TWI728628B

TWI728628B - 豬心臟型脂肪酸結合蛋白基因鑑別方法

Info

Publication number: TWI728628B
Application number: TW108147959A
Authority: TW
Inventors: 張秀鑾; 陳婉婷; 吳明哲; 朱家德
Original assignee: 張秀鑾
Priority date: 2019-12-27
Filing date: 2019-12-27
Publication date: 2021-05-21
Also published as: TW202124725A

Abstract

本發明係關於一種豬心臟型脂肪酸結合蛋白基因鑑別方法，所採用的技術是一種多重突變點拆離式聚合酶連鎖反應（Multiplexed Mutagenically Separated PCR），簡稱Multiplexed MS-PCR。本發明可以豬隻血液、精液或組織等含細胞來源物之萃取基因組DNA（Genomic DNA，縮寫為gDNA），針對位於豬第六號染色體上之心臟型脂肪酸結合蛋白基因5’端非轉錄序列(H-FABP-5’UTR-T1324C)及第2內含子點突變(H-FABP-in2-T1489C and H-FABP-in2-G1811C)單核苷酸多態性（Single Nucleotide Polymorphism, SNP），設計三組引子對應，配合參與反應之成分物，製備成聚合酶鏈鎖反應（Polymerase chain reaction, PCR）之反應綜合液，於容器內加熱變性進行聚合酶鏈鎖反應，此方法可免除限制酶分切步驟，且免除使用昂貴之限制酶，過程簡易而可以得到最佳的PCR反應條件，因此將PCR產物電泳呈相後，一次獲得三個點突變之最佳基因型判斷依據。

Description

豬心臟型脂肪酸結合蛋白基因鑑別方法

本發明係關於一種豬心臟型脂肪酸結合蛋白基因鑑別方法。

豬肉為人類日常生活不可或缺的重要動物性蛋白質來源之一，尤其在華人日常飲食中。消費者對於豬肉品質的喜好程度，顯著地影響肉類的產銷量。影響豬肉品質重要因素之一為豬隻豬肉肌間脂肪(Intramuscular Fat,IMF，下稱IMF)，該IMF經研究證實，其含量多寡會影響肉質柔嫩度與多汁性等特性。因此準確掌握IMF便能顯著篩選具優良肉質之豬隻，提升產銷量與品質，進而增加豬農收益。

研究證實，豬隻心臟型脂肪酸結合蛋白(Heartfatty acid-binding protein,H-FABP，以下稱H-FABP)基因，與IMF含量息息相關。H-FABP基因位於豬第六染色體上，且Gerbens等人在1999年的研究結果顯示，H-FABP基因型多態性能顯著影響杜洛克豬種之IMF含量，並於2014年Chen等人的報告指出，具有利H-FABP基因型組合(HH6)之商用三品種肉豬(LYD)有顯著高肌間脂肪含量(平均IMF%值達2.59%)；故可確立H-FABP基因為篩選高IMF含量之候選基因。

是知，目前常見對於確立豬隻H-FABP基因，主要之鑑別方法以H-FABP基因之5'端非轉錄序列(H-FABP-5'UTR-T1324C)及第2內含子(H-FABP-in2-T1489C and H-FABP-in2-G1811C)等三突變點作為基因輔助選拔的標記，並運用聚合酶鏈鎖反應(Polymerase chain reaction,PCR)限制片段長度多態性(Restriction Fragment Length Polymorphism,RFLP)之方法(下稱PCR-RFLP)，作為鑑定突變點基因型多態性之方法。

該PCR-RFLP係首先以聚合酶鏈鎖反應(PCR)擴增目標片段後，運用限制酶能辨識特定核苷酸序列之特性，以HaeⅢ、Msp I及Hif I等三種限制酶截切擴增片段，再透過瓊脂糖凝膠體電泳將不同長度的擴增片段分開，最後依據不同截切擴增片段於瓊脂糖凝膠上呈現不同的位置，達到基因型判定之目的。

此種運用PCR-RFLP之方法，雖然可達到其一定之功效，然而由於擴增片段的截切攸關基因型判定的關鍵因素，因此須運用單價較為高昂之限制酶酵素，且前述之鑑別方式操作相對較為耗時與繁瑣，因此仍有改善之空間。

鑑於先前技術之問題，本發明者認為應有一種可將豬心臟型脂肪酸結合蛋白基因三個突變點同時鑑別之方法，包括一種多重突變點拆離式聚合酶連鎖反應(Multiplexed MS-PCR，Multiplexed Mutagenically Separated PCR)。係選自豬隻血液、精液或組織等具細胞來源之物質，萃取基因組DNA(gDNA，Genomic DNA)，針對位於豬第六號染色體上之心臟脂肪酸結合蛋白基因5'端非轉錄序列(H-FABP-5'UTR-T1324C)及第2內含子點突變(H-FABP-in2-T1489C and H-FABP-in2-G1811C)單核苷酸多態性(Single Nucleotide Polymorphism,SNP)，設計三組引子對應，配合參與反應之成分物，製備成聚合酶鏈鎖反應(Polymerase chain reaction,PCR)之反應綜合液，於容器內加熱變性進行聚合酶鏈鎖反應，其後產物經由電泳圖即可判斷影響肉質的促進型交替基因(H、a、d)。

本發明藉由前述方法(Multiplexed MS-PCR)，可依據一次聚合酶鏈鎖反應(Polymerase chain reaction,PCR)產物的長度同時鑑別上述三個突變點之基因型。經由所設計之引子對與PCR反應條件，使得前述對應三組引子對在進行PCR檢測時，所增幅放大的產物能隨基因型不同而有不同長度，如此即可免除限制酶分切步驟所需人力與耗材，且免除使用昂貴之限制酶，過程簡易而可以得到最佳PCR反應條件，因此將PCR產物電泳呈相後，能獲得最佳的基因型判斷依據。

第一圖係本發明之方法流程圖。

第二圖係本發明之效果示意圖。

以下藉由圖式之配合，說明本發明之構造、特點以及實施例，俾使貴審查委員對本發明有更進一步之理解。

請參閱第一圖所示，本發明係關於一種豬心臟型脂肪酸結合蛋白基因鑑別方法，其步驟包括：

1.係選自豬隻血液、精液及組織其中一來源萃取基因組DNA(gDNA，Genomic DNA)，針對位於豬第六號染色體上之心臟型脂肪酸結合蛋白基因5'端非轉錄序列(H-FABP-5'UTR-T1324C)及第2內含子點突變(H-FABP-in2-T1489C and H-FABP-in2-G1811C)單核苷酸多態性(Single Nucleotide Polymorphism,SNP)；

2.對應該三點突變單核苷酸多態性，設計三組引子對之單股核苷酸序列為：對應H-FABP-5'UTR-T1324C，引子對之單股核苷酸序列為

HF1：5'-CCCAGCGGCTTCCTTCTCAGAAT-3'

HF2：5'-ACTCGCGGGCTCCGTGCCAACAGCGGCTTCCTTCTCATATC-3'

HR：5'-TCACGTGACGAGGCGTGGCGTA-3'

對應H-FABP-in2-T1489C，引子對之單股核苷酸序列為：

AF1：5'-GGACATCTACCCTCTCTCAGGTT-3'

AF2：5'-CAGCTTCCAAGGAGGAGGCCACATCTACCCTCTCTCACGAC-3'

AR：5'-TCGGGTCTGGTGAAAAGATACTAC-3'

對應H-FABP-in2-G1811C，引子對之單股核苷酸序列為：

DF1：5'-GCCAACAGTTCTATGGGATAC-3'

DF2：5'-GGGCAAGAAATCCAATTAAACCGCAACAGTTCTATGGCGTGG-3'

DR：5'-TACACCCTTATGATCACCTTCCTCATTCC-3'。

3.其中該聚合酶鏈鎖反應(Polymerase chain reaction,PCR)之反應綜合液包括：體積0.5μL基因組DNA；體積2.0μL dNTP；體積2.0μL，濃度2μM之PCR緩衝液；體積2.0μL，濃度1.5U,Biotools Taq DNA聚合酶；H-FABP-5'UTR-T1324C引子組-體積0.2μL，濃度10μM之HF1、體積0.2μL濃度1μM HF2及體積0.3μL濃度10μM HR；H-FABP-in2-T1489C引子組-體積1.7μL，濃度10μM之AF1、體積0.8μL，濃度10μM之AF2及體積2.0μL，濃度10μM之AF1；H-FABP-in2-G1811C引子組-體積0.3μL，濃度10μM之DF1、體積0.1μL，濃度10μM之DF2及體積0.2μL濃度10μM之DR；以上個別之體積誤差±5%，濃度誤差±5%，且其餘添加蒸餾水配置成總體積10~15μL之反應綜合液。

4.於以加熱變性進行聚合酶鏈鎖反應之溫度/時間較佳之實施例：

(一)、Multiplexed MS-PCR的基本擴增循環包括三步驟；(1)雙股DNA變性-90~94℃/5秒鐘以上，較佳為94℃/10秒鐘；(2)引子黏合-55~65℃/5秒鐘以上，較佳為65℃/10秒鐘，(3)延長作用-65~72℃/10秒鐘以上較佳為72℃/10秒鐘；以上述三步驟為1次循環，共需經20次以上(25次為佳)循環作用。

(二)、附加步驟：可在基本擴增循環增加前置步驟-預先變性，以高溫90~94℃/5秒鐘以上，較佳為94℃、1分30秒鐘；及後置步驟-最後延長作用，以65~72℃/10秒鐘以上，較佳為72℃以及2分鐘)，可顯著提升PCR反應效果。

5.將PCR產物電泳分離並加以染色呈相：豬心臟型脂肪酸結合蛋白基因5'端非轉錄序列點突變(H-FABP-5'UTR-T1324C,H-Locus)判別上，僅有短片段者(191 bp)為促進型，而僅有長片段者(209 bp)為抑制型，同時具有長和短兩個片段者為雜合型。第2內含子第1489點突變(H-FABP-in2-T1489C,A-Locus)判別上，僅有短片段者(146 bp)為促進型，而僅有長片段者(164 bp)為抑制型，同時具有長和短兩個片段者為雜合型。第2內含子第1811點突變(H-FABP-in2-G1811C,D-Locus)判別上，僅有長片段者(119 bp)為促進型，而僅有短片段者(98 bp)為抑制型，同時具有長和短兩個片段者為雜合型，基因組合型詳如表一。

6.可依據一次聚合酶鏈鎖反應(Polymerase chain reaction,PCR)產物的長度鑑別其基因型，包括所使用之引子對與PCR反應條件；前述九種引子在進行PCR檢測時，所增幅放大的產物能隨基因型不同而有不同長度。本發明經過數次的測試而得到最佳的PCR反應條件，如此不僅可免除限制酶分切步驟，且可將僅經由一次的PCR反應條件的PCR產物電泳呈相後，獲得最佳的基因型判斷依據。

本發明對於以H-FABP基因作為基因輔助選拔的標記，利用多樣、複合(Multiplexed)MS-PCR方法偵測子代H-FABP基因型及屠體肌肉內IMF，運用統計分析方法得到不同H-FABP基因型與IMF含量之關係，以第二圖研究結果顯示基因型HHaadd具有較高的IMF含量。

肉質基因分由Hh、Aa、Dd等三個檢測型來影響肉質，H-FABP基因型代號是兩個英文字母和一個數字；英文字母HH=高肉質基因型組合、HL=中肉質基因型組合、LL=低肉質基因型組合；數字由0至6，表示第六號染色體兩條染色體上有幾個影響肉質的促進型交替基因(H、a、d)；數字6為有6個促進型交替基因(HHaadd)，故歸類為HH6；數字3至5為有3、4或5個促進型交替基因，故歸類為HL3、HL4、HL5；數字0至2為有0、1或2個促進型交替基因，故歸類為LL0、LL1、LL2。

請參閱第二圖所示，上、下二圖分別顯示較短時間與較長時間，不同時間區間內所為之本發明之效果示意圖，其中該第一圖顯示，豬隻心臟型脂肪酸結合蛋白基因遺傳標記之檢測。其中M為DNA片段大小標記，第1道之樣品為H-Locus雜合型Hh(H-FABP-5'UTR-T1324C)，第2道之樣品為A-Locus雜合型Aa(H-FABP-in2-T1489C)，第3道之樣品為D-Locus雜合型Dd(H-FABP-in2-G1811C)，第4-10道之樣品基因組合型依序為LL0(hhAADD)、LL1(HhAADD)、LL2(HhAADd)、HL3(HhAaDd)、HL4(HHAAdd)、HL5(HHAadd)及HH6(HHaadd)。

本發明之優點：

本發明之檢測法分成單一突變點MS-PCR及多重突變點MS-PCR兩種，在與PCR-RFLP檢測法比較下，多重突變點MS-PCR不僅可降低約45%檢測成本，且可縮短24%檢測時間。

本發明檢測法比較

A表示以PCR-RFLP檢測模式分次對H-FABP-5'UTR-T1324C、H-FABP-in2-T1489C及H-FABP-in2-G1811C等三點突變做基因型判定。

B表示以多重突變點MS-PCR檢測模式對H-FABP-5'UTR-T1324C、H-FABP-in2-T1489C及H-FABP-in2-G1811C等三點突變做基因型判定。

綜上所述，本發明確實符合產業利用性，且未於申請前見於刊物或公開使用，亦未為公眾所知悉，且具有非顯而易知性，符合可專利之要件，爰依法提出專利申請。惟上述所陳，為本發明產業上一較佳實施例，舉凡依本發明申請專利範圍所作之均等變化，皆屬本案訴求標的之範疇。

<110> 張秀鑾

<120> 豬心臟型脂肪酸結合蛋白基因鑑別方法

<140> TW 108147959

<141> 2019-12-27

<160> 9

<210> 1

<211> 23

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> 引子

<400> 1

<210> 2

<211> 41

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> 引子

<400> 2

<210> 3

<211> 22

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> 引子

<400> 3

<210> 4

<211> 23

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> 引子

<400> 4

<210> 5

<211> 41

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> 引子

<400> 5

<210> 6

<211> 24

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> 引子

<400> 6

<210> 7

<211> 21

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> 引子

<400> 7

<210> 8

<211> 42

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> 引子

<400> 8

<210> 9

<211> 29

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> 引子

<400> 9

Claims

一種豬心臟型脂肪酸結合蛋白基因鑑別方法，包括一種多重突變點拆離式聚合酶連鎖反應(Multiplexed MS-PCR，Multiplexed Mutagenically Separated PCR)，係選自豬隻血液、精液及組織其中一來源萃取基因組DNA(gDNA，Genomic DNA)，針對位於豬第六號染色體上之心臟脂肪酸結合蛋白基因5'端非轉錄序列(H-FABP-5'UTR-T1324C)及第2內含子點突變(H-FABP-in2-T1489C and H-FABP-in2-G1811C)單核苷酸多態性(Single Nucleotide Polymorphism,SNP)，設計三組引子對，後形成聚合酶鏈鎖反應(Polymerase chain reaction,PCR)綜合液，並對該聚合酶鏈鎖反應綜合液加熱變性進行聚合酶鏈鎖反應，其後產物經由電泳圖即可判斷影響肉質的促進型交替基因(H、a、d)，其中對應該三點突變所設計之引子對單股核苷酸序列為對應H-FABP-5'UTR-T1324C，引子對單股核苷酸序列為：HF1為SEQ ID NO：1 HF2為SEQ ID NO：2 HR為SEQ ID NO：3；對應H-FABP-in2-T1489C，引子對單股核苷酸序列為：AF1為SEQ ID NO：4 AF2為SEQ ID NO：5 AR為SEQ ID NO：6；對應H-FABP-in2-G1811C，引子對單股核苷酸序列為：DF1為SEQ ID NO：7 DF2為SEQ ID NO：8 DR為SEQ ID NO：9。
如申請專利範圍第1項所述之豬心臟型脂肪酸結合蛋白基因鑑別方法，其中該聚合酶鏈鎖反應(Polymerase chain reaction,PCR)之反應綜合液包括：體積0.5μL基因組DNA；體積2.0μL dNTP；體積2.0μL，濃度2μM之PCR緩衝液；體積2.0μL，濃度1.5U,Biotools Taq DNA聚合酶；H-FABP-5'UTR-T1324C引子組-體積0.2μL，濃度10μM之HF1、體積0.2μL濃度1μM HF2及體積0.3μL濃度10μM HR；H-FABP-in2-T1489C引子組-體積1.7μL，濃度10μM之AF1、體積0.8μL，濃度10μM之AF2及體積2.0μL，濃度10μM之AF1；H-FABP-in2-G1811C引子組-體積0.3μL，濃度10μM之DF1、體積0.1μL，濃度10μM之DF2及體積0.2μL濃度10μM之DR；以上個別之體積誤差±5%，濃度誤差±5%，且其餘添加蒸餾水配置成總體積10~15μL之反應綜合液。
如申請專利範圍第1項所述之豬心臟型脂肪酸結合蛋白基因鑑別方法，其中該以加熱變性進行聚合酶鏈鎖反應，分別於multiplexed MS-PCR的基本擴增循環中分別步驟之分別反應條件；(1)雙股DNA變性為90至94℃，並持續5秒鐘以上；(2)引子黏合為55~65℃，並持續5秒鐘以上；(3)延長作用為65~72℃，並持續10秒鐘以上；以上述三步驟為1次循環，經複數循環，形成基本擴增循環步驟。
如申請專利範圍第3項所述之豬心臟型脂肪酸結合蛋白基因鑑別方法，其中該基本擴增循環步驟之前，進行一預先變性之前置步驟，條件為：90~至94℃，持續5秒鐘以上。
如申請專利範圍第3項所述之豬心臟型脂肪酸結合蛋白基因鑑別方法，其中該基本擴增循環步驟之後，進行後置步驟以形成一延長作用，條件為：65至72℃，持續5秒鐘以上。
如申請專利範圍第1項所述之豬心臟型脂肪酸結合蛋白基因鑑別方法，其中該dNTP包括濃度各2μM的dATP,dCTP,dGTP and dTTP。