TWI694832B

TWI694832B - 山竹果萃取物用於製備具有抑制透明質酸酶及ｄｎａ修復的活性之組成物的用途

Info

Publication number: TWI694832B
Application number: TW107131024A
Authority: TW
Inventors: 梁家華
Original assignee: 嘉藥學校財團法人嘉南藥理大學
Priority date: 2018-09-04
Filing date: 2018-09-04
Publication date: 2020-06-01
Also published as: TW202010508A

Abstract

本發明係有關於一種山竹(Garcinia mangostana)果萃取物及其用途。此山竹果萃取物係以水或乙醇萃取山竹全果或山竹果殼所獲得，具有抑制透明質酸酶活性及DNA修復的活性，可作為具有抑制透明質酸酶活性及DNA修復的活性之組成物的有效成分。

Description

山竹果萃取物用於製備具有抑制透明質酸酶及DNA修復的活性之組成物的用途

本發明係有關於一種植物萃取物，特別是有關於一種山竹果萃取物用於製備具有抑制透明質酸酶活性及DNA修復的活性之組成物的用途。

自有機及天然的飲食概念興起後，生技公司及食品業者積極投入關於天然植物的相關萃取產品之研發。為使植物萃取相關產品對身體健康助益有科學驗證的基礎，植物的活性成分分析及功效評估成為產品開發的重點項目。而原產於東南亞地區的山竹(Garcinia mangostana)，又名莽吉柿、山竺、山竹子、倒捻子、鳳果，亦成為研究開發的對象之一。

透明質酸廣泛地存在於動物的各種組織中，在生物體內顯示出多種重要的生理功能，如潤滑關節、調節蛋白質的運轉、促進創傷癒合等。當生物體遭遇過敏、發炎、癌症等，會誘發透明質酸酶大量表現而分解透明質酸。因此，如能抑制透明質酸酶的活性，除能使透明質酸不被分解以維持其正常的生理功能，又能達到抗炎、抗過敏、抗腫瘤的功效。

此外，目前已知自由基會與體內的細胞組織產生氧化反應，導致組織細胞失去正常功能，甚至破壞DNA而造成損害或突變進而引發癌症。而紫外線為造成自由基大量產生的因素之一，紫外線增加人體自由基的活性後，在一般的狀況下，人體具有修復能力。惟過量的紫外線將皮膚出現皺紋、色素斑，甚至細胞DNA修復能力會受到破壞，進而造成細胞老化、癌化或死亡。

目前並無文獻證實山竹果萃取物是否具有抑制透明質酸酶活性及DNA修復的活性。有鑑於此，亟需提供一種山竹果萃取物的新用途，以拓展其應用面。

因此，本發明之一態樣是提供一種山竹(Garcinia mangostana)果萃取物用於製備具有抑制透明質酸酶活性及DNA修復的活性之組成物的用途。

本發明之另一態樣係在提供一種抑制透明質酸酶之組成物，其包含以山竹果萃取物為有效成分。

本發明之又一態樣係在提供一種修復DNA之組成物，其包含以山竹果萃取物為有效成分。

根據本發明之上述態樣，提出一種山竹果萃取物用於製備具有抑制透明質酸酶活性及DNA修復的活性之組成物的用途。在一實施例中，此山竹果萃取物係以水或乙醇萃取山竹全果或山竹果殼所獲得，且此組成物包含50μg/mL 至1000μg/mL之山竹果萃取物。

依據本發明上述實施例，此組成物包含100μg/mL至1000μg/mL之此山竹果萃取物。

依據本發明上述實施例，此組成物包含100μg/mL至500μg/mL之由山竹果殼萃取之山竹果水萃取物。

依據本發明上述實施例，此組成物包含500μg/mL至1000μg/mL之由山竹全果萃取之山竹果水萃取物。

根據本發明之另一態樣，提出一種抑制透明質酸酶之組成物，包含以山竹果萃取物為有效成分，其中此山竹果萃取物係以水或乙醇萃取山竹全果或山竹果殼所獲得，且此組成物包含50μg/mL至1000μg/mL之山竹果萃取物。

根據本發明之又一態樣，提出一種修復DNA之組成物，包含以山竹果萃取物為有效成分，其中此山竹果萃取物係以水或乙醇萃取山竹全果或山竹果殼所獲得，且此組成物包含50μg/mL至1000μg/mL之山竹果萃取物。

應用本發明之山竹果萃取物，其係以水或乙醇萃取山竹全果或山竹果殼所獲得，具有抑制透明質酸酶活性及DNA修復的活性，可用於製備具有抑制透明質酸酶及DNA修復的活性之組成物的用途。

為讓本發明之上述和其他目的、特徵、優點與實施例能更明顯易懂，所附圖式之詳細說明如下：〔圖1A〕為根據本發明一實施例之山竹果水萃取物抑制透明質酸酶活性之SDS page凝膠電泳圖。

〔圖1B〕係繪示圖1A之抑制透明質酸酶活性的直條圖。

〔圖2A〕為顯示在過氧化氫及/或UVB的處理下利用本發明一實施例之山竹果水萃取物保護DNA之核酸電泳圖。

〔圖2B〕係繪示圖2A各組之超螺旋型DNA的百分比的直條圖。

〔圖3〕係繪示根據本發明一實施例之經UVB照射的HaCaT細胞與山竹果水萃取物共培養後的細胞存活率之直條圖。

〔圖4〕係繪示根據本發明一實施例之山竹果萃取物與HaCaT細胞共培養的細胞存活率之直條圖。

〔圖5A〕及〔圖5B〕係繪示根據本發明一實施例之山竹果萃取物於體外DPPH自由基(圖5A)及ABTS自由基(圖5B)的清除率之直條圖。

〔圖6A〕係繪示根據本發明一實施例之山竹果萃取物抑制細胞內反應性含氧物種(reactive oxygen species；ROS)活性之直條圖。

〔圖6B〕係繪示根據本發明一實施例之山竹果萃取物抑制細胞內過氧化氫酶(catalase)活性之直條圖。

〔圖7A〕係繪示根據本發明一實施例之山竹果水萃取物於體外抑制酪胺酸酶活性之直條圖。

〔圖7B〕係繪示根據本發明一實施例之山竹果水萃取物對於細胞內酪胺酸酶活性之直條圖。

承上所述，本發明提供一種山竹(Garcinia mangostana)果萃取物用於製備具有抑制透明質酸酶活性及DNA修復的活性之組成物的用途，此山竹果萃取物係以水或乙醇萃取山竹全果或山竹果殼所獲得。

本發明此處所稱的「山竹果萃取物」可為山竹果殼水萃取物、山竹全果水萃取物、山竹果殼乙醇萃取物及/或山竹全果乙醇萃取物。

在一實施例中，萃取山竹果殼或全果時，首先，在不高於室溫(例如10℃至40℃)之溫度下，清洗及粉碎山竹果殼或全果。接著，在不高於室溫之溫度下，將粉碎的山竹果殼或全果浸泡於萃取溶劑中，以1：5之固液比萃取72小時，以獲得粗萃混合物。前述之萃取溶液可例如水，或95%至99%體積百分比(vol%)之乙醇溶液。接著，進行固液分離步驟，其係利用紗布、濾紙、離心或其他習知方式，去除粗萃混合物之殘渣及固形份，以獲得粗萃液。然後，利用減壓濃縮法、冷凍乾燥法等習知方式去除粗萃液之萃取溶劑後，獲得山竹果殼萃取物或山竹全果萃取物。

上述山竹果萃取物經實驗證實，具有抑制透明質酸酶活性及DNA修復等活性，可應用於製備組成物的有效成份，其中前述之組成物可例如皮膚外用組成物、食品組成物或醫藥組成物等。此處所稱「皮膚外用」係指用於清潔、保護、保養、美妝皮膚之製品，例如洗面乳、乳液、面膜、化妝品等。此處所稱的「食品」，係指經過產品安全性、功效性評估試驗等科學驗證之食品。

在前述組成物之實施例中，山竹果殼水萃取物之含量以50μg/mL至1000μg/mL為宜，又以100μg/mL至500μg/mL為較佳。山竹全果水萃取物之含量以50μg/mL至1000μg/mL為宜，又以包含500μg/mL至1000μg/mL為較佳。山竹果殼乙醇萃取物及山竹全果乙醇萃取物之含量亦分別以50μg/mL至1000μg/mL為宜。

在應用時，本發明提供一種抑制透明質酸酶之組成物以及一種修復DNA之組成物，其分別包含以山竹果萃取物為有效成分。在上述實施例中，山竹全果水萃取物具有抑制透明質酸酶之活性，然以山竹果殼水萃取物更佳。在上述實施例中，山竹全果水萃取物具有DNA修復活性，然以山竹果殼水萃取物更佳。

上述DNA受損的原因並無特別的限制，可以是來自紫外線(ultraviolet；UV)或反應性含氧物種(reactive oxygen species；ROS)所造成之損害。前述的紫外線可包括但不限於紫外線A(UVA)、紫外線B(UVB)、紫外線C(UVC)及/或上述之任意組合。前述的反應性含氧物種可包括但不限於超氧化物(superoxide；O₂ ^-)、羥基自由基(hydroxy radical；‧OH)、過氧化物自由基(peroxide radical；ROO‧)、過氧化氫(H₂O₂)等。

以下利用數個實施例以說明本發明之應用，然其並非用以限定本發明，本發明技術領域中具有通常知識者，在不脫離本發明之精神和範圍內，當可作各種之更動與潤飾。

實施例一：山竹果萃取物的製備

1.山竹果殼水萃取物之製備

首先，在室溫(例如10℃至40℃)或略低於室溫下粉碎0.1公斤之山竹果殼，接著，將粉碎的山竹果殼加入去離子水(ddH₂O)，使山竹果殼浸泡於水溶液進行萃取後，以紗布、濾紙、離心或其他習知方式過濾一次或重複數次後，去除粗萃混合物之殘渣及固形成份，以獲得粗萃液。然後，利用減壓濃縮法、冷凍乾燥法等習知方式去除粗萃液之萃取溶劑後，獲得山竹果殼水萃取物。此山竹果殼水萃取物以下式(I)計算萃取率(下同)為6wt%，其中包含相當於1.93mg/g之沒食子酸當量(gallic acid equivalents)的總酚量(total phenolic contents；TPC)及相當於327.1mg/g之芸香苷當量(rutin equivalents)的總黃酮量(total flavonoids content；TFC)：萃取率(%)=(萃取物重量/材料原重量)×100% (I)

2.山竹全果水萃取物之製備

利用與實施例一第1節相同的方式，由0.1公斤之山竹全果獲得山竹全果水萃取物。此山竹全果水萃取物之萃取率為6.9wt%，其中包含相當於1.54mg/g之沒食子酸當量的總酚量及相當於1.6mg/g之芸香苷當量的總黃酮量。

3.山竹果殼乙醇萃取物之製備

首先，在室溫(例如10℃至40℃)或略低於室溫下粉碎0.1公斤之山竹果殼，接著，將粉碎的山竹果殼加入乙醇，使山竹果殼浸泡於95vol%之乙醇溶液進行萃取後，以紗布、濾紙、離心或其他習知方式過濾一次或重複數次後，去除粗萃混合物之殘渣及固形成份，以獲得粗萃液。然後，利用減壓濃縮法、冷凍乾燥法等習知方式去除粗萃液之萃取溶劑後，獲得山竹果殼乙醇萃取物。此山竹果殼乙醇萃取物之萃取率6wt%，其中包含相當於1.98mg/g之沒食子酸當量的總酚量及相當於469.8mg/g之芸香苷當量的總黃酮量。

4.山竹全果乙醇萃取物之製備

利用與實施例一第3節相同的方式，由0.1公斤之山竹全果獲得山竹全果乙醇萃取物。此山竹全果乙醇萃取物之萃取率8.5wt%，其中包含相當於1.57mg/g之沒食子酸當量的總酚量。

實施例二：山竹果水萃取物抑制透明質酸酶活性的評估

透明質酸酶(Hyaluronidase)係一類能夠降低體內透明質酸活性的酶之總稱，參與人體的許多病理及生理活動，且透明質酸酶與過敏及發炎反應具有密切的關係。此實施例係利用表沒食子兒茶素沒食子酸酯(epigallocatechin gallate；EGCG)作為透明質酸酶之抑制劑，評估山竹果水萃取物抑制透明質酸酶的活性。

此實施例係將濃度3000 unit的透明質酸酶分別與EGCG(50μg/mL；作為對照組)、實施例一之山竹果殼水萃取物(100μg/mL)及山竹全果水萃取物(1000μg/mL)混合後，在25℃下反應2小時，進行十二烷基磺酸鈉聚丙烯醯胺(SDS page)凝膠電泳分析，其中SDS page凝膠電泳的技術應為本發明所屬技術領域中具有通常知識者所熟知，在此不另贅述。待電泳結束後，將電泳槽中之膠片取出，浸泡於清洗緩衝溶液(washing buffer)中，於室溫震盪清洗0.5小時後，移除清洗緩衝溶液，再加入反應緩衝溶液(reaction buffer)，於37℃水浴中震盪反應18小時。反應完畢後，將膠片取出，浸泡於0.5%的阿爾辛藍染液(Alcian blue solution)中震盪染色0.5小時後，再浸泡於褪染緩衝溶液(destaining buffer)中，褪染6小時至8小時直到色帶(band)清晰可見為止。使用影像擷取分析系統拍下電泳膠片，其結果如圖1A所示。圖1A再進行影像分析，由各色帶的訊號強弱與控制組相比，計算出透明質酸酶活性的抑制百分比(%)，其結果如圖1B所示。如抑制百分比越高，代表抑制透明質酸酶活性的能力越佳。

請參閱圖1A，其為利用山竹果水萃取物抑制透明質酸酶活性之SDS page凝膠電泳圖。其中，電泳泳道(lane)由左至右為添加EGCG(50μg/mL)(對照組)、緩衝溶液(控制組)、山竹果殼水萃取物(100μg/mL)及山竹全果水萃取物(1000μg/mL)之透明質酸酶溶液。

請參閱圖1B，其係繪示圖1A之抑制透明質酸酶活性的直條圖。其中，X軸由左至右代表添加EGCG(50μg/mL)(對照組)、緩衝溶液(控制組)、山竹果殼水萃取物(100μg/mL)及山竹全果水萃取物(1000μg/mL)之透明質酸酶溶液。Y軸為抑制透明質酸酶活性的百分比(%)。在圖1B中，以平均值±標準偏差(SD)表示數值(n=3)。圖號*代表與緩衝溶劑處理組(控制組，作為0%)相比，該組別在統計上具有顯著差異性(p<0.05)。

由圖1A及圖1B之結果顯示，相較於控制組，山竹果殼水萃取物、山竹全果水萃取物及EGCG皆具有抑制透明質酸酶的活性，且山竹果殼水萃取物抑制透明質酸酶活性的效果與EGCG相當，證實山竹果水萃取物具有抑制透明質酸酶之活性。

實施例三：山竹果水萃取物保護DNA效果的評估

羥基自由基由過氧化氫(H₂O₂)及/或UVB照射下經光解作用後形成，攻擊DNA並使其結構受損。本實施例分別利用過氧化氫及/或UVB照射，模擬自由基對超螺旋型(supercoiled；SC)的pUC119質體DNA之傷害，使超螺旋型DNA受損而形成開環型(open circular；OC)或線型(linear；LC)的結構，由超螺旋型DNA的比例評估山竹果水萃取物保護DNA的效果。

此實施例先於pUC119(購自Addgene)質體DNA中不添加(控制組與氧化及UVB傷害組)或添加不同濃度(100μg/mL至1000μg/mL)的實施例一之山竹果水萃取物，再將pUC119質體DNA不暴露(控制組)或暴露於0.1mM之過氧化氫後，分別不照射(控制組)或照射劑量20mJ/cm²之UVB，接著利用濃度0.8%之瓊脂凝膠進行電泳30分鐘。使用影像擷取分析系統拍下電泳膠片，其結果如圖2A所示。圖2A經影像分析軟體計算出各色帶的強度後，以控制組的超螺旋型DNA之色帶強度作為100%，換算各組的百分，其結果如圖2B所示。如超螺旋型DNA的百分比越高，代表山竹果水萃取物保護DNA的能力越佳。

請參閱圖2A，其為顯示在過氧化氫及/或UVB的處理下，山竹果水萃取物保護DNA之核酸電泳圖。其中，電泳泳道由左至右為未經處理之pUC119質體DNA(控制組)；同時施予過氧化氫與UVB之pUC119質體DNA(氧化及UVB傷害組)；同時施予過氧化氫、UVB與山竹果殼水萃取物(100μg/mL、250μg/mL及500μg/mL)之pUC119質體DNA；同時施予過氧化氫、UVB與山竹全果水萃取物(500μg/mL及1000μg/mL)之pUC119質體DNA。

請參閱圖2B，其係繪示圖2A各組之超螺旋型DNA的百分比的直條圖。其中，X軸由左至右代表未經處理之pUC119質體DNA(控制組)；同時施予過氧化氫與UVB之pUC119質體DNA(氧化及UVB傷害組)；同時施予過氧化氫、UVB與山竹果殼水萃取物(100μg/mL、250μg/mL及500μg/mL)之pUC119質體DNA；同時施予過氧化氫、UVB與山竹全果水萃取物(500μg/mL及1000μg/mL)之pUC119質體DNA。Y軸代表超螺旋型DNA之百分比(%)。在圖2B中，以平均值±標準偏差(SD)表示數值(n=3)。圖號*代表與同時施予過氧化氫及UVB之pUC119質體DNA(氧化及UVB傷害組)相比，該組別在統計上具有顯著差異性(p<0.05)。

由圖2A及圖2B之結果顯示，相較於氧化及UVB傷害組，山竹全果水萃取物之超螺旋型DNA含量較高，具有保護DNA抗氧化及避免DNA損傷的活性。

實施例四：山竹果水萃取物保護HaCaT細胞之的評估

此實施例係將經照射UVB的人類皮膚角質細胞株(HaCaT；國立成功大學醫學院許漢銘醫師提供)(下同)與山竹果水萃取物共培養後，由HaCaT細胞的存活率評估山竹果水萃取物對細胞的保護能力。

此實施例係將HaCaT細胞株以10,000細胞/孔之細胞濃度接種於96孔細胞培養盤中培養24小時後，移除細胞上清液，更換無血清之新鮮培養液，置於細胞培養箱中培養。培養4小時後，移除上清液並以磷酸鹽緩衝液(Phosphate buffered saline；PBS)潤洗後抽乾。接著，利用20mJ/cm²照射能量之UVB照射或不照射(控制組)上述細胞達累積照射能量後，立即於96孔細胞培養盤之每孔細胞中，加入不添加(控制組與UVB組)或添加不同濃度(50μg/mL至1000μg/mL)的實施例一之山竹果水萃取物之新鮮無血清培養液，繼續培養4小時。然後，利用溴化3-(4,5-二甲基-2-噻唑基)-2,5-二苯基四氮唑[3-(4,5-dimethylthiazol-2-yl)-2,5-diphenyltetrazolium bromide；MTT；5mg/mL]評估細胞存活率(cell viability)。於96孔細胞培養盤中，每孔細胞加入10μL之MTT，於37℃且5%之CO₂下培養4小時後，移除上清液，再加入100μL之二甲亞碸(dimethyl sulfoxide；DMSO)溶解MTT甲臢(MTT formazan)，震盪5分鐘後，測量其於波長570nm的吸光值以計算細胞存活率。上述吸光值之測量可根據製造商(例如CellTiter 96 AQ,Promega,Madison.WI,U.S.A.)提供之使用手冊，利用例如多功能微量盤測讀機(Multi-Detection Microplate Reader；Synergy^TM2，BioTek Instruments,Inc.,U.S.A.)進行。以未經處理之HaCaT細胞(控制組)之吸光值作為100%，計算各組吸光值，其結果如圖3所示。如細胞存活率越高，代表山竹果水萃取物保護HaCaT細胞的能力越佳。

請參閱圖3，其係繪示根據本發明一實施例之經UVB照射的HaCaT細胞與山竹果水萃取物共培養後的細胞存活率之直條圖。其中，X軸由左至右依序為未經處理組(控制組)；施予UVB之處理組(UVB組)；施予UVB與山竹果殼水萃取物(50μg/mL、100μg/mL、250μg/mL及500μg/mL)之處理組；施予UVB與山竹全果水萃取物(500μg/mL及1000μg/mL)之處理組。Y軸為HaCaT細胞存活率之相對百分比(%)。在圖3中，以平均值±標準偏差(SD)表示數值(n=3)。圖號*代表與僅施予UVB之處理組(UVB組)相比，該組別在統計上具有顯著差異性(p<0.05)。

由圖3之結果顯示，HaCaT細胞在施予UVB後，細胞存活率下降至65%。而在在施予UVB的HaCaT細胞中添加高濃度(500μg/rmL及1000μg/mL)的山竹果殼水萃取物共培養後，細胞存活率隨著明顯提升，證實山竹果水萃取物可保護HaCaT細胞。

實施例五：山竹果萃取物之細胞毒性的評估

此實施例係在HaCaT細胞不添加(控制組)或添加山竹果萃取物後共培養，以細胞存活率評估山竹果萃取物之細胞毒性。

在此實施中，將HaCaT細胞株以10,000細胞/孔之細胞濃度接種於96孔細胞培養盤中培養24小時後，於96孔細胞培養盤之每孔細胞中，加入不添加(控制組)或添加不同濃度(50μg/mL至1000μg/mL)的實施例一之山竹果萃取物之血清新鮮培養液，繼續培養24小時。然後，利用與實施例四相同之MTT法評估細胞存活率。以未經任何處理之HaCaT細胞(控制組)之細胞存活率作為100%，計算細胞在不同濃度之山竹果萃取物下的存活率，結果如圖4所示。如細胞存活率越高，代表山竹果萃取物對於細胞的毒性越低。

請參閱圖4，其係繪示根據本發明一實施例之山竹果萃取物與HaCaT細胞共培養的細胞存活率之直條圖。其中，X軸由左至右分別代表未經處理組(控制組)及山竹果殼水萃取物(50μg/mL、100μg/mL、250μg/mL及500μg/mL)處理組、山竹果殼乙醇萃取物(50μg/mL、100μg/mL、250μg/mL及500μg/mL)處理組、山竹全果水萃取物(500μg/mL及1000μg/mL)處理組與山竹全果乙醇萃取物(500μg/mL及1000μg/mL)處理組。Y軸代表HaCaT細胞株之細胞存活率(%)。

由圖4之結果顯示，與50μg/mL至1000μg/mL之山竹果殼水萃取物共培養的HaCaT細胞，細胞的存活率均維持在90%以上，顯示50μg/mL至1000μg/mL之山竹果殼水萃取物不具細胞毒性。

其次，山竹果殼乙醇萃取物在濃度50μg/mL時，細胞存活率為90%。惟當濃度調升至100μg/mL時，細胞存活率驟降至20%以下，顯示濃度50μg/mL以下之山竹果殼乙醇萃取物不具細胞毒性。

再者，山竹全果水萃取物在高濃度(500μg/mL及1000μg/mL)時，細胞存活率均維持在80%以上，顯示500μg/mL至1000μg/mL之山竹全果水萃取物不具細胞毒性。

又山竹全果乙醇萃取物在高濃度(500μg/mL及1000μg/mL)時，細胞存活率亦均維持在80%以上，顯示500μg/mL至1000μg/mL之山竹全果乙醇萃取物不具細胞毒性。

實施例六：山竹果萃取物清除自由基之活性的評估

自由基在身體維持正常生理功能上扮演重要的角色，惟自由基的活性高且不穩定，過多的自由基會和體內的細胞組織產生氧化反應，導致細胞組織失去正常功能，甚至破壞DNA。此實施例利用2,2-二苯基-1-苦味胼基(2,2-Diphenyl-1-picryl-hydrazyl；DPPH)及2,2'-聯氮雙(3-乙基苯並噻唑啉-6-磺酸)二銨鹽[2,2’-azino-bis-(3-ethylbenzthiazoline-6-sulfonic acid)；ABTS]作為自由基，評估山竹果萃取物清除自由基的活性。

1. DPPH自由基清除活性(DPPH free radical scavenging activity)測定

DPPH自由基是一種穩定的自由基，在甲醇或乙醇溶液中呈藍紫色，且於波長517nm有最大吸光值。當自由基清除劑存在時，DPPH自由基的顏色由藍紫轉為淡黃色，吸光值也隨之降低。因此，在含有DPPH自由基之甲醇或乙醇溶液中，不添加(控制組)或添加不同濃度(50μg/mL至1000μg/mL)的實施例一之山竹果萃取物後，測量其於波長517nm吸光值的變化，再與控制組之吸光值(以100%計算)比較，可得出自由基之清除率(%)，藉此評估山竹果萃取物之抗氧化力。測得的吸光值越低時，代表山竹果萃取物的抗氧化能力越佳，則DPPH自由基之清除率越高。此實施例係以下式(II)計算DPPH自由基之清除率，其結果如圖5A所示：DPPH自由基之清除率(%)=(1-A517 nm_sample/A517 nm_blank)×100% (II)

請參閱圖5A，其係繪示根據本發明一實施例之山竹果萃取物於體外清除DPPH自由基的清除率之直條圖。在圖5A中，X軸由左至右分別代表未經處理組(控制組)及添加山竹果殼水萃取物(50μg/mL、100μg/mL、250μg/mL及500μg/mL)處理組、山竹果殼乙醇萃取物(50μg/mL、100μg/mL、250μg/mL及500μg/mL)處理組、山竹全果水萃取物(100μg/mL、250μg/mL、500μg/mL及1000μg/mL)處理組、山竹全果乙醇萃取物(100μg/mL、250μg/mL、500μg/mL及1000μg/mL)處理組與抗壞血酸(25μg/mL；ascorbic acid，AA)(下同)之處理組。Y軸代表DPPH自由基之清除率(%)。其次，圖5A係以平均值±標準偏差(SD)表示數值(n=3)。圖號*代表與控制組相比，該組別在統計上具有顯著差異性(p<0.05)。

由圖5A之結果顯示，抗壞血酸的DPPH自由基之清除率為85%。而濃度50μg/mL之山竹果殼水萃取物可清除超過60%的DPPH自由基；濃度250μg/mL之山竹果殼水萃取物的DPPH自由基清除率與抗壞血酸相當；濃度500μg/mL之山竹果殼水萃取物的DPPH自由基之清除率高於抗壞血酸，顯示山竹果殼水萃取物具有極佳的自由基清除活性。

其次，濃度50μg/mL之山竹果殼乙醇萃取物可清除超過70%的DPPH自由基；濃度100μg/mL之山竹果殼乙醇萃取物，其DPPH自由基清除率與抗壞血酸相當，顯示山竹果殼乙醇萃取物具有極佳的自由基清除活性。

再者，山竹全果水萃取物的濃度高於250μg/mL時，可顯著清除DPPH自由基，顯示山竹全果水萃取物具有良好的自由基清除活性。

又山竹全果乙醇萃取物的濃度高於100μg/mL時，可顯著清除DPPH自由基，顯示山竹全果乙醇萃取物具有良好的自由基清除率。因此，由上述結果證實山竹果萃取物具有自由基清除活性。

2. ABTS自由基清除活性(ABTS free radical scavenging activity)測定

ABTS在過氧化酶(peroxidase)的催化下，會產生ABTS自由基，而呈現穩定的藍綠色，且於波長734nm有最大吸光值。因此藉由不添加(控制組)或添加不同濃度(50μg/mL至1000μg/mL)的實施例一之山竹果萃取物與ABTS自由基反應，經由測定波長734nm吸光值的變化，再與控制組之吸光值進行換算，得出特定濃度下之自由基之清除率，評估山竹果萃取物的抗氧化能力。當吸光值越低時，代表山竹果萃取物的抗氧化能力越佳，則ABTS自由基之清除率越高，其結果如圖5B所示。此實施例係以下式(III)計算ABTS自由基之清除率：ABTS自由基之清除率(%)=(1-A734 nm_sample/A734 nm_blank)×100% (III)

請參閱圖5B，其係繪示山竹果萃取物於體外清除自由基ABTS的效果之直條圖。其中，X軸由左至右分別代表未經處理(控制組)及添加山竹果殼水萃取物(50μg/mL、100μg/mL、250μg/mL及500μg/mL)處理組、山竹果殼乙醇萃取物(50μg/mL、100μg/mL、250μg/mL及500μg/mL)處理組、山竹全果水萃取物(100μg/mL、250μg/mL、500μg/mL及1000μg/mL)處理組、山竹全果乙醇萃取物(100μg/mL、250μg/mL、500μg/mL及1000μg/mL)處理組與抗壞血酸(25μg/mL)之處理組。Y軸代表ABTS自由基之清除率(%)。在圖5B中，以平均值±標準偏差(SD)表示數值(n=3)。圖號*代表與控制組相比，該組別在統計上具有顯著差異性(p<0.05)。

由圖5B之結果顯示，抗壞血酸的ABTS自由基之清除率約為85%。而濃度50μg/mL之山竹果殼水萃取物可清除超過60%的ABTS自由基；濃度為100μg/mL之山竹果殼水萃取物的ABTS自由基清除率與抗壞血酸相當；濃度250μg/mL至500μg/mL之山竹果殼水萃取物的ABTS自由基清除率接近100%，顯示山竹果殼水萃取物具有極佳的自由基清除活性。

其次，濃度50μg/mL之山竹果殼乙醇萃取物可清除超過80%的ABTS自由基，且隨著濃度增加而遞增；濃度100μg/mL之山竹果殼乙醇萃取物，其ABTS自由基清除率超過抗壞血酸；濃度250μg/mL至500μg/mL之山竹果殼水萃取物的ABTS自由基清除率接近100%，顯示山竹果殼乙醇萃取物具有極佳的自由基清除活性。

再者，山竹全果水萃取物的濃度高於250μg/mL時，可顯著清除ABTS自由基，顯示山竹全果水萃取物具有良好的自由基清除活性。

又山竹全果乙醇萃取物的濃度高於100μg/mL時，可顯著清除ABTS自由基，顯示山竹全果乙醇萃取物具有良好的自由基清除率。因此，由上述結果證實山竹果萃取物具有自由基清除活性。

實施例七：山竹果萃取物之抗氧化力的評估

由於細胞內過氧化氫酶(catalase)可代謝細胞內過多的過氧化氫(H₂O₂)。本實施例係對HaCaT細胞不添加(控制組)或添加山竹果水萃取物後，藉由測定細胞內反應性含氧物種(ROS)及過氧化氫酶的活性，分析細胞內山竹果水萃取物的抗氧化力。

1.細胞內反應性含氧物種(ROS)的活性

2',7'-二氯螢光雙醋酸鹽(2',7'-dichlorofluorescin diacetate；DCFH-DA)螢光染劑被用來測定細胞內ROS的含量。DCFH-DA是一種穩定的非極性化合物，可自由通透細胞膜。當DCFH-DA進入細胞後，會被細胞內的脂酶(esterase)水解，形成具有極性的2’,7’-二氯二氫螢光素(2’,7’-dichlorodihydrofluorescin；DCFH)停留在細胞內。此時細胞內的ROS與DCFH產生氧化還原反應形成2’,7’-2’,7’-二氯螢光素(dichlorofluorescin；DCF)，以450nm至530nm波長激發後，產生的綠色螢光可在510nm至550nm被偵測出。

此實施例係將HaCaT細胞(10,000細胞/孔)培養在96孔細胞培養盤至少24小時，不添加(控制組與0.1mM H₂O₂組)或添加不同濃度(100μg/mL至1000μg/mL)的實施例一之山竹果水萃取物，與HaCaT細胞共培養24小時後，移除含待測物的培養液。加入0.1mM過氧化氫反應1小時誘導ROS產生。移除過氧化氫培養液後，再加入含有10μM DCFH-DA(購自Sigma)的培養液於37℃反應60分鐘。用PBS清洗兩次後，利用螢光光度計，例如Synergy^TM 2多功能微量盤測讀機(Multi-Mode Microplate Reader；BioTek,U.S.A.)於波長504nm激發波長，於524nm發射波長偵測DCF螢光表現。以未經處理之HaCaT細胞(控制組)之細胞內ROS的濃度作為100%，換算出各組細胞內ROS活性(%)，其結果如圖6A所示。如ROS的活性越低，代表細胞內山竹果水萃取物的抗氧化力越高。

請參閱圖6A，其係繪示山竹果萃取物抑制細胞內ROS活性之直條圖。其中，X軸由左至右分別代表未經處理之HaCaT細胞(控制組)；添加過氧化氫之HaCaT細胞(0.1 mM H₂O₂組)；同時添加過氧化氫與山竹果殼水萃取物(100μg/mL、250μg/mL及500μg/mL)之HaCaT細胞；同時添加過氧化氫與山竹全果水萃取物(500μg/mL及1000μg/mL)之HaCaT細胞；同時添加過氧化氫與抗壞血酸(25μg/mL)之HaCaT細胞。Y軸為細胞內ROS之活性的相對比率(%)。在圖6A中，以平均值±標準偏差(SD)表示數值(n=3)。圖號*代表與添加過氧化氫之HaCaT細胞組(0.1mM H₂O₂組)相比，該組別在統計上具有顯著差異性(p<0.05)。

由圖6A之結果顯示，添加抗壞血酸使HaCaT細胞內的ROS之活性下降至近100%。而HaCaT細胞添加低濃度(100μg/mL)之山竹果殼水萃取物後，ROS之活性下降至低於抗壞血酸組，且ROS之活性隨著山竹果殼水萃取物的濃度增加而遞減，顯示山竹果殼水萃取物具有極佳的抗氧化力。

其次，添加濃度500μg/mL之山竹全果水萃取物後，HaCaT細胞內ROS之活性下降至低於抗壞血酸組，且ROS之活性隨著山竹果殼水萃取物的濃度增加而遞減，顯示山山竹全果水萃取物具有極佳的抗氧化力。因此，由上述結果證實，以水萃取之山竹果萃取物具有細胞內抗氧化力，可抑制細胞內反應性含氧物種之含量而減少對細胞的傷害。

2. HaCaT細胞內過氧化氫酶(catalase)的活性

此實施例係將HaCaT細胞(10,000細胞/孔)培養在10平方公分細胞培養盤至少24小時，不添加(控制組與0.1mM H₂O₂組)或添加不同濃度(100μg/mL至1000μg/mL)的實施例一之山竹果水萃取物，與HaCaT細胞共培養24小時後，移除含待測物的培養液。以5mM過氧化氫反應1 小時誘導ROS產生。移除培養液後，收集細胞，離心並除去上清液，加入PBS使細胞懸浮後，進行冷凍和解凍循環三次使細胞裂解後，離心並取得上清液，進行過氧化氫酶測定。取40μg細胞裂解物混合10μL、5mM過氧化氫，於波長240nm進行3分鐘內之吸光值變化測定，以測定過氧化氫酶的活性，以未經處理之HaCaT細胞(控制組)之過氧化氫酶的活性作為100%，換算出各組細胞內的過氧化氫酶活性(%)，其結果如圖6B所示。如過氧化氫酶活性越高，代表細胞內山竹果水萃取物的抗氧化力越高。

請參閱圖6B，其係繪示山竹果萃取物抑制細胞內過氧化氫酶(catalase)活性之直條圖。其中，X軸由左至右分別代表未經處理組之HaCaT細胞(控制組)；添加過氧化氫之HaCaT細胞(0.1mM H₂O₂組)；添加過氧化氫與山竹果殼水萃取物(100μg/mL、250μg/mL及500μg/mL)之HaCaT細胞；添加過氧化氫與山竹全果水萃取物(500μg/mL及1000μg/mL)之HaCaT細胞；及添加過氧化氫與抗壞血酸(25μg/mL)之HaCaT細胞。Y軸為細胞內過氧化氫酶之活性的相對比率(%)。在圖6B中，以平均值±標準偏差(SD)表示數值(n=3)。圖號*代表與添加過氧化氫之HaCaT細胞(0.1mM H₂O₂組)相比，該組別在統計上具有顯著差異性(p<0.05)。

由圖6B之結果顯示，添加抗壞血酸使HaCaT細胞內過氧化氫酶之活性上升至100%以上。而在HaCaT細胞中添加低濃度(100μg/mL)的山竹果殼水萃取物後，過氧化氫酶的活性上升至高於抗壞血酸組，顯示山竹果殼水萃取物具有極佳的抗氧化力。因此，由上述結果證實山竹果殼水萃取物可提升細胞內過氧化氫酶之活性並抑制細胞內ROS之含量，而減少對細胞的傷害。

實施例八：山竹果水萃取物抑制酪胺酸酶活性的評估

細胞之黑色素(melanogenesis)主要透過α-黑色素細胞刺激素(α-melanocyte-stimulating hormone；α-MSH)活化酪胺酸酶(tyrosinase)反應生成。反應途徑為酪胺酸(tyrosine)經酪胺酸酶催化形成多巴二羥苯丙氨酸(dihydroxyphenylalanine；DOPA)，DOPA再度經酪胺酸酶催化則形成多巴醌(DOPAquinone)，進而引起黑色素的合成。藉由抑制酪胺酸酶的活性，可減少黑色素的合成。本實施例係由蘑菇中取得之蘑菇酪胺酸酶，進行體外及細胞內之蘑菇酪胺酸酶活性抑制測試。

1.體外抑制蘑菇酪胺酸酶活性之分析

首先，不添加(控制組)或添加不同濃度(100μg/mL至1000μg/mL)的實施例一之山竹果水萃取物與50個酵素單位(unit)之蘑菇酪胺酸酶溶液，於室溫下反應10分鐘，以475nm波長下測定蘑菇酪胺酸酶之背景值。隨後，避光加入85μL之12.5mM L-DOPA溶液於室溫下混合。利用分光光度計，例如Synergy^TM 2多功能微量盤測讀機(Multi-Mode Microplate Reader；BioTek,U.S.A.)，測量各孔的蘑菇酪胺酸酶之吸光值。再與控制組之吸光值進行換算，得出特定濃度下之蘑菇酪胺酸酶活性抑制率，其結果如圖7A所示。此實施例係以下式(IV)計算細胞外蘑菇酪胺酸酶之抑制活性：蘑菇酪胺酸酶活性抑制率(%)=〔Ab-(At-A0)〕/Ab×100% (IV)

在式(IV)中，Ab代表含溶劑、酪胺酸、PBS及酪胺酸酶，但不含山竹果萃取物或抗壞血酸；At代表含山竹果萃取物及酪胺酸、PBS及酪胺酸酶；而A0代表含山竹果萃取物或抗壞血酸、酪胺酸及PBS，但不含酪胺酸酶。

請參閱圖7A，其係繪示山竹果水萃取物於體外抑制酪胺酸酶活性之直條圖。其中，X軸由左至右分別代表未經處理(控制組)及添加山竹果殼水萃取物(100μg/mL、250μg/mL及500μg/mL)、山竹全果水萃取物(500μg/mL及1000μg/mL)與抗壞血酸(50μg/mL)之蘑菇酪胺酸酶溶液。Y軸為細胞外蘑菇酪胺酸酶之抑制活性的相對比率(%)。在圖7A中，以平均值±標準偏差(SD)表示數值(n=3)。圖號*代表與未經處理之蘑菇酪胺酸酶溶液(控制組)相比，該組別在統計上具有顯著差異性(p<0.05)。

結果圖7A之結果顯示，以山竹果殼水萃取物在濃度100μg/mL時，可抑制約50%的蘑菇酪胺酸酶活性，且抑制細胞外蘑菇酪胺酸酶的活性之相對比率，與山竹果殼水萃取物的濃度呈正相關，顯示山竹果殼水萃取物具有酪胺酸酶之抑制活性。

其次，高濃度(500μg/mL及1000μg/mL)之山竹全果水萃取物顯著地具有細胞外蘑菇酪胺酸酶之抑制活性。因此，由上述結果證實，山竹果水萃取物具有酪胺酸酶之抑制活性。

2.細胞內抑制酪胺酸酶活性之分析

此實施例係評估黑色素癌細胞B16F10(寄存編號：BCRC 60031)的細胞內酪胺酸酶活性之測定。取B16F10細胞(5×10⁴細胞/孔)及100nM的α-MSH於24孔細胞培養盤中，於37℃、5% CO₂中培養24小時後，不添加(控制組)或添加10μl不同濃度(100μg/mL至1000μg/mL)的實施例一之山竹果萃取物，再於37℃，5% CO₂中培養24小時後，將上述細胞以PBS清洗後抽乾後，加入100μL之1N NaOH溶解細胞後，利用分光光度計，例如上述之多功能微量盤測讀機，測量各孔細胞溶解液於波長405nm下的吸光值。以未經處理之B16F10細胞(控制組)之酪胺酸酶活性作為100%，換算出各組細胞內的酪胺酸酶活性(%)，其結果如圖7B所示。

請參閱圖7B，其係繪示根據本發明一實施例之山竹果水萃取物對於細胞內酪胺酸酶活性之直條圖。其中，X軸由左至右分別代表未經處理之B16F10細胞(控制組)；添加α-MSH之B16F10細胞(α-MSH組)；添加α-MSH與山竹果殼水萃取物(100μg/mL、250μg/mL及500μg/mL)之B16F10細胞；添加α-MSH與山竹全果水萃取物(500μg/mL及1000μg/mL)之B16F10細胞；及添加α-MSH與熊果素(50μg/mL)之B16F10細胞。Y軸為細胞內酪胺酸酶活性的相對比率(%)。在圖7B中，以平均值±標準偏差(SD)表示數值(n=3)。圖號*代表與添加α-MSH之B16F10細胞(α-MSH組)相比，該組別在統計上具有顯著差異性(p<0.05)。

由圖7B之結果顯示，相較於控制組，B16F10細胞內之酪胺酸酶活性，在添加山竹果殼水萃取物、山竹全果水萃取物及熊果素後均有明顯下降。因此，上述結果證實，山竹果水萃取物具有抑制酪胺酸酶之活性。

綜而言之，由上述數個實施例證實，山竹果萃取物可用於抑制透明質酸酶活性、避免DNA受自由基損害及減少細胞受紫外線傷害。

需補充的是，本發明雖以特定的製程、特定的分析方法或特定儀器作為例示，說明本發明之山竹果萃取物用於製備具有抑制透明質酸酶及DNA修復的活性之組成物的用途，惟本發明所屬技術領域中任何具有通常知識者可知，本發明並不限於此，在不脫離本發明之精神和範圍內，本發明之山竹果萃取物用於製備具有抑制透明質酸酶及DNA修復的活性之組成物的用途亦可使用其他製程、其他的分析方法或其他儀器進行。

雖然本發明已以數個實施例揭露如上，然其並非用以限定本發明，在本發明所屬技術領域中任何具有通常知識者，在不脫離本發明之精神和範圍內，當可作各種之更動與潤飾，因此本發明之保護範圍當視後附之申請專利範圍所界定者為準。

Claims

一種山竹(Garcinia mangostana)果萃取物用於製備具有抑制透明質酸酶活性及DNA修復的活性之組成物的用途，其中該山竹果萃取物係以水或乙醇萃取一山竹全果或一山竹果殼所獲得，且該組成物包含50μg/mL至小於1000μg/mL之該山竹果萃取物。
如申請專利範圍第1項所述之山竹果萃取物用於製備具有抑制透明質酸酶活性及DNA修復的活性之組成物的用途，其中該組成物包含100μg/mL至小於1000μg/mL之該山竹果萃取物。
如申請專利範圍第1項所述之山竹果萃取物用於製備具有抑制透明質酸酶活性及DNA修復的活性之組成物的用途，其中該組成物包含100μg/mL至500μg/mL之由該山竹果殼萃取之一山竹果水萃取物。
如申請專利範圍第1項所述之山竹果萃取物用於製備具有抑制透明質酸酶活性及DNA修復的活性之組成物的用途，其中該組成物包含500μg/mL至小於1000μg/mL之由該山竹全果萃取之一山竹果水萃取物。
一種抑制透明質酸酶之組成物，包含以一山竹果萃取物為一有效成分，其中該山竹果萃取物係以水或乙醇萃取一山竹全果或一山竹果殼所獲得，且該組成物包含50μg/mL至小於1000μg/mL之該山竹果萃取物。
一種修復DNA之組成物，包含以山竹果萃取物為一有效成分，其中該山竹果萃取物係以水或乙醇萃取一山竹全果或一山竹果殼所獲得，且該組成物包含50μg/mL至小於1000μg/mL之該山竹果萃取物。