TWI684602B - 免疫原性肽組合物 - Google Patents
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Abstract
本發明係關於能夠與主要組織相容性複合體I類分子結合以在個體中誘發抗癌免疫反應之肽組合物。特定言之，肽組合物包含至少四連接盒1肽及黑色素瘤抗原家族D4b肽。本發明另外係關於肽組合物及肽疫苗之用途，其用於在該個體中誘發該抗癌免疫反應。
Description
本發明係關於用於增強有需要之患者之抗腫瘤反應的肽組合物。
頭頸鱗狀細胞癌(HNSCC)為肺癌、乳癌、胃癌、結腸直腸癌及肝癌之後的第六最常見之癌症(Ferlay等人，2015)。由於鱗狀細胞發現於皮膚外層及黏膜中，HNSCC產生於口腔、鼻子及咽喉之黏膜中。
目前，治療選擇仍限於手術、放射線療法及化學療法。較新類型之癌症療法選擇，靶向療法包括使用靶向癌細胞之藥物。當前，由美國食品藥物管理局(FDA)唯一批准用於HNSCC之靶向療法為西妥昔單抗(cetuximab)，其藉由充當表皮成長因子受體(EGFR)之抑制劑而靶向癌細胞。當患者接受化學療法與西妥昔單抗之治療組合時，相比於僅接受化學療法之患者，總存活持續時間的中值提高2.6個月(Vermorken等人，2008)。
鑒於此等患者之存活持續時間僅略微地提高，此後便批准替代癌症治療。免疫療法(依賴於患者之免疫系統，藉由刺激免疫反應而對抗癌症之治療)包括以不同方式操作之不同治療。一些免疫療法治療用於移除身體之免疫系統的抑制，而其他免疫療法治療用於訓練免疫系統特異性地偵測及攻擊癌細胞。
免疫療法已展示為治療HNSCC之似乎合理的方法，因為新興的研究已展示HNSCC患者中存在高突變負載及高含量之腫瘤浸潤淋巴細胞。Nasman等人，2012進一步報導浸潤CD8+ T細胞之高密度與患有人類乳突狀瘤病毒感染陽性(HPV+)以及陰性(HPV-)扁桃體鱗狀細胞癌之患者之臨床結果之間的正相關，突顯HNSCC之免疫原性特性。
FDA批准之免疫療法治療之兩個實例為尼沃單抗(nivolumab)及帕博利珠單抗(pembrolizumab)，其均為用於治療晚期黑色素瘤、非小細胞肺癌及腎細胞癌之抗程式性細胞死亡蛋白質1(PD-1)單株抗體。此等免疫檢查點抑制劑已在治療頭頸癌患者中顯示有前景的結果，其中相比於標準療法組中16%之存活率，當一組HNSCC患者接受尼沃單抗時，HNSCC患者之總存活率為36%。另外，相比於後一組中之患者，前一組中之此等患者之存活期長2.4個月，其中報導較少3級或4級事件(Ferris等人，2016)。
接受帕博利珠單抗以治療復發性或轉移性HNSCC之患者中之客觀反應率，亦即腫瘤尺寸減小之完全反應或部分反應為16%。
此等結果為令人鼓舞的，但不管可用檢查點抑制劑免疫療法之有前景的功效，大比例之治療患者有待回應於療法。儘管未完全理解，咸信個體中不存在預先存在的強抗腫瘤免疫反應可阻止藥物之效率，因為抗腫瘤免疫性在影響腫瘤分期及控制癌轉移中重要。
因而，因此需要能夠增強個體之抗腫瘤免疫反應的替代免疫療法方法，其因此增強當前免疫療法之功效。
本發明之目標因此為提供能夠在患者中誘發抗癌反應之肽組合物。
本發明之另一目標為提供能夠延遲患者中之腫瘤生長的肽組合物。
本發明之另一目標為提供用於在患者中誘發抗癌免疫反應之肽疫苗。
本發明之此等及其他目標係經由使用肽組合物達成，其特徵在於肽組合物包含至少四連接盒1(FJX1)肽及黑色素瘤抗原家族D4b(MAGED4b)肽。
更特定言之，根據本發明，肽組合物PV1包含FJX1肽(F1)及MAGED4b肽(M6)，其與主要組織相容性複合體(MHC)I類分子結合以在個體中誘發抗癌免疫反應。
本發明之第二態樣係關於根據PV1之肽疫苗，其中該肽疫苗包含至少M6肽及F1肽以藉由與MHC I類分子結合而在個體中誘發抗癌免疫反應。
本發明另外係關於一定量F1及M6肽之用途，其用於製造供治療有需要之個體之頭頸鱗狀細胞癌(HNSCC)、乳癌、結腸癌、直腸癌、肺癌、前列腺癌或任何其他表現FJX1或/及MAGED4B之癌症類型中之任一者或組合用之藥物，其中該藥物能夠與MHC I類分子結合以在個體中誘發抗癌免疫反應。
由於F1及M6肽為MHC I類特異性的，因此較佳的是肽組合物僅提供至具有匹配HLA亞型之個體。
圖1係關於MAGED4b及FJX1於HNSCC樣品中之表現。圖1(a)說明關於IHC染色之強度評分的代表性影像。圖1(b)顯示具有FJX1及MAGED4b表達之患者的百分比。
圖2說明HNSCC患者中之肽特異性T細胞群體。在減去非肽負載對照之後顯示識別肽負載二聚體(CD8、TCR及IgG1陽性T淋巴細胞)之平均抗原特異性T細胞群體。負載有FJX1(F1)、MAGED4b(M6)及PV1(M6及F1)肽之二聚體蛋白質可藉由來自HNSCC患者之固有T細胞識別。如在圖2中所見，PV1肽可藉由相比於單一肽(單獨的F1或M6)之較高T細胞群體識別。
圖3說明在藉由PV1肽活體外刺激之後，HNSCC患者中分泌較高含量之細胞介素。圖3(a)及圖3(b)分別顯示離體(ex vivo)及細胞毒性(CTX)ELISPOT檢定中之干擾素γ(IFNγ)分泌及顆粒酶B分泌。
圖4說明PV1肽在表現不同表現量之FJX1及MAGED4b之患者中引發T細胞反應之功效。圖4(a)顯示腫瘤組織之FJX1及MAGED4b染色之不同強度的代表性影像。圖4(b)指示回應於細胞毒性ELISPOT檢定中之PV1刺激的IFNγ及顆粒酶B分泌且與患者活體組織切片(biopsies)中之FJX1及MAGED4B表現量相關。圖4(c)顯示相比於具有可忽略的MAGED4B及FJX1表現之腫瘤，來自腫瘤高度表現至少1種靶抗原之患者的PBMC/T細胞更易於經刺激且回應於PV1刺激分泌較高含量之IFNγ及顆粒酶B分泌。
圖5顯示當相比於藉由格里斯檢定(Griess assay)量測之脂多醣(LPS)時，M6、F1及PV1肽不藉由巨噬細胞增加過度的非特異性發炎反應。
圖6顯示在小鼠中測試時，PV1肽之免疫原性。圖6(a)指示相比於暴露於非負載及無關肽負載二聚體時的僅基線或可忽略的反應，經PV1疫苗接種之小鼠顯示可針對PV1負載二聚體反應之T細胞的顯著增加。圖6(b)顯示經PV1疫苗接種之小鼠能夠在離體ELISPOT中識別呈遞PV1肽之T2細胞且以劑量依賴性方式誘發IFNγ分泌。
圖7(a)說明在疫苗接種時段期間，經疫苗接種小鼠之體重。圖7(b)顯示經疫苗接種小鼠之主要器官(心臟、肺、腎、肝及脾)之影像。
圖8指示相比於媒劑對照，經PV1肽疫苗接種之小鼠的腫瘤生長。
圖9(a)及9(b)分別顯示FJX1及MAGED4b蛋白質在OSCC及NPC細胞株中在mRNA水準下之過度表現。
圖10指示MAGED4b及FJX1在各種癌細胞株中在蛋白質水準下之表現。圖10(a)指示MAGED4b及FJX1於16個ORL細胞株(口腔癌細胞株)中之表現，圖10(b)顯示MAGED4b及FJX1於永生化NP/NPC細胞株(鼻咽(nasopharynx/nasopharyngeal)癌細胞株)中之表現。圖10(c)展示未在正常口腔角質細胞中偵測到MAGED4B之表現，同時偵測到低含量之FJX1之表現。
圖11(a)及11(b)顯示FJX1及MAGED4b在具有源自癌症基因組圖譜(TCGA)資料庫(https：//cancergenome.nih.gov/)之匹配正常樣品的一組HNSCC樣品中在轉錄組水準下之表現，其相對於TATA-盒結合蛋白(TBP)標準化。
圖12顯示MAGED4B及FJX1在包括肺癌(A549)、前列腺癌(PC3)、結腸直腸癌(HT-29、HCT-116)及乳癌(SKBR-3、MCF-7)細胞株之多個癌細胞株中在蛋白質水準下之表現。
現將以更詳細方式描述本發明之實施例，其中較佳實施例之實例及本發明之範疇將完全轉達給熟習此項技術者。然而，應理解，本揭示內容不意欲將本發明限制於所揭示之精確形式，而是提供以使得本揭示內容將徹底且完整。
肽疫苗(一種免疫療法形式)係基於致瘤抗原設計，且工作以針對個體中攜有相同抗原之腫瘤細胞刺激細胞毒性免疫反應。在使用肽疫苗優於其他免疫療法之若干優點中包含易於合成、誘發T細胞反應之功效及安全性，如在許多研究及試驗中所展示(Slingluff CL,Jr,2011)。
然而，現有肽疫苗儘管可靠地誘發T細胞反應，但在誘發臨床腫瘤消退中獲得之成功有限，已存在關於限制單一抗原肽疫苗之功效之抗原異質性及抗原損失的擔憂。因此，為了提高HNSCC中之肽疫苗成功率，應適應較寬免疫反應，尤其是可回應於多種抗原之免疫反應。
Yoshitake等人2015報導已指示當在HNSCC中同時使用多抗原疫苗時，實際上具有益處，因為相比於僅接受標準療法之患者，患者存活期延長1.4個月，自3.5個月延長至4.9個月。另外，相比於具有陰性細胞毒性T淋巴細胞(CTL)反應之患者，產生CTL反應之疫苗接種患者具有較長總存活期。同樣，此強有力地指示肽疫苗，特定言之多抗原肽疫苗能夠藉由對腫瘤細胞引發細胞毒性殺死效應而加強針對腫瘤細胞之患者免疫反應。
然而，多抗原肽疫苗之開發歸因於干擾而不容易。主要組織相容性複合體(MHC)分子對於獲得性免疫系統識別外來分子為必需的，且工作以結合至源自細胞表面上之病原體的抗原以藉由適當T細胞識別。當共投予
(co-administered)多抗原肽疫苗時，結合至相同MHC分子之疫苗之肽可彼此干擾，因為較低親和力肽與MHC分子之結合受較高親和力肽競爭性地抑制。此後便建議向身體之不同部分投予此等疫苗以降低干擾發生之機率。此方法仍然不實用，尤其當向患者投予之肽之數目增加時。
不管此事實，本申請案之發明人已成功地能夠展示此後稱為PV1之雙抗原肽組合物在使用收集自口腔癌及鼻咽癌個體之外周血液單核細胞(PBMC)活體外誘發抗腫瘤反應中，及在動物模型中之免疫原性及功效。特定言之，PV1包含至少兩種能夠與MHC I類分子結合以在個體中誘發抗癌免疫反應之肽。至少兩種肽包含源自四連接盒1(FJX1)及黑色素瘤抗原家族D4b(MAGED4b)之肽。
應理解，術語「FJX1」或「F1肽」係指基因、RNA產物或蛋白質產物且可互換地使用。
另外應理解，術語「MAGED4b」或「M6肽」係指基因、RNA產物或蛋白質產物，且可互換地使用。
亦應理解，術語「PV1」、「PV1組合物」及「PV1肽」係指M6及F1的DNA、RNA或蛋白質產物之組合且可互換地使用。
在產生此多抗原肽組合物期間，首先識別口腔癌及鼻咽癌個體中之MAGED4b及FJX1表現模式。獲得由HNSCC腫瘤樣品組成之組織微陣列且使用免疫組織化學(IHC)方法，藉由用抗MAGED4b及抗FJX1抗體探測組織切片而測定FJX1及MAGED4b之表現量。
HNSCC腫瘤樣品中量測之FJX1及MAGED4b之表現量顯示如下：表1：顯示表現MAGED4b或FJX1或兩者之個體的百分比
如上表中所見，幾乎所有個體(94.7%)之腫瘤組織樣品，無論獲自患有口腔癌(OSCC)之個體或患有鼻咽癌(NPC)之個體指示表現MAGED4b或FJX1。在收集之94個組織中，僅5個NPC組織不顯示FJX1或MAGED4b之表現。100%患有OSCC之個體表現FJX1或MAGED4b。
MAGED4b及FJX1於HNSCC樣品中之表現另外說明於圖1中，其說明MAGED4b及FJX1於HNSCC腫瘤組織樣品中之表現。抗體針對MAGED4b及FJX1之免疫反應性係基於具有陽性染色之腫瘤細胞的百分比；4點強度評分系統評分，該系統介於強度0(陰性)、強度1(弱)及強度2-3(強)範圍內，其描繪於圖1(a)中。圖1(b)反映由本發明人發現FJX1及MAGED4b表現於大於80%的早期及晚期OSCC及NPC腫瘤樣品中。
已在馬來西亞專利第MY-148542-A號及馬來西亞專利申請第PI 2011003259號(均由本發明人申請)中論述分別地，FJX1經顯示表現於鼻咽癌患者中且MAGED4b表現於口腔癌患者中。
然而，應突顯的是多抗原肽組合物情況下之困難(已在上文論述)為可能發生干擾，因為此等肽可彼此競爭結合至MHC分子，因此使得肽組合物之功效無效。儘管如此，將成功地顯示所揭示之PV1組合物中之F1及M6肽之組合情況相反且實際上增加肽組合物之功效，其將在下文詳述。
PV1包含源自FJX1及MAGED4b之肽，其中胺基酸序列如下表2及3中所列。除了確定肽組合之相容性之外，亦必要的是肽能夠與MHC I類分子結合以誘發抗癌免疫反應。
應瞭解，根據本申請案，FJX1及MAGD4b之肽序列之結構可經修飾或改變，修飾或改變包含肽序列中之胺基酸的刪除(deletion)、取代(substitution)或插入(insertion)。
由於FJX1及MAGED4b均基於人類白血球抗原A2(HLA-A2)抗原決定位所設計，因此僅血液樣品具有匹配HLA亞型之個體供本發明人使用。藉由使用藻紅素(phycoerythrin,PE)標記之抗HLA-A2抗體對PBMC樣品染色進行HLA-A2分型，且在流式細胞儀上分析。
為了維持此研究之精確性，包括陽性對照HLA-A2限制FluM衍生肽，及作為無關肽對照之HLA-A2限制人類免疫缺陷病毒(HIV)肽。兩種對照之胺基酸序列如下所示：
肽純度係使用高效液相層析(HPLC)測定，所有純度均高於80%。
根據本發明，肽可以合成方式製備或自天然來源，諸如天然腫瘤或病原生物體分離。
在PV1之免疫原性(immunogenicity)測定中，首先使用F1、M6及PV1肽測試經分離之PBMC中之內源性FJX1及MAGED4b特異性CD8+T細胞之存在，其中FluM及HIV肽分別在二聚體檢定中用作陽性及無關肽對照。首先藉由培育二聚人類HLA-A2：Ig融合蛋白質、ß2-微球蛋白及肽(F1、M6、PV1、FluM或HIV)之混合物隔夜而製備肽特異性二聚體。次日，將新分離的PBMC添加至製備之二聚體且培育，隨後用磷酸鹽緩衝鹽水(PBS)洗滌。接著將PBMC再懸浮於PBS中且用異硫氰酸螢光素(fluorescein isothiocyannate,FITC)標記之抗IgG1、PE標記之抗CD8及別藻藍蛋白(allophycocyanin,APC)標記之抗TCRα/β抗體染色。接著洗滌PBMC且再懸浮於PBS中且進行流式細胞測量術分析，其中肽特異性CD8+T細胞之存在係藉由評估為經IgG1-FITC、CD8-PE及TCRα/β-APC抗體陽性染色之PBMC確定。對給定肽具有特異性之CD8+T細胞之百分比計算為減去關於無肽情況下之染色獲得之值之後的肽二聚體陽性CD8+T細胞之值。
如圖2中所見，顯示識別減去非肽負載對照之後的肽負載二聚體之平均抗原特異性T細胞群體。負載有F1、M6及PV1肽之二聚體蛋白質可藉由來自HNSCC個體之固有T細胞識別，其中7.1%之T細胞識別PV1肽，相比於單獨的單一肽M6或F1之最高T細胞群體。此因此指示當組合使用兩種肽時，PV1具有較強免疫原性。
接著，離體(ex vivo)及細胞毒性酶聯免疫斑點(Enzyme-Linked ImmunoSpot,ELISPOT)檢定分別用於評估干擾素γ(IFNγ)及顆粒酶B細胞介素
分泌T細胞在單細胞水準之存在，及研究源自患者之肽脈衝CTL對過度表現靶抗原之靶細胞株之反應。
在離體ELISPOT檢定期間，PBMC與介白素7(IL-7)及介白素12(IL-12)蛋白質一起在培養基中培育，隨後用鹽溶液洗滌PBMC且將其再懸浮於完全培養基中。接著，懸浮細胞分別與F1、M6、PV1、FluM及HIV肽混合且在抗人類IFNγ及顆粒酶B塗佈之ELISPOT盤中培育。接著在略微修改製造商說明書之情況下進行ELISPOT檢定。特定言之，將懸浮細胞置於對應的ELISPOT盤上隔夜以捕獲釋放之細胞介素。次日，IFNγ及顆粒酶B偵測抗體稀釋於含有人類AB血清之PBS中且在各對應盤中培育。接著洗滌且添加經稀釋抗生蛋白鏈菌素標記之二級抗體且進一步培育該等盤。接著添加硝基藍四唑鎓、5-溴-4-氯-3'-吲哚磷酸(BCIP/NBT)以及受質以使由細胞介素分泌T細胞形成之斑點可見。最後，偵測之斑點經定量及分析，其中肽特異性CTL係藉由減去未暴露於肽之背景對照孔中形成之斑點計算，且其中FluM及HIV肽分別用作陽性及無關肽對照。
細胞毒性ELISPOT檢定用於研究源自患者之肽脈衝CTL對過度表現靶抗原之靶細胞株之反應。CTL與靶細胞共培養，其中將此培養物再懸浮於補充有IL-7及介白素2(IL-2)蛋白質之完全培養基中且施用於IFNγ及顆粒酶B ELISPOT盤。進一步培育細胞懸浮液以允許CTL與靶細胞株之間的相互作用，隨後測定CTL針對表現FJX1及MAGED4b之靶細胞的潛在殺死能力。
自圖3可見，在藉由PV1肽活體外刺激之後，HNSCC患者中分泌較高含量之細胞介素。圖3(a)及3(b)中之圖顯示離體及細胞毒性(CTX)ELISPOT檢定中之IFNγ及顆粒酶B之分泌。在肽刺激之前，針對M6、F1及PV1之固有T細胞反應較低。在藉由肽脈衝樹突狀細胞刺激T細胞之後，細胞毒性
ELISPOT結果顯示PV1誘發相當或較好的針對靶細胞(195M及C666.1F)之細胞毒性T細胞反應，分泌較高含量之IFNγ及顆粒酶B。
亦發現相比於微弱表現MAGED4b及/或FJX1之腫瘤，患有過度表現MAGED4b及/或FJX1之腫瘤的患者在PV1刺激之後反應較好，指示PV1之特異性。
為了進一步闡述，圖4指示基於腫瘤組織之FJX1及MAGED4b染色強度之4組個體。圖4(a)說明對患者腫瘤樣品染色中之FJX1及MAGED4b之不同表現量的代表性影像。在圖4(b)中可見，相比於具有低FJX1或MAGED4b表現之患者，在腫瘤中表現高含量之此等蛋白質的患者當藉由PV1刺激時具有較好反應，且在細胞毒性ELISPOT檢定中分泌較高含量的顆粒酶B及IFNγ。另外，亦可在圖4(c)中看出，表現高含量的兩種抗原之患者在藉由PV1刺激之後具有較好的針對靶細胞之反應，而表現低含量的兩種抗原之患者對刺激無反應，表明PV1肽疫苗之特異性。
為了評估肽是否引起任何細胞毒性或非特異性發炎性反應，藉由巨噬細胞量測發炎反應之格里斯檢定(Griess assay)首先用於評估藉由M6及F1肽誘發之發炎水準。小鼠巨噬細胞用各種濃度之M6、F1及PV1肽處理。含二甲亞碸(DMSO)之PBS用作陰性對照，而LPS用作陽性對照。基於由小鼠巨噬細胞產生之誘導型一氧化氮合成酶(inducible nitric oxide synthase,iNOS)之含量間接量測發炎程度。
圖5(a)顯示小鼠巨噬細胞上藉由M6或F1肽誘發之發炎的程度。可見不管投予之M6肽的濃度，在M6肽存在下藉由小鼠巨噬細胞產生之亞硝酸鹽比接受LPS刺激之小鼠巨噬細胞低7倍。類似地，此亦可觀測於F1肽存在下之小
鼠巨噬細胞中，其中亞硝酸鹽釋放的量比陽性對照(LPS)之釋放量低10倍。鑒於藉由M6及F1肽之低亞硝酸鹽產量，可因此表明iNOS表現之上調不由該等肽刺激，隨後指示藉由M6及F1肽誘發之發炎的程度較低且不預期藉由誘發非抗原特異性反應而引起非所需效應。
當M6及F1肽組合為PV1肽時顯示相同結果，其中iNOS積聚的量顯著低於LPS處理組中之彼等，如圖5(b)中所見。
接著，運行另外的評估以確定PV1組合物於動物模型中之評估。
帶有獲自使用患者PBMC之二聚體及ELISPOT檢定的結果，使用轉殖基因小鼠模型評估PV1之免疫原性及功效，其實現針對HLA-A2呈遞抗原之人類T細胞免疫反應的建模。
小鼠經如下表中所見之6種不同處理組疫苗接種：
其中DMSO為二甲亞碸，PV1為包含M6及F1肽之組合物，且IFA為不完全弗氏佐劑(Incomplete Freund's adjuvant)。
在疫苗接種時段之後，小鼠經安樂死且自小鼠脾臟收穫免疫細胞。疫苗接種小鼠之IFNγ分泌肽特異性CD8+ T細胞之存在係使用二聚體檢定測定且與媒劑對照組之結果比較。
接著，使用ELISPOT檢定，評估能夠執行細胞毒性功能以在疫苗接種後殺死呈遞肽之癌細胞的T細胞群體。
如圖6(a)中所見，相比於媒劑對照小鼠，經低至500μg濃度之PV1疫苗接種之小鼠能夠展示針對PV1負載二聚體之高識別。此反應為肽特異性的，因為疫苗接種小鼠在暴露於非負載及無關肽(HIV)負載二聚體時顯示基線或可忽略的反應。
另外，來自疫苗接種小鼠之固有T細胞亦能夠識別呈遞PV1肽之T2細胞，且能夠在離體ELISPOT檢定中以劑量依賴性方式執行針對此等T2細胞之殺死活性，如圖6(b)中所見。同樣地，此指示及促進PV1疫苗接種可增加此等小鼠中之PV1識別T細胞的暗示。
有利地，應注意，在整個疫苗接種時段中，一週一次地獲取小鼠體重。未在此時段期間觀測到體重損失或不良事件。另外，從來自所有投予PV1之處理組之小鼠收穫主要器官，諸如心臟、肺、腎、肝或脾，其中未在此等小鼠中觀測到局部毒性。此另外說明於圖7(a)及7(b)中。
由於500μg濃度之PV1能夠在免疫原性測試中刺激針對PV1之T細胞識別，因此選擇1000μg在後續評估中測試以測定PV1在延緩腫瘤生長中之功效。將總共1×106個表現人類HLA-A2(AAD)及MAGED4b基因之同基因型B16黑素瘤細胞皮下移植至小鼠中。在腫瘤尺寸達到30-50mm3之後，將小鼠隨機分配至兩個處理組。第一組接受1000μg伴以不完全弗氏佐劑(IFA)之PV1肽，而媒劑對照組接受含5% DMSO之PBS。每週兩次量測腫瘤尺寸。
如圖8中所說明，可見用PV1及佐劑處理之小鼠顯示相比於媒劑對照組之腫瘤生長延緩。此因此指示PV1能夠延緩腫瘤生長。
基於以上結果，PV1強烈地指示其在延緩腫瘤生長中高效，伴以可忽略的(若存在)對疫苗接種小鼠之主要器官之副作用。
PV1肽疫苗已展示為在活體外及活體內兩者中具免疫原性。最重要的是，使用PV1已展現針對活體外表現MAGED4b及FJX1之靶癌細胞株的抗原特異性細胞毒性及延緩之活體內腫瘤生長，表明PV1作為HNSCC之候選治療疫苗的潛力。有益地，PV1不僅可使HNSCC患者受益，且亦可使罹患乳癌、結腸癌、肺癌、前列腺癌及直腸癌之患者受益。在下表7中，本發明人顯示MAGED4b及FJX1亦表現於患有乳癌、結腸癌、肺癌、前列腺癌及直腸癌之患者的腫瘤組織中。
從上表7可見，FJX1及/或MAGED4b表現於大於90%的OSCC及NPC樣品中。此兩種抗原亦表現於患有乳癌、結腸癌、肺癌、前列腺癌及直腸
癌之患者的組織中。約97%患有此等癌症類型之個體量測為表現MAGED4b或FJX1[表7(d)]。在此5種癌症類型之早期及晚期階段腫瘤兩者中偵測到MAGED4b及FJX1之表現(表7)。鑒於兩種蛋白質均在幾乎一半的此等癌症類型中高度過度表現，此強烈指示可產生包含FJX1及MAGED4b之肽組合物以不僅治療HNSCC個體，且亦治療患有乳癌、結腸癌、肺癌、前列腺癌及直腸癌之個體。
根據本申請案，肽組合物可進一步開發為多抗原肽疫苗。特定言之，可開發包含至少FJX1及MAGED4b肽之疫苗以藉由與MHC I類分子結合而在個體中誘發抗癌免疫反應。在較佳實施例中，MHC I類分子為HLA-A2分子。
肽疫苗可與任何可用的癌症治療處理組合使用。以免疫檢查點抑制劑為例，當單獨使用時，免疫檢查點抑制劑可能不足以再活化患者之免疫系統。然而，當與PV1組合使用時，咸信增加抗原特異性T細胞庫之方法能夠進一步增強HNSCC患者之反應率。
然而，應瞭解，癌症治療處理不限於單獨的免疫檢查點抑制劑，且可包含其他癌症治療處理。
另外，佐劑亦可與PV1及所選癌症治療處理組合投予以提高針對PV1之免疫反應。佐劑之實例，諸如弗氏佐劑或人類粒細胞巨噬細胞集落刺激因子(GM-CSF)可為適用的。
或者，肽組合物亦可用於製造藥物。特定言之，有效量的FJX1及MAGED4b可用於製造供治療有需要之個體之HNSCC、乳癌、結腸癌、直腸癌、肺癌或前列腺癌中之任一者或組合用之藥物，其中藥物能夠與MHC I類分子結合以在個體中誘發抗癌免疫反應。
包括以下實例以進一步揭示本發明之較佳實施例。然而，應瞭解，如以下實例中所用之技術表示由本發明人發現在本發明之實踐中運行良好之技術，且可因此認為構成其實踐之較佳模式。然而，熟習此項技術者可適應所揭示之特定實施例中之變化且仍可獲得相同或類似結果而不背離本發明之範疇。
材料及方法
患者樣品
來自馬來西亞的4所中心醫院(Penang General Hospital,Penang、Tengku Ampuan Rahimah Hospital,Selangor、University of Malaya Hospital,Kuala Lumpur及Tung Shin Hospital,Kuala Lumpur)之新診斷HNSCC患者登記進行此研究。此項目經馬來亞大學牙科學院機構審查委員會(Institutional Review Board,Faculty of Dentistry,University of Malaya)[參考：DF OS0910/0049(L)]及馬來西亞衛生部醫學研究及倫理學委員會(Medical Research and Ethics Committee,Ministry of Health,Malaysia)(NMRR-09-944-4848)批准。
研究目的為向所有患者解釋，在收集血液樣品之前獲得書面知情同意書。
血液樣品經處理以測定每一患者之HLA分子類型，其將詳細描述於下文中。所有患者之人口統計資訊顯示於下表8中。
細胞株
口腔癌(ORL-48、ORL-115、ORL-136、ORL-150、ORL-153、ORL-156、ORL-166、ORL-174、ORL-188、ORL-195、ORL-196、ORL-204、ORL-207、ORL-214、ORL-215、ORL-247)、鼻咽癌(NP69、NP640、HK1、TW01、C666.1、HeLa/S及HeLa/T)、乳癌(MCF-7及SKBR-3)、結腸癌(HT-29及HCT-116)、前列腺癌(PC-3)、肺癌(A549)細胞株、四種正常口腔角質細胞原代培養物(ORL-231、ORL-295、ORL-235、ORL-232)及兩種永生化鼻咽(NP)細胞株NP69及NP460供本發明人使用。HeLa/S及HeLa/T為先前誤認作NPC細胞株之HeLa細胞之變異體(Ye等人，2015)。此等細胞株經購買(Gibco,Thermo Fisher,MA,USA)且在推薦培養基(用於口腔癌細胞株之DMEM/F12；用於鼻咽癌、乳癌、結腸癌及肺癌細胞株之RPMI-1640)中培養且補充有2mML-麩醯胺酸(Sigma Aldrich,MO,USA)及10%胎牛血清(Gibco,Thermo Fisher,MA,USA)。而角質細胞-SFM(Gibco,Thermo Fisher,MA,USA)用於培養正常口腔角質細胞及非惡性鼻咽細胞株。過度表現靶抗原之細胞株ORL195-MAGED4B(稱為195M)及HeLa/T-FJX1(稱為HeLa/T-F)用作西方墨點實驗中之陽性對照。過度表現FJX1之C666.1-A2細胞株(如由Dr.Ricardo Dolcetti,Centro di Riferimento Oncologico,Italy所提供)(稱為C666.1F)；及過度表現MAGED4B之ORL-195(稱為195M)用作細胞毒性ELISPOT檢定中之靶細胞株，該檢定將更多描述於下文。用於此研究中之所有細胞株已在其用於此研究中之前經認證。
肽
用於此實例中之肽包含源自FJX1(F1)及MAGED4b(M6)之兩種HLA-A2限制肽。HLA-A2限制FluM衍生肽用作陽性對照且HIV肽用作無關肽對照。肽之序列如表2-5中所示。用於此研究之所有肽由JPT Peptide Technologies(Berlin,Germany)商業生產。肽之純度經測定且經由使用HPLC確保，其中肽之純度結果高於80%。
定量PCR(qPCR)
定量PCR(qPCR)用於測定OSCC及NPC細胞株中之兩種靶抗原M6及F1抗原之mRNA含量。來自所有16個OSCC及7個NPC細胞株之總RNA係使用Nucleospin RNA II純化套組(Macherey-Nagel,Düren,Germany)提取且用於使用oligo(dT)引子及Superscript II(Invitrogen,Thermo Fisher,MA,USA)合成cDNA。定量PCR藉由標準SYBR Green協定，使用ABI Prism7500®序列偵測系統(Applied Biosystems,Germany)進行。3-磷酸甘油醛去氫酶(GAPDH)經擴增且充當內部對照。
所用引子如下(SEQ ID NO：5-SEQ ID NO：10)：FJX1：有義5'CCCGCAAAGGTGTCTAAAAACT3'及反義5'GTGCTGGCACAGTAAAGAATCCT3'；MAGED4b：有義5'CCAGAATCAGAACCGAGA3'及反義5'CCAAAATCTCCGTCCTCA3'；
GAPDH：有義5'GAAGGTGAAGGTCGGAGTC3'及反義5' GAAGATGGTGATGGGATT TC 3'。
當相比於正常口腔及鼻咽組織之表現量時，相對表現之最小2倍增加視為過度表現。
西方墨點法
細胞藉由補充有1× HALT蛋白酶抑制劑混合液(Pierce Biotechnology,IL,USA)之RIPA溶解緩衝液(5% NaDOC，1% SDS，25mM HEPES pH 7.5，1M HCl，1.5mM MgCl2，1mM EDTA，1% Triton X-100，1mM DTT)在冰上溶解。在10000g下在4℃下離心20分鐘之後，收集細胞溶解物。使用Bradford蛋白質檢定(Pierce Biotechnology,MA,USA)測定總蛋白質之濃度。50μg總蛋白質經受12%及10% SDS-聚丙烯醯胺凝膠電泳(分別用於偵測FJX1及MAGED4b蛋白質)且轉移至Immobilon-P膜(Millipore,MA,USA)上。墨點經5%脫脂奶(Tris緩衝生理鹽水伴以0.1% Tween-20，TBST)阻斷1小時且另外與以下一級抗體一起培育：抗MAGED4B(1：1000，Sigma Aldrich,MO,USA)、抗FJX1(1：2000，Aviva Systems Biology,CA,USA)。墨點在含有0.1% Tween-20之TBS緩衝液(TBS-T)中洗滌(3次，各持續5分鐘)且接著藉由與辣根過氧化酶(horseradish peroxidase)結合之對應二級抗體(1：10000；Southern Biotech,AL,USA)探測1小時。在TBS-T中洗滌之後，經由增強型化學發光方法，使用FluorChem HD2成像系統(ProteinSimple,CA USA)進行偵測。以抗GAPDH(1：1000，Trevigen,MD,USA)或抗肌動蛋白(1：1000，Milipore,CA,USA)抗體作為各實驗之管家對照(housekeeping control)而探測墨點。
免疫組織化學
研究中包括的由NPC(n=74)、OSCC(n=49)及179個多種癌症(乳癌，n=41；結腸癌，n=30；肺癌，n=48；前列腺癌，n=44；直腸癌，n=16)組成之組織微陣列(Tissue microassay,TMA)切片購自Biomax(MD,USA)。藉由免疫組織化學(IHC)，使用抗MAGED4B(1：100；目錄號HPA003554；Sigma Aldrich,MO,USA)及抗FJX1(1：200；目錄號HPA059220；Sigma Aldrich,MO,USA)抗體，接著藉由偵測系統，使用DakocytomationEnvision+Dual Link SystemHRP(DAB+)套組(Dako,Glostrup,Denmark)來偵測靶蛋白之表現量。亦對來自登記進行PV1功效評估之患者的存檔FFPE OSCC及NPC組織切片進行IHC分析。兩種抗體之免疫反應性係基於具有陽性染色之腫瘤細胞的百分比及4點強度評分系統評分：0=陰性表現；1=弱陽性；2=中等陽性；3=強陽性(Charafe-Jauffret等人，2004)。所有IHC分析由認證的病理學家評估。自分析排除具有缺失、不完全核心，或太小而無法評估之腫瘤的組織微陣列。
製備周邊血液單核細胞(PBMC)
在CPT真空管(Becton Dickinson,USA)中收集來自OSCC或NPC患者之35ml血液且根據製造商說明書分離PBMC。接著在漢克氏平衡鹽溶液(Hanks'Balanced Salt Solution；HBSS)(Gibco,Thermo Fisher,MA,USA)中洗滌PBMC且再懸浮於含有補充有5%熱滅活人類AB血清(Gemini Bio-Product,CA,USA)、1×青黴素/鏈黴素(Gibco,Thermo Fisher,MA,USA)及2mM L-麩醯胺酸之洛斯維帕克紀念研究所(RPMI)培養基(Gibco,Thermo Fisher,MA,USA)的完全培養基中。經分離之PBMC接著用於經由使用HLA-A2：Ig二聚體檢定以及離體及細胞毒性ELISPOT檢定進行HLA分型，其將詳細描述於下文。
血液標本之HLA分型
鑒於FJX1及MAGED4b肽均為HLA-A2特異性的，本發明人僅利用具有匹配HLA亞型之血液樣品。HLA-A2狀態係藉由使用藻紅素(PE)標記之小鼠抗人類HLA-A2抗體(純系BB7.2；BD Pharmingen,CA,USA)染色PBMC樣品而測定。經PE標記之小鼠抗人類HLA IgG2b k-同型(純系BB7.2；BD Pharmingen,CA,USA)及小鼠抗人類HLA-ABC(純系DX17；BD Pharmingen,CA,USA)染色之PBMC分別用作陰性及陽性對照。為了染色，細胞與適當抗體一起在4℃下培育1小時，經洗滌，且在FACSCanto 2細胞計數器(BD Biosciences,CA,USA)上分析。
二聚體檢定
使用HLA-A2：Ig二聚體檢定評估HLA-A2陽性NPA及OSCC患者之PBMC中之內源性FJX1及MAGED4b特異性CD8+T細胞之存在。肽特異性二聚體藉由組合1μg重組可溶二聚人類HLA-A2：Ig重組蛋白(BD Pharmingen,CA,USA)、0.25μg ß2-微球蛋白(Sigma Aldrich,MO,USA)及5μg肽(F1、M6或PV1)製備且在37℃下培育隔夜。負載有完全培養基(CM)及ß2-微球蛋白之二聚體用作背景對照，負載有HIV肽及ß2-微球蛋白之二聚體用作無關肽對照，且具有ß2-微球蛋白之FluM負載之二聚體用作陽性對照。次日，將新分離的PBMC添加至獨立圓底聚丙烯管(BD Falcon,CA,USA)中之對應肽負載二聚體中且在4℃下培育30分鐘且用1ml磷酸鹽緩衝鹽水(PBS)洗滌。細胞接著再懸浮於100μl PBS中且用FITC結合之大鼠抗小鼠IgG1(純系A85-1；BD Biosciences,CA,USA)、PE結合之小鼠抗人類CD8(純系HIT8a；BD Biosciences,CA,USA)及APC結合之小鼠抗人類TCR α/ß(純系BW242/412；Miltenyi Biotech,Germany)在4℃下染色1小時。接著洗滌細胞且再懸浮於PBS中且使用FACSCanto 2細胞計
數器(BD Biosciences,CA,USA)進行流式細胞測量術分析。肽特異性CD8+ T細胞之存在係藉由評估為對IgG1、CD8及APC呈陽性之細胞測定，且對給定肽具有特異性之CD8+ T細胞之百分比且計算為減去關於無肽情況下之染色獲得之值之後的肽二聚體陽性CD8+T細胞之值。
離體ELISPOT
ELISPOT檢定用於評估細胞介素(IFNγ及顆粒酶B)分泌T細胞在單細胞水準之存在。如先前所描述，離體ELISPOT用於測定識別肽之來自患者PBMC之固有T細胞(Lim等人，2014)。首先，PBMC與50ng/ml IL-7及10ng/ml IL-12一起在培養基中在37℃下培育兩小時。在兩小時培育之後，細胞用4ml HBSS(Gibco,Thermo Fisher,MA,USA)洗滌且再懸浮於200μl完全培養基中。懸浮細胞接著與50μg/ml F1、M6、PV1、FluM及HIV肽混合。100μl混合物中之每一者在抗人類IFNγ/顆粒酶B塗佈之ELISPOT盤(Mabtech,Sweden)中培育隔夜。在隔夜培育之後，根據製造商說明書加以略微修改進行ELISPOT檢定。將IFNγ或顆粒酶B偵測抗體添加至對應盤中且在37℃下培育兩小時。接著洗滌且添加抗生蛋白鏈菌素標記之二級抗體且盤另外在37℃下培育45分鐘。兩種抗體均在含有0.5%人類AB血清之PBS(Gemini Bio-Products,CA,USA)中以1：500稀釋。添加有BCIP/NBT的受質以使由細胞介素分泌T細胞形成之斑點可見。偵測之斑點接著使用CTL ELISPOT分析儀(Cellular Technology Limited,OH,USA)定量且使用免疫斑點專業軟體(ImmunoSpot Professional Software)(Cellular Technology Limited,OH,USA)分析。肽特異性CTL係藉由減去未暴露於肽之背景對照孔中形成之斑點計算，且其中FluM及HIV肽分別用作陽性及無關肽對照。
樹突狀細胞(DC)及細胞毒性T-淋巴細胞(CTL)分離及培養
來自患者之樹突狀細胞經分離且隨後用作抗原呈遞細胞。簡言之，將PBMC再懸浮於巨噬細胞-無血清培養基(M-SFM)(Gibco,Thermo Fisher,MA,USA)中，接種於6孔盤中且在37℃下培育1小時。在培育之後，收集來自PBMC之非黏附細胞，在HBSS中沖洗且接著再懸浮於含有10ng/ml IL-7之完全培養基中。每孔大致2-5×105個細胞接種至圓底96孔盤中。細胞接著在37℃下培育2-5天以藉由添加50μg/ml肽而擴增T細胞。由培育產生之黏附細胞在37℃下，在M-SFM中，在100ng/ml GM-CSF及25ng/ml IL-4存在下培養2-5天以誘發樹突狀細胞(DC)之分化。藉由用培養基取出細胞而自培養皿收集分化DC且接著等分至1.5ml離心管中，與50μg/ml肽(F1、M6及PV1)一起在37℃下培育2小時，隨後施用於源自非黏附PBMC之成熟T細胞。在共培養18-24小時之後，將10ng/ml IL-2添加至DC/T細胞培養物且再培育24小時。在培育之後，含有IL-2之培養基經新鮮完全培養基置換且在37℃下另外培育3-5天以使細胞毒性T-淋巴細胞(CTL)活化。CTL接著在擴增後細胞毒性ELISPOT檢定中與靶細胞(195M及C666.1F)共培育以測定CTL針對FJX1或MAGED4b表現靶細胞之潛在殺死能力。
細胞毒性ELISPOT檢定
細胞毒性ELISPOT檢定用於研究源自患者之肽脈衝CTL對過度表現靶抗原之靶細胞株之反應。CTL與195M及C666.1F以20：1之靶效比共培養，且將此培養物再懸浮於200μl補充有20ng/ml IL-7及IL-2之完全培養基中且接著以每孔100μl施用至IFNγ或顆粒酶B ELISPOT盤。細胞懸浮液接著在37℃下另外培育16小時。接著，如上文所述地進行ELISPOT檢定。
結果
患者人口統計資料
收集來自41個HNSCC(NPC及OSCC)患者之外周血(peripheral blood)用於此研究。其中，約50%(20/41)為HLA-A2陽性且用於後續分析。在此等患者中，16/20為NPC患者且4/20為OSCC患者。此等HLA-A2陽性患者中之80%(16/20)來自重病階段(階段III及階段IV)且此等患者之人口統計資料顯示於表8中。在20個HLA-A2患者中，來自15個患者之樣品經受二聚體檢定，同時16個經受離體及細胞毒性ELISPOT檢定。其餘的樣品由於不充分PBMC或次佳樣品品質(血液溶解)而自實驗排除。
MAGED4B及FJX1為在HNSCC中過度表現之腫瘤抗原
本發明人先前已展示MAGED4b及FJX1分別在OSCC及NPC中過度表現，儘管表現在其各別正常對應物中可忽略(Chong等人，2012；Chong等人，2009；Ahmad Zabidi MM 2011；Bose等人，2009)。在此研究中，在擴展之HNSCC樣品集合中篩選此2種抗原中之過度表現。獲得之資料顯示FJX1過度表現於NPC及OSCC細胞株兩者中。如圖9(a)中所見，當分別相比於正常口腔角質細胞及正常鼻咽組織時，在5/16個OSCC(ORL-150、ORL-153、ORL-156、ORL-174及ORL-48)及6/7個NPC(HK1、TW01、TW04及C666.1)及永生化NP(NP69及NP460)細胞株中偵測到mRNA含量之大於2倍增加。值得注意的是，觀測到相比於正常口腔角質細胞[圖10(c)]，所有OSCC(除了ORL-136)及NP/NPC細胞株在蛋白質層級表現顯著含量的FJX1[圖10(a)]。類似地，對於MAGED4B，發現mRNA含量在OSCC細胞株ORL-153、永生化NP69及NPC細胞株C666.1中為大於2倍[圖9(b)]。值得注意的，當相比於陽性對照[異位地過度表現MAGED4B之細胞；圖10(a)及10(b)]時，所有OSCC(除了ORL-195及ORL-48)及所有NPC細胞株顯示蛋白質層級的MAGED4B之邊緣表現，且在正
常口腔角質細胞之原代培養物中，未偵測到MAGED4B表現[圖10(c)]。本發明人亦研究具有來自TCGA資料庫(癌症基因組圖譜(Cancer Genome Atlas)N.2015)之匹配正常資料之43例頭頸癌的RNAseq資料且指出當相比於匹配正常資料時，大於60%之腫瘤群體具有顯著較高含量的FJX1[圖11(a)，p<0.01]且約40%之群體具有較高含量的MAGED4B[圖11(b)，p<0.01]。
本發明人隨後證實商業上獲得之TMA中之MAGED4B及FJX1表現量之此等觀測結果由OSCC及NPC核心(統稱為HNSCC)組成且代表性染色顯示於圖1(a)中。廣泛地，MAGED4B及FJX1表現均在蛋白質層級偵測，其中染色強度評分介於0、1、2及3範圍內。在大多數OSCC樣品(分別為49/49及47/49)中偵測到MAGED4B及FJX1之表現；而對於NPC情況，偵測到存在兩種蛋白質(MAGED4B；58/63及FJX1；64/74)[表7(a)]。當兩種TMA在一起分析時，本發明人展示此等HNSCC樣品中之高達94.7%(89/94)過度表現MAGED4B或FJX1且僅5.3%(5/94)情況對兩種抗原均呈陰性[表7(b)]。然而，未在FJX1之染色強度與疾病階段或組織分化程度之間發現顯著相關性。另一方面，MAGED4B之表現量與OSCC樣品(p=0.016)及NPC(p=0.007)之分化程度顯著相關，但不與任何疾病階段相關，如下表中所見。
內源性T細胞識別PV1存在於HNSCC患者中
由於MAGED4B及FJX1均展示為存在於HNSCC患者中，因此假設亦將存在MAGED4B及/或FJX1特異性CD8+T細胞。使用二聚體檢定，本發明人確定能夠識別PV1肽(MAGED4B及FJX1肽)之CD8+T細胞(CD8+TCR+IgG1+)的百分比。本發明人展示在所有分析之HNSCC樣品(15/15)中存在PV1特異性CD8+T細胞，藉由非肽負載二聚體對照標準化之後的平均值在2.6%-7.1%範圍內(圖2)。偵測之平均內源性PV1特異性T細胞群體相比於單一F1(2.6%；p<0.001)或M6特異性T細胞(4.6%；p=0.177)群體較高(7.1%)，表明當組合使用兩種肽時，免疫原性較強。當相比於非負載二聚體對照(p=0.125)時，未在識別HIV肽負載二聚體之T細胞群體之間觀測到顯著差異。儘管T細胞群體識別陽性對照，當相比於非負載二聚體對照(p<0.001)時，FluM肽負載二聚體顯著較高。
本發明人接著使PV1特異性CD8+ T細胞之存在與MAGED4B及FJX1之表現相關。MAGED4B、FJX1以及MAGED4B與FJX1抗原特異性CD8+T細胞之平均百分比用作截止以將患者分組為高及低抗原特異性T細胞。本發明人展示約33%具有高含量的識別F1、M6及PV1負載二聚體之抗原特異性T細胞之患者表現高含量的FJX1及MAGED4B兩者。相反，僅10%具有低含量的抗原特異性CD8+ T細胞之患者高度表現兩種抗原。驚人地，表現極少FJX1及MAGED4B兩者之患者始終顯示低百分比的F1、M6及PV1抗原特異性T細胞，如下表中所見。
PV1肽活體外(in vitro)誘發自HNSCC患者T細胞之細胞毒性細胞介素分泌
隨後，本發明人試圖確定使用PV1肽是否將能夠增加細胞毒性T細胞之含量。為了測定PV1在HNSCC患者(n=16；15個樣品與用於HLA-A2：Ig二聚體檢定中之樣品重疊)中誘發細胞毒性活性之功效，本發明人藉由M6、F1或PV1(F1及M6)活體外刺激患者之T細胞，且將T細胞暴露至表現MAGED4B(195M)或FJX1(C666.1F)之靶細胞。在任何刺激之前，離體ELISPOT檢定顯示儘管在HLA-A2：Ig二聚體檢定中偵測到肽特異性T細胞，刺激之前的IFNγ及顆粒酶B細胞介素分泌細胞(CSC)之細胞數較低[圖3(a)及3(b)]。如圖3(a)及3(b)中所見，在藉由M6、F1或PV1活體外刺激之後，細胞毒性ELISPOT(CTX ELISPOT)檢定顯示溶細胞活性(cytolytic activity)增加，導致當相比於離體ELISPOT中之細胞介素分泌細胞群體時，IFNγ及顆粒酶B兩者之細胞介素分泌細胞數目較高。總體而言，當相比於先前肽刺激時，對M6、F1或PV1肽之HNSCC患者T細胞反應展示細胞毒性ELISPOT檢定中之細胞介素分泌的2.4至39.7倍增加。然而，HIV肽亦在刺激之後誘發增加水準之IFNγ及顆粒酶B分泌。
T細胞活化水準在腫瘤表現高MAGED4B及FJX1之HNSCC患者中較高
在用於ELISPOT檢定之16個患者樣品中，本發明人能夠自12/16個患者獲得存檔之FFPE腫瘤塊。接著進行IHC以測定MAGED4B及FJX1於此等
腫瘤中之表現。本發明人接著基於IHC染色強度[圖4(a)]將患者分為4組(FJX1-低、FJX1-高、MAGED4B-低及MAGED4B-高)，且在藉由肽刺激之後於細胞毒性ELISPOT檢定中比較患者之T細胞反應。染色強度0分類為陰性，強度1分類為低表現且強度2-3視為高表現。當相比於具有低FJX1或MAGED4B表現之患者時，具有較高FJX1或MAGED4B表現之患者展示較高數目的細胞介素分泌細胞(IFNγ或顆粒酶B)[圖4(b)]。本發明人亦發現相比於對腫瘤表現高含量之FJX1或MAGED4B的患者，對組織具有低FJX1以及MAGED4B表現量之患者較少回應於PV1刺激[圖4(c)]。資料表明表現高含量之FJX1或MAGED4B之HNSCC患者之免疫系統更易於經PV1肽疫苗刺激。
PV1可在其他癌症患者中具有有益效應
為了調查其他癌症中之FJX1及MAGED4B表現及識別可受益於PV1療法之潛在患者群體，本發明人使用患有5種最常見癌症(乳癌、肺癌、結腸癌、前列腺癌及直腸癌)之一組TMA研究MAGED4B及FJX1之表現。結果展示在所有5種癌症之大於80%患者中偵測到MAGED4B之表現且在FJX1表現可見類似觀測結果，除了僅約50%之結腸癌患者對於FJX1呈陽性。當共同地分析MAGED4B及FJX1兩者之表現時，本發明人顯示大於90%之乳房、結腸、肺、前列腺及直腸腫瘤組織具有MAGED4B或FJX1表現[表7(a)]。總體而言，不管疾病階段，MAGED4B及FJX1在乳癌、結腸癌、肺癌、前列腺癌及直腸癌腫瘤中展示為過度表現[表7(b)]。對此5種癌細胞株(A549，肺癌；PC3，前列腺癌；HT-29，結腸直腸癌；HCT-116，結腸直腸癌；SKBR-3，乳癌；MCF-7，乳癌)之西方墨點法分析顯示MAGED4B表現在A549及PC3細胞株中較高，同時表現量在HCT-116、SKBR-3及MCF-7中較弱。另一方面，顯示FJX1表現於除了PC3的6個
測試細胞株中之5個(A549、HT-29、HCT-116、SKBR-3及MCF-7)中(圖12)，表明PV1可在靶向表現MAGED4B及/或FJX1之此等癌症中具有潛力。
許多腫瘤傾向於具有通常僅在諸如睾丸之免疫位點中(Inaoka等人，2011；Gjerstorff等人，2015)及在胚胎發生期間(Lawrence等人，2011；Becker等人，2012)表現之蛋白質之失調表現。此等抗原之獨特表現使其成為癌症療法之良好標靶。吾人之前述研究識別2種腫瘤抗原FJX1及MAGED4B，其參與此類過程，分別在正常情況下具有可忽略的表現但在NPC及OSCC中過度表現(Chai等人，2015；Chong等人，2012)。在此研究中，本發明人將該群體消耗於較大數目之細胞株及腫瘤樣品。IHC資料展示大部分OSCC及NPC腫瘤具有MAGED4B或FJX1之過度表現。顯示FJX1在HNSCC細胞株及腫瘤組織中過度表現。但對於MAGED4B，儘管IHC染色在大多數HNSCC腫瘤組織中顯示陽性染色，但偵測之MAGED4B之表現量在HNSCC癌細胞株中較低。此可能係歸因於抗原於長期培養環境中之損失。其他相關研究顯示MAGED4B表現與腫瘤分化程度相關，但本發明人未在2種抗原之表現與患者之疾病分期之間發現任何顯著相關性。由於OSCC及NPC構成大部分頭頸癌(HNSCC)病例，本發明人假設MAGED4B及FJX1均可為HNSCC之重要標靶。總體而言，發明人確認此兩種抗原在約90%之HNSCC患者中過度表現且充當HNSCC患者之良好治療標靶。除此以外，本發明人亦顯示MAGED4B及FJX1存在於其他癌症類型之腫瘤中，包括乳癌、結腸癌、肺癌、前列腺癌及直腸癌，指示靶向此2種抗原不僅可有益於HNSCC患者，且亦潛在地有益於罹患乳癌、結腸癌、肺癌、前列腺癌及直腸癌之患者。
本發明人設計MAGED4B特異性及FJX1特異性肽疫苗以分別靶向OSCC及NPC。本發明人顯示來自OSCC及NPC患者之PBMC經分別源自MAGED4B及FJX1之肽疫苗之脈衝能夠引發針對靶癌細胞之細胞毒性免疫反應。然而，由於腫瘤之異質性性質及癌細胞隨著其進展而損失抗原表現之可能性(Cecco等人，2011)，靶向單一腫瘤抗原作為治療模式始終不足。為了克服此類限制，重要的是靶向多個抗原以誘發較寬免疫反應，以確保可根除大部分腫瘤，以避免選擇抗原陰性純系(Gerdemann等人，2011)，且同時有益於較大患者群體。對食道癌患者之前述研究顯示多種抗原肽疫苗可在患者中引發更穩固免疫反應。相比於針對單一抗原肽具有CTL反應之患者，對多種抗原肽疫苗具有CTL反應之患者賦予較好總存活期(Kono等人，2012)。在當前研究中，本發明人組合MAGED4b及FJX1(稱為PV1)之肽且試圖以靶向頭頸癌患者之雙抗原肽疫苗形式測試PV1功效。
本發明人之結果顯示雙抗原疫苗PV1相比於單一肽更具免疫原性。當相比於單獨的M6或F1肽時，較大固有T細胞群體能夠在二聚體檢定中識別PV1。本發明人亦觀測到儘管T細胞分泌IFNγ及顆粒酶B之能力在活體外肽刺激之前受到抑制，但IFNγ及顆粒酶B分泌T細胞群體之含量在細胞毒性ELISPOT檢定中增加。相比於經單一肽之刺激，PV1刺激之後的IFNγ及顆粒酶B分泌一樣高(若非更好)。總體而言，使用針對頭頸癌細胞株的包含MAGED4B及FJX1肽兩者之雙抗原肽為引人注目的且保證進一步發展以有益於患者。本發明人亦觀測到經無關HIV-gag蛋白質肽引發T細胞，誘發自T細胞之非特異性IFNγ及顆粒酶B分泌。如由Karlsson等人於2004年的先前報導，本發明人假設此非特異性刺激係歸因於在活體外刺激後誘發假陽性反應之可溶性不佳之肽。因此，可溶性
不佳之HIV肽可能不為用於肽刺激之後的細胞毒性ELISPOT檢定之良好無關肽對照。
重要的是，本發明人之資料顯示來自具有較高抗原表現量之患者的T細胞更易於再敏化(re-sensitized)，且在PV1刺激後具有較好反應。此令人鼓舞的資料指示PV1以抗原特異性方式起作用，且基於表現量或MAGED4B或FJX1於腫瘤上之存在的患者篩選將為PV1療法之重要納入標準。
最近，兩種免疫檢查點抑制劑由美國食品藥物管理局(U.S.Food and Drug Administration)批准用於治療HNSCC。尼沃單抗(Nivolumab)(OPDIVO,Bristol-Myers Squibb Company)在2016年11月被批准且帕博利珠單抗(Pembrolizumab)(KEYTRUDA,Merck & Co.,Inc.)在2016年8月更早被加速批准。然而，接受此等藥物之HNSCC患者之反應率據報導僅低至13%(OPDIVO,Bristol-Myers Squibb Company)(Ferris等人，2016)及16%(KEYTRUDA,Merck & Co.,Inc.)(美國食品藥物管理局2016)。由於免疫系統在免疫活化與抑制之間始終維持制約與平衡之複雜度(Chen L及Flies DB,2013)，使用單獨的免疫檢查點抑制劑釋放免疫反應之制動可能不足以再活化患者中已抑制之免疫系統。與免疫原性免疫活化劑組合，諸如源自腫瘤抗原之癌症疫苗，已報導為通過更改效應T細胞與調節T細胞比率，增加抗原特異性T細胞而更有效地活化免疫反應(Morse及Lyerly,2015；Mkrtichyan等人，2011；Avogadri等人，2014；Karyampudi等人，2014)。如本發明人所展示，雙抗原PV1肽疫苗具免疫原性且能夠在HNSCC患者中誘發抗腫瘤免疫反應，表明免疫檢查點抑制劑與PV1之組合可增強HNSCC患者中之反應率。
然而，不同肽可具有不同的針對MHC分子之結合親和力，且因此可在與抗原決定位結合中引起競爭。因此，進一步研究確保呈遞FJX1及MAGED4B肽之兩種抗原決定位的較佳調配物，或投予疫苗之較佳策略，以便應考慮及保證在不同身體部位進行投予。總體而言，本發明人之結果顯示PV1在相當的水準，或相比於單一肽甚至更佳之水準進行。具有表現FJX1或MAGED4B之腫瘤的HNSCC患者可受益於疫苗。吾人之資料亦表明PV1亦可有益於其他癌症類型，包括乳癌、肺癌、前列腺癌、結腸癌及直腸癌之患者。當前正使用轉殖基因活體內模型評估誘發足夠免疫反應及PV1功效以控制腫瘤負荷之最佳劑量。
在動物模型中評估PV1
PV1不增加非所需發炎性反應
在使用動物模型評估PV1免疫原性之前，量測發炎性反應之格里斯檢定用於評估M6及F1肽之毒性。小鼠巨噬細胞細胞株RAW264.7用各種濃度之M6、F1或PV1肽處理：25μg/ml、50μg/ml及100μg/ml且將含10% DMSO之PBS用作陰性對照，同時將1ng/ml脂多醣(LPS)用作陽性對照。基於由RAW264.7細胞產生之誘導型一氧化氮合成酶(iNOS)之含量間接量測發炎程度。
圖5(a)顯示RAW264.7上藉由M6或F1肽誘發之發炎的程度。在M6存在下藉由RAW264.7產生之亞硝酸鹽低於接受LPS刺激之彼等至少7倍(P<0.01)。亦在F1處理組中觀測到相同趨勢，其中釋放之亞硝酸鹽的量低於陽性對照10倍(P<0.05)。此表明M6及F1不刺激iNOS表現之上調，其進一步指示藉由此兩種靶肽誘發之發炎的程度較低。當M6及F1組合為PV1時，吾人之結
果一致地顯示PV1處理組中iNOS積聚的量顯著低於LPS處理組中之彼等(10倍差異，P<0.05)[圖5(b)]。格里斯檢定結果顯示PV1不在活體外設定下誘發發炎。
PV1疫苗接種增加抗原特異性T細胞之活化
當使用自HNSCC患者提取之外周血單核細胞(PBMC)測試時，由MAGED4B肽6(M6)及FJX1肽1(F1)組成之雙抗原PV1展示為免疫原性的。此研究旨在使用轉殖基因小鼠模型B6.Cg-Tg(HLA-A/H2-D)2Enge/J評估PV1之免疫原性及功效，其使得能夠對針對HLA-A2呈遞抗原之人類T細胞免疫反應建模。
小鼠以如上表6中所示之5種不同處理組每週經疫苗接種，連續地持續3週(3個劑量)。在第4週，殺死小鼠且自小鼠脾臟收穫免疫細胞。使用二聚體檢定確定經疫苗接種小鼠之IFNγ分泌肽特異性CD8+ T細胞之存在且與媒劑對照組比較。
結果顯示PV1具免疫原性。相比於媒劑對照動物(含5% DMSO之磷酸鹽緩衝鹽水，PBS)，經低至500μg PV1疫苗接種之動物顯示針對PV1負載二聚體之高識別。此反應為肽特異性的，因為經疫苗接種小鼠在暴露於非負載及無關肽(HIV)負載二聚體時顯示基線/可忽略的反應，如圖6(a)中所說明。
使用ELISPOT檢定，本發明人評估能夠執行細胞毒性功能以在疫苗接種後殺死呈遞肽之癌細胞的T細胞群體。經疫苗接種動物能夠識別呈遞PV1之T2細胞且以劑量依賴性方式執行針對此等T2細胞之殺死活性[圖6(b)]，表明PV1疫苗接種已成功地增加此等動物中之T細胞之識別。
PV1為安全的且未在經疫苗接種小鼠中觀測到不良事件
在疫苗接種時段期間一週兩次地獲取動物體重。本發明人在4週免疫時段期間於所有處理組中未觀測到任何體重損失或不良事件[圖7(a)]。
自所有處理組小鼠收穫之主要器官(心臟、肺、腎、肝及脾)的病理性報告顯示所有PV1處理小鼠在正常限度內。未在此等動物中觀測到局部毒性[圖7(b)]。
PV1延緩小鼠中之腫瘤生長
在前述免疫原性研究中，本發明人顯示PV1能夠在低至500μg之濃度下誘發抗原特異性T細胞反應。因此，1000μg PV1用於後續檢定以測定PV1在降低小鼠中之腫瘤負荷中之功效。
將總共1×106個細胞(表現AAD及MAGED4B基因之同基因型B16黑色素瘤細胞)移植至小鼠上。在腫瘤尺寸達到30-50mm3之後，將小鼠隨機分配至2組。處理組小鼠接受1000μg PV1+IFA，而媒劑對照組接受含5% DMSO之PBS。
每週兩次地量測腫瘤尺寸且用1000μg PV1+IFA處理之小鼠在相比於媒劑對照(VC)組時顯示延緩之腫瘤生長(圖8)。
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Claims (17)
- 一種肽組合物，其中該肽組合物包含至少四連接盒1(FJX1)肽及黑色素瘤抗原家族D4b(MAGED4b)肽，該肽組合物與主要組織相容性複合體(MHC)I類分子結合以在一個體中誘發一抗癌免疫反應。
- 如請求項1所述之肽組合物，其中該等MHC I類分子為人類白血球抗原A2(HLA-A2)分子。
- 如請求項1所述之肽組合物，其中該FJX1肽包含SEQ ID NO.1之肽序列。
- 如請求項1所述之肽組合物，其中該MAGED4b肽包含SEQ ID NO.2之序列。
- 如請求項3或4所述之肽組合物，其中該肽序列中之至少一個胺基酸經刪除。
- 如請求項3或4所述之肽組合物，其中該肽序列中之至少一個胺基酸經取代。
- 如請求項3或4所述之肽組合物，其中該肽序列中之至少一個胺基酸經插入。
- 如請求項1所述之肽組合物，其中該肽組合物與該等MHC I類分子結合以增加該個體中之細胞介素分泌細胞，以在該個體中誘發該抗癌反應。
- 如請求項8所述之肽組合物，其中該細胞介素包含干擾素γ(IFNγ)及顆粒酶B。
- 如請求項1所述之肽組合物，其中該抗癌免疫反應係在FJX1及/或MAGED4b由癌細胞表現時於個體中誘發。
- 如請求項10所述之肽組合物，其中該等癌細胞為頭頸鱗狀細胞癌(HNSCC)細胞、乳癌細胞、結腸癌細胞、直腸癌細胞、肺癌細胞或前列腺癌細胞中之任一者或組合。
- 一種疫苗，其包含至少如請求項1-11中所述之肽組合物。
- 如請求項12所述之疫苗，其中該疫苗可與癌症治療處理(treatments)組合使用。
- 如請求項13所述之疫苗，更包含免疫檢查點抑制劑。
- 如請求項14所述之疫苗，其中該等免疫檢查點抑制劑包含抗PD-1抗體。
- 如請求項13所述之疫苗，其中該抗癌免疫反應係在來自頭頸鱗狀細胞癌(HNSCC)、乳癌、結腸癌、直腸癌、肺癌或前列腺癌中之任一者或組合之癌細胞於該個體中被偵測時誘發。
- 一種有效量的四連接盒1(FJX1)肽及黑色素瘤抗原家族D4b(MAGED4b)之用途，其用於製造供治療有需要之一個體之頭頸鱗狀細胞癌(HNSCC)、乳癌、結腸癌、直腸癌、肺癌或前列腺癌中之任一者或組合用之藥物，其中該藥物能夠與主要組織相容性複合體(MHC)I類分子結合以在該個體中誘發一抗癌免疫反應。
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