TWI658828B - 用於舒緩及減輕近視之醫藥組合物及其製備方法與用途 - Google Patents

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Abstract

本發明提供一種用於舒緩及減輕近視之醫藥組合物，其包括有效劑量之抗發炎藥以及醫藥學上可接受之賦形劑；本發明所使用之醫藥組合物之成分安全性高，並藉由有效劑量之抗發炎藥物達到治療及舒緩近視之效果；本發明藉由特定醫藥學上可接受之賦形劑藉以包覆抗發炎藥物之製備方法可達到穩定且快速溶解之效果。

Description

用於舒緩及減輕近視之醫藥組合物及其製備方法與用途
本發明關於一種醫藥組合物，尤指包含有特定重量比例之抗發炎藥物之醫藥組合物；本發明關於前述醫藥組合物之製備方法，尤指藉由特定賦形劑包覆抗發炎藥物以達到穩定且快速溶解之方法；本發明更關於一種前述醫藥組合物用於製備醫藥品以舒緩或減輕近視之用途。
近視眼的發病率在近十年迅速增加，並引起全球公共衛生單位之關注；在全球，由於裸眼近視以及屈光不正(refractive errors，REs)，已有1.53億人具有5年以上視野缺損(visual defect)，其中8億人更遭受失明之困擾。在美國，因近視導致之經濟成本已經增長到了每年2.5億美元，因此，近視是一個重要卻治療不足(undertreated)之眼部疾病。雖然近視大多數情況下可藉由眼鏡、隱形眼鏡或者屈光手術矯正，然而未校正的屈光不正仍佔視覺障礙(visual impairment)約33%。基於黃斑以及視網膜併發症等風險，高度近視係相當危險的。近視原因主要源自眼球的玻璃腔不正常延長，現有技術以單眼視野剝奪(monocular form deprivation，MFD)的動物模型已證實可用於研究近視之進程，其中眼球延長與鞏膜重塑(sclera remodeling)、藉由減少結締組織的合成而導致鞏膜組織損失以及增加I型 膠原蛋白(collagen I，COL1)降解有關，並進而改變鞏膜組成及延展性(ductility)。近來研究顯示，猴子之光受體(photoreceptors)以及視網膜色素(retinal pigment epithelium)藉由產生活化訊息以調控鞏膜組織重塑，而在調節眼睛生長及軸向長度扮演重要角色。
動物的近視研究顯示，非選擇性毒蕈鹼乙醯膽鹼受體拮抗劑(nonselective muscarinic acetylcholine receptor，mAchR)阿托品(atropine)，能夠有效防止眼軸延長而造成之近視。阿托品抑制近視之效果在樹鼩(tree shrews)、猴、雞、豚鼠(guinea pigs)、大鼠、小鼠、敘利亞倉鼠(Syrian hamsters)以及人類臨床試驗皆能看到有效性。然而，抑制近視之機制仍是未知。
在近視的眼睛中，轉化生長因子-β(transforming growth factor-β，TGF-β)和基質金屬蛋白酶2(matrix metalloproteinase 2，MMP2)表現升高，而I型膠原蛋白表現則是下降。TGF-β調控細胞功能，例如細胞生長、分化、發炎及傷口癒合，而MMP家族則在發炎反應中於細胞外基質、組織重建以及血管生成(vascularization)扮演主要角色。其中MMPs失調被認為導致近視機制之一；MMP2於鞏膜之上調控表現可見於雞和樹鼩，且近視可藉由視覺剝奪(deprivation)而被誘發表現。TGF-β可藉由活化NF-κB以調控MMP2之表現，其中NF-κB可於纖維母細胞中調控各種發炎激素之表現。
若干報告顯示發炎於近視歷程之作用：葡萄膜炎(uveitis)會引起急性或近視轉變，其中急性鞏膜炎(acute scleritis)可觀察到急性近視之現象。由追蹤26年且患有幼年型類風濕性關節炎(juvenile chronic arthritis，JCA)之病患群中可發現近視屈光不正之比例與年齡匹配對照組的比例更大，這顯示JCA與近視之間的相關性。同樣的研究表明，衰弱鞏膜結締組織導致慢性發炎，進而導致近視發生率較高。此外，急性近視亦為全身性紅斑狼瘡(systemic lupus erythematosus，SLE)的一種特徵。
鑑於現有技術並未有安全且有效抑制近視的問題，本發明的目的在於提供一種包含有特定重量比例之抗發炎藥之醫藥組合物，即使在已近視的情況下，仍可顯著舒緩及減輕近視。
為達到上述目的，本發明提供一種用於舒緩及減輕近視之醫藥組合物，其包括有效劑量之抗發炎藥以及醫藥學上可接受之賦形劑。
依據本發明，本發明所述之醫藥組合物係以人工淚液以及醫藥學上可接受之賦形劑包覆有效劑量之抗發炎藥物所形成；其中抗發炎藥物係雙醋瑞因(diacerein)或雙氯芬酸(diclofenac)；「人工淚液」如此處所指係一種與人體淚液成份相似之溶液，其成分包含，但不限於水、鹽類、透明質酸鈉、羧甲基纖維素、羥丙甲纖維素或羥丙基纖維素；人工淚液於本發明之用途如本領域熟悉技術人士所知，其係藉由使水分均勻分布於眼球表面已達到潤滑眼球並舒緩眼睛酸澀與疲勞之效果；其中「醫藥學上可接受之賦形劑」如此處所指係用於包覆溶解雙醋瑞因，其醫藥學 上可接受之賦形劑包括，但不限於蓖麻油聚乙烯醚系列(Cremophor®)、苯扎氯銨(alkyldimethylbenzylammonium，BKC)、卵磷脂(lecithin)、膽固醇(cholesterol)、杜比可磷酸鹽緩衝液(Dulbecco's phosphate buffered saline，DPBS)、聚山梨醇酯80(tween 80)蓖麻油(castor oil)、人工淚液或其組合。
較佳的，所述之醫藥組合物中，抗發炎藥係雙醋瑞因，且雙醋瑞因之濃度介於0.01體積莫耳濃度(M)至0.02M，且醫藥學上可接受之賦形劑包含tween 80、蓖麻油及人工淚液。
更佳的，所述之醫藥組合物中，醫藥學上可接受之賦形劑係以人工淚液之總體積為基準，tween 80與蓖麻油之體積比例為0.01至0.02：0.003。
更佳的，所述之醫藥組合物包含0.004克雙醋瑞因、1ml人工淚液、10μl tween 80及3μl蓖麻油。
較佳的，所述之醫藥組合物中，其中抗發炎藥係雙氯芬酸，且雙氯芬酸之濃度係介於0.01M至0.02M，且賦形劑為人工淚液。
更佳的，所述之組合物包含0.004克雙氯芬酸及1ml人工淚液。
較佳的，所述之醫藥組合物更可包括醫藥學上可接受之賦形劑，其中賦形劑的實例包括水、鹽水、磷酸鹽緩衝生理食鹽水、右旋糖、甘油、乙醇及其類似物的一或多種及其組合。藥學上可接受之賦形劑更可進一步包含微量輔助物質，諸如濕潤劑或乳化劑、防腐劑或緩衝劑。
本發明再提供一種前述醫藥組合物之製備方法，其包括：齊備如前述之抗發炎藥；齊備如前述之醫藥學上可接受之賦形劑；將有效劑量之抗發炎藥以分次逐步之方式，於震盪條件下與該醫藥學上可接受之賦形劑混合，以獲得該醫藥組合物。
較佳的，所述之抗發炎藥係雙醋瑞因，醫藥學上可接受之賦形劑係tween 80、蓖麻油及人工淚液，且係以人工淚液之總體積為基準，將tween 80與蓖麻油以體積比例為0.01至0.02：0.003混合並溶於人工淚液後以形成混合液，再將雙醋瑞因分次逐步加入混合液中，以獲得該醫藥組合物。
較佳的，所述之抗發炎藥係雙氯芬酸，醫藥學上可接受之賦形劑係人工淚液，將雙氯芬酸以0.03至0.06：10重量比例分次逐步加入人工淚液中，以獲得該醫藥組合物。
本發明更提供一種如前述之醫藥組合物用於製備舒緩及減輕近視之醫藥品之用途，其係將有效劑量之醫藥品施予受體局部部位，以使受體局部部位達到減緩近視之效果。
依據本發明，「有效劑量」係指在劑量上及對於所需要之時間而言對達成所要減緩近視有效之量；其如本發明所例示者，有效減緩近視劑量可透過抑制發炎實驗試驗而得知。
依據本發明，所述之醫藥品可用現有技術水準中以習知之方法，利用已知之賦形劑，如黏合劑、崩散劑、分散劑、充填劑、安定劑、稀釋劑或染劑加以製造。
較佳的，所述之受體係動物或人類。
較佳的，所述之施予方式係口服施予、局部注射施予或外用施予。
較佳的，所述之外用施予受體之有效劑量係濃度介於0.5%至1%。
更佳的，所述之局部部位是眼球。
較佳的，所述之口服施予受體之有效劑量係介於每天10毫克(mg/day)至50mg/day。
依據本發明，雖實施例將前述醫藥組合物配置成眼藥水並以外用方式施用，但口服施用之劑量可根據藥品作為原本用途時之口服建議劑量，如雙醋瑞因作為關節炎藥物之錠片所含之有效成分為50mg(建議一次攝取之最大量；一天最多攝取三次，計150mg)。
本發明所述之醫藥品可以多種形式存在，該等形式包括，但不限於液體、半固體及固體藥劑形式，其中液體溶液(例如可注射及可輸注溶液)包括分散液或懸浮液；固體藥劑包括，但不限於錠劑、丸劑、粉劑、脂質體及栓劑。較佳的形式取決於預期的投藥模式及治療應用；較佳的，所述之醫藥品之劑型是局部外用製劑形式，包括，但不限於藥膏、貼布、皮下植入、滴劑(drop)或凝膠。更佳的，本發明之醫藥品係被製造成適合於局部地施用於眼球的外用製劑(external preparation)，其劑型包括，但不限於 藥膏、滴劑或凝膠。
更佳的，本發明所述之醫藥品作為外部製劑時，可使用添加劑，其添加劑包括，但不限於保存劑(preserving agents)、抗氧化劑(antioxidants)、界面活性劑(surfactants)、吸收增強劑(absorption enhancers)、安定劑(stabilizing agents)、活性劑(active agents)、保濕劑(humectants)、pH調整劑(pH adjusting agents)、助溶劑(solubilizing agents)、滲透增強劑(penetration enhancers)以及抗刺激劑(anti-irritants)；以上添加劑的種類選用及用量是本領域熟悉技術人士之例行技術範疇內。
本發明所述之醫藥組合物可用於發炎反應與近視發展的預防和治療；本發明所使用的醫藥組合物成分安全性高，且不會對細胞產生毒性；再者，本發明所述之醫藥組合物即使在眼球已發炎的狀況下，仍然能以有效劑量抑制發炎反應並達到治療及舒緩近視之效果。此外，本發明所述之製備方法，係以特定成分之混合液藉以包覆雙醋瑞因或雙氯芬酸以達到穩定且快速溶解之效果。
圖1A是本發明之倉鼠進行單眼視野剝奪試驗(MFD)21天後，分別於MFD右眼施予PBS(作為控制組)或不同濃度阿托品(0.125%、0.5%及1%)之RE值(屈光度)柱狀圖。
圖1B至圖ID是本發明於倉鼠之左眼、MFD右眼分別施予PBS(控制組)或施予阿托品後藉由免疫組織染色法分別觀察CHRM1、CHRM3、MMP2、collagen I、TGF-β(於鞏 膜或視網膜)表現之組織染色圖。
圖2A是本發明於倉鼠之左眼、MFD右眼分別施予PBS(作為控制組)或3%環孢菌素A(CSA)之RE值柱狀圖。
圖2B是本發明於倉鼠之左眼、MFD右眼分別施予PBS(作為控制組)或3%環抱菌素A後藉由免疫組織染色法分別觀察MMP2與TGF-β表現之組織染色圖。
圖3A是本發明於倉鼠之左眼、MFD右眼分別施予PBS(作為控制組)、脂多醣(LPS)或肽聚醣(PGN)之RE值柱狀圖。
圖3B是本發明於倉鼠之左眼、MFD右眼分別施予PBS(作為控制組)、脂多醣或肽聚醣後藉由免疫組織染色法分別觀察MMP2與TGF-β表現之組織染色圖。
圖3C是本發明於倉鼠之無MFD眼分別施予PBS(作為控制組)、脂多醣或肽聚醣之RE值柱狀圖。
圖3D是本發明於倉鼠之無MFD左眼、MFD右眼分別施予PBS(作為控制組)、脂多醣或肽聚醣後藉由免疫組織染色法分別觀察之MMP2、collagen I及TGF-β表現之組織染色圖。
圖4A是本發明於倉鼠之無MFD左眼、MFD右眼分別施予PBS(作為控制組)或阿托品後藉由免疫組織染色法分別觀察之c-FOS及NF-κB表現之組織染色圖。
圖4B是本發明於倉鼠之無MFD左眼、MFD右眼分別施予PBS(作為控制組)或CSA後藉由免疫組織染色法分別觀察之c-FOS及NF-κB表現之組織染色圖。
圖4C是本發明於倉鼠之無MFD左眼、MFD右眼分別施 予PBS(作為控制組)、脂多醣或肽聚醣後藉由免疫組織染色法分別觀察c-FOS及NF-κB表現之組織染色圖。
圖4D是本發明於倉鼠之無MFD左眼、MFD右眼分別施予PBS(作為控制組)或阿托品後藉由免疫組織染色法分別觀察之IL-6、TNF-α及IL-10表現之組織染色圖。
圖4E是本發明於倉鼠之無MFD左眼、MFD右眼分別施予PBS(作為控制組)、脂多醣或肽聚醣後藉由免疫組織染色法分別觀察之IL-10及TNF-α表現之組織染色圖。
圖4F是本發明於倉鼠之無MFD左眼、MFD右眼分別施予PBS(作為控制組)或CSA後藉由免疫組織染色法分別觀察之IL-6、TNF-α及IL-10表現之組織染色圖。
圖5A是本發明將豚鼠右眼進行MFD試驗之示意圖。
圖5B是本發明於豚鼠之無MFD左眼、MFD右眼分別施予PBS(作為控制組)、脂多醣或肽聚醣後藉由免疫組織染色法分別觀察MMP2、collagen I及TGF-β表現之組織染色圖。
圖5C是本發明於豚鼠之控制組(施予PBS)、MFD眼、MFD眼施予阿托品後藉由免疫組織染色法分別觀察c-FOS及IL-10表現之組織染色圖。
圖6A是本發明將大鼠鞏膜纖維母細胞分別施予PBS(做為控制組)或100μM阿托品後藉由免疫螢光染色法分別觀察MMP2及collagen I表現之細胞螢光圖。
圖6B是將圖6A所述之免疫螢光染色法之結果量化之柱狀圖。
圖6C是本發明將大鼠鞏膜纖維母細胞分別施予PBS(做 為控制組)、400μM阿托品、10mM雙醋瑞因、每毫升1微克(μg/ml)LPS、1μg/ml LPS與400μM阿托品以及1μg/ml LPS與10mM雙醋瑞因後藉由電泳法分別觀察原MMP2(pro MMP2)、活化之MMP2、原MMP9(pre MMP9)及活化之MMP9表現之電泳圖。
圖6D是本發明將人視網膜色素上皮細胞ARPE-19以雙醋瑞因作為控制組，並分別施予200μM阿托品、400μM阿托品、1μg/ml LPS、1μg/ml LPS與400μM阿托品以及10μg/ml LPS後藉由電泳法觀察MMP2基因表現。
圖6E是人視網膜色素上皮細胞ARPE-19以PBS作為對照組，分別施予100ng/ml LPS或100ng/ml LPS+100μM阿托品處理30分鐘後，再以西方墨點法觀察蛋白質表現，其中LPS藉由抑制PI3K-AKT和MAPK途徑以誘導的NF-κB和AP1活化。ERK蛋白以及ERK蛋白之Thr202/Tyr204位置之磷酸化、AKT蛋白以及AKT蛋白之Ser473位置之磷酸化、PI3K蛋白以及PI3K蛋白之p85(Tyr458)/p55(Tyr199)、NF-κB蛋白以及NF-κB蛋白之(p65(Ser536))以及c-Fos蛋白以及c-Fos蛋白之Ser32磷酸化狀態之電泳圖；β-actin係作為內部控制組。
圖7A至圖7C分別為全身性紅斑狼瘡、川崎病以及第1型糖尿病之近視發生累積率之曲線圖。
圖8是本發明將倉鼠分別施予人工淚液(控制組)或施予不同濃度(3mM、30mM、100mM)之白藜蘆醇(實驗組)之屈光度差異之柱狀圖。
圖9是本發明將倉鼠之近視右眼及左眼分別施予人工淚 液(控制組)或施予100mM白藜蘆醇後，藉由免疫組織染色法分別觀察collagen I、TGF-β及TNF-α表現之組織染色圖。
圖10是本發明將人類視網膜色素上皮細胞ARPE-19施予1μg/ml LPS或50mM白藜蘆醇+1μg/ml LPS刺激24小時後，收取細胞上清液，利用酵素免疫吸附法測定單核球趨化蛋白-1(monocyte chemotactic protein-1，MCP-1)表現之柱狀圖。
圖11是本發明將人類視網膜色素上皮細胞施予500ng/ml LPS 30分鐘；或預處理50μM白藜蘆醇30分鐘後再加入500ng/ml LPS處理30分鐘之Akt蛋白及其於Ser473位置之磷酸化表現之電泳圖及柱狀圖。
圖12是本發明將人類視網膜色素上皮細胞ARPE-19施予500ng/ml LPS 30分鐘；或預處理50μM白藜蘆醇30分鐘後再加入500ng/ml LPS處理30分鐘之ERK1/2蛋白及其於Thr202/Tyr204位置之磷酸化表現之電泳圖及柱狀圖。
圖13是本發明所述之醫藥組合物用於抑制近視發展之示意圖，其中帶正號之箭頭表示促進過程、帶負號之箭頭表示抑制過程；基於本發明之實施例結果顯示發炎可導致近視；而近視後，與發炎相關的基因MMP2、TGF-β、NFκB、c-Fos、TNF-α、IL-6及IL-10皆會大量表現，如過程中施用LPS與PGN則會加重近視與發炎進程，以及使上述基因表現量再增加；反之若施用抗發炎藥物雙醋瑞因或雙氯芬酸與白藜蘆醇則會抑制此一進程，達到減緩與預防近視的效果。
本發明將由下列的實施例做為進一步說明，這些實施例並不限制本發明前面所揭示的內容。熟習本發明之技藝者，可以做些許之改良與修飾，但不脫離本發明之範疇。
材料與方法 製備例1 動物試驗
3週齡敘利亞倉鼠共160隻，體重各80克至90克以及2至3週齡的白化豚鼠共20隻。所有動物保持在12小時光照/黑暗週期。所有的程序符合由中國醫科大學實驗動物管理和使用委員會之規定，且皆於符合動物眼科與視覺研究中使用的指導方針進行試驗。將倉鼠之右眼瞼縫合21天，並藉由覆蓋右眼的布[與眼睛距離至少為1厘米(cm)]以誘發倉鼠近視。因此，右眼被誘發單眼視野剝奪(MFD)(左眼作為對照組)之倉鼠隨機被分為治療組或對照組(每組10隻動物)，每日兩隻眼睛接受藥物或磷酸鹽緩衝鹽水(phosphate-buffered saline，PBS)施予。
製備例2 細胞培養
R28大鼠視網膜上皮細胞(rat retinal epithelial cells)是由羅斯眼科研究所(Ross Eye Institute，紐約州立大學)之Gail Seigel所提供。將細胞於37℃、5%CO2環境培養於Dulbecco改良的Eagle培養基(DMEM)和10%胎牛血清(fetal bovine serum，FBS)，並於每3天至4天置換培養基。鞏膜培養於含有10% FBS DMEM之60毫米(mm)培養皿中藉以分離初級鞏膜纖維母細胞(primary scleral fibroblasts)，且本案之實施例中須少於3個繼代培養。初級鞏膜纖維母細胞接種於6孔盤中(1×105細胞/well)，以100ng/mL脂多醣(lipopolysaccharide，LPS)(購自於Sigma公司)處理或不處理4小時後，再以濃度為100莫耳體積濃度(μM)阿托品處理24小時。細胞裂解物(cell lysate)以定量即時聚合酶鏈鎖反應(quantitative real time polymerase chain reaction，qPCR)以檢測基因表現程度。
製備例3 cDNA微陣列分析
鞏膜組織可從單眼視野剝奪(MFD)小鼠或正常小鼠眼睛獲得，並藉由RNeasy迷你試驗套組(mini kit)(購自於Qiagen公司)分離總RNA。RNA的完整性和純度可藉由生物分析儀(Agilent Bioanalyser)檢定。將5管等量之總RNA混合，並使用Affymetrix基因芯片人類基因組U133 Plus 2.0進行cDNA微陣列分析。cDNA微陣列係以GeneArray scanner進行掃描，並以DNA-Chip Analyser software軟體進行分析。當某控制組之基因與某近視眼睛之基因表現相差大於1.2倍，即可被選定為獨創性途徑分析(ingenuity pathway analysis，IPA)。
製備例4 生理測量和組織準備
屈光不正(RE)[即球面屈光(spherical-component RE)之定義為水平和垂直線的平均值]可藉由手持線狀眼膜曲率器(retinoscope)進行測定。動物以含有10%乙醚(ether)之氧氣麻醉，並於試驗開始與結束時進行眼屈光(ocular refraction)測量。試驗結束時，依據美國國立衛生研究院公共衛生服務之實驗室動物指導方針將 動物犧牲。眼睛在冰盤上藉由外科顯微鏡(購於日本Topcon公司)以及剃刀(razor blade)摘除，並於垂直於前後軸(anterior-posterior axis)大約1毫米(mm)後方鋸齒緣進行切割，使眼球前方之虹膜(iris)及睫狀體(ciliary body)分離；眼球後方的鞏膜則藉由7mm直徑的環鋸(trephine)切除。軸向長度則是藉由A-scan超音波掃描(ultrasonography)(型號為PacScan 300+)測量，並以10次測量作為平均值。
製備例5 藉由PCR陣列檢測基因表達圖譜
由製備例3獲得之總RNA可用於PCR陣列分析。將1微克(μg)RNA經由高容量cDNA反轉錄試劑盒(high-capacity cDNA reverse transcription kit)(購自於Applied Biosystems公司)形成終體積20μl並進行逆轉錄，並藉由96孔RT2 Profiler PCR Arrays-Human Autophagy(購自於美國Qiagen公司)於LightCycler 480 PCR系統(購自於德國羅氏公司)檢測與近視歷程有關的基因。
製備例6 免疫螢光染色(immunofluorescence staining)
將由製備例2所獲得之初級鞏膜纖維母細胞置於載玻片並以Tris緩衝鹽水(Tris-buffered saline，TBS)洗滌，隨後以含有1%BSA及0.1% Triton X-100阻斷(bolcking)1小時後，再以TBS清洗2次並以4%三聚甲醛(paraformaldehyde)固定。以TBS洗滌三次後，以抗MMP2抗體(anti-MMMP2)或抗COL1抗體(anti-COL1)處理1小時後，再以合適的二級抗體及4',6-二脒基-2-苯基吲哚(4',6-diamidino-2-phenylindole，DAPI)進行DNA染色。再 以TBS洗滌三次後，利用螢光顯微鏡將細胞成像拍照。所有實驗至少重複三次。
製備例7 MMP2和MMP9活性分析
將製備例2所述之細胞以密度為1×106接種在24孔盤培養至少12小時。以PBS洗滌細胞3次後，將細胞培養於具有/無每毫升100奈克(ng/ml)LPS、100ng/ml LPS與濃度為100μM atropine或100ng/ml LPS與50μM雙醋瑞因(diacerein)之培養基中。培養48小時後，分別收集細胞上清液並以等體積之加樣緩衝液(loading buffer)[包含有125mM Tris鹽酸、pH值為6.8且濃度為3%SDS、40%甘油以及濃度為0.02%溴酚藍(bromophenol)]混合，以獲得各樣品；再將各樣品以含有0.1%明膠(gelatin)之8%十二院基硫酸鈉聚丙烯醯胺凝膠電泳(sodium dodecyl sulfate polyacrylamide gel electrophoresis，SDS-PAGE)進行蛋白質分離。
製備例8 西方墨點法分析(Western blot analysis)
人視網膜色素上皮細胞(human retinal pigment epithelial cells)ARPE-19[購自新竹生物資源保存及研究中心(Bioresource Collection and Research Center，BCRC)，編號為BCRC-60383]。ARPE-19細胞係培養於含10%FBS之DMEM培養基中並置於37℃、5%CO2環境，每3天至4天置換培養基。將ARPE-19細胞分別以PBS(作為對照組)、濃度為100ng/ml LPS或100ng/ml LPS+100μM atropine處理30分鐘。將30μg的總細胞裂解物進行 SDS-PAGE，並進行免疫轉漬分析(immunoblot analysis)，其中初級抗體包括ERK(Thr202/Tyr204)、AKT(Ser473)、PI3K(p85[Tyr458]/p55[Tyr199])、NF-κB(p65,Ser536)以及c-Fos(Ser32；購自於美國Cell Signaling公司)；次級抗體可以是綴合有山葵過氧化氫酶(horseradish peroxidase)之抗兔子或抗老鼠的抗體。具有免疫反應之蛋白可藉由增強化學發光套組(enhanced chemiluminescence kit，ECL kit)(購自美國Thermo Scientific公司)作為檢測，並以β-肌動蛋白抗體(β-actin antibody)(購自於美國Abcam公司)作為均等載入ERK、AKT、PI3K、NF-κB以及c-Fos之對照組。
製備例9 qPCR
藉由RNeasy MiniKit(購自於美國Qiagen公司)萃取總RNA，並將5μg的RNA經由逆轉錄系統Superscript First Strand Synthesis system(購自於美國Invitrogen公司)逆轉錄為cDNA。用於qPCR之引子及探針係選自於通用探針庫(英國Roche)，並可藉由甘油醛-3-磷酸脫氫酶(glyceraldehyde 3-phosphate dehydrogenase)作為各樣品轉錄程度標準化。
製備例10 免疫組織染色
由歷經atropine處理及對照組動物身上取下眼睛，並將眼睛分別包埋在石蠟中並切成厚度為20μm之切片；再將切片放置在載玻片上。以pH為6.0之檸檬酸鹽緩衝液(citrate buffer)於沸水中進行抗原修復(antigen retrieval)，再以針對IL-6、TNF-α、TGF-β、MMP2、c-Fos、 NF-κB、CHRM1以及CHRM 3之抗體進行染色，並藉由EnVision System peroxidase kit(購自於美國DAKO公司)觀察免疫反應。
製備例11 全國性以人群為基礎之回顧性陣列研究(nationwide population-based retrospective cohort study)
數據源自於健保資料庫(National health insurance research database，NHIRD)，該資料庫係由國家衛生研究院(National Health Research Institute)維護，其數據係以人口為基礎(佔台灣超過99%人口)以及由國民健康保險的理賠數據獲得，該數據庫包含了所有的醫療索賠和參保人員的信息，以提供足夠之樣本量。為確保精確性和可靠性，係由1996年到2008年隨機挑選50%小於18歲之孩童。就發炎性疾病而言，包括全身性紅斑狼瘡、第1型糖尿病(T1D)和川崎病(Kawasaki disease，KD)之指數是根據國際疾病分類臨床修正第九版疾病(International Classification of Diseases,Ninth Revision,Clinical Modification，ICD-9-CM)以及重大傷病證明資料庫(Registry for Catastrophic Illness Patient Database)作為定義，其中包括特定的主要傷害或疾病。城市化的程度可分為七大類，級別1和7分別代表最高和最低的程度。由於很少孩童被分類為級別5至7中，故將這些孩童與級別4合併。投保人的身份是被加密的(encrypted)，且經由中國醫科大學附屬醫院的倫理委員會同意。
研究樣本：孩童於2000年和2004年之間被新 診斷為SLE(ICD-9-CM代碼710.0)形成SLE陣列。以SLE診斷日期為基準，將4位患有SLE(患者組)與4個無罹患SLE(對照組)的孩童基於性別、年齡(±1歲)、城市化程度、父母職業以及基準年隨機挑選；患者為索引日期前確診近視(ICD-9-CM代碼367.1)已被排除。患有SLE與無罹患SLE的孩童持續追蹤直到出現近視或在2008年12月31日之前遭遇無法追蹤。相同的T1DM陣列分析(ICD-9-CM代碼250.X1和250.X3)以及KD陣列分析(ICD-9-CM代碼446.1)亦作為近視之研究。
統計分析：藉由χ2檢驗比較患者組和對照組之人口因素，其包括性別、年齡、城市化程度以及父母的職業，並可藉由Cox比例風險回歸分析SLE與無SLE、第1型糖尿病與無第1型糖尿病以及和川崎病與無川崎病之近視的發生率(incidence rate)和風險比值(hazard ratio)。
製備例12 配製白藜蘆醇溶液
取0.1141公克(g)白藜蘆醇(購自於Sigma Aldrich公司)粉末溶於6ml酒精中，以獲得白藜蘆醇溶液；1.46g β-環糊精(β-cyclodextrin，購自Sigma Aldrich公司)溶於2ml無菌二次水中，以獲得β環糊精溶液(作為助溶劑)；以莫耳數為1：2之比例將白藜蘆醇溶液緩緩滴入β環糊精溶液中，攪拌均勻以形成一混合液。將混合液冷凍抽乾，再加入5ml的人工淚液(購自Alcon公司，視舒坦)回溶，使其濃度為100mM。細胞或動物實驗所需要不同濃度的白藜蘆醇，分別使用不含胎牛血清之培養液或人工淚液稀釋使用。
製備例13 配製雙醋瑞因(diacerein)溶液
雙醋瑞因先以適當比例之環糊精進行包覆後，卻無法溶於乙醇(即會產生沉澱現象)。因此，以下嘗試以人工淚液、聚山梨醇酯80(tween 80)與蓖麻油(castor oil)作為賦形劑包覆雙醋瑞因。
於15ml試管中加入約8ml之人工淚液(購自Alcon公司，視舒坦)，再加入100μl之tween 80與30mg之蓖麻油，以震盪器震盪均勻後分次逐步加入總量為40mg之雙醋瑞因(購自於Sigma-Aldrich公司)，每次加入皆震盪溶解後再加入，待全部加完，補人工淚液至10ml後以超音波震盪助溶30分鐘而成終濃度10毫體積莫耳濃度(mM)之雙醋瑞因藥水。
製備例14 配製雙氯氛酸(diclofenac)溶液
實施例中使用高、低兩種濃度，分別為6mg/ml與3mg/ml。量取5ml之人工淚液，再秤取30mg之雙氯芬酸鈉加入，以震盪器充分震盪溶解後，以獲得濃度為6mg/ml(0.6 w/v%)之雙氯氛酸溶液。量取5ml之人工淚液，再秤取15mg之雙氯芬酸鈉加入，以震盪器充分震盪溶解後，以獲得濃度為3mg/ml(0.3 w/v%)之雙氯氛酸溶液。
實施例1 阿托品(atropine)抑制近視
藉由製備例1所述之單眼視野剝奪(MFD)動物模型及製備例4所述之生理測量以研究發炎與近視之間的關係。在未進行單眼視野剝奪試驗前，左右眼之間的屈光度是沒有差異的。
表1 施予阿托品前後之屈光度
如表1及圖1A所示，進行單眼視野剝奪試驗21天後，MFD右眼施予PBS(控制組)之RE值為4.65±0.37 D，而無MFD左眼之RE值為7.68±0.34 D(P<0.0001)；MFD右眼施予不同濃度阿托品(0.125%、0.5%及1%)之RE值分別為6.45±0.1 D、6.72±0.11 D與7.06±0.29 D；無MFD左眼施予不同濃度阿托品(0.125%、0.5%及1%)之RE值分別為8.32±0.16 D、8.58±0.12 D與10.79±0.16 D，以上數據顯示施予阿托品可抑制近視發展。
實施例2 近視中參與組織重塑之基因
如表2所示，藉由使用qPCR已發現鞏膜中TGF-β和MMP2會在近視誘導的動物模型中表現，其中TGF-β和MMP2在MFD右眼之表現程度分別高於1.49和1.59倍(P<0.05)。而CHRM2、CHRM4及CHRM5表現是相似的；在CHRM1與CHRM3之表現程度在MFD右眼與無MFD左眼分別為1.54及1.68倍以上(P<0.05)。
如圖1B所示，當施予阿托品治療後，與PBS處理的控制組相比，CHRM 1基因和CHRM 3基因表現程度在MFD右眼的鞏膜比無MFD左眼來得高。如圖1C及圖1D所示，和施予PBS(控制組)相比較，施予1%阿托品可降低MMP2表現並增加COL1表現。此外，如圖1D所示，雖在MFD眼中TGF-β在視網膜及鞏膜表現增加，但可被阿托品抑制。以上結果顯示，雖在MFD右眼中，藉由組織重塑而促使近視發展中某些基因表現，但可藉由施予阿托品校正。
實施例3 與發炎相關之基因在近視中被正調控(upregulated)
藉由製備例3所述之微陣列分析及製備例5所述之方法檢測鞏膜中PBS處理之MFD右眼以及無MFD眼之基因表現差異(超過200個基因)。由表2可見，c-fos及NF-κB兩個主要調節發炎反應之轉錄因子皆在MFD右眼過度表現，且其他發炎激素和受體亦藉由PCR陣列以檢測在MFD右眼與無MFD左眼之鞏膜基因之表現。轉錄因子c-Fos及NF-κB在MFD右眼之表現分別為無MFD左眼的1.25倍、1.52倍(P<0.05)。其他發炎激素包括白細胞介素(interleukin-6，IL-6)為2.05倍、TNF-α為1.54倍、TGF-β為1.49倍、IL-1β為1.87倍(P<0.05)。然而，與相較之下，抗發炎激素IL-10於MFD右眼表現則低於無MFD左眼0.58倍(P<0.05)。由於阿托品同時影響鞏膜和視網膜，同樣藉由微陣列檢測大鼠R28視網膜細胞以及倉鼠鞏膜纖維母細胞於LPS誘導發炎反應之基因表現差異。CHRM 1、CHRM 3、 c-Fos、IL-6、IL-1β，TGF-β，TNF-α及NF-κB之表現皆因LPS處理而正調控，但在兩種細胞類型中皆因阿托品存在而導致效果被抑制(P<0.05)。相比之下，IL-10之表現則因LPS被抑制以及因阿托品被提高(P<0.05)。以上結果顯示發炎反應與近視發展相關。
實施例4 藉由抑制發炎以抑制近視加深
為了確定是否能夠抑制發炎進以抑制近視發展，將免疫抑制劑環孢菌素A(immunosuppressive agent cyclosporine A，CSA)施加於倉鼠眼睛，並於第21天檢測RE值。
如表3及圖2A所示，MFD右眼和無MFD左眼睛經施予PBS(控制組)之RE值分別為7.92±0.54 D和10.15±0.25 D(P<0.0001)。MFD右眼和無MFD左眼施予3% CSA之RE值分別為9.25±0.63 D和9.90±0.53 D，顯示近視發展被抑制。且由圖2B可得知，MMP2和TGF-β之表現隨之降低。
為了測試增加發炎是否會增加近視發展，本實施例藉由誘導劑LPS及肽聚醣(peptidoglycan，PGN，500 ng/ml)(分別源自格蘭氏陰性及革蘭氏陽性細菌細胞壁)施予MFD小鼠每2天1次共21天。
結果如表4及圖3A所示，其中MFD眼(右眼)和無MFD左眼經施予PBS(控制組)之RE值分別為7.67±0.74 D和9.25±0.48 D(P<0.0001)；然而，MFD右眼和無MFD左眼施予LPS後之RE值分別降低至6.44±0.18 D和7.79±0.88 D；MFD右眼和無MFD左眼施予PGN後之RE值分別降低至6.47±0.39 D和6.78±0.63 D。由圖3B可見，MMP2和TGF-β之正調控伴隨RE值降低。
在圖3A中，藉由LPS及PGN誘導無MFD左眼產生近視，但施予PBS並無此現象產生(P<0.01)，這顯示發炎和近視發展之間有直接的關聯性。為了進一步證實此推測，將LPS和PGN施予倉鼠的無MFD眼睛21天。
如表5及圖3C所示，右眼、左眼施予PBS(控制組)之RE值分別為12.5±0.18 D和12.21±0.29 D。右眼、左眼分別施予LPS之RE值下降到8.56±0.42 D和8.33±0.96 D；右眼、左眼分別施予PGN之RE值下降到9.14±1.21 D和8.67±0.63 D，以上顯示施予PBS具有統計學上之顯著差異(P<0.001)，且由圖3D可見TGF-β和MMP2同時具有正調控之表現。
可藉由免疫組織染色評估發炎分子之表現。如圖4A所示，c-fos和NF-κB在MFD右眼之視網膜中的表現明顯高於無MFD左眼，但施予1%阿托品可抑制表現。如圖4B及圖4C所示，藉由LPS或PGN刺激，CSA降低了的c-Fos和NF-κB的表現。如圖4D所示，IL-6和TNF-α免疫反應在MFD右眼之視網膜有升高現象，但可藉由1%阿托品降低IL-6和TNF-α表現；相反地，施予阿托品可提升IL-10之表現。如圖4E所示，施予LPS或PGN可提升IL-10和TNF-α之表現，並可降低IL-10表現；如圖4F所示，施予CSA可分別降低IL-6和TNF-α之表現，但可提升IL-10的免疫反應。綜上所述，這些結果顯示，誘導發炎反應會加速近視之速度，但該加速度可藉由施予抗發炎劑逆轉。
如圖5A所示，與倉鼠模型之實施例相同，MFD試驗係將豚鼠右眼由覆蓋與眼睛距離至少1cm的布，以觀察類似的發炎反應。將1%阿托品施予豚鼠的眼睛，第21天測量RF值以及軸向長度。
表6 豚鼠施予阿托品之屈光度及軸向長度之影響
如表6所示，MFD右眼和無MFD左眼分別施予PBS之RE值分別為-9.22±0.93 D和-0.42±1.38 D；當施予阿托品之後，MFD右眼和無MFD左眼之RE值分別為-6.79±1.00D和-1.50±0.82 D。
MFD右眼和無MFD左眼分別施予PBS之軸向長度分別為1.17±0.01公分和1.08±0.00公分。當施予阿托品之後，MFD右眼和無MFD左眼之軸向長度分別為1.14±0.01公分和1.04±0.82公分；以上RE值和軸向長度顯示阿托品治療MFD右眼在統計學上具有顯著差異(P<0.005)。MMP2、TGF-β和c-Fos在近視眼睛之表現是上升的，而COL1下降。如圖5B及圖5C所示，相較於施予PBS，當施予阿托品之後可降低MMP2、TGF-β及c-Fos在鞏膜或視網膜之表現並增加COL1表現；且如圖5C所示，藉由MFD使IL-10之表現呈現負調控(downregulated)，但此結果可被阿托品抑制。以上結果顯示藉由MFD試驗應於不同種類動物模型可獲得相同結果。
實施例5 阿托品抑制磷脂醯肌醇3-激酶(phosphatidylinositol 3-kinase，PI3K)-Akt-NF-Kb以及細胞外信號調節激酶(extracellular signal-regulated kinase，ERK)-Fos途徑
為了確定阿托品抑制近視發展之分子機制，本實施例使用大鼠鞏膜纖維母細胞和人視網膜色素上皮細胞ARPE-19。如圖6A及圖6B所示，阿托品在大鼠鞏膜纖維母細胞中可抑制MMP2之表現，並增加COL1表現；如圖6C及圖6D所示，藉由LPS使MMP2活性增加，藉由阿托品或雙醋瑞因使MMP2活性降低。結果顯示，雙醋瑞因可作為一個新的抑制近視發展之抑制劑。
為了研究阿托品影響之訊息途徑，人視網膜色素上皮細胞ARPE-19施予LPS或LPS/阿托品歷經4小時處理。如圖6E所示，通過脂多醣活化之ERK及其下游訊息分子的c-FOS可被阿托品抑制，阿托品也可抑制LPS活化之PI3K、AKT及NF-κB。以上結果顯示，阿托品藉由負調控ERK-c-fos以及PI3K-AKT-NF-κB途徑抑制發炎。
實施例6 發炎性疾病與隨後近視風險之關聯性
藉由製備例11所述之方法進行兒童(小於18歲)回顧性陣列研究，以確定發炎性疾病諸如全身性紅斑狼瘡(SLE)、川崎病(KD)以及第1型糖尿病(T1D)與近視發生率之關聯性。
如表7至表9所示，從2000年到2004年，共診斷出1214位SLE、546位KD以及559位T1D兒童病患，並隨機從普通人群以1：4的比例挑選匹配之年齡、性別、城市化程度以及父母職業地位進行評估。
如表10至表12所示，近視的發病率評估至2008年年底；與對照組相比，其中SLE陣列結果顯示，近視的風險是1.40倍(95%CI=1.18-1.66)；KD陣列結果顯示，近視的風險是1.26倍高(95%CI=1.04-1.53)；KD陣列結果顯示，近視的風險是1.59倍(95%CI=1.31-1.94)。如圖7至圖7C所示，在後期追蹤之發生近視累積率，全身性紅斑狼瘡、KD以及T1D分別為3.5%、11.6%及7.9%，以上結果提供了臨床證據說明發炎疾病和發生近視之間的關聯性。
實施例7 白藜蘆醇對於MFD誘導近視倉鼠近視度數之影響
在實驗前使用驗光儀(中國醫藥大學附設醫院眼科配鏡部)測量兩眼之度數。將倉鼠施予人工淚液(控制組)或不同濃度(3mM、30mM、100Mm)之白藜蘆醇(實驗組)，每組五隻並將倉鼠的右眼進行縫合；各組於21天後拆線，並且測量雙眼之度數。
如表13所示，控制組中進行縫合的倉鼠右眼，其度數有明顯的增加，而處理不同濃度之白藜蘆醇後，度數均有明顯的下降，其中又以處理100mM白藜蘆醇抑制近視之效果最為明顯；且如圖8所示，左右眼的近視度數差異十分明顯，而施予不同濃度的白藜蘆醇之後會造成近視度數的減緩，其中又以施予100mM白藜蘆醇抑制近視效果最為明顯。
實施例8 白藜蘆醇對於近視誘導之發炎相關蛋白及調控近視相關蛋白表現的影響
本實施例藉由觀察近視的眼球中，施予100mM白藜蘆醇以觀察對於近視相關的蛋白質：第一型膠原蛋白(collagen I)以及發炎相關蛋白：TGF-β和腫瘤壞死因子-α(tumor necrosis factor-α，TNF-α)之蛋白質表現差異。
如圖9所示，進行縫合的右眼比無縫合的左眼其鞏膜中第一型膠原蛋白表現量較低。而在施予100mM白藜蘆醇，其鞏膜上原本減少的第一型膠原蛋白有回復效果；控制組中，進行縫合的右眼比無縫合的左眼其視網膜中TGF-β表現量較高，施予100mM白藜蘆醇後原本表現量較高TGF-β有減少的效果。TNF-α在視網膜上的表現量與TGF-β有相同的趨勢。
實施例9 白藜蘆醇對於脂多醣體體誘導的單核球趨化激素1蛋白表現的影響
利用人類視網膜色素上皮細胞做為模式細胞，以LPS刺激發炎24小時並產生單核球趨化蛋白-1(monocyte chemotactic protein-1，MCP-1)，再施予白藜蘆醇檢測抑制發炎反應之效果。
如圖10所示，利用1μg/ml LPS誘發發炎反應，使得MCP-1表現量上升，而同時施予50μM白藜蘆 醇和1μg/ml脂多醣體體刺激24小時後，MCP-1表現量會下降，因此白藜蘆醇對於MCP-1有明顯的抑制效果。
實施例10 白藜蘆醇對於LPS刺激的訊息傳遞路徑之影響
將人類視網膜色素上皮細胞施予500ng/ml LPS 30分鐘後，觀察Akt、ERK之影響。
如圖11及圖12所示，使用500ng/ml LPS刺激使得磷酸化Akt、ERK的表現量上升，而在預處理50μM白藜蘆醇後，再施予500ng/ml LPS刺激，其磷酸化Akt、ERK的表現量會下降。
實施例11 施予雙氯氛酸對於近視之影響
本實施例採用四週齡LEWIS品系大鼠，將右眼進行FDM誘導近視後分成三組：不施予藥物之控制組以及製備例14所調配獲得之雙氯芬酸溶液(濃度分別為6mg/ml、3mg/ml)，三個禮拜前後以驗光儀與眼軸儀量測鼠隻之右眼度數與眼軸長，紀錄其前後差距並平均後得表14之結果。
施用雙氯芬酸鈉之兩個組別皆為正值，也就是沒有近視，而不施用任何藥物之控制組數值為-9.20，引發了嚴重近視；而眼球軸長則是越長代表近視越深，由結 果也可觀察到控制組的軸長平均明顯較施用藥物組來得長。綜合來說，施用雙氯芬酸確實有明顯抑制近視進程的效果，另外雙氯芬酸之濃度3mg/ml抑制近視的效果較濃度為6mg/ml來得好。
本發明顯示發炎反應與近視發展之關聯性，其中阿托品雖具有副作用(如畏光和睫狀肌麻痺)，然而阿托品卻可抑制近視發展；此外，本發明所述之抗發炎藥雙醋瑞因或雙氯芬酸與醫藥學上可接受之賦形劑以特定比例結合後可作為替代阿托品用於抑制及/或減緩近視之藥物。

Claims (14)

  1. 一種用於舒緩及減輕近視之醫藥組合物，其包括有效劑量之抗發炎藥以及醫藥學上可接受之賦形劑，其中抗發炎藥包含雙醋瑞因，其中醫藥學上可接受之賦形劑係以人工淚液之總體積為基準，tween 80與蓖麻油之體積比例為0.01至0.02：0.003。
  2. 一種如請求項1所述之醫藥組合物之製備方法，其包括：提供該抗發炎藥，其中抗發炎藥是雙醋瑞因；提供該醫藥學上可接受之賦形劑，其中該醫藥學上可接受之賦形劑是tween 80、蓖麻油及人工淚液；以及以人工淚液之總體積為基準，將tween 80與蓖麻油以體積比例為0.01至0.02：0.003混合並溶於人工淚液後以形成混合液，再於震盪條件下將雙醋瑞因分次逐步加入混合液中，以獲得該醫藥組合物。
  3. 一種如請求項1所述之醫藥組合物用於製備舒緩及減輕近視之醫藥品之用途，其係將有效劑量之醫藥品施予受體局部部位，以使受體局部部位達到減緩近視之效果。
  4. 如請求項3所述之用途，其中受體係動物。
  5. 如請求項3所述之用途，其中施予方式係口服施予、局部注射施予或外用施予。
  6. 如請求項3所述之用途，其中局部部位係眼球。
  7. 如請求項5所述之用途，其中將醫藥品以外用施予受體之有效劑量係濃度介於0.5%至1%。
  8. 如請求項5所述之用途，其中將醫藥品以口服施予受體之有效劑量係介於每天10毫克(mg/day)至50mg/day。
  9. 如請求項5所述之用途，其中醫藥品施予型式係藥膏、滴劑或凝膠。
  10. 一種雙氯芬酸(diclofenac)用於製備舒緩及減輕近視之醫藥品之用途，其係將有效劑量之醫藥品施予受體眼球，以使受體達到減緩近視之效果，其中受體係動物。
  11. 如請求項10所述之用途，其中施予方式係口服施予、局部注射施予或外用施予。
  12. 如請求項11所述之用途，其中將醫藥品以外用施予受體之有效劑量係濃度介於0.5%至1%。
  13. 如請求項11所述之用途，其中將醫藥品以口服施予受體之有效劑量係介於每天10毫克(mg/day)至50mg/day。
  14. 如請求項11所述之用途，其中醫藥品施予型式係藥膏、滴劑或凝膠。
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