TWI750108B - 免疫球蛋白之霧化 - Google Patents
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Abstract
本發明關於藉由將包含多株免疫球蛋白(Ig)之組成物霧化來產生氣霧劑的方法。選擇有效之膜霧化器及經優化用於以此膜霧化器霧化的組成物可獲致特別有效之產生用於將Ig投予至呼吸道之氣霧劑的方法。
Description
本發明關於產生用於治療目的之氣霧劑的方法。更具體的說，本發明關於霧化含有免疫球蛋白(Ig)，尤其是多株免疫球蛋白(諸如免疫球蛋白G(IgG)、免疫球蛋白A(IgA)或免疫球蛋白M(IgM)或彼等之組合)之組成物的方法。
免疫球蛋白(Ig)為人血漿之組分，其在免疫反應中具有重要作用。這些特定免疫蛋白係由B淋巴細胞合成且可在所有脊椎動物之血漿、淋巴及其他身體分泌物中找到。免疫球蛋白構成人血漿蛋白的約20%。三種免疫球蛋白類別IgG、IgA和IgM的重要性勝於其他類別。人IgG代表血漿中最豐富之免疫球蛋白，而IgA代表外分泌物，諸如唾液、眼淚及呼吸道和腸道之黏液中的主要抗體類別。IgA形成對抗細菌和病毒病原體的第一線抵禦之一。IgM顯然為人循環系統中形體上最大的抗體，其在感染病程的早期出現且在進一步暴露後通常重新出現得較少。
在上個世紀中，免疫球蛋白製劑被成功地用於治療感染性疾病，作為具有原發性免疫缺陷病症之患者的替代療法並用於預防和治療各種發炎和自體免疫性疾病，以及某些神經系統病症。
這些免疫球蛋白製劑係經研發以供全身投予且主要係由IgG所組成。目前，這些製劑係源自於數千位健康捐血者(1,000至60,000位捐血者)之匯集的血漿並同時包含特異性及天然抗體，反映該捐血群之累積抗原經驗(cumulative antigen experience)。此大範圍的特異性及天然抗體可識別很多種抗原(例如病原體、外來抗原和自身/自體抗原)。
一般而言，免疫球蛋白係經由靜脈內或皮下途徑投予。數種市售之調製劑可用於這些投予途徑。此外，現已建議局部投予免疫球蛋白，更具體的說，投予至呼吸道(包括上呼吸道：鼻子和鼻腔通道、副鼻竇、喉、口咽、咽、聲帶(voice box)、喉頭和氣管；以及下呼吸道：呼吸氣道(respiratory airway)、肺、分岔處、支氣管和細支氣管、呼吸性細支氣管、肺泡管、肺泡囊和肺泡)。
例如，US 4,994,269描述用於局部投予對抗綠膿桿菌(P.aeruginosa)之抗體的方法。該抗體可以氣霧劑之形式投予，例如經由施用至鼻子來投予、以氣霧劑之形式施用至肺或經由氣管內來投予。
WO 92/01473描述包括將直接針對存在於主要保護性病毒表面抗原上之各種保護性抗原位點的特異性單株抗體
之混合物的小顆粒(<2μm)氣霧劑投予入易感宿主之下呼吸道的方法。
在Rimensberger and Roth(“Physical Properties of Aerosolized Immunoglobulin for Inhalation Therapy”,Journal of Aerosol Medicine,Vol.8(3),pp 255-262,1995)中，以四種壓縮空氣霧化器評估免疫球蛋白溶液(IVIG)之霧化。
美國2002/0136695描述藉由定量吸入器或霧化器投予免疫球蛋白A之氣霧劑以用於預防或治療疾病(包括免疫缺陷和感染)。
WO 03/059424描述可根據具有識別標記/標籤之吸入劑(nebule)含量特性來控制氣霧劑產生器的控制器。該系統可用於霧化數種藥物群組。其提及抗體為藥物群組之一。
WO 2004/004798描述用於全身性遞送治療劑的方法和組成物，其係藉由投予含有抗體或治療劑與FcRn結合搭檔之接合物的氣霧劑到達肺的中央氣道上皮來進行。該方法和產品具有不需要投予至肺部深處來實現全身性遞送的優點。建議使用具有不同作用原理之氣霧劑產生器。
WO 2006/122257描述採用抑制補體系統活化及可用於預防或治療肺部疾病或病況之抗體的方法和組成物。建議使用不同的霧化器類型來投予單株抗體。
WO 2011/098552描述用於製備免疫球蛋白單可變域(single variable domain)之氣霧劑的方法，其中該形成
之聚集體的量明顯減少。
雖然這些文獻建議數種方法來施用不同類型之抗體，對於以特別快速和有效之方式來霧化多株Ig(例如IgG、IgA、IgM或彼等之組合)之方法仍然是有需要的。
因此，本發明的一目的係提供用於產生含有多株Ig(例如IgG、IgA、IgM或彼等之組合)之組成物的氣霧劑之方法，以用有效方式遞送多株Ig至患者之呼吸道，例如該氣霧劑產生器之遞送劑量(DD)可為至少40%，或較佳為至少50%，該可吸入部分(粒徑小於5μmMMD)應為至少70%或較佳為至少80%，並且，在氣霧劑產生後，該液體貯存器中之插入流體的發泡特性及剩餘量亦降低，例如低於1.0mL或較佳為低於0.5mL，或更佳為低於0.3mL。
本發明提供產生氣霧劑(aerosol)之方法，其包括下列步驟：(a)提供包含多株Ig(例如IgG、IgA、IgM或彼等之組合)之液態水性組成物，其中該Ig之濃度係在每毫升20至200毫克(mg)之範圍內；(b)提供具有供填入該組成物之貯存器的膜霧化器(membrane nebulizer)；以及(c)使用該霧化器將組成物霧化(nebulize)以獲得氣霧劑(氣霧劑產生)。
於較佳之實施態樣中，該Ig為多株的(polyclonal)。較佳地，該Ig為多株IgG、多株單體(monomeric)
IgA、多株雙體(dimeric)IgA、多株IgM、或彼等之組合。於一些實施態樣中，組成物可另包含分泌成分，較佳為重組製造之人分泌成分。
於具體之實施態樣中，該液態水性組成物中之Ig(例如IgG、IgA、IgM或彼等之組合)的濃度係在每毫升20至100mg之範圍內。此外，該組成物可包含安定劑。該安定劑可為脯胺酸。其他賦形劑(諸如界面活性劑)亦可被包含在該組成物中。
於特定之實施態樣中，霧化器貯存器係與大氣隔離，從而使貯存器內之壓力在步驟(c)之前或步驟(c)期間降低。於一較佳之實施態樣中，該霧化器為振動膜霧化器。於某些實施態樣中，該霧化器特別適合用於產生針對下呼吸道及/或上呼吸道之氣霧劑。
於一態樣中，本發明之方法製造含有至少40%、較佳為至少50%、更佳為至少60%之填入貯存器中的Ig(例如IgG、IgA、IgM或彼等之組合)劑量的氣霧劑。於另一態樣中，該方法製造氣霧劑，其中該Ig(例如IgG、IgA、IgM或彼等之組合)之活性為填入貯存器之組成物中的活性之至少60%、較佳為至少70%、更佳為至少80%、再更佳為至少90%。
根據下文之詳細描述、實施例及申請專利範圍，本發明之進一步的實施態樣將變得顯明。
10‧‧‧貯存器
16‧‧‧密封元件
18‧‧‧部分
21‧‧‧可滑動元件
122‧‧‧可振動膜
124‧‧‧第一側
125‧‧‧第二側
126‧‧‧貫通孔
132‧‧‧噴嘴部分
第1圖顯示可用於本發明中之已知的膜霧化器之示意圖。
第2圖顯示可用於本發明中之已知的膜之電腦斷層掃描(CT)圖像。
第3圖顯示在還原(A)和非還原(B)條件下藉由SDS-PAGE進行未霧化和霧化之IgG組成物(PrivigenTM)的結構分析之結果。
第4圖顯示在還原(A)和非還原(B)條件下藉由SDS-PAGE進行未霧化和霧化之IgG(在PBS或甘胺酸中)、IgA和IgAM組成物的結構分析之結果。(C)顯示在還原(左片)和非還原(右片)條件下另外的IgA(p、q)、IgAM(r、s)、SIgAM(t、u)及IgG(v、w、x、y)之SDS-PAGE。
第5圖顯示不同調製劑在霧化前(-)及霧化後(N)對肺炎鏈球菌(S.pneumonia)之結合。
第6圖顯示霧化對於不同調製劑在霧化前及霧化後對各種態樣之上皮細胞單層的弗氏志賀氏菌(Shigella flexneri)感染之活性的影響：(A)對於上皮細胞回應弗氏志賀氏菌而已(C+)、或再加上各種免疫球蛋白調製劑之未霧化(-)或霧化(N)調製劑的發炎細胞激素(inflammatory cytokine)分泌之影響；(B)弗氏志賀氏菌感染而已(C+)、或再加上各種免疫球蛋白調製劑之未霧化(-)或霧化(N)調製劑，對細胞單層之跨上皮細胞膜電阻(transepithelial membrane resistance)的影響；
(C)以弗氏志賀氏菌感染後而已(C+)、或再加上各種免疫球蛋白調製劑之未霧化(-)或霧化(N)調製劑時的受感染面積(左側組)和感染病灶數目(右側組)。
第7圖顯示在動物模型中霧化之免疫球蛋白調製劑在肺部之沉積及其出現在BAL中的時程。
第8圖顯示使用抗γ鏈(a)、抗α鏈(b)及抗μ鏈(c)作探針(probe)時，在時間0、1h、6h、12h和24h採取之BAL樣本的西方點墨分析(Western blot)。
本發明之方法為藉由霧化液態水性組成物來產生氣霧劑之方法。液態水性組成物為其中該液態載體或溶劑主要或完全由水組成之液體系統。於具體情況中，該液態載體可含有一或多種至少可部分與水溶混(miscible)之液體的小部分。
組成物係包含多株免疫球蛋白，此免疫球蛋白通常係從人捐血者之血漿獲得。較佳地，該來自多個捐血者之血漿係，例如從超過100位捐血者、較佳為從超過500位捐血者、甚至更佳為從超過1000位捐血者匯集。通常將該血漿匯集體進行乙醇分餾，隨後進行數個純化步驟，諸如進一步之沉澱步驟及/或管柱色層分析步驟，以及去活化並除去病毒及其他病原體的步驟，諸如奈米過濾或溶劑/清潔劑處理。
組成物係包含多株免疫球蛋白(其亦被稱為Ig)。此多株Ig(例如IgG、IgA、IgM或彼等之組合)可從人類捐血者之血漿獲得。正常之人IgG可以至少95%IgG之純度獲得。因此，於一實施態樣中，包含在用於本發明之方法中的組成物中之IgG的純度一般為至少95%IgG，較佳為至少96%IgG，更佳為至少98%IgG，甚至更佳為至少99%IgG。較佳地，其僅含少量IgA。例如，於一實施態樣中，該組成物每毫升最多含有25μg IgA。
於另一具體實施態樣中，組成物包含之IgA的純度為至少90%，較佳為至少92%，更佳為至少94%，再更佳為至少96%，最佳為至少98%。較佳地，IgA係從人血漿純化；然而，亦可使用其他來源之IgA，諸如牛奶、唾液或其他含有IgA之體液。於另一具體實施態樣中，IgA為單體(monomeric)IgA。再於另一具體實施態樣中，IgA富含雙體(dimeric)IgA；較佳為至少20%之IgA為雙體形式，更佳為至少30%，再更佳為至少40%，最佳為至少50%。選擇性地，IgA組成物可另外包含分泌成分，較佳為重組製造(recombinantly produced)之分泌成分。例如，可使用如WO 2013/132052(其全文以引用方式納入本文)中所揭示之組成物。
再於另一具體實施態樣中，組成物係包含IgM。於一實施態樣中，組成物包含IgM和IgA。於一較佳之實施態樣中，組成物包含IgM及雙體IgA(其亦包含J-鏈)。選擇性地，組成物亦可包含分泌成分，較佳為重組製造之分
泌成分。再於另一實施態樣中，組成物包含IgM、IgA和IgG。於一具體實施態樣中，此組成物可含有76%IgG、12%IgA及12%IgM。
於本發明之方法中係使用相對高濃度之Ig，例如IgG、IgA、IgM、或彼等之組合。更具體地，Ig(尤其是IgG、IgA、IgM或彼等之組合)的濃度係在20至200mg/mL之範圍內。較佳地，濃度係在20至190mg/mL、20至180mg/mL、20至170mg/mL、20至160mg/mL、20至150mg/mL、30至200mg/mL、30至190mg/mL、30至180mg/mL、30至170mg/mL、30至160mg/mL、30至150mg/mL、40至200mg/mL、40至190mg/mL、40至180mg/mL、40至170mg/mL、40至160mg/mL、40至150mg/mL之範圍內。更佳地，濃度係在20至140mg/mL、20至130mg/mL、20至120mg/mL、30至140mg/mL、30至130mg/mL、30至120mg/mL、40至140mg/mL、40至130mg/mL、40至120mg/mL、50至140mg/mL、50至130mg/mL或50至120mg/mL之範圍內，再更佳地，濃度為約50mg/mL、60mg/mL、70mg/mL、80mg/mL、90mg/mL、100mg/mL、110mg/mL、或120mg/mL。相對高之濃度對能有低填充量和短霧化時間且因此確保該方法之治療效力是很重要的。
使用膜霧化器(membrane nebulizer)來產生根據本發明之方法的氣霧劑。霧化器於本文中係定義為能夠將液體物質霧化成分散液相(dispersed liquid phase)的裝
置。氣霧劑(aerosol)於本文中係定義為包含連續氣相且有不連續或分散相之液體顆粒分散於其中之系統。
氣霧劑產生器可具有被構造成保持流體(例如含有Ig，IgG、IgA、IgM或彼等之組合)之初始體積的液體貯存器、具有開口的膜，該液體貯存器與膜連通以例如藉由重力將液體供應至該膜的一側，該膜為可振動的以將液體輸送通過開口，藉此使該液體在膜的另一側以氣霧劑之形式射出。
氣霧劑產生器可具有：當流體貯存器之一部分的壁振動時能從存在於一側之液體產生液滴並將它們於另一側以氣霧劑之形式釋出的膜；以及，振動產生裝置(例如壓電元件(piezoelectric element))，其連接至流體貯存器之一部分的壁從而使該流體貯存器之該部分的壁振動(被動膜霧化器(passive membrane nebulizer)，第I型)。
氣霧劑產生器可具有：當流體補給器(例如管)之一部分的壁振動時能從存在於一側之液體產生液滴並將它們於另一側以氣霧劑之形式釋出的膜；以及，振動產生裝置(例如壓電元件)，其連接至該流體補給器從而使該流體補給器振動(被動膜霧化器，第Ⅱ型)。
氣霧劑產生器可具有：振動時能從存在於一側之液體產生液滴並將它們於另一側以氣霧劑之形式釋出的膜；以及，振動產生裝置(例如壓電元件)，其連接至該膜從而使該膜振動(主動膜霧化器(active membrane nebulizer))。
分散相基本上係由液滴所組成。分散相之液滴包含在液體環境中之多株Ig，例如IgG、IgA、IgM或彼等之組合。液體環境主要為水相，具有或不具有如下文中進一步描述之另外的賦形劑。熟習本技藝之人士將理解與如本文所揭示之液體組成物相關之特性和偏好亦可應用在由其產生之氣霧劑的分散相，反之亦然。
氣霧劑之連續氣相可選自醫藥上可接受之任何氣體或氣體之混合物。例如，氣體可單純為空氣或壓縮空氣，此為使用霧化器作為氣霧劑產生器之吸入療法中最為常見的。或者，可使用其他氣體和氣體混合物，諸如富含氧、二氧化碳、或氮氣和氧氣之混合物的空氣。
下列二個數值可通過實驗測定且可用於描述所產生之氣霧劑的粒徑或液滴尺寸：質量中數粒徑(mass median diameter)(MMD)及質量中數氣動粒徑(mass median aerodynamic diameter)(MMAD)。此二個數值之間的差異在於MMAD係標準化至水的密度(相當空氣動力學(equivalent aerodynamic))。
MMAD可藉由衝擊器(impactor)測量，例如安德森串式衝擊器(Anderson Cascade impactor)(ACI)或新一代衝擊器(Next Generation impactor)(NGI)。或者可使用雷射繞射法(例如Malvern MasterSizer XTM)來測量MMD。
藉由本發明方法所產生之氣霧劑的分散相(dispersed phase)呈現出之粒徑為，例如較佳地，其MMD小於10
μm，較佳為約1至約6μm，更佳為約1.5至約5μm，再更佳為約2至約4.5μm。或者，該粒徑之MMAD較佳為小於10μm，較佳為約1至約6μm，更佳為約1.5至約5μm，再更佳為約2至約4.5μm。另一描述氣霧劑之分散相的參數為霧化之液體顆粒或液滴的粒徑分佈。幾何標準偏差(GSD)係常用來測量所產生之氣霧劑顆粒或液滴的顆粒或液滴尺寸分佈之廣度。
在上述範圍內之精確MMD的選擇應考慮該氣霧劑沉積之目標區域或組織。例如，理想之液滴直徑將根據是否想要經口、經鼻或經氣管吸入及是否聚焦在上及/或下呼吸道遞送(例如遞送至口咽、喉、氣管、支氣管、肺泡、肺、鼻及/或副鼻竇)而有不同。此外，年齡依賴性解剖幾何形狀(例如鼻、口或呼吸氣道之幾何形狀)以及患者之呼吸系統疾病和病況，及其呼吸模式係屬於決定用於藥物遞送至下或上呼吸道之最佳粒徑(例如MMD和GSD)的重要因素。
一般而言，由小於2mm之內部直徑所界定之小氣道代表幾乎99%之肺容積，因此在肺功能中具有重要作用。肺泡為深層肺部中與血液交換氧氣和二氧化碳之位置。由一些病毒或細菌誘發之肺泡發炎會導致該位置分泌流體並直接影響到肺部攝取氧氣。以氣霧劑進行之針對深層肺部氣道的治療需要MMD小於5.0μm之氣霧劑，較佳為小於4.0μm，更佳為小於3.5μm，再更佳為小於3.0μm。
為了將氣霧劑遞送至呼吸道，該氣霧劑之MMD小於
10.0μm，較佳為小於5.0μm，更佳為小於3.3μm，再更佳為小於2.0μm。較佳地，MMD(液滴尺寸)係在約1.0至約5.0μm之範圍內且尺寸分佈(size distribution)之GSD小於2.2，較佳為小於2.0，更佳為小於1.8，再更佳為小於1.6。此粒徑及粒徑分佈(particle size distribution)參數對在人呼吸道(例如肺)包括支氣管和細支氣管中獲得相對於被霧化之藥物量而言為高的局部藥物濃度特別有用。於此文中，必須考慮到深層肺部沉積需要較沉積在成人和兒童之中央氣道中者更小的MMD，且在幼嬰和嬰兒方面，在約1.0至約3.3μm之範圍內的更小之液滴尺寸(MMD)更佳，在小於2.0μm之範圍內者甚至更佳。因此，在氣霧劑療法中常評估小於5μm(代表可被成人吸入之部分)和小於3.3μm(代表可被兒童吸入或沉積在成人較深層肺部之部分)的液滴部分。亦常評估小於2μm之液滴部分，因其代表可理想地到達成人和兒童之末端細支氣管和肺泡且可穿透幼嬰和嬰兒之肺部的氣霧劑部分。
在本發明之方法中，其粒徑小於5μm之液滴部分較佳為多於65%，更佳為多於70%，再更佳為多於80%。其粒徑小於3.3μm之液滴部分較佳為多於25%，更佳為多於30%，甚至更佳為多於35%，再更佳為多於40%。其粒徑小於2μm之液滴部分較佳為多於4%，更佳為多於6%，甚至更佳為多於8%。
氣霧劑亦可藉由在呼吸模擬實驗(breath simulation
experiment)中測定其遞送劑量(DD)來定性。遞送劑量(delivered dose)可用來計算可吸入劑量(respirable dose)(RD)，例如根據藉由雷射繞射(例如Malvern MasterSizer XTM)或使用衝擊器(例如安德森串式衝擊器-ACI，或新一代衝擊器(Next Generation Impactor)-NGI)所測量之可呼吸部分(respirable fraction)(RF)。當將本發明之方法應用在具有成人呼吸模式(正弦流(sinusoidal flow)，500mL潮氣量(tidal volume)，15次呼吸/分鐘)之呼吸模擬實驗(例如使用呼吸模擬器(breathing simulator)，像來自Copley之BRS3000或來自PARI之Compass Ⅱ TM)、並將2mL組成物(例如200mg Ig，200mg IgG、200mg IgA、200mg IgM或彼等之組合)填入膜霧化器時，遞送劑量(DD)較佳為高於40%(80mg Ig，例如IgG、IgA、IgM或彼等之組合)，更佳為高於45%(90mg Ig，例如IgG、IgA、IgM或彼等之組合)，甚至更佳為高於50%(100mg Ig，例如IgG、IgA、IgM或彼等之組合)。
在治療上呼吸道，尤其是鼻子、鼻及/或鼻竇黏膜、竇口鼻道複合體(osteomeatal complex)及副鼻腔(paranasal cavity)方面，小於約5.0μm、或小於約4.5μm、或小於約4.0μm、或小於約3.3或小於約3.0μm之MMD特別合適。
所產生之氣霧劑施用於上氣道之適用性可在鼻吸入模式中評估，諸如WO 2009/027095中所描述之人類鼻造型
模型(human nasal cast model)。在遞送氣霧劑至鼻子方面，現有，例如來自PARI之SinusTM裝置(噴射式霧化器)，還有膜霧化器(VibrentTM技術之原型)。
本發明之方法中所使用的霧化器為膜霧化器。較佳地，膜霧化器為振動膜霧化器(vibrating membrane nebulizer)。後者類型之霧化器包含其中填入該用於霧化之液體的貯存器。當操作該霧化器時，液體被饋送至被製成可振盪、即振動(例如藉由壓電元件)的膜。存在於該振動膜之一側的液體以此方式被運送通過該振動膜之開口(亦稱為“孔”或“洞”)並以氣霧劑之形式出現在該振動膜之另一側。(例如：來自PARI之eFlow rapid和eRapid、來自Health and Life之HL100及來自Aerogen之AeronebGo和AeronebSolo)。此霧化器可稱為“主動膜霧化器(active membrane nebulizer)”。
於其他有用之膜霧化器中，組成物可藉由振動該液體，而非該膜來霧化。此振盪流體膜霧化器包含其中填入欲霧化之液體的貯存器。當操作該霧化器時，該液體經由液體饋送系統被饋送至被製成可振盪(即振動，例如藉由壓電元件)的膜。此液體饋送系統可為貯存器(例如AerovectRxTM Technology、Pfeifer Technology)之振動後壁或振動液體輸送滑動器(例如來自Respironics之I-NebTM裝置，或來自Omron之U22TM裝置)。這些霧化器可稱為“被動膜霧化器(passive membrane nebulizer)”。
以膜霧化器霧化液體時可使用不同類型之膜。這些膜
之特徵在於不同的孔洞尺寸，這些不同的孔洞尺寸產生具有不同液滴尺寸(MMD及GSD的尺寸)之氣霧劑。根據該組成物之特性及期望之氣霧劑特性可使用不同的膜類型(即，不同之經修飾的膜霧化器或氣霧劑產生器)。於本發明之方法中較佳為使用能產生其MMD在2.0μm至5.0μm之範圍內(較佳為在3.0μm至4.9μm之範圍內，更佳為在3.4μm至4.5μm之範圍內)的氣霧劑之膜類型。較佳地，於本發明之另一實施態樣中係使用內建在氣霧劑產生器裝置中且可產生其MMD在2.8μm至5.5μm之範圍內(較佳為在3.3μm至5.0μm之範圍內，且更佳為在3.3μm至4.4μm之範圍內)的氣霧劑(例如等張生理鹽水(NaCl 0.9%))之膜類型。較佳地，於本發明之另一實施態樣中係使用內建在氣霧劑產生器裝置中且可產生其MMD在2.8μm至5.5μm之範圍內(較佳為在2.9μm至5.0μm之範圍內，且更佳為在3.8μm至5.0μm之範圍內)的氣霧劑(例如等張生理鹽水)之膜類型。
本發明者已發現當將貯存器與大氣隔離，從而使貯存器內之壓力能在霧化該液態水性組成物(其包含多株Ig，例如IgG、IgA、IgM或彼等之組合)之步驟(即，步驟(c))前或期間降低時，本發明的方法作用得特別好。換言之，若在比氣霧劑液滴要射入之區域之周圍壓力稍低的壓力下將該液態水性組成物饋送至膜時，本方法特別有效。在霧化該液體的步驟之前，貯存器中之初始壓力較佳為至少50mbar，更佳為至少75mbar、最佳為至少
100mbar。
再者，氣霧劑產生器具有與液體貯存器合作之負壓產生裝置從而在膜振盪之前(即，開始投藥或使用之前)將密封狀態之液體貯存器中的液體貯存體積(V1)增加至體積(V2)。此負壓產生裝置可依US 6,983,747 B2(其全部內容以引用方式併入本文)中之揭示內容形成。或者，該負壓產生裝置亦可依WO 2007/020073 A1(其全部內容以引用方式併入本文)中之揭示內容配置。
為了實現減少貯存器中之壓力，特佳地，藉由設置在該貯存器(10)中之開口以對該開口提供氣密密封(gas-tight seal)的密封元件(16)、及連接該密封元件(16)之可滑動元件(21)而使貯存器與大氣隔離，該可滑動元件(21)與該密封元件(16)之連接方式係使得該可滑動元件(21)之移動能使該密封元件(16)的至少一部分(18)移動，從而在貯存器(10)中產生負壓，如第1圖所示。此降低貯存器內之壓力的方法描述於WO 02/064265(其全部內容以引用方式併入本文)中。或者，該負壓產生裝置亦可依EP 1353759 B1(其全部內容以引用方式併入本文)中之揭示內容配置。於其他有用之膜霧化器中，負壓係在密封之液體貯存器中藉由閉合元件或機械系統，利用例如體積膨脹風箱(volume expansion bellow)、移動、抽吸(sucking)、抽送(pumping)或類似者而產生。
或者，亦可將貯存器中之負壓產生裝置配置成在從流
體或液體產生氣霧劑的完整過程中在貯存器內產生幾乎恆定的負壓範圍。在霧化該液體之步驟期間，貯存器中之負壓範圍較佳為在50至400mbar之範圍內，更佳為在100至400mbar之範圍內，再更佳為在100至350mbar之範圍內，且最佳為在100至200mbar之範圍內。此負壓範圍裝置可依WO 2012/069531 A2(其全部內容以引用方式併入本文)中之揭示內容形成。
然而，負壓亦可單獨在霧化期間產生，或者如上述藉由閉合元件(closing element)產生之負壓可在進行霧化期間(即，步驟(c))維持在相當恆定之水準。
若該方法旨在針對下呼吸道(諸如支氣管或深層肺部)，特佳地，選擇壓電穿孔膜型(piezoelectric perforated membrane-type)霧化器來產生該氣霧劑。合適之霧化器的實例包括被動膜霧化器，諸如I-NebTM、U22TM、U1TM、Micro AirTM、超音波霧化器例如MultisonicTM，及/或主動膜霧化器，諸如HL100TM、RespimateTM、eFlowTM Technology霧化器、AeroNebTM、AeroNeb ProTM、AeronebGoTM和AeroDoseTM裝置系列以及原型Pfeifer、Chrysalis(Philip Morris)或AerovectRxTM裝置。用於使該藥物針對下呼吸道之特佳的霧化器為振動穿孔膜霧化器或所謂的主動膜霧化器，諸如，例如eFlowTM霧化器(可從德國PARI取得之電子振動膜霧化器)。或者，可使用被動膜霧化器，例如來自Omron之U22TM或U1TM或根據Telemaq.fr技術或Ing.Erich Pfeiffer
GmbH技術之霧化器。
用於針對(target)上呼吸道之較佳的膜霧化器為經由穿孔振動膜(perforated vibrating membrane)原理產生氣霧劑之霧化器，諸如使用eFlowTM技術之經修飾的調查研究用膜霧化器，但其亦能發射脈動空氣流，以使所產生之氣霧劑雲在所需位置或在運送該氣霧劑雲至所需位置(例如鼻竇或副鼻竇)之期間脈動(即，經受壓力波動)。此類型之霧化器具有用於引導該運送氣霧劑雲之流進入鼻子的噴嘴(nose piece)。相較於以連續(非脈動)模式遞送氣霧劑，藉由此經修飾之電子霧化器遞送的氣霧劑可更佳地達到鼻竇腔(sinonasal cavity)或副鼻腔(paranasal cavity)。脈動壓力波(pulsating pressure wave)實現更強之鼻竇通氣(ventilation)，這使得伴隨施用之氣霧劑在這些腔中有較佳的分佈和沉積。
更具體地，用於針對(target)患者之上呼吸道的較佳霧化器為適於以小於約5升/分鐘之有效流速產生氣霧劑且適於同時操作用於實現約10至約90Hz之頻率之氣霧劑之壓力脈動的裝置的霧化器，其中該有效流速為該氣霧劑進入患者之呼吸系統時的流速。此電子霧化裝置之實例揭示於WO 2009/027095中。
於本發明之一較佳實施態樣中，用於針對上呼吸道之霧化器為使用輸送流之霧化器，當該氣霧劑雲到達期望位置時該輸送流可被中斷，然後啟動氣霧劑雲之脈動，例如以交替模式。該細節描述於WO 2010/097119 A1和
WO2011/134940 A1中。
無論是適於肺部或鼻與鼻竇遞送，霧化器較佳應經過選擇或調整以能夠以較佳之輸出率霧化單位劑量。單位劑量於本文中係定義為指定在單次投藥(single administration)中投予之包含有效量之活性化合物(即，Ig、IgG、IgA、IgM或彼等之組合)的液態水性組成物的體積。較佳地，該霧化器能以至少0.1mL/min之速率遞送此單位劑量，或者，假設該組成物之相對密度通常為約1時，以至少100mg/min之速率遞送。更佳地，該霧化器能分別產生至少0.4mL/min或400mg/min之輸出率。於其他實施態樣中，該霧化器或氣霧劑產生器之液體輸出率為至少0.50mL/min，較佳為至少0.55mL/min，更佳為至少0.60mL/min，再更佳為至少0.65mL/min，最佳為至少0.7mL/min，此裝置稱為具有高輸出或高輸出率之氣霧劑產生器。較佳地，該液體輸出率係在約0.35至約1.0mL/min之範圍內或在約350至約1000mg/min之範圍內；較佳地，該液體輸出率係在約0.5至約0.90mL/min之範圍內或在約500至約800mg/min之範圍內。液體輸出率意指每單位時間霧化之液體組成物的量。該液體可包含活性化合物、藥物、Ig、IgG、IgA、IgM或彼等之組合及/或代用品，諸如氯化鈉0.9%。
現已發現在本發明之方法中(即，用於從濃度為每毫升20至200mg之多株Ig(例如IgG、IgA、IgM或彼等之組合)組成物產生氣霧劑)，可在霧化器中使用特定之膜
類型來增加輸出率。例如，現已發現在輸出率方面特別有利的為使用如下述之膜(122)：其具有用於與流體接觸的第一側(124)及相對的第二側(125)，該膜具有多個在第一側到第二側之延伸方向(E)上穿透該膜之貫通孔(126)，藉此，流體係於該膜振動時通過貫通孔從第一側到達第二側以在第二側產生氣霧劑，各貫通孔(126)沿著其延伸方向(E)具有最小直徑(DS)、較該最小直徑大之較大直徑(DL)，且此直徑被限定為將近該最小直徑之三倍、較佳為二倍，各貫通孔具有由貫通孔於延伸方向上的連續部分所界定的噴嘴部分(132)，該噴嘴部分(132)包含貫通孔之最小直徑並以該貫通孔之較大直徑為邊界，其特徵在於，各貫通孔(126)於延伸方向上的總長度對各該噴嘴部分(132)於延伸方向上的長度的比係至少為4。此膜描述於WO 2012/168181 A1中並顯示於第2圖中，其顯示出電腦斷層掃描(CT)圖像與附帶之描述。
霧化器之輸出率應經過選擇以達成液體組成物之短霧化時間。顯然地，霧化時間將取決於欲霧化之組成物的體積及輸出率。較佳地，霧化器應係經過選擇或改造成能在不超過20分鐘之內霧化某體積之包含有效劑量之多株Ig(例如IgG、IgA、IgM或彼等之組合)的液體組成物。更佳地，單位劑量之霧化時間不超過15分鐘。於另一實施態樣中，霧化器係經過選擇或改造成能使每單位劑量之霧化時間不超過10分鐘，更佳為不超過6分鐘且甚至更
佳為不超過3分鐘。目前最佳之霧化時間係在0.5至5分鐘的範圍內。
在根據本發明方法之步驟(c)中被霧化的組成物之體積較佳為低體積，以允許短的霧化時間。該體積(亦稱為劑量之體積、或劑量單位體積、或單位劑量體積)應被理解為意圖用於單次投藥或單次霧化器治療期的體積。具體的說，該體積可在0.3mL至6.0mL之範圍內，較佳為0.5mL至4.0mL，或更佳為1.0mL至約3.0mL，或甚至更佳為約2mL。當殘留體積是有需要或有助益時，此殘留體積應少於1.0mL，更佳為少於0.5mL，最佳為少於0.3mL。因而該有效霧化體積較佳為在0.2至3.0mL或0.5至2.5mL之範圍內，或更佳為在0.75至2.5mL或1.0至2.5mL之範圍內。
較佳地，霧化器被改造成所產生之氣霧劑中該液體組成物之裝載劑量的主要部分係以氣霧劑之形式遞送，即，具有高輸出。更具體地，霧化器被改造成所產生之氣霧劑中含有至少50%之組成物中之Ig(例如IgG、IgA、IgM或彼等之組合)劑量，或者，換言之，其發射至少50%之充填在該貯存器中的液體組成物。尤其是與單株抗體(其中由於該單株抗體之特異性因而不需要那麼高的劑量)相比，選擇能產生如此高之多株Ig(例如IgG、IgA、IgM或彼等之組合)的輸出的霧化器是很重要的。已發現，如本發明方法中所使用之膜霧化器能產生其中之組成物多株Ig(例如IgG、IgA、IgM或彼等之組合)之輸出特別高的
氣霧劑。
此外，霧化器可包含具有吸入和呼出閥之腔室，亦稱為氣霧劑室或混合室。膜霧化器貯存器中填入液體，該膜產生氣霧劑進入混合室。較佳地，該呼氣閥(exhalation valve)係位在噴嘴(mouth piece)附近而吸入閥(inhalation valve)係位在進入之周圍空氣開口附近。這樣可減少患者呼氣階段氣霧劑之損失，因為在該階段製造之氣霧劑主要被保持在混合室中直到患者吸氣。具有此混合室之膜霧化器描述於WO 2001/34232和WO 2010/066714中。可使用不同尺寸之混合室。在本發明之方法中，較佳為使用體積至少為45mL之大混合室，更佳為至少50mL，再更佳為至少60mL。或者，可使用體積在60至150mL之範圍內的大混合室。具有此種大混合室之膜霧化器描述於EP 1 927 373(其全部內容以引用方式併入本文)中。
較佳地，本發明方法中所使用之液態水性組成物含有一或多種安定劑。當配製液體免疫球蛋白調製劑時經常遇到的問題為若未以適當之添加劑充分安定時該免疫球蛋白傾向聚集並形成沉澱物。已知數種胺基酸諸如脯胺酸、甘胺酸和組胺酸，或醣類，或糖醇，或蛋白質諸如白蛋白，或彼等之組合可安定在液體調製劑中之免疫球蛋白且可用於液態水性組成物中。
在藉由霧化以肺部投予Ig，例如IgG、IgA、IgM或彼等之組合方面，較佳為使用高濃度之Ig，例如IgG、
IgA、IgM或彼等之組合。一般而言，高劑量之多株Ig是必要的，但將欲霧化之體積儘可能最小化以使霧化時間儘可能短是很重要的。後者與患者依從性(patient compliance)有關。因此，在本發明之方法中具有高Ig濃度之Ig組成物為較佳者。然而，已發現，Ig之濃度增加會導致黏度非線性增加。
眾所周知，液體組成物之動態黏度對藉由霧化組成物所形成之氣霧劑的液滴尺寸分佈及霧化效率具有影響。在以膜霧化器霧化液體組成物方面，本發明方法中所使用之液體組成物大致上較佳為在20℃+/-0.1℃之溫度下顯示出動態黏度在約0.8至約4.0mPa．s之範圍內。更佳地，當根據European Pharmacopoeia第6.0版2.2.49章節及DIN 53015之要求，根據Höppler以落球黏度計(“Kugelfallviskosimeter”)測量時，在20℃+/-0.1℃之溫度下，該動態黏度(dynamic viscosity)係在約1.0至約3.5mPa．s的範圍內。由此，可測定球或球體在具有限定尺寸及限定斜率之管或毛細管中的滾動時間。根據該滾動時間可測定在管或毛細管中之液體的黏度。該測量通常係在20℃+/-0.1℃之溫度下進行。
本發明之一實施態樣為用於產生免疫球蛋白溶液之氣霧劑的方法，其中該免疫球蛋白溶液之黏度為1至17mPa．s、1至16mPa．s、1至15mPa．s、1至14mPa．s、1至13mPa．s、1至12mPa．s、1至11mPa．s、1至10mPa．s、2至17mPa．s、2至16mPa．s、2至15mPa．s、2
至14mPa．s、2至13mPa．s、2至12mPa．s、2至11mPa．s、2至10mPa．s、3至17mPa．s、3至16mPa．s、3至15mPa．s、3至14mPa．s、3至13mPa．s、3至12mPa．s、3至11mPa．s、3至10mPa．s；較佳地，該免疫球蛋白溶液之黏度為1至9mPa．s、1至8mPa．s、1至7mPa．s、1至6mPa．s、2至9mPa．s、2至8mPa．s、2至7mPa．s、2至6mPa．s、3至9mPa．s、3至8mPa．s、3至7mPa．s、或3至6mPa．s；更佳地，該免疫球蛋白溶液之黏度為1至5mPa．s、1至4mPa．s、2至5mPa．s、2至4mPa．s、3至5mPa．s、或3至4mPa．s。
為避免由高黏度引起之霧化問題，現已發現較佳使用脯胺酸(proline)作為安定劑，如WO2011/095543中所揭示者，由於Ig(例如IgG、IgA、IgM或彼等之組合)之黏度較低，即使Ig之濃度高，亦可獲得製劑。因此，現已發現當意圖在使用霧化器來產生氣霧劑的方法中使用多株Ig組成物時，在這些組成物中添加脯胺酸特別有利。脯胺酸一方面提供液體組成物中之Ig所需的安定性，另一方面其可降低組成物之黏度，從而允許具有高Ig濃度之小液體體積霧化，此導致快速而有效的藉霧化之治療。
當使用脯胺酸作為安定劑時，特佳為使用L-脯胺酸。L-脯胺酸通常存在於人體內且具有非常有利之毒性變化形廓(toxicity profile)。L-脯胺酸之安全性係在重複之劑量毒性研究(repeated-dose toxicity study)、生殖毒
性研究(reproduction toxicity study)、致突變性研究(mutagenicity study)及安全性藥理學研究(safety pharmacology study)中調查且未發現不良作用。
一般而言，添加在該組成物中之脯胺酸(更佳為L-脯胺酸)的量為使該免疫球蛋白組成物中之脯胺酸的濃度為約10至約1000mmol/L，更佳為約100至約500mmol/L、最佳為約250mmol/L。
於本發明之一實施態樣中，包含多株IgG及安定量之脯胺酸的液態水性組成物之黏度係在1mPa．s至17mPa．s之範圍內(在20.0℃+/-0.1℃之溫度下)。在20.0℃+/-0.1℃之溫度下，包含100mg/mL之多株IgG及250mM之脯胺酸的組成物之黏度為約3mPa．s。
根據本發明使用且包含脯胺酸之IgG組成物的pH值為4.2至5.4，較佳為4.6至5.0，最佳為約4.8，其進一步促進該製劑之高安定性。
使用脯胺酸使得能製備其中該調製劑之安定性增加的組成物，且該組成物之黏度係經由使用單一用劑而降低。此獲致在以膜霧化器產生氣霧劑之方法中特別有用的組成物。
本發明之方法中所使用的液體組成物亦可包含其他醫藥上可接受之賦形劑，該醫藥上可接受之賦形劑可用於優化該組成物之特性及/或氣霧劑之特性。此賦形劑之實例為用於調節或緩衝pH值之賦形劑、用於調節滲透壓(osmolality)之賦形劑、抗氧化劑、界面活性劑、用於
緩釋或延長局部滯留之賦形劑、掩味劑、甜味劑及調味劑。這些賦形劑係用於取得支持該調製劑之安定性、氣霧化、耐受性及/或該調製劑被吸入時之效力的最佳pH值、滲透壓、黏度、表面張力和味道。
本發明所使用之免疫球蛋白溶液之表面張力為約60至75mN/m，較佳為約64至71mN/m。
例如，可在組成物中添加界面活性劑。這些可協助控制免疫球蛋白在組成物中(即，在儲存期間和貯存器中)和霧化期間(即，通過霧化器之膜期間和之後)的聚集率(rate of aggregation)，從而影響氣霧劑中之Ig(例如IgG、IgA、IgM或彼等之組合)的活性。有用之界面活性劑的實例為聚山梨醇酯，諸如聚山梨醇酯80。
一般而言，應用本發明之方法已發現可獲致其中該Ig(例如IgG、IgA、IgM或彼等之組合)之活性至少為填入該霧化器貯存器之組成物中Ig活性的80%的氣霧劑。因此，本發明之方法既不造成Ig顯著聚集，亦不造成Ig顯著變性。Ig之活性可藉由標準免疫學方法測定(例如ELISA、流式細胞術及以細胞為基礎之測定)。
藉由本發明之方法產生的氣霧劑可用於其中顯示需要多株Ig(例如IgG、IgA、IgM或彼等之組合)的數種病況之療法和預防中。
尤其是，藉由本發明之方法產生之氣霧劑可用於需要替代療法之患者中，即，具有肺病、鼻竇炎之患者、因為不具有足夠之抗體而處於反複感染之風險中的患者，或者
，換言之，具有免疫缺乏症候群者。更具體地說，氣霧劑可用於治療患有原發性免疫缺陷(primary immunodeficiency)(PID)、繼發性免疫缺陷(secondary immunodeficiency)(SID)之患者，諸如由慢性淋巴性白血病(chronic lymphoid leukemia)或多發性骨髓瘤造成之低γ球蛋白血症(hypogammaglobulinemia)及復發性細菌感染、同種異體(allogeneic)血液幹細胞移植(HSCT)後之低γ球蛋白血症、由治療惡性腫瘤之化療造成之低γ球蛋白血症、由於以生物製品(諸如利妥昔單抗(rituximab))治療惡性腫瘤或自體免疫性疾病造成之低γ球蛋白血症、由用於治療自體免疫性疾病或臟器器官移植(solid organ transplantation)之免疫抑制藥物所造成之對呼吸道感染易感，及患有後天性免疫缺乏症候群(AIDS，HIV)之患者。此外，氣霧劑可用於下列治療中：具有慢性氣道感染之病況諸如囊性纖維化(cystic fibrosis)及原發性纖毛運動異常症(primary ciliar dyskinesia)、慢性阻塞性肺疾病(COPD)、慢性細菌性鼻竇炎，具有氣道慢性發炎之病況諸如閉塞性細支氣管炎(bronchiolitis obliterans)、閉塞性細支氣管炎器質化肺炎(bronchiolitis obliterans organizing pneumonia)、非囊性纖維化支氣管擴張(non-cystic fibrosis bronchiectasis)、慢性細菌性支氣管炎(chronic bacterial bronchitis)、間質性肺病(interstitial lung disease)、支氣管哮喘(bronchial asthma)或尋常型間質性肺炎(usual interstitial
pneumonia)，或過敏性病症諸如外源性過敏性肺泡炎(exogenous allergic alveolitis)、過敏性哮喘(allergic asthma)或慢性鼻竇炎。
再者，藉由本發明之方法所產生的氣霧劑可用於具有需要加以調整之異常免疫系統的患者之免疫調節中。因此，氣霧劑可用於處於高出血風險或在手術前需要校正血小板數量之具有自發性(或原發性)血小板減少性紫瘢(thrombocytopenic purpura)(ITP)的患者、具有Guillain-Barré症候群、川崎氏症(Kawasaki)或慢性發炎性脫髓鞘多發性神經病變(chronic inflammatory demyelinating polyneuropathy)(CIDP)之患者。
下表中列出之市售之免疫球蛋白調製劑可用於本發明之方法中以作為包含多株免疫球蛋白G之液態水性組成物：
下列非限制性實施例係用於說明本發明。
評估含有100mg/mL正常的人免疫球蛋白及0.25mol/L脯胺酸(在注射用水中)的組成物之霧化。免疫球
25μg之IgA；其係從人類捐血者之血漿製備。該組成物之pH為4.82、密度為1.0336g/mL、在20℃之黏度為3.33mPa．s、在20℃之表面張力為71.1mN/m且滲透壓(osmolality)為312mOsm/kg。
使用具有大混合室(體積約90mL)之電子振動膜霧化器(使用德國PARI Pharma GmbH之eFlowTM技術的經修飾之膜霧化器)進行霧化，液體貯存器中之初始負壓係在100至400mbar之範圍內，且不同之膜類型具有不同之孔洞尺寸及孔洞幾何形狀。設計不同類型之膜以產生不同的液滴或粒徑(以質量中數粒徑(MMD)和幾何標準差(GSD)定性)及/或不同之輸出率(例如藥物遞送率(drug delivery rate)(DDR)或總輸出率(TOR或所謂之輸出))。置於氣霧劑產生器裝置中之膜的正常輸出率定義為低於0.55mL/min，而高輸出率之定義為至少0.55mL/min之數值。或者，輸出率係以mg/min定性(或定義)；正常輸出率為例如低於550mg/min，高輸出率為例如至少550mg/min。(或者，高輸出率之限值可定義為至少0.50mL/min，較佳為至少0.55mL/min，更佳為至少0.60mL/min或最佳為至少0.65mL/min，以及據此之以mg/min計之輸出率)。該限值取決於液體特性，例如密度、黏度、表面張力等，且可為了確保氣霧劑產生器裝置之品質的目的而定義，例如可為了替代溶液(surrogate solution)(如氯化鈉0.9%)定義，而非為Ig，例如IgG、IgA及/或IgM溶液定義。然後，從建於氣霧劑產生
器裝置中之膜所產生的替代溶液(例如0.9%氯化鈉)之正常輸出率定義為至少0.55mL/min，更佳為至少0.60mL/min，再更佳為至少0.65mL/min。或者，高輸出率為至少550mg/min，較佳為至少600mg/min，更佳為至少650mg/min。用於霧化該IgG組成物之膜的類型確認且定性於表1中。
使用雷射繞射儀(Malvern MasterSizer XTM)來測定所產生之氣霧劑的液滴尺寸(以質量中數粒徑(MMD)表示)及液滴尺寸分佈(以幾何標準偏差(GSD)表示)。將體積為2mL之IgG組成物填入霧化器貯存器中，並藉由使用20L/min之抽吸流(aspiration flow)將氣霧劑雲(aerosol cloud)引導通過MasterSizer XTM儀之雷射光束來分析在操作該霧化器時所產生之氣霧劑。在測量過程中之溫度和相對濕度分別為23℃(±2℃)和50%(±5%)。在相同實驗中評估總輸出率(Total Output Rate)(TOR)。每一種類型之膜測量二次(n=2)。結果(平均值和標準差(SD))顯示於表2中。
以三種使用eFlowTM技術且具有大混合室(約90mL)之經修飾的膜霧化器重複實施例1中所描述之雷射繞射實驗，液體貯存器中之初始負壓係在100至400mbar之範圍內，使用第2型和第4型膜(如上文所指明者)。除了測定MMD、GSD和TOR外，測量小於5μm、小於3.3μm及小於2μm之液滴的百分比(即，不同之可吸入部分(Respirable Fraction)(RF)的百分比)。小於5μm之液滴部分為可吸入成人之下呼吸道的液滴百分比之良好指示，而小於3.3μm之液滴部分係提供可吸入兒童之下呼吸道的液滴百分比之估計值。小於2μm之液滴部分表示能夠到達末端細支氣管和肺泡之液滴百分比。具有不同粒徑之氣霧劑的肺部沉積可藉由數學模型計算，諸如，例如用於不同年齡群(如成人、兒童、幼嬰或嬰兒)的ICRP模型(由ICRP Task Group Radiat Prot Dosimetry(1991)38(1-3)：159-165,A.C.James et al.提出之呼吸道沉積模型(Respiratory Tract Deposition Model))。
每一測試之霧化器進行二次實驗(n=2)。測量結果顯示於表3中。
將各種來自血漿之免疫球蛋白同種型(isotype)和聚合體(IgA和IgM)，以及IgG調製劑霧化並以類似於實施例1中描述之方式使用相同的霧化器和膜將所得之氣霧劑定性。
更具體地說，藉由雷射繞射比較藉由霧化下列調製劑
更具體地說，藉由雷射繞射比較藉由霧化下列調製劑所獲得之氣霧劑的特性。
當使用調查研究用之eFlowTM霧化器系統霧化時，藉由雷射繞射測量(Malvern MasterSizer XTM)來測定各調製劑之粒徑分佈，該調查研究用之eFlowTM霧化器系統具有大混合室及在各自關閉時誘導負壓之貯存器，具有2種不同類型之膜(如實施例1中所具體指明者)。在各例中之充填容積為2mL。測量之參數為MMD、GSD、總輸出率(TOR)及可吸入部分(Respirable Fraction)。TOR之測定係藉由在霧化前和霧化完成後稱量該填充之霧化器的重量並將重量差除以霧化時間而計算出。
所有測定係以三重複來進行。結果(三次測定之平均值和標準差(SD))顯示於表4中。
這些結果顯示所有測試之調製劑可被以霧化成具有良好性能。
亦在呼吸模擬實驗中評估實施例1和實施例3中所描述之組成物的霧化，此呼吸模擬實驗係以三種經修飾的膜霧化器進行，其係使用eFlowTM技術且具有大混合室，並採用第2型和第4型膜(如上文中所具體指明者)。每一霧化器測試二次(n=2)。
該呼吸模擬實驗係根據Ph.Eur.2.9.44，使用成人呼吸模式進行(即，潮氣量為500mL之正弦流(sinusoidal flow)，每分鐘呼吸15次，吸氣：呼氣比(I：E)為50：50)。在每一測試中，霧化器被連接至竇泵(sinus pump)(PARI Compass Ⅱ TM呼吸模擬器)。將吸氣過濾器(inspiratory filter)(聚丙烯；3M)安裝在包含噴嘴(mouth piece)之霧化器與泵之間並以橡膠連接物固定。在霧化器中填入2Ml之實施例1中所描述之組成物並開始霧化，且持續至不再看到氣霧劑產生為止。將含有藥物之氣霧劑液滴收集於吸入過濾器上。
為了測定遞送劑量(delivered dose)，即，霧化期間收集在過濾器上之免疫球蛋白的量，以鑷子從過濾器殼體移除吸入過濾器並放在帶有螺旋蓋之50毫升塑膠管中。然後，以40毫升含有0.9%生理鹽水和在純水中之0.5% SDS(十二烷基硫酸鈉，98.5%)的緩衝液清洗該過濾器
殼體，接著將該清洗流體加入該具有過濾器之管中。在旋轉器上搖動並將濾液萃取1小時。
另外，以40ml之上述緩衝液清洗該霧化器數次並將該清洗液收集在燒杯中，以用於測定殘餘在該貯存器中之藥物的量(殘餘物)。
使用UV分光光度法(UV spectrophotometry)分析從濾液萃取產生及從清洗霧化器產生之溶液。以緩衝液稀釋各溶液之樣本以達到約0.5mg/mL之免疫球蛋白濃度。將約0.8毫升之稀釋的樣本溶液填充在拋棄式微光烯槽(micro cuvette)中並在280nm相對於緩衝液測量。根據Beer-Lambert定律(A=ε．c．L)，利用質量吸收係數(mass absorption coefficient)ε(0.1%)=1.38mL/(mg．cm)計算在溶液中之Ig含量。更具體地，計算Ig含量之公式為：c(mg/mL)=稀釋因子 * A280/ε * l
根據該遞送劑量(delivered dose)及實施例2中藉由雷射繞射測定之平均可吸入部分(mean respirable fraction)來計算可吸入劑量(respirable dose)。
在呼吸模擬實驗(breath simulation experiment)中亦記錄霧化時間。呼吸模擬實驗之結果總結於表5a和5b中。在各測試之參數方面，每一種膜類型所進行之6個實驗(即，3種不同霧化器的2次試驗)結果的平均值與標準差(SD)一起顯示。
測定在實施例1和實施例3中所獲得之霧化組成物的免疫球蛋白之結構完整性(structural integrity)和多聚體化(multimerization)的特性。為此，於霧化之組成物的樣本進行(i)SDS-PAGE，(ii)粒徑排阻層析(size exclusion chromatography)(SEC)及(iii)動態光散射(dynamic light scattering)(DLS)分析。
在霧化過程之後直接收集霧化之樣本如下：以彈性連接物(elastomeric connector)將Falcon管直接連接到霧化器混合室之出口。在實驗前將霧化器、連接器及Falcon管經高壓滅菌(autoclave)並在層流(laminar airflow)條件下進行霧化。在霧化器之貯存器中填入4mL之樣本調製劑。以螺帽封閉該採樣管並在完整性測試前將其冷凍在-18℃。
共將36個樣本進行SDS-PAGE和SEC分析：
‧取8個樣本分析與脯胺酸一起配製之IgG(第3圖)：2個未經霧化之對照樣本(a)、以第2型膜獲得之3個霧化的樣本(b)及以第4型膜獲得之3個霧化的樣本(c)。分別以二重複(未經霧化之樣本)及三重複(霧化之樣本)分析樣本。
‧取14個樣本分析在PBS(d、f、g)中之IgG及在甘胺酸(e、h、i)中之IgG(第4圖)：2個未經霧化之對照樣本(d、e)、以第2型膜獲得之6個霧化的樣本
(f、h)及以第4型膜獲得之6個霧化的樣本(g、i)。以三重複來分析樣本(霧化之樣本)。
‧取14個樣本分析IgA(j、l、m)及IgAM(k、n、o)(第4圖)：2個未經霧化之對照樣本(j、k)、以第2型膜獲得之6個霧化的樣本(l、n)及以第4型膜獲得之6個霧化的樣本(m、o)。以三重複來分析樣本(霧化之樣本)。
‧取10個樣本分析IgA(p、q)、IgAM(r、s)、SIgAM(t、u)及IgG(v、w、x、y)(第4圖)：5個未經霧化之對照樣本(p、r、t、v、x)及以第4型膜獲得之5個霧化的樣本(q、s、u、w、y)。
從人類捐血者之血漿製備所有免疫球蛋白溶液。該IgG溶液之蛋白質濃度為100mg/mL且含有至少98%之IgG。所有三種IgG調製劑(250mM脯胺酸；250mM甘胺酸；PBS)之pH值為4.8。該IgA溶液和IgAM(聚合體IgA+IgM)溶液之蛋白質濃度為50mg/mL且係配製在PBS中，pH值為7.4。該IgA溶液之相對IgM含量為2%，IgAM溶液之相對IgM含量為35%。該IgA和IgAM溶液亦是在脯胺酸中配製(125mM)。人類重組分泌成分(recombinant secretory component)與PBS中之IgA和IgM聯合，然後配製於脯胺酸(125mM)中。在脯胺酸中配製之IgA溶液中的IgM含量如下：IgA(<2%)、IgAM(33%)、SIgAM(32%)。
根據製造商之規程使用Life Technologies之Mini-
Cell系統進行SDS-PAGE。簡單地說，將樣本分別在還原或非還原條件下，在樣本緩衝液中變性，並於預製梯度凝膠(pre-cast gradient gel)，NuPAGE NovexTM Bis-Tris 4-12% 1.0mm 15 well，使用NuPAGETM MES電泳緩衝液(Life Technologies)藉由電泳法分離。電泳後，根據製造商之規程，將凝膠中之蛋白質固定並以考馬斯(Coomassie)G-250(SimplyBlue SafestainTM；Life Technologies)染色。使用ImageQuantTM LAS 4000系統(GE Healthcare Lifesciences)數位式記錄蛋白質染色型態。
藉由SDS-PAGE分析取得之蛋白質帶型(protein banding pattern)顯示於第3圖中(其中標記a、b和c係指上述樣本之組別)和第4圖中(其中標記d、e、f、g、h、i、j、k、l、m、n、o、p、q、r、s、t、u、v、w、x和y係指上述樣本之組別)。第3A、4A、4C圖(左片)顯示在還原條件下獲得之結果，而第3B、4B、4C圖(右片)顯示在非還原條件下獲得之結果。
在SEC分析方面，將200μg/2μl(IgG)或100μg/2μl(IgA、IgAM)之樣本以0.7mL/min之流速注入Agilent Technologies 1260 InfinityTM HPLC系統之TSK凝膠G3000SWxl 7.8mm ID x 30cm管柱(Tosoh Bioscience)上以進行粒徑排阻層析(size exclusion chromatography)。從所得之層析圖分別評估下列者之相對含量：(i)免疫球蛋白聚合體(polymer)和聚集體(aggregate)，
(ii)單體(monomer)和雙體(dimer)，以及(iii)片段(fragment)。結果顯示於表6和7。
在DLS分析方面，以反向散射模式(backscatter mode)使用Malvern Zetasizer NanoTM測量樣本，使用相同、固定的儀器設定來測量位置、偵測衰減(detector attenuation)、運行歷時(run duration)、運行數(run number)和測量數(measurement number)，以專有之Zetasizer軟體將每一樣本之測量結果平均。結果顯示於表8中。
比較未經霧化及各別霧化之免疫球蛋白樣本，在還原和非還原二種條件下，相同免疫球蛋白調製劑之所有分析之樣本藉由SDS-PAGE分析所獲得的蛋白質帶型(protein banding pattern)完全相同(第3圖和第4圖)，這表明霧化樣本中之免疫球蛋白的結構完整性(structural integrity)被保存。
使用粒徑排阻高效液相層析(size exclusion high-performance liquid chromatography)(SE-HPLC)進行之分子尺寸分析強烈支持此發現。所有分析樣本之蛋白質粒級(protein size category)(聚合體和聚集體、單體和雙體、及片段)的相對含量彼此相當(表6、表7)。值得注意的是，IgG之脯胺酸或甘胺酸調製劑中所觀察到之聚集體含量
1%，這對經霧化、高度濃縮之IgG而言非常低且甚至滿足經靜脈投予IgG之需求。此外，具有增加之高分子量蛋白質物種含量的免疫球蛋白製劑(如在酸化之PBS中配製的10%(w/w)IgG(~3%聚集體含量)、在PBS中之5%(w/w)IgA(~17%Ig聚合體和聚集體)、在脯胺酸中之5%(w/w)IgA(~21%Ig聚合體和聚集體)、
在PBS中之5%(w/w)IgAM(~55%Ig聚合體和聚集體)、在脯胺酸中之5%(w/w)IgAM(~54%Ig聚合體和聚集體)、和在脯胺酸中之5%(w/w)SIgAM(~56%Ig聚合體和聚集體))在霧化過程亦未被明顯改變。
由於SEC分析未區分Ig聚合體和聚集體，進一步藉由動態光散射(DLS)(對較大顆粒之靈敏度較高之方法)分析霧化前和霧化後之富含聚合體的IgAM樣本。DLS分析將可揭露由於蛋白質聚集體之形成而造成之Ig蛋白質的粒徑分佈改變。然而，關於Z-平均值(Z-Average)、多分散性(polydispersity)和粒子計數率(particle count rate)之DLS分析結果指出霧化不會造成粒徑分佈(particle size distribution)改變(表8)。
總之，上述生化分析顯示出未經霧化和霧化之樣本幾乎沒有區別。
免疫球蛋白展示出直接取決於其Fab(抗原結合片段(fragment antigen binding))和Fc(可結晶化片段(fragment crystallizable))片段之不同的功能。Fab部分涉及抗原識別(antigen recognition)，Fc部分可結合至特異受體並活化下游分子路徑。重要的是，其亦可活化補體(complement)。
以經修飾之膜霧化器霧化實施例1和實施例3中所描述之組成物並收集所產生之氣霧劑，該經修飾之膜霧化器係使用eFlowTM技術且具有大混合室，並採用第2型和第4型膜(如上文中所具體指明者)。使用所收集之溶液來測定霧化後之免疫球蛋白的活性，將此活性與霧化前之組成物中的免疫球蛋白活性相比較以評估該霧化過程對免疫球蛋白之活性的影響。
首先，藉由測試霧化之免疫球蛋白的抗原識別能力(antigen recognition capacity)及Fc功能來測定活性。在所有人Ig製劑中均存有異種反應性(xenoreactive)抗體。在此組成物中添加異種抗原(xenoantigen)(兔子紅血球)可使形成免疫複合物。將所產生之免疫複合物(immune complex)添加至人多核嗜中性球(polymorphonuclear neutrophil)(PMN)中，其隨後藉由IgG之Fc片段之識別及結合至其FcγRII和FcγRIIIγ受體或者IgA之Fc片段之識別及結合至CD89(IgA受體)而被活化。然後，生成游離之氧自由基(呼吸爆發(respiratory burst))，此可藉由化學發光(chemiluminescence)檢測。細胞活化之程度係取決於免疫球蛋白之Fc部分的完整性及結合至紅血球的量。為了取得完全取決於免疫球蛋白之Fc部分的品質之數據，藉由FACS測量結合至兔紅血球之抗體的量，並計算化學發光和結合數據。Fc活性
50之免疫球蛋白顯示正常之Fc功能。結果呈現於表9a和9b中。在表9b中，Fc活性係以
霧化前活性之百分比表示，其係計算如下：Fc活性(樣本)=霧化前在半最大化學發光(half maximum chemiluminescence)時之經結合的Ig/霧化後在半最大化學發光時之經結合的Ig*100%
所有霧化前之免疫球蛋白的Fc活性
50%。
正常IgG對嗜中性球顯示97%之Fc活性。不論使用那一種類型之霧化膜，霧化之IgG顯示Fc活性非常接近IgG對照組(Fc活性>90%)。因此，霧化之IgG能夠識別異種抗原(xenoantigen)並結合及活化PMN以及未經霧化之IgG。
比較不同脯胺酸調製劑(IgG、IgA、IgAM及SIgAM)霧化前和霧化後之Fc活性顯示出霧化過程中未損失功能(表9a和9b)。
在第二個分析中，藉由測量補體活化來評估Fc功能。將霧化之IgG和對照組IgG吸附在聚苯乙烯微球上，形成免疫複合物之模型。然後，將這些經包覆之微球與作為補體來源之人血清一起培育。所造成之補體活化係藉由FACS測量沉積在該微球上之被活化的C3片段來定量。以結合至微球之IgG的實際量數據計算這些數據來評估IgG之Fc部分的完整性。
因此，發現IgG之霧化不會影響IgG活化補體的能力。
霧化後之免疫球蛋白之生物性質的進一步定性係包含藉由ELISA分析抗原識別(諸如EBV、CMV、FSME、HB、HAV、HSV、VZV、腮腺炎、德國麻疹和麻疹)、及補體結合反應和受體結合試驗。尤其是，評估所有調製劑
(5-9)之呼吸道融合病毒(Respiratory syncytial virus)(RSV)和肺炎雙球菌多醣(Pneumococcus polysaccharide)(PCP)抗原識別。根據製造商之規程進行ELISA。結果呈現於表10a和10b中。檢測各多株免疫球蛋白之調製劑中之抗RSV和抗PCP抗原抗體。重要的是，不同調製劑對RSV和PCP抗原之識別未受霧化影響。
在細菌上直接測試抗原識別。在4℃下，將5×107CFU/mL之肺炎鏈球菌(Streptococcus pneumoniae)A66.1菌株在碳酸鹽緩衝液中塗覆在polysorb盤(NUNC)上一整夜。以PBS-Tween(0.05%)清洗後，在室溫下以2.5%FCS(在PBS中)對盤進行阻斷(block)1.5小時。以PBS-Tween(0.05%)清洗後，加入333μg/mL之調製劑(在阻斷緩衝液(blocking buffer)中稀釋)並在室溫下培育2小時。以PBS-Tween(0.05%)清洗後，使用二級抗體(山羊之抗人IgG/A/M-HRP(Novex)；1mg/ml，1：2’000在阻斷緩衝液中)在室溫下培育2小時。一旦以PBS-Tween(0.05%)清洗後，將TMB受質加入小孔中並藉由添加HCL(鹽酸)來中止催化。然後在盤分析器上讀取該盤之數值。結果呈現於第5圖中。
檢測每一調製劑(5-9)中之抗肺炎鏈球菌抗體。較高之O.D.表示IgAM和SIgAM顯示出較佳之抗肺炎鏈球菌抗體力價(titer)。重要的是，霧化之調製劑與未經霧化之對照組的比較顯示出霧化之調製劑在識別細菌方面並無差異。因此，霧化未影響該多株免疫球蛋白之細菌抗原識別能力。
聚合體免疫球蛋白在黏膜表面具有重要作用。免疫球蛋白參與防止細菌進入體內，此過程稱為免疫排阻(immune exclusion)。其涉及由免疫球蛋白識別細菌表面上之抗原及聚合體免疫球蛋白較佳之聚集細菌的能力。
為了評估霧化是否可能損害聚合體免疫球蛋白之功能，在極化之黏膜上皮細胞的體外感染模型中測試調製劑(5-9)。使用弗氏志賀氏菌(Shigella flexneri)作為感染因子，因已知其可感染腸黏膜上皮細胞，導致人類腹瀉。為此目的使用腸細胞單層。將細胞單層保持在未經處理(C-)、或者僅暴露於弗氏志賀氏菌(C+)或再加上對照組調製劑(-)或再加上霧化之調製劑(N)達14小時(第6圖)。由弗氏志賀氏菌造成之感染會引起上皮細胞分泌發炎細胞激素，諸如TNF-α、CXCL8及CCL3(第6A圖)。此外，感染導致膜完整性及緊密連接(tight junction)喪失，此可藉由測量相關之跨膜電阻(transepithelial electrical resistance)損失來評估(第
6B圖)。最後，藉由計算感染病灶的數目及測量感染區域來監測感染(第6C圖)。測量這些終點之詳細規程發表於專利申請案WO2013132052及Longet S.et al,J Biol Chem.2014 Aug 1；289(31)：21617-26中。
於此體外感染模型中，單體(monomeric)免疫球蛋白沒有保護作用(Longet S.et al,J Biol Chem.2014 Aug 1；289(31)：21617-26)。只有在脯胺酸中之IgAM和SIgAM可減少感染、發炎細胞激素分泌及保護膜的完整性(第6A、B、C圖；調製劑8和9)。重要的是，弗氏志賀氏菌和霧化之IgAM和SIgAM的免疫複合物降低弗氏志賀氏菌之感染性(infectivity)和細胞激素分泌的程度與弗氏志賀氏菌和未經霧化之IgAM和SIgAM所形成的免疫複合物一樣。霧化單體免疫球蛋白(第6圖，調製劑5-7)不會影響其在體外之活性。事實上，在此感染模型中未觀察到任何功能之獲得或喪失。
整體而言，由此發現霧化多株免疫球蛋白不會改變免疫球蛋白之抗原識別作用及Fc功能。
使用連接至流通室(flow pass chamber)之膜霧化器將實施例1和實施例3中所描述之組成物霧化並投予大鼠，其中，氣霧劑係在流通室中被散佈給動物。
在施予氣霧劑後的不同時間(0、1小時、6小時、12
小時和24小時)，將大鼠犧牲。使用肺的左葉進行支氣管肺泡灌洗(bronchioalveolar lavage)(BAL)。為了達到此目的，將氣管插管並以無菌PBS(2×5mL)灌洗肺兩次。將來自各自BAL之產物匯集並收集在無菌塑膠管中。將BAL樣本離心(在約4℃下，在1500×g離心10分鐘)並將BAL上清液等分在二支無菌試管中(約各5毫升)。將右葉分離出、固定並使用標準技術製備以用於組織學研究。然後採用免疫組織化學方法(immunohistochemistry)，以特異性二級抗體在該石蠟切片上評估Ig在肺中之分佈。對肺之特定部分進行研究(例如呼吸性細支氣管、肺泡管、肺泡囊和肺泡)。
藉由ELISA測量BAL中所存有之免疫球蛋白。在IgA檢測方面，在室溫下，以山羊之抗人IgA(Bethyl Laboratories；1/500，在塗覆緩衝液(1.59gNa2CO3、2.93g NaHCO3、1ml H2O，pH 9.6)中)塗覆分析盤(NUNC)1小時。以PBS-Tween清洗後，在小孔(well)中加入阻斷溶液(PBS，1%BSA)並在室溫下培育1小時。以PBS-Tween清洗阻斷緩衝液並將樣本分佈在分析盤中，在37℃下培育2小時。以PBS-Tween清洗後，在室溫下將山羊之抗人IgA-HRP(Bethyl Laboratories；1/8000，在稀釋緩衝液(低交叉反應緩衝液(low cross buffer)(Candor)，1%酪蛋白)中)加入小孔中1小時。以PBS-Tween清洗後，在室溫下將TMB受質加入小孔中15分鐘並加入終止溶液(stop solution)以終止催化。
在IgG檢測方面，在室溫下，以山羊之抗人IgG(Acris；在塗覆緩衝液(1.59gNa2CO3、2.93g NaHCO3、1ml H2O，pH 9.6)中之最終濃度為1.5μg/mL)塗覆分析盤(NUNC)2小時。以PBS-Tween清洗後，在小孔中加入阻斷溶液(PBS，1.6%BSA)並在室溫下培育1小時。以PBS-Tween清洗阻斷緩衝液並將樣本分佈在盤中，在室溫下培育2小時。以PBS-Tween清洗後，在室溫下將山羊之抗人IgG-HRP(Acris；在稀釋緩衝液(低交叉反應緩衝液(Candor)，1%酪蛋白)中之最終濃度為0.3μg/mL)加入小孔中1小時。以PBS-Tween清洗後，在室溫下將TMB受質加入小孔中15分鐘並加入終止溶液以終止催化。結果呈現於第7圖中。
在BAL中檢測到之最高量的免疫球蛋白係藉由氣霧劑施用調製劑5、7和8時(時間0小時)。該霧化之免疫球蛋白的量隨著時間的推移減少，在動力(kinetic)末了(24小時)檢測到較少量。重要的是，在霧化後24小時仍可在BAL中檢測到霧化之免疫球蛋白。
亦分析來自大鼠之血漿中所存在之霧化的免疫球蛋白。在霧化後24小時血漿中未檢測到任一IgA調製劑(IgA和IgAM)。然而，在大鼠接受該氣霧劑後24小時可在三隻大鼠之血漿中檢測到霧化之IgG(見表11)。
上文中我們已證明霧化不會影響免疫球蛋白之結構。然而，已知肺臟中之黏液層含有可能影響施用之免疫球蛋白之完整性的蛋白酶。為了補充從BAL獲取之ELISA結果，我們藉由SDS-PAGE分析該霧化之免疫球蛋白的完整性。SDS PAGE係依照標準規程進行或依專利申請案WO2013132052中之描述進行。在免疫點墨分析(mmunoblotting)方面，使用多株兔子抗體：a)兔子之抗人γ鏈(Dako，與山葵過氧化酶(horseradish peroxidase)(HRP)接合；稀釋1/1/10’000)，b)兔子之抗人α鏈(Dako，與山葵過氧化酶(HRP)接合：稀釋1/5’000)；c)兔子之抗人μ鏈(Dako，與山葵過氧化酶(HRP)接合；稀釋1/3’000)。所有培育係在環境溫度下，在含有5%奶粉和0.5% Tween之PBS中進行3小時。以PBS-Tween進行最終清洗後，藉由化學發光揭露在膜上之免疫檢測並數位式記錄在ImageQuant LAS 4000系統(GE Healthcare Lifesciences)中。來自還原凝膠之西方點墨分析(Western blot)結果顯示於第8圖中。
確證ELISA數據，在已接受霧化之IgG之大鼠的各BAL樣本中檢測IgG之γ鏈(第8圖；5，a)。在霧化後24小時可檢測到條帶(band)。在接受霧化之IgA的大鼠BAL樣本中，在遞送後之早期時間點可檢測到α鏈(7，b)，但6小時後變微弱。α鏈確實很難在霧化後24小時檢測到(第8圖；7，b)。在接受霧化之IgAM的大鼠中，各BAL樣本中α鏈之檢測結果均為陽性，24小時之信號較低。在相同之BAL樣本中，各樣本直到24小時可檢測到μ鏈(c)，雖然在此最後之時間點變得微弱。
亦將BAL樣本在非還原凝膠上檢測。未檢測到γ、α及μ鏈之片段。檢測到之免疫球蛋白為完整的。
總之，我們已證明該霧化之免疫球蛋白可有效地到達動物的肺部且這些免疫球蛋白在此環境中可保持完整24小時，即使其量傾向於隨著時間的推移減少
慢性鼻竇炎(CS)為導致生活品質顯著受損(Khalid AN,Quraishi SA,Kennedy DW.Long-term quality of life measures after functional endoscopic sinus surgery.Am J Rhinol 2004 May；18(3)：131-6)及大量醫療照護花費(Anand VK.Epidemiology and economic impact of rhinosinusitis.Ann Otol Rhinol Laryngol Suppl 2004 May；193：3-5.)之最常見的慢性感染狀況之一(在免疫缺陷患者和一般大眾中的盛行率為13%)。
目前之治療包括抗生素、長期類固醇及(重複)手術。然而，這些介入在高風險群(例如原發性抗體缺陷(primary antibody deficiency)、囊性纖維化)中之效力有限，具有高失敗率，且重複使用可能發展出抗生素之抗藥性。
為了預防或治療CS，將實施例1中所描述之組成物(較佳為IgA或聚合體IgA和IgM之混合物，可選擇性地輔以重組分泌成分)霧化並使用具有大混合室且能發射脈動氣流至目標的鼻腔鼻竇或副鼻竇之膜霧化器投予目標患者。目標患者為已知屬於高風險群(例如原發性抗體缺陷(primary antibody deficiency)、囊性纖維化)或具有反複發作之CS的患者。
在罹患CS之患者中，在外科切除鼻息肉及/或抗生素或類固醇治療之後開始施藥。患者霧化吸入2mL之液體組成物，該液體組成物包含IgG(10%)或IgA(50mg/mL)或聚合體IgA和IgM之混合物(50mg/mL)，較佳為與重組分泌成分結合之聚合體IgA和IgM(50mg/mL)，每天至少一次，為期8週。此相當於一個治療週期。
在預防性療法中，患者霧化吸入2mL之液體組成物，該液體組成物包含IgG(10%)或IgA(50mg/mL)或聚合體IgA和IgM之混合物(50mg/mL)，較佳為與重組分泌成分結合之聚合體IgA和IgM(50mg/mL)，每年進行2個治療週期。
在預防性治療之情況中，霧化之免疫球蛋白減少鼻竇炎發作之延久性(chronicity)。
當施用於CS患者時，霧化之免疫球蛋白可減少症狀，諸如鼻塞及流鼻水，面部壓迫感或疼痛，眼睛、臉頰和鼻子周圍之腫脹。
IgG替代療法可有效減少PID患者中之肺炎和嚴重感染的比率。然而，這些患者仍然每年每個患者經歷3至4次感染。此高感染率與發炎的組合指出IgG療法對感染之慢性副作用，諸如支氣管擴張、慢性腹瀉、自體免疫及淋巴組織增生病症的影響很小。
接受長期IgG替代治療之肺炎、支氣管擴張及敗血症與低IgM相關，而低IgA會使胃腸道感染率明顯增加(Oksenhendler E,Gerard L,Fieschi C,et al.Infections in 252 patients with common variable immunodeficiency.Clin Infect Dis 2008 May 15；46(10)：1547-54；Gregersen S,Aalokken TM,Mynarek G,et al.Development of pulmonary abnormalities in patients with common variable immunodeficiency：associations with clinical and immunologic factors.Ann Allergy Asthma Immunol 2010 Jun；104(6)：503-10；Quinti I,Soresina A,GuerraA,et al.Effectiveness of immunoglobulin replacement therapy on
clinical outcome in patients with primary antibody deficiencies：Results from a multicenter prospective cohort study.J Clin Immunol 2011 Mar 2.)，此再次指出IgA及/或IgM可能為至關重要之遺漏因素。
支氣管擴張患者易受綠膿桿菌(Pseudomonas aeruginosa)感染。X性聯無γ球蛋白血症(X-linked Agammaglobulinaemia)(XLA)為一種影響PID患者次族群的病症。其特點為成熟B淋巴細胞和特異性抗體之生成缺陷及血清中之免疫球蛋白濃度低。這些患者顯示出可能導致發展出支氣管擴張之慢性感染。
患有慢性下呼吸道感染之特定研究族群為已經歷肺部綠膿桿菌感染第一次發作的XLA患者。該治療之目標將為預防感染復發和長期預防支氣管擴張。對於此特殊之適應症可考慮IgA或混合之IgM/IgA產品。患者霧化吸入2mL之液體組成物，該液體組成物包含IgG(10%)或IgA(50mg/mL)或聚合體IgA和IgM之混合物(50mg/mL)，較佳為與重組分泌成分結合之聚合體IgA和IgM(50mg/mL)，每天至少一次，為期8週(=一個治療週期)。患者應每年接受2個治療週期。
效力參數被完善定義，包括感染復發率、發展出支氣管擴張之比率、引出之痰中的微生物量(microbial load)/發炎參數(inflammatory parameter)。
如先前實施例中所顯示，使用調查研究用之經修飾的eFlow技術霧化免疫球蛋白既不會損害該免疫球蛋白之結構亦不會損害其功能。為了達成將欲遞送之特定量的免疫球蛋白投至氣道(上及/或下)時之較短的霧化時間，較高濃度之免疫球蛋白為較佳者。已知高分子量之免疫球蛋白(150kD至1040kD)及高濃度之分子兩者(不論是單獨或聯合)均會影響該調製劑之黏度。黏度直接影響霧化之性能。
為了更清楚了解黏度如何影響霧化性能，在三種不同的裝置上測試幾種調製劑。使用調查研究用之eFlow霧化器(經修飾之第4型膜)、Omron Micro Air U22及Aerogen Aeroneb®Go。
調製劑描述於表12中。
依實施例1、2和3中之描述進行雷射繞射實驗。使用3個調查研究用之經修飾的eFlow霧化器(主動振動膜
及負壓)、3個Omron Micro Air U22(被動振動膜)及1個Aerogen Aeroneb®Go(主動振動膜)進行此研究。樣本以二重複(Aeroneb®Go)或三重複(調查研究用之經修飾的eFlow、Micro Air U22)進行測試。根據各別製造商之使用說明書使用Omron及Aerogen霧化器。所有調製劑係以隨機順序進行測試。結果呈現於表13和14中。
如表13和14中所描繪者，相同蛋白質(例如單體多株免疫球蛋白)之濃度增加與黏度增加有關(對範圍在5%至20%之IgG而言分別為1.75至14.52mPa*s)。在較大且較複雜之蛋白質，諸如聚合體免疫球蛋白(IgA及IgM)方面，黏度增加較單體免疫球蛋白更快。5%和9%之IgG顯示出黏度分別為1.75和2.65mPa*s，而濃度為5%和9%之聚合體IgA和IgM的調製劑顯示出黏度為3.88及15.87mPa*s。增加之黏度與總輸出率(TOR)減少相關聯。黏度增加時液滴尺寸係最低程度地降低。
以調查研究用之經修飾的eFlow霧化器(IM-eFlow)霧化濃度增加之多株IgG需直到濃度成為13%時才可行。在15%IgG方面，3個霧化器中有1個可以霧化IgG。20%之IgG亦可藉由3個霧化器中之1個霧化，但TOR將非常低(6mg/min)。Omron Micro Air U22不能霧化濃度高於7%之IgG的調製劑且具有非常低之TOR(160mg/min)及較大之液滴尺寸(>6μm；IM-eFlow<4μm)。Aerogen Aeroneb®Go可霧化7%和9%之調製劑但具有非常低之TOR(分別為117和20mg/min)。在7%和9%IgG方面，eFlow霧化器顯示高性能(例如TOR>550mg/min)。
以eFlow霧化器霧化IgA和IgM調製劑(例如5%和8%之IgAM)是可行的且具有良好的性能。9%IgAM被霧化時僅一次具有正常性能。Omron Micro Air U22無法霧化這些含有聚合體多株免疫球蛋白之調製劑。Omron和
Aerogen裝置無法從黏度高於3mPa*s之免疫球蛋白調製劑產生氣霧劑。
總括而言，本發明藉由霧化多株免疫球蛋白之組成物來產生氣霧劑的方法顯示出在霧化高度濃縮之單體和聚合體免疫球蛋白方面具有優於目前方法的性能。
Claims (17)
- 一種產生氣霧劑(aerosol)之方法，其包括下列步驟：(a)提供包含多株免疫球蛋白(Ig)之液態水性組成物，其中該Ig之濃度係在每毫升40至200mg之範圍內；(b)提供具有供填入組成物之貯存器的膜霧化器(membrane nebulizer)；以及(c)使用該霧化器將組成物霧化(nebulize)，以獲得氣霧劑。
- 如申請專利範圍第1項之方法，其中，該組成物中之Ig的濃度係在每毫升40至120mg之範圍內。
- 如申請專利範圍第1或2項之方法，其中，該組成物進一步包含安定劑。
- 如申請專利範圍第3項之方法，其中，該安定劑為脯胺酸。
- 如申請專利範圍第1或2項之方法，其中，該組成物進一步包含界面活性劑。
- 如申請專利範圍第4項之方法，其中，該組成物進一步包含界面活性劑。
- 如申請專利範圍第1或2項之方法，其中，該貯存器係與大氣隔離，從而使貯存器內之壓力在步驟(c)之前或步驟(c)期間降低。
- 如申請專利範圍第7項之方法，其中，該貯存器 係藉由設置在該貯存器(10)中之開口以對該開口提供氣密密封的密封元件(16)、及連接該密封元件(16)之可滑動元件(21)而與大氣隔離，該可滑動元件(21)與該密封元件(16)之連接方式係使得該可滑動元件(21)之移動能使該密封元件(16)的至少一部分(18)移動，從而在貯存器(10)中產生負壓。
- 如申請專利範圍第1或2項之方法，其中，該膜霧化器為振動膜霧化器。
- 如申請專利範圍第1或2項之方法，其中，該膜霧化器包含可振動膜(122)，該可振動膜(122)具有用於與流體接觸的第一側(124)及相對的第二側(125)，該膜具有多個在第一側到第二側之延伸方向(E)上穿透該膜之貫通孔(126)，流體係於該膜振動時通過貫通孔從第一側到達第二側以在第二側產生氣霧劑，各貫通孔(126)沿著其延伸方向(E)具有最小直徑(DS)、至多較該最小直徑大三倍之較大直徑(DL)，各貫通孔具有由貫通孔於延伸方向上的連續部分所界定的噴嘴部分(132)，該噴嘴部分(132)包含貫通孔之最小直徑並以該貫通孔之較大直徑為邊界，其特徵在於，各貫通孔(126)於延伸方向上的總長度對各該噴嘴部分(132)於延伸方向上的長度的比係至少為4。
- 如申請專利範圍第1或2項之方法，其中，該霧化器適合用於產生針對患者之下呼吸道的氣霧劑。
- 如申請專利範圍第1或2項之方法，其中，該霧 化器適合用於產生針對患者之上呼吸道的氣霧劑。
- 如申請專利範圍第1或2項之方法，其中，該霧化器為主動膜霧化器(active membrane nebulizer)。
- 如申請專利範圍第1或2項之方法，其中，該免疫球蛋白(Ig)為多株免疫球蛋白G(IgG)、多株免疫球蛋白A(IgA)及/或多株免疫球蛋白M(IgM)。
- 如申請專利範圍第1或2項之方法，其中，該所遞送之氣霧劑係含有至少50%之填入該霧化器貯存器之組成物中的Ig劑量。
- 如申請專利範圍第1或2項之方法，其中，該氣霧劑中之Ig的活性至少為填入該霧化器貯存器之組成物中的Ig之80%。
- 如申請專利範圍第1或2項之方法，其中，該液態水性組成物之輸出率為高於100mg/min。
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