TWI698449B - 膜透過性之於側鏈鍵具肽鏈之高分子化合物 - Google Patents

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Abstract

本發明之高分子化合物於側鏈具有通式(1)或通式(2)所表示之基。
Figure 105105990-A0202-11-0001-1
(式中，X1表示中性胺基酸或ω-胺基烷酸之殘基，X2表示膜透過性肽之殘基，X3表示羥基、胺基、碳數1~4之烷氧基或苄氧基，a表示1~50之數)
Figure 105105990-A0202-11-0001-2
(式中，X4表示中性胺基酸或ω-胺基烷酸之殘基，X5表示膜透過性肽之殘基，X6表示氫原子、碳數1~6之烷基、苄基、碳數1~6之醯基、芳基磺醯基或氧基羰基，b表示1~50之數)

Description

膜透過性之於側鏈鍵具肽鏈之高分子化合物
本發明係關於一種將低膜透過性化合物導入至細胞內或黏膜內之情形時有用之高分子化合物。
近年來，進行有藉由將合成肽或蛋白質、進而DNA(Deoxyribonucleic acid，脫氧核糖核酸)或糖導入至細胞內，調節細胞內之蛋白質相互作用，並控制細胞內資訊傳遞或轉錄等而究明其等之功能或誘發特殊之功能之嘗試。利用此種方法，可期待迄今為止視為謎團之遺傳資訊之究明或病原之究明或者其治療方法之開發。又，因ES細胞(Embryonic Stem Cell，胚胎幹細胞)或iPS細胞(Induced Pluripotent Stem Cell，誘導性多能幹細胞)之開發而利用核酸或蛋白質控制細胞功能之技術之重要性逐漸增加。
一般而言，由於多肽、核酸、糖等水溶性高分子量物質具有較高之親水性，故而難以通過細胞膜。因此，作為將該等導入至細胞內之方法，已知有顯微注射法、電穿孔法、磷酸鈣法、脂轉染法、病毒載體法、膜透過性肽法等。
其中，膜透過性肽法係利用膜透過性肽誘發細胞之巨胞飲作用(macropinocytosis)之方法。作為膜透過性肽法，已知有使欲導入至細胞之目標化合物與膜透過性肽共價鍵結而導入之方法(例如參照專利文獻1、2)或使膜透過性之於側鏈具肽之高分子化合物與欲導入至細胞之目標化合物共存並僅導入目標化合物之方法(例如參照專利文獻3 ~4)。使目標化合物與膜透過性肽共價鍵結而導入之方法對細胞之損害較少，但需要複雜之預處理。另一方面，使用膜透過性之於側鏈具肽之高分子化合物之方法雖簡便，但先前已知之膜透過性之於側鏈具肽之高分子化合物存在由於水溶性高分子量物質之導入效率不充分，且亦具有較弱之細胞毒性，故而使用濃度受到限制之情形，於提高目標化合物之導入效率之情形時成為問題。
又，亦提出有將膜透過性之於側鏈具肽之高分子應用於藥劑之自上皮之吸收促進劑(例如參照專利文獻5)，但為了獲得充分之吸收促進效果，必須以高濃度使用，於實際使用化之情形時存在對黏膜之刺激性之顧慮。
[先前技術文獻] [專利文獻]
專利文獻1：US2003/229202A1
專利文獻2：日本專利特開2005-052083號公報
專利文獻3：US2010/113559A1
專利文獻4：日本專利特開2011-229495號公報
專利文獻5：日本專利特開2010-100781號公報
本發明係鑒於以上情況而完成者，目的在於提供一種能以簡便之方法將核酸、蛋白質等水溶性高分子量物質或藥劑以較高之效率導入至細胞內或黏膜內之高分子化合物及使用該高分子化合物之導入方法。
本發明者等人發現，藉由使用膜透過性之於側鏈具有含有肽之特定之基之高分子化合物，可將核酸、蛋白質等水溶性高分子量物質 或藥劑容易地導入至細胞內或黏膜內，從而完成了本發明。
即，本發明提供一種於側鏈具有下述通式(1)或下述通式(2)所表示之基之高分子化合物。
Figure 105105990-A0202-12-0003-4
(式中，X1表示自中性胺基酸或ω-胺基烷酸去除末端胺基及末端羧基後之殘基，X2表示自膜透過性肽去除末端胺基及末端羧基後之殘基，X3表示羥基、胺基、碳數1~4之烷氧基或苄氧基，a表示1~50之數)
Figure 105105990-A0202-12-0003-5
(式中，X4表示自中性胺基酸或ω-胺基烷酸去除末端胺基及末端羧基後之殘基，X5表示自膜透過性肽去除末端胺基及末端羧基後之殘基，X6表示氫原子、碳數1~6之烷基、苄基、碳數1~6之醯基、芳基磺醯基或氧基羰基，b表示1~50之數)
又，本發明提供一種用以將藥劑或水溶性高分子化合物等低膜透過性化合物導入至黏膜內或細胞內並且包含上述高分子化合物之導入劑。
又，本發明提供一種使用上述導入劑之用以將低膜透過性化合物導入至細胞內或黏膜內之方法。
根據本發明，於側鏈具有通式(1)或通式(2)所表示之基之高分子化合物即便不進行複雜之預處理，亦可將低膜透過性化合物以較高之效率導入至細胞內或黏膜內。
以下，對本發明之實施形態之一例進行說明，但本發明並不限定於以下實施形態。再者，於本發明中，所謂低膜透過性化合物，意指生物利用能(bioavailability)較低之化合物，具體而言，意指生物利用率(extent of bioavailability)為50%以下之化合物。生物利用率可利用以下之式算出。
生物利用率(%)=100×(藉由經口投予到達至血液中之量)/(藉由靜脈投予到達至血液中之量)
此處所言之「到達至血液中之量」係作為由血中濃度與橫軸(時間軸)所包圍之部分之面積(藥物血中濃度-時間曲線下面積：AUC)而求出。
本發明之高分子化合物及使用其之本發明之導入劑(以下亦將兩者統稱為本發明之高分子化合物)具有膜透過性肽殘基，可將低膜透過性化合物高效率地組入至細胞。認為將膜透過性肽組入至細胞之機構通常係膜透過性肽誘發細胞之巨胞飲作用而組入，於周圍存在低膜透過性化合物之情形時，該等低膜透過性化合物與膜透過性肽一併被組入。於本發明之高分子化合物中，利用膜透過性肽殘基而於細胞之複數個部位誘發巨胞飲作用，但本發明之高分子化合物為巨大分子，又，細胞亦難以將本發明之高分子化合物之1分子自複數個部位組入。因此，於本發明之高分子化合物之周圍存在低膜透過性化合物之情形時，利用藉由本發明之高分子化合物誘發巨胞飲作用之細胞而低膜透過性化合物偶發性且持續地被組入。因此，認為未必需要膜透過性肽殘基與低膜透過性化合物之間之相互作用，只要使將本發明之高分子化合物與低膜透過性化合物混合而成者接觸細胞或黏膜，則可將低膜透過性化合物導入至細胞內或黏膜內。
本發明之高分子化合物係於側鏈具有通式(1)或通式(2)所表示之基之接枝型之高分子化合物。於本發明中，將本發明之高分子化合物之主鏈部分稱為主鏈高分子。以下，對本發明之高分子化合物之構造詳細地進行說明。
[通式(1)所表示之基]
於通式(1)中，X1表示自中性胺基酸或ω-胺基烷酸去除末端胺基及末端羧基後之殘基，a表示1~50之數。作為中性胺基酸，例如可列舉：丙胺酸、天冬醯胺、半胱胺酸、麩醯胺、甘胺酸、異白胺酸、白胺酸、甲硫胺酸、苯丙胺酸、脯胺酸、絲胺酸、蘇胺酸、色胺酸、酪胺酸、纈胺酸、羥基脯胺酸等；作為ω-胺基烷酸，可列舉：3-胺基丙酸、4-胺基丁酸、5-胺基戊酸、6-胺基己酸、7-胺基庚酸、8-胺基辛酸、9-胺基壬酸、10-胺基癸酸、11-胺基十一酸等。作為X1所應用之中性胺基酸，就提高低膜透過性化合物之導入效率之方面而言，較佳為甘胺酸、丙胺酸、纈胺酸、異白胺酸、白胺酸、絲胺酸、蘇胺酸、苯丙胺酸，進而較佳為甘胺酸、丙胺酸、絲胺酸，最佳為甘胺酸。a較佳為1~30之數，進而較佳為1~20之數，最佳為1~10之數。於a為2~50之數之情形時，X1可為1種中性胺基酸殘基或ω-胺基烷酸殘基，亦可為自該等殘基中選擇之2種以上之組合。
於通式(1)中，X2表示自膜透過性肽去除末端胺基及末端羧基後之殘基。本發明之高分子化合物之膜透過性肽殘基可根據細胞或黏膜、欲導入之低膜透過性化合物適當選擇，構成膜透過性肽殘基之胺基酸之至少1種較佳為鹼性胺基酸。又，鹼性胺基酸可為L體或D體之任一者，可根據細胞或黏膜、欲導入之低膜透過性化合物適當選擇。
作為鹼性胺基酸，可列舉精胺酸、鳥胺酸、離胺酸、羥基離胺酸、組胺酸等，其中，較佳為含胍基之胺基酸，進而較佳為精胺酸。膜透過性肽殘基中之鹼性胺基酸之比率越高，低膜透過性化合物之導 入效率越提高，因此構成膜透過性肽之鹼性胺基酸相對於總胺基酸之比率以莫耳基準計較佳為50%以上，進而較佳為70%以上。構成膜透過性肽殘基之胺基酸中除鹼性胺基酸以外之胺基酸較佳為中性胺基酸。再者，於在本說明書中記載為胺基酸之情形時，只要未特別限定，則意指α-胺基酸。
關於構成膜透過性肽基之胺基酸之數量，就提高低膜透過性化合物之導入效率之方面而言，較佳為5~30，進而較佳為6~20，最佳為7~15。
作為膜透過性肽之較佳之具體例，可列舉：肽鍵結有7~30個精胺酸之精胺酸低聚物、具有GRKKRRQRRRPPQ之胺基酸序列之肽(統稱HIV-1 Tat：序列編號1)、具有TRQARRNRRRRWRERQR之胺基酸序列之肽(統稱HIV-1 Rev：序列編號2)、具有RRRRNRTRRNRRRVR之胺基酸序列之肽(統稱FHV Coat：序列編號3)、具有TRRQRTRRARRNR之胺基酸序列之肽(統稱HTLV-II Rex：序列編號4)、具有KLTRAQRRAAARKNKRNTR之胺基酸序列之肽(統稱CCMV Gag：序列編號5)等親水性之鹼性肽；具有RQIKIWFQNRRMKWKK之胺基酸序列之肽(統稱Antennapedia：序列編號6)、具有KMTRAQRRAAARRNRWTAR之胺基酸序列之肽(統稱BMW Gag：序列編號7)、具有RQIKIWFQNRRMKWKK之胺基酸序列之肽(統稱穿膜肽：序列編號8)、具有NAKTRRHERRRKLAIER之胺基酸序列之肽(統稱P22N：序列編號9)、具有DAATATRGRSAASRPTERPRAPARSASRPDDPVD之胺基酸序列之肽(統稱VP22：序列編號10)等兩親媒性之鹼性肽；具有GWTLNSAGYLLGKINLKALAALAKKIL之胺基酸序列之肽(統稱Transportan：序列編號11)、具有AGYLLGKINLKALAALAKKIL之胺基酸序列之肽(統稱TP-10：序列編號12)等疏水性之鹼性肽。該等之 中，就低膜透過性化合物之導入效率優異之方面而言，較佳為親水性之鹼性肽，進而較佳為精胺酸低聚物。精胺酸低聚物之中，精胺酸之重複數較佳為7~20，進而較佳為7~15，最佳為7~10。
於通式(1)中，X3表示羥基、胺基、碳數1~4之烷氧基或苄氧基。作為碳數1~4之烷氧基，可列舉：甲氧基、乙氧基、丙氧基、異丙氧基、丁氧基、異丁氧基、1-甲基丙氧基、第三丁氧基等。就低膜透過性化合物之導入效率之方面而言，作為X3，較佳為羥基、胺基、第三丁氧基、苄氧基，進而較佳為羥基、胺基，最佳為胺基。
於在側鏈具有通式(1)所表示之基之高分子化合物中存在複數個通式(1)所表示之基之情形時，各個通式(1)所表示之基之X1、X2、X3及a可相同，亦可不同。
[通式(2)所表示之基]
於通式(2)中，X4表示自中性胺基酸或ω-胺基烷酸去除末端胺基及末端羧基後之殘基，b表示1~50之數。作為中性胺基酸，例如可列舉：丙胺酸、天冬醯胺、半胱胺酸、麩醯胺、甘胺酸、異白胺酸、白胺酸、甲硫胺酸、苯丙胺酸、脯胺酸、絲胺酸、蘇胺酸、色胺酸、酪胺酸、纈胺酸、羥基脯胺酸等；作為ω-胺基烷酸，可列舉：3-胺基丙酸、4-胺基丁酸、5-胺基戊酸、6-胺基己酸、7-胺基庚酸、8-胺基辛酸、9-胺基壬酸、10-胺基癸酸、11-胺基十一酸等。作為X4所應用之中性胺基酸，就低膜透過性化合物之導入效率之方面或合成之容易度之方面而言，較佳為甘胺酸、丙胺酸、纈胺酸、異白胺酸、白胺酸、絲胺酸、蘇胺酸、苯丙胺酸，進而較佳為甘胺酸、丙胺酸、絲胺酸，最佳為甘胺酸。b較佳為1~30之數，進而較佳為1~20之數，最佳為1~10之數。於b為2~50之數之情形時，X4可為1種中性胺基酸殘基或ω-胺基烷酸殘基，亦可為自該等殘基中選擇之2種以上之組合。
於通式(2)中，X5表示自膜透過性肽去除末端胺基及末端羧基後 之殘基。本發明之高分子化合物之膜透過性肽殘基可根據細胞或黏膜、欲導入之低膜透過性化合物適當選擇，構成膜透過性肽殘基之胺基酸之至少1種較佳為鹼性胺基酸。又，鹼性胺基酸可為L體或D體之任一者，可根據細胞或黏膜、欲導入之低膜透過性化合物適當選擇。
作為鹼性胺基酸，可列舉：精胺酸、鳥胺酸、離胺酸、羥基離胺酸、組胺酸等；其中較佳為含胍基之胺基酸，進而較佳為精胺酸。膜透過性肽殘基中之鹼性胺基酸之比率越高，則低膜透過性化合物之導入效率越提高，因此構成膜透過性肽之鹼性胺基酸相對於總胺基酸之比率以莫耳基準計較佳為50%以上，進而較佳為70%以上。構成膜透過性肽基之胺基酸之中除鹼性胺基酸以外之胺基酸較佳為中性胺基酸。
關於構成膜透過性肽基之胺基酸之數量，就提高低膜透過性化合物之導入效率之方面而言，較佳為5~30，進而較佳為6~20，最佳為7~15。
作為膜透過性肽之較佳之具體例，可列舉：肽鍵結有7~30個精胺酸之精胺酸低聚物、具有GRKKRRQRRRPPQ之胺基酸序列之肽(統稱HIV-1 Tat：序列編號1)、具有TRQARRNRRRRWRERQR之胺基酸序列之肽(統稱HIV-1 Rev：序列編號2)、具有RRRRNRTRRNRRRVR之胺基酸序列之肽(統稱FHV Coat：序列編號3)、具有TRRQRTRRARRNR之胺基酸序列之肽(統稱HTLV-II Rex：序列編號4)、具有KLTRAQRRAAARKNKRNTR之胺基酸序列之肽(統稱CCMV Gag：序列編號5)等親水性之鹼性肽；具有RQIKIWFQNRRMKWKK之胺基酸序列之肽(統稱Antennapedia：序列編號6)、具有KMTRAQRRAAARRNRWTAR之胺基酸序列之肽(統稱BMW Gag：序列編號7)、具有RQIKIWFQNRRMKWKK之胺基酸序列之肽(統稱穿膜肽：序列編號8)、具有NAKTRRHERRRKLAIER之胺基酸序列之肽(統 稱P22N：序列編號9)、具有DAATATRGRSAASRPTERPRAPARSASRPDDPVD之胺基酸序列之肽(統稱VP22：序列編號10)等兩親媒性之鹼性肽；具有GWTLNSAGYLLGKINLKALAALAKKIL之胺基酸序列之肽(統稱Transportan：序列編號11)、具有AGYLLGKINLKALAALAKKIL之胺基酸序列之肽(統稱TP-10：序列編號12)等疏水性之鹼性肽。該等之中，就低膜透過性化合物之導入效率優異之方面而言，較佳為親水性之鹼性肽，進而較佳為精胺酸低聚物。精胺酸低聚物之中，精胺酸之重複數較佳為7~20，進而較佳為7~15，最佳為7~10。
於通式(2)中，X6表示氫原子、碳數1~6之烷基、苄基、碳數1~6之醯基、芳基磺醯基或氧基羰基。作為碳數1~6之烷基，可列舉：甲基、乙基、丙基、異丙基、丁基、異丁基、二級丁基、第三丁基、戊基、異戊基、二級戊基、第三戊基、己基、二級己基等。作為碳數1~6之醯基，可列舉：甲醯基、乙醯基、丙醯基、丁醯基、戊醯基、己醯基等。作為芳基磺醯基，可列舉：對甲苯磺醯基、2-硝基苯磺醯基、三氟乙醯基等。作為氧基羰基，例如可列舉：第三丁氧羰基、苄氧羰基、9-茀基甲氧基羰基、2,2,2-三氯乙氧羰基、烯丙氧基羰基等。就低膜透過性化合物之導入效率之方面而言，作為X6，較佳為乙醯基、氫原子、甲基、三氟乙醯基，進而較佳為乙醯基、氫原子，最佳為乙醯基。
於在側鏈具有通式(2)所表示之基之高分子化合物中存在複數個通式(2)所表示之基之情形時，各個通式(2)所表示之基之X4、X5、X6及b可相同，亦可不同。
[主鏈高分子]
本發明之接枝型高分子之主鏈高分子並無特別限定，就與細胞或蛋白質等水溶性高分子量物質之親和性優異之方面而言，較佳為親 水性高分子。此處，所謂親水性高分子，意指水溶性高分子或於水中膨潤之高分子。於本發明中，所謂水溶性高分子，係指於常壓下以0.1質量%以上之量均勻地溶解於25℃之水中之高分子。
作為親水性高分子，例如可列舉：瓜爾膠、瓊脂糖、甘露聚糖、葡甘露聚醣、聚葡萄糖、木質素、甲殼素、聚葡萄胺糖、鹿角菜膠、支鏈澱粉、硫酸軟骨素、纖維素、半纖維素、甲基纖維素、乙基纖維素、羥乙基纖維素、羥丙基纖維素、澱粉、陽離子澱粉、糊精之多糖類或多糖類之改性物；白蛋白、酪蛋白、明膠、聚麩醯胺酸、聚離胺酸等水溶性蛋白質或水溶性多肽；聚(甲基)丙烯酸、聚(丙烯酸羥乙基)酯、聚(甲基)丙烯醯胺、聚N-乙烯基乙醯胺、聚乙烯吡咯啶酮、聚乙烯醇、聚((甲基)丙烯酸酯2-胺基乙基)酯、(甲基)丙烯酸/丙烯醯胺共聚物、(甲基)丙烯酸/N-異丙基丙烯醯胺共聚物、(甲基)丙烯酸/N-乙烯基乙醯胺共聚物、(甲基)丙烯酸/馬來酸共聚物、(甲基)丙烯酸/富馬酸共聚物、乙烯/馬來酸共聚物、異丁烯/馬來酸共聚物、乙烯/馬來酸共聚物、烷基乙烯基醚/馬來酸共聚物、烷基乙烯基醚/富馬酸共聚物等乙烯系親水性高分子；及水溶性聚胺基甲酸酯等。
就膜透過性肽基對主鏈高分子之接枝化變得容易之方面而言，作為主鏈高分子，於本發明之高分子化合物為於側鏈具有通式(1)所表示之基之高分子化合物之情形時，較佳為具有羧基之高分子，更佳為具有羧基之親水性高分子，進而較佳為具有羧基之單體與不具羧基之單體之共聚物，最佳為(甲基)丙烯酸/N-乙烯基乙醯胺共聚物。
又，於在側鏈具有通式(2)所表示之基之高分子化合物之情形時，較佳為具有胺基之高分子，更佳為具有胺基之親水性高分子，最佳為聚葡萄胺糖。再者，所謂具有胺基或羧基，只要符合於側鏈具有通式(1)或(2)所表示之基之前之主鏈高分子即可。
於主鏈高分子具有羧基之情形時，就容易獲得作為本發明之高 分子化合物而較佳者之觀點等而言，具有羧基之單體單元之數量相對於構成主鏈高分子之單體單元之數量之比率較佳為5~80%，更佳為10~60%。
於主鏈高分子具有胺基之情形時，就容易獲得作為本發明之高分子化合物而較佳者之觀點等而言，具有胺基之單體單元之數量相對於構成主鏈高分子之單體單元之數量之比率較佳為5~100%，更佳為10~100%。再者，上述所述之具有胺基或羧基之單元之比率較佳為符合於側鏈具有通式(1)或通式(2)所表示之基之前之主鏈高分子。
[本發明之高分子化合物]
本發明之高分子化合物之特徵在於在側鏈具有通式(1)或通式(2)所表示之基。於本發明之高分子化合物中之通式(1)或通式(2)所表示之基之比率過低之情形及過高之情形時，低膜透過性化合物之導入效率降低，因此，本發明之高分子化合物中之通式(1)或通式(2)所表示之基之數量相對於構成主鏈高分子之單體單元(於多糖類或多糖類之改性物之情形時為單糖單元，於水溶性蛋白質或水溶性多肽之情形時為胺基酸單元)之數量，較佳為0.001~0.9，進而較佳為0.005~0.8，最佳為0.01~0.7。
於本發明之高分子化合物過小之情形時，本發明之高分子化合物容易被組入至細胞，於過大之情形時欲導入之低膜透過性化合物之導入效率降低，因此，本發明之高分子化合物之重量平均分子量較佳為10萬~5000萬，進而較佳為20萬~3000萬，最佳為30萬~1000萬。再者，於本發明中所謂重量平均分子量，係使用水系溶劑進行GPC(gel permeation chromatograph，凝膠滲透層析)分析之情形時之重量平均分子量，並且於主鏈高分子為多糖類或多糖類之改性物、或水溶性蛋白質之情形時，係指支鏈澱粉換算之重量平均分子量，於主鏈高分子為乙烯系親水性高分子之情形時，係指聚乙二醇(PEG)或聚環 氧乙烷(PEO)換算之重量平均分子量。
本發明之高分子化合物之低膜透過性化合物之導入效率較先前已知之膜透過性之於側鏈具肽鏈之高分子化合物高。推測其原因可能是先前已知之膜透過性之於側鏈具肽鏈之高分子化合物(例如參照日本專利特開2010-100781號公報)係膜透過性肽直接鍵結於主鏈高分子，相對於此，於本發明之高分子化合物中，膜透過性肽與主鏈高分子係經由下述通式(1a)或下述通式(2a)所表示之基而鍵結，藉此膜透過性肽殘基之自由度提高。又，於本發明之高分子化合物中，亦具有如下優點，即，藉由經由下述通式(1a)或下述通式(2a)所表示之基，幹聚合物之具有膜透過性肽之基之取代可較先前已知之膜透過性之於側鏈具肽鏈之高分子化合物於更溫和之條件下以較高之取代率進行。
Figure 105105990-A0202-12-0012-6
(式中，X1及a與通式(1)同義)
Figure 105105990-A0202-12-0012-7
(式中，X4及b與通式(2)同義)
[本發明之高分子化合物之製法]
本發明之高分子化合物之製造方法並無特別限定，可對具有通式(1)或通式(2)所表示之基之聚合性單體進行聚合而製造，亦可將通式(1)或通式(2)所表示之基導入至主鏈高分子而製造，就製造之容易度之方面而言，較佳為將通式(1)或通式(2)所表示之基導入至主鏈高分子而製造。於主鏈高分子為具有羧基之親水性高分子之情形時，可藉由使下述通式(1b)所表示之肽化合物之胺基與羧基進行肽反應而獲得。羧基與胺基之反應使用公知之方法即可，例如可列舉於利用N-羥 基琥珀醯亞胺使羧基琥珀醯亞胺酯化後使胺基反應之方法等。又，於主鏈高分子為具有胺基之親水性高分子之情形時，可藉由使下述通式(2b)所表示之肽化合物之羧基與胺基進行肽反應而獲得。根據該方法，可經由醯胺鍵最簡單地導入通式(1)或(2)所表示之基作為主鏈高分子之側鏈。其中，通式(1)或(2)所表示之基之固定法並不限定於本法，可使用通常所知之化學反應進行固定化。
Figure 105105990-A0202-12-0013-9
(式中，X1、X2、X3及a與通式(1)同義)
Figure 105105990-A0202-12-0013-10
(式中，X4、X5、X6及b與通式(2)同義)
[低膜透過性化合物]
藉由將本發明之高分子化合物用作用以將低膜透過性化合物導入至細胞內或黏膜內之導入劑，可導入各種低膜透過性化合物。作為此種低膜透過性化合物，例如可列舉：胰島素及胰島素分泌促進劑(例如Exendin-4、GLP-1)等肽、蛋白性醫藥品；類固醇激素、非類固醇系鎮痛抗炎症劑、精神穩定劑、抗高血壓藥、虛血性心疾患治療藥、抗組織胺藥、抗哮喘藥、抗帕金森藥、腦循環改善藥、抗噁心劑、抗抑鬱藥、抗心律不整藥、抗凝固藥、抗痛風藥、抗真菌藥、抗癡呆藥、Sjogren症候群治療藥、麻藥性鎮痛藥、β遮斷藥、β1激動劑、β2激動劑、副交感神經激動劑、抗腫瘤藥、利尿藥、抗血栓藥、組織胺H1受體拮抗藥、組織胺H2受體拮抗藥、抗過敏劑、戒煙輔助藥、維生素等醫藥品；脫氧核糖核酸(DNA)或核糖核酸(RNA)及該等之類似物或衍生物 (例如肽核酸(PNA)、硫代磷酸酯DNA等)等核酸化合物；酵素、抗體、糖蛋白質、轉錄因子等肽化合物；支鏈澱粉(pullulan)、支鏈澱粉(amylopectine)、直鏈澱粉、肝糖、環糊精、葡聚糖、羥乙基葡聚糖、甘露聚糖、纖維素、澱粉、海藻酸、甲殼素、聚葡萄胺糖、玻尿酸等多糖衍生物及其等之衍生物等。
可應用本發明之高分子化合物之細胞可為動物、植物、細菌等任一者之細胞，就低膜透過性化合物之導入效率之方面而言，較佳為人等哺乳類之細胞。就低膜透過性化合物之導入效率之方面而言，可應用本發明之多糖衍生物之黏膜亦較佳為人等哺乳類之細胞。
[細胞]
藉由使用本發明之高分子化合物，可將低膜透過性化合物導入至各種細胞內，亦可將低膜透過性化合物導入至分散於培養液(亦稱為液體培養基)等中之細胞、接著於固定培養基等之細胞、生物體組織之細胞等任一細胞。細胞可大致分為形成組織細胞或神經細胞等之接著系之細胞與血球細胞等浮游系之細胞。無法對浮游系之細胞應用顯微注射法或電穿孔法，而可應用磷酸鈣法、脂轉染法、病毒載體法等，但導入效率並不令人滿意。本發明之導入方法不僅是對接著系之細胞，對於浮游系之細胞，亦能以較高之導入效率導入低膜透過性化合物。
[向細胞內之導入方法]
於使用本發明之高分子化合物將低膜透過性化合物導入至細胞內之情形時，只要使含有本發明之高分子化合物與低膜透過性化合物之水性溶液或水性分散液與細胞接觸即可，無需病毒載體法或使用膜透過性肽之先前之導入方法般之複雜之預處理，又，幾乎不會對細胞造成惡劣影響則可將低膜透過性化合物導入至細胞內。
作為供本發明之高分子化合物與低膜透過性化合物溶解或分散而成為含有該等之水性溶液或水性分散液之水性介質，除蒸餾水、細胞培養通常使用之培養液以外，可列舉生理鹽水、5質量%葡萄糖水溶液等等張水，就對細胞之影響較少之方面而言，較佳為培養液、生理鹽水及5質量%葡萄糖水溶液。
於使細胞懸浮於水性溶液或水性分散液中之情形時，只要使細胞懸浮於含有低膜透過性化合物與本發明之高分子化合物之水性溶液或水性分散液中即可，亦可視需要對含有該等3者之懸濁液進行攪拌或振盪。又，於因細胞接著於固體培養基等或細胞組織較大等原因而無法使細胞懸浮於水性溶液或水性分散液中之情形時，只要使細胞浸漬於含有低膜透過性化合物與本發明之高分子化合物之水性溶液或水性分散液中即可。
於將低膜透過性化合物導入至細胞內之情形時，本發明之高分子化合物之使用濃度並無特別限定，於水性溶液或水性分散液中較佳為設為0.1μg/mL~10mg/mL。又，所導入之低膜透過性化合物之濃度亦並無特別限定，於水性溶液或水性分散液中較佳為設為0.5μg/mL~10mg/mL。進而，使細胞懸浮於培養液或生理鹽水之情形時之細胞之濃度亦無限定，於水性溶液或水性分散液中較佳為設為1萬~200萬cells/mL。
使本發明之高分子化合物、欲導入之低膜透過性化合物、及細胞之3者共存之時間並無特別限定，較佳為設為30分鐘~24小時。
[黏膜]
藉由於黏膜內使用本發明之高分子化合物，可將低膜透過性化合物導入至各種黏膜內。作為黏膜，可列舉鼻黏膜、口腔黏膜、陰道黏膜、直腸黏膜、眼黏膜、胃黏膜、腸管黏膜等。先前之膜透過性之於側鏈具肽鏈之高分子化合物對黏膜之刺激性較大，因此存在例如當 使用於鼻黏膜時會產生瘙癢之情形，但於本發明之高分子化合物中此種瘙癢得以減輕。
[向黏膜內之導入方法]
於使用本發明之高分子化合物將低膜透過性化合物導入至黏膜內之情形時，只要使本發明之高分子化合物與低膜透過性化合物之混合物密接於黏膜即可，只要為該混合物難以自黏膜剝離之劑形，則劑形並無限定。較佳之劑形因黏膜而有所不同，例如可列舉丸劑、片劑、口含錠劑、貼附劑、栓劑、糊劑等。本發明之高分子化合物與低膜透過性化合物之混合物只要根據劑形選擇液狀、乳狀、懸浮狀、凝膠狀、粉末狀、固體狀等形狀即可。低膜透過性化合物可根據目的而僅導入1種，亦可將2種以上組合。又，亦可視需要將賦形劑、乳化劑、分散劑、凝膠化劑、保濕劑等併用。
[小突起陣列之利用]
本發明之高分子化合物雖無法經由皮膚將低膜透過性化合物導入至細胞內，但可利用小突起陣列(於片材上配設有微細之突起之藥劑傳遞構件；例如參照US2005025778A1、日本專利特開2008-006178等)將低膜透過性化合物導入至皮膚下之細胞內。例如，將將本發明之高分子化合物與低膜透過性化合物之混合物塗佈於表面之小突起陣列或具有含有本發明之高分子化合物與低膜透過性化合物之混合物之小突起之小突起陣列貼附於皮膚表面，利用微細之突起貫通皮膚，使本發明之高分子化合物與低膜透過性化合物滲透至皮膚下，藉此可將低膜透過性化合物導入至皮膚下之細胞內。
實施例
以下，利用實施例對本發明進一步進行說明，但本發明並不受該等實施例限定。再者，只要未特別限定，則實施例中之「份」或「%」係依據質量基準者。
<實施例1>
將N-乙烯基乙醯胺/丙烯酸鈉共聚物(商品名：GE160-105，昭和電工公司製造)10g溶解於離子交換水1kg中，添加強酸性陽離子交換樹脂(商品名：Amberlyst 15DRY，Organo公司製造)10g並攪拌2小時，然後將離子交換樹脂濾出，並對濾液進行濃縮、冷凍乾燥而獲得N-乙烯基乙醯胺/丙烯酸共聚物(以下稱為GE160-105H)8.6g。
將500mg之GE160-105H溶解於二甲基甲醯胺(DMF)15mL中。將該溶液冷卻至0℃，添加溶解於5mL之DMF中之1.1g之N-羥基琥珀醯亞胺，進而添加溶解於5mL之DMF中之1.96g之二環己基碳二醯亞胺(DCC)並於室溫(25℃)下攪拌24小時進行反應。藉由過濾將所析出之固體濾出，並將濾液緩慢滴加至500mL之乙腈，藉由再次沈澱而獲得琥珀醯亞胺酯化GE160-105(以下稱為GE160-105OSu)620mg。
將20mg之GE160-105OSu溶解於0.2mL之DMF，使於通式(1b)中a為4、X1為自甘胺酸去除末端胺基及末端羧基後之殘基、X2為自八聚精胺酸去除末端胺基及末端羧基後之殘基、X3為胺基之化合物(RS Synthesis公司製造，商品名：H-(Gly)4-(D-Arg)8-NH2(Purity：90%)，TFA Salt)148mg溶解於DMF 0.8mL並進行混合，於60℃下攪拌24小時進行反應。反應之後，將反應溶液添加至纖維素透析管(無縫纖維素管，和光純藥公司製造)並將管之兩口紮緊後，使用離子交換水進行2天透析。其後，將管之內容物冷凍乾燥，獲得62mg之實施例1之高分子化合物。實施例1之高分子化合物係通式(1)之X1為自甘胺酸去除末端胺基及末端羧基後之殘基、X2為自八聚精胺酸去除末端胺基及末端羧基後之殘基、X3為胺基、且a為4之化合物。實施例1之高分子化合物之重量平均分子量為160萬，根據NMR之積分值得知具有下述構造。再者，式中，Gly表示甘胺酸殘基，Arg表示精胺酸殘基，x：y：z=70：1：29。
Figure 105105990-A0202-12-0018-11
<實施例2>
於實施例1中，將H-(Gly)4-(D-Arg)8-NH2之使用量自148mg變更為50mg，除此以外，進行與實施例1同樣之操作，獲得54mg之實施例2之高分子化合物。實施例2之高分子化合物係通式(1)之X1為自甘胺酸去除末端胺基及末端羧基後之殘基、X2為自八聚精胺酸去除末端胺基及末端羧基後之殘基、X3為胺基、且a為4之化合物。實施例2之高分子化合物之重量平均分子量為160萬，根據NMR之積分值得知具有下述構造。再者，式中，Gly表示甘胺酸殘基，Arg表示精胺酸殘基，x：y：z=70：15：15。
Figure 105105990-A0202-12-0018-12
<實施例3>
使於通式(2b)中b為4、X4為自甘胺酸去除末端胺基及末端羧基後之殘基、X5為自八聚精胺酸去除末端胺基及末端羧基後之殘基、X6為乙醯基之化合物(RS Synthesis公司製造，商品名：HO-(Gly)4-(D-Arg)8-COCH3(Purity：90%))150mg溶解於0.5mL之DMF。於添加132mg之N-羥基琥珀醯亞胺後，添加溶解於DMF 0.3mL之230mg之DCC。進而添加重量平均分子量約10萬之聚葡萄胺糖之DMF溶液(100mg/mL)，並於室溫(25℃)下攪拌24小時。將反應溶液添加至纖維素透析管(無縫纖維素管，和光純藥公司製造)並將管之兩口紮緊後，使用 離子交換水進行2天透析。其後，將管之內容物冷凍乾燥，獲得32mg之實施例2之高分子化合物。實施例3之高分子化合物之重量平均分子量為11萬，根據NMR之積分值得知具有下述構造。再者，式中，Gly表示甘胺酸殘基，Arg表示精胺酸殘基，x：y=80：20。
Figure 105105990-A0202-12-0019-13
<比較例1>
使用八聚精胺酸之末端羧基經醯胺化之化合物(GL Biochem公司製造，商品名：RRRRRRRR-NH2，[R=D-Arg]TFA Salt)之DMSO溶液(350mg/mL)0.5mL代替H-(Gly)4-(D-Arg)8-NH2之DMF溶液，除此以外，進行與實施例1同樣之操作，獲得32mg之比較例1之高分子化合物。比較例1之高分子化合物之重量平均分子量為160萬，根據NMR之積分值得知具有下述構造。再者，式中，Arg表示精胺酸殘基，x：y：z=70：15：15。
Figure 105105990-A0202-12-0019-15
<比較例2>
依據US2010113559A1之製造例，使用重量平均分子量約10萬之聚葡萄胺糖製造比較例2之高分子化合物。比較例2之高分子化合物係具有下述構造之化合物。再者，式中，Arg表示精胺酸殘基，x：y=80：20。
[化11]
Figure 105105990-A0202-12-0020-16
<細胞>
CHO細胞：源自中國倉鼠卵巢之細胞
<培養基>
Ham'sF12培養基(商品名，和光公司製造)
Opti-MEM培養基(商品名，Life Technologies公司製造)
<試劑>
胰蛋白酶/EDTA溶液：0.25%之胰蛋白酶，1mmol/L之EDTA水溶液<低膜透過性化合物>
FITC-BSA：螢光素標記-牛血清白蛋白(Sigma-Aldrich公司製造)
<向細胞內之導入效率>
於24孔盤之各阱中播種CHO細胞之Ham'sF12培養基懸濁液(2×105cells/mL)500μL，於二氧化碳培養箱中預培養24小時。於去除上清液之培養基後，添加FITC-BSA之Opti-MEM培養基溶液(10μg/mL)250μL，進而添加實施例1~3之高分子化合物、或比較例1~2之高分子化合物之Opti-MEM培養基溶液(100μg/mL)250μL，於二氧化碳培養箱中培養1小時。去除上清液之培養基溶液，並利用磷酸緩衝生理鹽水500μL清洗2次後，添加胰蛋白酶EDTA溶液100μL，使所培養之CHO細胞自盤剝離並分散。繼而，添加0.08%錐蟲藍溶液100μL使細胞懸浮，並回收至微型管中。使所回收之細胞懸濁液通過細胞濾器，並利用流式細胞儀測定MFI(平均螢光強度)。又，將未使用高分子化合物者作為空白樣品。將結果示於表1。
Figure 105105990-A0202-12-0021-17
細胞外之FITC-BSA因錐蟲藍而失活從而不會發出螢光，僅導入至細胞內之FITC-BSA發出螢光。MFI表示各細胞之每1次螢光強度之平均值，因此MFI之值越大，表示於細胞內越組入有作為水溶性高分子化合物之FITC-BSA。根據表1之結果可知，實施例1~3之高分子化合物使水溶性高分子量物質向細胞內之導入效率較高。
<110> 常翔學園教育基金會(Josho Gakuen Educational Foundation)艾迪科公司(ADEKA Corporation)
<120> 膜透過性之於側鏈具肽鏈之高分子化合物
<160> 12
<170> 專利版本3.5
<210> 1
<211> 13
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 親水性鹼性肽
<400> 1
Figure 105105990-A0305-02-0024-3
<210> 2
<211> 17
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 親水性鹼性肽
<400> 2
Figure 105105990-A0305-02-0024-4
<210> 3
<211> 15
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 親水性鹼性肽
<400> 3
Figure 105105990-A0202-12-0023-20
<210> 4
<211> 13
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 親水性鹼性肽
<400> 4
Figure 105105990-A0202-12-0023-21
<210> 5
<211> 19
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 親水性鹼性肽
<400> 5
Figure 105105990-A0202-12-0023-23
<210> 6
<211> 16
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 兩親性鹼性肽
<400> 6
Figure 105105990-A0202-12-0024-26
<210> 7
<211> 19
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 兩親性鹼性肽
<400> 7
Figure 105105990-A0202-12-0024-25
<210> 8
<211> 16
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 兩親性鹼性肽
<400> 8
Figure 105105990-A0202-12-0024-24
<210> 9
<211> 17
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 兩親性鹼性肽
<400> 9
Figure 105105990-A0202-12-0025-27
<210> 10
<211> 34
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 兩親性鹼性肽
<400> 10
Figure 105105990-A0202-12-0025-28
<210> 11
<211> 27
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 疏水性鹼性肽
<400> 11
Figure 105105990-A0202-12-0025-30
Figure 105105990-A0202-12-0026-32
<210> 12
<211> 21
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 疏水性鹼性肽
<400> 12
Figure 105105990-A0202-12-0026-31
Figure 105105990-A0202-11-0002-3

Claims (5)

  1. 一種高分子化合物，其於側鏈具有下述通式(1)或下述通式(2)所表示之基，
    Figure 105105990-A0305-02-0029-1
     (式中，X1表示自選自甘胺酸、丙胺酸、纈胺酸、異白胺酸、白胺酸、絲胺酸、蘇胺酸及苯丙胺酸之中性胺基酸或ω-胺基烷酸去除末端胺基及末端羧基後之殘基，X2表示自膜透過性肽去除末端胺基及末端羧基後之殘基，X3表示羥基、胺基、碳數1~4之烷氧基或苄氧基，a表示2~50之數；構成上述膜透過性肽之鹼性胺基酸相對於總胺基酸之比率以莫耳基準計為50%以上)
    Figure 105105990-A0305-02-0029-2
     (式中，X4表示自中性胺基酸或ω-胺基烷酸去除末端胺基及末端羧基後之殘基，X5表示自膜透過性肽去除末端胺基及末端羧基後之殘基，X6表示氫原子、碳數1~6之烷基、苄基、碳數1~6之醯基、芳基磺醯基或氧基羰基，b表示1~50之數；構成上述膜透過性肽之鹼性胺基酸相對於總胺基酸之比率以莫耳基準計為50%以上)。
  2. 如請求項1之高分子化合物，其中主鏈高分子為乙烯系親水性高分子。
  3. 一種導入劑，其係用以將低膜透過性化合物導入至細胞內或黏膜內並且包含如請求項1或2之高分子化合物之導入劑。
  4. 一種用以將低膜透過性化合物導入至生物體外之細胞內之方 法，其使用如請求項3之導入劑。
  5. 一種用以將低膜透過性化合物導入至生物體外之黏膜組織內之方法，其使用如請求項3之導入劑。
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