TWI670055B

TWI670055B - 使用2,4-二甲氧基-6-甲基苯-1,3-二醇來治療異位性皮膚炎

Info

Publication number: TWI670055B
Application number: TW107112417A
Authority: TW
Inventors: 王東弘; 黃澤宏; 方嘉佑; 楊世駿; 莊士億
Original assignee: 長庚醫療財團法人林口長庚紀念醫院; 長庚大學
Priority date: 2018-04-11
Filing date: 2018-04-11
Publication date: 2019-09-01
Also published as: TW201943414A

Abstract

本發明是有關於使用2,4-二甲氧基-6-甲基苯-1,3-二醇來治療異位性皮膚炎。

Description

使用2,4-二甲氧基-6-甲基苯-1,3-二醇來治療異位性皮膚炎

本發明是有關於使用2,4-二甲氧基-6-甲基苯-1,3-二醇(2,4-dimethoxy-6-methylbenzene-1,3-diol)來治療異位性皮膚炎(atopic dermatitis)。

異位性皮膚炎(atopic dermatitis)[亦被稱為過敏性皮膚炎(allergic dermatitis)以及濕疹(eczema)]是一種慢性發炎性皮膚病(chronic inflammatory skin disease)，常見的症狀包括皮膚乾癢(dryness and itch)、紅腫(redness and swelling)、脫屑(desquamation)、龜裂(crack)以及結痂(crust formation)。對於嬰幼兒而言，好發部位主要為臉部，而對於孩童與成人，好發部位則為膝蓋與手肘的關節屈側。

由於異位性皮膚炎的病理狀況相當複雜，至今對於它的發病機制(pathogenesis)仍不清楚，目前已有研究顯示，遺傳在異位性皮膚炎的發病機制上扮演一個重要的角色，而過敏原(例如食物、塵蟎以及動物毛髮等)可能會誘發異位性皮膚炎的發病，進而影響皮膚的屏障功能(barrier function)。當皮膚的屏障功能降低會使病原菌感染的風險提高，而由於患者的搔癢所導致的破皮亦會提高此風險，故大部分的患者有併發感染(complicated by infection)，包括細菌感染[特別是二甲苯青黴素-抗性的金黃色葡萄球菌(methicillin-resistant Staphylococcus aureus, MRSA)感染]以及病毒感染[特別是單純疱疹病毒(herpes simplex virus type, HSV)感染]，而受感染的皮膚又更容易被誘發異位性皮膚炎。此外，許多患者亦會發展出過敏性鼻炎(allergic rhinitis)以及氣喘(asthma)。

目前臨床上用來治療異位性皮膚炎的藥物主要是局部的皮質類固醇(topical corticosteroid)[例如氫皮質酮(hydrocortisone)以及特安皮質醇(triamcinolone)]，若有併發感染則進一步組合使用抗生素。然而，這些藥物可能會導致患者產生副作用(side effects)以及抗藥性(drug resistance)。因此，研究人員嘗試從傳統中藥(traditional Chinese medicines, TCM)或植物中來尋找安全並且可用以治療異位性皮膚炎的活性組分(active components)。

牛樟芝( Taiwanofungus camphoratus)(中文別名為樟芝、樟菇、樟內菇以及牛樟菇；同種異名為 Antrodia camphorata、 Antrodia cinnamomea以及 Ganoderma comphoratum)以及香杉芝( Taiwanofungus salmoneus)(中文別名為香杉菇；同種異名為 Antrodia salmonea)皆是多孔菌科(Polyporaceae)台芝屬( Taiwanofungus)的真菌，主要分別生長在台灣高海拔的樟樹( Cinnamomum kanehirai)與香杉樹( Cunninghamia konishii)上。由於香杉芝在分類與成分上與牛樟芝相近，而被認為可用來作為牛樟芝的替代品。已有研究指出，牛樟芝與香杉芝皆具有抗氧化(antioxidant)、抗腫瘤(antitumor)、抗細菌(antibacterial)以及抗發炎(anti-inflammation)的生物活性。此外，牛樟芝被揭示具有治療動脈再狹窄(arterial restenosis)、口腔癌(oral cancer)、過敏性鼻炎、糖尿病(diabetes mellitus)、癌症惡病質(cancer cachexia)、高膽固醇血症(hypercholesterolemia)、痛風(gout)以及皮膚病況[包括痤瘡(acnes vulagaris)、蕁麻疹(urticaria)與濕疹(eczema)]的效用(US 20110177113 A1)。

在Shen C.C. et al. (2008), Journal of the Chinese Chemical Society, 55:854-857中，Shen C.C.等人使用氯仿來萃取香杉芝菌絲體的液態發酵培養物，接著，利用管柱層析法(column chromatography)以及薄層層析法(thin layer chromatography, TLC)而從所得到的氯仿萃取物中分離出9種化合物，其中包括： (1) 6個習知化合物，亦即2-甲氧基-6-甲基-p-苯醌(2-methoxy-6-methyl-p-benzoquinone)、2,3-甲氧基-5-甲基-p-苯醌(2,3-dimethoxy-5-methyl-p-benzoquinone)、2-羥基-5-甲氧基-3-甲基-p-苯醌(2-hydroxy-5-methoxy-3-methyl-p-benzoquinone)、齒孔酸(eburcoic acid)、吡咯烷二酮(pyrroledione)，以及fomefficinic acid C；以及 (2) 3個新穎化合物，亦即2,4-二甲氧基-6-甲基苯-1,3-二醇(2,4-dimethoxy-6-methylbenzene-1,3-diol)、2-(2,4-二羥基-3,5-二甲氧基苯基)-5-甲氧基-3-甲基-1,4-苯醌[2-(2,4-dihydroxy-3,5-dimethoxybenzyl)-5-methoxy-3-methyl-1,4-benzoquinone](被命名為salmoquinone)，以及3-(4-羥基苯基)-4-異丁基-1H-吡咯-2,5-二酮[3-(4-hydroxyphenyl)-4-isobutyl-1H-pyrrole-2,5-dione]，其中，2,4-二甲氧基-6-甲基苯-1,3-二醇具有下列所示的化學式：。之後，該等化合物被拿來處理惡性黑色素瘤細胞株(malignant melanoma cell line) H2058以及肝癌細胞株(hepatoma cell lines) HA22T與HepG2，而結果發現，在上述9種經分離的化合物中只有2-甲氧基-6-甲基-p-苯醌以及2,3-甲氧基-5-甲基-p-苯醌能夠對該等癌細胞展現細胞毒性(cytotoxicity)。

在Yang S.S. et al. (2009), Planta. Med., 75:512-516中，Yang S.S.等人使用甲醇來萃取牛樟芝菌絲體的固態發酵培養物，繼而對所得到的甲醇萃取物進行過濾與濃縮，然後將所得到的殘餘物(residue)溶於65%甲醇中，並且依序使用正己烷與乙酸乙酯來進行分配分離(partitioning)。接著，利用管柱層析法從所得到的乙酸乙酯分離部分中分離出5種化合物，其中包括安卓奎諾爾B (antroquinonol B)、4-乙醯基安卓奎諾爾B (4-acetyl-antroquinonol B)、2,3-(甲撐二氧基)-6-甲基苯-1,4-二醇[2,3-(methylenedioxy)-6-methylbenzene-1,4-diol]、2,4-二甲氧基-6-甲基苯-1,3-二醇以及安卓錠D (antrodin D)。除了2,3-(甲撐二氧基)-6-甲基苯-1,4-二醇，其他4種化合物皆被發現能夠抑制LPS-活化的小鼠巨噬細胞RAW 264.7 (LPS-activated mouse macrophage cell RAW 264.7)分泌一氧化氮。特別地，安卓奎諾爾B以及4-乙醯基安卓奎諾爾B展現較強的抑制效用。

經研究，申請人意外地發現2,4-二甲氧基-6-甲基苯-1,3-二醇除了具有上述活性之外，還能夠有效地治療異位性皮膚炎。

發明概要

於是，本發明提供一種2,4-二甲氧基-6-甲基苯-1,3-二醇供應用於製備一用來治療異位性皮膚炎之醫藥品的用途。

本發明亦提供一種用於治療在一個體中的異位性皮膚炎之方法，其包括對該個體投藥以2,4-二甲氧基-6-甲基苯-1,3-二醇。

發明的詳細說明

要被瞭解的是：若有任何一件前案刊物在此被引述，該前案刊物不構成一個下述承認：在台灣或任何其他國家之中，該前案刊物形成本技藝中的常見一般知識之一部分。

為了這本說明書之目的，將被清楚地瞭解的是：文字“包含有(comprising)”意指“包含但不限於”，以及文字“包括(comprises)”具有一對應的意義。

除非另外有所定義，在本文中所使用的所有技術性與科學術語具有熟悉本發明所屬技藝的人士所共同瞭解的意義。一熟悉本技藝者會認知到許多與那些被描述於本文中者相似或等效的方法和材料，它們可被用於實施本發明。當然，本發明決不受到所描述的方法和材料之限制。

在本發明中，申請人藉由活體外試驗( in vitrotest)而發現：2,4-二甲氧基-6-甲基苯-1,3-二醇能夠抑制TNF-α與IFN-γ在HaCaT細胞中所誘發的似異位性皮膚炎的發炎反應(atopic dermatitis-like inflammation)。此外，申請人進一步藉由動物實驗而證實：2,4-二甲氧基-6-甲基苯-1,3-二醇能夠治療併發感染的異位性皮膚炎(atopic dermatitis complicated by infection)，並且改善異位性皮膚炎與感染所造成的角質層(stratum corneum)的屏障功能(barrier function)之損害。於是，本發明揭示一種2,4-二甲氧基-6-甲基苯-1,3-二醇供應用於製備一用來治療異位性皮膚炎之醫藥品的用途。本發明亦提供一種用於治療異位性皮膚炎之醫藥品，其包含有2,4-二甲氧基-6-甲基苯-1,3-二醇。

如本文中所使用的，術語“治療(treating)”或“治療(treatment)”意指減少(reducing)、減輕(alleviating)、改善(ameliorating)、緩解(relieving)或控制(controlling)一疾病(disease)或障礙(disorder)的一或多個臨床徵兆(clinical sign)，以及降低(lowering)、停止(stopping)或逆轉(reversing)一正在被治療中的病況(condition)或症狀(symptom)之嚴重性的進展(progression of severity)。

依據本發明，該異位性皮膚炎可為併發感染的異位性皮膚炎。

較佳地，該異位性皮膚炎是併發細菌感染的異位性皮膚炎，而該細菌是選自於由下列所構成的群組：葡萄球菌屬物種( Staphylococcusspp.)、丙酸桿菌屬物種( Propionibacteriumspp.)、棒狀桿菌屬物種( Corynebacteriumspp.)，以及它們的組合。更佳地，該細菌是選自於由下列所構成的群組：金黃色葡萄球菌( Staphylococcus aureus)、表皮葡萄球菌( Staphylococcus epidermidis)，以及它們的抗藥性菌株(drug resistant strain)。在本發明的一個較佳具體例中，該細菌是二甲苯青黴素-抗性的金黃色葡萄球菌(methicillin-resistant Staphylococcus aureus, MRSA)。

較佳地，該異位性皮膚炎是併發病毒感染的異位性皮膚炎，而該病毒是選自於由下列所構成的群組：單純疱疹病毒(herpes simplex virus, HSV)、傳染性軟疣病毒(Molluscum contagiosum virus)、正痘病毒(Orthopoxvirus)，以及它們的組合。

依據本發明，2,4-二甲氧基-6-甲基苯-1,3-二醇可以利用化學家所熟知的合成技術而被製得。

另擇地，2,4-二甲氧基-6-甲基苯-1,3-二醇亦可利用本技藝中所慣用的分離純化方法而從一天然來源(natural source)中被分離純化出來。在此方面，可以參考，例如Shen C.C. et al. (2008)(同上述)以及Yang S.S. et al. (2009)(同上述)。

依據本發明，該天然來源是牛樟芝( Taiwanofungus camphoratus)或香杉芝( Taiwanofungus salmoneus)。在本發明的一個較佳具體例中，2,4-二甲氧基-6-甲基苯-1,3-二醇是從牛樟芝的菌絲體培養物之乙醇萃取物中被分離純化出來。

依據本發明，該醫藥品可利用熟習此技藝者所詳知的技術而被製造成一適合於非經腸道的(parenteral)、口服的(oral)或局部的(topical)投藥之劑型，這包括，但不限於：注射品(injection)[例如，無菌的水性溶液(sterile aqueous solution)或分散液(dispersion)]、無菌的粉末(sterile powder)、錠劑(tablet)、片劑(troche)、丸劑(pill)、膠囊(capsule)、外部製劑(external preparation)以及類似之物。

該醫藥品可進一步包含有一被廣泛地使用於藥物製造技術之藥學上可接受的載劑(pharmaceutically acceptable carrier)。例如，該藥學上可接受的載劑可包含一或多種選自於下列的試劑：溶劑(solvent)、緩衝液(buffer)、乳化劑(emulsifier)、懸浮劑(suspending agent)、分解劑(decomposer)、崩解劑(disintegrating agent)、分散劑(dispersing agent)、黏結劑(binding agent)、賦形劑(excipient)、安定劑(stabilizing agent)、螯合劑(chelating agent)、稀釋劑(diluent)、膠凝劑(gelling agent)、防腐劑(preservative)、潤濕劑(wetting agent)、潤滑劑(lubricant)、吸收延遲劑(absorption delaying agent)、脂質體(liposome)以及類似之物。有關這些試劑的選用與數量是落在熟習此項技術之人士的專業素養與例行技術範疇內。

依據本發明，該醫藥品可以一選自於由下列所構成的群組中的非經腸道途徑(parenteral routes)來投藥：靜脈內注射(intravenous injection)、皮下注射(subcutaneous injection)、表皮內注射(intraepidermal injection)、皮內注射(intradermal injection)以及病灶內注射(intralesional injection)。

依據本發明，該醫藥品可利用熟習此技藝者所詳知的技術而被製造成一適合於口服投藥(oral administration)的劑型(dosage form)，這包括，但不限於：無菌的粉末、錠劑(tablet)、片劑(troche)、口含錠(lozenge)、丸劑(pellet)、膠囊(capsule)、分散性粉末(dispersible powder)或細顆粒(granule)、溶液、懸浮液(suspension)、乳劑(emulsion)、糖漿(syrup)、酏劑(elixir)、濃漿(slurry)以及類似之物。

依據本發明，該醫藥品亦可利用熟習此技藝者所詳知的技術而被製造成一適合於局部地施用於皮膚上的外部製劑(external preparation)，這包括，但不限於：乳劑(emulsion)、凝膠(gel)、軟膏(ointment)、乳霜(cream)、貼片(patch)、擦劑(liniment)、粉末(powder)、氣溶膠(aerosol)、噴霧(spray)、乳液(lotion)、乳漿(serum)、糊劑(paste)、泡沫(foam)、滴劑(drop)、懸浮液(suspension)、油膏(salve)以及繃帶(bandage)。

依據本發明，該外部製劑是藉由將本發明的醫藥品與一為熟習此項技藝者所詳知的基底(base)相混合而被製備。

依據本發明，該基底可包含有一或多種選自於下列的添加劑(additives)：水、醇(alcohols)、甘醇(glycol)、碳氫化合物(hydrocarbons)[諸如石油膠(petroleum jelly)以及白凡士林(white petrolatum)]、蠟(wax)[諸如石蠟(paraffin)以及黃蠟(yellow wax)]、保存劑(preserving agents)、抗氧化劑(antioxidants)、界面活性劑(surfactants)、吸收增強劑(absorption enhancers)、安定劑(stabilizing agents)、膠凝劑(gelling agents)[諸如卡波普 ^®941 (carbopol ^®941)、微結晶纖維素(microcrystalline cellulose)以及羧基甲基纖維素(carboxymethylcellulose)]、活性劑(active agents)、保濕劑(humectants)、氣味吸收劑(odor absorbers)、香料(fragrances)、pH調整劑(pH adjusting agents)、螯合劑(chelating agents)、乳化劑(emulsifiers)、閉塞劑(occlusive agents)、軟化劑(emollients)、增稠劑(thickeners)、助溶劑(solubilizing agents)、滲透增強劑(penetration enhancers)、抗刺激劑(anti-irritants)、著色劑(colorants)以及推進劑(propellants)等。有關這些添加劑的選用與數量是落在熟習此項技術之人士的專業素養與例行技術範疇內。

依據本發明，該醫藥品可與一或多種選自於由下列所構成之群組中的藥物一起合併使用：消炎劑(anti-inflammatory agent)、免疫抑制劑(immunosuppressive agent)、抗組織胺藥物(antihistamine)、抗菌劑(antibacterial agent)、抗病毒劑(antiviral agent)、傷口治療劑(wound-healing agent)、止癢劑(antipruritic)、抗乾皮膚劑(anti-dry skin agent)、保濕劑(humectant)，以及皮膚營養劑(skin nutrient)。

依據本發明，2,4-二甲氧基-6-甲基苯-1,3-二醇的投藥劑量與投藥次數會視下列因素而變化：要被治療的疾病之嚴重性，投藥途徑，以及要被治療的個體之年齡、身體狀況與反應。一般而言，依據本發明的醫藥品可呈單一劑量或是分成數個劑量的形式，且可被口服地、非經腸道地或局部地投藥。

較佳實施例之詳細說明

本發明將就下面的實施例來做進一步說明，但應瞭解的是，該等實施例僅是供例示說明用，而不應被解釋為本發明的實施上的限制。 實施例 一般實驗方法： 1. 統計學分析 (statistical analysis) ：

在下面的實施例中，各組的實驗被重複3次，而實驗數據是以“平均值(mean)±平均值的標準誤差(standard error of the mean, SEM)”來表示。所有的數據是藉由史徒登氏t -試驗(Student’s t-test)來作分析，俾以評估各組之間的差異性。若所得到的統計分析結果是 p＜0.05，這表示有統計學顯著性(statistical significance)。 實施例 1. 製備源自於牛樟芝 ( Taiwanofungus camphoratus) 的 2,4- 二甲氧基 -6- 甲基苯 -1,3- 二醇 (2,4-dimethoxy-6-methylbenzene-1,3-diol)

在本實施例中所使用的牛樟芝是採集自台中市東勢林場，並經由18S rDNA序列分析以及NCBI資料庫的序列比對而被確認是屬於台芝屬(genus of Taiwanofungus)的牛樟芝。首先，將牛樟芝接種於一PDB瓊脂培養盤(PDB agar plate)上，並於室溫下進行培養歷時30天。接著，將所形成的牛樟芝菌絲體切塊，而使得它具有一為0.5 mm ³的體積，然後將之接種至一液態培養基[含有3%葡萄糖、1.5%糖蜜(molasses)、0.5%蛋白腖(peptone)、1.5%麥芽萃取物(malt extract)、0.6%酵母萃取物(yeast extract)、0.06% KH ₂PO ₄、0.06% MgSO ₄以及0.06%麩胺酸單鈉(monosodium glutamate)]中並於室溫下進行震盪培養歷時24小時，接而進行靜置培養歷時30天。之後，對所形成的菌絲體培養物秤取500 g並以一均質機(Oster ^®Classic Series 14-Speed Blender)來進行均質處理。之後，加入1.5 L的95%乙醇來進行浸泡並靜置歷時2天，繼而藉由過濾來收取上澄液並利用減壓濃縮以移除乙醇，而得到一殘餘物(residue)。對所得到的殘餘物重複進行乙醇浸泡-過濾-減壓濃縮步驟2次，藉此而得到一菌絲體培養物的乙醇萃取物。

將所得到的乙醇萃取物溶於250 mL的乙酸乙酯(ethyl acetate, EtOAc)中，繼而以250 mL的純水來進行分配分離(partitioning)。收取乙酸乙酯層(EtOAc layer)並以減壓濃縮來移除乙酸乙酯，然後將所得到的殘餘物拿來進行矽膠管柱層析(silica gel column chromatography)並以正己烷(n-hexane)/丙酮(acetone)作為洗提液(eluent)來進行梯度洗提(gradient elution)[梯度為9：1→7：1→5：1→3：1→1：1 (v/v)]。收集正己烷：丙酮=7：1 (v/v)所洗提出的洗出物(eluate)，而得到一呈褐色油膏狀的化合物。

所得到之經純化的化合物的 ¹H-NMR光譜是使用一Burker Avance II 400 MHz NMR光譜儀(NMR spectrometer)而被偵測，所使用的溶劑為CDCl ₃，而化學位移(chemical shifts)(δ)是以ppm為單位。所測得的 ¹H-NMR光譜被顯示於圖1中。

依據圖1，該化合物被確認是一具有下列化學結構式的2,4-二甲氧基-6-甲基苯-1,3-二醇： 實施例2. 2,4- 二甲氧基 -6- 甲基苯 -1,3- 二醇 的活體外抗異位性皮膚炎(atopic dermatitis) 效用的評估 實驗材料： 1. 人類角質細胞細胞株 (human keratinocyte cell line) HaCaT 的來源與培養：

在本實施例中所使用的人類角質細胞細胞株HaCaT是由高雄醫學大學陳逸夫教授所提供。

HaCaT細胞被培養於含有杜貝可氏改良的依格氏培養基(Dulbecco’s Modified Eagle’s Medium, DMEM)(Gibco)[添加有10%胎牛血清(fetal bovine serum, FBS)]的培養皿(petri dish)中，接著在培養條件被設定為37℃與5% CO ₂的培養箱中進行培養。之後，大約每隔2-3天更換新鮮的培養基。當細胞密度達到約80-90%匯聚(confluence)時，移除培養基並以磷酸鹽緩衝生理鹽水(phosphate buffered saline, PBS)來洗滌細胞，接著加入胰蛋白酶-EDTA (trypsin-EDTA)以使細胞自培養皿的底部脫離。之後，加入新鮮的培養基來中和胰蛋白酶的活性並以量吸管(pipette)反覆地吸沖培養基以充分打散細胞，然後將所形成的細胞懸浮液分配到新的培養皿中，並在培養條件被設定為37℃與5% CO ₂的培養箱中進行繼代培養。 實驗方法：

首先，將依據上面“實驗材料”來進行繼代培養的HaCaT細胞分成1個正常對照組、1個病理對照組、以及3個實驗組(亦即實驗組1至3)，繼而將各組細胞以一為1×10 ⁵細胞/井的數量培養於含有0.5 mL的DMEM培養基(添加有10% FBS)的24-井培養盤(24-well plate)中，並在培養箱(37℃、5% CO ₂)中進行培養過夜。接著，移除各井的培養基並以PBS予以清洗，繼而添加0.5 mL的DMEM培養基，並在培養箱(37℃、5% CO ₂)中進行培養歷時24小時。之後，將正常對照組以及病理對照組的細胞培養物分別更換以DMEM培養基以及添加有20 ng/mL TNF-α與20 ng/mL IFN-γ的DMEM培養基，而實驗組1至3的細胞培養物則更換以添加有20 ng/mL TNF-α、20 ng/mL IFN-γ以及依據上面實施例1所得到的2,4-二甲氧基-6-甲基苯-1,3-二醇(濃度分別為10、50以及100 μg/mL)的DMEM培養基。

各組細胞在培養箱(37℃、5% CO ₂)中進行培養歷時24小時之後，將所形成的培養物以800 rpm來進行離心歷時10分鐘，繼而收取上澄液並使用BioLegend ELISA套組(Cat. No. 440804與Cat. No. 441104)來進行CCL5以及CCL17的表現量測定。各組所測得的吸光值分別根據預先以具有不同已知濃度的CCL5與CCL17的標準品相對於它們自身的吸光值所作出的標準曲線而分別被換算成CCL5與CCL17的濃度(pg/mL)。之後，依照上面“一般實驗方法”的第1項「統計學分析」當中所述的方法來分析所得到的實驗數據。 結果：

圖2與圖3分別顯示各組細胞培養物所測得的CCL5以及CCL17的表現量。從圖2與圖3可見，與正常對照組的細胞相較之下，病理對照組的細胞會大量地表現CCL5以及CCL17，這表示TNF-α與IFN-γ成功地誘發HaCaT細胞產生似異位性皮膚炎的發炎反應(atopic dermatitis-like inflammation)。而與病理對照組的細胞相較之下，實驗組1至3的CCL5以及CCL17之表現量皆呈現顯著下降的情形，並且展現出劑量-依賴的效用(dose-dependent effect)。這個實驗結果顯示：2,4-二甲氧基-6-甲基苯-1,3-二醇具有減緩異位性皮膚炎的效用。 實施例3. 2,4- 二甲氧基 -6- 甲基苯 -1,3- 二醇 對於經感染之帶有皮上致敏化- 誘發的異位性皮膚炎(epicutaneous sensitization-induced atopic dermatitis) 的小鼠的治療效用之評估

在本實驗中，申請人是參考Fang Y.P. et al. (2016), Int. J. Pharm., 497:277-286當中所述的方法而對經處理以膠布剝離(tape stripping)的小鼠皮膚施用卵白蛋白(ovalbumin, OVA)來誘導小鼠產生異位性皮膚炎，俾以評估2,4-二甲氧基-6-甲基苯-1,3-二醇的治療效用。 實驗材料 ： 1. 實驗動物 ：

在本實施例中所使用的雌性BALB/c小鼠(female BALB/c mice)(6-7週大，體重約為16-17 g)是購自於國家實驗動物中心(National Laboratory Animal Center, R.O.C.)。所有的實驗動物個別地被飼養於一個光照與黑暗各為12小時、室溫維持在21-24℃以及相對濕度維持在45-70%的動物房中，而且水分與飼料被充分地供給。有關實驗動物的一切實驗程序是由林口長庚紀念醫院的實驗動物照護及使用委員會(Institutional Animal Care and Use Committee of Linkou Chang Gung Memorial Hospital)所認可，並依據美國國家衛生研究院(National Institutes of Health, NIH)的實驗動物飼養管理及使用規範(Guide for the Care and Use of Laboratory Animals)來進行。 2. 二甲苯青黴素 - 抗性的金黃色葡萄球菌 (methicillin-resistant Staphylococcus aureus, MRSA) 菌液的製備 ：

將MRSA ATCC 33591 [購自於美國類型培養物收集中心(American Type Culture Collection, ATCC)]接種至TSB培養基(購自於Becton Dickinson)中，並於37℃下進行培養歷時20小時。之後，將所形成的培養物以12,000 rpm來進行離心歷時3分鐘。在倒除上澄液之後，以PBS來清洗沉澱物(pellets)，繼而以PBS予以散浮並調整至OD ₆₀₀值為1，藉此而得到MRSA菌液。 3. 貼片 (patch) 的製備 ：

在本實施例中所使用的貼片是藉由對棉片(購自於德記儀器，大小為1 cm × 1 cm)添加以下面表1中所示的成分而被製得，其中所使用的OVA是購自於Sigma。表1. 貼片所添加的成分貼片所添加的成分 OVA貼片 100 μg OVA (配於100 μL PBS中) OVA-MRSA貼片 100 μg OVA (配於100 μL MRSA菌液中) 治療貼片 1 mg 2,4-二甲氧基-6-甲基苯-1,3-二醇 (配於100 μL PBS中) PBS貼片 100 μL PBS 實驗方法： A、 異位性皮膚炎的誘發以及 MRSA 的感染 ：

首先，將雌性BALB/c小鼠隨機分成1個正常對照組、2個病理對照組(亦即病理對照組1與2)以及1個實驗組(每組n＝6)。接著，對正常對照組的小鼠腹膜內注射以PBS (劑量為100 μL/隻)，而病理對照組1與2以及實驗組的小鼠被腹膜內注射以OVA(配於100 μL PBS中，劑量為100 μg/隻)。各組小鼠每天被注射1次，持續進行13天。

在OVA注射開始之後的第11天，對各組小鼠的背側部分(dorsal part)進行剃毛(shaving)。而在OVA注射開始之後的第12天，將膠布分別黏貼於病理對照組1與2以及實驗組的小鼠之背部皮膚並立即撕下，此膠布剝離處理被重複進行9次。接著，對病理對照組1與2以及實驗組的小鼠之背部皮膚施用OVA貼片，每隻小鼠同時被施用以2片貼片於不同的皮膚區域上，每片貼片的施用時間為24小時。至於正常對照組的小鼠沒有接受任何處理。

在OVA注射開始之後的第13天，各組小鼠的處理方式是參照上面在OVA注射開始之後的第12天所描述的操作程序來進行。

在OVA注射開始之後的第14天，各組小鼠的處理方式大體上是參照上面在OVA注射開始之後的第12天所描述的操作程序來進行，不同之處在於：針對病理對照組2以及實驗組的小鼠，以OVA-MRSA貼片來代替OVA貼片。 B、 2,4- 二甲氧基 -6- 甲基苯 -1,3- 二醇的投藥 ：

在OVA注射開始之後的第15與16天，對實驗組的小鼠之背部皮膚施用治療貼片，而對正常對照組以及病理對照組1與2的小鼠之背部皮膚施用PBS貼片，每隻小鼠同時被施用以2片貼片於不同的皮膚區域上，每片貼片的施用時間為24小時。

在OVA注射開始之後的第17天，對各組小鼠之經貼片處理的背部皮膚進行下面第C與D項的分析。接著，藉由使用外科用剪刀(surgical scissors)來收集正常對照組、病理對照組2以及實驗組的小鼠之經貼片處理的背部皮膚之組織，繼而將之拿來進行下面第E項的分析。 C、 臨床症狀 (clinical signs) 的評估 ：

使用MICROTECH MiniScope-V手持數位顯微相機(購自於上宸光學)對各組小鼠的背部皮膚進行拍照，並且觀察是否有出現異位性皮膚炎的症狀[包括脫屑(desquamation)、紅腫(redness and swelling)以及結痂(crust formation)]。 D、 穿皮水分散失 (transepidermal water loss, TEWL) 的測定 ：

各組小鼠的背部皮膚是藉由使用蒸發計(evaporimeter)(Tewameter ^®TM300, Courage & Khazaka)來進行穿皮水分散失的測定。之後，依照上面“一般實驗方法”的第1項「統計學分析」當中所述的方法來分析所得到的實驗數據。 E、 MRSA 的菌數測定 ：

對所得到的正常對照組、病理對照組2以及實驗組的小鼠之皮膚組織各取大約0.15 g並分別加入至1 mL的PBS中，繼而以組織研磨器(tissue grinder)(Roche)來進行研磨處理。接著，以PBS來對所形成的組織均質物(tissue homogenate)進行10倍連續稀釋(10-fold serial dilution)，然後對經稀釋的組織均質物各取適量並將之均勻塗佈於TSB瓊脂培養盤上，繼而於37℃下培養歷時20小時。接著，觀察計算菌落數並依據稀釋倍數來換算出各個組織均質物中所含有的MRSA菌數。之後，依照上面“一般實驗方法”的第1項「統計學分析」當中所述的方法來分析所得到的實驗數據。 結果： A、 臨床症狀的評估 ：

圖4顯示在OVA注射開始之後的第17天對各組小鼠的背部皮膚進行拍攝所得到的照片。從圖4可見，與正常對照組的小鼠相較之下，病理對照組1的小鼠有出現脫屑與紅腫的症狀，而病理對照組2的小鼠不僅有出現更嚴重的脫屑與紅腫，還有觀察到結痂的現象，這表示OVA成功地誘發小鼠產生異位性皮膚炎，而MRSA的感染使得病況更為嚴重。而與病理對照組1與2的小鼠相較之下，實驗組的小鼠的症狀有顯著減輕的情形，甚至是近似於正常對照組。這個實驗結果顯示：2,4-二甲氧基-6-甲基苯-1,3-二醇能夠治療異位性皮膚炎及其併發的MRSA感染。 B、 穿皮水分散失的測定 ：

圖5顯示各組小鼠在OVA注射開始之後的第17天所測得的背部皮膚之穿皮水分散失數值。從圖5可見，與正常對照組相較之下，病理對照組1的穿皮水分散失數值有顯著地上升，而病理對照組2的穿皮水分散失數值呈現出更進一步的上升，這表示OVA成功地誘發小鼠產生異位性皮膚炎並且造成角質層(stratum corneum)的屏障功能(barrier function)之損害，而MRSA的感染使得屏障功能之損害更為嚴重。而與病理對照組1與2相較之下，實驗組的穿皮水分散失數值有顯著地下降。這個實驗結果顯示：2,4-二甲氧基-6-甲基苯-1,3-二醇能夠治療異位性皮膚炎及其併發的MRSA感染，並且改善異位性皮膚炎與MRSA感染所造成的角質層損害。 C、 MRSA 的菌數測定 ：

圖6顯示各組小鼠的背部皮膚組織的組織均質物中所含有的MRSA菌數。從圖6可見，與正常對照組的小鼠相較之下，病理對照組2的MRSA菌數有顯著地上升，這表示併發MRSA感染之異位性皮膚炎被成功地誘發。而與病理對照組2相較之下，實驗組的MRSA菌數有顯著地下降。這個實驗結果顯示：2,4-二甲氧基-6-甲基苯-1,3-二醇能夠有效地對抗異位性皮膚炎所併發之MRSA感染。

綜合以上的實驗結果可知：2,4-二甲氧基-6-甲基苯-1,3-二醇可以有效地治療異位性皮膚炎，特別是併發感染的異位性皮膚炎(atopic dermatitis complicated by infection)。

於本說明書中被引述之所有專利和文獻以其整體被併入本案作為參考資料。若有所衝突時，本案詳細說明(包含界定在內)將佔上風。

雖然本發明已參考上述特定的具體例被描述，明顯地在不背離本發明之範圍和精神之下可作出很多的修改和變化。因此意欲的是，本發明僅受如隨文檢附之申請專利範圍所示者之限制。

本發明的上述以及其它目的、特徵與優點，在參照以下的詳細說明與較佳實施例和隨文檢附的圖式後，將變得明顯，其中：圖1顯示2,4-二甲氧基-6-甲基苯-1,3-二醇(2,4-dimethoxy-6-methylbenzene-1,3-diol)的 ¹H-NMR光譜；圖2顯示各組細胞培養物所測得的CCL5表現量，其中“**”表示：當與病理對照組作比較， p＜0.01；以及“***”表示：當與病理對照組作比較， p＜0.001；圖3顯示各組細胞培養物所測得的CCL17表現量，其中“***”表示：當與病理對照組作比較， p＜0.001；圖4顯示在卵白蛋白(ovalbumin, OVA)注射開始之後的第17天對各組小鼠的背部皮膚進行拍攝所得到的照片，其中正常對照組表示被處理以PBS的小鼠；病理對照組1表示帶有異位性皮膚炎(atopic dermatitis)的小鼠；病理對照組2表示經MRSA感染之帶有異位性皮膚炎的小鼠；以及實驗組表示被處理以2,4-二甲氧基-6-甲基苯-1,3-二醇之經MRSA感染之帶有異位性皮膚炎的小鼠；圖5顯示各組小鼠在OVA注射開始之後的第17天所測得的背部皮膚之穿皮水分散失數值，其中“***”表示：當與正常對照組作比較， p＜0.001；“#”表示：當與病理對照組2作比較， p＜0.05；以及“###”表示：當與病理對照組2作比較， p＜0.001；以及圖6顯示各組小鼠的背部皮膚組織的組織均質物中所含有的MRSA菌數，其中“###”表示：當與病理對照組2作比較， p＜0.001。

Claims

一種2,4-二甲氧基-6-甲基苯-1,3-二醇供應用於製備一用來治療併發感染的異位性皮膚炎之醫藥品的用途。
如請求項1的用途，其中該併發感染的異位性皮膚炎是併發MRSA感染的異位性皮膚炎。
如請求項1的用途，其中該醫藥品進一步包含有一藥學上可接受的載劑。
如請求項1的用途，其中該醫藥品是呈一供局部投藥的劑型。
如請求項1的用途，其中該醫藥品是呈一供口服投藥的劑型。
如請求項1的用途，其中該醫藥品是呈一供非經腸道投藥的劑型。
如請求項1的用途，其中該醫藥品可與一或多種選自於由下列所構成之群組中的藥物一起合併使用：消炎劑、免疫抑制劑、抗組織胺藥物、抗菌劑、抗病毒劑、傷口治療劑、止癢劑、抗乾皮膚劑、保濕劑，以及皮膚營養劑。