分子的比率。表 D.
抗體離子定量
藉由將在每個TMA核心樣品中配製的BCL2肽的量與測量的146
Nd標記的抗BCL2抗體的量進行比較，測定在TMA核心中可檢測的BCL2肽的分數。結果(表E)顯示，可檢測的BCL2肽的量隨著肽濃度的增加而增加，如預期的那樣。表 E.
由含BCL2肽的核心結合的抗體。
結果還表明，隨著抗原濃度的增加，可檢測的添加BCL2肽的比例降低；在2.5×10-7
M下可檢測到1.4%的添加肽，而在2.5×10-4
M時檢測到~0.14%的添加肽。
結論
總之，實施例1-10的結果表明含有抗原的凝膠可以使用任何組織學實驗室中可用的材料和方法產生，並且可以包埋和切片以產生均勻染色的樣品。這些實施例證明該方法與各種固定劑相容並且與使用基於顯色、免疫螢光和質譜的方法進行的檢測相容。可能的抗原的選擇僅受靶蛋白的可用性或線性表位序列的知識的限制。產生已知組合物的合成對照的能力提供了更精確地表徵和控制常規使用的免疫組織化學方案的機會，而不依賴於異質組織樣品中固有的複雜因素和主觀人類解釋。
這些結果提供了使用對每種蛋白質特異的抗體來對來自BCL2、MYC和MCL1的線性肽表位進行概念證明檢測，並進一步證明了全長IgG和301-胺基酸人蛋白質的檢測。本文中配製和測試的靶表位濃度跨越四個數量級，從2.5×10-8
M到2.5×10-4
M，延伸到組織中發現的蛋白質濃度範圍的上限。在該範圍的高端，平均分子間距離小於20 nM，接近全長IgG分子的兩個臂之間的距離(~14 nM)。只有非常豐富的蛋白質達到這種密度。在該程序中使用的蛋白質濃度在許多組織中發現的範圍內(7-25%)(Cole, J. (2017)Scientific Reports
7:44707)，因此再現了一些機械和生物化學組織特性。
這些結果進一步證明，與組織中的IHC測定性能相關的定量參數 - 非特異性背景、檢測限、動態範圍、半最大信號的抗原濃度和Hill斜率 - 可以在任何實驗室中以客觀可定義的精度，藉助於數位載玻片掃描儀和基本影像分析功能來進行評估。結果表明，這些參數可隨著當使用一種抗原-抗體對時的不同的實驗條件，隨著不同的抗體檢測相同的抗原以及隨著不同的抗體/抗原對而變化。例如，在圖 12A-12E
中所示的三種測定中，測量的ACHM值差異超過50倍。在使用純系124 BCL2測定的一系列10次重複實驗中，最大信號、動態範圍、log(ACHM)和Hill斜率的計算資料參數具有小於10%的變異係數，但是更高的精度是可能的。這些實驗在生理範圍(2.5 x 10-8
至2.5 x 10-4
M)內使用連續10倍稀釋的抗原，但藉由包括測定的動態範圍的10%和90%之間的更多樣品，可以提高ACHM和斜率定量的精確度。因為可以比藉由對組織或細胞聚合體的主觀人評估更客觀和精確地評估測定性能，所以可以更精確地定製測定的性能以滿足臨床需要，並且更嚴格地控制。
具有一系列抗原濃度的合成對照允許使用可重複的標準對IHC染色方案進行優化、量化和隨時間控制。本文中描述的概念允許以在兩個極端之間的中間水準對IHC測定進行品質控制，該等兩個極端是在受控的體外條件下評估純化的抗體和抗原之間的相互作用，以及藉由經驗優化來評估組織樣品中的抗體反應性。
考慮將該方法應用於正在進行的定量免疫組織化學分析。合成抗原凝膠樣品是均勻的，具有均一的厚度，並含有已知數量的表位分子，允許將信號強度與抗原濃度相關聯。包含有用的表位濃度範圍的載玻片上TMA切片可以容易地與診斷組織切片相鄰，允許測定技術充分性，或在任何載玻片上評估定量影像分析。由於該方法中使用的組成部分和程序是完全定義的，因此在不同實驗室中創建的試劑原則上應該在功能上相似。這種方法可以讓研究人員比較和校準不同實驗室中使用的方案，在描述定性染色終點時更清楚地進行溝通，最終更精確地控制用於研究和患者護理決策的IHC分析。實施例 11 ：用聚離胺酸製備的合成抗原凝膠
上述實施例(參見，例如，實施例3)描述了測試受質蛋白質形成適於IHC染色的凝膠的能力，例如，藉由形成允許IHC染色並黏附於玻璃IHC載玻片的均勻凝膠。該實施例描述了針對抗原/凝膠基質形成來測試聚離胺酸。
聚離胺酸提供多個甲醛反應性側鏈，並且可以以1-4 kDa至大於300 kDa的各種分子量商購獲得。聚離胺酸單體的式量為128 Da(假設沒有鹽抗衡離子)，因此市售的聚離胺酸分子包括8-30個離胺酸單體至大於2,300個離胺酸單體的聚合物。
如上證明，在熱變性和與甲醛反應時，12.5%(終濃度)的BSA產生有用的基質，其中靶抗原可以包埋和交聯。假設式量為69,293 Da，12.5%的BSA濃度為1.8 mM。每個BSA分子含有60個離胺酸側鏈。除離胺酸外，每個BSA分子還含有26個精胺酸和21個酪胺酸側鏈，每個側鏈都可以與甲醛有效反應。因此，在12.5%BSA凝膠中，存在60×1.8 mM或108 mM離胺酸側鏈。
因此，基於類似計算的聚離胺酸凝膠基質樣品在最終凝膠中含有約108 mM離胺酸側鏈。假設聚離胺酸聚合物中單個離胺酸側鏈的式量為128 Da，凝膠中聚離胺酸的最終濃度為約14 mg/mL。如果商業聚離胺酸含有抗衡離子鹽，則使用更高的每體積重量。例如，聚離胺酸* HBr鹽的式量為209 g/mol。藉由將相等體積的216 mM聚離胺酸溶液(約28 mg/mL純，45 mg/mL，作為HBr鹽)與濃縮的甲醛原液(37%)混合，實現所需的聚離胺酸終濃度。不希望受理論束縛，認為樣品中的離胺酸側鏈在聚離胺酸鏈內和/或之間彼此交聯，以形成凝膠。
將上述濃度的聚離胺酸溶液與37%甲醛(和任選的所關注抗原)混合並加熱至85℃10分鐘，然後如上測試凝膠形成和抗原結合。在甲醛處理後，測試不同聚合物長度的聚離胺酸的凝膠形成。在一些實施例中，聚離胺酸包含L-對映異構體、R-對映異構體或L-和R-對映異構體的混合物。將含有各種濃度的抗原的聚離胺酸凝膠與陰性對照比較，例如不含抗原的聚離胺酸凝膠，或含有非特異性蛋白質或其他抗原的聚離胺酸凝膠，和/或陽性對照例如實施例1-10中描述的凝膠(例如，含有相同抗原的12.5%BSA凝膠)。測定這些凝膠的抗原結合，例如在藉由實施例1-10中的顯色或免疫螢光結合測定法測定的IHC載玻片或TMA上。
儘管上述本發明已出於清楚理解的目的藉由說明和實例方式詳細描述，但描述和實施例不應解釋為限制本發明的範圍。本文引用的所有專利和科學文獻的公開內容皆以全文引用的方式明確併入本文。
專利或申請文件含有至少一幅彩色附圖。在提出請求並支付必要費用後，本事務所將提供具有一張或多張彩色附圖的本專利或專利申請公佈的副本。
圖 1
顯示了使用從組織樣品獲得的載玻片進行IHC染色的示例性工作流程。
圖 2A
顯示在1.5mL微量離心管中產生，然後從其中取出的牛血清白蛋白(BSA)凝膠。
圖 2B 和 2C
顯示了在1.5mL微量離心管中產生，然後從其中取出的BSA凝膠切片的不同視圖。
圖 2D
顯示了製備用於脫水和石蠟處理的切片凝膠部分。
圖 2E
顯示了包埋在石蠟「供體塊」中的切片凝膠部分。比例尺：1cm。
圖 2F
顯示了由各種石蠟凝膠供體塊產生的組織微陣列(TMA)。最暗的核心是含有黑色和綠色顏料的取向參考。
圖 3A
顯示了包埋在石蠟塊中的BCL2肽/BSA凝膠圓柱的4微米厚切片的IHC染色結果。插入物顯示使用從BCL2肽/BSA凝膠獲得的切片進行的BCL2 IHC染色的40倍放大，該等凝膠(自左至右)不含肽，含有5x10-5
mg/mL(2.5E-8 M)BCL2肽，5x10-4
mg/mL(2.5E-7 M)BCL2肽，5x10-3
mg/mL(2.5E-6 M)BCL2肽，5x10-2
mg/mL(2.5E-5 M)BCL2肽，或0.5 mg/mL(2.5E-4 M)BCL2肽。標記對應於0、1+、2+或3+(在0至3+定性標度上)BCL2染色的切片。
圖 3B
顯示了六個獨立實驗的結果，其分析了圖 3A
中所示切片的光密度(OD)與BCL2肽濃度的關係。
圖 3C
顯示了六個獨立實驗的結果，其分析了圖 3A
中所示切片的影像強度與BCL2肽濃度的關係。
圖 3D 和 3E
顯示了BCL2肽/BSA凝膠圓柱的4微米厚切片的定量免疫螢光(IF)染色的結果，其包埋在石蠟塊中，用抗BCL2一級抗體染色，並用螢光報道分子檢測(使用Ventana Medical Systems OmniMAP抗鼠HRP檢測系統，其次是Ventana Discovery Red 610檢測系統)。測試樣品包括野生型(未突變的)BCL2肽，具有六種不同單胺基酸取代的BCL2肽和來自MCL1蛋白的肽(預期不會結合抗BCL2抗體的陰性對照樣品)。圖 3D
顯示了報道分子的紅色螢光。圖 3E
顯示在DAPI過濾通道(檢測BSA核心中的藍色自發螢光)中成像的相同TMA的螢光。
圖 3F 和 3G
顯示了包埋在石蠟塊中，用初始對照一級抗體染色的BCL2肽/BSA凝膠圓柱的4微米厚切片的定量免疫螢光(IF)染色的結果。圖 3F
顯示了報道分子的螢光。圖 3G
顯示在DAPI過濾通道(檢測BSA核心中的自發螢光)中成像的相同TMA的螢光。
圖 3H
示出了圖 3D
中所示的結果的量化(報告為平均光學發射率)。野生型BCL2肽在每個濃度下顯示最強的信號；如預期的那樣，陰性對照MCL1肽顯示最小信號。具有單個胺基酸取代的六種BCL2肽顯示可變信號，通常介於野生型BCL2和陰性對照MCL1肽之間。
圖 3I
顯示了圖 3F
中所示的結果的量化(報告為平均光學發射率)。如預期的那樣，初始對照抗體顯示幾乎檢測不到的信號。
圖 3J
示出了圖 3D
中所示的結果的量化(報告為平均信號強度)。野生型BCL2肽在每個濃度下顯示最強的信號；如預期的那樣，陰性對照MCL1肽顯示最小信號。具有單個胺基酸取代的六種BCL2肽顯示可變信號，通常介於野生型BCL2和陰性對照MCL1肽之間。
圖 3K
示出了圖 3F
中所示的結果的量化(報告為平均信號強度)。如預期的那樣，初始對照抗體顯示幾乎檢測不到的信號。
圖 4A
顯示了在含有小鼠IgG(左)或大鼠IgG(右)的BSA凝膠切片上使用驢抗小鼠二級抗體的對照IHC染色。
圖 4B
顯示在含有小鼠IgG(左)或大鼠IgG(右)的BSA凝膠切片上使用驢抗大鼠二級抗體的對照IHC染色。
圖 4C
顯示了引入人BCL2的抗BCL2純系124抗體表位(如UniProt登錄號P10415中闡述的人BCL2序列的胺基酸41-54)的胺基酸取代(如所示)對IHC染色的影響。該影像是4微米厚的切片，其從使用BCL2肽/BSA凝膠圓柱(每個直徑1 mm)構建的石蠟包埋的組織微陣列切下，用抗BCL2抗體純系124染色並用顯色試劑及方法檢測。
圖 4D
顯示了圖 4C
中所示的結果的量化(報告為光密度(O.D.))。
圖 5A-5D
顯示了使用蛋白質/BSA凝膠藉由IHC從用人KSR2免疫的小鼠中獲得的27種不同抗體的篩選結果(與圖 5D
中的用初始小鼠IgG進行染色相比)。每個圖的頂行顯示對於不含蛋白質的BSA凝膠使用每種抗體來進行IHC染色的結果。底行顯示了對於包埋有用於使小鼠免疫的人KSR2蛋白的BSA凝膠使用每種抗體來進行IHC染色的結果。針對每個相應的列指示小鼠抗體純系。核取標記表示最高性能的純系，如靶蛋白樣品中的強信號(下部行)和陰性對照樣品中的最小信號(上部行)所證明。
圖 6
顯示評估溫度和加熱時間對BSA凝膠形成的影響的結果。溫度錶示加熱液體25%BSA溶液的溫度。時間表示加熱BSA溶液，然後在冷卻至室溫之前測試固/液相的持續時間。S =固體；L =液體；半S =半固體。
圖 7
顯示評估時間、溫度和BSA濃度對BSA凝膠形成的影響的結果。溫度錶示加熱液體BSA溶液的溫度。時間表示加熱BSA溶液，然後在冷卻至室溫之前測試固/液相的持續時間。百分比表示BSA/PBS液體溶液中BSA的濃度。S =固體；L =液體；o/n =過夜。
圖 8
顯示了由具有(底行)或沒有(頂行)兔IgG的BSA、蛋清蛋白或明膠製成的凝膠的IHC染色，該兔IgG使用抗兔IgG二級抗體來檢測。
圖 9
顯示了由具有(底行)或沒有(頂行)兔IgG的乳白蛋白、肝蛋白粉或大豆粉製成的非均勻凝膠。
圖 10
顯示由具有(底行)或不具有(頂行)兔IgG的酪蛋白或脫脂奶粉製成的凝膠未黏附到用於IHC染色的載玻片上。
圖 11A-11D
顯示了使用顯色測定法檢查凝膠中抗原分佈的兩個單獨實驗的結果。將含有5×10-5
M BCL2肽(圖 11A 和 11C
中的上部行)或不含肽(圖 11A 和 11C
中的下部行)的BSA凝膠的4微米厚的「供體塊」切片在兩個單獨的實驗中(實驗1：圖 11A 和 11C
中的左列；實驗2：圖 11A 和 11C
中的右列)用抗BCL2純系124染色。使用ImageJ中的繪圖輪廓功能沿水平(圖 11A
)和垂直(圖 11C
)軸線來量化染色切片的數位影像。結果分別顯示在(圖 11B
)和(圖 11D
)中。實驗1和2分別用黑色和灰色表示。BCL2肽和僅BSA對照切片的資料分別以實線和虛線表示。
圖 12A-12E
顯示了使用BCL2肽TMA對BCL2進行IHC分析的結果。(圖 12A
)用抗BCL2純系124染色的組織微陣列切片包括雙重TMA核心，該等TMA核心不含添加肽(BSA)，含有編碼BCL2蛋白質的胺基酸41-54的稀釋系列肽，或所示濃度的來自人MCL1蛋白的陰性對照肽。BCL2和MCL1行的影像是來自相同TMA切片的不同視野。TMA核心的直徑為1 mm。來自(圖 12A
)中描述的相同TMA的連續切片用免疫螢光檢測(圖 12B
)用抗BCL2純系124染色或用顯色檢測(圖 12C
)用抗BCL2純系EPR17509染色。(圖 12D
)如圖 12A-12C
所示，對含有BCL2肽(圓圈)或MCL1肽(正方形)的各個核心中的信號進行定量。(圖 12E
)(圖 12D
)中所示的曲線的相關參數。Hill斜率參數傳達曲線的陡度。ACHM是半最大信號的抗原濃度。
圖 13A
顯示含有BSA凝膠核心的單個組織微陣列的連續切片，該等核心不含添加肽(BSA)，含有編碼BCL2蛋白的胺基酸41-54的肽，或來自人MCL1蛋白的陰性對照肽。使用抗BCL2純系SP66或純系E17對兩個載玻片針對BCL2抗原進行顯色染色。
圖 13B
顯示了(圖 13A
)中所示的影像的量化。
圖 14A-14C
顯示了重複切片的再現性。(圖 14A
)來自包含雙重TMA核心的單個組織微陣列的六個連續切片的影像，該等核心沒有添加肽(BSA)，或具有編碼BCL2蛋白質的胺基酸41-54的肽。兩個操作員在六個不同的日期使用純系124對每個載玻片進行BCL2染色。操作員1染色運行1；操作員2染色運行2-6。(圖 14B
)圖 14A
中所示影像的定量。顯示了六個TMA中每一個上的來自每個肽濃度的雙重核心的平均信號。(圖 14C
)該表總結了圖 14B
中所示曲線的相關參數。
圖 15A-15C
顯示了具有和不具有抗原修復的BCL2肽的IHC染色。(圖 15A
)TMA含有BSA凝膠核心，該等核心不含添加肽(BSA)，或含有指定濃度的編碼BCL2蛋白的胺基酸41-54的肽。在抗原修復之前，切片在具有(AR)或沒有(無AR)的情況下進行染色。(圖 15B
)圖 15A
所示影像的定量。實心正方形：帶抗原修復；空心正方形：無抗原修復。顯示了每種肽濃度下來自雙重核心的平均信號。(圖 15C
)該表總結了圖 15B
中所示曲線的相關參數。
圖 16A-16C
顯示替代的BCL2肽N-和C-末端影響信號強度。(圖 16A
)來自包含雙重BSA凝膠核心的單個TMA切片的影像，該等核心沒有添加肽(BSA)或具有編碼BCL2蛋白質的胺基酸41-54的22個胺基酸肽(第I-V行)，其側接有三個胺基酸序列GSG，以及所示的備選N-和C-末端胺基酸(乙醯-N，C-醯胺)。(圖 16B
)圖 16A
所示影像的定量。顯示了每種肽濃度下來自雙重核心的平均信號。(圖 16C
)該表總結了圖 16B
中所示曲線的相關參數。
圖 17A-17E
顯示了BCL2和MYC肽的IHC染色。(圖 17A
)如所示，含有來自人MYC的2.5×10-4
M肽的供體塊的切片。比例尺為1 mm。(圖 17B 和 17C
)用抗BCL2純系124(圖 17B
)或抗MYC純系Y69(圖 17C
)染色的單個TMA切片包括雙重核心，其被配製成不含肽(BSA)，或含有編碼BCL2胺基酸41-54和MYC胺基酸9-24的肽。(圖 17D
)圖 17B 和 17C
中所示影像的定量。顯示了每種肽濃度下來自雙重核心的平均信號。(圖 17E
)圖 17D
中所示曲線的相關參數。
圖 18A-18C
顯示雙重MYC/BCL2免疫螢光(IF)影像分析。(圖 18A
)來自包括核心的TMA的單個切片，該等核心不含肽(BSA)，或含有指定濃度的編碼BCL2胺基酸41-54和MYC胺基酸9-24的肽。切片用抗BCL2純系124和抗MYC純系Y69依次染色，用Ventana Discovery FAM(BCL2；綠色)或Discovery Cy5(MYC；紅色)套組檢測，然後在每種螢光染料的適當波長下成像。(圖 18B
)圖 18A
所示影像的定量。顯示了每種肽濃度下來自雙重核心的平均信號。誤差棒是±1標準偏差。(圖 18C
)該表總結了圖 18B
中所示曲線的相關參數。
圖 19A 和 19B
顯示聚集的抗BCL2純系124資料。(圖 19A
)將來自圖 12A-12E 和 14A-17E
的資料(n = 10個獨立的IHC測定，每個測定在每個肽濃度下具有雙重的核心)分組並作圖。誤差棒代表1個標準偏差(n=10)。(圖 19B
)圖 19A
中資料的相關參數。
圖 20A 和 20B
將圖 5A-5D
中篩選的抗體針對人KSR2進行染色測試，其中進行和未進行抗原修復。圖 20A
中的影像顯示了不含蛋白質(BSA)或含有6.3×10-6
M所關注蛋白質的BSA凝膠切片，在抗原修復之前，該蛋白質在具有(AR)或沒有(無AR)的情況下用所選擇的小鼠抗體染色。圖 20B
提供了圖 20A
中所示結果的量化。
圖 21A 和 21B
顯示了具有小鼠、大鼠和兔IgG的BSA凝膠。(圖 21A
)由含有初始兔、大鼠或小鼠IgG(0.1毫克/毫升；6.7×10-7
M)的雙重BSA凝膠核心組成的TMA的連續切片用對於來自所示物種的IgG具有特異性的驢二級抗體染色。TMA核心的直徑為1 mm。(圖 21B
)圖 21A
中所示影像的定量：兔IgG抗原(實心棒)；大鼠IgG(散列棒)；小鼠IgG(空心棒)。對於每個物種特異性抗體，含有靶IgG的核心中的信號顯著高於含有非靶IgG的核心(p ＜0.0001)。誤差棒為1 SD。注意，這些資料也在圖 3C
中示出。
圖 22A-22C
顯示使用替代固定劑產生肽凝膠的結果。(圖 22A
)藉由在18.5%甲醛或50%鋅固定劑存在下於85℃加熱10分鐘，用BCL2或MYC肽製備供體核心。將供體塊配製成不含肽(BSA)，或含有編碼BCL2胺基酸41-54和MYC胺基酸9-24的肽。切片用適當的抗BCL2純系124或抗MYC純系Y69染色。(圖 22B
)圖 22A
所示影像的定量。(圖 22C
)圖 22B
所示曲線的相關參數。
圖 23A 和 23B
顯示了測試替代固定劑的結果。(圖 23A
)含有BCL2肽的BSA凝膠藉由在含鋅固定劑(Zn和熱)或濃縮甲醛(37%福爾馬林和熱)存在下加熱至85℃來製備，或在不存在固定劑的情況下加熱至85℃，然後在室溫下在含鋅固定劑(熱，Zn)，4%PFA(熱，4%PFA)或中性緩衝福爾馬林(熱，NBF)中固定。(圖 23B
)圖 23A
中的影像的量化。
圖 24A-24C
顯示BCL2肽TMA的成像質量細胞計數分析。(圖 24A
)TMA切片的代表性視野(約150平方微米)，該等切片用偶聯至146
Nd質譜標籤的抗BCL2純系EPR17509染色，並在Fluidigm Hyperion掃描質譜儀中成像。雙重TMA核心不含有添加的肽(BSA)，含有編碼BCL2蛋白質的胺基酸41-54的肽，或所指示濃度的來自人MCL1蛋白質的陰性對照肽。(圖 24B
)圖 24A
所示影像的定量。誤差棒表示1個標準偏差。(圖 24C
)該表總結了圖 24B
所示曲線的相關參數。Hill斜率參數傳達曲線的陡度。ACHM是半最大信號的抗原濃度。
Claims (24)
- 一種產生用於免疫組織化學(IHC)染色的固體抗原/載體蛋白凝膠的方法，該方法包含：(a)將純化的抗原與包含載體蛋白的液體溶液混合，以產生抗原/載體蛋白液體溶液；和(b)加熱該抗原/載體蛋白液體溶液以形成該固體抗原/載體蛋白凝膠；其中該抗原為多肽抗原，該載體蛋白由血清白蛋白所組成，且該抗原/載體蛋白液體溶液包括交聯劑。
- 如請求項1之方法，其在(b)之後進一步包含：(i)使該固體抗原/載體蛋白凝膠脫水並將脫水的固體抗原/載體蛋白凝膠包埋在石蠟塊中；或(ii)使該固體抗原/載體蛋白凝膠在液體包埋介質中溫育(incubate)並在該包埋介質中冷凍該固體抗原/載體蛋白凝膠；或(iii)將該固體抗原/載體蛋白凝膠包埋在塑性樹脂中；或(iv)將該固體抗原/載體蛋白凝膠切成一個或多個厚度為約30nm至約50μm的固體抗原/載體蛋白凝膠切片。
- 如請求項2之方法，其中該交聯劑為基於醛的固定劑。
- 如請求項3之方法，其中該固定劑包含至少約1%之最終濃度的甲醛。
- 如請求項1之方法，其進一步包含：在(b)之後，使該固體抗原/載體蛋白凝膠脫水；將脫水的固體抗原/載體蛋白凝膠包埋在石蠟塊中；將具有包埋之抗原/載體蛋白凝膠的石蠟塊切成一個或多個厚度為約30nm至約50μm的切片；使包埋的固體抗原/載體蛋白凝膠的一個或多個切片經受抗原修復(antigen retrieval)；及在抗原修復後，封閉該包埋的固體抗原/載體蛋白凝膠的一個或多個切片。
- 如請求項1之方法，其進一步包含：在(b)之後，使該固體抗原/載體蛋白凝膠在液體包埋介質中溫育(incubate)；在該包埋介質中冷凍該固體抗原/載體蛋白凝膠；將冷凍的固體抗原/載體蛋白凝膠切成一個或多個厚度為約30nm至約50μm的切片；及封閉該冷凍的抗原/載體蛋白凝膠的一個或多個切片。
- 如請求項1之方法，其中該抗原包含N-末端酪胺酸、C-末端半胱胺酸或兩者。
- 如請求項7之方法，其中該交聯劑為半胱胺酸反應性試劑。
- 如請求項1之方法，其中該血清白蛋白為牛、山羊、馬或人血清白蛋白， 且其中在(a)中產生的該抗原/載體蛋白液體溶液包含濃度大於或等於2%(w/v)且小於或等於25%(w/v)的載體蛋白。
- 如請求項1之方法，其中該抗原/載體蛋白液體溶液在(b)中加熱至至少約65℃。
- 一種固體抗原/載體蛋白凝膠，其係藉由如請求項1至10中任一項之方法產生。
- 一種組織微陣列(tissue microarray，TMA)，其至少包含藉由如請求項1至10中任一項之方法產生的第一固體抗原/載體蛋白凝膠和藉由如請求項1至10中任一項之方法產生的第二固體抗原/載體蛋白凝膠。
- 一種用於免疫組織化學(IHC)染色的固體抗原/載體蛋白凝膠，其包含與載體蛋白交聯的純化抗原，其中該抗原為多肽抗原，該載體蛋白由血清白蛋白所組成，且該固體凝膠已在交聯劑存在下形成。
- 如請求項13之固體凝膠，其中該固體凝膠在包埋介質中冷凍；或該固體凝膠在石蠟中包埋；或該固體凝膠在塑性樹脂中包埋。
- 如請求項14之固體凝膠，其中該交聯劑為基於醛之固定劑。
- 如請求項15之固體凝膠，其中該固定劑包含至少約1%之濃度的甲醛。
- 如請求項16之固體凝膠，其中該抗原包含N-末端酪胺酸、C-末端半胱胺酸或兩者。
- 如請求項17之固體凝膠，其中該交聯劑為半胱胺酸反應性試劑。
- 如請求項13至18中任一項之固體凝膠，其中該血清白蛋白為牛、山羊、馬或人血清白蛋白，且其中該固體凝膠包含濃度大於或等於2%(w/v)且及小於或等於25%(w/v)的載體蛋白。
- 一種組織微陣列(TMA)，其包含至少第一和第二固體抗原/載體蛋白凝膠，其中該等第一和第二固體抗原/載體蛋白凝膠均包含與載體蛋白交聯的純化抗原，其中該抗原為多肽抗原，該載體蛋白由血清白蛋白所組成，且該固體凝膠已在交聯劑存在下形成。
- 一種用於抗原的免疫組織化學(IHC)染色的方法，其包含：提供如請求項11的固體抗原/載體蛋白凝膠或藉由如請求項1之方法產生的固體抗原/載體蛋白凝膠，其中該固體抗原/載體蛋白凝膠含有該抗原；提供樣品；使該固體抗原/載體蛋白凝膠和該樣品與特異性結合該抗原的一級抗體接觸；在使該固體抗原/載體蛋白凝膠和該樣品與該一級抗體接觸之後，使該固體抗原/載體蛋白凝膠和該樣品與特異性結合該一級抗體的二級抗體接觸，其中可 檢測部分(moiety)與該二級抗體偶聯；從該固體抗原/載體蛋白凝膠中檢測該可檢測部分的信號；和從該樣品中檢測該可檢測部分的信號，其中與從該固體抗原/載體蛋白凝膠檢測到的信號相比，檢測到來自該樣品的該信號表明該樣品中存在該抗原。
- 一種用於抗原的對照免疫組織化學(IHC)染色的方法，其包含：提供第一和第二固體抗原/載體蛋白凝膠，其中該等第一和第二固體抗原/載體蛋白凝膠中的每一者係如請求項13或藉由如請求項1之方法產生，其中該第一固體抗原/載體蛋白凝膠含有第一濃度的該抗原，並且其中該第二固體抗原/載體蛋白凝膠含有高於該第一濃度的第二濃度的該抗原；使該等第一和第二固體抗原/載體蛋白凝膠與特異性結合該抗原的一級抗體接觸；在使該等第一和第二固體抗原/載體蛋白凝膠與該一級抗體接觸後，使該等第一和第二固體抗原/載體蛋白凝膠與特異性結合該一級抗體的二級抗體接觸，其中可檢測部分(moiety)與該二級抗體偶聯；從該第一固體抗原/載體蛋白凝膠中檢測該可檢測部分的第一信號；和從該第二固體抗原/載體蛋白凝膠中檢測該可檢測部分的第二信號，其中檢測到大於該第一信號的第二信號表明該抗原的對照IHC染色。
- 一種用二級抗體進行對照免疫組織化學(IHC)染色的方法，其包含：提供第一和第二固體抗原/載體蛋白凝膠，其中該等第一和第二固體抗原/載體蛋白凝膠中的每一者係如請求項13或藉由如請求項1之方法產生，其中該第一固體抗原/載體蛋白凝膠包含具有第一同種型(isotype)的第一抗體，並且其 中該第二固體抗原/載體蛋白凝膠包含具有不同於該第一同種型的第二同種型的第二抗體；使該等第一和第二固體抗原/載體蛋白凝膠與特異性結合該第一同種型的二級抗體接觸，其中可檢測部分(moiety)與該二級抗體偶聯；從該第一固體抗原/載體蛋白凝膠中檢測該可檢測部分的信號；和檢測到缺乏來自該第二固體抗原/載體蛋白凝膠的該可檢測部分的該信號，其中檢測到與該第一固體抗原/載體蛋白凝膠相關的該信號和缺乏與該第二固體抗原/載體蛋白凝膠相關的該信號表示用該二級抗體進行對照染色。
- 一種用於抗原的對照免疫組織化學(IHC)染色的套組，其包含：(a)第一固體凝膠，其包含與載體蛋白交聯的純化抗原，其中該抗原為多肽抗原，該載體蛋白由血清白蛋白所組成，該第一固體凝膠已在交聯劑存在下形成，且該純化抗原以第一濃度存在於該第一固體凝膠中；和(b)第二固體凝膠，其包含與該載體蛋白交聯的該純化抗原，其中該第二固體凝膠已在交聯劑存在下形成，且該純化抗原以不同於該第一濃度的第二濃度存在於該第二固體凝膠中。
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