TW201505643A - 牛樟芝萃取物用於製備調節Ｔｈ１７細胞之藥物的用途 - Google Patents

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Abstract

本發明提供一種牛樟芝萃取物用於製備調節Th17細胞之藥物的用途，其中該牛樟芝萃取物具有調節Th17細胞之功效。

Description

牛樟芝萃取物用於製備調節Th17細胞或治療與 Th17細胞調節相關之疾病之藥物的用途
本發明係關於一種牛樟芝萃取物的用途，且特別關於一種牛樟芝萃取物用於製備調節Th17細胞之藥物的用途。
Th17細胞是一群獨特的CD4+T細胞，起初被視為會產生IL-17及IL-17F的T細胞(Harrington et al.,2005；Park et al.,2005；Langrish et al.,2005)。有別於Th1與Th2細胞，Th17細胞的發展受TGF-β及其他發炎性細胞激素如IL-6、IL-21、IL-1β及IL-23所調控(Bi and Yang,2012)。除了IL-17A與IL-17F外，Th17細胞還可分泌其他指標性的細胞激素如IL-21、IL-22、IFN-γ、IL-4、IL-10、IL-9、IL-26、CXCL8與CCL20等(Marwaha et al.,2012)，因而可作用於其他細胞如纖維母細胞、角質細胞、內皮細胞、嗜中性白血球及記憶性T細胞等(Gaffen,2011；Ghoreschi et al.,2011；Wilke et al.,2011a)。目前發現Th17細胞及其作用分子如IL-17、IL-21、IL-22、GM-CSF及CCL20等與自體免疫疾病及發炎性疾病的病理發生有關，例如：全身性 紅斑性狼瘡、乾癬、類風濕性關節炎、多發性硬化症、發炎性腸症、過敏、氣喘等(Maddur et al.,2012)。
牛樟芝(學名為Antrodia cinnamomea,Antrodia camphorata或Taiwanofungus camphoratus)是傳統的中草藥，為台灣特有的真菌，僅寄生於牛樟樹(Cinnamomum kanehirae Hayata(Lauraceae))之實木內或潮濕的表面上(Ao et al.2009；Lu et al.2009)。現今已將牛樟芝用於治療肝炎、癌症、腹痛、腹瀉、高血壓或是護肝、解毒等用途上，然而，目前仍不清楚牛樟芝是否具備調節Th17細胞的功效。
本發明提供一種用於調節Th17細胞之醫藥組成物，包括：一牛樟芝萃取物為有效成分，其中該牛樟芝萃取物具有調節Th17細胞之功效。
本發明還提供一種牛樟芝萃取物用於製備調節Th17細胞之藥物的用途，其中該牛樟芝萃取物具有調節Th17細胞之功效。
本發明更提供一種牛樟芝萃取物用於製備治療與Th17細胞調節相關之疾病之藥物的用途，其中該牛樟芝萃取物具有抑制Th17細胞分化之功效。
第1圖顯示牛樟芝萃取物ACFB03對Th17細胞分化的影響，**：p<0.01，***：p<0.001。
第2圖顯示牛樟芝萃取物ACFB06對Th17細胞分化的影 響，*：p<0.05，**：p<0.01。
第3圖顯示牛樟芝萃取物ACFB12對Th17細胞分化的影響，*：p<0.05。
第4圖顯示牛樟芝萃取物AC06-EA對Th17細胞分化的影響，*：p<0.05。
第5圖顯示牛樟芝萃取物AC06-A對Th17細胞分化的影響，**：p<0.01。
第6圖顯示牛樟芝萃取物ACFB12對全身性紅斑性狼瘡病人之Th17細胞活性的影響，***：p<0.001。
第7圖顯示牛樟芝萃取物ACFB12對葛瑞夫氏病人之Th17細胞活性的影響，*：p<0.05。
第8圖顯示牛樟芝萃取物ACFB12對咪喹莫特誘發之乾癬動物模式之Th17細胞活性的影響，***：p<0.001。
在本發明一實施態樣中，本發明可提供一種用於調節Th17細胞之醫藥組成物。本發明之用於調節Th17細胞之醫藥組成物可包括一牛樟芝萃取物為有效成分，但不限於此。
於本發明用於調節Th17細胞之醫藥組成物中，牛樟芝萃取物可具有一調節Th17細胞之功效。上述調節Th17細胞之功效可包括，例如，抑制或促進Th17細胞分化、增生等，但不限於此。在一實施例中，上述調節Th17細胞之功效包括抑制Th17細胞分化。
又，於本發明用於調節Th17細胞之醫藥組成物中，上述牛樟芝萃取物可包括一牛樟芝子實體之萃取物或一牛 樟芝菌絲體之萃取物。
上述牛樟芝萃取物可藉由對牛樟芝子實體或菌絲體進行一萃取製程而獲得，但不限於此。上述萃取製程可使用至少一萃取溶劑。
在一實施例中，上述牛樟芝萃取物為一牛樟芝子實體之萃取物。於此實施例中，牛樟芝子實體之萃取物可藉由對牛樟芝子實體進行一萃取製程而獲得，但不限於此。上述萃取製程可使用至少一萃取溶劑。
而於此實施例中，上述至少一萃取溶劑可包括，但不限於，醇類及/或水等。上述醇類的例子可包括甲醇、乙醇、異丙醇、丁醇等，但不限於此。在一實施例中，上述醇類為乙醇，又上述乙醇可包括10-95%之乙醇水溶液，但不限於此。此外，在一特定實施例中，上述乙醇可為25%、50%或95%之乙醇水溶液。
再者，上述用以獲得牛樟芝子實體之萃取物的萃取製程可包括下列步驟，但不限於此。
首先，將牛樟芝子實體以上述至少一萃取溶劑加熱回流以形成一混合物。在一實施例中，加熱回流之時間可為約0.5-8小時。在一特定實施例中，加熱回流之時間可為約1小時。
然後，將上述混合物過濾以獲得一濾液與一濾渣，其中所獲得之濾液即可牛樟芝子實體萃取物。
在另一實施例中，上述牛樟芝萃取物為一牛樟芝菌絲體之萃取物。於此實施例中，牛樟芝菌絲體之萃取物可藉 由對牛樟芝菌絲體進行一萃取製程而獲得，但不限於此。上述萃取製程可使用至少一萃取溶劑。
又於此實施例中，上述至少一萃取溶劑可包括，但不限於，乙酸乙酯或丙酮等，但不限於此。在一實施例中，至少一萃取溶劑為乙酸乙酯，而在另一實施例中，至少一萃取溶劑為丙酮。
此外，上述用以獲得牛樟芝菌絲體之萃取物的萃取製程可包括下列步驟，但不限於此。
首先，將牛樟芝菌絲體以上述至少一萃取溶劑加熱回流以形成一混合物。在一實施例中，加熱回流之時間可為約0.5-8小時。在一特定實施例中，加熱回流之時間可為約1小時。
然後，將上述混合物過濾以獲得一濾液與一濾渣，其中所獲得之濾液即可牛樟芝子菌絲萃取物。
另外，在一實施例中，上述本發明用於調節Th17細胞之醫藥組成物可更包括一藥學上可接受之載體或鹽類。
於本發明用於調節Th17細胞之醫藥組成物中，上述藥學上可接受之載體可包括，但不限於溶劑、分散媒(dispersion medium)、套膜(coating)、抗菌與抗真菌試劑與一等滲透壓與吸收延遲(absorption delaying)試劑等與藥學投予相容者。對於不同的給藥方式，可利用一般方法將藥學組合物配製成劑型(dosage form)。
又，上述藥學上可接受之鹽類可包括，但不限於鹽類包括無機陽離子，例如，鹼金屬鹽類，如鈉、鉀或胺鹽， 鹼土金族鹽類，如鎂、鈣鹽，含二價或四價陽離子之鹽類，如鋅、鋁或鋯鹽。此外，也可是為有機鹽類，如二環己胺鹽類、甲基-D-葡糖胺，胺基酸鹽類，如精胺酸、離胺酸、組織胺酸、麩胺酸醯胺。
本發明所製備出藥物給藥可以口服、非口服、經由吸入噴霧(inhalation spray)或藉由植入貯存器(implanted reservoir)的方式。非口服可包括皮下(subcutaneous)、皮內(intracutaneous)、靜脈內(intravenous)、肌肉內(intramuscular)、關節內(intraarticular)、動脈(intraarterial)、滑囊(腔)內(intrasynovial)、胸骨內(intrasternal)、蜘蛛膜下腔(intrathecal)、疾病部位內(intralesional)注射以及灌注技術。
口服成分的形式可包括，但不限定於，藥錠、膠囊、乳劑(emulsions)、水性懸浮液(aqueous suspensions)、分散液(dispersions)與溶液。
再者，在一實施例中，本發明用於調節Th17細胞之醫藥組成物係可用於與Th17細胞調節相關之疾病的治療，但不限於此。上述與Th17細胞調節相關之疾病的例子，可包括，但不限於，全身性紅斑性狼瘡、葛瑞夫氏病、乾癬、類風濕性關節炎、第一型糖尿病、橋本氏甲狀腺炎、多發性硬化症、帕金森氏症、發炎性腸病、過敏性疾病、後天免疫不全疾病、慢性阻塞性肺疾病、動脈粥樣硬化、心肌炎、擴張性心肌病變與癌症等。
在另一實施例中，本發明用於調節Th17細胞之醫藥組成物係可用於全身性紅斑性狼瘡、葛瑞夫氏病或乾癬的治 療。上述全身性紅斑性狼瘡可包括活動型全身性紅斑性狼瘡，但不限於此。
在本發明另一實施態樣中，本發明可提供一種牛樟芝萃取物用於製備調節Th17細胞之藥物的用途，其中上述牛樟芝萃取物可具有調節Th17細胞之功效。上述調節Th17細胞之功效可包括，但不限於，抑制或促進Th17細胞分化、增生等。在一實施例中，上述調節Th17細胞之功效包括抑制Th17細胞分化。
於本發明牛樟芝萃取物用於製備調節Th17細胞之藥物的用途中，牛樟芝萃取物可包括一牛樟芝子實體之萃取物或一牛樟芝菌絲體之萃取物。
上述牛樟芝萃取物可藉由對牛樟芝子實體或菌絲體進行一萃取製程而獲得，但不限於此。上述萃取製程可使用至少一萃取溶劑。
在一實施例中，上述牛樟芝萃取物為一牛樟芝子實體之萃取物。於此實施例中，牛樟芝子實體之萃取物可藉由對牛樟芝子實體進行一萃取製程而獲得，但不限於此。上述萃取製程可使用至少一萃取溶劑。
上述至少一萃取溶劑可包括，醇類及/或水等，但不限於此。適合之醇類可包括，例如甲醇、乙醇、異丙醇、丁醇等，但不限於此。在一實施例中，醇類為乙醇，又乙醇可包括10-95%之乙醇水溶液，但不限於此。此外，在一特定實施例中，上述乙醇可為25%、50%或95%之乙醇水溶液。
上述用以獲得牛樟芝子實體之萃取物的萃取製程 可包括下列步驟，但不限於此。
首先，將牛樟芝子實體以上述至少一萃取溶劑加熱回流以形成一混合物。在一實施例中，加熱回流之時間可為約0.5-8小時。在一特定實施例中，加熱回流之時間可為約1小時。
接著，將上述混合物過濾以獲得一濾液與一濾渣，其中所獲得之濾液即可牛樟芝子實體萃取物。
在另一實施例中，上述牛樟芝萃取物則為一牛樟芝菌絲體之萃取物。於此實施例中，牛樟芝菌絲體之萃取物可藉由對牛樟芝菌絲體進行一萃取製程而獲得，但不限於此。上述萃取製程可使用至少一萃取溶劑。
又於此實施例中，上述至少一萃取溶劑可包括，但不限於，乙酸乙酯或丙酮等，但不限於此。在一實施例中，至少一萃取溶劑為乙酸乙酯，而在另一實施例中，至少一萃取溶劑為丙酮。
此外，上述用以獲得牛樟芝菌絲體之萃取物的萃取製程可包括下列步驟，但不限於此。
首先，將牛樟芝菌絲體以上述至少一萃取溶劑加熱回流以形成一混合物。在一實施例中，加熱回流之時間可為約0.5-8小時。在一特定實施例中，加熱回流之時間可為約1小時。
然後，將上述混合物過濾以獲得一濾液與一濾渣，其中所獲得之濾液即可牛樟芝子菌絲萃取物。
又，在一實施例中，於本發明牛樟芝萃取物用於 製備調節Th17細胞之藥物的用途中，上述調節Th17細胞之藥物係可用於與Th17細胞調節相關之疾病的治療，但不限於此。
與Th17細胞調節相關之疾病可包括全身性紅斑性狼瘡、葛瑞夫氏病、乾癬、類風濕性關節炎、第一型糖尿病、橋本氏甲狀腺炎、多發性硬化症、帕金森氏症、發炎性腸病、過敏性疾病、後天免疫不全疾病、慢性阻塞性肺疾病、動脈粥樣硬化、心肌炎、擴張性心肌病變或癌症等，但不限於此。
又，於本發明牛樟芝萃取物用於製備調節Th17細胞之藥物的用途中，上述調節Th17細胞之藥物係可用於全身性紅斑性狼瘡、葛瑞夫氏病或乾癬的治療，但不限於此。上述全身性紅斑性狼瘡可包括，例如活動型全身性紅斑性狼瘡。
在本發明又另一實施態樣中，本發明可提供一種牛樟芝萃取物用於製備治療與Th17細胞調節相關之疾病之藥物的用途，其中上述牛樟芝萃取物具有抑制Th17細胞分化之功效。在一實施例中，牛樟芝萃取物為前述之牛樟芝萃取物。
與Th17細胞調節相關之疾病的例子，可包括，限於全身性紅斑性狼瘡、葛瑞夫氏病、乾癬、類風濕性關節炎、第一型糖尿病、橋本氏甲狀腺炎、多發性硬化症、帕金森氏症、發炎性腸病、過敏性疾病、後天免疫不全疾病、慢性阻塞性肺疾病、動脈粥樣硬化、心肌炎、擴張性心肌病變與癌症等。
在一實施例中，上述與Th17細胞調節相關之疾病為全身性紅斑性狼瘡、葛瑞夫氏病或乾癬。又，上述全身性紅斑性狼瘡可包括，例如活動型全身性紅斑性狼瘡。
實施例 實施例1：牛樟芝萃取物之製備
1. 牛樟芝子實體萃取物ACFB03之製備
ACFB03樣品之製備方法描述如下：
(1)將10g牛樟芝子實體粉體，加入100ml的95%乙醇水溶液以形成一混合物，且之後將混合物加熱迴流1小時。
(2)將混合物利用離心方式去除於其中之雜質(6000rpm；20分鐘)以收集上清液，之後以減壓濃縮去除於上清液中之溶劑以獲得一乾燥之萃取物。
(3)加入20ml純水，且以超音波震盪，以回溶上述萃取物並形成一懸浮液。
(4)將懸浮液進行冷凍乾燥，以去除水分。
(5)收集冷凍乾燥的樣品共1.67g。代號ACFB03。
2. 牛樟芝子實體萃取物ACFB06之製備
ACFB06樣品之製備方法描述如下：
(1)將10g牛樟芝子實體粉體，加入100ml的25%乙醇水溶液以形成一混合物，且之後將混合物加熱迴流1小時。
(2)將混合物利用離心方式去除於其中之雜質(6000rpm；20分鐘)以收集上清液，之後以減壓濃縮去除於上清液中之溶劑以獲得一乾燥之萃取物。
(3)加入20ml純水，且以超音波震盪，以回溶上述萃取物並形成一懸浮液。
(4)將懸浮液進行冷凍乾燥，以去除水分。
(5)收集冷凍乾燥的樣品共0.59g。代號ACFB06。
3. 牛樟芝子實體萃取物ACFB12之製備
ACFB12樣品之製備方法描述如下：
(1)將80g牛樟芝子實體粉體，加入800ml的50%乙醇水溶液以形成一混合物，且之後將混合物加熱迴流1小時。
(2)趁熱將混合物以濾紙(Toyo,N0.2)減壓過濾，以收集濾液並獲得牛樟芝子實體殘留物(濾渣)。持續減壓抽濾30分鐘以抽乾牛樟芝子實體殘留物。
(3)回收上述牛樟芝子實體殘留物，並將1600ml的純水加入其中以形成一混合物，之後將混合物加熱迴流1小時。
(4)趁熱將混合物以利用濾紙(Toyo,N0.2)減壓過濾，收集濾液。
(5)收集兩次的濾液進行減壓濃縮，先濃縮步驟2的濾液，且於濃縮步驟2的濾液之步驟期間再合併步驟4所得濾液進行減壓濃縮，濃縮至合適濃度後進行冷凍乾燥，以去除水分。
(6)收集冷凍乾燥的樣品共20.34g。代號ACFB12。
4. 牛樟芝菌絲體萃取物AC06-EA(乙酸乙酯萃取物)之製備
AC06-EA樣品之製備方法描述如下：
(1)將2g牛樟芝菌絲體，加入30ml的乙酸乙酯混合以形成一混合物，且之後將混合物加熱迴流1小時。
(2)將混合物利用離心方式去除混合物中之雜質(6000rpm；10分鐘)，再經濾紙(Toyo,N0.2)過濾以收集濾液，之後以減壓濃縮去除於濾液中之溶劑以獲得萃取物。
(3)收集萃取物樣品共0.32g。代號AC06-EA。
5. 牛樟芝菌絲體萃取物AC06-A(丙酮萃取物)之製備
AC06-A樣品之製備方法描述如下：
(1)將2g牛樟芝菌絲體，加入30ml的丙酮混合以形成一混合物，且之後將混合物加熱迴流1小時。
(2)將混合物利用離心方式去除混合物中之雜質(6000rpm；10分鐘)，再經濾紙(Toyo,N0.2)過濾以收集濾液，之後以減壓濃縮去除於濾液中之溶劑以獲得萃取物。
(3)收集萃取物樣品共0.30g。代號AC06-A。
實施例2：牛樟芝子實體萃取物對於抑制Th17細胞分化能力之評估
於本實施例中，透過小鼠脾臟細胞建構之Th17細胞分化系統，評估實施例1所得之牛樟芝子實體萃取物(ACFB12、ACFB03、ACFB06)與牛樟芝菌絲體萃取物(AC06-EA與AC06-A)對於Th17細胞分化之影響。
1. 牛樟芝子實體萃取物ACFB03對於抑制Th17細胞分化能力之評估
將C57BL/6小鼠(6~8週齡)之脾臟取出並利用篩網磨碎，收集細胞懸浮液即為初級脾臟細胞。接著利用IMag magnetic system(BD Pharmingen,San Jose,CA)分離出CD4+T細胞，取將細胞以5X105細胞/孔之密度加入24孔細胞培養盤中，並將細胞分成控制組、負對照組、實驗組A、實驗組B、 實驗組C五組，而各組之詳細處理如表1所示。
參見表1。控制組係為未加入任何處理試劑之CD4+T細胞；負對照組為Th17分化組，給予細胞激素與中和性抗體處理，促使CD4+T細胞分化為Th17細胞；實驗組A、實驗組B與實驗組C，為分別同時加入不同濃度的牛樟芝子實體萃取物(ACFB03)，以觀察其對於Th17細胞分化之影響。將上述細胞於37℃且含5% CO2培養箱中培養。經過三天培養後，分別於每個孔洞中加入10ul PMA(0.05mg/ml)(Sigma)與1ul brefeldin A(eBioscience)刺激4小時，之後分別收取細胞與上清 液體。細胞部分藉由Fixation & Permeabilization Buffers(eBioscience)進行固定與穿透，接著加入抗-小鼠IL-17 FITC抗體(0.25ug/test)(eBioscience)進行染色，且透過流式細胞儀(Partec)分析Th17細胞的百分比，其結果如第1圖所示。
第1圖顯示，實驗組中給予牛樟芝子實體萃取物(ACFB03)處理後能抑制Th17細胞的分化，且在10ug/ml與20ug/ml的濃度處理下，皆有良好的抑制效果，幾乎可完全抑制Th17細胞的分化。
2. 牛樟芝子實體萃取物ACFB06對於抑制Th17細胞分化能力之評估
將C57BL/6小鼠(6~8週齡)之脾臟取出並利用篩網磨碎，收集細胞懸浮液即為初級脾臟細胞。接著利用IMag magnetic system(BD Pharmingen,San Jose,CA)分離出CD4+T細胞，將細胞以5X105細胞/孔之密度加入24孔細胞培養盤中，並將細胞分成控制組、負對照組、實驗組D、實驗組E、實驗組F五組，而各組之詳細處理如表1所示。
參見表2。控制組係為未加入任何處理試劑之CD4+T細胞；負對照組為Th17分化組，給予細胞激素與中和性抗體處理，促使CD4+T細胞分化為Th17細胞；實驗組D、實驗組E與實驗組F，為分別同時加入不同濃度的牛樟芝子實體萃取物ACFB06，以觀察其對於Th17細胞分化之影響。將上述細胞於37℃且含5% CO2培養箱中培養。經過三天培養後，分別於每個孔洞中加入10ul PMA(0.05mg/ml)(Sigma)與1ul brefeldin A(eBioscience)刺激4小時，之後分別收取細胞與上清液體。細胞部分藉由Fixation & Permeabilization Buffers(eBioscience)進行固定與穿透，接著加入抗-小鼠IL-17 FITC抗體(0.25ug/test)(eBioscience)進行染色，且透過流式細胞儀(Partec)分析Th17細胞的百分比，其結果如第2圖所示。
第2圖顯示，實驗組中給予牛樟芝子實體萃取物ACFB06處理後，亦可抑制Th17細胞的分化。
3. 牛樟芝子實體萃取物ACFB12對於抑制Th17細胞分化能力之評估
將C57BL/6小鼠(6~8週齡)之脾臟取出並利用篩網磨碎，收集細胞懸浮液即為初級脾臟細胞。接著利用IMag magnetic system(BD Pharmingen,San Jose,CA)分離出CD4+T細胞，將細胞以5X105細胞/孔之密度加入24孔細胞培養盤中，並將細胞分成控制組、負對照組、實驗組G、實驗組H、實驗組I五組，而各組之詳細處理如表3所示。
參見表3。控制組係為未加入任何處理試劑之CD4+T細胞；負對照組為Th17分化組，給予細胞激素與中和性 抗體處理，促使CD4+T細胞分化為Th17細胞；實驗組G、實驗組H與實驗組I，為分別同時加入不同濃度的牛樟芝子實體萃取物ACFB12，以觀察其對於Th17細胞分化之影響。將上述細胞於37℃且含5% CO2培養箱中培養。經過三天培養後，分別於每個孔洞中加入10ul PMA(0.05mg/ml)(Sigma)與1ul brefeldin A(eBioscience)刺激4小時，之後分別收取細胞與上清液體。細胞部分藉由Fixation & Permeabilization Buffers(eBioscience)進行固定與穿透，接著加入抗-小鼠IL-17 FITC抗體(0.25ug/test)(eBioscience)進行染色，且透過流式細胞儀(Partec)分析Th17細胞的百分比，其結果如第3圖所示。
第3圖顯示，實驗組中給予牛樟芝子實體萃取物ACFB12處理後能抑制Th17細胞的分化，其抑制效果隨著劑量增加有相對增強之趨勢，尤其在10ug/ml與20ug/ml的濃度下之抑制效果更為顯著。
根據第1-3圖所示之結果可知，牛樟芝子實體萃取物ACFB06對Th17細胞的分化之抑制效果相對於牛樟芝子實體萃取物ACFB12及ACFB03則減弱許多。
實施例3：牛樟芝菌絲體萃取物對於抑制Th17細胞分化能力之評估
於本實施例中，透過小鼠脾臟細胞建構之Th17細胞分化系統，評估實施例1所得之牛樟芝菌絲體萃取物(AC06-EA與AC06-A)對於Th17細胞分化之影響。
1. 牛樟芝菌絲體萃取物AC06-EA對於抑制Th17細胞分化能力之評估
將C57BL/6小鼠(6~8週齡)之脾臟取出並利用篩網磨碎，收集細胞懸浮液即為初級脾臟細胞。接著利用IMag magnetic system(BD Pharmingen,San Jose,CA)分離出CD4+T細胞，將細胞以5X105細胞/孔之密度加入24孔細胞培養盤中，並將細胞分成控制組、負對照組、實驗組J、實驗組K、實驗組L五組，而各組之詳細處理如表4所示。
參見表4。控制組係為未加入任何處理試劑之CD4+T細胞；負對照組為Th17分化組，給予細胞激素與中和性 抗體處理，促使CD4+T細胞分化為Th17細胞；實驗組J、實驗組K與實驗組L，為分別同時加入不同濃度的牛樟芝菌絲體萃取物AC06-EA，以觀察其對於Th17細胞分化之影響。將上述細胞於37℃且含5% CO2培養箱中培養。經過三天培養後，分別於每個孔洞中加入10ul PMA(0.05mg/ml)(Sigma)與1ul brefeldin A(eBioscience)刺激4小時，之後分別收取細胞與上清液體。細胞部分藉由Fixation & Permeabilization Buffers(eBioscience)進行固定與穿透，接著加入抗-小鼠IL-17 FITC抗體(0.25ug/test)(eBioscience)進行染色，且透過流式細胞儀(Partec)分析Th17細胞的百分比，其結果如第4圖所示。
第4圖顯示，實驗組中給予牛樟芝菌絲體萃取物AC06-EA處理後能抑制Th17細胞的分化，其抑制效果隨著劑量增加有相對增強之趨勢，尤其在20ug/ml的濃度下，有較顯著的抑制效果。
2. 牛樟芝菌絲體萃取物AC06-A對於抑制Th17細胞分化能力之評估
將C57BL/6小鼠(6~8週齡)之脾臟取出並利用篩網磨碎，收集細胞懸浮液即為初級脾臟細胞。接著利用IMag magnetic system(BD Pharmingen,San Jose,CA)分離出CD4+T細胞，將細胞以5X105細胞/孔之密度加入24孔細胞培養盤中，並將細胞分成控制組、負對照組、實驗組M、實驗組N、實驗組O五組，而各組之詳細處理如表5所示。
表5、各組別的詳細處理
參見表5。控制組係為未加入任何處理試劑之CD4+T細胞；負對照組為Th17分化組，給予細胞激素與中和性抗體處理，促使CD4+T細胞分化為Th17細胞；實驗組M、實驗組N與實驗組O，為分別同時加入不同濃度的牛樟芝菌絲體萃取物AC06-A，以觀察其對於Th17細胞分化之影響。將上述細胞於37℃且含5% CO2培養箱中培養。經過三天培養後，分別於每個孔洞中加入10ul PMA(0.05mg/ml)(Sigma)與1ul brefeldin A(eBioscience)刺激4小時，之後分別收取細胞與上清液體。細胞部分藉由Fixation & Permeabilization Buffers (eBioscience)進行固定與穿透，接著加入抗-小鼠IL-17 FITC抗體(0.25ug/test)(eBioscience)進行染色，且透過流式細胞儀(Partec)分析Th17細胞的百分比，其結果如第5圖所示。
第5圖顯示，實驗組中給予牛樟芝菌絲體萃取物AC06-A處理後，亦可抑制Th17細胞的分化且其抑制效果與AC06-EA相似。
實施例4：牛樟芝子實體萃取物ACFB12對於全身性紅斑性狼瘡病人之Th17細胞的影響
於本實驗中，透過全身性紅斑性狼瘡病人周邊血液單核細胞，來評估牛樟芝子實體萃取物ACFB12對於Th17細胞活性之影響。其實施步驟如下所述：將21位活動型全身性紅斑性狼瘡病人及20位健康者的周邊血液以ACFB12(20ng/ml)(實驗組)或是DMSO(對照組)處理6小時後，分離其單核細胞。之後再以IL-17抗體進行細胞內染色，最後利用流式細胞儀分析Th17細胞的百分比。實驗結果如第6圖所示。
第6圖實驗結果顯示，牛樟芝子實體萃取物ACFB12於20ng/ml下即可有效降低全身性紅斑性狼瘡病人之Th17細胞(平均值：0.95% vs. 0.48%；p<0.001)，但ACFB12對於健康者的Th17細胞則無影響。
實施例5：牛樟芝子實體萃取物ACFB12對於葛瑞夫氏病人之Th17細胞的影響
本實施例中，透過葛瑞夫氏病人周邊血液單核細胞來評估牛樟芝子實體萃取物ACFB12對於Th17細胞之影響。 其實施步驟如下：
收集1位葛瑞夫氏病人與1位健康者的周邊血液，接著分離出周邊血液單核細胞，分別給予ACFB12(20ug/ml)(實驗組)與DMSO(對照組)處理16小時後，再以IL-17抗體進行細胞內染色，最後利用流式細胞儀分析Th17細胞的百分比。實驗結果如第7圖所示。
第7圖實驗結果顯示，牛樟芝子實體萃取物ACFB12於20ug/ml濃度處理下，除了可降低葛瑞夫氏病人之Th17細胞(平均值：0.30% vs. 0.21%)外，亦可降低健康者之Th17細胞(平均值：0.08% vs. 0.03%；p<0.05)。
實施例6：牛樟芝子實體萃取物ACFB12對於咪喹莫特(imiquimod,IMQ)誘導之乾癬動物模式Th17細胞的影響
本實施例中，透過咪喹莫特(imiquimod,IMQ)誘導之乾癬動物模式來評估牛樟芝子實體萃取物ACFB12對於Th17細胞之影響。其實施步驟如下：
首先將Balb/c小鼠(6~8週齡)背部毛髮剃除，並將小鼠分成控制組、對照組、實驗組三組，控制組中未給予小鼠任何處理；對照組將62.5mg咪喹莫特乳膏(Aldara；3M Pharmaceuticals)塗抹於小鼠背部，每天給予一次咪喹莫特乳膏，連續給予十天，以誘導小鼠皮膚乾癬症狀產生；而實驗組則將62.5mg咪喹莫特乳膏塗抹於小鼠背部，接著透過腹腔注射給予牛樟芝子實體萃取物ACFB12(10mg/kg)，每天給予一次咪喹莫特乳膏與牛樟芝子實體萃取物ACFB12(10mg/kg)，連續給予十天。之後犧牲小鼠並且將其脾臟取出，並將脾臟通 過70-μm格狀鐵網以取得單顆細胞懸浮液。利用紅血球細胞裂解液(Red blood cell lysis buffer)剔除於上述單顆細胞懸浮液中之紅血球，然後將其以經由PBS清洗兩次後，即獲得初級脾臟淋巴球細胞。進一步將脾臟淋巴球細胞(2×106)植入已塗覆抗-CD3單株抗體(1μg/ml)(BD Pharmingen)的24孔細胞培養盤中，刺激細胞24小時後，取出細胞溶於0.2% BSA/PBS，利用抗-小鼠CD4 PE抗體染色30分鐘，接著將細胞利用PBS清洗三次。進一步利用2%多聚甲醛(paraformaldehyde)與0.5%皂素(saponin)進行固定與穿透，接著加入抗-小鼠IL-17 FITC抗體進行細胞內部的染色。最後利用流式細胞儀(FACSCalibur；BD Biosciences)及CellQuest軟體(BD Biosciences)分析CD4+/IL-17+雙陽性細胞之百分比。
第8圖顯示，對照組相對於控制組在給予咪喹莫特後，可明顯增強小鼠脾臟的CD4+/IL-17+雙陽性細胞，然而在實驗組中同時給予咪喹莫特與牛樟芝子實體萃取物ACFB12後，則可降低CD4+/IL-17+雙陽性細胞(平均值：9.3% vs. 3.6%；p<0.001)。

Claims (13)

  1. 一種牛樟芝萃取物用於製備調節Th17細胞之藥物的用途，其中該牛樟芝萃取物具有調節Th17細胞之功效。
  2. 如申請專利範圍第1項所述之牛樟芝萃取物用於製備調節Th17細胞之藥物的用途，其中該調節Th17細胞之功效包括抑制Th17細胞分化。
  3. 如申請專利範圍第1項所述之牛樟芝萃取物用於製備調節Th17細胞之藥物的用途，其中該牛樟芝萃取物包括一牛樟芝子實體之萃取物或一牛樟芝菌絲體之萃取物。
  4. 如申請專利範圍第3項所述之牛樟芝萃取物用於製備調節Th17細胞之藥物的用途，其中該牛樟芝子實體之萃取物係藉由對該牛樟芝子實體進行一萃取製程所獲得，該萃取製程使用至少一萃取溶劑，該至少一溶劑包括一醇類及/或水。
  5. 如申請專利範圍第4項所述之牛樟芝萃取物用於製備調節Th17細胞之藥物的用途，其中該醇類包括甲醇、乙醇、異丙醇或丁醇。
  6. 如申請專利範圍第5項所述之牛樟芝萃取物用於製備調節Th17細胞之藥物的用途，其中該乙醇包括10-95%之乙醇水溶液。
  7. 如申請專利範圍第4項所述之牛樟芝萃取物用於製備調節Th17細胞之藥物的用途，其中該萃取製程包括：將該牛樟芝子實體以該至少一溶劑加熱回流已形成一混合物；以及對該混合物進行過濾以獲得一濾液，而該濾液為該牛樟芝 子實體萃取物。
  8. 如申請專利範圍第3項所述之牛樟芝萃取物用於製備調節Th17細胞之藥物的用途，其中該牛樟芝菌絲體之萃取物係藉由對該牛樟芝子實體進行一萃取製程所獲得，該萃取製程使用至少一萃取溶劑，該至少一溶劑包括一乙酸乙酯或丙酮。
  9. 一種牛樟芝萃取物用於製備治療與Th17細胞調節相關之疾病之藥物的用途，其中該牛樟芝萃取物具有抑制Th17細胞分化之功效。
  10. 如申請專利範圍第9項所述之牛樟芝萃取物用於製備治療與Th17細胞調節相關之疾病之藥物的用途，其中該牛樟芝萃取物包括一牛樟芝子實體之萃取物或一牛樟芝菌絲體之萃取物。
  11. 如申請專利範圍第9項所述之用於製備治療與Th17細胞調節相關之疾病之藥物的用途，其中與Th17細胞調節相關之疾病包括全身性紅斑性狼瘡、葛瑞夫氏病、類風濕性關節炎、乾癬、第一型糖尿病、橋本氏甲狀腺炎、多發性硬化症、帕金森氏症、發炎性腸病、過敏性疾病、後天免疫不全疾病、慢性阻塞性肺疾病、動脈粥樣硬化、心肌炎、擴張性心肌病變或癌症。
  12. 如申請專利範圍第9項所述之用於製備治療與Th17細胞調節相關之疾病之藥物的用途，其中與Th17細胞調節相關之疾病為全身性紅斑性狼瘡、葛瑞夫氏病或乾癬。
  13. 如申請專利範圍第12項所述之用於製備治療與Th17細胞調節相關之疾病之藥物的用途，其中該全身性紅斑性狼瘡 包括活動型全身性紅斑性狼瘡。
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