TWI779726B

TWI779726B - 海茸萃取物之製備方法及用途

Info

Publication number: TWI779726B
Application number: TW110126337A
Authority: TW
Inventors: 沈俊煌
Original assignee: 諾亞牧場股份有限公司
Priority date: 2021-07-16
Filing date: 2021-07-16
Publication date: 2022-10-01
Also published as: TW202304489A

Abstract

一種海茸萃取物之製備方法，包含步驟：(a)將乾燥海茸泡水成海茸溶液；(b)於海茸溶液中加入纖維分解酵素及第一綜合酵素，並靜置一段時間；(c)將海茸溶液加熱至高溫；(d)待海茸溶液冷卻後，於海茸溶液中加入第二綜合酵素，並靜置一段時間；以及(e)將海茸溶液加熱至高溫。

Description

海茸萃取物之製備方法及用途

本案係關於一種海藻萃取物之製備方法及用途，尤指一種海茸萃取物之製備方法及用途。

海茸( Durvillaea Antarctica)是海藻中歸類於褐藻的一種營養豐富、口感鮮美的天然食品，是野生天然的深海植物，更是深海植物中最珍貴稀有的一員。由於海茸生長的條件非常嚴苛，全世界僅在智利南海沿岸未經任何污染的海域中，才能少量生長。海茸生長週期為3年，5年以上才能剝離出海茸芯。海茸屬世界限制性的開採資源，每年的出口總量限制為300多噸。海茸莖部(海茸尾)和根部(海茸筋)的許可開採週期分別為4年和8年，產量更少。海茸含有豐富的鈣、碘、鐵、鉀、纖維質、胡蘿蔔素、海藻膠、褐藻多醣等多種人體不可或缺的營養物質，不只為時下最健康美味的營養食品，更可以做為具有生物活性的機能性食品素材。

為了提升海茸的應用價值，本案提出一種改良的海茸萃取方法，並進一步開發海茸萃取物的新用途。

本案之目的在於改良海茸的萃取方法並開發海茸萃取物的新用途，以提升海茸萃取物的應用價值。

為達上述目的，本案提供一種海茸萃取物之製備方法，包含步驟：(a)將乾燥海茸泡水成海茸溶液；(b)於海茸溶液中加入纖維分解酵素及第一綜合酵素，並靜置一段時間；(c)將海茸溶液加熱至高溫；(d)待海茸溶液冷卻後，於海茸溶液中加入第二綜合酵素，並靜置一段時間；以及(e)將海茸溶液加熱至高溫。

在一實施例中，步驟(a)係將乾燥海茸浸泡於10到30倍體積的水中。

在一實施例中，纖維分解酵素包含選自羧甲基纖維素酶、纖維素酶C1、及β-葡萄糖苷酶所組成的群組中的至少一酵素。

在一實施例中，第一綜合酵素包含選自澱粉酶、蛋白酶、及纖維素酶所組成的群組中的至少一酵素。

在一實施例中，在步驟(b)中，於海茸溶液中加入纖維分解酵素及第一綜合酵素後，係靜置6-10小時。

在一實施例中，在步驟(c)中，海茸溶液係加熱至70-90度。

在一實施例中，第二綜合酵素包含選自澱粉酶、蛋白酶、脂肪酶、及纖維素酶所組成的群組中的至少一酵素。

在一實施例中，步驟(d)係待海茸溶液冷卻至30-60度後，再於海茸溶液中加入第二綜合酵素，並靜置20-60分鐘。

在一實施例中，在步驟(e)中，海茸溶液係加熱至70-90度。

為達上述目的，本案更提供一種海茸萃取物之用途，其係用於製備抗癌醫藥組成物，其中海茸萃取物係以前述之製備方法所製備。

體現本案特徵與優點的一些實施例將在後段的說明中詳細敘述。應理解的是本案能夠在不同的態樣上具有各種的變化，其皆不脫離本案的範圍，且其中的說明及圖式在本質上為說明之用，而非用以限制本案。

為了提升海茸萃取物的應用價值，本案提供一種改良的海茸萃取物製備方法，並進一步開發海茸萃取物於抗癌方面的新用途。第1圖顯示本案海茸萃取物製備方法的流程圖。如第1圖所示，本案海茸萃取物之製備方法包含：將乾燥海茸泡水成海茸溶液(步驟S1)；於海茸溶液中加入纖維分解酵素及第一綜合酵素，並靜置一段時間(步驟S2) ；將海茸溶液加熱至高溫(步驟S3)；待海茸溶液冷卻後，於海茸溶液中加入第二綜合酵素，並靜置一段時間(步驟S4)；將海茸溶液加熱至高溫(步驟S5)，待海茸溶液冷卻後即完成海茸萃取物之製備。以下將進一步詳細說明各步驟之實施方式。

前述乾燥海茸可從產地進口，例如從智利進口，但不以此為限。在步驟S1中，乾燥海茸可先沖洗去掉表面上的鹽分，再以海茸本體的數十倍體積(例如10到30倍)泡水數小時(例如6-10小時)，使海茸泡發膨脹。在一實施例中，乾燥海茸較佳係浸泡於15-20倍的溫水中，例如40-45度的溫水，泡發時間約為6-8小時，但不以此為限。

纖維分解酵素包含選自羧甲基纖維素酶(carboxymethyl cellulase，簡稱CMCase)、纖維素酶C1 (cellulase C1)、及β-葡萄糖苷酶(β-glucosidase)所組成的群組中的至少一酵素，且在一實施例中，纖維分解酵素包含此群組中的全部酵素。羧甲基纖維素酶又稱內切葡聚醣酶(endoglucanase)，能夠隨機地將長鏈纖維素切成許多小片段的寡醣。纖維素酶C1又稱外切葡聚醣酶(cellobiohydrolase)，可從長鏈纖維素的還原端或非還原端進行分解，其主要產物為纖維二醣。β-葡萄糖苷酶則可把纖維二醣分解為單醣的葡萄醣。

於步驟S2所述之纖維分解酵素中，羧甲基纖維素酶的反應濃度為3,000-9,000 U/L，纖維素酶C1的反應濃度為1,200-3,600 U/L，β-葡萄糖苷酶的反應濃度為10-30 U/L，但不以此為限。在一示範實施例中，羧甲基纖維素酶的反應濃度為4,500 U/L，纖維素酶C1的反應濃度為1,800 U/L，β-葡萄糖苷酶的反應濃度為15 U/L，但不以此為限。

第一綜合酵素包含選自澱粉酶(amylase)、蛋白酶(protease)、及纖維素酶(cellulase)所組成的群組中的至少一酵素，且在一實施例中，第一綜合酵素包含此群組中的全部酵素。

於步驟S2所述之第一綜合酵素中，澱粉酶的反應濃度為1,100-3,300 U/L，蛋白酶的反應濃度為2,400-7,200 U/L，纖維素酶的反應濃度為12-36 U/L，但不以此為限。在一示範實施例中，澱粉酶的反應濃度為1,650 U/L，蛋白酶的反應濃度為3,600 U/L，纖維素酶的反應濃度為18 U/L，但不以此為限。

在步驟S2中，於海茸溶液中加入纖維分解酵素及第一綜合酵素後，約靜置6-10小時，以提供充分時間讓酵素作用。

接著在步驟S3中，將海茸溶液加熱至高溫，例如70-90度，以使酵素失活並不再作用。

之後在步驟S4中，待海茸溶液冷卻至約30-60度後，再於海茸溶液中加入第二綜合酵素。第二綜合酵素包含選自澱粉酶(amylase)、蛋白酶(protease)、脂肪酶(lipase)、及纖維素酶(cellulase)所組成的群組中的至少一酵素，且在一實施例中，第二綜合酵素包含此群組中的全部酵素。

於步驟S4所述之第二綜合酵素中，澱粉酶的反應濃度為20,000-50,000 U/L，蛋白酶的反應濃度為20,000-50,000 U/L，脂肪酶的反應濃度為1,600-4,000 U/L，纖維素酶的反應濃度為80-200 U/L，但不以此為限。在一示範實施例中，澱粉酶的反應濃度為37,500 U/L，蛋白酶的反應濃度為37,500 U/L，脂肪酶的反應濃度為3,000 U/L，纖維素酶的反應濃度為150 U/L，但不以此為限。

接著將添加第二綜合酵素之海茸溶液靜置約20-60分鐘，以提供充分時間讓酵素作用。

之後在步驟S5中，將海茸溶液加熱至高溫，例如70-90度，以使酵素失活並不再作用。

最後，待海茸溶液冷卻後即完成海茸萃取物之製備。此處之海茸萃取物為一海茸水解液。萃取過程中僅將天然海茸原料加入水及各種分解酵素，並未添加任何酸鹼物質或化學溶劑，故為安全無毒可食用之產品，亦可進一步乾燥為粉末型態進行保存。海茸營養豐富，可調節生理機能、養顏美容，幫助維持消化道機能，促進新陳代謝及健康維持，更是養生及調節體質的食品。透過各種分解酵素的作用，更可將大分子變成小分子，使各種營養素更容易被身體吸收，且同時提升了風味而更適於飲用。

第2圖顯示本案海茸萃取物的分子量分佈分析，其中圖(A)(B)分別顯示不同批次萃取物的分子量分佈。如第2圖所示，有50%以上的海茸萃取物其分子量小於6000道爾頓(Da)，顯示本案萃取方法確實可有效將大分子變成小分子。

進一步分析本案海茸萃取物之總糖、岩藻糖及硫酸鹽含量，其結果如下表1所示。從表1可知，本案海茸萃取物之總糖、岩藻糖及硫酸鹽含量分別為73.0%、27.2%及16.3%，顯示本案萃取方法可保留多醣體結構，且達到高濃度品質，使具機能性的成分能被有效吸收。表1

樣品名稱	總糖(%)	岩藻糖(%)	硫酸鹽(%)
海茸萃取物	73.0	27.2	16.3

除了保健食品的應用外，本案更進一步開發海茸萃取物於抗癌方面的新用途。為驗證本案所製備之海茸萃取物的抗癌功效，本案進一步以海茸萃取物處理人類肝癌細胞、人類肺癌細胞、及人類大腸癌細胞，觀察海茸萃取物對細胞存活率、細胞型態、染色分析、及凋亡蛋白酶(caspase)活性之影響。其中，人類肝癌細胞、人類肺癌細胞、及人類大腸癌細胞係分別以HepG2、A-549、及HT-29細胞株來進行實驗。

首先，於人類肝癌細胞HepG2中添加本案所製備之海茸萃取物，且作用濃度分別為0、1.0、2.5、5.0、10.0及20.0 mg/mL，並進行72小時的培養後觀察細胞存活率。第3圖顯示本案海茸萃取物對於人類肝癌細胞的細胞存活率分析。結果顯示，海茸萃取物具有抑制人類肝癌細胞生長之效果，其於濃度為 20.0 mg/mL時具有最佳之細胞毒殺效果，並且於濃度為10-20 mg/mL時其細胞存活率已可達到50%以下，表示海茸萃取物具有抑制人類肝癌細胞生長之潛力。

由於海茸萃取物對於人類肝癌細胞之毒殺效果，以濃度為15 mg/mL時對於人類肝癌細胞之生長抑制效果可明顯低於50%，因此後續的細胞實驗，皆以15 mg/mL的濃度進行處理。

第4圖顯示本案海茸萃取物對於人類肝癌細胞的細胞型態影響，其中圖(A)(B)分別為控制組及處理組之細胞型態，且處理組係使用15 mg/mL的海茸萃取物並處理細胞72小時。結果顯示，在控制組中，大部分人類肝癌細胞可以維持原本貼附型細胞的型態且外觀較完整；而在處理組中可發現，人類肝癌細胞經處理海茸萃取物後，細胞型態有變小、變圓及上浮的現象，可以推論海茸萃取物對於人類肝癌細胞具有毒殺效果。

接著利用annexin V/propidium iodide染色分析來偵測早期及晚期的細胞凋亡。第5圖顯示本案海茸萃取物對於人類肝癌細胞的細胞凋亡染色分析，其中圖(A)左右的流式細胞儀分析圖分別為控制組及處理組之染色分析圖，圖(B)則為死細胞數量變化情形的量化圖。一般而言，在流式細胞儀分析圖左下角區域為活細胞(living cell)，右下角區域為早期凋亡細胞(early apoptotic cell)，右上角區域為晚期凋亡細胞(late apoptotic cell)，左上角區域為壞死細胞(necrotic cell)，且由右上角區域的晚期凋亡細胞的數量可以做為細胞凋亡的指標。從圖5(A)左圖控制組的染色分析可發現，未處理海茸萃取物的人類肝癌細胞具有較多的活細胞及較少的死細胞；而從圖5(A)右圖處理組的染色分析可發現，人類肝癌細胞經處理海茸萃取物後，具有較多的死細胞及較少的活細胞。另外，根據圖5(B)的死細胞(即晚期凋亡細胞)數量變化情形的量化圖可發現，人類肝癌細胞經處理海茸萃取物後，其死細胞數量顯著地上升，可以推論海茸萃取物對於人類肝癌細胞具有產生細胞凋亡的效果。

此外，凋亡蛋白酶(caspase)的活化亦為判斷細胞凋亡的指標之一，故本案進一步分析處理海茸萃取物後的人類肝癌細胞之caspase-9及caspase-3的活化情形。第6圖顯示本案海茸萃取物對於人類肝癌細胞的caspase-9活化情形，其中圖(A)左右分別為控制組及處理組的caspase-9活化情形，圖(B)則為活化caspase-9變化情形的量化圖。根據圖6(A)可發現，左側控制組的人類肝癌細胞具有較少量的活化Caspase-9，而在右側處理組的人類肝癌細胞中，活化的Caspase-9有明顯的增加。又，根據圖6(B)的活化caspase-9變化情形的量化圖可發現，人類肝癌細胞經處理海茸萃取物後，其活化Caspase-9的百分比顯著地上升，可以推論海茸萃取物對於人類肝癌細胞具有產生細胞凋亡的效果。

第7圖顯示本案海茸萃取物對於人類肝癌細胞的caspase-3活化情形，其中圖(A)左右分別為控制組及處理組的caspase-3活化情形，圖(B)則為活化caspase-3變化情形的量化圖。根據圖7(A)可發現，左側控制組的人類肝癌細胞具有較少量的活化Caspase-3，而在右側處理組的人類肝癌細胞中，活化的Caspase-3有明顯的增加。又，根據圖7(B)的活化caspase-3變化情形的量化圖可發現，人類肝癌細胞經處理海茸萃取物後，其活化Caspase-3的百分比顯著地上升，可以推論海茸萃取物對於人類肝癌細胞具有產生細胞凋亡的效果。

因此，由前述細胞存活率及細胞型態分析的結果可發現，海茸萃取物對於人類肝癌細胞具有毒殺效果。再由annexin V/propidium iodide染色及caspase活性分析的結果可發現，海茸萃取物具有引起人類肝癌細胞發生細胞凋亡的效果。

本案亦於人類肺癌細胞A-549中添加本案所製備之海茸萃取物，且作用濃度分別為0、1.0、2.5、5.0、10.0及20.0 mg/mL，並進行72小時的培養後觀察細胞存活率。第8圖顯示本案海茸萃取物對於人類肺癌細胞的細胞存活率分析。結果顯示，海茸萃取物具有抑制人類肺癌細胞生長之效果，其於濃度為 20.0 mg/mL時具有最佳之細胞毒殺效果，並且於濃度為10-20 mg/mL時其細胞存活率已可達到50%以下，表示海茸萃取物具有抑制人類肺癌細胞生長之潛力。

由於海茸萃取物對於人類肺癌細胞之毒殺效果，以濃度為15 mg/mL時對於人類肺癌細胞之生長抑制效果可明顯低於50%，因此後續的細胞實驗，皆以15 mg/mL的濃度進行處理。

第9圖顯示本案海茸萃取物對於人類肺癌細胞的細胞型態影響，其中圖(A)(B)分別為控制組及處理組之細胞型態，且處理組係使用15 mg/mL的海茸萃取物並處理細胞72小時。結果顯示在控制組中，大部分人類肺癌細胞可以維持原本貼附型細胞的型態且外觀較完整；而在處理組中可發現，人類肺癌細胞經處理海茸萃取物後，細胞型態有變小、變圓及上浮的現象，可以推論海茸萃取物對於人類肺癌細胞具有毒殺效果。

接著利用annexin V/propidium iodide染色分析來偵測早期及晚期的細胞凋亡。第10圖顯示本案海茸萃取物對於人類肺癌細胞的細胞凋亡染色分析，其中圖(A)左右的流式細胞儀分析圖分別為控制組及處理組之染色分析圖，圖(B)則為死細胞數量變化情形的量化圖。從圖10(A)左圖控制組的染色分析可發現，未處理海茸萃取物的人類肺癌細胞具有較多的活細胞及較少的死細胞；而從圖10(A)右圖處理組的染色分析可發現，人類肺癌細胞經處理海茸萃取物後，具有較多的死細胞及較少的活細胞。另外，根據圖10(B)的死細胞(即晚期凋亡細胞)數量變化情形的量化圖可發現，人類肺癌細胞經處理海茸萃取物後，其死細胞數量顯著地上升，可以推論海茸萃取物對於人類肺癌細胞具有產生細胞凋亡的效果。

進一步分析處理海茸萃取物後的人類肺癌細胞之caspase-9及caspase-3的活化情形。第11圖顯示本案海茸萃取物對於人類肺癌細胞的caspase-9活化情形，其中圖(A)左右分別為控制組及處理組的caspase-9活化情形，圖(B)則為活化caspase-9變化情形的量化圖。根據圖11(A)可發現，左側控制組的人類肺癌細胞具有較少量的活化Caspase-9，而在右側處理組的人類肺癌細胞中，活化的Caspase-9有明顯的增加。又，根據圖11(B)的活化caspase-9變化情形的量化圖可發現，人類肺癌細胞經處理海茸萃取物後，其活化Caspase-9的百分比顯著地上升，可以推論海茸萃取物對於人類肺癌細胞具有產生細胞凋亡的效果。

第12圖顯示本案海茸萃取物對於人類肺癌細胞的caspase-3活化情形，其中圖(A)左右分別為控制組及處理組的caspase-3活化情形，圖(B)則為活化caspase-3變化情形的量化圖。根據圖12(A)可發現，左側控制組的人類肺癌細胞具有較少量的活化Caspase-3，而在右側處理組的人類肺癌細胞中，活化的Caspase-3有明顯的增加。又，根據圖12(B)的活化caspase-3變化情形的量化圖可發現，人類肺癌細胞經處理海茸萃取物後，其活化Caspase-3的百分比顯著地上升，可以推論海茸萃取物對於人類肺癌細胞具有產生細胞凋亡的效果。

因此，由前述細胞存活率及細胞型態分析的結果可發現，海茸萃取物對於人類肺癌細胞具有毒殺效果。再由annexin V/propidium iodide染色及caspase活性分析的結果可發現，海茸萃取物具有引起人類肺癌細胞發生細胞凋亡的效果。

本案同樣於人類大腸癌細胞HT-29中添加本案所製備之海茸萃取物，且作用濃度分別為0、1.0、2.5、5.0、10.0及20.0 mg/mL，並進行72小時的培養後觀察細胞存活率。第13圖顯示本案海茸萃取物對於人類大腸癌細胞的細胞存活率分析。結果顯示，海茸萃取物具有抑制人類大腸癌細胞生長之效果，其於濃度為 20.0 mg/mL時具有最佳之細胞毒殺效果，並且於濃度為10-20 mg/mL時其細胞存活率已可達到50%以下，表示海茸萃取物具有抑制人類大腸癌細胞生長之潛力。

由於海茸萃取物對於人類大腸癌細胞之毒殺效果，以濃度為15 mg/mL時對於人類大腸癌細胞之生長抑制效果可明顯低於50%，因此後續的細胞實驗，皆以15 mg/mL的濃度進行處理。

第14圖顯示本案海茸萃取物對於人類大腸癌細胞的細胞型態影響，其中圖(A)(B)分別為控制組及處理組之細胞型態，且處理組係使用15 mg/mL的海茸萃取物並處理細胞72小時。結果顯示在控制組中，大部分人類大腸癌細胞可以維持原本貼附型細胞的型態且外觀較完整；而在處理組中可發現，人類大腸癌細胞經處理海茸萃取物後，細胞型態有變小、變圓及上浮的現象，可以推論海茸萃取物對於人類大腸癌細胞具有毒殺效果。

接著利用annexin V/propidium iodide染色分析來偵測早期及晚期的細胞凋亡。第15圖顯示本案海茸萃取物對於人類大腸癌細胞的細胞凋亡染色分析，其中圖(A)左右的流式細胞儀分析圖分別為控制組及處理組之染色分析圖，圖(B)則為死細胞數量變化情形的量化圖。從圖15(A)左圖控制組的染色分析可發現，未處理海茸萃取物的人類大腸癌細胞具有較多的活細胞及較少的死細胞；而從圖15(A)右圖處理組的染色分析可發現，人類大腸癌細胞經處理海茸萃取物後，具有較多的死細胞及較少的活細胞。另外，根據圖15(B)的死細胞(即晚期凋亡細胞)數量變化情形的量化圖可發現，人類大腸癌細胞經處理海茸萃取物後，其死細胞數量顯著地上升，可以推論海茸萃取物對於人類大腸癌細胞具有產生細胞凋亡的效果。

進一步分析處理海茸萃取物後的人類大腸癌細胞之caspase-9及caspase-3的活化情形。第16圖顯示本案海茸萃取物對於人類大腸癌細胞的caspase-9活化情形，其中圖(A)左右分別為控制組及處理組的caspase-9活化情形，圖(B)則為活化caspase-9變化情形的量化圖。根據圖16(A)可發現，左側控制組的人類大腸癌細胞具有較少量的活化Caspase-9，而在右側處理組的人類大腸癌細胞中，活化的Caspase-9有明顯的增加。又，根據圖16(B)的活化caspase-9變化情形的量化圖可發現，人類大腸癌細胞經處理海茸萃取物後，其活化Caspase-9的百分比顯著地上升，可以推論海茸萃取物對於人類大腸癌細胞具有產生細胞凋亡的效果。

第17圖顯示本案海茸萃取物對於人類大腸癌細胞的caspase-3活化情形，其中圖(A)左右分別為控制組及處理組的caspase-3活化情形，圖(B)則為活化caspase-3變化情形的量化圖。根據圖17(A)可發現，左側控制組的人類大腸癌細胞具有較少量的活化Caspase-3，而在右側處理組的人類大腸癌細胞中，活化的Caspase-3有明顯的增加。又，根據圖17(B)的活化caspase-3變化情形的量化圖可發現，人類大腸癌細胞經處理海茸萃取物後，其活化Caspase-3的百分比顯著地上升，可以推論海茸萃取物對於人類大腸癌細胞具有產生細胞凋亡的效果。

因此，由前述細胞存活率及細胞型態分析的結果可發現，海茸萃取物對於人類大腸癌細胞具有毒殺效果。再由annexin V/propidium iodide染色及caspase活性分析的結果可發現，海茸萃取物具有引起人類大腸癌細胞發生細胞凋亡的效果。

此外，本案更進一步進行海茸萃取物之免疫調節活性分析。首先，於小鼠巨噬細胞RAW 264.7中添加本案所製備之海茸萃取物，且作用濃度分別為0、125、250、500、1000及2000 μg/mL，並進行24小時的培養後，觀察海茸萃取物對於細胞存活率的影響，以及對於誘導RAW 264.7細胞產生一氧化氮(NO)的影響。第18圖顯示本案海茸萃取物對於小鼠巨噬細胞的細胞存活率分析，結果顯示，海茸萃取物在上述濃度之下對小鼠巨噬細胞之存活率仍可達約80%以上，故海茸萃取物對免疫細胞(如巨噬細胞)具有極低或不具細胞毒性。第19圖顯示本案海茸萃取物對於小鼠巨噬細胞的誘導NO生成分析，結果顯示，海茸萃取物具有誘導免疫細胞(如巨噬細胞)NO生成量上升的效果，可證明海茸萃取物應具有免疫調節之功能。

又，由於誘導型一氧化氮合成酶(inducible NO synthase，簡稱iNOS)的表現量增加，可證實處理海茸萃取物能誘導免疫細胞產生NO及其他細胞激素的產生，因此在免疫細胞中iNOS的表現量可以做為判斷是否可以誘發免疫調節的指標之一，故本案進一步觀察處理海茸萃取物後的RAW 264.7細胞之iNOS表現量。第20圖顯示本案海茸萃取物對於小鼠巨噬細胞的iNOS表現量影響，其中圖(A)左為控制組，圖(A)右為作用濃度為250 μg/mL的處理組，圖(B)則為iNOS表現量情形的量化圖。從第20圖可觀察到，經處理海茸萃取物後，RAW 264.7細胞之iNOS表現量有增加的趨勢，且iNOS表現量的百分比也明顯上升，可以推論海茸萃取物可藉由調控免疫細胞iNOS蛋白質表現量來達到免疫調節之效果。

因此，由小鼠巨噬細胞RAW 264.7細胞之細胞存活率、誘導NO生成及iNOS表現量的結果可以發現，海茸萃取物對於免疫細胞具有誘導NO生成及誘導iNOS表現的效果，因此可推論海茸萃取物具有免疫調節之功效。

綜上所述，本案海茸萃取物之製備方法添加了多種分解酵素，可將大分子變成小分子，使各種營養素更容易被身體吸收，且萃取過程並未添加任何酸鹼物質或化學溶劑，故為安全無毒可食用之產品。再者，本案所製備之海茸萃取物對於人類肝癌細胞、人類肺癌細胞、及人類大腸癌細胞皆具有毒殺效果及產生細胞凋亡的效果，且本案海茸萃取物更具有免疫調節之功效。因此，本案海茸萃取物具有抗癌功效，可進一步開發製備為抗癌醫藥組成物，有助於癌症治療或預防。

縱使本發明已由上述實施例詳細敘述而可由熟悉本技藝人士任施匠思而為諸般修飾，然皆不脫如附申請專利範圍所欲保護者。

S1~S5:步驟S1~S5

第1圖顯示本案海茸萃取物製備方法的流程圖。第2圖顯示本案海茸萃取物的分子量分佈分析。第3圖顯示本案海茸萃取物對於人類肝癌細胞的細胞存活率分析。第4圖顯示本案海茸萃取物對於人類肝癌細胞的細胞型態影響。第5圖顯示本案海茸萃取物對於人類肝癌細胞的細胞凋亡染色分析。第6圖顯示本案海茸萃取物對於人類肝癌細胞的caspase-9活化情形。第7圖顯示本案海茸萃取物對於人類肝癌細胞的caspase-3活化情形。第8圖顯示本案海茸萃取物對於人類肺癌細胞的細胞存活率分析。第9圖顯示本案海茸萃取物對於人類肺癌細胞的細胞型態影響。第10圖顯示本案海茸萃取物對於人類肺癌細胞的細胞凋亡染色分析。第11圖顯示本案海茸萃取物對於人類肺癌細胞的caspase-9活化情形。第12圖顯示本案海茸萃取物對於人類肺癌細胞的caspase-3活化情形。第13圖顯示本案海茸萃取物對於人類大腸癌細胞的細胞存活率分析。第14圖顯示本案海茸萃取物對於人類大腸癌細胞的細胞型態影響。第15圖顯示本案海茸萃取物對於人類大腸癌細胞的細胞凋亡染色分析。第16圖顯示本案海茸萃取物對於人類大腸癌細胞的caspase-9活化情形。第17圖顯示本案海茸萃取物對於人類大腸癌細胞的caspase-3活化情形。第18圖顯示本案海茸萃取物對於小鼠巨噬細胞的細胞存活率分析。第19圖顯示本案海茸萃取物對於小鼠巨噬細胞的誘導NO生成分析。第20圖顯示本案海茸萃取物對於小鼠巨噬細胞的iNOS表現量影響。

S1~S5:步驟S1~S5

Claims

一種海茸萃取物之製備方法，包含步驟：(a)將一乾燥海茸泡水成一海茸溶液；(b)於該海茸溶液中加入一纖維分解酵素及一第一綜合酵素，並靜置6-10小時，其中該第一綜合酵素包含澱粉酶、蛋白酶、及纖維素酶；(c)將該海茸溶液加熱至70-90度，以使該纖維分解酵素及該第一綜合酵素失活並不再作用；(d)待該海茸溶液冷卻後，於該海茸溶液中加入一第二綜合酵素，並靜置20-60分鐘，其中該第二綜合酵素包含澱粉酶、蛋白酶、脂肪酶、及纖維素酶；以及(e)將該海茸溶液加熱至70-90度，以使該第二綜合酵素失活並不再作用，且待該海茸溶液冷卻後即完成該海茸萃取物之製備，其中，該海茸萃取物之製備過程未添加任何酸鹼物質或化學溶劑。
如請求項1所述之製備方法，其中該步驟(a)係將該乾燥海茸浸泡於10到30倍體積的水中。
如請求項1所述之製備方法，其中該纖維分解酵素包含選自羧甲基纖維素酶、纖維素酶C1、及β-葡萄糖苷酶所組成的群組中的至少一酵素。
如請求項1所述之製備方法，其中該步驟(d)係待該海茸溶液冷卻至30-60度後，再於該海茸溶液中加入該第二綜合酵素。
一種海茸萃取物之用途，其係用於製備一抗癌醫藥組成物，其中該海茸萃取物係以請求項1至4中任一項所述之製備方法所製備，且該抗癌醫藥組成物係用於抑制人類肝癌細胞、人類肺癌細胞、及人類大腸癌細胞之生長。