CN110494153A - 免疫原性肽组合物 - Google Patents

Abstract

本发明是关于能够与主要组织相容性复合体I类分子结合以在个体中诱发抗癌免疫反应的肽组合物。特定而言的，肽组合物包含至少四连接盒1肽及黑色素瘤抗原家族D4b肽。本发明另外是关于肽组合物及肽疫苗的用途，其用于在该个体中诱发该抗癌免疫反应。

Description

免疫原性肽组合物

技术领域

本发明为关于用于增强有需要的患者的抗肿瘤反应的肽组合物。

背景技术

头颈鳞状细胞癌(HNSCC)为肺癌、乳癌、胃癌、结肠直肠癌及肝癌之后的第六最常见的癌症(Ferlay等人,2015)。由于鳞状细胞发现于皮肤外层及黏膜中，HNSCC产生于口腔、鼻子及咽喉的黏膜中。

目前，治疗选择仍限于手术、放射线疗法及化学疗法。较新类型的癌症疗法选择，靶向疗法包括使用靶向癌细胞的药物。当前，由美国食品药物管理局(FDA)唯一批准用于HNSCC的靶向疗法为西妥昔单抗(cetuximab)，其藉由充当表皮成长因子受体(EGFR)的抑制剂而靶向癌细胞。当患者接受化学疗法与西妥昔单抗的治疗组合时，相比于仅接受化学疗法的患者，总存活持续时间的中值提高2.6个月(Vermorken等人,2008)。

鉴于此等患者的存活持续时间仅略微地提高，此后便批准替代癌症治疗。免疫疗法(依赖于患者的免疫系统，藉由刺激免疫反应而对抗癌症的治疗)包括以不同方式操作的不同治疗。一些免疫疗法治疗用于移除身体的免疫系统的抑制，而其他免疫疗法治疗用于训练免疫系统特异性地侦测及攻击癌细胞。

免疫疗法已展示为治疗HNSCC的似乎合理的方法，因为新兴的研究已展示HNSCC患者中存在高突变负载及高含量的肿瘤浸润淋巴细胞。Nasman等人，2012进一步报导浸润CD8⁺T细胞的高密度与患有人类乳突状瘤病毒感染阳性(HPV⁺)以及阴性(HPV^-)扁桃体鳞状细胞癌的患者的临床结果的间的正相关，突显HNSCC的免疫原性特性。

FDA批准的免疫疗法治疗的两个实例为尼沃单抗(nivolumab)及帕博利珠单抗(pembrolizumab)，其均为用于治疗晚期黑色素瘤、非小细胞肺癌及肾细胞癌的抗程式性细胞死亡蛋白质1(PD-1)单株抗体。此等免疫检查点抑制剂已在治疗头颈癌患者中显示有前景的结果，其中相比于标准疗法组中16％的存活率，当一组HNSCC患者接受尼沃单抗时，HNSCC患者的总存活率为36％。另外，相比于后一组中的患者，前一组中的此等患者的存活期长2.4个月，其中报导较少3级或4级事件(Ferris等人,2016)。

接受帕博利珠单抗以治疗复发性或转移性HNSCC的患者中的客观反应率，亦即肿瘤尺寸减小的完全反应或部分反应为16％。

此等结果为令人鼓舞的，但不管可用检查点抑制剂免疫疗法的有前景的功效，大比例的治疗患者有待回应于疗法。尽管未完全理解，众所周知的是个体中不存在预先存在的强抗肿瘤免疫反应可阻止药物的效率，因为抗肿瘤免疫性在影响肿瘤分期及控制癌转移中重要。

因而，因此需要能够增强个体的抗肿瘤免疫反应的替代免疫疗法方法，其因此增强当前免疫疗法的功效。

发明内容

本发明的目标因此为提供能够在患者中诱发抗癌反应的肽组合物。

本发明的另一目标为提供能够延迟患者中的肿瘤生长的肽组合物。

本发明的另一目标为提供用于在患者中诱发抗癌免疫反应的肽疫苗。

本发明的此等及其他目标经由使用肽组合物达成，其特征在于肽组合物包含至少四连接盒1(FJX1)肽及黑色素瘤抗原家族D4b(MAGED4b)肽。

更特定而言的，根据本发明，肽组合物PV1包含FJX1肽(F1)及MAGED4b肽(M6)，其与主要组织相容性复合体(MHC)I类分子结合以在个体中诱发抗癌免疫反应。

本发明的第二方面是关于根据PV1的肽疫苗，其中该肽疫苗包含至少M6肽及F1肽以藉由与MHC I类分子结合而在个体中诱发抗癌免疫反应。

本发明另外涉及一定量F1及M6肽的用途，其用于制造供治疗有需要的个体的头颈鳞状细胞癌(HNSCC)、乳癌、结肠癌、直肠癌、肺癌、前列腺癌或任何其他表现FJX1或/及MAGED4B的癌症类型中的任一者或组合用的药物，其中该药物能够与MHC I类分子结合以在个体中诱发抗癌免疫反应。

由于F1及M6肽为MHC I类特异性的，因此较佳的是肽组合物仅提供至具有匹配HLA亚型的个体。

附图说明

图1为关于MAGED4b及FJX1于HNSCC样品中的表现。图1(a)说明关于IHC染色的强度评分的代表性影像。图1(b)显示具有FJX1及MAGED4b表达的患者的百分比。

图2说明HNSCC患者中的肽特异性T细胞群体。在减去非肽负载对照之后显示识别肽负载二聚体(CD8、TCR及IgG1阳性T淋巴细胞)的平均抗原特异性T细胞群体。负载有FJX1(F1)、MAGED4b(M6)及PV1(M6及F1)肽的二聚体蛋白质可藉由来自HNSCC患者的固有T细胞识别。如在图2中所见，PV1肽可藉由相比于单一肽(单独的F1或M6)的较高T细胞群体识别。

图3说明在藉由PV1肽活体外刺激之后，HNSCC患者中分泌较高含量的细胞介素。图3(a)及图3(b)分别显示离体(ex vivo)及细胞毒性(CTX)ELISPOT检定中的干扰素γ(IFNγ)分泌及颗粒酶B分泌。

图4说明PV1肽在表现不同表现量的FJX1及MAGED4b的患者中引发T细胞反应的功效。图4(a)显示肿瘤组织的FJX1及MAGED4b染色的不同强度的代表性影像。图4(b)指示回应于细胞毒性ELISPOT检定中的PV1刺激的IFNγ及颗粒酶B分泌且与患者活体组织切片(biopsies)中的FJX1及MAGED4B表现量相关。图4(c)显示相比于具有可忽略的MAGED4B及FJX1表现的肿瘤，来自肿瘤高度表现至少1种靶抗原的患者的PBMC/T细胞更易于经刺激且回应于PV1刺激分泌较高含量的IFNγ及颗粒酶B分泌。

图5显示当相比于藉由格里斯检定(Griess assay)量测的脂多醣(LPS)时，M6、F1及PV1肽不藉由巨噬细胞增加过度的非特异性发炎反应。

图6显示在小鼠中测试时，PV1肽的免疫原性。图6(a)指示相比于暴露于非负载及无关肽负载二聚体时的仅基线或可忽略的反应，经PV1疫苗接种的小鼠显示可针对PV1负载二聚体反应的T细胞的显著增加。图6(b)显示经PV1疫苗接种的小鼠能够在离体ELISPOT中识别呈递PV1肽的T2细胞且以剂量依赖性方式诱发IFNγ分泌。

图7(a)说明在疫苗接种时段期间，经疫苗接种小鼠的体重。图7(b)显示经疫苗接种小鼠的主要器官(心脏、肺、肾、肝及脾)的影像。

图8指示相比于媒剂对照，经PV1肽疫苗接种的小鼠的肿瘤生长。

图9(a)及9(b)分别显示FJX1及MAGED4b蛋白质在OSCC及NPC细胞株中在mRNA水准下的过度表现。

图10指示MAGED4b及FJX1在各种癌细胞株中在蛋白质水准下的表现。图10(a)指示MAGED4b及FJX1于16个ORL细胞株(口腔癌细胞株)中的表现，图10(b)显示MAGED4b及FJX1于永生化NP/NPC细胞株(鼻咽(nasopharynx/nasopharyngeal)癌细胞株)中的表现。图10(c)展示未在正常口腔角质细胞中侦测到MAGED4B的表现，同时侦测到低含量的FJX1的表现。

图11(a)及11(b)显示FJX1及MAGED4b在具有源自癌症基因组图谱(TCGA)资料库(https://cancergenome.nih.gov/)的匹配正常样品的一组HNSCC样品中在转录组水准下的表现，其相对于TATA-盒结合蛋白(TBP)标准化。

图12显示MAGED4B及FJX1在包括肺癌(A549)、前列腺癌(PC3)、结肠直肠癌(HT-29、HCT-116)及乳癌(SKBR-3、MCF-7)细胞株的多个癌细胞株中在蛋白质水准下的表现。

具体实施方式

现将以更详细方式描述本发明的实施例，其中较佳实施例的实例及本发明的范畴将完全转达给熟习此项技术者。然而，应理解，本揭示内容不意欲将本发明限制于所揭示的精确形式，而是提供以使得本揭示内容将彻底且完整。

肽疫苗(一种免疫疗法形式)为基于致瘤抗原设计，且工作以针对个体中携有相同抗原的肿瘤细胞刺激细胞毒性免疫反应。在使用肽疫苗优于其他免疫疗法的若干优点中包含易于合成、诱发T细胞反应的功效及安全性，如在许多研究及试验中所展示(SlingluffCL,Jr,2011)。

然而，现有肽疫苗尽管可靠地诱发T细胞反应，但在诱发临床肿瘤消退中获得的成功有限，已存在关于限制单一抗原肽疫苗的功效的抗原异质性及抗原损失的担忧。因此，为了提高HNSCC中的肽疫苗成功率，应适应较宽免疫反应，尤其是可回应于多种抗原的免疫反应。

Yoshitake等人2015报导已指示当在HNSCC中同时使用多抗原疫苗时，实际上具有益处，因为相比于仅接受标准疗法的患者，患者存活期延长1.4个月，自3.5个月延长至4.9个月。另外，相比于具有阴性细胞毒性T淋巴细胞(CTL)反应的患者，产生CTL反应的疫苗接种患者具有较长总存活期。同样，此强有力地指示肽疫苗，特定言的多抗原肽疫苗能够藉由对肿瘤细胞引发细胞毒性杀死效应而加强针对肿瘤细胞的患者免疫反应。

然而，多抗原肽疫苗的开发归因于干扰而不容易。主要组织相容性复合体(MHC)分子对于获得性免疫系统识别外来分子为必需的，且工作以结合至源自细胞表面上的病原体的抗原以藉由适当T细胞识别。当共投予(co-administered)多抗原肽疫苗时，结合至相同MHC分子的疫苗的肽可彼此干扰，因为较低亲和力肽与MHC分子的结合受较高亲和力肽竞争性地抑制。此后便建议向身体的不同部分投予此等疫苗以降低干扰发生的机率。此方法仍然不实用，尤其当向患者投予的肽的数目增加时。

不管此事实，本申请案的发明人已成功地能够展示此后称为PV1的双抗原肽组合物在使用收集自口腔癌及鼻咽癌个体的外周血液单核细胞(PBMC)活体外诱发抗肿瘤反应中，及在动物模型中的免疫原性及功效。特定而言的，PV1包含至少两种能够与MHC I类分子结合以在个体中诱发抗癌免疫反应的肽。至少两种肽包含源自四连接盒1(FJX1)及黑色素瘤抗原家族D4b(MAGED4b)的肽。

应理解，术语“FJX1”或“F1肽”指基因、RNA产物或蛋白质产物且可互换地使用。

另外应理解，术语“MAGED4b”或“M6肽”指基因、RNA产物或蛋白质产物，且可互换地使用。

亦应理解，术语“PV1”、“PV1组合物”及“PV1肽”指M6及F1的DNA、RNA或蛋白质产物的组合且可互换地使用。

在产生此多抗原肽组合物期间，首先识别口腔癌及鼻咽癌个体中的MAGED4b及FJX1表现模式。获得由HNSCC肿瘤样品组成的组织微阵列且使用免疫组织化学(IHC)方法，藉由用抗MAGED4b及抗FJX1抗体探测组织切片而测定FJX1及MAGED4b的表现量。

HNSCC肿瘤样品中量测的FJX1及MAGED4b的表现量显示如下：

表1：显示表现MAGED4b或FJX1或两者的个体的百分比

如上表中所见，几乎所有个体(94.7％)的肿瘤组织样品，无论获自患有口腔癌(OSCC)的个体或患有鼻咽癌(NPC)的个体指示表现MAGED4b或FJX1。在收集的94个组织中，仅5个NPC组织不显示FJX1或MAGED4b的表现。100％患有OSCC的个体表现FJX1或MAGED4b。

MAGED4b及FJX1于HNSCC样品中的表现另外说明于图1中，其说明MAGED4b及FJX1于HNSCC肿瘤组织样品中的表现。抗体针对MAGED4b及FJX1的免疫反应性基于具有阳性染色的肿瘤细胞的百分比；4点强度评分系统评分，该系统介于强度0(阴性)、强度1(弱)及强度2-3(强)范围内，其描绘于图1(a)中。图1(b)反映由本发明人发现FJX1及MAGED4b表现于大于80％的早期及晚期OSCC及NPC肿瘤样品中。

已在马来西亚专利第MY-148542-A号及马来西亚专利申请第PI2011003259号(均由本发明人申请)中论述分别地，FJX1经显示表现于鼻咽癌患者中且MAGED4b表现于口腔癌患者中。

然而，应突显的是多抗原肽组合物情况下的困难(已在上文论述)为可能发生干扰，因为此等肽可彼此竞争结合至MHC分子，因此使得肽组合物的功效无效。尽管如此，将成功地显示所揭示的PV1组合物中的F1及M6肽的组合情况相反且实际上增加肽组合物的功效，其将在下文详述。

PV1包含源自FJX1及MAGED4b的肽，其中氨基酸序列如下表2及3中所列。除了确定肽组合的相容性的外，亦必要的是肽能够与MHC I类分子结合以诱发抗癌免疫反应。

表2：F1的肽序列

SEQ ID NO.	肽序列	针对HLA型的特异性
			1	WLLALGSLLAL	HLA-A2

表3：M6的肽序列

SEQ ID NO.	肽序列	针对HLA型的特异性
			2	RLSLLLVIL	HLA-A2

应了解，根据本申请案，FJX1及MAGD4b的肽序列的结构可经修饰或改变，修饰或改变包含肽序列中的氨基酸的删除(deletion)、取代(substitution)或插入(insertion)。

由于FJX1及MAGED4b均基于人类白血球抗原A2(HLA-A2)抗原决定位所设计，因此仅血液样品具有匹配HLA亚型的个体供本发明人使用。藉由使用藻红素(phycoerythrin,PE)标记的抗HLA-A2抗体对PBMC样品染色进行HLA-A2分型，且在流式细胞仪上分析。

为了维持此研究的精确性，包括阳性对照HLA-A2限制FluM衍生肽，及作为无关肽对照的HLA-A2限制人类免疫缺陷病毒(HIV)肽。两种对照的氨基酸序列如下所示：

表4：HLA-A2限制FluM衍生肽的肽序列

SEQ ID NO.	肽序列	针对HLA型的特异性
			3	GILGFVFTL	HLA-A2

表5：HIV肽的肽序列

SEQ ID NO.	肽序列	针对HLA型的特异性
			4	SLYNTYATL	HLA-A2

肽纯度为使用高效液相层析(HPLC)测定，所有纯度均高于80％。

根据本发明，肽可以合成方式制备或自天然来源，诸如天然肿瘤或病原生物体分离。

在PV1的免疫原性(immunogenicity)测定中，首先使用F1、M6及PV1肽测试经分离的PBMC中的内源性FJX1及MAGED4b特异性CD8⁺T细胞的存在，其中FluM及HIV肽分别在二聚体检定中用作阳性及无关肽对照。首先藉由培育二聚人类HLA-A2:Ig融合蛋白质、β2-微球蛋白及肽(F1、M6、PV1、FluM或HIV)的混合物隔夜而制备肽特异性二聚体。次日，将新分离的PBMC添加至制备的二聚体且培育，随后用磷酸盐缓冲盐水(PBS)洗涤。接着将PBMC再悬浮于PBS中且用异硫氰酸萤光素(fluorescein isothiocyannate,FITC)标记的抗IgG1、PE标记的抗CD8及别藻蓝蛋白(allophycocyanin,APC)标记的抗TCRα/β抗体染色。接着洗涤PBMC且再悬浮于PBS中且进行流式细胞测量术分析，其中肽特异性CD8⁺T细胞的存在为藉由评估为经IgG1-FITC、CD8-PE及TCRα/β-APC抗体阳性染色的PBMC确定。对给定肽具有特异性的CD8⁺T细胞的百分比计算为减去关于无肽情况下的染色获得的值之后的肽二聚体阳性CD8⁺T细胞的值。

如图2中所见，显示识别减去非肽负载对照之后的肽负载二聚体的平均抗原特异性T细胞群体。负载有F1、M6及PV1肽的二聚体蛋白质可藉由来自HNSCC个体的固有T细胞识别，其中7.1％的T细胞识别PV1肽，相比于单独的单一肽M6或F1的最高T细胞群体。此因此指示当组合使用两种肽时，PV1具有较强免疫原性。

接着，离体(ex vivo)及细胞毒性酶联免疫斑点(Enzyme-Linked ImmunoSpot,ELISPOT)检定分别用于评估干扰素γ(IFNγ)及颗粒酶B细胞介素分泌T细胞在单细胞水准的存在，及研究源自患者的肽脉冲CTL对过度表现靶抗原的靶细胞株的反应。

在离体ELISPOT检定期间，PBMC与介白素7(IL-7)及介白素12(IL-12)蛋白质一起在培养基中培育，随后用盐溶液洗涤PBMC且将其再悬浮于完全培养基中。接着，悬浮细胞分别与F1、M6、PV1、FluM及HIV肽混合且在抗人类IFNγ及颗粒酶B涂布的ELISPOT盘中培育。接着在略微修改制造商说明书的情况下进行ELISPOT检定。特定而言的，将悬浮细胞置于对应的ELISPOT盘上隔夜以捕获释放的细胞介素。次日，IFNγ及颗粒酶B侦测抗体稀释于含有人类AB血清的PBS中且在各对应盘中培育。接着洗涤且添加经稀释抗生蛋白链菌素标记的二级抗体且进一步培育该等盘。接着添加硝基蓝四唑鎓、5-溴-4-氯-3'-吲哚磷酸(BCIP/NBT)以及受质以使由细胞介素分泌T细胞形成的斑点可见。最后，侦测的斑点经定量及分析，其中肽特异性CTL为藉由减去未暴露于肽的背景对照孔中形成的斑点计算，且其中FluM及HIV肽分别用作阳性及无关肽对照。

细胞毒性ELISPOT检定用于研究源自患者的肽脉冲CTL对过度表现靶抗原的靶细胞株的反应。CTL与靶细胞共培养，其中将此培养物再悬浮于补充有IL-7及介白素2(IL-2)蛋白质的完全培养基中且施用于IFNγ及颗粒酶B ELISPOT盘。进一步培育细胞悬浮液以允许CTL与靶细胞株的间的相互作用，随后测定CTL针对表现FJX1及MAGED4b的靶细胞的潜在杀死能力。

自图3可见，在藉由PV1肽活体外刺激之后，HNSCC患者中分泌较高含量的细胞介素。图3(a)及3(b)中的图显示离体及细胞毒性(CTX)ELISPOT检定中的IFNγ及颗粒酶B的分泌。在肽刺激之前，针对M6、F1及PV1的固有T细胞反应较低。在藉由肽脉冲树突状细胞刺激T细胞之后，细胞毒性ELISPOT结果显示PV1诱发相当或较好的针对靶细胞(195M及C666.1F)的细胞毒性T细胞反应，分泌较高含量的IFNγ及颗粒酶B。

亦发现相比于微弱表现MAGED4b及/或FJX1的肿瘤，患有过度表现MAGED4b及/或FJX1的肿瘤的患者在PV1刺激之后反应较好，指示PV1的特异性。

为了进一步阐述，图4指示基于肿瘤组织的FJX1及MAGED4b染色强度的4组个体。图4(a)说明对患者肿瘤样品染色中的FJX1及MAGED4b的不同表现量的代表性影像。在图4(b)中可见，相比于具有低FJX1或MAGED4b表现的患者，在肿瘤中表现高含量的此等蛋白质的患者当藉由PV1刺激时具有较好反应，且在细胞毒性ELISPOT检定中分泌较高含量的颗粒酶B及IFNγ。另外，亦可在图4(c)中看出，表现高含量的两种抗原的患者在藉由PV1刺激之后具有较好的针对靶细胞的反应，而表现低含量的两种抗原的患者对刺激无反应，表明PV1肽疫苗的特异性。

为了评估肽是否引起任何细胞毒性或非特异性发炎性反应，藉由巨噬细胞量测发炎反应的格里斯检定(Griess assay)首先用于评估藉由M6及F1肽诱发的发炎水准。小鼠巨噬细胞用各种浓度的M6、F1及PV1肽处理。含二甲亚砜(DMSO)的PBS用作阴性对照，而LPS用作阳性对照。基于由小鼠巨噬细胞产生的诱导型一氧化氮合成酶(inducible nitricoxide synthase,iNOS)的含量间接量测发炎程度。

图5(a)显示小鼠巨噬细胞上藉由M6或F1肽诱发的发炎的程度。可见不管投予的M6肽的浓度，在M6肽存在下藉由小鼠巨噬细胞产生的亚硝酸盐比接受LPS刺激的小鼠巨噬细胞低7倍。类似地，此亦可观测于F1肽存在下的小鼠巨噬细胞中，其中亚硝酸盐释放的量比阳性对照(LPS)的释放量低10倍。鉴于藉由M6及F1肽的低亚硝酸盐产量，可因此表明iNOS表现的上调不由该等肽刺激，随后指示藉由M6及F1肽诱发的发炎的程度较低且不预期藉由诱发非抗原特异性反应而引起非所需效应。

当M6及F1肽组合为PV1肽时显示相同结果，其中iNOS积聚的量显著低于LPS处理组中的彼等，如图5(b)中所见。

接着，运行另外的评估以确定PV1组合物于动物模型中的评估。

带有获自使用患者PBMC的二聚体及ELISPOT检定的结果，使用转殖基因小鼠模型评估PV1的免疫原性及功效，其实现针对HLA-A2呈递抗原的人类T细胞免疫反应的建模。

小鼠经如下表中所见的6种不同处理组疫苗接种：

表6：疫苗接种小鼠的处理组

组	处理
		第1组：	5％DMSO
第2组：	IFA
		第3组：	100μg PV1+IFA
第4组：	500μg PV1+IFA
		第5组：	1000μg PV1+IFA
第6组：	2000μg PV1+IFA

其中DMSO为二甲亚砜，PV1为包含M6及F1肽的组合物，且IFA为不完全弗氏佐剂(Incomplete Freund's adjuvant)。

在疫苗接种时段之后，小鼠经安乐死且自小鼠脾脏收获免疫细胞。疫苗接种小鼠的IFNγ分泌肽特异性CD8⁺T细胞的存在为使用二聚体检定测定且与媒剂对照组的结果比较。

接着，使用ELISPOT检定，评估能够执行细胞毒性功能以在疫苗接种后杀死呈递肽的癌细胞的T细胞群体。

如图6(a)中所见，相比于媒剂对照小鼠，经低至500μg浓度的PV1疫苗接种的小鼠能够展示针对PV1负载二聚体的高识别。此反应为肽特异性的，因为疫苗接种小鼠在暴露于非负载及无关肽(HIV)负载二聚体时显示基线或可忽略的反应。

另外，来自疫苗接种小鼠的固有T细胞亦能够识别呈递PV1肽的T2细胞，且能够在离体ELISPOT检定中以剂量依赖性方式执行针对此等T2细胞的杀死活性，如图6(b)中所见。同样地，此指示及促进PV1疫苗接种可增加此等小鼠中的PV1识别T细胞的暗示。

有利地，应注意，在整个疫苗接种时段中，一周一次地获取小鼠体重。未在此时段期间观测到体重损失或不良事件。另外，从来自所有投予PV1的处理组的小鼠收获主要器官，诸如心脏、肺、肾、肝或脾，其中未在此等小鼠中观测到局部毒性。此另外说明于图7(a)及7(b)中。

由于500μg浓度的PV1能够在免疫原性测试中刺激针对PV1的T细胞识别，因此选择1000μg在后续评估中测试以测定PV1在延缓肿瘤生长中的功效。将总共1×10⁶个表现人类HLA-A2(AAD)及MAGED4b基因的同基因型B16黑素瘤细胞皮下移植至小鼠中。在肿瘤尺寸达到30-50mm³之后，将小鼠随机分配至两个处理组。第一组接受1000μg伴以不完全弗氏佐剂(IFA)的PV1肽，而媒剂对照组接受含5％DMSO的PBS。每周两次量测肿瘤尺寸。

如图8中所说明，可见用PV1及佐剂处理的小鼠显示相比于媒剂对照组的肿瘤生长延缓。此因此指示PV1能够延缓肿瘤生长。

基于以上结果，PV1强烈地指示其在延缓肿瘤生长中高效，伴以可忽略的(若存在)对疫苗接种小鼠的主要器官的副作用。

PV1肽疫苗已展示为在活体外及活体内两者中具免疫原性。最重要的是，使用PV1已展现针对活体外表现MAGED4b及FJX1的靶癌细胞株的抗原特异性细胞毒性及延缓的活体内肿瘤生长，表明PV1作为HNSCC的候选治疗疫苗的潜力。有益地，PV1不仅可使HNSCC患者受益，且亦可使罹患乳癌、结肠癌、肺癌、前列腺癌及直肠癌的患者受益。在下表7中，本发明人显示MAGED4b及FJX1亦表现于患有乳癌、结肠癌、肺癌、前列腺癌及直肠癌的患者的肿瘤组织中。

表7：显示为表现MAGED4b或FJX1或两者的患者的百分比，及各蛋白质的表现量

(a)

(b)

(c)

(d)

(e)

从上表7可见，FJX1及/或MAGED4b表现于大于90％的OSCC及NPC样品中。此两种抗原亦表现于患有乳癌、结肠癌、肺癌、前列腺癌及直肠癌的患者的组织中。约97％患有此等癌症类型的个体量测为表现MAGED4b或FJX1[表7(d)]。在此5种癌症类型的早期及晚期阶段肿瘤两者中侦测到MAGED4b及FJX1的表现(表7)。鉴于两种蛋白质均在几乎一半的此等癌症类型中高度过度表现，此强烈指示可产生包含FJX1及MAGED4b的肽组合物以不仅治疗HNSCC个体，且亦治疗患有乳癌、结肠癌、肺癌、前列腺癌及直肠癌的个体。

根据本申请案，肽组合物可进一步开发为多抗原肽疫苗。特定而言的，可开发包含至少FJX1及MAGED4b肽的疫苗以藉由与MHC I类分子结合而在个体中诱发抗癌免疫反应。在较佳实施例中，MHC I类分子为HLA-A2分子。

肽疫苗可与任何可用的癌症治疗处理组合使用。以免疫检查点抑制剂为例，当单独使用时，免疫检查点抑制剂可能不足以再活化患者的免疫系统。然而，当与PV1组合使用时，咸信增加抗原特异性T细胞库的方法能够进一步增强HNSCC患者的反应率。

然而，应了解，癌症治疗处理不限于单独的免疫检查点抑制剂，且可包含其他癌症治疗处理。

另外，佐剂亦可与PV1及所选癌症治疗处理组合投予以提高针对PV1的免疫反应。佐剂的实例，诸如弗氏佐剂或人类粒细胞巨噬细胞集落刺激因子(GM-CSF)可为适用的。

或者，肽组合物亦可用于制造药物。特定而言的，有效量的FJX1及MAGED4b可用于制造供治疗有需要的个体的HNSCC、乳癌、结肠癌、直肠癌、肺癌或前列腺癌中的任一者或组合用的药物，其中药物能够与MHC I类分子结合以在个体中诱发抗癌免疫反应。

包括以下实例以进一步揭示本发明的较佳实施例。然而，应了解，如以下实例中所用的技术表示由本发明人发现在本发明的实践中运行良好的技术，且可因此认为构成其实践的较佳模式。然而，熟习此项技术者可适应所揭示的特定实施例中的变化且仍可获得相同或类似结果而不背离本发明的范畴。

实例1

材料及方法

患者樣品

来自马来西亚的4所中心医院(Penang General Hospital,Penang、TengkuAmpuan Rahimah Hospital,Selangor、University of Malaya Hospital,Kuala Lumpur及Tung Shin Hospital,Kuala Lumpur)的新诊断HNSCC患者登记进行此研究。此项目经马来亚大学牙科学院机构审查委员会(Institutional Review Board,Faculty of Dentistry,University of Malaya)[参考：DF OS0910/0049(L)]及马来西亚卫生部医学研究及伦理学委员会(Medical Research and Ethics Committee,Ministry of Health,Malaysia)(NMRR-09-944-4848)批准。

研究目的为向所有患者解释，在收集血液样品之前获得书面知情同意书。

血液样品经处理以测定每一患者的HLA分子类型，其将详细描述于下文中。所有患者的人口统计资讯显示于下表8中。

表8：募集的HLA-A2患者的临床特征的概述

细胞株

口腔癌(ORL-48、ORL-115、ORL-136、ORL-150、ORL-153、ORL-156、ORL-166、ORL-174、ORL-188、ORL-195、ORL-196、ORL-204、ORL-207、ORL-214、ORL-215、ORL-247)、鼻咽癌(NP69、NP640、HK1、TW01、C666.1、HeLa/S及HeLa/T)、乳癌(MCF-7及SKBR-3)、结肠癌(HT-29及HCT-116)、前列腺癌(PC-3)、肺癌(A549)细胞株、四种正常口腔角质细胞原代培养物(ORL-231、ORL-295、ORL-235、ORL-232)及两种永生化鼻咽(NP)细胞株NP69及NP460供本发明人使用。HeLa/S及HeLa/T为先前误认作NPC细胞株的HeLa细胞的变异体(Ye等人，2015)。此等细胞株经购买(Gibco,Thermo Fisher,MA,USA)且在推荐培养基(用于口腔癌细胞株的DMEM/F12；用于鼻咽癌、乳癌、结肠癌及肺癌细胞株的RPMI-1640)中培养且补充有2mML-麸酰胺酸(Sigma Aldrich,MO,USA)及10％胎牛血清(Gibco,Thermo Fisher,MA,USA)。而角质细胞-SFM(Gibco,Thermo Fisher,MA,USA)用于培养正常口腔角质细胞及非恶性鼻咽细胞株。过度表现靶抗原的细胞株ORL195-MAGED4B(称为195M)及HeLa/T-FJX1(称为HeLa/T-F)用作西方墨点实验中的阳性对照。过度表现FJX1的C666.1-A2细胞株(如由Dr.RicardoDolcetti,Centro di Riferimento Oncologico,Italy所提供)(称为C666.1F)；及过度表现MAGED4B的ORL-195(称为195M)用作细胞毒性ELISPOT检定中的靶细胞株，该检定将更多描述于下文。用于此研究中的所有细胞株已在其用于此研究中之前经认证。

肽

用于此实例中之肽包含源自FJX1(F1)及MAGED4b(M6)的两种HLA-A2限制肽。HLA-A2限制FluM衍生肽用作阳性对照且HIV肽用作无关肽对照。肽的序列如表2-5中所示。用于此研究的所有肽由JPT Peptide Technologies(Berlin,Germany)商业生产。肽的纯度经测定且经由使用HPLC确保，其中肽的纯度结果高于80％。

定量PCR(qPCR)

定量PCR(qPCR)用于测定OSCC及NPC细胞株中的两种靶抗原M6及F1抗原的mRNA含量。来自所有16个OSCC及7个NPC细胞株的总RNA为使用Nucleospin RNA II纯化套组(Macherey-Nagel,Düren,Germany)提取且用于使用oligo(dT)引子及Superscript II(Invitrogen,Thermo Fisher,MA,USA)合成cDNA。定量PCR藉由标准SYBR Green协定，使用ABI序列侦测系统(Applied Biosystems,Germany)进行。3-磷酸甘油醛去氢酶(GAPDH)经扩增且充当内部对照。

所用引子如下(SEQ ID NO:5-SEQ ID NO:10)：

FJX1：有义5'CCCGCAAAGGTGTCTAAAAACT3'及

反义5'GTGCTGGCACAGTAAAGAATCCT3'；

MAGED4b：有义5'CCAGAATCAGAACCGAGA3'及

反义5'CCAAAATCTCCGTCCTCA3'；

GAPDH：有义5'GAAGGTGAAGGTCGGAGTC3'及

反义5'GAAGATGGTGATGGGATT TC 3'。

当相比于正常口腔及鼻咽组织的表现量时，相对表现的最小2倍增加视为过度表现。

西方墨點法(Western blot)

细胞藉由补充有1×HALT蛋白酶抑制剂混合液(Pierce Biotechnology,IL,USA)的RIPA溶解缓冲液(5％NaDOC，1％SDS，25mM HEPES pH 7.5，1M HCl，1.5mM MgCl₂，1mMEDTA，1％Triton X-100，1mM DTT)在冰上溶解。在10000g下在4℃下离心20分钟之后，收集细胞溶解物。使用Bradford蛋白质检定(Pierce Biotechnology,MA,USA)测定总蛋白质的浓度。50μg总蛋白质经受12％及10％SDS-聚丙烯酰胺凝胶电泳(分别用于侦测FJX1及MAGED4b蛋白质)且转移至Immobilon-P膜(Millipore,MA,USA)上。墨点经5％脱脂奶(Tris缓冲生理盐水伴以0.1％Tween-20，TBST)阻断1小时且另外与以下一级抗体一起培育：抗MAGED4B(1:1000，Sigma Aldrich,MO,USA)、抗FJX1(1:2000，Aviva Systems Biology,CA,USA)。墨点在含有0.1％Tween-20的TBS缓冲液(TBS-T)中洗涤(3次，各持续5分钟)且接着藉由与辣根过氧化酶(horseradish peroxidase)结合的对应二级抗体(1:10000；SouthernBiotech,AL,USA)探测1小时。在TBS-T中洗涤之后，经由增强型化学发光方法，使用FluorChem HD2成像系统(ProteinSimple,CA USA)进行侦测。以抗GAPDH(1:1000，Trevigen,MD,USA)或抗肌动蛋白(1:1000，Milipore,CA,USA)抗体作为各实验的管家对照(housekeeping control)而探测墨点。

免疫组织化学

研究中包括的由NPC(n＝74)、OSCC(n＝49)及179个多种癌症(乳癌，n＝41；结肠癌，n＝30；肺癌，n＝48；前列腺癌，n＝44；直肠癌，n＝16)组成的组织微阵列(Tissuemicroassay,TMA)切片购自Biomax(MD,USA)。藉由免疫组织化学(IHC)，使用抗MAGED4B(1:100；目录号HPA003554；Sigma Aldrich,MO,USA)及抗FJX1(1:200；目录号HPA059220；SigmaAldrich,MO,USA)抗体，接着藉由侦测系统，使用DakocytomationEnvision+Dual LinkSystemHRP(DAB+)套组(Dako,Glostrup,Denmark)来侦测靶蛋白的表现量。亦对来自登记进行PV1功效评估的患者的存档FFPE OSCC及NPC组织切片进行IHC分析。两种抗体的免疫反应性为基于具有阳性染色的肿瘤细胞的百分比及4点强度评分系统评分：0＝阴性表现；1＝弱阳性；2＝中等阳性；3＝强阳性(Charafe-Jauffret等人，2004)。所有IHC分析由认证的病理学家评估。自分析排除具有缺失、不完全核心，或太小而无法评估的肿瘤的组织微阵列。

制备周边血液单核细胞(PBMC)

在CPT真空管(Becton Dickinson,USA)中收集来自OSCC或NPC患者的35ml血液且根据制造商说明书分离PBMC。接着在汉克氏平衡盐溶液(Hanks'Balanced Salt Solution；HBSS)(Gibco,Thermo Fisher,MA,USA)中洗涤PBMC且再悬浮于含有补充有5％热灭活人类AB血清(Gemini Bio-Product,CA,USA)、1×青霉素/链霉素(Gibco,Thermo Fisher,MA,USA)及2mML-麸酰胺酸的洛斯维帕克纪念研究所(RPMI)培养基(Gibco,Thermo Fisher,MA,USA)的完全培养基中。经分离的PBMC接着用于经由使用HLA-A2:Ig二聚体检定以及离体及细胞毒性ELISPOT检定进行HLA分型，其将详细描述于下文。

血液标本的HLA分型

鉴于FJX1及MAGED4b肽均为HLA-A2特异性的，本发明人仅利用具有匹配HLA亚型的血液样品。HLA-A2状态为藉由使用藻红素(PE)标记的小鼠抗人类HLA-A2抗体(纯系BB7.2；BD Pharmingen,CA,USA)染色PBMC样品而测定。经PE标记的小鼠抗人类HLAIgG2b k-同型(纯系BB7.2；BD Pharmingen,CA,USA)及小鼠抗人类HLA-ABC(纯系DX17；BD Pharmingen,CA,USA)染色的PBMC分别用作阴性及阳性对照。为了染色，细胞与适当抗体一起在4℃下培育1小时，经洗涤，且在FACSCanto 2细胞计数器(BD Biosciences,CA,USA)上分析。

二聚体检定

使用HLA-A2:Ig二聚体检定评估HLA-A2阳性NPA及OSCC患者的PBMC中的内源性FJX1及MAGED4b特异性CD8⁺T细胞的存在。肽特异性二聚体藉由组合1μg重组可溶二聚人类HLA-A2:Ig重组蛋白(BD Pharmingen,CA,USA)、0.25μgβ2-微球蛋白(Sigma Aldrich,MO,USA)及5μg肽(F1、M6或PV1)制备且在37℃下培育隔夜。负载有完全培养基(CM)及β2-微球蛋白的二聚体用作背景对照，负载有HIV肽及β2-微球蛋白的二聚体用作无关肽对照，且具有β2-微球蛋白的FluM负载的二聚体用作阳性对照。次日，将新分离的PBMC添加至独立圆底聚丙烯管(BD Falcon,CA,USA)中的对应肽负载二聚体中且在4℃下培育30分钟且用1ml磷酸盐缓冲盐水(PBS)洗涤。细胞接着再悬浮于100μl PBS中且用FITC结合的大鼠抗小鼠IgG1(纯系A85-1；BD Biosciences,CA,USA)、PE结合的小鼠抗人类CD8(纯系HIT8a；BDBiosciences,CA,USA)及APC结合的小鼠抗人类TCRα/β(纯系BW242/412；MiltenyiBiotech,Germany)在4℃下染色1小时。接着洗涤细胞且再悬浮于PBS中且使用FACSCanto 2细胞计数器(BD Biosciences,CA,USA)进行流式细胞测量术分析。肽特异性CD8⁺T细胞的存在为藉由评估为对IgG1、CD8及APC呈阳性的细胞测定，且对给定肽具有特异性的CD8⁺T细胞的百分比且计算为减去关于无肽情况下的染色获得的值之后的肽二聚体阳性CD8⁺T细胞的值。

离体ELISPOT

树突状细胞(DC)及细胞毒性T-淋巴细胞(CTL)分离及培养

来自患者的树突状细胞经分离且随后用作抗原呈递细胞。简言之，将PBMC再悬浮于巨噬细胞-无血清培养基(M-SFM)(Gibco,Thermo Fisher,MA,USA)中，接种于6孔盘中且在37℃下培育1小时。在培育之后，收集来自PBMC的非黏附细胞，在HBSS中冲洗且接着再悬浮于含有10ng/ml IL-7的完全培养基中。每孔大致2-5×10⁵个细胞接种至圆底96孔盘中。细胞接着在37℃下培育2-5天以藉由添加50μg/ml肽而扩增T细胞。由培育产生的黏附细胞在37℃下，在M-SFM中，在100ng/ml GM-CSF及25ng/ml IL-4存在下培养2-5天以诱发树突状细胞(DC)的分化。藉由用培养基取出细胞而自培养皿收集分化DC且接着等分至1.5ml离心管中，与50μg/ml肽(F1、M6及PV1)一起在37℃下培育2小时，随后施用于源自非黏附PBMC的成熟T细胞。在共培养18-24小时之后，将10ng/ml IL-2添加至DC/T细胞培养物且再培育24小时。在培育之后，含有IL-2的培养基经新鲜完全培养基置换且在37℃下另外培育3-5天以使细胞毒性T-淋巴细胞(CTL)活化。CTL接着在扩增后细胞毒性ELISPOT检定中与靶细胞(195M及C666.1F)共培育以测定CTL针对FJX1或MAGED4b表现靶细胞的潜在杀死能力。

细胞毒性ELISPOT检定

细胞毒性ELISPOT检定用于研究源自患者的肽脉冲CTL对过度表现靶抗原的靶细胞株的反应。CTL与195M及C666.1F以20:1的靶效比共培养，且将此培养物再悬浮于200μl补充有20ng/ml IL-7及IL-2的完全培养基中且接着以每孔100μl施用至IFNγ或颗粒酶BELISPOT盘。细胞悬浮液接着在37℃下另外培育16小时。接着，如上文所述地进行ELISPOT检定。

结果

患者人口统计资料

收集来自41个HNSCC(NPC及OSCC)患者的外周血(peripheral blood)用于此研究。其中，约50％(20/41)为HLA-A2阳性且用于后续分析。在此等患者中，16/20为NPC患者且4/20为OSCC患者。此等HLA-A2阳性患者中的80％(16/20)来自重病阶段(阶段III及阶段IV)且此等患者的人口统计资料显示于表8中。在20个HLA-A2患者中，来自15个患者的样品经受二聚体检定，同时16个经受离体及细胞毒性ELISPOT检定。其余的样品由于不充分PBMC或次佳样品品质(血液溶解)而自实验排除。

MAGED4B及FJX1为在HNSCC中过度表現的肿瘤抗原

本发明人先前已展示MAGED4b及FJX1分别在OSCC及NPC中过度表现，尽管表现在其各别正常对应物中可忽略(Chong等人，2012；Chong等人，2009；Ahmad Zabidi MM 2011；Bose等人，2009)。在此研究中，在扩展的HNSCC样品集合中筛选此2种抗原中的过度表现。获得的资料显示FJX1过度表现于NPC及OSCC细胞株两者中。如图9(a)中所见，当分别相比于正常口腔角质细胞及正常鼻咽组织时，在5/16个OSCC(ORL-150、ORL-153、ORL-156、ORL-174及ORL-48)及6/7个NPC(HK1、TW01、TW04及C666.1)及永生化NP(NP69及NP460)细胞株中侦测到mRNA含量的大于2倍增加。值得注意的是，观测到相比于正常口腔角质细胞[图10(c)]，所有OSCC(除了ORL-136)及NP/NPC细胞株在蛋白质层级表现显著含量的FJX1[图10(a)]。类似地，对于MAGED4B，发现mRNA含量在OSCC细胞株ORL-153、永生化NP69及NPC细胞株C666.1中为大于2倍[图9(b)]。值得注意的，当相比于阳性对照[异位地过度表现MAGED4B的细胞；图10(a)及10(b)]时，所有OSCC(除了ORL-195及ORL-48)及所有NPC细胞株显示蛋白质层级的MAGED4B的边缘表现，且在正常口腔角质细胞的原代培养物中，未侦测到MAGED4B表现[图10(c)]。本发明人亦研究具有来自TCGA资料库(癌症基因组图谱(Cancer Genome Atlas)N.2015)的匹配正常资料的43例头颈癌的RNAseq资料且指出当相比于匹配正常资料时，大于60％的肿瘤群体具有显著较高含量的FJX1[图11(a)，p<0.01]且约40％的群体具有较高含量的MAGED4B[图11(b)，p<0.01]。

本发明人随后证实商业上获得的TMA中的MAGED4B及FJX1表现量的此等观测结果由OSCC及NPC核心(统称为HNSCC)组成且代表性染色显示于图1(a)中。广泛地，MAGED4B及FJX1表现均在蛋白质层级侦测，其中染色强度评分介于0、1、2及3范围内。在大多数OSCC样品(分别为49/49及47/49)中侦测到MAGED4B及FJX1的表现；而对于NPC情况，侦测到存在两种蛋白质(MAGED4B；58/63及FJX1；64/74)[表7(a)]。当两种TMA在一起分析时，本发明人展示此等HNSCC样品中的高达94.7％(89/94)过度表现MAGED4B或FJX1且仅5.3％(5/94)情况对两种抗原均呈阴性[表7(b)]。然而，未在FJX1的染色强度与疾病阶段或组织分化程度的间发现显著相关性。另一方面，MAGED4B的表现量与OSCC样品(p＝0.016)及NPC(p＝0.007)的分化程度显著相关，但不与任何疾病阶段相关，如下表中所见。

表9：比较IHC染色強度与分期及分化程度的统计分析

抗原	测试参数	NPC	OSCC
				FJX1	阶段(早期/晚期)	p＝0.475	p＝0.977
	分化程度(I/II/III)	p＝0.051	p＝0.694
				MAGED4B	阶段(早期/晚期)	p＝0.913	p＝0.276
	分化程度(I/II/III)	p＝0.007	p＝0.016

内源性T细胞识别PV1存在于HNSCC患者中

由于MAGED4B及FJX1均展示为存在于HNSCC患者中，因此假设亦将存在MAGED4B及/或FJX1特异性CD8⁺T细胞。使用二聚体检定，本发明人确定能够识别PV1肽(MAGED4B及FJX1肽)的CD8⁺T细胞(CD8+TCR+IgG1+)的百分比。本发明人展示在所有分析的HNSCC样品(15/15)中存在PV1特异性CD8⁺T细胞，藉由非肽负载二聚体对照标准化之后的平均值在2.6％-7.1％范围内(图2)。侦测的平均内源性PV1特异性T细胞群体相比于单一F1(2.6％；p<0.001)或M6特异性T细胞(4.6％；p＝0.177)群体较高(7.1％)，表明当组合使用两种肽时，免疫原性较强。当相比于非负载二聚体对照(p＝0.125)时，未在识别HIV肽负载二聚体的T细胞群体的间观测到显著差异。尽管T细胞群体识别阳性对照，当相比于非负载二聚体对照(p<0.001)时，FluM肽负载二聚体显著较高。

本发明人接着使PV1特异性CD8⁺T细胞的存在与MAGED4B及FJX1的表现相关。MAGED4B、FJX1以及MAGED4B与FJX1抗原特异性CD8⁺T细胞的平均百分比用作截止以将患者分组为高及低抗原特异性T细胞。本发明人展示约33％具有高含量的识别F1、M6及PV1负载二聚体的抗原特异性T细胞的患者表现高含量的FJX1及MAGED4B两者。相反，仅10％具有低含量的抗原特异性CD8⁺T细胞的患者高度表现两种抗原。惊人地，表现极少FJX1及MAGED4B两者的患者始终显示低百分比的F1、M6及PV1抗原特异性T细胞，如下表中所见。

表10：在二聚体检定中具有高于/低于平均百分比的CD8+抗原特异性T细胞百分比的患者及其对于肿瘤组织的抗原(F；FJX1及M；MAGED4B)表现。“H”表示“高表现”且“L”表示“低/弱表现”。

PV1肽活体外(in vitro)诱发自HNSCC患者T细胞的细胞毒性细胞介素分泌

随后，本发明人试图确定使用PV1肽是否将能够增加细胞毒性T细胞的含量。为了测定PV1在HNSCC患者(n＝16；15个样品与用于HLA-A2:Ig二聚体检定中的样品重叠)中诱发细胞毒性活性的功效，本发明人藉由M6、F1或PV1(F1及M6)活体外刺激患者的T细胞，且将T细胞暴露至表现MAGED4B(195M)或FJX1(C666.1F)的靶细胞。在任何刺激之前，离体ELISPOT检定显示尽管在HLA-A2:Ig二聚体检定中侦测到肽特异性T细胞，刺激之前的IFNγ及颗粒酶B细胞介素分泌细胞(CSC)的细胞数较低[图3(a)及3(b)]。如图3(a)及3(b)中所见，在藉由M6、F1或PV1活体外刺激之后，细胞毒性ELISPOT(CTX ELISPOT)检定显示溶细胞活性(cytolytic activity)增加，导致当相比于离体ELISPOT中的细胞介素分泌细胞群体时，IFNγ及颗粒酶B两者的细胞介素分泌细胞数目较高。总体而言，当相比于先前肽刺激时，对M6、F1或PV1肽的HNSCC患者T细胞反应展示细胞毒性ELISPOT检定中的细胞介素分泌的2.4至39.7倍增加。然而，HIV肽亦在刺激之后诱发增加水准的IFNγ及颗粒酶B分泌。

T细胞活化水准在肿瘤表现高MAGED4B及FJX1的HNSCC患者中较高

在用于ELISPOT检定的16个患者样品中，本发明人能够自12/16个患者获得存档的FFPE肿瘤块。接着进行IHC以测定MAGED4B及FJX1于此等肿瘤中的表现。本发明人接着基于IHC染色强度[图4(a)]将患者分为4组(FJX1-低、FJX1-高、MAGED4B-低及MAGED4B-高)，且在藉由肽刺激之后于细胞毒性ELISPOT检定中比较患者的T细胞反应。染色强度0分类为阴性，强度1分类为低表现且强度2-3视为高表现。当相比于具有低FJX1或MAGED4B表现的患者时，具有较高FJX1或MAGED4B表现的患者展示较高数目的细胞介素分泌细胞(IFNγ或颗粒酶B)[图4(b)]。本发明人亦发现相比于对肿瘤表现高含量的FJX1或MAGED4B的患者，对组织具有低FJX1以及MAGED4B表现量的患者较少回应于PV1刺激[图4(c)]。资料表明表现高含量的FJX1或MAGED4B的HNSCC患者的免疫系统更易于经PV1肽疫苗刺激。

PV1可在其他癌症患者中具有有益效应

为了调查其他癌症中的FJX1及MAGED4B表现及识别可受益于PV1疗法的潜在患者群体，本发明人使用患有5种最常见癌症(乳癌、肺癌、结肠癌、前列腺癌及直肠癌)的一组TMA研究MAGED4B及FJX1的表现。结果展示在所有5种癌症的大于80％患者中侦测到MAGED4B的表现且在FJX1表现可见类似观测结果，除了仅约50％的结肠癌患者对于FJX1呈阳性。当共同地分析MAGED4B及FJX1两者的表现时，本发明人显示大于90％的乳房、结肠、肺、前列腺及直肠肿瘤组织具有MAGED4B或FJX1表现[表7(a)]。总体而言，不管疾病阶段，MAGED4B及FJX1在乳癌、结肠癌、肺癌、前列腺癌及直肠癌肿瘤中展示为过度表现[表7(b)]。对此5种癌细胞株(A549，肺癌；PC3，前列腺癌；HT-29，结肠直肠癌；HCT-116，结肠直肠癌；SKBR-3，乳癌；MCF-7，乳癌)的西方墨点法分析显示MAGED4B表现在A549及PC3细胞株中较高，同时表现量在HCT-116、SKBR-3及MCF-7中较弱。另一方面，显示FJX1表现于除了PC3的6个测试细胞株中的5个(A549、HT-29、HCT-116、SKBR-3及MCF-7)中(图12)，表明PV1可在靶向表现MAGED4B及/或FJX1的此等癌症中具有潜力。

论述

许多肿瘤倾向于具有通常仅在诸如睾丸的免疫位点中(Inaoka等人，2011；Gjerstorff等人，2015)及在胚胎发生期间(Lawrence等人，2011；Becker等人，2012)表现的蛋白质的失调表现。此等抗原的独特表现使其成为癌症疗法的良好标靶。吾人的前述研究识别2种肿瘤抗原FJX1及MAGED4B，其参与此类过程，分别在正常情况下具有可忽略的表现但在NPC及OSCC中过度表现(Chai等人，2015；Chong等人，2012)。在此研究中，本发明人将该群体消耗于较大数目的细胞株及肿瘤样品。IHC资料展示大部分OSCC及NPC肿瘤具有MAGED4B或FJX1的过度表现。显示FJX1在HNSCC细胞株及肿瘤组织中过度表现。但对于MAGED4B，尽管IHC染色在大多数HNSCC肿瘤组织中显示阳性染色，但侦测的MAGED4B的表现量在HNSCC癌细胞株中较低。此可能归因于抗原于长期培养环境中的损失。其他相关研究显示MAGED4B表现与肿瘤分化程度相关，但本发明人未在2种抗原的表现与患者的疾病分期的间发现任何显著相关性。由于OSCC及NPC构成大部分头颈癌(HNSCC)病例，本发明人假设MAGED4B及FJX1均可为HNSCC的重要标靶。总体而言，发明人确认此两种抗原在约90％的HNSCC患者中过度表现且充当HNSCC患者的良好治疗标靶。除此以外，本发明人亦显示MAGED4B及FJX1存在于其他癌症类型的肿瘤中，包括乳癌、结肠癌、肺癌、前列腺癌及直肠癌，指示靶向此2种抗原不仅可有益于HNSCC患者，且亦潜在地有益于罹患乳癌、结肠癌、肺癌、前列腺癌及直肠癌的患者。

本发明人设计MAGED4B特异性及FJX1特异性肽疫苗以分别靶向OSCC及NPC。本发明人显示来自OSCC及NPC患者的PBMC经分别源自MAGED4B及FJX1的肽疫苗的脉冲能够引发针对靶癌细胞的细胞毒性免疫反应。然而，由于肿瘤的异质性性质及癌细胞随著其进展而损失抗原表现的可能性(Cecco等人，2011)，靶向单一肿瘤抗原作为治疗模式始终不足。为了克服此类限制，重要的是靶向多个抗原以诱发较宽免疫反应，以确保可根除大部分肿瘤，以避免选择抗原阴性纯系(Gerdemann等人，2011)，且同时有益于较大患者群体。对食道癌患者的前述研究显示多种抗原肽疫苗可在患者中引发更稳固免疫反应。相比于针对单一抗原肽具有CTL反应的患者，对多种抗原肽疫苗具有CTL反应的患者赋予较好总存活期(Kono等人，2012)。在当前研究中，本发明人组合MAGED4b及FJX1(称为PV1)的肽且试图以靶向头颈癌患者的双抗原肽疫苗形式测试PV1功效。

本发明人的结果显示双抗原疫苗PV1相比于单一肽更具免疫原性。当相比于单独的M6或F1肽时，较大固有T细胞群体能够在二聚体检定中识别PV1。本发明人亦观测到尽管T细胞分泌IFNγ及颗粒酶B的能力在活体外肽刺激的前受到抑制，但IFNγ及颗粒酶B分泌T细胞群体的含量在细胞毒性ELISPOT检定中增加。相比于经单一肽的刺激，PV1刺激之后的IFNγ及颗粒酶B分泌一样高(若非更好)。总体而言，使用针对头颈癌细胞株的包含MAGED4B及FJX1肽两者的双抗原肽为引人注目的且保证进一步发展以有益于患者。本发明人亦观测到经无关HIV-gag蛋白质肽引发T细胞，诱发自T细胞的非特异性IFNγ及颗粒酶B分泌。如由Karlsson等人于2004年的先前报导，本发明人假设此非特异性刺激归因于在活体外刺激后诱发假阳性反应的可溶性不佳的肽。因此，可溶性不佳的HIV肽可能不为用于肽刺激之后的细胞毒性ELISPOT检定的良好无关肽对照。

重要的是，本发明人的资料显示来自具有较高抗原表现量的患者的T细胞更易于再敏化(re-sensitized)，且在PV1刺激后具有较好反应。此令人鼓舞的资料指示PV1以抗原特异性方式起作用，且基于表现量或MAGED4B或FJX1于肿瘤上的存在的患者筛选将为PV1疗法的重要纳入标准。

最近，两种免疫检查点抑制剂由美国食品药物管理局(U.S.Food and DrugAdministration)批准用于治疗HNSCC。尼沃单抗(Nivolumab)(OPDIVO,Bristol-MyersSquibb Company)在2016年11月被批准且帕博利珠单抗(Pembrolizumab)(KEYTRUDA,Merck&Co.,Inc.)在2016年8月更早被加速批准。然而，接受此等药物的HNSCC患者的反应率据报导仅低至13％(OPDIVO,Bristol-Myers Squibb Company)(Ferris等人，2016)及16％(KEYTRUDA,Merck&Co.,Inc.)(美国食品药物管理局2016)。由于免疫系统在免疫活化与抑制的间始终维持制约与平衡的复杂度(Chen L及Flies DB,2013)，使用单独的免疫检查点抑制剂释放免疫反应的制动可能不足以再活化患者中已抑制的免疫系统。与免疫原性免疫活化剂组合，诸如源自肿瘤抗原的癌症疫苗，已报导为通过更改效应T细胞与调节T细胞比率，增加抗原特异性T细胞而更有效地活化免疫反应(Morse及Lyerly,2015；Mkrtichyan等人，2011；Avogadri等人，2014；Karyampudi等人，2014)。如本发明人所展示，双抗原PV1肽疫苗具免疫原性且能够在HNSCC患者中诱发抗肿瘤免疫反应，表明免疫检查点抑制剂与PV1的组合可增强HNSCC患者中的反应率。

然而，不同肽可具有不同的针对MHC分子的结合亲和力，且因此可在与抗原决定位结合中引起竞争。因此，进一步研究确保呈递FJX1及MAGED4B肽的两种抗原决定位的较佳调配物，或投予疫苗的较佳策略，以便应考虑及保证在不同身体部位进行投予。总体而言，本发明人的结果显示PV1在相当的水准，或相比于单一肽甚至更佳的水准进行。具有表现FJX1或MAGED4B的肿瘤的HNSCC患者可受益于疫苗。吾人的资料亦表明PV1亦可有益于其他癌症类型，包括乳癌、肺癌、前列腺癌、结肠癌及直肠癌的患者。当前正使用转殖基因活体内模型评估诱发足够免疫反应及PV1功效以控制肿瘤负荷的最佳剂量。

实例2

在动物模型中评估PV1

PV1不增加非所需发炎性反应

在使用动物模型评估PV1免疫原性之前，测量发炎性反应的格里斯检定用于评估M6及F1肽的毒性。小鼠巨噬细胞细胞株RAW264.7用各种浓度的M6、F1或PV1肽处理：25μg/ml、50μg/ml及100μg/ml且将含10％DMSO的PBS用作阴性对照，同时将1ng/ml脂多醣(LPS)用作阳性对照。基于由RAW264.7细胞产生的诱导型一氧化氮合成酶(iNOS)的含量间接测量发炎程度。

图5(a)显示RAW264.7上藉由M6或F1肽诱发的发炎的程度。在M6存在下藉由RAW264.7产生的亚硝酸盐低于接受LPS刺激的彼等至少7倍(P<0.01)。亦在F1处理组中观测到相同趋势，其中释放的亚硝酸盐的量低于阳性对照10倍(P<0.05)。此表明M6及F1不刺激iNOS表现的上调，其进一步指示藉由此两种靶肽诱发的发炎的程度较低。当M6及F1组合为PV1时，吾人的结果一致地显示PV1处理组中iNOS积聚的量显著低于LPS处理组中的彼等(10倍差异，P<0.05)[图5(b)]。格里斯检定结果显示PV1不在活体外设定下诱发发炎。

PV1疫苗接种增加抗原特异性T细胞的活化

当使用自HNSCC患者提取的外周血单核细胞(PBMC)测试时，由MAGED4B肽6(M6)及FJX1肽1(F1)组成的双抗原PV1展示为免疫原性的。此研究旨在使用转殖基因小鼠模型B6.Cg-Tg(HLA-A/H2-D)2Enge/J评估PV1的免疫原性及功效，其使得能够对针对HLA-A2呈递抗原的人类T细胞免疫反应建模。

小鼠以如上表6中所示的5种不同处理组每周经疫苗接种，连续地持续3周(3个剂量)。在第4周，杀死小鼠且自小鼠脾脏收获免疫细胞。使用二聚体检定确定经疫苗接种小鼠的IFNγ分泌肽特异性CD8⁺T细胞的存在且与媒剂对照组比较。

结果显示PV1具免疫原性。相比于媒剂对照动物(含5％DMSO的磷酸盐缓冲盐水，PBS)，经低至500μg PV1疫苗接种的动物显示针对PV1负载二聚体的高识别。此反应为肽特异性的，因为经疫苗接种小鼠在暴露于非负载及无关肽(HIV)负载二聚体时显示基线/可忽略的反应，如图6(a)中所说明。

使用ELISPOT检定，本发明人评估能够执行细胞毒性功能以在疫苗接种后杀死呈递肽的癌细胞的T细胞群体。经疫苗接种动物能够识别呈递PV1的T2细胞且以剂量依赖性方式执行针对此等T2细胞的杀死活性[图6(b)]，表明PV1疫苗接种已成功地增加此等动物中的T细胞的识别。

PV1为安全的且未在经疫苗接种小鼠中观测到不良事件

在疫苗接种时段期间一周两次地获取动物体重。本发明人在4周免疫时段期间于所有处理组中未观测到任何体重损失或不良事件[图7(a)]。

自所有处理组小鼠收获的主要器官(心脏、肺、肾、肝及脾)的病理性报告显示所有PV1处理小鼠在正常限度内。未在此等动物中观测到局部毒性[图7(b)]。

PV1延缓小鼠中的肿瘤生長

在前述免疫原性研究中，本发明人显示PV1能够在低至500μg的浓度下诱发抗原特异性T细胞反应。因此，1000μg PV1用于后续检定以测定PV1在降低小鼠中的肿瘤负荷中的功效。

将总共1×10⁶个细胞(表现AAD及MAGED4B基因的同基因型B16黑色素瘤细胞)移植至小鼠上。在肿瘤尺寸达到30-50mm³之后，将小鼠随机分配至2组。处理组小鼠接受1000μgPV1+IFA，而媒剂对照组接受含5％DMSO的PBS。

每周两次地量测肿瘤尺寸且用1000μg PV1+IFA处理的小鼠在相比于媒剂对照(VC)组时显示延缓的肿瘤生长(图8)。

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(1) 通用信息

<160> SEQ ID NOS的数量: 4

(2) SEQ ID NO:1的信息:

<210> SEQ ID NO 1

<211> 长度: 11 个氨基酸

<212> 类型: 氨基酸

<223> 其他信息:

(i) 链型: 单链

(ii) 拓扑结构: 线性

(iii) 分子类型: 肽

<400> 序列: 1

Trp Leu Leu Ala Leu Gly Ser Leu Leu Ala Leu

1 5 10

(2) SEQ ID NO:2的信息:

<210> SEQ ID NO 2

<211> 长度: 9 个氨基酸

<212> 类型: 氨基酸

<223> 其他信息:

(iv) 链型: 单链

(v) 拓扑结构: 线性

(vi) 分子类型: 肽

<400> 序列: 2

Arg Leu Ser Leu Leu Leu Val Ile Leu

1 5

(2) SEQ ID NO:3的序列:

<210> SEQ ID NO 3

<211> 长度: 9 个氨基酸

<212> 类型: 氨基酸

<223> 其他信息:

(i) 链型: 单链

(ii) 拓扑结构: 线性

(iii) 分子类型: 肽

<400> 序列: 3

Gly Ile Leu Gly Phe Val Phe Thr Leu

1 5

(2) SEQ ID NO:4的信息:

<210> SEQ ID NO 4

<211> 长度: 9 个氨基酸

<212> 类型: 氨基酸

<223> 其他信息:

(i) 链型: 单链

(ii) 拓扑结构: 线性

(iii) 分子类型: 肽

<400> 序列: 4

Ser Leu Tyr Asn Thr Tyr Ala Thr Leu

1 5

(1) 通用信息

(2) 定量PCR中使用的引物的信息 (qPCR)

FJX1: 正义链 5?CCCGCAAAGGTGTCTAAAAACT 3?

反义链 5?GTGCTGGCACAGTAAAGAATCCT 3?

MAGED4b: 正义链 5?CCAGAATCAGAACCGAGA 3?

反义链 5?CCAAAATCTCCGTCCTCA 3?

GAPDH: 正义链 5?GAAGGTGAAGGTCGGAGTC 3?

反义链 5?GAAGATGGTGATGGGATT TC 3?

Claims (17)

1.一种肽组合物，其中该肽组合物包含至少四连接盒1(FJX1)肽及黑色素瘤抗原家族D4b(MAGED4b)肽，该肽组合物与主要组织相容性复合体(MHC)I类分子结合以在一个体中诱发一抗癌免疫反应。

2.如权利要求1所述的肽组合物，其中，该等MHCI类分子为人类白血球抗原A2(HLA-A2)分子。

3.如权利要求1所述的肽组合物，其中，该FJX1肽具有SEQ ID NO.1的肽序列。

4.如权利要求1所述的肽组合物，其中，该MAGED4b肽具有SEQ ID NO.2的序列。

5.如权利要求3或4所述的肽组合物，其中，该肽序列中的至少一个氨基酸经删除。

6.如权利要求3或4所述的肽组合物，其中，该肽序列中的至少一个氨基酸经取代。

7.如权利要求3或4所述的肽组合物，其中，该肽序列中的至少一个氨基酸经插入。

8.如权利要求1所述的肽组合物，其中，该肽组合物与该等MHCI类分子结合以增加该个体中的细胞介素分泌细胞，以在该个体中诱发该抗癌反应。

9.如权利要求8所述的肽组合物，其中，该细胞介素包含干扰素γ(IFNγ)及颗粒酶B。

10.如权利要求1所述的肽组合物，其中，该抗癌免疫反应係在FJX1及/或MAGED4b由癌细胞表现时于个体中诱发。

11.如权利要求10所述的肽组合物，其中，该等癌细胞为头颈鳞状细胞癌(HNSCC)细胞、乳癌细胞、结肠癌细胞、直肠癌细胞、肺癌细胞或前列腺癌细胞中的任一者或组合。

12.一种疫苗，其包含至少如权利要求1-11中所述的FJX1肽及MAGED4b肽。

13.如权利要求12所述的疫苗，其中，该疫苗可与癌症治疗处理(treatments)组合使用。

14.如权利要求13所述的疫苗，更包含免疫检查点抑制剂。

15.如权利要求14所述的疫苗，其中，该等免疫检查点抑制剂包含抗PD-1抗体。

16.如权利要求13所述的疫苗，其中，该抗癌免疫反应为在来自头颈鳞状细胞癌(HNSCC)、乳癌、结肠癌、直肠癌、肺癌或前列腺癌中的任一者或组合的癌细胞于该个体中被侦测时诱发。

17.一种有效量的四连接盒1(FJX1)肽及黑色素瘤抗原家族D4b(MAGED4b)的用途，其用于制造供治疗有需要的一个体的头颈鳞状细胞癌(HNSCC)、乳癌、结肠癌、直肠癌、肺癌或前列腺癌中的任一者或组合用的药物，其中，该药物能够与主要组织相容性复合体(MHC)I类分子结合以在该个体中诱发一抗癌免疫反应。