TWI646981B - Stabilizer and stabilization method for high density lipoprotein in serum or plasma - Google Patents
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Abstract
提供一種血清或血漿中高密度脂蛋白(HDL)之安定劑,其係用以正確測量血清或血漿中高密度脂蛋白HDL中之成分;一種血清或血漿中HDL之安定化方法;一種血清或血漿中HDL之保存方法;及一種HDL中之成分定量用之標準品。
一種血清或血漿中HDL之安定劑,其將聚氧乙烯多環苯基醚衍生物或萘磺酸衍生物作為有效成分;一種血清或血漿中HDL之安定化方法及保存方法,其特徵為於血清或血漿中添加聚氧乙烯多環苯基醚衍生物或萘磺酸衍生物;一種血清或血漿中HDL中之成分定量用標準品,其特徵為含有血清或血漿中之HDL、及聚氧乙烯多環苯基醚衍生物或萘磺酸衍生物,且該HDL中之成分之含量經定值。
Description
本發明係關於血清或血漿中高密度脂蛋白之安定劑、血清或血漿中高密度脂蛋白之安定化方法、血清或血漿中高密度脂蛋白之保存方法、血清或血漿中高密度脂蛋白中之成分定量用之標準品、血清或血漿中高密度脂蛋白中之成分定量用之標準品之製造方法、血清或血漿中高密度脂蛋白中之成分之定量方法、及血清或血漿中高密度脂蛋白中之成分之定量用套組。
血清及血漿係於臨床檢査經常使用的檢體之一者。血清及血漿中含有高密度脂蛋白(HDL)、低密度脂蛋白(LDL)、超低密度脂蛋白(VLDL)等之脂蛋白,各脂蛋白中含有膽固醇、中性脂肪、磷脂質等之成分。此等之脂蛋白基於電荷的差異,可藉由瓊脂糖凝膠電泳而分離,又基於粒徑的差異,可藉由聚丙烯醯胺凝膠電泳而分離。已知血清及血漿中之脂蛋白於保存中變性。經變性的脂蛋白因與原本脂蛋白相比,電荷、粒徑會變化,藉由瓊脂糖凝膠電泳、聚丙烯醯胺凝膠電泳,可檢測出脂蛋白之變性。
迄今,就用以抑制脂蛋白變性的脂蛋白之安定化方法而言,已知有使用2-甲基-4-異噻唑啉-3-酮的方
法(參照專利文獻1)、使用硫酸胍的方法(參照專利文獻2)、使用具有磺基的緩衝劑的方法(參照專利文獻3)等。
就測量血清及血漿中特定脂蛋白中的成分的方法而言,已有報告不分離該特定脂蛋白的測量方法,所謂均質法(homogeneous method)。尤其,於HDL中之膽固醇(以下,記載為HDL-C)或LDL中之膽固醇(以下,記載為LDL-C)之測量,已有報告使用界面活性劑的均質法,例如,已有報告使用非離子性界面活性劑、多價陰離子(polyanion)、及白蛋白的HDL-C之測量方法(專利文獻4);使用四級銨鹽、及多價陰離子的HDL-C之測量方法(專利文獻5);使用聚氧乙烯(polyoxyethylene)多環系界面活性劑的LDL-C之測量方法(參照專利文獻6~8);或使用芳基磺酸衍生物的LDL-C之測量方法(參照專利文獻8)。
[專利文獻1]日本特開平10-087693號公報
[專利文獻2]日本特開平9-216835號公報
[專利文獻3]WO2006/054519小冊
[專利文獻4]WO2004/035816小冊
[專利文獻5]WO2006/118199小冊
[專利文獻6]WO2004/048605小冊
[專利文獻7]日本特開2009-282044號公報
[專利文獻8]WO2011/136316小冊
血清或血漿中之脂蛋白於保存中、或經由冷凍乾燥而容易變性。此脂蛋白之變性會影響脂蛋白中之成分的測量、干擾脂蛋白中之成分之正確測量,經常成為問題。
本發明之目的在於提供一種血清或血漿中HDL之安定劑,其係用以正確測量血清或血漿中HDL中的成分;血清或血漿中HDL之安定化方法;血清或血漿中HDL之保存方法;HDL中之成分定量用之標準品及其製造方法;血清或血漿中HDL中之成分之定量方法;及血清或血漿中HDL中之成分之定量用套組。
本發明者們為了解決本課題而不斷專研的結果,發現所謂藉由於血清或血漿中添加聚氧乙烯多環苯基醚衍生物或萘磺酸(naphthalenesulfonic acid)衍生物,而血清或血漿中HDL被安定化,可正確定量HDL-C等之HDL中的成分的見識而完成本發明。即,本發明係關於以下之[1]~[18]。
[1]一種血清或血漿中HDL之安定劑,其含有聚氧乙烯多環苯基醚衍生物或萘磺酸衍生物作為有效成分。
[2]一種血清或血漿中HDL之安定化方法,其特徵為於血清或血漿中添加聚氧乙烯多環苯基醚衍生物或萘磺酸衍生物。
[3]一種血清或血漿中HDL之安定化方法,其特徵為
含有以下之步驟:(1)於血清或血漿中添加聚氧乙烯多環苯基醚衍生物或萘磺酸衍生物的步驟;(2)將步驟(1)所獲得的混合物冷凍乾燥的步驟;及(3)將步驟(2)所獲得的冷凍乾燥物以水性媒質溶解的步驟。
[4]一種血清或血漿中HDL之保存方法,其特徵為於血清或血漿中添加聚氧乙烯多環苯基醚衍生物或萘磺酸衍生物。
[5]一種血清或血漿中HDL之保存方法,其特徵為包含以下之步驟:(1)於血清或血漿中添加聚氧乙烯多環苯基醚衍生物或萘磺酸衍生物的步驟;及(2)將步驟(1)所獲得的混合物保存的步驟。
[6]一種血清或血漿中HDL之保存方法,其特徵為包含以下之步驟:(1)於血清或血漿中添加聚氧乙烯多環苯基醚衍生物或萘磺酸衍生物的步驟;(2)將步驟(1)所獲得的混合物冷凍乾燥的步驟;(3)將步驟(2)所獲得的冷凍乾燥物以水性媒質溶解的步驟;及(4)將步驟(3)所獲得的水溶液保存的步驟。
[7]一種血清或血漿中HDL中的成分定量用標準品,其特徵為含有血清或血漿中之HDL、及聚氧乙烯多環苯基醚衍生物或萘磺酸衍生物,且該HDL中的成
分之含量經定值。
[8]如[7]記載之標準品,其係藉由包含以下之步驟的方法所製造:(1)於血清或血漿中添加聚氧乙烯多環苯基醚衍生物或萘磺酸衍生物的步驟;及(2)將步驟(1)所獲得的混合物中所含的HDL中之成分之濃度,使用已知量之該成分而定值的步驟。
[9]一種血清或血漿中HDL中之成分定量用標準品,其特徵為含有經冷凍乾燥的血清或血漿中之HDL、及聚氧乙烯多環苯基醚衍生物或萘磺酸衍生物,且該HDL中之成分之含量經定值。
[10]如[9]記載之標準品,其係藉由包含以下之步驟的方法所製造:(1)於血清或血漿中添加聚氧乙烯多環苯基醚衍生物或萘磺酸衍生物的步驟;(2)將步驟(1)所獲得的混合物冷凍乾燥的步驟;及(3)將步驟(2)所獲得的冷凍乾燥物中所含的HDL中之成分之含量,使用已知量之該成分而定值的步驟。
[11]如[7]至[10]中任一項記載之標準品,其中HDL中之成分係膽固醇。
[12]一種血清或血漿中HDL中之成分定量用的標準品之製造方法,其特徵為包含以下之步驟:(1)於血清或血漿中添加聚氧乙烯多環苯基醚衍生物或萘磺酸衍生物的步驟;及(2)將步驟(1)所獲得的混合物中所含的HDL中之成
分之濃度,使用已知量之該成分而定值的步驟。
[13]一種血清或血漿中HDL中之成分定量用的標準品之製造方法,其特徵為包含以下之步驟:(1)於血清或血漿中添加聚氧乙烯多環苯基醚衍生物或萘磺酸衍生物的步驟;(2)將步驟(1)所獲得的混合物冷凍乾燥的步驟;及(3)將步驟(2)所獲得的冷凍乾燥物中所含的HDL中之成分之含量,使用已知量之該成分而定值的步驟。
[14]如[12]或[13]記載之製造方法,其中HDL中之成分係膽固醇。
[15]一種血清或血漿中HDL中之成分之定量方法,其特徵為包含以下之步驟:(1)使用血清或血漿中HDL中之成分之測量試藥,而測量該成分的步驟;(2)使用如[7]至[10]中任一項記載之標準品、及步驟(1)之測量試藥,製作表示該成分之濃度與對於該成分的測量值之間之關係的校正曲線的步驟;及(3)自步驟(1)所獲得的測量值、及步驟(2)所製作的校正曲線,決定血清或血漿中之該成分之濃度的步驟。
[16]如[15]記載之定量方法,其中HDL中之成分係膽固醇。
[17]一種血清或血漿中HDL中之成分之定量用套組,其特徵為含有血清或血漿中HDL中之成分之測量試藥、及如[7]至[10]中任一項記載之標準品。
[18]如[17]記載之套組,其中HDL中之成分係膽固醇。
藉由本發明,可提供一種血清或血漿中HDL之安定劑,其係用以正確測量血清或血漿中之HDL-C等的HDL中之成分;一種血清或血漿中HDL之安定化方法;一種血清或血漿中HDL之保存方法;一種HDL中之成分定量用的標準品及其製造方法;一種血清或血漿中HDL中之成分之定量方法;及一種血清或血漿中HDL中之成分之定量用套組。
(血清及血漿)
本發明中的血清及血漿只要為由自人類或動物採取而獲得的全血所調製的血清及血漿,則可為任一者,由自人類採取而獲得的全血所調製的血清及血漿為較佳。血清可藉由下列方法而調製:將使用不含抗凝固劑的採血管而將採取的全血離心分離的方法;使其自然沉降的方法等。血漿可藉由下列方法而調製:將藉由置入抗凝固劑的採血管所採取的全血離心分離的方法;使其自然沉降的方法等。就抗凝固劑而言,可列舉例如乙二胺四乙酸(EDTA)2鉀鹽、肝素、氟化鈉、檸檬酸鈉等。就動物而言,例如可列舉例如猴、大猩猩、紅毛猩猩、黑猩猩、狒狒等之靈長類等。
(高密度脂蛋白:HDL)
本發明中的HDL係比重為1.063~1.21的脂蛋白。
(HDL中之成分)
就本發明中的HDL中之成分而言,例如可列舉膽固醇、中性脂肪等,較佳為膽固醇。
(安定劑)
本發明之安定劑係將血清或血漿中之HDL安定化者。本發明之安定劑含有聚氧乙烯多環苯基醚衍生物(以下,記載為POE多環苯基醚衍生物)或萘磺酸衍生物作為有效成分。就本發明中的POE多環苯基醚衍生物而言,例如可列舉聚氧乙烯多環苯基醚(以下,記載為POE多環苯基醚)、聚氧乙烯多環苯基醚硫酸酯(以下,記載為POE多環苯基醚硫酸酯)、聚氧乙烯‧聚氧丙烯多環苯基醚(以下,記載為POE‧POP多環苯基醚)等。
就POE多環苯基醚之具體例(市售品)而言,例如可列舉Newcol 703、Newcol 704、Newcol 706、Newcol 707、Newcol 708、Newcol 709、Newcol 710、Newcol 711、Newcol 712、Newcol 714、Newcol 714(80)、Newcol 719、Newcol 723、Newcol 723(60)、Newcol 729、Newcol 733、Newcol 740、Newcol 740(60)、Newcol 747、Newcol 780(60)、Newcol 610、Newcol 610(80)、Newcol 2604、Newcol 2607、Newcol 2609、Newcol 2614(以上,日本乳化劑公司製)、Noigen EA-87、Noigen EA-137、Noigen EA-157、Noigen EA-167、Noigen EA-177、Noigen EA-197D、Noigen EA-207D(以上,第一工業製藥公司製)等。
就POE多環苯基醚硫酸酯之具體例(市售品)而言,例如可列舉Newcol 707-SF、Newcol 707-SFC、Newcol 707-SN、Newcol 714-SF、Newcol 714-SN、Newcol 723-SF、Newcol 740-SF、Newcol 780-SF、Newcol 2607-SF、Newcol 2614-SF(以上,日本乳化劑公司製)、HITENOL NF-08、HITENOL NF-0825、HITENOL NF-13、HITENOL NF-17(以上,第一工業製藥公司製)等。
就POE‧POP多環苯基醚之具體例(市售品)而言,例如可列舉Newcol 707-F、Newcol 710-F、Newcol 714-F、Newcol 2608-F、Newcol 2600-FB、Newcol 2616-F、Newcol 3612-FA(以上,日本乳化劑公司製)等。
就萘磺酸衍生物而言,例如可列舉萘磺酸甲醛縮合物等。就萘磺酸甲醛縮合物之具體例(市售品)而言,例如可列舉Disrol SH、S-kol(30)(以上,日本乳化劑公司製)、DEMOL N、DEMOL NL、DEMOL RN、DEMOL RN-L、DEMOL T、DEMOL T-45、DEMOL MS、DEMOL SN-B(以上,花王公司製)等。
就本發明之安定劑所含的POE多環苯基醚衍生物或萘磺酸衍生物之含量而言,只要為可將血清或血漿中之HDL安定化的含量即可,並未特別限制,通常於血清或血漿100mL中添加本發明之安定劑時,係成為0.01~5g的含量,成為0.05~1g的含量為較佳。
(冷凍乾燥)
於本發明,冷凍乾燥係以於該領域使用的通常意義而使用,意指將試料冷凍,直接於冷凍狀態下減壓,自
試料去除水分進行乾燥。冷凍乾燥之條件並未特別限制,但通常於-80~35℃,較佳為-80~30℃之溫度,以0.667~1333Pa,較佳為13.3~133.3Pa之壓力,進行6~120小時,更佳為12~120小時。冷凍乾燥品之水分含量通常為10重量%以下,較佳為1重量%以下。
(HDL之安定化方法)
本發明之HDL之安定化方法包含於血清或血漿中添加POE多環苯基醚衍生物或萘磺酸衍生物的步驟。添加於血清或血漿的POE多環苯基醚衍生物或萘磺酸衍生物之量,只要為於血清或血漿中使HDL安定化的量即可,並未特別限制,通常每100mL血清或血漿為0.01~5g,0.05~1g為較佳。
於血清或血漿中添加POE多環苯基醚衍生物之際,POE多環苯基醚衍生物係可添加POE多環苯基醚衍生物本身,但亦可作為POE多環苯基醚衍生物水溶液添加。又,於血清或血漿中添加萘磺酸衍生物之際,萘磺酸衍生物係可添加萘磺酸衍生物本身,但亦可作為萘磺酸衍生物水溶液添加。於此等水溶液之調製,可使用去離子水、蒸餾水、緩衝液等之水性媒質。就用以調製緩衝液之緩衝劑而言,例如可列舉後述之緩衝劑等。此等之水溶液之pH只要為將該水溶液添加於血清或血漿後,血清或血漿中之脂蛋白不會沉澱的pH即可,並未特別限制,pH6~9為較佳。
又,本發明之HDL之安定化方法的另一態樣包含以下步驟。
(1)於血清或血漿中添加POE多環苯基醚衍生物或萘磺酸衍生物的步驟;(2)將步驟(1)所獲得的混合物冷凍乾燥的步驟;及(3)將步驟(2)所獲得的冷凍乾燥物以水性媒質溶解的步驟。
就步驟(3)中的水性媒質而言,只要為溶解血清或血漿中之HDL,於HDL之水溶液中可安定地保持HDL者即可,並未特別限制,例如,可列舉前述之水性媒質等。
(HDL之保存方法)
本發明之HDL之保存方法包含於血清或血漿中添加POE多環苯基醚衍生物或萘磺酸衍生物的步驟。又,本發明之HDL之保存方法之另一態樣包含以下之步驟。
(1)於血清或血漿中添加POE多環苯基醚衍生物或萘磺酸衍生物的步驟;及(2)將步驟(1)所獲得的混合物保存的步驟。
再者,本發明之HDL之保存方法的另一態樣包含以下之步驟。
(1)於血清或血漿中添加POE多環苯基醚衍生物或萘磺酸衍生物的步驟;(2)將步驟(1)所獲得的混合物冷凍乾燥的步驟;(3)將步驟(2)所獲得的冷凍乾燥物以水性媒質溶解的步驟;及(4)將步驟(3)所獲得的水溶液保存的步驟。
就本發明之HDL之保存方法中的保存條件而
言,只要為安定地保存HDL的條件即可,並未特別限制。HDL之保存方法中的保存溫度只要為安定地保存HDL的溫度即可,並未特別限制,通常為-80~45℃,-5~30℃為較佳,2~10℃為特佳。HDL之保存方法中的保存期間只要為安定地保存HDL的期間即可,並未特別限制,通常為1日~2年。
(標準品)
本發明之血清或血漿中HDL中的成分定量用標準品,可為溶液狀態亦可為冷凍乾燥狀態。標準品為溶液狀態的情形,本發明之標準品含有血清或血漿中之HDL、及POE多環苯基醚衍生物或萘磺酸衍生物,且該HDL中之成分之含量經定值。又,標準品為冷凍乾燥狀態的情形,本發明之標準品含有經冷凍乾燥的血清或血漿中之HDL、及POE多環苯基醚衍生物或萘磺酸衍生物,且該HDL中之成分之含量經定值。又,本發明之標準品不僅可作為血清或血漿中HDL中之成分定量用的標準品,亦可使用作為血清或血漿中HDL中之成分定量中的精密度管理物質。
(標準品之製造方法)
本發明之標準品為溶液狀態的情形,本發明之標準品之製造方法包含以下之步驟。
(1)於血清或血漿中添加POE多環苯基醚衍生物或萘磺酸衍生物的步驟;及(2)將步驟(1)所獲得的混合物中所含的HDL中之成分的濃度,使用已知量之該成分而定值的步驟。
又,本發明之標準品為冷凍乾燥狀態的情形,本發明之標準品之製造方法包含以下之步驟。
(1)於血清或血漿中添加POE多環苯基醚衍生物或萘磺酸衍生物的步驟;(2)將步驟(1)所獲得的混合物冷凍乾燥的步驟;及(3)將步驟(2)所獲得的冷凍乾燥物中所含的HDL中之成分的含量,使用已知量之該成分而定值的步驟。
於本發明之標準品之製造方法,添加於血清或血漿的POE多環苯基醚衍生物或萘磺酸衍生物之量,只要為於血清或血漿中安定化HDL的量即可,並未特別限制,通常每100mL血清或血漿為0.01~5g,0.05~1g為較佳。
將本發明之標準品之製造方法之一態樣記載於下。
將血清或血漿冷卻至2~8℃,於經冷卻的血清或血漿中添加POE多環苯基醚衍生物或萘磺酸衍生物水溶液。將此含有血清或血漿的水溶液之pH以約1mol/L之氫氧化鈉或約1mol/L之鹽酸溶液調整為pH6~9後,將此經pH調整的水溶液使用0.2~0.4微米左右之過濾膜過濾而作為標準品。
又,將本發明之標準品之製造方法的另一態樣記載於下。
將血清或血漿冷卻至2~8℃,於經冷卻的血清或血漿中添加POE多環苯基醚衍生物或萘磺酸衍生物水溶液。將此含有血清或血漿的水溶液之pH以約1mol/L之氫氧
化鈉或約1m0l/L之鹽酸溶液調整為pH6~9後,將此經pH調整的水溶液使用0.2~0.4微米左右的過濾膜過濾。將獲得的溶液分注於冷凍乾燥用之小瓶,半封蓋。將分注於小瓶的溶液,於-30℃以下之低溫使其冷凍後,於133.3Pa之真空條件下使其冷凍乾燥,一邊緩緩加溫一邊最終地以0~20℃進行乾燥,而製造冷凍乾燥狀態之標準品。
又,冷凍乾燥狀態之標準品,於校正曲線製作等,係溶解於已知量之水性媒質而使用。就用以溶解冷凍乾燥狀態之標準品的水性媒質而言,只要為使本發明之HDL中之成分之定量方法成為可能的水性媒質即可,並未特別限制,例如可列舉去離子水、蒸餾水、緩衝液等。就用以調製緩衝液的緩衝劑而言,例如可列舉後述之緩衝劑等。
(標準品之定值)
於本發明,標準品之定值係指將被製造的標準品中所含之應測量的HDL中之成分的含量,使用含有已知量之該成分的標準血清而決定。其中,含有已知量之該成分的標準血清係指例如藉由美國衛生及公共服務部疾病控制與預防中心(CDC)之基準分析法等之非利用均質法的方法,而該成分之含量被決定的血清。使用此標準血清及被製造的標準品作為檢體,藉由使用實際的自動分析裝置的均質法進行測量,比較含有已知量之該成分的標準血清之測量值(例如,吸光度)與被製造的標準品之測量值(例如,吸光度),而決定被製造的標準品中之該成分之含量。被製造的標準品係於檢査施設作為標準血
清而被用於檢體之測量值之決定。
(標準品中的POE多環苯基醚衍生物或萘磺酸衍生物之含量)
本發明之標準品所含的POE多環苯基醚衍生物及萘磺酸衍生物之含量,只要為可安定地保持標準品中之HDL、可正確地測量標準品中之HDL中之成分的含量即可,並未特別限制,通常相對於血清或血漿100mL,為0.01~5g,0.05~1g為較佳。
(添加物)
於本發明之標準品,因應必要,可含有緩衝劑、金屬離子、鹽類、界面活性劑、防腐劑、糖化合物等之添加物。就緩衝劑而言,例如可列舉乳酸緩衝劑、檸檬酸緩衝劑、乙酸緩衝劑、琥珀酸緩衝劑、酞酸緩衝劑、磷酸緩衝劑、三乙醇胺緩衝劑、二乙醇胺緩衝劑、離胺酸緩衝劑、巴比妥緩衝劑(barbiturate buffer)、咪唑緩衝劑、蘋果酸緩衝劑、草酸緩衝劑、甘胺酸緩衝劑、硼酸緩衝劑、碳酸緩衝劑、甘胺酸緩衝劑、古德緩衝劑(Good's buffer)等。就古德緩衝劑而言,例如可列舉2-啉基乙烷磺酸(MES)、雙(2-羥乙基)亞胺基參(羥甲基)甲烷(Bis-Tris)、N-(2-乙醯胺)亞胺基二乙酸(ADA)、哌-N,N’-雙(2-乙烷磺酸)(PIPES)、N-(2-乙醯胺)-2-胺基乙烷磺酸(ACES)、3-啉基-2-羥基丙烷磺酸(MOPSO)、N,N-雙(2-羥乙基)-2-胺基乙烷磺酸(BES)、3-啉基丙烷磺酸(MOPS)、N-[參(羥甲基)甲基]-2-胺基乙烷磺酸(TES)、2-[4-(2-羥乙基)-1-哌基]乙烷磺酸(HEPES)、3-[N,N-
雙(2-羥乙基)胺基]-2-羥基丙烷磺酸(DIPSO)、N-[參(羥甲基)甲基]-2-羥基-3-胺基丙烷磺酸(TAPSO)、哌-N,N’-雙(2-羥基丙烷磺酸)(POPSO)、3-[4-(2-羥乙基)-1-哌基]-2-羥基丙烷磺酸(HEPPSO)、3-[4-(2-羥乙基)-1-哌基]丙烷磺酸[(H)EPPS]、N-[參(羥甲基)甲基]甘胺酸(Tricine)、N,N-雙(2-羥乙基)甘胺酸(Bicine)、N-參(羥甲基)甲基-3-胺基丙烷磺酸(TAPS)、N-環己基-2-胺基乙烷磺酸(CHES)、N-環己基-3-胺基-2-羥基丙烷磺酸(CAPSO)、N-環己基-3-胺基丙烷磺酸(CAPS)等。
就金屬離子而言,例如可列舉鎂離子、鈣離子、錳離子、鋅離子等。就鹽類而言,例如可列舉氯化鈉、氯化鉀等。就界面活性劑而言,例如可列舉非離子性界面活性劑、陽離子性界面活性劑、陰離子性界面活性劑、兩性界面活性劑等。就防腐劑而言,例如可列舉疊氮化鈉、鏈黴素(streptomycin)、建它黴素(gentamicin)等之抗生素、Bio ACE、Proclin 300(商標)、Proxel GXL(商標)等。
就上述糖化合物而言,例如可列舉單糖類、雙糖類等,但雙糖類為較佳。就單糖類而言,例如可列舉葡萄糖、果糖、岩藻醣(fucose)等。就雙糖類而言,例如可列舉蔗糖、海藻糖(trehalose)、麥芽糖等。單糖類、雙糖類等亦可併用2種以上。又,將糖化合物與血清或血漿混合之際之糖化合物的添加量,相對於血清或血漿100mL,通常為0.5~20g,1~15g為較佳,1.25~12.5g為更佳。
(HDL中之成分之定量方法)
本發明之血清或血漿中HDL中之成分的定量方法包含以下之步驟。
(1)使用血清或血漿中HDL中之成分之測量試藥,而測量該成分的步驟;(2)使用本發明之標準品及步驟(1)之測量試藥,製作表示該成分之濃度與對該成分的測量值之間之關係之校正曲線的步驟;及(3)自步驟(1)所獲得的測量值、及步驟(2)所製作的校正曲線,決定血清或血漿中之該成分之濃度的步驟。
於上述步驟(1)之應測量的HDL中之成分的測量,可使用周知的HDL中之成分之測量方法。就HDL中之成分之測量方法而言,例如可列舉HDL-C測量方法、HDL中之中性脂肪(以下,記載為HDL-TG)之測量方法等。又,就HDL中之成分之測量方法而言,不將HDL藉由離心分離等之手段作劃分,而於除了HDL以外,LDL或VLDL等之複數種脂蛋白亦共存於同一反應液的狀態下測量HDL中之成分的方法,即所謂利用均質法的測量方法為較佳。
就利用均質法的HDL-C測量方法而言,例如可列舉WO2004/035816小冊所記載的方法:將檢體與膽固醇測量用酵素,於含有非離子性界面活性劑、多價陰離子及白蛋白的水性媒質中使其反應,藉由測量生成的過氧化氫或還原型輔酶,而測量檢體中之HDL-C的方法;WO2006/118199小冊所記載的方法:將檢體與膽固醇
測量用酵素,於含有特定構造之四級銨鹽、及多價陰離子的水性媒質中使其反應,藉由測量生成的過氧化氫或還原型輔酶,而測量檢體中之HDL-C的方法等。其中,膽固醇測量用酵素係指(i)膽固醇酯水解酵素、及膽固醇氧化酵素之組合、或(ii)膽固醇酯水解酵素、氧化型輔酶、及膽固醇脫氫酵素之組合。
(HDL中之成分之定量用套組)
本發明之血清或血漿中HDL中之成分之定量用套組,係含有本發明之標準品與HDL中之成分之測量試藥。藉由使用本發明之套組,可簡便地進行HDL中之成分之定量。就HDL中之成分之測量試藥而言,可使用周知的HDL中之成分之測量試藥。就HDL中之成分之測量試藥而言,例如可列舉HDL-C測量試藥、HDL-TG測量試藥等。又,就HDL中之成分之測量試藥而言,不將HDL藉由離心分離等之手段作劃分,而於除了HDL以外,LDL或VLDL等之複數種脂蛋白亦共存於同一反應液的狀態下測量HDL中之成分的試藥,即所謂利用均質法的測量方法所使用的試藥為較佳。
就利用均質法的HDL-C測量方法所使用的HDL-C測量試藥而言,例如可列舉WO2004/035816小冊記載的含有膽固醇測量用酵素、非離子性界面活性劑、多價陰離子及白蛋白的HDL-C測量試藥、或WO2006/118199小冊記載的含有膽固醇測量用酵素、特定構造之四級銨鹽、及多價陰離子的HDL-C測量試藥等。其中,膽固醇測量用酵素係指(i)膽固醇酯水解酵素、及膽固醇氧化酵
素之組合、或、(ii)膽固醇酯水解酵素、氧化型輔酶、及膽固醇脫氫酵素之組合。又,就均質法所使用的HDL-C測量試藥而言,亦可使用市售之測量試藥。就市售之測量試藥而言,例如可列舉HDL膽固醇測量試藥的Determiner L HDL-C(協和Medex公司製)、MetaboLead HDL-C(協和Medex公司製)、「生研」HDL-EXN(DENKA生研公司製)等。
本發明之標準品或本發明之套組,較佳用於使用自動而連續測量血清或血漿中HDL中之成分的自動分析機的測量方法。
(HDL之安定劑、安定化方法、及保存方法之效果之驗證)
本發明之HDL安定劑、安定化方法、及保存方法之效果可藉由例如下列方法而驗證。混合自複數健康人類採取的血清或血漿而調製混合血清(pooled serum)或混合血漿(pooled plasma)。將調製的混合血清或混合血漿分成2組,於一方之混合血清或混合血漿中添加本發明之HDL之安定劑,而準備有添加本發明之HDL之安定劑的混合血清或混合血漿(A組之血清或血漿)、及未添加本發明之HDL之安定劑的混合血清或混合血漿(B組之血清或血漿)。將A組之血清或血漿以一定量、分注於由相同形狀與材質而成的複數容器中,因應必要,藉由前述方法進行冷凍乾燥。其次,藉由前述方法而進行定值,調製標準品(標準品A)。同樣地,使用B組之血清或血漿,而調製標準品(標準品B)。
添加本發明之安定劑後立即準備標準品A之N管(標準品A1~標準品AN),作為調製後立即之標準品溶液A保存前(A保存前1~A保存前N)。冷凍乾燥狀態之標準品的情形,針對各標準品A(標準品A1~標準品AN)以一定量之純水加以溶解,作為調製後立即之標準品溶液A保存前(A保存前1~A保存前N)。
再者,溶解後立即將標準品溶液A保存前於5℃保存7日,作為標準品溶液A保存後(標準品A保存後1~標準品A保存後N)。
將各自之標準品溶液A保存前(標準品A保存前1~標準品A保存前N)作為檢體,使用HDL-C測量試藥,測量吸光度A保存前(吸光度A保存前1~吸光度A保存前N)。同樣地,使用各自之標準品溶液A保存後(標準品A保存後1~標準品A保存後N)作為檢體,使其與HDL膽固醇測量試藥反應,而測量吸光度A保存後(吸光度A保存後1~吸光度A保存後N)。針對獲得的吸光度A保存前及吸光度A保存後各自算出平均值(平均吸光度A保存前與平均吸光度A保存後),按照以下之式(I),算出殘存率(%)。
殘存率(%)=平均吸光度A保存後/平均吸光度A保存前*100 (I)
算出的殘存率(%)越接近100,意味血清或血漿中HDL越被安定化,而可正確地測量HDL中之成分。即,殘存率(%)越接近100,意味血清或血漿中HDL越被安定化。
以下,藉由實施例以進一步詳細說明本發明
,但此等並未以任何方式限定本發明之範圍。又,於本實施例,使用下述製造商之試藥及機器類。
血清(Discovery Life Sciences公司製)、海藻糖(林原公司製)、Newcol 740(60)(POE多環苯基醚衍生物;日本乳化劑公司製)、Newcol 740-SF(POE多環苯基醚衍生物;日本乳化劑公司製)、DEMOL N(萘磺酸衍生物;花王公司製)、硼矽酸玻璃小瓶[大和特殊硝子公司製(容量:2mL;直徑:16mm;茶褐色)]、冷凍乾燥機(東京理化器械公司製;EYELA DRC-1100型、FDU-2100型)。
藉由以下之方法,檢討因POE多環苯基醚衍生物及萘磺酸衍生物所致的HDL之安定化效果。
(1)冷凍乾燥用血清之調製
調製包含以下之組成的血清1~4及血清0。
<血清1~4及血清0>
血清 1L
海藻糖 40g
HDL之安定劑(參照第1表)
(2)冷凍乾燥血清之製造
將上述調製的血清1各分注0.5mL於玻璃小瓶,將一次冷凍乾燥設定於-34℃ 32小時、二次冷凍乾燥設定於20℃ 4小時,而進行冷凍乾燥,最後直接於真空狀態以橡膠栓加以密封,而製造冷凍乾燥血清1。
使用血清2~4及血清0替代血清1,進行同樣的操作,而調製冷凍乾燥血清2~4及冷凍乾燥血清0。
(3)殘存率之算出
準備上述(2)調製的冷凍乾燥血清1之小瓶3瓶,於各小瓶中添加純水0.5mL而將再構成的血清1保存前(血清1保存前1~血清1保存前3)作為檢體(3檢體)使用,使用「MetaboLead HDL-C」作為HDL-C測量試藥,按照「MetaboLead HDL-C」所附帶之附屬文件所記載的操作順序,針對各檢體進行測量,測量對於各檢體的吸光度1保存前(吸光度1保存前1~吸光度1保存前3),算出吸光度1保存前1~吸光度1保存前3之平均值作為平均吸光度1保存前。除了使用冷凍乾燥血清2~4及冷凍乾燥血清0替代冷凍乾燥血清1以外,藉由同樣之方法進行測量,算出平均吸光度2保存前~平均吸光度4保存前及平均吸光度0保存前。
其次,將使上述血清1保存前(血清1保存前1~血清1保存前3)於5℃保存7日所獲得的血清1保存後(血清1保存後1~血清1保存後3)作為檢體(3檢體)使用,使用「MetaboLead HDL-C」作為HDL-C測量試藥,按照「MetaboLead HDL-C」所附帶之附屬文件所記載的操作順序,針對各檢體進行測量,測量對於各檢體的吸光度1保存後(吸光度1保存後1
~吸光度1保存後3),算出吸光度1保存後1~吸光度1保存後3之平均值作為平均吸光度1保存後。除了使用冷凍乾燥血清2~4及冷凍乾燥血清0替代冷凍乾燥血清1以外,藉由同樣之方法進行測量,算出平均吸光度2保存後~平均吸光度4保存後及平均吸光度0保存後。
針對冷凍乾燥血清1,使用算出的平均吸光度1保存前與平均吸光度1保存後,按照以下之式(II),算出殘存率(%)。
殘存率(%)=平均吸光度1保存後/平均吸光度1保存前*100 (II)
針對冷凍乾燥血清1,依據上述順序進行共3次測量,算出共3次之測量之各測量中的殘存率,並決定所算出的殘存率之平均值(平均殘存率)。
除了各自使用平均吸光度2保存前與平均吸光度2保存後之組合、平均吸光度3保存前與平均吸光度3保存後之組合、平均吸光度4保存前與平均吸光度4保存後之組合、及平均吸光度0保存後與平均吸光度0保存後之組合來替代平均吸光度1保存前與平均吸光度1保存後之組合以外,以與上述同樣之順序,對冷凍乾燥血清2~4及冷凍乾燥血清0之各冷凍乾燥血清,進行共3次測量,對於各冷凍乾燥血清算出共3次之測量之各測量中的殘存率,並對各冷凍乾燥血清決定所算出的殘存率之平均值(平均殘存率)。再者,針對算出的殘存率,將顯著水準作為0.05而進行利用Dunnett法的檢定(Dunnett檢定)。其結果示於第2表。
如由第2表所明示,於添加本發明之安定劑而調製的冷凍乾燥血清,與未添加本發明之安定劑而調製的冷凍乾燥血清作比較,殘存率為高。於HDL-C定量用之標準品,為了正確的HDL-C之測量,即使為將標準品於溶液狀態下保存的情形,亦要求儘可能接近100%的殘存率之極高的殘存率。因此,第2表中,有添加本發明之安定劑的情形與未添加的情形之殘存率之差具有重要意義。此外,將顯著水準作為0.05而進行Dunnett檢定的結果,可知於添加本發明之安定劑而調製的全部冷凍乾燥血清,對於添加本發明之安定劑而調製的冷凍乾燥血清的殘存率、與對於未添加本發明之安定劑而調製的冷凍乾燥血清的殘存率之間具有顯著差異。因此,可知藉由本發明之安定劑,將血清或血漿中之HDL安定化,藉此可正確地測量血清或血漿中HDL中之成分。
依據本發明,提供血清或血漿中HDL之安定劑、血清或血漿中HDL之安定化方法、血清或血漿中HDL
之保存方法、可正確測量血清或血漿中HDL中之成分的標準品及其製造方法、血清或血漿中HDL中之成分之定量方法、及血清或血漿中HDL中之成分之定量用套組。
本發明之血清或血漿中HDL之安定劑、血清或血漿中HDL之安定化方法、血清或血漿中HDL之保存方法、血清或血漿中HDL中之成分定量用標準品及其製造方法、血清或血漿中HDL中之成分之定量方法、及血清或血漿中HDL中之成分之定量用套組係有用於代謝症候群等之診斷。
Claims (15)
- 一種聚氧乙烯多環苯基醚、聚氧乙烯多環苯基醚硫酸酯或萘磺酸甲醛縮合物之用途,其係用於將冷凍乾燥之血清或血漿中高密度脂蛋白安定化。
- 一種血清或血漿中高密度脂蛋白之安定化方法,其特徵為於血清或血漿中添加聚氧乙烯多環苯基醚、聚氧乙烯多環苯基醚硫酸酯或萘磺酸甲醛縮合物,並進行冷凍乾燥。
- 一種血清或血漿中高密度脂蛋白之安定化方法,其特徵為包含以下之步驟:(1)於血清或血漿中添加聚氧乙烯多環苯基醚、聚氧乙烯多環苯基醚硫酸酯或萘磺酸甲醛縮合物的步驟;(2)將步驟(1)所獲得的混合物冷凍乾燥的步驟;及(3)將步驟(2)所獲得的冷凍乾燥物以水性媒質溶解的步驟。
- 一種血清或血漿中高密度脂蛋白之保存方法,其特徵為於血清或血漿中添加聚氧乙烯多環苯基醚、聚氧乙烯多環苯基醚硫酸酯或萘磺酸甲醛縮合物,並進行冷凍乾燥。
- 一種血清或血漿中高密度脂蛋白之保存方法,其特徵為包含以下之步驟:(1)於血清或血漿中添加聚氧乙烯多環苯基醚、聚氧乙烯多環苯基醚硫酸酯或萘磺酸甲醛縮合物的步驟; (2)將步驟(1)所獲得的混合物冷凍乾燥的步驟;(3)將步驟(2)所獲得的冷凍乾燥物保存的步驟。
- 一種血清或血漿中高密度脂蛋白之保存方法,其特徵為包含以下之步驟:(1)於血清或血漿中添加聚氧乙烯多環苯基醚、聚氧乙烯多環苯基醚硫酸酯或萘磺酸甲醛縮合物的步驟;(2)將步驟(1)所獲得的混合物冷凍乾燥的步驟;(3)將步驟(2)所獲得的冷凍乾燥物以水性媒質溶解的步驟;及(4)將步驟(3)所獲得的水溶液保存的步驟。
- 一種血清或血漿中高密度脂蛋白中之成分定量用標準品,其特徵為含有經冷凍乾燥的血清或血漿中之高密度脂蛋白、及聚氧乙烯多環苯基醚、聚氧乙烯多環苯基醚硫酸酯或萘磺酸甲醛縮合物,且該高密度脂蛋白中之成分之含量經定值。
- 如請求項7之標準品,其係藉由包含以下之步驟的方法所製造:(1)於血清或血漿中添加聚氧乙烯多環苯基醚、聚氧乙烯多環苯基醚硫酸酯或萘磺酸甲醛縮合物的步驟;(2)將步驟(1)所獲得的混合物冷凍乾燥的步驟;及(3)將步驟(2)所獲得的冷凍乾燥物中所含的高密度脂蛋白中之成分之含量,使用已知量之該成分而定值的步驟。
- 如請求項7或8之標準品,其中高密度脂蛋白中之成分係膽固醇。
- 一種血清或血漿中高密度脂蛋白中之成分定量用之標準品之製造方法,其特徵為包含以下之步驟:(1)於血清或血漿中添加聚氧乙烯多環苯基醚、聚氧乙烯多環苯基醚硫酸酯或萘磺酸甲醛縮合物的步驟;(2)將步驟(1)所獲得的混合物冷凍乾燥的步驟;及(3)將步驟(2)所獲得的冷凍乾燥物中所含的高密度脂蛋白中之成分之含量,使用已知量之該成分而定值的步驟。
- 如請求項10之製造方法,其中高密度脂蛋白中之成分係膽固醇。
- 一種血清或血漿中高密度脂蛋白中之成分之定量方法,其特徵為包含以下之步驟:(1)使用血清或血漿中高密度脂蛋白中之成分之測量試藥,而測量該成分的步驟;(2)使用如請求項7或8之標準品、及步驟(1)之測量試藥,而製作表示該成分之濃度與對於該成分的測量值之間之關係的校正曲線的步驟;及(3)自步驟(1)所獲得的測量值、及步驟(2)所製作的校正曲線,決定血清或血漿中之該成分之濃度的步驟。
- 如請求項12之定量方法,其中高密度脂蛋白中之成分係膽固醇。
- 一種血清或血漿中高密度脂蛋白中之成分之定量用 套組,其特徵為含有血清或血漿中高密度脂蛋白中之成分之測量試藥、及如請求項7或8之標準品。
- 如請求項14之套組,其中高密度脂蛋白中之成分係膽固醇。
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