TWI790356B - 直接飼喂微生物在預防和/或治療動物中的基於大腸桿菌的感染中之用途 - Google Patents
直接飼喂微生物在預防和/或治療動物中的基於大腸桿菌的感染中之用途 Download PDFInfo
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Abstract
描述了一種用於預防和/或治療動物中的基於大腸桿菌的感染之組成物及方法。
Description
本領域涉及直接飼喂微生物在預防和/或治療患有基於大腸桿菌的感染的動物中之用途。背景技術
大腸桿菌( Escherichia coli , E. Coli )
係一種革蘭氏陰性、桿狀細菌,通常棲息在大多數哺乳動物和鳥類物種的腸道菌群或腸道生態系統中。基於菌體(O)抗原、莢膜(K)抗原、纖毛(F)抗原和鞭毛(H)抗原,將大腸桿菌分類為150至200個血清型或血清組。大多數大腸桿菌係共生體,即,它們棲息於腸道中但對宿主動物無害。只有一小部分的菌株係致病性的,能產生毒力因子,使得它們引起疾病。一些大腸桿菌具有組合的、未知與疾病相關的毒力基因,並且這些大腸桿菌可被認為是潛在致病性的。所有大腸桿菌都可以攜帶抗微生物劑抗性基因。
在動物中,大腸桿菌的毒力菌株造成了多種疾病,其中包括新生牛犢的敗血症和腹瀉、奶牛的急性乳腺炎、家禽的大腸桿菌病(其還與支原體引起的肝周炎、心包炎、肺部敗血症、腹膜炎等慢性呼吸道疾病相關)、以及犬的阿拉巴馬腐爛(Alabama rot)。
大腸桿菌細菌藉由糞便不斷地流入動物的直接環境中,並且污染室內棲息的動物的圍欄、墊料和地面以及室外動物的土壤。它們可以存留很長時間,或許能存留超過10周,並藉由泥漿和糞肥傳播到施肥的田地和作物以及地下水和地表水中。
大腸桿菌藉由污染的飼料、處理者和飲用水傳播給其他動物,並且可能藉由運輸卡車等交通工具在農場與農場之間傳播。在鳥類的情況下,感染藉由口途徑或藉由吸入受污染的粉塵發生。來自動物的大腸桿菌也可藉由直接接觸,或攝取糞肥傳播後被污染的食品或水,或攝取屠宰場獸體污染後的肉類傳播給人類。產腸毒素大腸桿菌(EnterotoxigenicEscherichia ( E. ) coli
)(ETEC)引起的腸道感染係幼畜(例如豬和小牛)中最常見的大腸桿菌病類型,通常表現為嚴重的水瀉。這也是旅行者中腹瀉(“旅行者腹瀉”)和發展中國家兒童腹瀉的重要原因。
豬中的ETEC通常具有傳染性,在若干病豬和從一批到另一批豬中且以高數量發現了相同的菌株。這些菌株通常僅在感染後幾天內流出,這可能是由於免疫力的發展。
抗生素在治療人類和動物方面的使用導致了抗微生物抗性,現在已成為全球主要的健康威脅。正在尋求開發抗生素替代品以解決該全球健康問題。因此,需要找到新的和替代的方法,來預防和/或治療動物中的基於大腸桿菌的感染。
在一個實施方式中,公開了一種用於預防和/或治療動物中的基於大腸桿菌的感染之組成物,其中所述組成物包含直接飼喂微生物的基於芽孢桿菌屬(Bacillus
)的組分,該組分包含枯草芽孢桿菌(Bacillus subtilis
)菌株3BP5(NRRL B-50510)、解澱粉芽孢桿菌(Bacillus amyloliquefaciens
)918(NRRL B-50508)和15AP4(PTA-6507)。
在第二實施方式中,本文所公開的組成物可以在動物中產生一種或多種性能益處,該性能益處選自由以下各項組成之群組:增加的增重、增重飼料比(gain feed ratio)、改善的腸障壁完整性、降低的死亡率和糞便中減少的大腸桿菌流出。
在第三實施方式中,該直接飼喂微生物呈內生孢子的形式。
在第四實施方式中,本文所述的組成物中的任一種進一步包含至少一種酶,該至少一種酶視需要可以被包入膠囊內。
在第五實施方式中,至少一種酶選自由以下各項組成之群組:植酸酶、蛋白酶、澱粉酶、木聚糖酶和β-葡聚糖酶。
在第六實施方式中,本文所述的組成物中的任一種可以是飼料添加劑組成物或預混物。
在第七實施方式中,公開了包含本文所公開的飼料添加劑組成物中的任一種的飼料。
在第八實施方式中,公開了一種套組(kit),該套組包含本文所公開的飼料添加劑組成物中的任一種和施用說明書。
在第九實施方式中,公開了一種用於預防和/或治療動物中的基於大腸桿菌的感染之方法,該方法包括施用有效量的包含直接飼喂微生物的組成物,該直接飼喂微生物包含枯草芽孢桿菌菌株3BP5(NRRL B-50510)、解澱粉芽孢桿菌918(NRRL B-50508)和15AP4(PTA-6507)。如此施用的組成物可在動物中產生一種或多種性能益處,該性能益處選自由以下各項組成之群組:增加的增重、增重飼料比、改善的腸障壁完整性、降低的死亡率和糞便中減少的大腸桿菌流出。該組成物可涵蓋上文或本公開中其他地方所述的特徵中的任一種。
引用的所有專利、專利申請和出版物均藉由引用以其全文併入本文。
在本公開中,使用了許多術語和縮寫。除非另有特別說明,以下定義適用。
元素或組分前的冠詞“一個/種(a/an)”和“該(the)”關於所述元素或組分的實例(即,事件)的數目旨在是非限制性的。因此,“一個/種(a/an)”和“該(the)”應理解為包括一個/種或至少一個/種,並且元素或組分的單數詞語形式還包括複數,除非該數字明顯意指單數。
術語“包含”意指如申請專利範圍中所提及的說明的特徵、整數、步驟或組分的存在,而並未排除一個或多個其他特徵、整數、步驟、組分或其組的存在或添加。術語“包含”旨在包括由術語“基本上由…組成”和“由…組成”所涵蓋的實施方式。類似地,術語“基本上由…組成”旨在包括由術語“由…組成”所涵蓋的實施方式。
在存在的情況下,所有範圍係包含端值的和可組合的。例如,當列舉“1至5”的範圍時,所列舉的範圍應解釋為包括“1至4”、“1至3”、“1至2”、“1至2和4至5”、“1至3和5”等範圍。
如本文與數值結合使用的術語“約”係指數值的+/- 0.5的範圍,除非該術語在上下文中另有具體定義。例如,短語“約6的pH值”係指pH值為從5.5至6.5,除非該pH值另有具體定義。
在本說明書全文中給出的每一最大數值限度旨在包括每一較低數值限度,如同此類較低數值限度在此明確寫出一樣。在本說明書全文中給出的每一最小數值限度將包括每一較高數值限度,如同此類較高數值限度在此明確寫出一樣。在本說明書全文中給出的每一數值範圍將包括落入此類較寬數值範圍內的每一較窄數值範圍,如同此類較窄數值範圍在此全部明確寫出一樣。
術語“動物”和“受試者”在本文中可互換地使用。動物包括所有非反芻動物(包括人類)和反芻動物。在具體實施方式中,該動物係非反芻動物,例如馬和單胃動物。單胃動物的實例包括但不限於豬(pig和swine),例如仔豬、生長豬、母豬;家禽,例如火雞、鴨、小雞、肉仔雞、蛋雞;魚,例如鮭魚、鱒魚、吳郭魚、鯰魚和鯉魚;以及甲殼類,例如蝦和對蝦。在一個另外的實施方式中,動物可以是多胃的,例如,反芻動物,包括但不限於牛、小牛、山羊、綿羊、長頸鹿、北美野牛、駝鹿、麋鹿、犛牛、水牛、鹿、駱駝、羊駝、美洲駝、羚羊、叉角羚和鹿牛羚。
如本文所使用的術語“反芻動物”係指能夠在消化之前藉由在專門的胃中發酵(主要地藉由微生物作用)基於植物的食物而從其獲取營養素的哺乳動物。該過程通常需要將發酵的攝取物(稱為反芻的食物(cud))反芻和再次咀嚼。再次咀嚼反芻的食物以進一步分解植物物質並且刺激消化的過程被稱為反芻。大約150種反芻動物包括馴養和野生物種。反芻動物包括但不限於牛、奶牛、山羊、綿羊、長頸鹿、犛牛、鹿、麋鹿、羚羊、水牛等。
如本文所使用的,術語“CFU”意指“菌落形成單位”並且是代表衍生自單個祖細胞的細胞聚集的菌落中的活細胞的測量。
如本文所使用的,術語“直接飼喂微生物”(“DFM”)係活的(有活力的)天然存在的微生物的來源。DFM可以包含一個或多個這樣的天然存在的微生物,例如細菌菌株。DFM的類別包括形成孢子的細菌,例如芽孢桿菌屬和梭菌屬(Clostridium
),以及非形成孢子的細菌,例如乳酸菌、酵母和真菌。因此,術語DFM涵蓋以下一種或多種:直接飼喂細菌、直接飼喂酵母、直接飼喂酵母或真菌及其組合。
芽孢桿菌屬是獨特的、形成孢子的革蘭氏陽性桿菌。這些孢子非常穩定,並且可以承受環境條件,如熱、濕氣和一定範圍的pH。這些孢子當被動物攝入後會萌發成有活性的營養細胞,並可用於粗粉和壓成丸粒的飲食中。
如本文所使用的術語“基於芽孢桿菌屬的組分”係指 (i) 基於芽孢桿菌屬的直接飼喂微生物,其包含本文所述的芽孢桿菌屬細菌菌株,(ii) 從由這些菌株製備的芽孢桿菌屬培養物中獲得的上清液,或 (iii) (i) 和 (ii) 的組合。
“飼料”和“食品”分別意指任何天然或人造飲食、膳食等,或此類膳食的組分,其意在或適合於分別被非人類動物和人類食用、攝取、消化。
如本文所使用的,術語“食品”以廣義使用 - 並且涵蓋用於人類的食品和食品產品以及用於非人類動物的食品(即飼料)。
關於在飼養家畜時餵養動物的產品,使用術語“飼料”。術語“飼料”和“動物飼料”可以互換使用。在一個較佳的實施方式中,該食品或飼料供單胃動物和多胃動物食用。
如本文所使用的,術語“益生菌”定義了當例如以足夠數量攝取或局部應用時,有益地影響宿主生物體(即藉由賦予宿主生物體一個或多個可證明的健康益處)的活的微生物(包括例如細菌或酵母)。益生菌可以改善一個或多個粘膜表面的微生物平衡。例如,粘膜表面可以是腸、泌尿道、呼吸道或皮膚。如本文所使用的,術語“益生菌”還涵蓋可以刺激免疫系統的有益分支並同時減少在粘膜表面(例如腸)中的炎症反應的活的微生物。雖然沒有益生菌攝入的下限或上限,但是已經表明,至少106
-1012
,較佳的是至少106
-1010
,較佳的是108
-109
cfu作為日劑量將在受試者中有效地實現有益的健康效果。
術語“益生菌”意指藉由選擇性地刺激一種或有限數量的有益細菌的生長和/或活性來有益地影響宿主的不可消化食物成分。
如本文所使用的術語“病原體”意指任何疾病的致病物。這樣的致病物可以包括但不限於細菌、病毒、真菌致病物等。
術語“基於大腸桿菌的感染”係指由大腸桿菌細菌引起的疾病或感染,例如腹瀉。
術語“衍生自”和“獲自”不僅是指由所討論的生物體的菌株生產或可以由其生產的蛋白質,而且是指由從此類菌株分離的DNA序列編碼並且在含有此類DNA序列的宿主生物體中生產的蛋白質。另外,該術語係指由合成來源和/或cDNA來源的DNA序列編碼並且具有所討論的蛋白質的鑒定特徵的蛋白質。
術語“有效量”係指向動物施用以達到所希望效果的特定組分的足夠量。
在一個實施方式中,本公開了一種用於預防和/或治療動物中的基於大腸桿菌的感染之組成物,其中所述組成物包含直接飼喂微生物的基於芽孢桿菌屬的組分,該組分包含枯草芽孢桿菌菌株3BP5(NRRL B-50510)、解澱粉芽孢桿菌菌株918(NRRL B-50508)和15AP4(PTA-6507)。
在第二實施方式中,本文所公開的組成物可以在動物中產生一種或多種性能益處,該性能益處選自由以下各項組成之群組:增加的增重、增重飼料比、改善的腸障壁完整性和糞便中減少的大腸桿菌流出。
本文所述的基於芽孢桿菌屬的DFM組分可包含活細菌或可包含上清液或可以是活細菌和培養上清液的組合。較佳的基於芽孢桿菌屬的DFM組分係活細菌。
在一個實施方式中,DFM可以是形成孢子的細菌菌株,並且因此該術語DFM可以由孢子組成或包含孢子,例如細菌孢子。因此,如本文所使用的“活細菌”可包括細菌孢子,例如內生孢子或分生孢子。可替代地,本文所述飼料添加劑組成物中的DFM可不由細菌孢子組成或不包含細菌孢子,例如內生孢子或分生孢子。
本文所述的基於芽孢桿菌屬的DFM組分係以下菌株的組合: 枯草芽孢桿菌菌株3BP5登錄號NRRL B-50510、 解澱粉芽孢桿菌菌株918 ATCC登錄號NRRL B-50508、和 解澱粉芽孢桿菌菌株1013 ATCC登錄號NRRL B-50509。
菌株3BP5和菌株1013描述於2013年2月28日公開的WO 2013-329013中。
菌株15AP4描述於2005年11月17日公佈的US 2005-0255092中。
在某些實施方式中,重要的是基於芽孢桿菌屬的DFM組分具有對熱的耐受性,即是耐熱性的,例如是形成孢子的。當飼料粒化時尤其如此。芽孢桿菌屬能在生長不利的條件下形成穩定的內生孢子,並且對熱、pH、水分和消毒劑有很強的抵抗力。如果細菌/DFM不是孢子形成物,那麼它應該被保護使其在如下文所述的飼料加工中存活。
如本文所述的基於芽孢桿菌屬的組分可以作為一種或多種培養物和一種或多種載體製備(如果使用的話),並可以將它們添加到條帶或槳式混合器中,並且混合約15分鐘,儘管時間可以增加或減少。將組分混合,這樣使得產生培養物和載體的均勻混合物。最終產物較佳的是乾燥的可流動粉末。因此,基於芽孢桿菌屬的組分可包含:基於芽孢桿菌屬的直接飼喂微生物,該直接飼喂微生物包含本文所述的三種芽孢桿菌屬細菌菌株、或從芽孢桿菌屬培養物中獲得的上清液、或一種或多種芽孢桿菌屬細菌菌株和上清液的組合。然後可以將此類基於芽孢桿菌屬的組分添加到動物飼料或飼料預混物中。可以將它添加到動物飼料的頂部(“頂部加料”),或者可以將它添加到液體中,例如動物的飲用水中。
在如本文所述的基於芽孢桿菌屬的DFM中包含單個菌株的比例可以從1%到99%不等,較佳的是從25%到75%不等。
動物飼料中如本文所述的基於芽孢桿菌屬的組分的合適劑量的範圍可以為約1x103
CFU/g飼料至約1x1010
CFU/g飼料,適當地在約1x104
CFU/g飼料至約1x108
CFU/g飼料之間,適當地在約7.5x104
CFU/g飼料至約1x107
CFU/g飼料之間。
熟悉該項技術者將容易地知道來自本文所述屬中的特定微生物物種和/或菌株,其用於食品和/或農業工業中並且其通常被認為適合於動物消費。動物飼料可以包括植物材料,例如玉米、小麥、高粱、大豆、低芥酸菜籽、向日葵,或針對家禽、豬、反芻動物、水產養殖和寵物的這些植物材料或植物蛋白源中的任一種的混合物。
術語“動物飼料”、“飼料”和“餵養料”可互換地使用,並且包含選自下組的一種或多種飼料原料,該組包含:a) 穀類,例如小粒穀物(例如小麥、大麥、黑麥、燕麥及其組合)和/或大粒穀物(例如玉蜀黍或高粱);b) 來自穀類的副產物,例如玉米穀蛋白粉、具有可溶物的乾酒糟(Distillers Dried Grains with Solubles)(DDGS)(特別是基於玉米的具有可溶物的乾酒糟(cDDGS))、小麥麩、粗小麥粉、次麥粉、米糠、稻殼、燕麥殼、棕櫚仁和柑橘渣;c) 獲自以下來源的蛋白質:例如大豆、向日葵、花生、羽扇豆、豌豆、蠶豆、棉花、低芥酸菜籽、魚粉、乾血漿蛋白質、肉和骨粉、馬鈴薯蛋白、乳清、乾椰肉、芝麻;d) 獲自植物和動物來源的油和脂肪;和/或e) 礦物質和維生素。
當用作或用於製備飼料(例如功能性飼料)時,如本文所述的基於芽孢桿菌屬的組分可以與以下中的一種或多種結合使用:營養上可接受的載體、營養上可接受的稀釋劑、營養上可接受的賦形劑、營養上可接受的輔劑、營養活性成分。例如,可以提及至少一種選自下組的組分,該組由以下組成:蛋白質、肽、蔗糖、乳糖、山梨醇、甘油、丙二醇、氯化鈉、硫酸鈉、醋酸鈉、檸檬酸鈉、甲酸鈉、山梨酸鈉、氯化鉀、硫酸鉀、醋酸鉀、檸檬酸鉀、甲酸鉀、醋酸鉀、山梨酸鉀、氯化鎂、硫酸鎂、醋酸鎂、檸檬酸鎂、甲酸鎂、山梨酸鎂、偏亞硫酸氫鈉、對羥基苯甲酸甲酯和對羥基苯甲酸丙酯。
在一個較佳的實施方式中,如本文所述的基於芽孢桿菌屬的組分可與飼料組分混合以形成餵養料。如本文所使用的術語“飼料組分”意指餵養料的全部或部分。餵養料的部分可意指餵養料的一種成分或餵養料的一種以上(例如2種或3種或4種或更多種)成分。在一個實施方式中,術語“飼料組分”涵蓋預混物或預混物成分。較佳的是,飼料可以是秣料或其預混物、複合飼料或其預混物。包含如本文所述的基於芽孢桿菌屬的組分的飼料添加劑組成物可以與複合飼料混合或混合至複合飼料的預混物中,或混合至秣料中、秣料組分中或秣料的預混物中。
如本文所使用的,術語秣料意指提供給動物的任何食物(而不是動物必須自己覓食)。秣料涵蓋已經切下的植物。
術語秣料包括乾草、稈、青貯飼料、壓縮飼料和顆粒飼料、油和混合口糧,並且也包括發芽穀物和豆類。
秣料可獲自選自以下的植物中的一種或多種:苜蓿(alfalfa,lucerne)、大麥、百脈根(birdsfoot trefoil)、蕓薹屬(brassicas)、Chau moellier、羽衣甘藍、油菜籽(低芥酸菜籽)、蕪菁甘藍(瑞典甘藍)、蘿蔔、三葉草、雜種三葉草、紅三葉草、地下三葉草、白三葉草、草、燕麥草(false oat grass)、羊茅草、狗牙根(Bermuda grass)、雀麥草、石南草(heath grass)、草地早熟禾(meadow grasses)(來自天然混合的草原草地)、野茅(orchard grass)、黑麥草、梯牧草(Timothy-grass)、玉米(玉蜀黍)、粟、燕麥、高粱、大豆、樹(用作樹-乾草的修剪下的樹嫩枝)、小麥、和豆科植物。
術語“複合飼料”意指呈粗粉、丸粒、球丸(nut)、餅或碎屑形式的商業飼料。複合飼料可由多種原料和添加劑共混而來。根據目標動物的特定需求配製這些共混物。
複合飼料可以是提供所有每日所需營養素的完全飼料、提供口糧(蛋白質、能量)的一部分的濃縮物、或僅提供另外的微量營養素(例如礦物質和維生素)的補充劑。
用於複合飼料的主要成分係飼料穀物,所述飼料穀物包括玉米、大豆、高粱、燕麥、和大麥。
合適地,如本文所提及的預混物可以是由微量成分構成的組成物,所述微量成分為例如維生素、礦物質、化學防腐劑、抗生素、發酵產物和其他必需成分。預混物通常是適合於共混進商業口糧內的組成物。
本文所述的任何餵養料可包含一種或多種選自下組的飼料材料,該組包含:a) 穀類,例如小粒穀物(例如小麥、大麥、黑麥、燕麥、及其組合)和/或大粒穀物(例如玉蜀黍或高粱);b) 來自穀類的副產物,例如玉米蛋白粉、乾酒糟穀物可溶物(Distillers Dried Grain Soluble)(DDGS)、小麥麩、粗小麥粉、次麥粉、米糠、稻殼、燕麥殼、棕櫚仁和柑橘渣;c) 獲自以下來源的蛋白質:例如大豆、向日葵、花生、羽扇豆、豌豆、蠶豆、棉花、低芥酸菜籽、魚粉、乾血漿蛋白質、肉和骨粉、馬鈴薯蛋白、乳清、乾椰肉、芝麻;d) 獲自植物和動物來源的油和脂肪;e) 礦物質和維生素。
此外,這樣的餵養料可含有按重量計至少30%、至少40%、至少50%或至少60%的玉米和大豆粉、或者玉米和全脂大豆、或者小麥粉或向日葵粉。
另外或可替代地,餵養料可包含至少一種高纖維飼料材料和/或至少一種高纖維飼料材料的至少一種副產物以提供高纖維餵養料。高纖維飼料材料的實例包括:小麥,大麥,黑麥,燕麥,來自穀類的副產物,例如玉米蛋白粉、具有可溶物的乾酒糟(DDGS)、麥麩、粗小麥粉、次麥粉、米糠、稻殼、燕麥殼、棕櫚仁和柑橘渣。一些蛋白質源也可視為高纖維:獲自例如向日葵、羽扇豆、蠶豆和棉花等來源的蛋白質。
如本文所述,飼料可為以下中的一種或多種:複合飼料和預混物,包括丸粒、球丸或(牲畜)餅;作物或作物殘餘物:玉米、大豆、高粱、燕麥、大麥、玉米稈、椰子核、稻草、穀殼、甜菜殘渣;魚粉;新割的草和其他飼用植物;肉粉和骨粉;糖蜜;油餅和濾餅;低聚糖;糖漬飼用植物:乾草和青貯飼料;海草;種子和穀物,完整的或藉由壓碎、碾磨等製備;發芽穀物及豆類;酵母提取物。
如本文所使用的,術語飼料在一些實施方式中還涵蓋寵物食品。寵物食品係旨在由寵物消費的植物或動物材料,例如狗食品或貓食品。寵物食品(例如狗和貓食品)可以處於乾燥形式(例如用於狗的磨碎食物)或濕罐裝形式。貓食品可含有胺基酸牛磺酸。
術語飼料在一些實施方式中還可涵蓋魚食。魚食通常含有使養殖魚保持良好健康所需的大量營養素、痕量元素和維生素。魚食可以呈小片、丸粒或片的形式。壓成丸粒的形式(其中的一些快速沈降)經常用於較大魚或底飼物種。一些魚食還含有添加劑(例如β胡蘿蔔素或性激素)以人工增強觀賞性魚的顏色。
還涵蓋在術語“飼料”中的是鳥食,鳥食包括用於喂鳥器中使用的食物以及用於飼喂寵物鳥的食物。典型地,鳥食由多種種子組成,但也可涵蓋板油(牛肉或羊肉脂肪)。
如本文所使用的,術語“接觸”係指將飼料添加劑組成物間接或直接應用至產品(例如飼料)中。可以使用的應用方法的實例包括但不限於:在包含飼料添加劑組成物的材料中處理產品、藉由將飼料添加劑組成物與產品混合而直接應用、將飼料添加劑組成物噴塗至產品表面上或將產品浸入飼料添加劑組成物的製劑中。
基於芽孢桿菌屬的組分可以較佳的是與產品(例如,餵養料)混合。可替代地,餵養料的乳液或原始成分中可包括基於芽孢桿菌屬的組分。
對於一些應用而言,重要的是,使基於芽孢桿菌屬的組分在待影響/處理的產品表面上可用或可用於待影響/處理的產品表面。
可應用基於芽孢桿菌屬的組分,以用受控量的基於芽孢桿菌屬的組分散佈、塗布和/或浸漬產品(例如餵養料或餵養料的原始成分)。
本文所述的DFM能以合適的濃度添加,例如,以在最終飼料產品中給出如下每日劑量的濃度:約2x103
CFU/g飼料至約2x1011
CFU/g飼料,合適地約2x106
至約1x1010
,合適地約3.75x107
CFU/g飼料至約1x1010
CFU/g飼料。
較佳的是,基於芽孢桿菌屬的組分對高至約70ºC、高至約85ºC、或高至約95ºC的熱處理將是熱穩定的。熱處理可以進行約30秒到若干分鐘。術語“熱穩定”意指在加熱至指定溫度之前存在/有活性的基於芽孢桿菌屬的組分的至少約50%在冷卻至室溫之後仍存在/有活性。在一個特別較佳的實施方式中,將基於芽孢桿菌屬的組分均質化,以產生粉末。
可替代地,將基於芽孢桿菌屬的組分配製成如WO 2007/044968中所述的顆粒(稱為TPT顆粒),該文獻藉由引用併入本文。
在另一個較佳的實施方式中,當將飼料添加劑組成物配製成顆粒時,這些顆粒包含包覆在蛋白質核心上的水合障壁鹽。這樣的鹽塗層的優點係改善的耐熱性、改善的保藏穩定性和保護免受其他原本會不利影響該至少一種蛋白酶和/或包含一種或多種細菌菌株的DFM的飼料添加劑的影響。較佳的是,用於鹽塗層的鹽在20ºC具有大於0.25的水活度或大於60%的恒定濕度。較佳的是,鹽塗層包含Na2
SO4
。
含有基於芽孢桿菌屬的組分的飼料可以使用飼料製丸製程生產。視需要,製丸步驟可包括在丸粒形成之前進行的蒸汽處理或調理階段。可將包含粉末的混合物置於調節器中,例如帶有蒸汽注射的混合器。將該混合物在高至指定溫度(例如從60ºC-100ºC)的調節器中加熱,典型的溫度將是70ºC、80ºC、85ºC、90ºC或95ºC。停留時間可以是從幾秒鐘到幾分鐘並且甚至幾小時不等。例如5秒鐘、10秒鐘、15秒鐘、30秒鐘、1分鐘、2分鐘、5分鐘、10分鐘、15分鐘、30分鐘和1小時。
關於顆粒,至少一個塗層可包含構成所述顆粒的至少55% w/w的水分水合材料;和/或至少一個塗層可包含兩層塗層。所述兩層塗層可為水分水合塗層和防潮層塗層。在一些實施方式中,所述水分水合塗層可為所述顆粒的25% w/w至60% w/w並且所述防潮層塗層可為所述顆粒的2% w/w至15% w/w。所述水分水合塗層可選自無機鹽、蔗糖、澱粉和麥芽糖糊精,並且所述防潮層塗層可選自聚合物、樹膠、乳清和澱粉。
所述顆粒可使用飼料製丸製程產生,並且所述飼料預處理製程可在70ºC至95ºC(例如在85ºC至95ºC)進行長達若干分鐘。
可將基於芽孢桿菌屬的組分配製成用於動物飼料的顆粒,所述顆粒包含:芯;活性劑,在儲存之後以及在顆粒作為一種成分的蒸汽加熱製丸製程之後,所述顆粒的活性劑保持至少80%活性;防潮層塗層;和水分水合塗層,其至少為所述顆粒的25% w/w,所述顆粒在蒸汽加熱製丸製程之前具有小於0.5的水活度。
所述顆粒可具有選自聚合物和樹膠的防潮層塗層並且所述水分水合材料可為無機鹽。所述水分水合塗層可為所述顆粒的25% w/w至45% w/w並且所述防潮層塗層可為所述顆粒的2% w/w至10% w/w。
顆粒可使用蒸汽加熱製丸製程生產,該製程可在85ºC至95ºC進行長達若干分鐘。
可替代地,所述組成物處於適合消耗的液體製劑中,較佳的是,這種液體消耗品含有以下中的一種或多種:緩衝劑、鹽、山梨醇和/或甘油。
此外,可藉由將該基於芽孢桿菌屬的組分施用(例如噴塗)於載體底物(例如像碾碎的小麥)上來配製飼料添加劑組成物。
在一個實施方式中,包含如本文所述的基於芽孢桿菌屬的組分的這樣的飼料添加劑組成物可以被配製成預混物。僅舉個實例,該預混物可包含一種或多種飼料組分,例如一種或多種礦物質和/或一種或多種維生素。
可替代地,所述組成物處於適合消耗的液體製劑中,較佳的是,這種液體消耗品含有以下中的一種或多種:緩衝劑、鹽、山梨醇和/或甘油。
此外,可藉由將該基於芽孢桿菌屬的組分施用(例如,噴塗)於載體底物(例如像碾碎的小麥)上來配製飼料添加劑組成物。
在一個實施方式中,如本文所述的基於芽孢桿菌屬的組分可以被配製成預混物。僅舉個實例,該預混物可包含一種或多種飼料組分,例如一種或多種礦物質和/或一種或多種維生素。
應當理解,如本文所公開的基於芽孢桿菌屬的組分適合用於添加至任何適當的飼料材料中。
如本文所使用的,術語飼料材料係指由動物消耗的基礎飼料材料。進一步應當理解,飼料材料可以包括例如至少一種或多種未加工的穀物和/或加工過的植物和/或動物材料,如大豆粉或骨粉。
技術人員將理解,不同的動物需要不同的餵養料,甚至同一種動物也可能需要不同的餵養料,這取決於飼養該動物的目的。
較佳的是,餵養料可包含如下飼料材料,其包含玉蜀黍或玉米、小麥、大麥、黑小麥、黑麥、水稻、木薯、高粱和/或任何副產物,以及富含蛋白質的組分,如大豆粉、油菜籽粉、低芥酸菜籽粉、棉籽粉、向日葵籽粉、動物副產物粉及其混合物。更較佳的是,餵養料可包括動物脂肪和/或植物油。
視需要,餵養料還可含有另外的礦物質(例如鈣)和/或另外的維生素。較佳的是,餵養料為玉米大豆粉混合物。
在另一個方面,提供了一種用於生產餵養料之方法。餵養料典型地在飼料磨機中生產,在磨機中首先將原料研磨成合適的粒度,然後與適當的添加劑混合。然後,可以將餵養料生產成糊狀或丸粒;後者通常涉及這樣的方法,藉由該方法將溫度升高至目標水平,然後使飼料藉由模具從而生產出特定大小的丸粒。讓丸粒冷卻。隨後,可添加液體添加劑例如脂肪和酶。生產餵養料也可涉及另外的步驟,該步驟包括製丸之前的擠出或膨脹,尤其是藉由至少可包括使用蒸汽的適宜技術進行的擠出或膨脹。
餵養料可為單胃動物的餵養料,諸如家禽(例如肉雞、蛋雞、肉種雞、火雞、鴨子、鵝、水禽)、生豬(所有年齡段)、寵物(例如狗、貓)或魚,較佳的是,餵養料為家禽的餵養料。
本文所述的基於芽孢桿菌屬的組分可以置於動物飼料的頂部,即,頂部加料。可替代地,本文所述的基於芽孢桿菌屬的組分可以添加到液體中,例如動物的飲用水中。
如本文所使用的,術語“接觸”係指間接或直接將如本文所述的基於芽孢桿菌屬的組分應用到產品(例如飼料)中。
可以使用的應用方法的實例包括但不限於:在包含基於芽孢桿菌屬的組分的材料中處理產品、藉由將包含如本文所述的基於芽孢桿菌屬的組分的飼料添加劑組成物與產品混合而直接應用、將這樣的飼料添加劑組成物噴塗至產品表面上或將產品浸入飼料添加劑組成物的製劑中。在一個實施方式中,較佳的是將包含如本文所述的基於芽孢桿菌屬的組分的飼料添加劑組成物與產品(例如餵養料)混合。可替代地,餵養料的乳液或原始成分中可包括飼料添加劑組成物。這允許所述組成物賦予性能益處。
製備如本文所述的基於芽孢桿菌屬的組分的方法還可以包括將粉末製成丸粒的另外步驟。粉末可以與本領域已知的其他組分進行混合。可強加力使粉末、或包含粉末的混合物通過模具,並將所得線料切成適宜的不同長度的丸粒。
視需要,製丸步驟可包括在丸粒形成之前進行的蒸汽處理或調理階段。可將包含粉末的混合物置於調節器中,例如帶有蒸汽注射的混合器。將混合物在高至指定溫度(例如從60ºC-100ºC)的調節器中加熱,典型的溫度將是70ºC、80ºC、85ºC、90ºC、或95ºC。停留時間可以是從幾秒鐘到幾分鐘並且甚至幾小時不等。例如5秒鐘、10秒鐘、15秒鐘、30秒鐘、1分鐘、2分鐘、5分鐘、10分鐘、15分鐘、30分鐘和1小時。
技術人員將理解,不同的動物需要不同的餵養料,甚至同一種動物也可能需要不同的餵養料,這取決於飼養該動物的目的。
視需要,餵養料還可含有另外的礦物質(例如鈣)和/或另外的維生素。在一些實施方式中,餵養料為玉米大豆粉混合物。
餵養料典型地在飼料磨機中生產,在磨機中首先將原料研磨成合適的粒度,然後與適當的添加劑混合。然後,可以將餵養料生產成糊狀或丸粒;後者通常涉及這樣的方法,藉由該方法將溫度升高至目標水平,然後使飼料藉由模具從而生產出特定大小的丸粒。讓丸粒冷卻。隨後,可添加液體添加劑例如脂肪和酶。製備餵養料也可涉及另外的步驟,該步驟包括製丸之前的擠出或膨脹,尤其是藉由至少可包括使用蒸汽的適宜技術進行的擠出或膨脹。
如上所述,基於芽孢桿菌屬的組分和/或包含其的餵養料能以任何合適的形式使用。它能以固體或液體製劑或其替代物的形式使用。固體製劑的實例包括粉劑、糊劑、大丸粒、膠囊劑、丸粒、片劑、塵劑和顆粒,其可以是可潤濕的、噴霧乾燥的或冷凍乾燥的。液體製劑的實例包括但不限於水性溶液、有機溶液或水性-有機溶液、懸浮液和乳劑。
在一些應用中,可將所述飼料添加劑組成物與飼料混合或在飲用水中施用。
基於芽孢桿菌屬的組分,包含將如本文所述的基於芽孢桿菌屬的組分與飼料可接受的載體、稀釋劑或賦形劑混合,並且(視需要)進行包裝。
可將餵養料和/或基於芽孢桿菌屬的組分與至少一種礦物質和/或至少一種維生素組合。由此衍生的組成物可在此稱為預混物。餵養料可以包含按重量計至少0.0001%的基於芽孢桿菌屬的組分。合適地,餵養料可以包含按重量計至少0.0005%、至少0.0010%、至少0.0020%、至少0.0025%、至少0.0050%、至少0.0100%、至少0.020%、至少0.100%、至少0.200%、至少0.250%、至少0.500%的基於芽孢桿菌屬的組分。
較佳的是,食品或基於芽孢桿菌屬的組分可以進一步包含至少一種生理學上可接受的載體。所述生理學上可接受的載體較佳的是選自以下中的至少一種:麥芽糖糊精、石灰岩(碳酸鈣)、環糊精、小麥或小麥組分、蔗糖、澱粉、Na2
SO4
、滑石、PVA、及其混合物。在一個另外的實施方式中,食品或飼料可以進一步包含金屬離子螯合劑。金屬離子螯合劑可選自EDTA或檸檬酸。
在一個實施方式中,可以將如本文所述的基於芽孢桿菌屬的組分(包入膠囊內或不包入膠囊內)與至少一種生理學上可接受的載體一起配製,該載體選自以下中的至少一種:麥芽糖糊精、石灰石(碳酸鈣)、環糊精、小麥或小麥組分、蔗糖、澱粉、Na2
SO4
、滑石、PVA、山梨醇、苯甲酸鹽、山梨酸鹽、甘油、蔗糖、丙二醇、1,3-丙二醇、葡萄糖、對羥基苯甲酸酯、氯化鈉、檸檬酸鹽、醋酸鹽、磷酸鹽、鈣、偏亞硫酸氫鹽、甲酸鹽及其混合物。
在一些實施方式中,如本文所述的基於芽孢桿菌屬的組分將處於生理學上可接受的載體中。合適的載體可以是大的、緩慢代謝的大分子,例如蛋白質、多肽、脂質體、多糖、聚乳酸、聚乙醇酸、聚合胺基酸、胺基酸共聚物和失活病毒顆粒。可以使用藥學上可接受的鹽,例如無機酸鹽,如鹽酸鹽、氫溴酸鹽、磷酸鹽和硫酸鹽,或有機酸鹽,如醋酸鹽、丙酸鹽、丙二酸鹽和苯甲酸鹽。治療組成物中的藥學上可接受的載體可另外含有液體,如水、鹽水、甘油和乙醇。另外,輔助物質(例如潤濕劑或乳化劑或pH緩衝物質)可以存在於這類組成物中。此類載體使得藥物組成物能夠配製成用於被患者攝取的片劑、丸劑、膠囊、液體、凝膠、糖漿、漿液和懸浮液。一旦配製,可以直接向受試者施用所述藥物組成物。待治療的受試者可以是動物。
據信,本文所公開的組成物可以在動物中產生一種或多種性能益處(即,動物性能),該性能益處選自由以下各項組成之群組:增加的增重、增重飼料比、改善的腸障壁完整性、降低的死亡率和糞便中減少的大腸桿菌流出。
較佳的是,“動物性能”藉由飼料效率和/或動物增重和/或飼料轉化率來確定。
所謂“改善的動物性能”,其係指相比於不包含本文所公開的成分的飼料或飼料添加劑組成物,有增加的飼料效率、和/或增加的增重和/或降低的飼料轉化率和/或改善的腸障壁完整性和/或降低的死亡率和/或糞便中減少的大腸桿菌流出。
較佳的是,“改善的動物性能”意指存在增加的飼料效率和/或增加的增重和/或降低的飼料轉化率。如本文所使用的,術語“飼料效率”係指當一段時間內給動物無限制地餵食或飼喂規定量的食物時出現的動物增重的量。
所謂“增加的飼料效率”,其意指與在不存在所述飼料添加劑組成物的情況下飼喂的動物相比,在飼料中使用本發明的飼料添加劑組成物導致每單位飼料攝入量中增重增加。
如本文所使用的,術語“飼料轉化率”係指飼喂給動物以使動物體重增加指定量的飼料量。
改善的飼料轉化率意指較低的飼料轉化率。
所謂“較低的飼料轉化率”或“改善的飼料轉化率”,其意指在飼料中使用飼料添加劑組成物導致動物體重增加指定量時所需飼喂給動物的飼料量低於在該飼料不包含如本文公開的飼料添加劑組成物時使動物體重增加相同量時所需的飼料量。
腸道完整性和微生物群似乎有助於維持腸道健康。支持腸障壁有助於降低感染和炎症的風險。例如,緊密連接係兩個細胞的緊密相關區域,這兩個細胞的膜連接在一起,形成流體幾乎不能滲透的障壁。保護緊密連接完整性的能力可以改善動物的健康。還需要保持緊密連接以避免“滲漏的腸道”,該滲漏的腸道可能導致進一步的細胞損傷。因此,希望的是藉由幫助或增加動物維持良好調節的障壁功能的能力來改善腸道完整性,所述障壁功能阻止細菌非故意地進入動物體內。
緊密連接(也稱為閉鎖連接)係兩個細胞的緊密相關區域,這兩個細胞的膜連接在一起,形成流體幾乎不能滲透的障壁。在腸道健康的背景下,緊密連接係腸上皮細胞之間的通道,其可帶來良好的或差的腸道完整性。當存在良好的腸道完整性時,緊密連接蛋白例如密連蛋白(Claudin)3和緊連蛋白(Occludin)以較高水平在兩個上皮細胞之間表現,有助於提供能夠阻止病原體從腸腔轉移到體循環中的障壁(降低的滲透性)。密連蛋白係最重要的緊密連接蛋白家族,並且密連蛋白
3係編碼這些緊密連接蛋白的基因之一。緊連蛋白係另一種重要的緊密連接蛋白。密連蛋白和緊連蛋白係最早確定的緊密連接整合膜蛋白。緊密連接蛋白RNA的測量可以作為障壁完整性和腸道健康的指標,因為如果在動物的胃腸道中緊密連接不維持,它可以導致滲透性,滲透性可以允許病原體和毒素從腸腔轉移到體循環,從而損害動物健康或甚至導致動物死亡(例如敗血症)。
藉由使用如本文教導的組成物而減少糞便中大腸桿菌流出可以減少基於大腸桿菌的感染的進一步傳播,並且也改善動物性能。
如本文所使用的營養物消化率係指從胃腸道或胃腸道指定區段(例如小腸)消失的營養物的比率。營養物消化率可測量為所施用至受試者的營養物與受試者糞便中所排出來的營養物之間的差值、或施用至受試者的營養物與保留在胃腸道指定區段(例如回腸)上的消化物中的營養物之間的差值。
如本文所使用的,營養物消化率可藉由在一段時間期間收集總排泄物,測量所攝入營養物與所排泄的營養物之間的差值;或利用惰性標記物來測量,該惰性標記物不會被動物吸收,並允許研究者計算整個胃腸道或胃腸道區段中所消失的營養物的量。這樣的惰性標記物可以是二氧化鈦、氧化鉻或酸不溶性灰分。消化率可以表示為在飼料中營養物的百分比,或表示為可消化的營養物的質量單位/飼料中的營養物的質量單位。
如本文所使用的營養物消化率涵蓋澱粉消化率、脂肪消化率、蛋白質消化率和胺基酸消化率。
如本文所使用的能量消化率意指所消費的飼料總能量減去糞便的總能量,或所消費的飼料總能量減去動物胃腸道指定區段(例如回腸)中剩餘消化物的總能量。如本文所使用的,代謝能係指表觀代謝能,並且意指所消耗的飼料總能量減去糞便、尿和消化的氣體產物中包含的總能量。可使用與測定營養物消化率相同的方法,藉由總能量的攝入量與糞便排出的總能量之間的差值,或與胃腸道指定區段(例如回腸)中存在的消化物總能量之間的差值來測量能量消化率和代謝能,同時對氮排泄進行適當校正來計算飼料的代謝能。
在一些實施方式中,本文所述的組成物可提高受試者對膳食半纖維素或纖維的消化率或利用率。
如在本文所使用的,術語存活率係指存活的受試者的數目。術語“改善的生存率”可以是“降低的死亡率”的另一種說法。
“增加的增重”係指與飼喂不含所述飼料添加劑組成物的飼料的動物相比,飼喂包含飼料添加劑組成物的飼料時體重增加的動物。
本文所公開的組成物和方法的非限制性實例包括:
1. 一種用於預防和/或治療動物中的基於大腸桿菌的感染之組成物,其中所述組成物基於芽孢桿菌屬的直接飼喂微生物組分,該組分包含單獨的芽孢桿菌屬菌株3BP5(NRRL B-50510)、解澱粉芽孢桿菌菌株918(NRRL B-50508)和15AP4(PTA-6507)或這些菌株與衍生自這些菌株的培養物上清液的組合。
2. 如實施方式1所述之組成物,其中所述組成物產生一種或多種性能益處,該一種或多種性能益處選自由以下各項組成之群組:增加的增重、增重飼料比、改善的腸障壁完整性、降低的死亡率和糞便中減少的大腸桿菌流出。
3. 如實施方式1或2所述之組成物,其中該直接飼喂微生物呈內生孢子的形式。
4. 如實施方式1或2所述之組成物,其中所述組成物進一步包含至少一種酶,該至少一種酶可以視需要被包入膠囊內。
5. 如實施方式3所述之組成物,其中所述組成物進一步包含至少一種酶,該至少一種酶可以視需要被包入膠囊內。
6. 如實施方式4所述之組成物,其中該至少一種酶選自由以下各項組成之群組:植酸酶、蛋白酶、澱粉酶、木聚糖酶和β-葡聚糖酶。
7. 如實施方式1、2、5或6所述之組成物,其中所述組成物係飼料添加劑組成物或預混物。
8. 如實施方式3所述之組成物,其中所述組成物係飼料添加劑組成物或預混物。
9. 如實施方式4所述之組成物,其中所述組成物係飼料添加劑組成物或預混物。
10. 一種飼料,該飼料包含如實施方式7所述之飼料添加劑組成物。
11. 一種飼料,該飼料包含如實施方式8或9所述之飼料添加劑組成物。
12. 一種套組,該套組包含如實施方式7所述之飼料添加劑組成物、和施用說明書。
13. 一種套組,該套組包含如實施方式8或9所述之飼料添加劑組成物、和施用說明書。
14. 一種用於預防和/或治療動物中的基於大腸桿菌的感染的方法,該方法包括施用有效量的包含基於芽孢桿菌屬的直接飼喂微生物組分的組成物,該組分包含枯草芽孢桿菌菌株3BP5(NRRL B-50510)、解澱粉芽孢桿菌菌株918(NRRL B-50508)和15AP4(PTA-6507)。
15. 如實施方式14所述之方法,其中該組成物產生一種或多種性能益處,該一種或多種性能益處選自由以下各項組成之群組:增加的增重、增重飼料比、改善的腸障壁完整性和糞便中減少的大腸桿菌流出。
16. 如實施方式14或15所述之方法,其中該直接飼喂微生物呈內生孢子的形式。
17. 如實施方式14或15所述之方法,其中所述組成物進一步包含至少一種酶,該至少一種酶可以視需要被包入膠囊內。
18. 如實施方式16所述之方法,其中所述組成物進一步包含至少一種酶,該至少一種酶可以視需要被包入膠囊內。
19. 如實施方式17所述之方法,其中該至少一種酶選自由以下各項組成之群組:植酸酶、蛋白酶、澱粉酶、木聚糖酶和β-葡聚糖酶。
20. 如實施方式18所述之方法,其中該至少一種酶選自由以下各項組成之群組:植酸酶、蛋白酶、澱粉酶、木聚糖酶和β-葡聚糖酶。
21. 如實施方式14、15、19和20所述之方法,其中所述組成物係飼料添加劑組成物或預混物。
22. 如實施方式16所述之方法,其中所述組成物係飼料添加劑組成物或預混物。
實例
除非本文另外定義,否則本文所用的全部技術術語和科學術語具有與本公開所屬領域的普通技術人員通常所理解的相同意義。Singleton等人,DICTIONARY OF MICROBIOLOGY AND MOLECULAR BIOLOGY
[微生物學和分子生物學詞典], 2D版, John Wiley and Sons[約翰威利父子公司], 紐約 (1994),以及Hale和Marham,THE HARPER COLLINS DICTIONARY OF BIOLOGY
[哈珀柯林斯生物學詞典], Harper Perennial [哈珀永久出版社], 紐約州 (1991) 為技術人員提供了本公開中所使用的許多術語的通用詞典。
本公開在下面的實例中進一步定義。應該理解,這些實例儘管說明了某些實施方式,但僅以示例的方式給出。從以上的討論和所述實例中,熟悉該項技術者能夠確定本公開的本質特性,並且在不脫離本公開的精神和範圍的情況下,可進行各種變化和修改以使其適應各種用途和條件。
實例
1
基於芽孢桿菌屬三菌株(芽孢桿菌屬菌株
3BP5
、
918
、
15AP4
)的直接飼喂微生物對用
F18
產腸毒素大腸桿菌激發的斷奶豬的生長性能、糞便大腸桿菌流出評分和腸障壁功能的影響
材料與方法
住所和環境
動物和實驗方案的使用經動物實驗委員會批准。如NRC(2012)所建議的,配製飼喂時的基礎飲食以平衡能量和蛋白質,並且以達到或超過使這個年齡的豬生長的營養需求(表1)。
將基礎飲食分成幾部分,然後將這些部分用如表1中所確定的直接飼喂微生物(DFM)進行處理。在飼料混合過程中,沖洗混合器以防止飲食的交叉污染。在每個批次的開始、中間和結束時從每種治療飲食中收集樣品,並且一起混合樣品至飼料中的DFM計數。在混合過程中收集來自每種治療飲食的樣品並將樣品在-20ºC儲存直至需要。
[ 表 1] :豬的糊狀形式的基礎飲食組成實例( % ,飼喂時) 1
在一個階段中以糊狀形式遞送的飲食治療2
FTU – 植酸酶單位3
SID – 標準化回腸可消化的4
STTD – 標準化全消化道可消化的
實驗設計
在為期17天的實驗中,共使用了72隻新斷奶的、混合性別的(閹豬和小母豬各50%)仔豬,體重為6.44 ± 0.64 kg。對每隻仔豬進行基因測試以確保對F18大腸桿菌的易感性。將這些豬單獨稱重,按重量劃分區段,並將區段內的豬隨機分配4種飲食治療中的一種。將這些豬以每個圍欄兩頭豬安置,並根據它們的激發狀態關在2個獨立的空間中的一個中;對於18隻未被激發的對照豬(9個圍欄;PC治療)給予1個較小的空間,並且對於54隻受激發的豬(27個圍欄;對於NC、NC + DFM1和NC + DFM2,每種治療,9個圍欄)給予另一個較大的空間。所有豬都安置在環境受控制的空間裡。每個圍欄都配有一個單側的不銹鋼自動餵食器和一個乳頭飲水器,允許豬隨意獲取飼料和水。
該實驗進行了17天。它由對飲食的7天適應期、隨後是10天的激發期組成。將NC、NC + DFM1和NC + DFM2治療組中的豬在斷奶後第7天(該研究的第7天)用F18產腸毒素大腸桿菌(ETEC)進行口服感染。PC治療組未被大腸桿菌激發。
生長性能和糞便樣本收集和分析
在第0、7和17天(試驗結束)測量體重和飼料消耗,以監測平均日增重(ADG)、平均日飼料攝入量(ADFI)和增重與飼料比(G:F)。在第7天(緊接在激發之前)和感染後天數(dpi)1、2、3、4、5、6、7和10天收集糞便拭子以評估大腸桿菌流出。使用以下量表以盲法方式每日對糞便評分進行目測排名:1= 固體;2= 半固體;3= 半液體;4= 液體。
在dpi 10(該研究的最後一天),將各圍欄中的每隻豬藉由弩槍進行安樂死,然後放血,以收集以下組織:新鮮的和固定的回腸和結腸區段,以及回腸和結腸消化物。藉由PCR分析回腸組織區段以測定影響緊密連接(腸道)完整性的緊密連接蛋白的RNA表現。
使用PROC MIXED(SAS 9.4)分析生長性能數據,其中以初始體重作為協變數。將時間過程數據作為PROC GLIMMIX中的重複測量進行分析。
結果
生長性能:
在7天適應期期間,四種治療中的ADG、ADFI或G:F無顯著的差異(P > 0.10)。然而,NC+ DFM2的增重在數值上大於所有其他治療。進行NC + DFM2飲食的豬在該研究的前7天內增重0.781 kg(最終重量 – 初始重量),而PC、NC和NC + DFM1分別增重0.239、0.188和0.365 kg(表3)。
這意味著飼喂NC + DFM2飲食的豬在飲食適應的前7天中也具有比所有其他治療在數值上更高的ADG和G:F(表3)。
在10天的激發期(該研究的第8天至17天)後,與PC相比,進行NC、NC + DFM1和NC + DFM2治療的豬具有較低的最終BW(P
= 0.002)、較低的ADG(P
<.0001)和較低的ADFI(P
= 0.002)(表4)。這係成功的大腸桿菌激發的預期結果。但是,只有NC和NC + DFM1治療組具有比對照更低的G:F。
NC + DFM2豬具有中間的G:F,其比NC高19%(0.647對比0.542)並且在統計學上類似於PC(表4)。
飼喂DFM2的豬在10天的激發期期間增重2.477 kg,而飼喂NC或NC+ DFM1的豬分別僅增重2.312和1.881 kg(表4)。
大腸桿菌流出評分:
總體上,如預期的那樣,PC治療大腸桿菌流出評分(SS)低於激發治療的大腸桿菌流出評分(P
<.0.01,表6)。與NC相比,NC + DFM2治療在2 dpi時增加了SS(P
= 0.04)但在7 dpi時降低了SS(P
= 0.003)(表5)。在dpi 5和10時,對比NC,NC + DFM2在數值上降低了SS(表5)。
總體上,與NC相比,NC + DFM1和NC + DFM2在數值上減少了大腸桿菌糞便流出(分別為1.96和2.03,對比2.12;表6)。
[ 表 5]. 在感染後每天,飲食治療對 ETEC 流出 1 的影響 1
ETEC流出評分系統:0 =負,1 =第1部分的增長,2 =第2部分的增長,3 =第3部分的增長,4 =第4部分的增長2
對照:1) PC對比NC,2) NC對比NC + DFM1,3) NC對比NC + DFM2
糞便評分:
從感染後第3天到8 dpi,如預期的那樣,PC具有比NC更低的糞便評分(FS)(P
<.0001,表7)。在2 dpi時,飼喂NC + DFM2的豬比NC豬具有更高的FS;然而,在dpi 7時,DFM 2豬比NC豬具有更低的FS(P < 0.10;表7)。
此外,在dpi 4-10時,飼喂DFM2的豬比NC飼喂的豬具有在數值上更低的FS。在任何dpi時,對比NC,DFM1都沒有顯著地減小FS(表7)。
[ 表 7]. 在感染後每天,飲食治療對糞便評分 1 的影響 1
糞便評分系統:0 = 正常,1 = 半固體,2 = 輕微腹瀉,3 = 嚴重腹瀉2
對照:1) PC對比NC,2) NC對比DFM1,3) NC對比DFM2
緊密連接蛋白
RNA
表現(腸道完整性):
緊密連接(也稱為閉鎖連接)係兩個細胞的緊密相關區域,這兩個細胞的膜連接在一起,形成流體幾乎不能滲透的障壁。在腸道健康的背景下,緊密連接係腸上皮細胞之間的通道,其可帶來良好的或差的腸道完整性。當存在良好的腸道完整性時,緊密連接蛋白例如密連蛋白3和緊連蛋白在兩個上皮細胞之間表現,有助於提供能夠阻止病原體從腸腔轉移到體循環中的障壁。密連蛋白係最重要的緊密連接蛋白家族,並且密連蛋白3係編碼這些緊密連接蛋白的基因之一。緊連蛋白係另一種重要的緊密連接蛋白。密連蛋白和緊連蛋白係最早確定的緊密連接整合膜蛋白。緊密連接蛋白RNA的測量可以作為障壁完整性和腸道健康的指標,因為如果在動物的胃腸道中緊密連接不維持,可能導致滲透性,所述滲透性可能允許病原體和毒素從腸腔轉移到體循環,從而損害動物健康或甚至導致動物死亡。
在實驗中發現,飲食治療對緊密連接蛋白密連蛋白3的RNA表現沒有顯著的影響;然而,PC在數值上高於NC和NC + DFM1(分別為0.982對比0.638和0.648;圖1)。然而,NC + DFM2示出密連蛋白3的RNA表現在數值上類似於PC(0.945對比0.982;圖1)。
治療,即DFM1或DFM2,對緊密連接蛋白緊連蛋白的RNA表現具有顯著的影響,其中NC和NC+DFM1具有比PC更低的緊連蛋白表現,但NC + DFM2介於PC和NC之間(P = 0.045)。P值示出了治療之間的總體差異,如圖1所示。
[圖1]示出了飲食治療對作為腸道健康指標的緊密連接蛋白的表現之影響。
Claims (13)
- 一種用於預防和/或治療動物中的基於大腸桿菌(E.coli)的感染之組成物,其中所述組成物包含基於芽孢桿菌屬(Bacillus)的直接飼喂微生物組分,該組分包含單獨的枯草芽孢桿菌(Bacillus subtilis)菌株3BP5(NRRL B-50510)、解澱粉芽孢桿菌(Bacillus amyloliquefaciens)菌株918(NRRL B-50508)和15AP4(PTA-6507)或這些菌株與衍生自這些菌株的培養物上清液的組合。
- 如申請專利範圍第1項所述之組成物,其中所述組成物產生一種或多種性能益處,該一種或多種性能益處選自由以下各項組成之群組:增加的增重、增重飼料比、改善的腸障壁完整性、降低的死亡率和糞便中減少的大腸桿菌流出。
- 如申請專利範圍第1或2項所述之組成物,其中該直接飼喂微生物呈內生孢子的形式。
- 如申請專利範圍第1或2項所述之組成物,其中所述組成物進一步包含至少一種酶,該至少一種酶係被包入膠囊內。
- 如申請專利範圍第3項所述之組成物,其中所述組成物進一步包含至少一種酶,該至少一種酶係被包入膠囊內。
- 如申請專利範圍第4項所述之組成物,其中該至少一種酶選自由以下各項組成之群組:植酸酶、蛋白酶、澱粉酶、木聚糖酶和β-葡聚糖酶。
- 如申請專利範圍第1、2、5或6項中任1項所述之組成物,其中所述組成物係飼料添加劑組成物或預混物。
- 如申請專利範圍第3項所述之組成物,其中所述組成物係飼料添加劑組成物或預混物。
- 如申請專利範圍第4項所述之組成物,其中所述組成物係飼料添加。
- 一種飼料,該飼料包含如申請專利範圍第7項所述之飼料添加劑組成物。
- 一種飼料,該飼料包含如申請專利範圍第8或9項所述之飼料添加劑組成物。
- 一種套組,該套組包含如申請專利範圍第7項所述之飼料添加劑組成物、和施用說明書。
- 一種套組,該套組包含如申請專利範圍第8或9項所述之飼料添加劑組成物、和施用說明書。
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