TWI711468B

TWI711468B - 苧麻萃取物用於製備保護細胞與美白抗皺組合物之用途

Info

Publication number: TWI711468B
Application number: TW107106824A
Authority: TW
Inventors: 梁家華; 良鵬曾; 陳品儒; 陳依筠
Original assignee: 嘉藥學校財團法人嘉南藥理大學
Priority date: 2018-03-01
Filing date: 2018-03-01
Publication date: 2020-12-01
Also published as: TW201936170A

Abstract

本發明有關於一種苧麻(Boehmeria nivea)萃取物用於製備保護細胞美白抗皺組合物之用途，其係將一有效劑量之苧麻萃取物投予至一所需個體，以降低細胞黑色素含量與抑制玻尿酸分解，其中苧麻萃取物係利用水溶液萃取而得，藉此，苧麻萃取物可用於製備具美白抗皺功效之化妝保養組成物或醫藥組合物。

Description

苧麻萃取物用於製備保護細胞與美白抗皺組合物之用途

本發明係有關於一種苧麻(Boehmeria nivea)萃取物用於製備保護細胞與美白抗皺組合物之用途。

追求皮膚白皙為現今許多人的保養目標，此外在皮膚色素沉澱的相關疾病中，有效的降低皮膚黑色素含量亦為最終的治療目標。目前使用較多的美白成分包含維生素C及其衍生物、對苯二酚(Hydroquinone)、杜鵑花酸(Acelaic acid)、熊果素(Arbutin)、傳明酸(Tranexamic acid)、鞣花酸(Ellagic acid)以及麴酸(Kojic acid)等等；雖然這些成分具有良好的美白效果，但是若使用不當反而會對皮膚造成傷害，例如對苯二酚具有細胞毒性會造成皮膚炎甚至引起褚色症(ochronosis)，杜鵑花酸可能造成皮膚紅腫、灼熱，麴酸亦有引起皮膚敏感之風險；因此，研發具有低細胞毒性以及美白功效優秀之物質或成分仍為相關產業積極開發的重點。此外，若皮膚中的玻尿酸或膠原蛋白流失，亦會導致皮膚細紋的產生，因此研發降低皺紋產生之保養組合物亦相當受到重視。

苧麻(Boehmeria nivea)又被稱為野苧麻、青麻或白麻，以往主要作為紡織衣料的原料來源，苧麻纖維可用於織布、編織繩索或背帶等製品；此外，苧麻亦可作為藥用植物，其植物的各部位，包含根、根莖、帶葉嫩莖、葉或花皆可入藥；其主要功效包含清熱涼血、解毒利尿等等。中華民國專利第TW I527587(B)號專利係將苧麻屬之植物萃取物用於製備治療肝臟纖維化藥物之用途，苧麻屬植物可為苧麻或山苧麻，其萃取物可以改善受試者的肝臟功能。但是，關於苧麻的其他功效所知仍然甚少。

今，發明人鑑於現有苧麻對於美白之影響仍為未知，於是乃一本孜孜不倦之精神，並藉由其豐富專業知識及多年之實務經驗所輔佐，據此研創出本發明。

本發明主要目的為提供一種苧麻(Boehmeria nivea)萃取物用於製備美白抗皺組合物之用途，尤其係指一種降低細胞黑色素含量與抑制玻尿酸流失之低細胞毒性的苧麻萃取物。

為了達到上述實施目的，本發明一種苧麻萃取物用於製備保護細胞與美白抗皺組合物之用途，其係將一有效劑量之苧麻萃取物投予至一所需個體，以降低細胞黑色素含量與抑制玻尿酸分解，其中苧麻萃取物係利用一水溶液萃取而得。

於本發明之一實施例中，苧麻萃取物進一步保護細胞免於紫外線傷害。

於本發明之一實施例中，苧麻萃取物抑制玻尿酸酶(Hyaluronidase)活性。

於本發明之一實施例中，苧麻萃取物之有效劑量係為100~1000μg/mL。

於本發明之一實施例中，苧麻萃取物之有效劑量係為1000μg/mL。

藉此，本發明之苧麻萃取物可進一步添加於化妝保養組合物或醫藥組合物中，以達到美白之功效。

第一圖：苧麻萃取物細胞毒性分析圖。

第二圖：苧麻萃取物保護細胞免於紫外線傷害分析圖。

第三(A)圖：苧麻萃取物保護DNA免於紫外線傷害電泳膠分析圖。

第三(B)圖：苧麻萃取物保護DNA免於紫外線傷害定量分析圖

第四圖：苧麻萃取物抑制酪胺酸酶活性分析圖。

第五圖：苧麻萃取物降低細胞內黑色素含量分析圖。

第六(A)圖：苧麻萃取物抑制玻尿酸酶活性電泳膠分析圖。

第六(B)圖：苧麻萃取物抑制玻尿酸酶活性定量分析圖。

本發明之目的及其結構功能上的優點，將依據以下圖面所示之結構，配合具體實施例予以說明，俾使審查委員能對本發明有更深入且具體之瞭解。

本發明一種苧麻(Boehmeria nivea)萃取物用於製備保護細胞與與美白抗皺組合物之用途，其係將一有效劑量例如為100~1000μg/mL之苧麻萃取物投予至一所需個體，以降低細胞黑色素含量並抑制玻尿酸分解，其中苧麻萃取物係利用一水溶液萃取而得；此外，苧麻萃取物可進一步保護細胞免於紫外線傷害；藉此，本發明之苧麻萃取物可作為美白或皮膚保溼抗皺、抗老化之化妝保養組合物或醫藥組合物。

此外，藉由下述具體實施例，可進一步證明本發明可實際應用之範圍，但不意欲以任何形式限制本發明之範圍。

實施例一：苧麻萃取物

(1)苧麻萃取物製備

將苧麻的地上部(aerial part)、莖部(stem)以及葉片(leaves)分別磨成粉末，以熱水或是95%乙醇溶液中3天，以獲得各部位之苧麻水萃取液或是苧麻乙醇萃取液；再將苧麻水萃取液或是苧麻乙醇萃取液利用真空乾燥機進行凍乾步驟，以獲得各部位之苧麻水萃取物或是苧麻乙醇萃取物；將獲得之苧麻萃取物儲存於4℃，進行試驗之前，再將各萃取物溶於二甲基亞碸(Dimethyl sulfoxide，簡稱DMSO)溶液以供後續使用。

其中苧麻之地上部(aerial part)係只苧麻生長於土壤以上之部位，包含莖部與葉部；各萃取物之簡稱與產率請參見表一

(2)苧麻萃取物總酚含量與總黃酮含量測定

配置沒食子酸(gallic acid，GA)標準液，並取50μL GA標準液與250μL的10倍稀釋酚類試劑(10-fold diluted，Folin-Ciocalteu’s phenol reagent)混合，室溫靜置5分鐘；加入200μL碳酸鈉溶液(7.5% w/v Na₂CO₃)及500μL去離子水，避光，於室溫作用1小時；測量GA標準液於波長760nm之吸光值且繪製標準曲線。將待測樣品以上述方式量測其波長760nm吸光值，再與標準曲線比對換算，以獲得待測樣品的總酚含量；此檢測結果係代表1克待測物與多少毫克之沒食子酸具有相同功效，且以「mg-GA/g」單位表示之。

配置芸香苷(rutin)標準液，並取37μL芸香苷標準液與490μL去離子水、3μL亞硝酸鈉溶液(5% w/v NaNO₂)混合並作用6分鐘；加入30μL之10%三氯化鋁(AlCl₃)，反應6分鐘；加入400μL之4%氫氧化鈉(NaOH)溶液與40μL去離子水，混合均勻並靜置15分鐘；測量芸香苷標準液之波長510nm之吸光值且繪製標準曲線。將待測樣品以同樣方式測量波長510nm吸光值，並與標準曲線比對換算，以獲得待測樣品的總黃酮含量；此檢測結果係代表1克待測物與多少毫克之芸香苷具有相同功效，且以「mg-rutin/g」單位表示之。

請參見表二，為苧麻各萃取物的的總酚與總黃酮含量，其中BNW與BNE的總酚含量與總黃酮含量較高。

實施例二：苧麻萃取物之美白、細胞保護與抑制玻尿酸酶活性之功效

(1)苧麻萃取物之細胞毒性。

本試驗以不同劑量之苧麻萃取物處理人類皮膚角質化細胞株，HaCaT細胞，並於作用24小時之後評估苧麻萃取物之細胞毒性。實驗流程簡述如下：將HaCaT細胞培養於96孔盤，培養隔夜後，加入100~1000μg/mL之BNW或BNE，共同作用24小時之後，再以MTT細胞存活度測試，測量HaCaT細胞的存活程度；此試驗中以純水作為對照組(C)，並將其細胞存活率定義為100%。

請參見第一圖，BNW對於細胞毒性相當低，即使在使用劑量為1000μg/mL之狀況下，細胞存活率仍高於90%；BNE於使用劑量為100~500μg/mL時，細胞存活率皆大於90%，但在使用劑量為1000μg/mL的情形下，細胞存活率僅有30~40%。

(2)苧麻萃取物保護細胞免於紫外線傷害

將HaCaT細胞株隔夜培養後，置入UV箱，使細胞承受累積總能量為20mJ/cm²之紫外光，並將培養液更換為無血清培養液，並加入不同劑量之BNW，共同培養4小時之後，再以MTT細胞存活度測試，測量HaCaT細胞的存活程度；此試驗中以不照射UV之組別作為存活度100%之對照組(C)。

請參見第二圖，UVB照射確實會造成細胞死亡，存活之細胞數量僅為對照組(Control)存活細胞之60%左右，然而處理BNW之組別，其細胞存活度與UVB組相比有顯著提高之趨勢，且具有劑量依存現象，處理1000μg/mL BNW之組別，細胞存活度可回升至對照組的80~90%。

另，以質體DNA實驗系統，觀察苧麻萃取物於UV造成之DNA損傷之影響，實驗方法簡述如下：將pUC119質體、H₂O₂、FeSO₄以及不同濃度的BNW混合，並以20J/m²之UVB照射，於37℃作用1小時之後，再將混合物以0.8%洋菜膠進行電泳；電泳30分鐘後再將洋菜膠進行影像擷取並以定量軟體(Quantity One software and the Gel Doc 2000 system(Bio-Rad Laboratories，CA))進行分析，比較S-form質體(SC)與L-form質體(LC)的百分比；每組試驗重複三次。

請參閱第三(A)圖，質體DNA沒有任何處理下，其S-form(SC)的DNA量明顯多於L-form(LC)的DNA量，但是以UV+H₂O₂處理明顯增加L-form(LC)的DNA量，且S-form(SC)的DNA幾乎偵測不到；但加入不同濃度的BNW後，S-form(SC)的DNA量開始增加；圖中之OC代表O-form，為僅有單股DNA斷裂一缺口(opened form)，其損傷程度低於L-form(LC)之DNA。第三(B)圖為電泳膠片的定量結果，以完全無處理之對照組(C)的S-form DNA(SC)量作為100%，與其他組別進行比較；根據第三(B)圖，以UV+H₂O₂之組別幾乎偵測不到S-form(SC)的DNA，而加入苧麻BNW者能提高S-form(SC)的DNA量，且具有劑量依存的現象。

(3)苧麻萃取物抑制黑色素形成

將20μL不同濃度之BNW以及維他命C(AA)分別加入96孔盤中，加入25μL酪胺酸酶(25unit)混合後，於室溫下靜置10分鐘，再加入155μL之2.5mM L-tyrosine或L-多巴(L-Dopa)溶液，作用1小時之後取出並測量波長450nm之吸光值；以維生素C(AA)視為酪胺酸酶抑制率為100%之正對照組，並將其他組別與維生素C(AA)組進行比較。請參閱第四圖，BNW具有約30~50%之酪胺酸酶抑制率，且具有劑量依存現象。

接著以黑色素瘤細胞株B16F10細胞做為實驗模型，並以α-MSH(α-melanocyte stimulating hormone)刺激細胞產生黑色素，再同時給予細胞苧BNW，以觀察細胞黑色素含量之變化。試驗方法簡述如下：將B16F10細胞培養於培養盤中，並加入100nM之α-MSH，隔夜培養；加入不同劑量之BNW，作用72小時；移除細胞上清液並以1X PBS緩衝液清洗後，吸乾1X PBS緩衝液；加入1N氫氧化鈉溶液，於60℃作用1小時，以使細胞內之黑色素溶出；取細胞溶出液，測量波長405nm之吸光值(簡稱OD₄₀₅)，以計算樣品中之黑色素含量；本試驗中以無處理之組別作為對照組(C)，並將其細胞內黑色素含量定義為100%，α-MSH組別為黑色素生成之正對照組，而50μg/mL之熊果素(Arbutin)做為降低黑色素含量之正對照組；細胞內黑色素含量之計算公如下： [(待測物OD₄₀₅-負對照組OD₄₀₅)/負對照組OD₄₀₅] X 100%

請參見第五圖，處理α-MSH之組別會使細胞內黑色素含量提高至對照組之120%左右。然而處理BNW之組別，細胞內黑色素含量有顯著下降的趨勢，且有劑量依存現象，於使用劑量為1000μg/mL時，細胞內黑色素可降低至對照組的60%左右。

(4)苧麻萃取物之玻尿酸酶(Hyaluronidase)抑制能力

於製作十二烷基硫酸鈉聚丙醯烯胺凝膠(SDS-PAGE)時加入玻尿酸(簡稱HA)，若電泳的樣品中含有玻尿酸酶(Hyaluronidase，簡稱HAase)時，電泳後將SDS-PAGE染色會呈現一透明條帶，表示SDS-PAGE所含有的HA被分解而無法染上染劑；若樣品中不含有HAase或是HAase失去活性，則染色後的SDS-PAGE不會呈現透明條帶。

本實驗方法簡述如下：(A)製備SDS-PAGE膠片，下膠為含有1.7mL 0.1% HA之10% SDS PAGE，上膠為5% SDS-PAGE；(B)準備樣品：樣品共三組，分別為：沒食子酸酯化兒茶素(Epigallocatechin gallate，EGCG)；pH5.7氯化鈉-甲酸鈉緩衝液組(Buffer組)；以及BNW。將樣品與HAase混合，於37℃作用18小時，再進行電泳；電泳結束後以考馬斯亮藍R250(Coomassie Brilliant Blue R250)進行染色以觀察膠片透明條待的產生情形。

請參閱第六(A)圖，Buffer組可觀察到明顯的透明條帶產生，但EGCG組並無觀察到明顯的透明條帶，表示EGCG確實可抑制HAase活性；BNW組雖有觀察到透明條帶，但透明條帶的面積低於Buffer組，表示BNW仍具有抑制HAase活性之功效；第六(B)圖為電泳凝膠片定量分析圖，EGCG具有約80%玻尿酸酶活性抑制能力，而1000μg/mL之BNW具有約50%玻尿酸酶活性抑制能力。

由上述之實施說明可知，本發明與現有技術相較之下，本發明具有以下優點：

本發明之苧麻萃取物具有抑制黑色素形成以及抑制玻尿酸分解之功效，能用於製備具有美白抗皺功效之組合物。

此外，本發明之苧麻萃取物，係萃取自天然之苧麻材料，細胞毒性低，且能進一步保護細胞免於紫外線傷害，以提供一種天然來源、可用以製作安全性高化妝保養組合物或醫藥組合物之材料。

綜上所述，本發明之苧麻萃取物用於製備美白抗皺組合物之用途，的確能藉由上述所揭露之實施例，達到所預期之使用功效，且本發明亦未曾公開於申請前，誠已完全符合專利法之規定與要求。爰依法提出發明專利之申請，懇請惠予審查，並賜准專利，則實感德便。

惟，上述所揭之圖示及說明，僅為本發明之較佳實施例，非為限定本發明之保護範圍；大凡熟悉該項技藝之人士，其所依本發明之特徵範疇，所作之其它等效變化或修飾，皆應視為不脫離本發明之設計範疇。

Claims

一種苧麻(Boehmeria nivea)地上部熱水萃取物用於製備保護皮膚細胞免於紫外線傷害、降低細胞黑色素含量以及抑制玻尿酸酶(Hyaluronidase)活性組合物之用途，係將一有效劑量之苧麻地上部熱水萃取物投予至一所需個體，以降低紫外線誘發之DNA斷裂與細胞死亡、抑制玻尿酸分解以及抑制酪胺酸酶活性；其中該有效劑量為1000μg/mL之下，皮膚細胞的24小時存活率高於90%；其中該苧麻地上部熱水萃取物的製備方法包括：將苧麻的地上部磨成粉末，該地上部包含莖部與葉部；以及於熱水中浸泡3天，以獲得一苧麻地上部熱水萃取液。
一種苧麻(Boehmeria nivea)地上部熱水萃取物用於製備保護皮膚細胞免於紫外線傷害、降低細胞黑色素含量與抑制玻尿酸酶(Hyaluronidase)活性組合物之用途，係將一有效劑量之苧麻地上部熱水萃取物投予至一所需個體，以降低紫外線誘發之DNA斷裂與細胞死亡、，抑制酪胺酸酶活性以及抑制玻尿酸分解；其中該有效劑量為1000μg/mL之下，皮膚細胞的24小時存活率高於90%；其中該苧麻地上部熱水萃取物的製備方法由以下步驟所組成：將苧麻的地上部磨成粉末，該地上部包含莖部與葉部；於熱水中浸泡3天，以獲得一苧麻地上部熱水萃取液；以及利用真空乾燥機對該苧麻地上部熱水萃取液進行凍乾，以獲得該苧麻地上部熱水萃取物。
如申請專利範圍第1或2項所述之用途，其中該有效劑量係為100~1000μg/mL。
如申請專利範圍第3項所述之用途，其中該有效劑量係為1000μg/mL。