TWI643950B - 保護水生無脊椎動物免於疾病之方法及組成物 - Google Patents

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愛迪 史克拉
貝爾特 林恩 哈瑞斯
馬太 爾登曼
庫特 艾菲爾 迦摩天
強納生Ｆ 史密斯
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Abstract

本發明提供保護水生無脊椎動物免於疾病之組成物及方法。在一具體實施例中，製備針對該致病微生物之核酸分子之dsRNA或反股RNA，並傳遞給動物。在另一具體實施例中，將致病微生物之核酸分子傳遞給動物。在另一具體實施例中，利用複製子顆粒將RNA或核酸分子傳遞給動物。在另一具體實施例中，將保護性分子傳遞給動物之消化道。得到免於疾病之保護力。

Description

保護水生無脊椎動物免於疾病之方法及組成物
本發明係關於保護水生無脊椎動物免於疾病之方法及組成物。
【相關申請案】
本申請案主張先前於2010年10月27日申請且同在申請中之臨時申請案USSN 61/407,297；於2010年12月1日申請且同在申請中之申請案USSN 61/418,433；於2011年3月7日申請且同在申請中之申請案USSN 61/449,940；2011年5月10日申請且同在申請中之申請案USSN 61/484,255；於2011年7月15日申請且同在申請中之申請案USSN 61/508,172；及於2011年8月19日申請且同在申請中之申請案USSN 61/525,332之優先權，該等申請案各自之揭示內容以引用之方式完全併入本文中。
聯邦獎助研究與發展之相關聲明
本發明係依據2010-33610-20936之合約，接受美國農業部國家食品與農業研究所(The U.S. Department of Agriculture,National Institute of Food and Agriculture)SBIR之政府獎助。政府保有本發明之部份權益。
序列表
本申請案包含之序列表已透過EFS-Web以ASCII格式提交，且以全文引用之方式併入本文中。該ASCII複本(於2011年10月4日製成)，被命名為150004US.txt，檔案大小為104,052個位元組(bytes)。
水產養殖已成為全世界食用動物生產中成長最快的領域之一。這種突長歸因於野生漁業的庫存量下降，但美國、歐洲與日本對海產食品的需求卻日漸提高所致。水生無脊椎動物的疾病為此產業嚴重的問題。
例如，成長最快的需求領域之一為進口養殖蝦。根據FAO資料，過去20年來發現，水生養殖，特定言之，白蝦(Litopenaeus vannamei)(俗稱太平洋白蝦或太平洋白腳蝦)之蝦養殖已經從1980年的8000公噸上升至2004年漁業與水產養殖部(2004 Fisheries and Aquaculture Department)的1,380,000公噸。FishStatPlus-漁業統計軟體2009(Fishery Statistical software2009)(www.fao.org/fishery/statistics/software/fishstat/en.)。此大幅增加主要歸因於亞洲開始改為積極養殖白蝦(Litopenaeus vannamei)替代原生的草對蝦(Penaeus monodon)(俗稱草蝦)出口至美國，此等國家明確言之例如為：中國、泰國、印尼及越南，以致產量增加。上述文獻：漁業統計軟體2009(Fishery Statistical software 2009)。白蝦(Litopenaeus vannamei)引進亞洲成為養殖品種後即佔有主要市場，在2004年時佔有全球一半蝦產量。(Lightner,D.V.,2005，”蝦養殖之生物安全性：利用SPF母群及例行追蹤排除病原菌(Biosecurity in Shrimp farming：pathogen exclusion through use of SPF stock and routine surveillance)”，Journal of the World Aquaculture Society 36,229-248)。
由於白蝦(L. vannamei)開始佔有主要外銷養殖市場，亦成為美國國內需求主流。蝦的進口在1990至2004年期間，從16億美元上升至37億美元(美國農業部對外農業局(USDA Foreign Agriculture Service)，2005年，”美國海產食品進口持續上揚(US Seafood Imports Continue to Soar)”。國際貿易報告(International Trade Reports). 8-8-2005. 7-28-2010)，分別佔2004年海產食品總進口量的34%及海產食品總消耗量的25%。2004年中，70%美國進口的海產食品中有40%為養殖品，主要來自東南亞。快速提高的白蝦(L. vannamei)生產已經供過於求，並造成國際市場(主要指美國與歐盟)價格下跌。2005年時，15至20克大小的太平洋白蝦已經從5美元持續下跌至約3美元(如上述文獻：漁業與水產養殖部(Fisheries and Aquaculture Department)，2009)。
相較於野生種群，當養殖產量持續提高市場占有率時，疾病亦同樣衝擊蝦的養殖。生產者已採取諸如提高放養密度、縮小陸上魚塭養殖及提高餵食率的措施來提高競爭力。此舉造成感染疾病的可能性增加，明確言之，感染病毒病源體後造成二次細菌感染。病毒疾病如白斑症病毒(WSSV)已成為流行病，造成全世界數十億元損失。例如，當台灣的蝦養殖業爆發數次高死亡率疾病後，首次在1992年發現WSSV(Chou、H.-Y.、Huang,C.-Y.、Wang,C.-H.、Chiang,H.-C.、Lo,C.-F，1995，”導致台灣之養殖斑節蝦白斑症之桿狀病毒感染之病源(Pathogenicity of a baculovirus infection causing white spot syndrome in cultured penaeid shrimp in Taiwan)”。Diseases of Aquatic Organisms 23,165-173)。據估計，單亞洲一地自從1992年以來已損失超過60億美元，自從WSSV在1999年進入美洲後，即損失10至20億美元(Lightner 2003，”由IHHNV、WSSV、TSV及YHV造成之斑節蝦病毒流行病：在美國的病例及目前狀況(The penaeid shrimp viral pandemics due to IHHNV,WSSV,TSV and YHV: history in the Americas and current status)，Proceedings of the 32nd Joint UJNR Aquaculture Panel Symposium,Davis and Santa Barbara,California,USA,pp. 17-20)。另一個例子為厄瓜多爾蒙受的嚴重損失，在WSSV入侵後損失65%產量，單在外銷量即損失超過5億美元。此外，喪失130,000個工作，超過100,000公頃蝦池遭棄置(McClennen,C.，”白斑症候群病毒，對拉丁美洲養殖蝦業發展之經濟、環境與技術關係(White Spot Syndrome Virus,The Economic,Environmental and Technical Implications on the Development of Latin American Shrimp Farming)”，2004年法律與外交碩士論文(Master of Arts in Law and Diplomacy Thesis. 2004)。同樣地，祕魯在2000年的產量劇降至1998年的十分之一，85%蝦池遭棄置，單飼料成本即損失9百萬美元(如上述文獻：McClennen,2004)。中國估計WSSV造成每年總產量損失80%(Zhan,W.-B.、Wang,Y.-H.，1998，”‘中國養殖蝦之白斑症病毒感染(White Spot Syndrome Virus Infection of Cultured Shrimp in China)”，Journal of Aquatic Animal Health 10,405-410.0)。
目前市場上沒有針對此等病源體可以使用的疫苗、治療劑或干預法，造成水生無脊椎動物嚴重經濟損失，尤其在生產蝦的國家中。
所有摘錄文獻之揭示內容已以引用之方式完全併入本文中。所提供之實例僅供說明用，並無意限制本發明之範圍。
本發明揭露之疫苗及組成物係保護水生無脊椎動物免於致病微生物之負面影響。疫苗中可提供保護性分子，其可為微生物之核酸分子、其所編碼之多肽、干擾性RNA(如：dsRNA或反股RNA)、或其編碼DNA或包含或製造上述任一者之複製子載體。此等分子保護動物免於疾病。本發明亦揭露投藥及製備之方法。
本發明揭示用於保護水生無脊椎動物免於疾病之組成物之製造方法。保護性分子係藉由下列步驟製得：識別導致疾病之微生物之標靶核酸分子，干擾該分子來保護動物免於疾病；以及製備dsRNA分子、反股RNA分子、或製造該等分子之DNA或包含該等分子之複製子顆粒。當投予動物時，可以保護免於疾病。本發明揭示保護動物免於疾病之WSSV VP19及VP28之核酸分子。本發明亦揭示保護動物免於疾病之反股及dsRNA分子。本發明亦揭示疫苗及組成物。
本發明提供一種保護水生無脊椎動物(特定言之蝦)免於疾病之方法。在一具體實施例中，針對特定核酸分子提供一種傳遞系統，其可誘發無脊椎動物對抗病原體之保護性及/或免疫反應。
本文所提供之實施例展現本發明在蝦上之用途，並特別適用於保護蝦(如：軟甲綱(Malacostraca)，其包括甲殼綱(Decapods)，包括蝦(Dendrobranchiates)(如明蝦(prawns))及蝦(Carideans)(如蝦(shrimp))免於疾病或病害。然而，其他無脊椎動物且特定言之水生無脊椎動物(淡水及海水)均可能因本發明所提供之保護作用而免於疾病及病害，該無脊椎動物包括例如(但不限於)：甲殼動物(crustacean)(例如：龍蝦、蟹、蝦、螯蝦)、軟體動物(mollusk)(例如：墨魚、蛤蜊、章魚、蝸牛、鮑魚、貽貝)、海綿動物門(Porifera)(海綿動物)、刺胞動物門(Cnidaria)(例如：水母、海葵)、櫛板動物門(Ctenophora)、棘皮動物門(Echinodermata)及水生蠕蟲。本發明特別適用於具有商業價值之水生無脊椎動物，尤其適用於養殖水生無脊椎動物(相對於彼等在海域中野生者)，其將於本文中說明。如本文所示，可採用浸泡法、經口傳遞法等將本發明之核酸分子及/或多肽或其片段傳遞至動物之消化道(其可在投藥通過消化道或其一部份後發現)。不同於如注射之方法，此方法對傳遞疫苗給動物大有幫助，並對動物提供實際且有效之免疫接種方式，尤其為動物進行多次集體接種疫苗時。
本發明之方法包括干擾致病源(agent)之核酸分子之表現或干擾致病源之核酸分子之方式。當提及干擾表現時，意指抑制、瓦解(disrupt)或干擾核酸分子之表現，以保護動物免於疾病。在一具體實施例中，該方法使用與致病源之核酸分子(標靶核酸分子)互補之反股RNA。反股RNA為與標靶互補之RNA，該標靶通常為標靶核酸分子之信使者RNA(messenger RNA，mRNA)。反股意指與標靶核酸分子之5’-至-3’正常取向為相反取向之序列。當傳遞至細胞時，反股RNA序列之表現會阻止標靶核酸分子所編碼蛋白質之正常表現。當提及RNA為互補時，意指包括用於反股壓制之多肽可能對應於：編碼該標靶多肽之序列之所有或部份之互補、該標靶多肽轉錄本(transcript)之5’及/或3’未轉譯區之所有或部份之互補、或編碼該標靶多肽之轉錄本之編碼序列及未轉譯區之所有或部份之互補。互補核酸分子為與所有或部份之標靶核酸分子之mRNA轉錄本互補之分子。此外，反股聚核苷酸可能與標靶序列完全互補(亦即，與標靶序列之互補為100%一致)或部份互補(亦即，與標靶序列之互補之一致性低於100%)。可採用反股壓制性來抑制同一細胞中多重蛋白質之表現。此外，可採用部份反股核苷酸來瓦解標靶核酸分子之表現。通常，可採用具有至少10個核苷酸、20個核苷酸、50個核苷酸、100個核苷酸、200個核苷酸、300、500、550、500、550或更多個及其中任一核苷酸數量之反股序列。該序列可能與信使者RNA之任一序列互補，亦即，可能接近5’-末端或封端位置(capping site)、位於封端位置下游、位於封端位置與起始密碼子(codon)之間，且該序列可能涵蓋所有或僅一部份非編碼區、可能橋接非編碼與編碼區、與所有或部份編碼區互補、與編碼區之3’-末端互補、或與mRNA之3’-未轉譯區互補。該反股序列可能與獨一序列或重覆序列互補，因此可加強結合之機率。因此，該反股序列可能涉及與獨一序列、與重覆序列之單一單位或與重覆序列之多個單位之結合。製備反股核酸分子之方法係已知者。參見例如：Shewmaker等人之美國專利第5,759,829號，其揭示內容以引用之方式併入本文中。
在本發明之另一具體實施例中，採用RNA干擾，且在較佳具體實施例中，採用雙股RNA分子(dsRNA)。總而言之，在此方法中，以標靶核酸分子之序列為基礎製造部份或完整之雙股RNA。製造dsRNA之明確方式可隨熟悉此相關技藝之人士改變，且包括例如(但不限於)：Graham等人之美國專利第6,573,099號之方法，其中，採用兩套相當於標靶序列之序列；或Fire等人之美國專利第6,326,193號之方法，其中，第一股為相當於標靶核酸之RNA序列，且第二股為與標靶序列互補之序列，其各自揭示內容以引用之方式併入本文中。此等股相互雜交，形成抑制性dsRNA。相當於標靶核酸分子之股可對應於其全部或一部份，只要可以形成dsRNA即可。若所使用之股用為標靶核酸之互補(反股)時，其可與所有或一部份之標靶核酸分子互補，只要所形成dsRNA會干擾標靶核酸分子即可。該dsRNA啟動之反應會使RNAse III Dicer酵素處理dsRNA形成約21至23個核苷酸之小型干擾性RNA(siRNA)，其再形成受RNA誘發之靜默複合物(silencing complex)RISC，其會破壞同源性mRNA。(參見Hammond,S. M.等人之Nature(2000)404：293-296)。當提及標靶核酸分子時，意指需要干擾其表現之疾病源之核酸分子或其片段。通常，可使用至少10個核苷酸、20個核苷酸、30個核苷酸、40個核苷酸、50個核苷酸、100個核苷酸、200個核苷酸、300、500、550、500、550、或更多個核苷酸及其中任何核苷酸數量之序列。
本案發明者已出示本發明可以使用之dsRNA序列之實例，並發現此等dsRNA之片段可用於提供保護性反應。例如，可干擾IMNV並提供保護性反應之dsRNA#3為380個鹼基對之序列。然而，dsRNA之片段係提供保護性反應。因此，當提及本發明之dsRNA時，亦包括可提供此等保護性反應之dsRNA之片段。
如下文所討論，本案發明者亦已證實編碼致病源之多肽或其片段之核酸分子可投予水生無脊椎動物，並觀察到保護性反應。
在一具體實施例中，採用複製子顆粒技術來傳遞保護性分子給動物。該核酸分子、所編碼之多肽、或該核酸分子或多肽之片段、或該反股或dsRNA可在投予動物時產生保護性反應，且在本文中有時候稱為保護性分子。保護性分子係利用熟悉此相關技藝之人士可採用之各種不同方式導入細胞中，不論透過攝取、吸收、經過纖維素酶處理、或利用輔劑或裝置、注射等方式均可，其實例將於下文中說明。
在一具體實施例中，本發明之疫苗包含保護性分子。在另一具體實施例中，該疫苗係藉由製造dsRNA，然後直接導入水生無脊椎動物之細胞，或置入載體或表現匣(expression cassette)中再導入細胞中而製得。本案發明者已發現，dsRNA可直接導入細胞中，並產生保護性反應。該dsRNA可利用DNA載體傳遞，然後由可被某些依賴細胞DNA之RNA聚合酶辨識之發動子(promoter)產生dsRNA。在另一具體實施例中，可採用複製子顆粒技術製造疫苗。若使用反股RNA作為疫苗時，在不希望受到任何理論之限制下，咸信該反股RNA可在其進入之細胞中形成dsRNA。
在導入保護性分子之前，先識別所要表現或抑制之致病源中之核酸序列(標靶核酸分子或標靶基因)。該保護性分子可以表現、抑制任何此等標靶核酸分子，或與其競爭結合位置，當投藥時，可以保護動物免於致病源。任何此等保護性分子均可用於本發明。此等保護性分子之實例為(但不限於)彼等編碼或抑制白斑症病毒(WSSV)或其片段之分子，且在較佳具體實施例中，為編碼或抑制VP28、及WSSV之VP19多肽或其片段、或感染性壞疽病病毒(IMNV)或其片段及刺激保護性反應之分子。本案發明者亦在一具體實施例中出示一種表現VP19反股及VP19蛋白質並提供保護作用之複製子顆粒。此外，本文亦出示一種可提供保護作用之標靶分子之dsRNA之片段。
一旦得到遺傳資訊，即可依疫苗型式提供該核酸分子或此等標靶核酸分子之反股或dsRNA。
在一具體實施例中，可將“裸(naked)”核酸分子或裸dsRNA或反股分子投予水生動物，亦即，該dsRNA或反股不需含在習知表現匣或載體中。此等分子可採用任何合宜方法製造，如下文說明之引子擴增法(primer amplification)及逆轉錄法。
在另一具體實施例中，保護性分子可利用可視需要包含其他組份之表現匣或載體傳遞。在另一具體實施例中，保護性分子可利用複製子顆粒傳遞。在又一具體實施例中，係利用傳遞至動物之消化道之疫苗來提供保護作用。
“載體”為用於轉移核酸至宿主細胞中之任何工具。載體可為可附接DNA節段之複製子，因此可以複製所附接之節段。"複製子"為在活體內DNA或RNA複製作用中具有自主單位功能之任何遺傳元素(例如：質體、噬菌體、黏質體、染色體、病毒)，亦即，可以在其控制下進行複製。術語“載體”包括在活體外、離體(ex vivo)或活體內導入核酸至細胞內之病毒與非病毒工具。病毒載體包括α病毒、反轉錄病毒、腺相關病毒、痘病毒(pox)、桿狀病毒(baculovirus)、牛痘病毒(vaccinia)、單純疱疹病毒、艾伯斯坦-巴爾病毒(Epstein-Barr)及腺病毒載體。非病毒載體包括(但不限於)：質體、微脂粒、帶電價脂質(細胞角質蛋白)、DNA-或RNA蛋白質複合物，及生物聚合物。除了核酸外，載體亦可包含一種或多種調節區、及/或用於選拔、測定及追蹤核酸轉移結果(轉移至哪一個組織、表現之持續期，等等)之可選拔的標記物。
“匣”係指可嵌入載體中之特異性限制酶切割位置之DNA之節段。該DNA之節段編碼感興趣之多肽或產生RNA，且該匣及限制酶切割位置之設計在於確保該匣嵌入適當讀碼框(reading frame)中，供進行轉錄及轉譯。
當核酸分子嵌入細胞中時，即已導入細胞中。當此等DNA或RNA已導入細胞內時，該細胞已被外源性或異源性之DNA或RNA“轉染(transfected)”。
當已轉染之DNA出現表型變化時，該細胞已被外源性或異源性之DNA“轉化(transformed)”。該轉化DNA可以整合(共價連結)進入染色體DNA，構成細胞之基因組。
“保留性修飾之變異株”適用於胺基酸及核酸序列。針對特定核酸序列時，保留性修飾之變異株(variant)係指彼等編碼相同或基本上相同之胺基酸序列之核酸，或若該核酸不編碼胺基酸序列，則指編碼基本上相同序列之核酸。由於遺傳密碼之簡併性(degeneracy)，有許多功能上相同之核酸可編碼任何指定之多肽。例如，密碼子CGU、CGC、CGA、CGG、AGA及AGG均編碼精胺酸胺基酸。因此，每一個由密碼子指定為精胺酸之位置上，該密碼子均可改變成任何上述相應密碼子，但不會改變所編碼之多肽。此等核酸變異性為“靜默取代(silent substitution)”或“靜默變異(silent variation)”，其係其中一種"保留性修飾變異"。除非另有說明，否則本文所說明編碼多肽之每一種聚核苷酸序列亦說明每一種可能之靜默變異。因此，靜默取代作用係編碼胺基酸之每一種核酸序列隱藏之特色。熟悉此相關技藝之人士咸了解，核酸中各密碼子(AUG除外，其通常為甲硫胺酸之唯一密碼子)均可經過標準技術修飾，產生功能上相同之分子。在有些具體實施例中，編碼保護性多肽之核苷酸序列最佳在用於產生多肽或RNA之特定宿主細胞(例如：酵母、哺乳動物、植物、真菌，等等)中達最優化表現。
以胺基酸序列而言，熟悉此相關技藝之人士咸了解，在核酸、肽、多肽或蛋白質序列上進行之個別取代、刪除或添加而使所編碼序列上改變、添加或刪除單一胺基酸或小百分比胺基酸成為本文所提及之“保留性修飾變異株”時，係指該“變異株”中之改變造成胺基酸被化學上類似之胺基酸取代。保留性取代之列表提供熟悉此相關技藝之人士習知之功能上類似之胺基酸。參見例如：Davis等人之“分子生物學基礎方法(Basic Methods in Molecular Biology)”，Appleton & Lange,Norwalk,Conn.(1994)。此等保留性修飾之變異株還包括(且不排除)多型性變異株、物種間同系物、及本發明之對偶基因。
下列8組各自包含可相互進行保留性取代之胺基酸：1)丙胺酸(A)、甘胺酸(G)；2)天冬胺酸(D)、麩胺酸(E)；3)天冬醯胺(N)、麩醯胺(Q)；4)精胺酸(R)、離胺酸(K)；5)異白胺酸(I)、白胺酸(L)、甲硫胺酸(M)、纈胺酸(V)；6)苯基丙胺酸(F)、酪胺酸(Y)、色胺酸(W)；7)絲胺酸(S)、蘇胺酸(T)；及8)半胱胺酸(C)、甲硫胺酸(M)(參見例如：Creighton，1984，蛋白質學(Proteins))。
單離之變異株蛋白質可從天然表現該蛋白質之細胞中純化、從已改變其表現(重組體)之細胞中純化、或採用已知蛋白質合成法合成。例如，將編碼該變異株多肽之核酸分子選殖至表現載體，將該表現載體導入宿主細胞中，於該宿主細胞中表現變異株蛋白質。然後可採用標準蛋白質純化技術，以適當純化方案自細胞中單離該變異株蛋白質。
當胺基酸序列為蛋白質之最終胺基酸序列之至少一部份時，該蛋白質係由胺基酸序列組成。此等模式中，蛋白質可能為原始多肽、變異株多肽及/或具有額外胺基酸分子，如：與其天然相關之胺基酸殘基(連續編碼序列)或異源性胺基酸殘基/肽序列。此等蛋白質可具有幾個額外胺基酸殘基或可包含數百個或更多個額外胺基酸。
用於本發明之變異株蛋白質可以附接至異源性序列，以形成嵌合或融合蛋白質。此等嵌合及融合蛋白質包含在讀碼框內(in-frame)與異源性蛋白質(其具有實質上不與該變異株蛋白質同源之胺基酸序列)融合之變異株蛋白質。該異源性蛋白質可與變異株蛋白質之N-末端或C-末端融合。
嵌合或融合蛋白質可採用標準重組體DNA技術製造。例如，編碼不同蛋白質序列之DNA片段可依據習知技術，於讀碼框內共同黏接。在另一具體實施例中，可採用習知技術(包括自動化DNA合成)合成融合基因。或者，可採用錨定引子(anchor primer)進行基因片段之PCR擴增法，在兩個相鄰基因片段之間形成互補突出端，隨後黏接並再擴增，以產生嵌合基因序列(參見Ausubel等人之Current Protocols in Molecular Biology,1992)。此外，可自商品取得許多種已編碼融合部份體(例如：GST蛋白質)之表現載體。可將編碼變異株蛋白質之核酸選殖至此等表現載體中，因此讓融合部份體在讀碼框內連接變異株蛋白質。
多肽有時候包含20種胺基酸(通常稱為20種天然胺基酸)以外之其他胺基酸。此外，許多種胺基酸(包括末端胺基酸)可經過天然過程修飾，如：加工處理及其他轉譯後修飾法、或相關技藝上已知之化學修飾技術。天然發生於多肽中之常見修飾法已說明於基礎教科書中、詳細之論文中、及研究文獻中，且其係熟悉此相關技藝之人士習知技術。因此，本發明之變異株肽亦包括其中經取代之胺基酸殘基不經由遺傳密碼編碼、其中包括取代基、其中成熟之多肽與另一種化合物(如：可延長該多肽半衰期之化合物(例如：乙二醇)融合)、或其中由額外胺基酸與成熟多肽(如：前導(leader)或分泌序列或用於純化成熟多肽或前蛋白質序列之序列)融合之衍生物或類似物。
已知修飾作用包括(但不限於)：乙醯化作用、醯化作用、ADP-核糖基化作用、醯胺化作用、共價附接黃素、共價附接血基質部份體、共價附接核苷酸或核苷酸衍生物、共價附接脂質或脂質衍生物、共價附接磷脂醯肌醇、交聯作用、環化作用、二硫鍵形成作用、脫甲基化作用、形成共價交聯、形成胱胺酸、形成焦麩胺酸鹽、甲醯基化作用、γ羧基化作用、糖基化作用、GPI錨端形成作用、羥基化作用、碘化作用、甲基化作用、肉桂醯基化作用、氧化作用、蛋白質水解作用、磷酸化作用、異戊烯化作用、消旋化作用、硒醯化作用、硫酸化作用、轉移-RNA所媒介之胺基酸加成至蛋白質(如：精胺醯化作用)、及泛素化作用。
本發明除了包含變異株蛋白質之片段或由其組成之蛋白質及肽以外，尚進一步提供本發明之該變異株蛋白質之片段，但其限制條件為此等片段可作為抗原及/或可供治療及/或保護對抗本發明所提出之感染。
“生物樣本”一詞係指動物之流體或組織。此等組份係相關技藝上已知且包括(但不限於)：血液、血漿、血清及腸道或生殖泌尿道之分泌物。
如本文所用，抗體之定義與相關技藝上已知之定義一致：其係由生物體因應抗原攻毒(challenge)所產生之多重亞單位(multi-subunit)蛋白質。本發明所使用之抗體包括單株抗體及多株抗體，以及此等抗體之片段，包括(但不限於)：Fab或F(ab’)hd 2、及Fv片段。
本文所用術語“亞單位”係指其本身可能具抗原性(亦即，可以在動物體內誘發免疫反應或保護性)之微生物之一部份。該術語應包括可藉由重組作用及生化方法得到之亞單位。
本文所用術語“單離株(isolate)”係指從特定來源得到之病毒。單離株亦可與術語“菌株(strain)”交換使用。
本文所用術語“疫苗”係指醫藥組成物，其包含可在動物體內誘發免疫及/或保護性反應之至少一種保護性分子、核酸或多肽或其片段，且可能(但不一定)包含一種或多種可加強該活性組份之活性之額外組份。該疫苗可額外包含典型為醫藥組成物之其他組份。在另一型式中，疫苗之免疫活性組份可包含該生物體之適當元素(亞單位疫苗)，其中此等元素之產生係藉由破壞整個生物體或此等微生物之生長培養基，然後進行純化步驟，產生所需結構(群)，或藉由適當操作合適之系統(如(但不限於)：細菌、昆蟲、哺乳動物或其他物種)所誘發之合成過程，加上隨後之單離與純化過程，或使用合適醫藥組成物直接將遺傳材料導入需要該疫苗之動物體內，而在該動物體內誘發該合成過程(聚核苷酸疫苗接種法)。疫苗可包含一種或同時包含超過一種上述元素。
本文所用術語“保護”、“保護作用”、“保護性免疫力”或“保護性免疫反應”意指本發明之疫苗或多肽使宿主動物產生活性免疫反應，因此當受到疾病攻毒時，該動物可以對抗感染。因此，保護性免疫反應將可降低曝露到微生物之宿主動物之罹病率及死亡率。以後再曝露到致病源之動物將受到保護。在一具體實施例中，對已曝露過致病源之動物在經過此等曝露後投予疫苗或多肽處理動物時，可以保護該動物。此例中，亦展現降低之罹病率及死亡率。熟悉此相關技藝之人士咸了解，在商業用動物條件下，可藉由評估池塘、組群、族群或獸群整體接種疫苗之效果，分析所產生之保護性免疫反應，例如，仍有少數經接種疫苗之動物可能出現罹病率及死亡率。此外，保護作用亦包括疾病之任何粗觀或組織病理學變化及/或症狀之嚴重性比該單離株在未受保護之類似動物(亦即，相對於適當對照組)中造成之彼等典型變化或症狀減輕。因此，保護性免疫反應將會隨疾病之變化來減輕疾病之症狀。熟悉此相關技藝之人士咸亦了解，以節肢動物宿主為例，保護性免疫力不一定等同脊椎動物中適應性免疫力之傳統記憶反應特徵。當曝露到微生物時，疾病罹病率及/或死亡率會下降，且亦可能降低感染之效價(titer)。
本文所用“免疫有效量”係指有效降低、消除、治療、預防或控制感染、疾病、病變或病症之症狀時之用量。
在一具體實施例中，本發明係有關一種包含微生物之多肽或其片段之多肽。本案發明者希望該多肽可為多肽之同源物、衍生物或變異體，或其免疫活性或功能性片段。該多肽可經單離、合成，或使用本文所說明編碼該多肽之核酸重組表現。
本發明亦提供一種編碼本發明之多肽或RNA之單離及/或重組之核酸。此外，應了解依據相關技藝之一般狀態，其他與該多肽之核苷酸或胺基酸序列同等之序列亦涵括在本發明內。例如，在自微生物單離之胺基酸序列或自微生物單離之核酸序列表現之胺基酸序列中有些刪除、嵌插及取代均涵蓋在本發明內，除非此等突變破壞了該多肽誘發產生保護性反應之能力。
本發明之核酸包括彼等編碼整個多肽或產生RNA序列之核酸，以及彼等編碼該多肽或RNA之次序列或產生dsRNA之片段之核酸。例如，本發明包括編碼該非全長度之多肽或RNA，但對感染卻具有保護活性之核酸。本發明不僅包括含有如本文所示核苷酸序列之核酸，而且亦包括與所例舉之具體實施例實質上相同、相對應、或實質上互補之核酸。例如，本發明包括其中包含與本文所示核苷酸序列之一致性為至少約70%之核酸，更佳為與所例舉之核苷酸序列之一致性為至少75%，亦更佳為至少80%，更佳為至少85%、86%、87%、88%、89%，亦更佳為至少90%、91%、92%、93%、94%，甚至更佳為至少約95%、96%、97%、98%、99%、100%(或其居間任何百分比)。該核苷酸序列可如上述方式修飾，只要所編碼之任何多肽或所製造之RNA或dsRNA可以誘發產生保護性反應即可。
本案發明者已顯示該所製造之dsRNA序列包括截短之片段。此等片段可為9個或更多個鹼基對，可為10個鹼基對、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、21、22、23、24、25、26、27、28、29、30、31、32、33、34、35、36、37、38、39、40、41、42、43、44、45、46、47、48、49、50、51、52、53、54、55、56、57、58、59、60、61、62、63、64、65、66、67、68、69、70、71、72、73、74、75、76、77、78、79、80、81、82、83、84、85、86、87、88、89、90、91、92、93、94、95、96、97、98、99、100、200、300、400、500、600、700、800、900、1000個或更多個，或其中間任一數量之鹼基對，只要當投予動物時可以產生保護性反應即可。依據本發明之具體實施例，在不希望受到任何理論之限制下，使用至少9個鹼基對來提供序列專一性，以干擾標靶分子。完整建立之RNA干擾性(RNAi)作用機轉已針對細胞微小RNA(miRNA)說明，其係與上述dsRNA之作用相關。miRNA之5’-末端7至8個核苷酸(有時候稱為種子序列)涉及與標靶mRNA中3’未轉譯區之核苷酸之華生-克里克(Watson-Crick)鹼基配對(Lewis,B. P.、C. B. Burge及D. P. Bartel，2005，”保留之種子配對，經常側接腺苷，表示數千個人類基因為miRNA標靶(Conserved seed pairing,often flanked by adenosines,indicates that thousands of human gene are miRNA targets)”。Cell 120：15-20)。RNA所誘發靜默複合物(RISC)會裂解其中鹼基配對完整及不完整之標靶mRNA，標靶mRNA係經過無活性轉譯，並在不降解mRNA下影響蛋白質表現(Bartel,D. P. 2004，”微小RNA：基因組、生物發生學、機轉及功能(MicroRNAs: genomics,biogenesis,mechanism,and function)”。Cell. 116：281-97)。相同之基於RISC之活性似乎為上述dsRNA為蝦提供保護作用之機轉。在較佳具體實施例中，使用至少20個鹼基，及在另一較佳具體實施例中，使用至少30個鹼基，其進一步有助於轉運至細胞中。在另一較佳具體實施例中，使用長度至少50bp或以上之dsRNA可達到更高效力。
為測試此等片段，採用AEM(抗病毒效應子分子)展開法係許多可行的方法之一種。依據成功用於IMNV之AEM展開法，此方法一般程序如下：決定用於AEM展開法之長標靶區，採用已建立之疾病攻毒模式，由攻毒後存活率測定該標靶區對免於疾病之保護作用，將在標準疾病生物分析法中(舉例說明於下文實施例1、2及3)，藉由在已證實之較長AEM中，逐漸縮短標靶區，設計出dsRNA，分析長度較短之dsRNA。
在實施例中，對於每個感興趣之標靶設計一組具有5’T7發動子序列之PCR引子，其可產生擴增子序列AS之約400bp部份。相對於基因組及基因轉錄體序列過濾篩選涵括在PCR引子中之擴增子序列，並預計可藉此將可能之非標靶效應降至最低。PCR產物係由衍生自所收集之蝦苗及成蝦RNA之全身cDNA產生。由此產物，使用Ambion Mega script活體外轉錄套組製造dsRNA，每次反應可產生50至100 μg高品質之dsRNA。通常，一次活體外轉錄反應之dsRNA產量可達到50至100μg。應注意，整個產生dsRNA製程中，從使用5’T7發動子序列產生基因專一性引子至形成產物通常需要3天(包括引子合成及O/N運送)。採用eGFP之異源性dsRNA來控制其啟動dsRNA反應之生理性影響。使用已經過證實之標靶之連續截短之區段重覆此過程。可採用任何可行方法測定基因壓制作用，包括由全身或特定組織RNA萃取物，使用由產生dsRNA之引子組所涵蓋區域擴增延伸或完全自其中移出之引子組進行定量性RT-PCR或RT-PCR、核酸雜化作用或北方墨點分析法。
編碼多肽或產生提供保護性反應之RNA之核酸可採用熟悉此相關技藝之人士已知之方法製得。合適之核酸(例如：cDNA、基因組、或次序列)可採用活體外方法選殖或擴增，如：使用合適引子進行之聚合酶鏈反應(PCR)、黏接酶鏈反應(LCR)、基於轉錄之擴增系統(TAS)、自主序列複製系統(SSR)。熟悉此相關技藝之人士習知有許多種選殖及活體外擴增方法。此等技術及足以透過許多選殖操作法指導熟悉此相關技藝之人士之說明可參見Berger及Kimmel之“分子選殖技術指南(Guide to Molecular Cloning Techniques)”，酵素學方法(Methods in Enzymology)152Academic Press,Inc.,San Diego,Calif.(Berger)”；Sambrook等人(2001)“分子選殖法-實驗室手冊(Molecular Cloning.--A Laboratory Manual)”(第三版)Vol. 1-3,Cold Spring Harbor Laboratory,Cold Spring Harbor Press,NY,(Sambrook等人)；“分子生物學新方法(Current Protocols in Molecular Biology)”，F. M. Ausubel等人編輯，Current Protocols,a joint venture between Greene Publishing Associates,Inc.及John Wiley & Sons,Inc.,(1994補充本)(Ausubel)”；Cashion等人之美國專利案案號5,017,478；及Carr之歐洲專利案第0,246,864號。足以透過活體外擴增方法指導熟悉此相關技藝之人士之技術實例可參見Berger、Sambrook及Ausubel之文獻，及Mullis等人(1987)美國專利案第4,683,202號；”PCR方法指南與應用(PCR Protocols A Guide to Methods and Applications)”(Innis等人編輯)Academic Press Inc. San Diego,Calif.(1990)(Innis)；Amheim & Levinson (Oct. 1,1990)C&EN 36-47；The Journal Of NIH Research(1991)3：81-94；(Kwoh等人(1989)Proc. Natl. Acad. Sci. USA 86：1173；Guatelli等人(1990)Proc. Natl. Acad. Sci. USA 87,1874；Lomell等人(1989)J. Clin. Chem.,35：1826；Landegren等人(1988)Science 241：1077-1080；Van Brunt(1990)Biotechnology 8：291-294；Wu及Wallace(1989)Gene 4：560；及Barringer等人(1990) Gene 89：117。選殖活體外擴增之核酸之改良方法說明於Wallace等人之美國專利案第5,426,039號。可採用上述任何合適方法製備編碼本發明之多肽或RNA之核酸，或此等核酸之次序列，包括例如：選殖及限制酶切割適當序列。
可採用“密碼子優化法(codon optimization)”優化該序列，使其最適合於動物中表現，且其定義為以較常用或最常用於無脊椎動物之基因中之密碼子置換天然序列中至少一個、超過一個或顯著數量之密碼子，來修飾該核酸序列，以加強其於所需水生動物(例如：蝦)細胞中之表現。各種不同物種對特定胺基酸之某些密碼子可能會出現某些偏差。
在一態樣中，本發明係有關一種聚核苷酸，包含優化密碼子之編碼區之核酸片段，其可編碼多肽或產生RNA，或其片段、變異株或衍生物，其中所使用之密碼子已配合在所指定水生動物之細胞達中最優化表現。其製法為將較適用於所需動物之基因中之密碼子導入DNA序列中。亦提供包含優化密碼子之編碼區之核酸片段之構築體、載體及宿主細胞，及其片段、變異株或衍生物，及使用該等聚核苷酸表現構築體、載體、宿主細胞來治療或預防動物疾病之各種不同方法。
然後可將編碼多肽或製造RNA之核酸透過使用載體、質體或構築體等來導入原核生物或真核生物之宿主細胞中，以製造多肽。典型之表現匣包含發動子，其係以操作方式連接編碼所需產物之核酸。該等表現匣典型包括在導入合適宿主細胞(包括例如細菌、昆蟲、真菌、植物或動物細胞)中之表現載體上。不論構成性或調節性發動子均可用於本發明。適用於真核生物宿主細胞之發動子係熟悉此相關技藝之人士習知者。本發明之表現載體可經由熟悉此相關技藝之人士已知之方法轉移至所選擇之宿主細胞中，該等方法包括例如：磷酸鈣轉染法、DEAE-葡聚糖媒介之轉染法、轉染法、微注射法、陽離子性脂質媒介之轉染法、電穿孔法、轉導法、畫痕標記法(scrape loading)、彈道導入法(ballistic introduction)、感染或其他方法。(參見”分子選殖法-實驗室手冊(Molecular Cloning-A Laboratory Manual)，第2版，第1-3冊，Sambrook等人編輯，Cold Spring Harbor Laboratory Press(1989))。可例如：採用由含在質體上之基因(如：amp、gpt、neo及hyg基因)所賦與對抗生素之抗性來選拔轉化細胞。
在一實例中，可由重組體載體、病毒載體或病毒表現保護性分子。在另一態樣中，表現保護性分子之重組體載體、病毒載體或微生物本身可以作為疫苗組份，作為保護劑或輔劑及誘發或加強保護性反應。例如，合適之重組體病毒載體包括(但不限於)：活腺病毒、痘病毒、桿狀病毒、假性狂犬病病毒(PRV)、委內瑞拉馬腦炎(Venezuelan equine encephalitis)(VEE)載體(如：菌株V3526或TC-83)，及衍生自VEE、馬動脈炎病毒(EAV)或傳染性胃腸炎病毒(TGE)之病毒複製子顆粒(VRP)。用於嵌插此等序列至病毒載體中及改變病毒DNA(例如：嵌插連接子序列等)之技術為熟悉此相關技藝之人士已知者(參見例如：上述文獻分子選殖法-實驗室手冊(Molecular Cloning-A Laboratory Manual)。
核酸分子可依操作方式連接編碼多肽或製造RNA之cDNA中5’末端之合適發動子及該cDNA中3’末端之終止訊號及聚(A)訊號。本文所用術語"以操作方式連接"意指該包含表現控制序列(例如：轉錄發動子及終止序列)之核酸分子位於載體或細胞中，使該表現控制序列可以調節該核酸分子所製造之多肽或RNA之表現。選殖及以操作方式連接此等序列之方法係熟悉此相關技藝之人士習知者。適合表現抗原之發動子之實例包括(但不限於)：巨細胞病毒立即早期(CMV)發動子、Rous肉瘤病毒長端重覆序列(RSV-LTR)發動子、猿猴病毒40(SV40)立即早期發動子，及可誘發之發動子(如：金屬硫蛋白發動子)。發動子之其他實例包括：T7噬菌體發動子、T3噬菌體發動子、β-半乳糖苷酶發動子，及Sp6噬菌體發動子。具有終止及聚(A)訊號之DNA之實例為SV40晚期基因聚(A)區。適合製造抗原之病毒表現系統之另一實例為辛德畢斯(Sindbis)表現系統(購自Invitrogen)。此等自商品取得之表現載體及系統之用法係相關技藝上已知者。
本發明之疫苗亦可包含多套數之一種保護性分子或保護性分子之組合。
在另一具體實施例中，製備複製子顆粒(RP)疫苗。RP載體具有數個可用於發展疫苗之優點，包括精確製造天然蛋白質、對淋巴細胞具有組織侵性(tropism)、不會有病毒複製及傳播、可誘發黏膜及全身性免疫力、有連續免疫接種之潛力、及雖然動物顯然已對病毒產生免疫性，但仍對VEE沒有預先存在之免疫力。(Dickerman RW、Baker GJ、Ordonez JV、Cherer WF(1973)，“委內瑞拉馬腦炎病毒血症及豬與牛之抗體反應(Venezuelan Equine Encephalomyelitis Viremia and Antibody Responses of Pigs and Cattle)”，American Journal of Veterinary Research 34：357-361)。VEE之複製方法類似其他α病毒。(Strauss J,Strauss E(1994)，“α病毒：基因表現、複製及演化(The αviruses：gene expression,replication,and evolution)，Microbiol Rev 58：491-562)。由正向基因組RNA可轉譯四種非結構蛋白質(nsP1至nsP4)，其功能為複製全長度反向RNA。反向RNA可作為模板以供複製其他基因組RNA，及供合成亞基因組信使者RNA(26S mRNA)，其產量比基因組RNA高出10倍莫耳濃度，其可主導合成VEE結構蛋白質。結構蛋白質先轉譯成聚蛋白質，其再共同轉譯及在轉譯後裂解，以釋放病毒衣殼體(capsid)(C)蛋白質及兩種成熟被膜醣蛋白(E1及E2)。由於VEE為正向RNA病毒，因此可使用VEE之全長度cDNA純系，來產生RNA轉錄本，當導入敏感(susceptible)之細胞中時，將引發完整之病毒複製循環及產生感染性病毒。(Davis NL、Willis LV、Smith JF、Johnston RE(1989)，”由cDNA純系於活體外合成傳染性委內瑞拉馬腦炎病毒RNA：活的刪除突變株之分析(In vitro synthesis of infectious Venezuelan equine encephalitis virus RNA from a cDNA clone: analysis of a viable deletion mutant)，Virology 171：189-204)。
由DNA質體使用定點突變法，所製成之VEE病毒將在被膜醣蛋白中包含突變，造成減毒之表型。當接種至動物時，此等減毒之VEE變異株不會在小鼠、馬及靈長類動物中造成疾病或顯著之病毒血症，但可以誘發保護性免疫力來對抗以後毒性之VEE攻毒。(Davis N、Powell N、Greenwald G、Willis L、Johnson B、Smith J、Johnston R(1991)之”委內瑞拉馬腦炎病毒E2醣蛋白質基因之減毒突變：在全長度cDNA純系中構築單一及多重突變株(Attenuating mutations in the E2 glycoprotein gene of Venezuelan equine encephalitis virus：construction of single and multiple mutants in a full-length cDNA clone)”，Virology 183：20-31;Grieder F、Davis N、Aronson J、Charles P、Sellon D、Suzuki K、Johnston R(1995)，”由醣蛋白之單一胺基酸變化所造成委內瑞拉馬腦炎病毒所誘發疾病發展之特定限制(Specific restrictions in the progression of Venezuelan equine encephalitis virus-induced disease resulting from single amino acid changes in the glycoproteins)”，Virology 206：994-1006)。
同樣地，外來基因亦可嵌入cDNA質體之VEE結構蛋白質基因區，當導入細胞中時，來自此等質體之RNA轉錄本將會複製並表現異源性基因。這種自行擴增之複製子RNA將在細胞中主導合成大量外來基因產物，典型可達到總細胞蛋白質之15至20%。(Pushko P、Parker M、Ludwig GV、Davis N、Johnston RE、Smith JF(1997)之“來自減毒之委內瑞拉馬腦炎病毒之複製子輔助系統：異源性基因活體外表現及免疫接種於活體內對抗異源性病原體(Replicon-helper Systems from Attenuated Venezuelan Equine Encephalitis Virus：Expression of HeterologousGenes in Vitro and Immunization against Heterologous Pathogens in Vivo),Journal of Virology 239：389-401)。
由於複製子RNA不包含VEE之結構基因調配物，因此其係單一周期之繁殖缺陷RNA，且僅在其所進入之細胞中複製。可藉由在中途提供VEE之結構蛋白質基因，而使複製子RNA可以封裝進入RP(第1A及1B圖)。當細胞被複製子RNA及兩個分開之助手RNA(其共同編碼VEE結構蛋白質之完整互補)時，複製子RNA即已封裝進入RP。如上述Pushko之文獻。重要的是，僅複製子RNA封裝進入VRP，因為助手RNA缺乏包被作用所需之封裝序列。因此，RP具有繁殖缺陷，其可在培養物或活體內感染標靶細胞，可高度表現外來基因，但缺乏製造病毒顆粒(其可散播至其他細胞)時所需之VEE基因組之關鍵部份(亦即，VEE結構蛋白質基因)。這種“分裂助手”系統大幅降低經由RNA-RNA重組作用再生成完整基因組之機會，且藉由從助手RNA中移除26S發動子來進一步降低使用助手RNA進行功能性重組之可能性(Kamrud等人之“製造α病毒複製子顆粒之無發動子助手RNA之2010發展與特徵分析(2010 Development and Characterization of Promoterless Helper RNAs for Production of Alphavirus Replicon Particles)。Journal of General Virology. 91:pp. 1723-1727)。基於獨立及另一層安全性；已在醣蛋白助手中導入減毒突變(Pushko等人之1997 Journal of Virology 239：389-401)。第6圖顯示VEE複製子顆粒疫苗及封裝系統製程。所需核酸分子之表現可藉由導入空間子(spacer)元素至IRES/NOI匣上游但在26S發動子下游，而向上或向下變化(Kamrud等人，2007，“IRES元素之無發動子分析之α病毒複製子方法(Avirus Replicon Approach to Promoterless Analysis of IRES Elements)”，Virology 360(2)，pp. 376-387)。此外，若所需產物之基因可能產生毒性蛋白質時，則在導入胺基磷酸酯嗎啉寡聚物之同時讓複製子與助手RNA經由電穿孔法進入細胞中，以阻斷表現。在封裝RP期間，PMO阻斷所需基因之轉譯。
用於製造此等複製子之方法及其變化係熟悉此相關技藝之人士習知者。其示例之方法可參見美國專利案第6,156,558號，其揭示內容已以引用之方式完全併入本文中，及美國專利案第6,521,235號；第6,531,135號；及美國專利案第7,442,381號；第6,541,010號；第7,045,335號；及第5,792,462號，其揭示內容已以引用之方式完全併入本文中。
本發明之具體實施例中係使用α病毒載體及α病毒複製子顆粒。術語“α病毒”係如相關技藝上已知之習知定義，且包括屬於披膜病毒科(Togaviridae family)之各種不同α病毒成員。其包括α病毒，如：東方馬腦炎病毒(EEE)、委內瑞拉馬腦炎病毒(VEE)、沼澤地病毒、穆坎布(Mucambo)病毒、皮克孫納(Pixuna)病毒、西方馬腦炎病毒(WEE)、辛德畢斯(Sindbis)病毒、南非蟲媒病毒86號、生里基森林(Semliki forest)病毒、米德堡(Middelburg)病毒、屈公(Chikungunya)病毒、歐尼恩(O’ nyong-nyong)病毒、羅斯河(Ross River)病毒、巴馬森林(Barmah Forest)病毒、蓋他(Getah)病毒、鷺山(Sagiyama)病毒、貝巴魯(Bebaru)病毒、馬雅羅(Mayaro)病毒、烏納(Una)病毒、奧拉(Aura)病毒、沃達羅(Whataroa)病毒、巴班奇(Babanki)病毒、庫孜拉加奇(Kyzylagach)病毒、高地(Highlands)J病毒、摩根堡(Fort Morgan)病毒、恩杜姆(Ndumu)病毒及博吉河(Buggy Creek)病毒。該病毒基因組為單股信使者-正向RNA，於5’-末端經甲基化封端修飾，於3’-末端經可變長度之聚(A)片段修飾。包含單一病毒蛋白質之結構亞單位C係與二十面體的核衣殼體中RNA基因組結合。在病毒顆粒中，病毒衣殼體被已覆蓋規則排列之穿膜蛋白質突刺(其分別由兩種醣蛋白：E1與E2之雜二聚複合物組成)之脂質被膜包圍。參見Pedersen等人之J. Virol. 14：40(1974)。辛德畢斯(Sindbis)及生里基森林病毒(Semliki forest virus)均視為典型α病毒，並已經過深入探討。參見Schlesinger之“披膜病毒科與黃病毒科(The Togaviridae and Flaviviridae)”，Plenum Publishing Corp.,New York(1986)。亦已探討VEE病毒。參見頒予Davis等人之美國專利案案第5,185,440號。
如上述專利案所示，使用α病毒複製子載體製備複製子亞單位得到多肽及使用α病毒複製子顆粒製造保護性分子之方法係熟悉此相關技藝之人士習知方法。有許多種修飾方法可以採用，且任何使用複製子亞單位或複製子顆粒之方法均可用於本發明。在某些具體實施例中，由α病毒複製子RNA載體在宿主細胞中表現感興趣之基因及收集表現產物。在另一具體實施例中，將包含感興趣之基因之複製子RNA與編碼α病毒衣殼體蛋白質及醣蛋白之兩種助手RNA一起導入細胞。使複製子RNA封裝進入複製子顆粒。此複製子顆粒可為該保護性分子。
因此，在一具體實施例中，提供一種針對感染性之缺陷α病毒顆粒之系統，其中各顆粒包含α病毒複製子RNA，且其中複製子RNA包含α病毒封裝訊號、一個或多個異源性RNA序列(群)、及編碼至少一種α病毒結構蛋白質之序列，且其中複製子RNA進一步缺乏編碼至少一種α病毒結構蛋白質之序列；其中，由在允許性細胞在培養物繼代所測定，該族群不包含可檢測之有複製能力之α病毒顆粒。例如，美國專利案第6,531,135號(其揭示內容已以引用之方式完全併入本文中)，於一具體實施例出示一種RP系統，其使用助手細胞，於α病毒-允許性細胞中表現感染性之複製缺陷α病毒顆粒。助手細胞包括：(a)第一助手RNA，其編碼(i)至少一種α病毒結構蛋白質，及(ii)不編碼至少一種α病毒結構蛋白質；及(b)與第一助手RNA分離之第二助手RNA，該第二助手RNA(i)不編碼至少一種由第一助手RNA編碼之α病毒結構蛋白質，及(ii)編碼至少一種不由第一助手RNA編碼之α病毒結構蛋白質，因此，所有α病毒結構蛋白質可以共同組裝進入細胞之α病毒顆粒中。較佳為至少已自該第一助手RNA中刪除該α病毒封裝節段。
當製備此等複製子時，熟悉此相關技藝之人士可以進行許多變化。例如，在本發明所揭露之另一具體實施例中，助手細胞亦包括編碼α病毒封裝節段及嵌插之異源性RNA之複製子RNA。在該具體實施例中，助手細胞亦包括複製子RNA，且α病毒封裝節段可能(且較佳)已自第一助手RNA及第二助手RNA中刪除。例如，在該具體實施例中，助手細胞包括編碼α病毒封裝節段之複製子RNA及嵌插之異源性.RNA，且第一助手RNA包括α病毒E1醣蛋白及α病毒E2醣蛋白，第二助手RNA包括α病毒衣殼體蛋白質。在一具體實施例中，複製子RNA、第一助手RNA及第二助手RNA均在分開之分子上，且共同轉染至宿主細胞中。
在另一具體實施例中，助手細胞包括編碼α病毒封裝節段之複製子RNA、嵌插之異源性RNA、及由第二助手RNA編碼之α病毒衣殼體蛋白質，且該第一助手RNA包括α病毒E1醣蛋白及α病毒E2醣蛋白。因此，複製子RNA及第一助手RNA係在分開之分子上，且複製子RNA及第二助手RNA係在同一分子上。異源性RNA包含外來RNA。
編碼結構蛋白質之RNA(亦即，第一助手RNA及第二助手RNA)可能宜包括一種或多種減毒突變。在一具體實施例中，第一助手RNA與第二助手RNA中至少一者包括至少一種減毒突變。於細胞內進行RNA重組作用時，減毒突變提供之優勢在於讓結構基因與非結構基因將一起產生減低毒性之病毒。
另一態樣提供製造感染性之複製缺陷α病毒顆粒之方法。該方法包括使用複製缺陷之複製子RNA轉染如上述之助手細胞，在轉染細胞中製造α病毒顆粒，然後從細胞中收集α病毒顆粒。複製子RNA編碼α病毒封裝節段及異源性RNA。轉染之細胞進一步包括如上述之第一助手RNA及第二助手RNA。
至於另一態樣，提供一組RNA，供表現感染性之複製缺陷α病毒。該組RNA包含以下組合：(a)編碼發動子序列之複製子RNA、嵌插之異源性RNA，其中，已自該複製子RNA中刪除編碼α病毒之至少一種結構蛋白質之RNA，因此該複製子RNA為複製缺陷、及(b)與複製子RNA分開之第一助手RNA，其中，第一助手RNA在中途編碼已自該複製子RNA中刪除之結構蛋白質，且其可包括或不包括發動子序列。在此具體實施例中，較佳為該編碼至少一種結構蛋白質之RNA節段係位於不同於第一助手RNA之RNA上。因此，例如，該組RNA可包括複製子RNA，該複製子RNA包括編碼α病毒封裝序列之RNA、嵌插之異源性RNA、及α病毒衣殼體蛋白質，但其中已刪除α病毒E1醣蛋白與α病毒E2醣蛋白二者；且該第一助手RNA包括編碼α病毒E1醣蛋白與α病毒E2醣蛋白二者之RNA。
在另一具體實施例中，該組RNA亦包括與該複製子RNA及第一助手RNA分開之第二助手RNA。在此具體實施例中，第二助手RNA在中途編碼至少一種結構蛋白質，其不同於由複製子RNA編碼及由第一助手RNA編碼之結構蛋白質。因此，例如，該組RNA可包括複製子RNA，該複製子RNA包括編碼α病毒封裝序列之RNA、及嵌插之異源性RNA；第一助手RNA，包括編碼發動子序列之RNA、及編碼α病毒E1醣蛋白與α病毒E2醣蛋白二者之RNA；及第二助手RNA，包括編碼α病毒衣殼體蛋白質之RNA，其中複製子RNA、該第一助手RNA與第二助手RNA係彼此在分開之分子上。
至於另一態樣，提供一種醫藥調配物，包括在醫藥上可接受之載劑中呈免疫有效量之如上述感染性α病毒顆粒。參見例如：‘135專利案第2段第10行至第11段第52行，其包括實施例1至5。
本文所用“結構蛋白質”或“α病毒結構蛋白質”一詞係指製造顆粒所需之經編碼的蛋白質，其中包含複製子RNA，且包括衣殼體蛋白質、E1醣蛋白及E2醣蛋白。如上述，α病毒之結構蛋白質分佈在一種或多種助手RNA中(亦即，第一助手RNA與第二助手RNA)。此外，一種或多種結構蛋白質可能位在與複製子RNA相同之RNA分子上，但其限制條件為該複製子RNA已刪除至少一種結構蛋白質，以使複製子及所得α病毒顆粒為複製缺陷。本文所用術語“已刪除”或“刪除”意指完全刪除特定節段或刪除足夠份量之該特定節段，以使該節段在依據標準用法下，無法操作或無功能性。參見例如：Temin等人之美國專利案案第4,650,764號。本文所用術語"複製缺陷"意指複製子RNA在沒有助手RNA存在之宿主細胞中無法製造顆粒。亦即，該宿主細胞無法製造其他顆粒。由於複製子RNA不包括製造顆粒所需之所有α病毒結構蛋白質，該複製子RNA為複製缺陷，因為其中已刪除至少一種所需之結構蛋白質。
用於製造感染性之複製缺陷α病毒顆粒之助手細胞包含如上述之一組RNA。該組RNA原則上包括第一助手RNA與第二助手RNA。該第一助手RNA包括編碼至少一種α病毒結構蛋白質，但不編碼所有α病毒結構蛋白質之RNA。換言之，該第一助手RNA不編碼至少一種α病毒結構蛋白質；亦即，已自第一助手RNA中刪除至少一種α病毒結構蛋白質基因。在一具體實施例中，第一助手RNA包括編碼α病毒E1醣蛋白之RNA，其已自第一助手RNA中刪除α病毒衣殼體蛋白質與α病毒E2醣蛋白。在另一具體實施例中，第一助手RNA包括編碼α病毒E2醣蛋白之RNA，其已自第一助手RNA中刪除α病毒衣殼體蛋白質與α病毒E1醣蛋白。在第三較佳具體實施例中，第一助手RNA包括編碼α病毒E1醣蛋白與α病毒E2醣蛋白之RNA，其已自第一助手RNA中刪除α病毒衣殼體蛋白質。第二助手RNA包括編碼病毒衣殼體蛋白質(其不同於第一助手RNA所編碼之結構蛋白質)之RNA。在該具體實施例中，該第一助手RNA包括僅編碼α病毒E1醣蛋白之RNA，該第二助手RNA可包括編碼已自第一助手RNA中刪除之α病毒衣殼體蛋白質與α病毒E2醣蛋白中之一者或二者之RNA。在該具體實施例中，該第一助手RNA包括僅編碼α病毒E2醣蛋白之RNA，該第二助手RNA可包括編碼已自第一助手RNA中刪除之α病毒衣殼體蛋白質與α病毒E1醣蛋白中之一者或二者之RNA。在該具體實施例中，第一助手RNA包括編碼α病毒E1醣蛋白與α病毒E2醣蛋白二者之RNA，第二助手RNA可包括編碼已自第一助手RNA中刪除之α病毒衣殼體蛋白質之RNA。
在一具體實施例中，已自至少第一助手RNA中刪除封裝節段或“包被作用序列”。在較佳具體實施例中，已自第一助手RNA及第二助手RNA二者中刪除封裝節段。
在一具體實施例中，已自第一助手RNA及第二助手RNA二者中刪除該封裝節段，較佳為助手細胞中除了包含第一助手RNA及第二助手RNA外，尚包含複製子RNA。該複製子RNA編碼該封裝節段及嵌插之異源性RNA。嵌插之異源性RNA可能為編碼蛋白質或肽之RNA。該嵌插之異源性RNA可編碼宿主(α病毒-允許性細胞)需要表現之蛋白質或肽，且包括在該細胞中表現該蛋白質或肽所需之發動子及調節節段。
例如，在本發明之一較佳具體實施例中，助手細胞包括一組RNA，其包括：(a)複製子RNA，包括編碼α病毒封裝序列之RNA及嵌插之異源性RNA；(b)第一助手RNA，包括編碼α病毒E1醣蛋白與α病毒E2醣蛋白之RNA；及(c)第二助手RNA，其包括編碼α病毒衣殼體蛋白質之RNA，因此α病毒E1醣蛋白、α病毒E2醣蛋白與衣殼體蛋白質共同組裝進入宿主細胞之α病毒顆粒中。
在另一具體實施例中，複製子RNA及第一助手RNA係在分開之分子上，及複製子RNA及第二助手RNA係在同一分子上，因此第一分子(亦即，第一助手RNA)包括編碼至少一種(並非所有)所需α病毒結構蛋白質之RNA，及第二分子(亦即，複製子RNA及第二助手RNA)包括編碼封裝節段之RNA、嵌插之異源性DNA及衣殼體蛋白質。因此，該衣殼體蛋白質係由第二助手RNA編碼，但第二助手RNA卻與複製子RNA共同位於第二分子上。例如，在本發明之一較佳具體實施例中，助手細胞包括一組RNA，其包括：(a)複製子RNA，其包括編碼α病毒封裝序列之RNA、嵌插之異源性RNA及α病毒衣殼體蛋白質；及(b)第一助手RNA，其包括編碼α病毒E1醣蛋白與α病毒E2醣蛋白之RNA，因此，該α病毒E1醣蛋白、α病毒E2醣蛋白及衣殼體蛋白質共同組裝進入宿主細胞之α病毒顆粒中。
在本發明之一具體實施例中，編碼α病毒結構蛋白質(亦即，衣殼體)、E1醣蛋白及E2醣蛋白之RNA包含至少一種減毒突變。本文所用“減毒突變”及“減毒胺基酸”一詞意指依據相關技藝上之標準術語，該核苷酸突變或編碼此等突變之胺基酸降低其在宿主中致病之可能性(亦即，喪失毒性)，參見例如：B. Davis,等人之微生物學132(Microbiology 132)(第3版，1980)，不論該突變為取代突變或為讀碼框內之刪除突變。“減毒突變”一詞不包括可能導致病毒死亡之突變。因此，根據此具體實施例中，第一助手RNA與第二助手RNA中至少一者包括至少一種減毒突變。在更佳具體實施例中，第一助手RNA與第二助手RNA中至少一者包括至少兩種或多種減毒突變。該多種減毒突變可能位於第一助手RNA或第二助手RNA上，或其可能隨機分佈一種或多種減毒突變在第一助手RNA上，及分佈一種或多種減毒突變在第二助手RNA上。適當之減毒突變將隨所採用之α病毒決定。例如，當α病毒為VEE時，合適之減毒突變可能選自下列所組成群組者：E2胺基酸位置76之密碼子，其係特異化之減毒胺基酸，較佳為以離胺酸、精胺酸或組胺酸作為E2胺基酸76；E2胺基酸位置120之密碼子，其係特異化之減毒胺基酸，較佳為以離胺酸作為E2胺基酸120；E2胺基酸位置209之密碼子，其係特異化之減毒胺基酸，較佳為以離胺酸、精胺酸或組胺酸作為E2胺基酸209；E1胺基酸272之密碼子，其係特異化之減毒突變，較佳為以蘇胺酸或絲胺酸作為E1胺基酸272；E1胺基酸81之密碼子，其係特異化之減毒突變，較佳為以異白胺酸或白胺酸作為E1胺基酸81；及E1胺基酸253之密碼子，其係特異化之減毒突變，較佳為以絲胺酸或蘇胺酸作為E1胺基酸253。
在另一具體實施例中，α病毒為南非蟲媒病毒編號86(S.A.AR86)，合適之減毒突變可能選自下列所組成群組者：nsP1胺基酸位置538之密碼子，其係特異化之減毒胺基酸，較佳為以異白胺酸作為nsP1胺基酸538；E2胺基酸位置304之密碼子，其係特異化之減毒胺基酸，較佳為以蘇胺酸作為E2胺基酸304；E2胺基酸位置314之密碼子，其係特異化之減毒胺基酸，較佳為以離胺酸作為E2胺基酸314；E2胺基酸位置376之密碼子，其係特異化之減毒胺基酸，較佳為以丙胺酸作為E2胺基酸376；E2胺基酸位置372之密碼子，其係特異化之減毒胺基酸，較佳為以白胺酸作為E2胺基酸372；nsP2胺基酸位置96之密碼子，其係特異化之減毒胺基酸，較佳為以甘胺酸作為nsP2胺基酸96；及nsP2胺基酸位置372之密碼子，其係特異化之減毒胺基酸，較佳為以纈胺酸作為nsP2胺基酸372。適合使用其他α病毒之具體實施例之合適減毒突變係熟悉此相關技藝之人士習知者。可能依據已知製程，於編碼RNA之cDNA上進行定點突變，將減毒突變導入RNA中。參見Kunkel,Proc. Natl. Acad. Sci. USA 82：488(1985)。或者，可能依據已知製程，於編碼RNA之cDNA上置換同源性限制酶切割片段，將減毒突變導入RNA中。
在一具體實施例中，保護性分子可為感興趣之核酸分子，亦指感興趣之基因，並指可能代表或不代表微生物完整基因之核酸分子。本文所用術語核酸或聚核苷酸係指去氧核糖核苷酸或核糖核苷酸及其呈單股或雙股型式之聚合物。用於製造疫苗之核酸分子可與自樣本所得之序列相同，或可為依據樣本所得序列經過合成後製得之序列。因此，該術語包括RNA及DNA，其可為基因或其一部份、cDNA、合成之聚去氧核糖核酸序列等，且可為單股或雙股，以及包括DNA/RNA雜合體。此外，本文所用術語包括天然存在之核酸分子，其可自細胞中單離，亦可為合成之分子，其可例如：採用化學合成方法或酵素方法(如：聚合酶鏈反應(PCR))製備。除非另有說明，否則該術語涵括包含天然核苷酸之已知類似物之核酸，其具有類似參考核酸之結合性質，且可類似天然存在核苷酸之方式進行代謝。除非另有說明，否則特定核酸序列亦可能涵括其保留性修飾之變異株(例如：簡併密碼子取代)及互補序列，以及明確指示之序列。明確言之，可能讓產生之序列中一個或多個選定(或所有)密碼子之第三個位置被混合鹼基及/或去氧肌苷殘基取代而達成簡併密碼子取代(Batzer等人之(1991)Nucleic Res. 19：5081；Ohtsuka等人之(1985)J. Biol. Chem. 260：2605-2608；Cassol等人之(1992)；Rossolini等人之(1994)Mol. Cell Probes 8：91-98)。術語核酸可與基因、cDNA及基因所編碼之mRNA交換使用。
保護性分子亦可為RNA干擾性分子或產生RNA干擾性分子之分子，或當投予動物時，可於動物中編碼可產生保護性及/或免疫反應之多肽或其片段之分子。如上述，其有時候亦稱為保護性分子或保護性抗原決定部位。在某些具體實施例中，若提供多肽時，該多肽可能為至少2個、3個、4個、5個、6個、7個、8個、9個或10個或更多個胺基酸。肽通常視為超過50個胺基酸。當提及根據本發明之多肽時，術語“片段”、“衍生物”及“同源物”意指基本上保留與該多肽相同生物功能或活性之多肽，亦即，其可作為抗原及/或提供治療及/或對抗疾病之保護作用。此等片段、衍生物及同源物可依據其保留該多肽一種或多種生物活性之能力(亦即，作為保護劑及/或提供治療及/或對抗病原體之保護作用)來選擇。因此，同源物包括來自基本上保留與該多肽相同生物功能或活性之不同菌株或屬種之多肽。本發明之多肽疫苗可能為重組體多肽、天然多肽或合成多肽，較佳為重組體多肽。
因此保護性分子可能為自生物樣本得到之感興趣之核酸分子，不論自感興趣之核酸分子直接得到或由其製造(合成性)均可；其所製造之多肽；干擾性RNA，如反股或dsRNA；製造該反股或dsRNA之DNA；包含該核酸分子、反股或dsRNA之複製子顆粒，或包含該疫苗之組合。動物不一定會反應產生抗體，但動物之罹病率或死亡率將會因投予疫苗而下降，此點將於本文中進一步說明。
本發明可應用於會對水生無脊椎動物造成不良影響之任何微生物/病原菌，且不限於任何特定此等微生物。特定言之，本發明提供免疫接種之方法，以對抗或預防或減輕感染到病原生物體之動物所導致之症狀。因此，當提及微生物時，意指包括任何此等致病源，例如：病毒、細菌、真菌、或原生動物寄生蟲。本發明之疫苗可提供免於疾病之保護作用，亦即，使動物免於所有或某些對健康不良影響之保護作用。
在不希望受到限制下，水生無脊椎動物之致病源之實例包括：微核糖核酸病毒目(Picornavirales)病毒，如雙核糖核酸病毒科(Marnavirdae)及二順反子病毒科(Dicistronvirdae)；嵌杯病毒科(Calciviridae)，如感染無脊椎動物之聖來加拉海獅(San Miguel sea lion)病毒(SMSV)；野田病毒科(Nodaviridae)，如影響蝦之南美白對蝦(Penaeus vannamei)野田病毒科(Nodaviridae)(PvNV)、影響蝦及明蝦之虹彩病毒(Iridovirus)；桿狀套病毒科(Ronivirdae)，如影響蝦、明蝦及磷蝦之黃頭病毒(Yellow Head Virus)(YHV)；布尼亞病毒科(Bunyaviridae)病毒，如影響蝦之毛利病毒(Mourilyan virus)(MoV)；雙核糖核酸病毒科(Birnaviridae)(如會影響牡蠣之感染性胰壞死病毒(IPNV))；造成牡蠣蝦苗面盤病毒疾病(OVVD)之二十面體病毒；感染牡蠣及造成奴卡氏菌病之奴卡氏菌(Nocardia sp.)細菌、感染蚌類之鰻弧菌(Vibrio anguilarum)、溶藻弧菌(V. alginolyticus)及塔氏弧菌(V. tubiashii infecting)；感染蝸牛之親水產氣單胞菌(Aeromonas hydrophila)；感染蚌類軟體動物之立克次菌(Rickettsiae)、披衣菌(Chlamydiae)及黴漿菌(Mycoplasmis)；感染蛤蜊之毛霉亮發菌(Leucothrix mucor)；感染蚵岩螺之密爾福海壺菌(Haliphthoros milfordensis)；感染蛤蜊之細囊黴菌(Leptolegnia)或海生軍團桿菌(Leptoleginella marina)；感染軟體動物之海生鞭孢簇蟲(Perkinsus marinus meront)及派金蟲(Perkinsus atlanticus)；感染軟體動物之單孢子蟲屬(Haplosporidium sp.)、波納米亞蟲屬(Bonamia sp.)及尼氏明欽蟲(Minchinia sp.)；感染墨魚、海蛞蝓(nudibranch)及章魚之破囊壺菌(Thraustochytrid)，與感染扇貝之派金蟲(Perkinsus quqwadi)。
在不希望受到限制下，蝦之此等致病源之實例包括白斑症病毒(WSSV)陶拉(Taura)症候群病毒(TSV)、感染性壞疽病病毒(IMNV)、感染性真皮及造血壞死病毒(IHHNV)、或藍蝦(Penaeus stylirostris)濃稠病毒(densovirus)(PstDV)、斑節蝦(penaeid shrimp)之桿狀病毒(BP)、斑節蝦(penaeid shrimp)棒狀病毒(Rhabdovirus)(RPS)、鰓相關病毒(Gill-associated virus)(GAV)、黃頭症病毒(YHV)、淋巴性器官相關病毒(LOVV)、淋巴性細小DNA病毒(parvolikevirus)病毒疾病(LPV)、肝胰腺細小DNA病毒(HPV)、或草對蝦(Penaeus monodon)濃稠病毒(densovirus)(PMDV)、桿狀病毒中腸腺壞死病毒(BMN)、草蝦桿狀病毒(Monodon baculovirus)(MBV)、腸呼吸道病毒(Reo like virus)疾病(REO)、棒狀病毒(Rhabdo virus)(RPS)、淡水長臂大蝦(Macrobrachium rosenbergii)野田病毒(nodavirus)(MrNV)、雷辛病毒(Laem-Singh virus)(LSNV)、毛利病毒(Mourlyan virus)(MoV)、創傷弧菌(Vibrio vulnificus)、腸炎弧菌(Vibro parahaemolyticus)、鰻弧菌(Vibrio anguillarinum)、對蝦弧菌(Vibrio penaeicida)、壞死性肝胰腺炎細菌(Necrotizing Hepatopancreatitis Bacterium)(NHPB)、哈威弧菌(Vibrio harveyi)、螺原體(Spiroplasma)、分枝桿菌(Mycobacterium)、鏈球菌(Streptococcus spp.)、纖毛蟲(Ciliates)、簇蟲(Gregarines)、寄生蠕蟲(Parasitic Helminths)、鐮胞菌(Fusarium spp.)、微孢子蟲(Microsporidia)及單孢子蟲(Haplosporidia)。
亦重要的是保護水生動物(特定言之蝦與其他養殖水生無脊椎動物)免於疾病之方法為針對疾病快速製造疫苗。本發明所說明之複製子顆粒技術即可以藉由將感興趣之基因導入複製子顆粒中產生快速反應，以有效且快速地製造疫苗。(Vander Veen等人之”針對新H1N1之有效豬疫苗之快速發展(Rapid development of an efficacious swine vaccine for novel H1N1)”。PLoS Curr.2009年10月29日；1：RRN1123.)
本發明特別適用於保護蝦免於疾病，因為蝦(特定言之養殖蝦)需要疫苗。該疾病之其中一種為例如：白斑症病毒(WSSV)。目前製造法著重於病原體排除法，其係飼養無特定病原菌(SPF)之蝦苗，排除雜質，水經過過濾，以預防病原體進入，及在孵化池位置嚴格保持生物安全性。只要保持排除病毒，均為有效作法，但由於WSSV在入海口水蝦養殖區中占優勢，此作法仍需接受極大挑戰。由於未曾接受處理之敏感SPF族群出現急性死亡率時，仍會造成巨大經濟損失。
過去曾實驗性採用之數種控制策略曾展現某種可靠程度。印度明蝦(Fenneropenaeus indicus)曾藉由經口投予經福馬林處理而失活化之WSSV病毒顆粒而受到保護。(Singh,I. S. B.,Manjusha,M.,Pai,S. S.,Philip,R.,2005.“經口投與失活化之WSSV可保護印度明蝦免於WSSV所誘發之疾病(Fenneropenaeus indicus is protectedfrom WSSV-induced disease by oral administration of inactivated WSSV)”。Disease of Aquatic Organisms 66,265-270)。然而，此效果似乎會有變化且當經口投藥時，卻無法保護太平洋白蝦(Litopenaus vannamei)，其係主要水產養殖物種(Loy與Harris之未公告文獻)。在同源物攻毒試驗中，接種疫苗組與對照組之間之死亡率或定量性即時PCR病毒基因組套數似乎沒有顯著差異(Loy與Harris之未公告文獻)。
針對WSSV被膜蛋白質之蛋白質亞單位疫苗已顯示可對蝦及螯蝦二者有效提供保護作用，免於WSSV感染。WSSV包含4個主要被膜蛋白質，沒有與其他病毒蛋白質同源之已知同源物；此等包括VP28、VP26、VP24及VP19。VP28存在於外膜且涉及細胞入侵。(McClennen,C.之“白斑症候群病毒，對拉丁美洲養殖蝦業發展之經濟、環境與技術關係(The Economic,EnVironmental and Technical Implications on the Development of Latin American Shrimp Farming)”。2004年法律與外交碩士論文(Master of Arts in Law and Diplomacy Thesis. 2004)，2004年，付印中)。VP28抗血清已顯示可於活體內中和病毒(McClennen，如上述文獻)。近來之研究已證實，這四種主要被膜蛋白質經由數種配對之蛋白質交互作用及一種自行連結作用，結合形成複合物(VP28)。(Zhou,Q.,Xu,L.,Li,H.,Qi,Y.-P.,Yang,F.,2009.“白斑症病毒之四種主要被膜蛋白質結合形成複合物(Four Major Envelope Proteins of White Spot Syndrome Virus Bind To Form A Complex)”。Journal of Virology 83,4709-4712)。
由VP28與VP19組成之亞單位疫苗可提供保護作用，免於WSSV感染，然而該保護作用期限短，因此無法在投藥後25天仍提供保護作用。(Witteveldt,J.,Vlak,J.M.,Van Hulten,M. C. W.,2004.“使用WSSV亞單位疫苗保護草對蝦對抗白斑症病毒(Protection of Penaeus monodon against white spot syndrome virus using a WSSV subunit vaccine)”。Fish & Shellfish Immunology 16,571-579)。針對各種不同WSSV被膜蛋白質之DNA疫苗亦已經過證實可用於防止感染。將針對VP28與VP281之裸DNA疫苗注射至草對蝦(Penaeus monodon)時，可證實其觀察到保護作用長達7周。(Rout,N.,Kumar,S.,Jaganmohan,S.,Murugan,V.,2007.”編碼病毒被膜蛋白質之DNA疫苗為黑蝦提供對抗WSSV之保護性免疫力(DNA vaccines encoding viral envelope proteins confer protective immunity against WSSV in black tiger shrimp)。Vaccine 25,2778-2786)。然而，個別注射裸DNA並不是商業上理想的作法，因為耗費成本及考慮田野中動物個別注射之可行性。Ning等人已證實，表現VP28之沙門氏鼠傷寒桿菌(Salmonella typhimurium)可在經口投藥後提供對抗感染之保護作用長達25天。然而，細菌僅留在螯蝦中7天。Fu等人顯示，表現VP28之枯草桿菌(Bacillus subtilis)孢子及營養性細胞可在投藥後保護淡水螯蝦(Procambarusclarkii)對抗WSSV感染達14天，且經過孢子處理之螯蝦存活率高於接受營養性細胞之處理。然而，使用減毒細菌表現系統仍有問題。其仍舊需要導入有能力回復毒性且可能成為人類病原體之活生物體。由於目前所有白斑症病毒之免疫接種技術仍有問題，因此吾等提出一種不同之疫苗接種法。
過去公開的工作重點在於dsRNA或針對此等病毒疾病使用疫苗或受體“阻斷劑”傳遞蛋白質。，本文在一具體實施例中，使用載體傳遞特定病毒序列之序列互補之單股RNA，當感染時會產生RNA/RNA互補結構。一具體實施例涉及傳遞此RNA或利用α病毒所衍生之複製子顆粒載體來使用病原菌之核酸分子。另一具體實施例僅使用dsRNA或含於複製子顆粒載體中。
感染性壞疽病病毒(IMNV)為蝦之另一種有問題之疾病，其係無被膜之小型(40 nm)二十面體單節段dsRNA病毒，且係整體病毒科(Totiviridae)之成員。(Poulos,B.T.,Tang,K. F. J.,Pantoja,C. R.,Bonami,J. R.,Lightner,D. V.,2006。“斑節蝦之感染性壞疽病病毒之純化與特徵分析(Purification and characterization of infectious myonecrosis virus of penaeid shrimp)”。Journal of General Virology 87,987-996)。注射經過蔗糖密度梯度純化之病毒顆粒可在無特定病原菌(SPF)動物中再現此疾病之結果驗證李弗氏(Rivers)假說(Poulos等人之2006，如上述文獻)。IMNV疾病之特徵在於遠端腹部節段之骨骼肌壞死，隨後即死亡，尤其在經過急性逆境壓力後。在組織病理學上，動物證實其特徵為骨骼肌凝固性壞死，在肌肉纖維之間出現液體累積，並由於類球體之累積，使淋巴性器官出現顯著肥大(Poulos等人之2006年，如上述文獻)。IMNV首先在2003年時發現，當時巴西東北部於2002年發生高死亡率，且動物之尾部肌肉出現壞死。據估計，單在2003年，IMNV即造成巴西數百萬美元的損失(Lightner,D. V.,1999.”斑節蝦病毒TSV、IHHNV、WSSV與YHV：美洲目前狀態，可採用之診斷法幾處理策略(The Penaeid Shrimp Viruses TSV,IHHNV,WSSV,and YHV：Current Status in the Americas,Available Diagnostic Methods,and Management Strategies)”。Journal of Applied Aquaculture 9,27-52)。印尼最近已在2006年證實IMNV，並出現散播至全世界的真正危機。由於目前沒有療法或疫苗，且對此病毒流行病學之了解很有限，因此恐將嚴重衝擊商業蝦養殖業。(Senapin,S.、Phewsaiya,K.、Briggs,M.、Flegel,T. W，.2006.“採用基因組定序法及利用替代性RT-PCR檢測法證實印尼暴發感染性壞疽病病毒(IMNV)(Outbreaks of infectious myonecrosis virus(IMNV)in Indonesia were confirmed by genome seduencing and use of an alternative RT-PCR detection method)”。Aquaculture 266,32-38)。從前暴發疫情時，死亡率為40%至70%，即使大幅降低放養密度，仍嚴重衝擊生產業。飼料轉換率(FCR)由正常之1.5向上變化至4.4。(Andrade,T. P. D.、Srisuvan Thinnarat、Tang,K. F. J.、Lightner,D. V.，2007。“使用TaqMan探針檢測及定量感染性壞疽病病毒(IMNV)之實時轉錄聚合酶鏈反應分析法(Real-time reverse transcription polymerase chain reaction assay using TaqMan probe for detection and quantification of Infectious myonecrosis virus(IMNV))”Aquaculture 264,9-15)。此現象與旱季期間之季節波動有關，且與IMNV暴發疫情最相關之因素為餵養時間長及放養密度高。(Arns da Silva,V.,dos Santos,F. L.,Bezarro,S. S.,Pedrosa,V. F.,Mendes,P.,Mendes E.S.,2010，“巴西Pernambuco之養殖白蝦之感染性壞疽病之數個季節調查結果(A multi-season survey for infectious myonecrosis in farmed shrimp,Litopenaeus vannamei,in Pernambuco,Brazil)”。Journal of Invertebrate Pathology 104,161-165)。由於此疾病目前及未來可能嚴重衝擊蝦產業，應謹慎發展疫苗或防治對策。此工作之目標在於發現一種RNAi啟動序列，當以低劑量接種至動物體內時，應產生保護性反應，並可在接種後長期保持。
IMNV基因組包含兩個開放讀碼框(ORF)。IMNV基因組已揭示於Nibert等人(2007)之Journal of General Virology 88：1315-1318，及Poulos等人(2006)之GenBank登錄號AY570982及Senapin等人(2007)之Genbank登錄號EF061744。這兩個GenBank序列之差異在於一個核苷酸，其中Poulos等人之序列為7560 bp，而Senapin等人之序列則額外嵌插腺嘌呤之核苷酸，長度為7561 bp。Poulos等人之序列列示於SEQ ID NO：66，及Senapin之序列列示於SEQ ID NO：67。Senapin之序列在基因組序列之bp 7431處包含嵌插腺嘌呤之單一核苷酸。由Poulous等人之ORF1序列編碼之多肽列示於SEQ ID NO：68，及由Senapin之ORF1序列編碼之多肽列示於SEQ ID NO：69。由Poulous等人之ORF2序列編碼之多肽列示於SEQ ID NO：70(GenBank No. AAT67231.1)及由Senapin等人之序列編碼之多肽列示於SEQ ID NO：71(GenBank ABN05325.1)。此範圍之差異並非本文工作之目標。ORF1編碼主要衣殼體蛋白質(SEQ ID NO：66或67之核苷酸136-4953，且稱為SEQ ID NO：72)及ORF2(核苷酸5241-7451，SEQ ID NO：73)編碼736個胺基酸依賴RNA之RNA聚合酶(RdRp)(Poulos等人，2006，如上述文獻；亦參見Nibert，2007，如上述文獻)。ORF1編碼179 kDa蛋白質(1605個胺基酸)，包括主要衣殼體蛋白質之N-末端序列。衣殼體直徑約400埃(angstroms)之等軸體(isometric)。近來IMNV基因組之研究已發現“似2A”裂解及“多變之七元體”，其可能產生衣殼體蛋白質-RdRp融合蛋白質及ORF1之三個裂解蛋白質。其等稱為“肽1”、“肽2”及“肽3”。此等蛋白質之角色有一些推論。“肽1”跨越鹼基136-415(SEQ ID NO：74，為10 kDa，在ORF 1 N-末端之93個胺基酸區，與已知dsRNA結合性蛋白質具有共通之序列相似性，且可能涉及宿主免疫壓制作用(Tang等人，2008，”感染性壞疽病病毒具有類似全病毒之120個亞單位衣殼體，但具有五重軸之纖維複合物(Infectious myonecrosis virus has a totivirus-like 120-subunit capsid,but with fiber complexes at the fivefold axes)。PNAS 105：17526-17531)。“Pep2”為32kDa之284個胺基酸(aa)產物，跨越鹼基415-1266(SEQ ID NO：75)及“Pep3”為38kDa之327個胺基酸產物，跨越鹼基1267-2247(SEQ ID NO：76)，共同代表ORF1之第一段704個胺基酸，據推論可能為變性凝膠上所見到之次要蛋白質，然而此仍為推測之結果(Tang等人，2008，如上述文獻)。
選擇三個標靶區(跨越病毒基因組之長度)作為產生dsRNA之初始標靶(參見第2圖)。第一區為相當於ORF1讀碼框1之N-末端區之序列，預計包含兩個共同轉譯裂解產物，跨越肽1及2(dsRNA95-474，本文稱為SEQ ID NO：1)。除此之外，亦選擇主要衣殼體蛋白質(MCP)(dsRNA3764-4805，本文稱為SEQ ID NO：4)及依賴RNA之RNA聚合酶(RdRp)dsRNA5518-6388(本文稱為SEQ ID NO：5)來產生dsRNA。肽1(93個胺基酸)及2(284個胺基酸)係分別由ORF 1讀碼框1內IMNV基因組之核苷酸136-415(SEQ ID NO：74)及415-1266(SEQ ID NO：75)編碼，仍未分析其功能特徵。肽1與過去說明之dsRNA結合性蛋白質有共通之序列同源性。IMNV之主要衣殼體蛋白質(909個胺基酸)係由ORF 1讀碼框1內核苷酸2227-4953(SEQ ID NO：77)編碼。依賴RNA之RNA聚合酶(736個胺 基酸)係由ORF2，讀碼框3內核苷酸5241-7451(SEQ ID NO：78)編碼。非特異性控制dsRNA之設計為相當於加強綠色螢光蛋白質(eGFP)之外源性序列。較短之dsRNA係設計在編碼肽1之IMNV基因組內(第2圖)。兩種dsRNA均產生原始dsRNA95-474(SEQ ID NO：1)之5’(bp193-474,SEQ ID NO：2)或3’(bp95-376,SEQ ID NO：3)末端100bp截型。
製造此等疫苗之工具與方法係熟悉此相關技藝之人士習知者，且已知此等製法有許多種變化及方式，並期待進一步發展。下列實施例說明許多種可用於製造及投予此等疫苗之選項。有關製造及投予本發明之疫苗之各種不同方式之討論已說明於Harris等人之美國專利案第7,622,254號，其揭示內容已以引用之方式完全併入本文中。
製造此等疫苗之一種方法為製造自體疫苗，亦即，採用一種製造可保護動物免於生物型病原性微生物不良作用之疫苗之方法。本文揭示內容及美國專利申請案“快速製造動物之改良疫苗之方法(Method of rapidly producing improved vaccines for animals)”(USSN_______，其主張2010年10月27日申請之美國臨時申請案USSN 61/407,297之優先權權益)說明一種由自體來源製造疫苗之方法。各自揭示內容已以引用之方式完全併入本文中。下列施實例亦說明且顯示感興趣之核酸分子及保護性分子之自體來源。總言之，在自體製程中，自動物取得曾曝露過微生物之生物樣本，從樣本中得到感興趣之微生物之核酸分子或其片段，並由該感興趣之核酸製造保護性分子。保護性分子可為包含感興趣之核酸分子之序列或其片段之核酸分子，可能為由感興趣之核酸分子製造之多肽或片段，或可能為與該感興趣之核酸分子呈反股或形成相當於所有或一部份感興趣之核酸分子之dsRNA之RNA分子，或製造該RNA分子之核酸分子，或包含或製造該RNA分子之複製子顆粒。此等製法中，提供一種可極快速製造且可解決保護動物對抗新型或演化之生物型問題之改良疫苗，來保護動物對抗病原菌。該疫苗為自體疫苗，亦即，可由出現在特定農場、動物群、牛群、池塘或地理區之感染源之核酸分子製造。不需要在實驗室中單離感染源即可製得基因。其係由已曝露過生物型病原性微生物之動物或動物群中所存在之微生物(群)之核酸製造。此等可得到該核酸分子之動物為彼等生活在預期可能會再曝露到相同病原菌生物型之環境之動物。例如(但不限於)：若此等動物為畜牧動物，則其可能棲息在草原、牧場、農場、池塘或地區，且充份接觸，因此熟悉此相關技藝之人士認為此等動物將會接觸或可能接觸到相同病原菌。當製備自體疫苗時，此等動物將接受疫苗接種。如美國獸醫學會(the American Veterinary Medical Association(AVMA))所提供者，相鄰或非相鄰族群均視為有風險之族群，亦可接種疫苗。參見www. avma. org/issues/policy/autogenous_biologics.asp“自體生物製劑使用指南(Guidelines for Use of Autogenous Biologics”(監督：COBTA；EB核准-1993；重申11/97；重申4/01；修正3/06，11/09)。當提及自體疫苗意指包括AVMA之目前定義，其中動物視為有風險，可接種疫苗。此外，個別動物可能為針對該動物製造自體疫苗之單一動物。感興趣之微生物核酸分子之來源為任何合宜生物樣本，如：預期含有該微生物核酸之動物組織、體液或細胞，不論血液、皮膚、器官組織、體液等均可。
術語生物型係指可藉由病原菌之一種或多種生物特徵與其他病原性物種成員區分。本發明特別適用於提供一種快速製造適用於病原菌之不同及/或新型生物型之疫苗，並在一具體實施例中特別適用於已在特定已曝露或可能曝露到該生物型之動物族群中發現該生物型。目前方法中，可取得之疫苗可能無法幫助對抗不同或新演化之生物型。本發明提供一種可以快速發展適用於新型或不同生物型之疫苗。可由一種或多種不同特徵區分物種之生物型變異株，如：核糖體RNA序列變異、DNA多型性、病原性反應、已曝露到特定疫苗之動物反應、產生毒素之血清型分類或許多其他可能隨病原菌出現之變異(參見例如：Sambrook等人之“分子選殖法：實驗室手冊(Molecular Cloning：A Laboratory Manual)”，第2版，Cold Spring Harbor Laboratory,cold Spring Harbor,New York 2001；”DNA選殖法實際操作(DNA cloning A Practical Approach)”，第I及II冊，Glove,D. M.編輯，IRL Press Ltd.,Oxford,1985；Harlow與Lane之“抗體實驗室手冊(Antibodies a Laboratory Manual)”，Cold Spring Harbor Publications,N.Y. 1988)。例如(但不限於)：流感可由其亞型及簇集判斷其生物型。由其內含蛋白質之差異，及進一步由血液凝集素及神經胺酸水解酶蛋白質之差異決定其族群。在一實施例中，可採用血液凝集素抑制試驗，其中將經過特定稀釋之樣本加至紅血球細胞中，由產生凝集作用之最高稀釋度決定效價。當含有針對流感病毒之抗體時，針對該病毒之抗體即可防止病毒附著紅血球細胞，因此抑制凝集。其結果將以提供可見凝集度時之最高稀釋度之倒數表示。參見例如：Katz等人之(2009)Morbid. Mortal. Weekly Rep. 58(19) 521-524。
生物型分類法之另一實施例為聚醣分類法，其中由基因型依據其糖基化型態分類。此等方法說明於Harris等人之美國專利案第7,622,254號，其揭示內容已以引用之方式完全併入本文中(尤其參見例如：表7第48及49欄)。例如，PRRSV(豬生殖與呼吸病毒)菌株係依據其為歐洲或北美菌株來分類。在PRRSV菌株分類法之另一態樣中，第一個字母為EU(歐洲類)或NA(北美類)來指定基因型簇集。EU係指PRRSV之同型中特徵為在GP5之位置46、53或此兩個位置上保留聚醣。本文所採用NA係指PRRSV之同型中特徵為在GP5之位置44、51或此兩個位置上保留聚醣。為各菌株指定之編號均對應於該‘254案中表7所示GP5胺基酸序列之胞外結構域中糖基化位置編號，但不包括位於NA菌株胺基酸44及51及EU菌株胺基酸46及53上高度保留之聚醣。因此，NA-0係指NA菌株之GP5中不含聚醣之胞外結構域及EU-0係指EU菌株之GP5中不含聚醣之胞外結構域。例如，NA-1係指北美菌株之GP5中在GP5之胞外結構域具有一個聚醣之胞外結構域，但不包括位於NA菌株胺基酸44及51之高度保留聚醣。表1表示PRRSV之此等聚醣分類法。
a NA+北美，EU=歐洲
b 位於GP5胞外結構域之聚醣編號，但不包括位於NA菌株胺基酸44與51及EU菌株胺基酸46與53之高度保留聚醣。當此等聚醣不存在時，其應註記如下：若NA-1菌株在胺基酸44位置缺少聚醣時，稱為NA-1(Δ44)。
c 當所預測聚醣編號上升時，其對誘發保護性(中和)抗體及/或對此等抗體之感受性之抗性亦提高。
NA-0及EU-0分別為針對所有NA及EU菌株預測之母菌株。因此，應試圖包括此等病毒來產生交叉反應抗體。在NA-0及EU-0之後，聚醣分類型態可能為目前仍很難為PRRSV定義異源性之預測指標。
任何可區分病原菌與其他物種之生物分類方法均可用於本發明。
此方法提供適用於產生自體疫苗之製法。目前所使用製法中，單離出整個生物體，然後減毒或殺死，再以所製備之病毒為動物接種。例如，Livingston等人之美國專利案第4,692,412號說明一種製備針對新生贅瘤疾病之自體疫苗之方法，其係混合包含隱形小體(Progenitor cryptocides)之無菌血液樣本與無菌蒸餾水，培養混合物，殺死混合物中之隱形小體(Progenitor cryptocides)或使其失活化，混合物經過微過濾排除血液細胞，及稀釋濾液形成疫苗。此處，不使用完整生物體(活的或失活化)作為疫苗，反而僅使用一種或多種微生物之個別感興趣之基因(群)(GOI)(亦稱為感興趣之核酸分子(NOI)或其片段)，其衍生自病原菌及/或由此等基因所編碼而構成自體疫苗之蛋白質。驚人地發現，可能使用此等核酸分子製造疫苗，及提供可保護動物之有效疫苗。感興趣之基因係指該核酸分子可能表示或不表示整個基因且可能製造RNA干擾性分子，或編碼投予動物時可於動物體內產生保護性及/或免疫反應之多肽或其片段。熟悉此相關技藝之人士咸了解，實際之疫苗使用保護性分子，且可能包含感興趣之基因或其片段，或可能包含可產生保護性反應之多肽或其片段，或可能包含干擾性RNA或可能包含其組合。該製法之優點係基於以下理由：
1)新疫苗不包含活病毒。目前改造之活病毒(MLV)疫苗沒有根除效果，因為其有散播能力，會回復毒性，或與野生菌株重組。
2)新疫苗可區別已感染動物及已接種疫苗之動物。目前MLV及死疫苗採用完整病毒。本發明則不包括整個感染體。
3)自體疫苗可以快速製造。因為菌株/生物型會變異且缺乏交叉保護作用，故治療動物疾病需要自體疫苗。ARP疫苗之製造速度(1個月，甚至更短)比傳統自體疫苗(3個月)更快，因此可以更快反應。
在另一具體實施例中，決定病原菌之抗原微變性，可視需要先決定是否需要製備新的自體疫苗。在此等具體實施例中，先得到包含如上述微生物之樣本，且可視需要決定其生物型。以流感為例，可決定亞型及簇集。通常，流感病毒係由包含呈節段之單股RNA基因組之內核糖核蛋白質核心及被基質蛋白質包圍之外層脂蛋白質被膜組成。流感病毒之基因組係由8個線性(-)股核糖核酸(RNA)節段(編碼免疫原性血液凝集素(HA)及神經胺酸水解酶(NA)蛋白質)與6個內核心多肽：核病毒衣殼體核蛋白質(NP)；基質蛋白質(M)；非結構蛋白質(NS)；及三種RNA聚合酶(PA、PB1、PB2)蛋白質組成。複製期間，基因組病毒RNA轉錄至宿主細胞之細胞核之(+)股信使者RNA及(-)股基因組cRNA中。8個基因組節段分別被封裝進入其中除了RNA外尚包含NP及聚合酶複合物(PB1、PB2及PA)之核糖核蛋白質複合物中。如上述，流感依據其內蛋白質之間是否缺乏血清型交叉反應性而分成三類：流感A、B及C。流感A病毒進一步基於血液凝集素與神經胺酸水解酶蛋白質之抗原性差異來分類。亞型及其他類型簇集之實例係顯示於下表2。流感病毒之血液凝集素抗原經常會隨HA及NA胺基酸序列之變化而改變其抗原專一性。
在本發明之一具體實施例中，得到抗血清，並決定是否為相同生物型，本實施例中，決定其反應方式是否與使用現有疫苗所得標準物之反應方式相同。以流感為例，可使用血液凝集素抑制試驗作為標準，如下文所說明。若反應方式相同，則可使用現有之疫苗，若不相符，則可製備新疫苗。此係一種測定微變(亦即，抗原性組份之變化)之方式。此方法比測定抗原性轉變(亦即，形成新亞型之主要變化)更有效。藉由測定抗原性組份，病毒可能仍留在相同簇集內，但卻出現充份微變性，因此新疫苗可能較有效。雖然以流感病毒為例說明，但此等製程顯然可應用於任何微生物。
已知需要針對許多種病原菌之保護性分子(群)來誘發保護作用。先從來自農場之診斷樣本擴增病原菌之感興趣之基因。雖然可以單離及純化病原菌，但不一定要採用此方法。此等具體實施例不僅消除不必要之步驟，而且可以加速製造過程進行，不需要有單離之病原菌。可以採用任何可行方法(如：PCR)來單離該基因或其任何保護性部份。然後使用該基因來製備疫苗，最後用於為已曝露過或可能曝露到病原菌之動物接種。與目前可使用疫苗比較時，此等疫苗更快、具生物型專一性、及可與診斷試驗相容。本發明亦提供所製造之疫苗及使用該疫苗保護動物之方法。
在本發明之一具體實施例中，提供一種識別可誘發保護作用之病毒或核酸之保護性序列之方法。此方法亦包括該保護性分子之片段、衍生物或同源物。在一態樣中，該方法包括以此等序列投予試驗動物。該試驗組及對照組動物隨後再接受感染量之致病微生物攻毒。熟悉此相關技藝之人士已知決定是否可提供保護作用之各種方法與技術，包括例如(但不限於)：觀察試驗組與對照組動物之間之症狀差異。若試驗組動物觀察到任何症狀比對照組動物降低時，表示該保護性分子(群)可提供某種程度對抗疾病之保護作用。若試驗組動物觀察到之症狀與對照組動物之觀察結果類似或增加時，表示該保護性分子(群)無法提供保護作用。
在另一態樣中，提供一種決定該保護性分子是否可提供對抗感染之保護作用之方法，其包括利用電子顯微鏡或抗體或分析法(如：可使用螢光呈色中和反應(FFN)試驗或西方墨點分析法)來決定試驗中是否存在攻毒疾病。可採用PCR方法來決定保護性分子是否存在。北方墨點法可用於檢測診斷性序列之存在。攻毒生物體存在時，表示所單離序列(群)無法有效保護對抗疾病，沒有攻毒生物體存在時，表示該保護性分子(群)可有效保護對抗疾病。在另一態樣，在許多不同分析法中，可採用ELISA或類似分析法決定該保護性分子是否有效。自從1971年即已知有ELISA或酵素聯結免疫分析法(immunoassay)。通常，取溶解於緩衝液中之抗原塗覆於塑膠表面上。當添加血清時，抗體會附著在固相上之抗原。當與酵素共軛時，即可證實此等抗體是否存在。添加適當受質將可定量檢測結合之共軛物。常用之ELISA分析法為一種使用生物素基化抗-(蛋白質)多株抗體及鹼性磷酸酶共軛物之方法。例如，用於定量漆氧化酶(laccase)含量之ELISA法可為一種採用自商品取得之多株兔子抗體進行之抗體夾心式分析法。該抗體會與用於檢測之鹼性，磷酸酶共軛。在另一實施例中，用於檢測胰蛋白酶或胰蛋白酶原之ELISA分析法係使用生物素基化抗胰蛋白酶或抗胰蛋白酶原多株抗體及抗生物鏈菌素-鹼性磷酸酶共軛物檢測。
熟悉此相關技藝之人士當然可採用許多種此等方法來決定該保護性分子是否可提供保護作用，及是否可在動物之投藥量下提供保護作用。
本案發明者亦計畫使用多種載體及病毒傳遞本發明之來自微生物之單離序列。在視需要之具體實施例中，可在疫苗中提供一種輔劑。輔劑可加強抗原之免疫原性，但本身不一定有免疫原性。輔劑之作用為在投藥部位附近局部保留抗原，以產生儲積效果，促使緩慢且持續釋放抗原至免疫系統之細胞。輔劑亦可吸引免疫系統之細胞至抗原儲積處，刺激此等細胞誘發免疫反應。多年來已使用免疫刺激劑或輔劑來改善宿主對例如疫苗之免疫反應。本發明之疫苗可與輔劑併用，該輔劑例如：脂多醣、氫氧化鋁及磷酸鋁(alum)、與膜蛋白質抗原複合之皂苷(免疫刺激複合物)、與礦物油形成之普洛尼克(pluronic)聚合物、含於礦物油中之死分枝桿菌、佛氏(Freund’s)完全輔劑、細菌產物如：胞壁醯基二肽(MDP)及脂多醣(LPS)，及脂質A，及脂質體。理想的輔劑之所需特徵可包括：(1)沒有毒性；(2)有能力刺激長期免疫反應；(3)製法簡單且具有長期儲存穩定性；(4)經由多種途徑投藥時，有能力誘發對抗原之CMI及HIR；(5)與其他輔劑具協同性；(6)可以與呈現抗原之細胞(APC)族群選擇性交互作用；(7)有能力專一性誘發適當T-細胞助手1(TH1)或TH2細胞-專一性免疫反應；及(8)有能力選擇性提高對抗抗原之適當抗體同型含量(例如：IgA)。本發明所使用之輔劑不一定需要具有所有此等特徵才可用於本發明。
另一種可使用之輔劑為大腸桿菌(E. coli)熱敏感性腸毒素(LT)。LT曾用於協助防止大腸桿菌誘發之下痢(參見例如：Limjuco等人之美國專利案第4,285,931號及第4,220,584號)。然而，自從早期單離出來後，已發現LT之用法基於毒性而受到很大限制，且除非經過某些方式改質以降低毒性，否則避免作為輔劑使用。參見Zhang等人(2009)Vet. Rex. Commun. DOI 10/1007/s11259-009-9222-7。因此曾試圖改變內毒素序列或進行截斷，來避免毒性問題。參見例如：Piazza等人之美國專利案第7,291,588號。然而，仍可能使用未突變但沒有毒性之LT作為輔劑。此等未突變LT並未截短或突變。因此，可提供一種沒有毒性影響之輔劑，而且可降低製造成本。
疫苗組成物可能利用生理上可接受之媒劑(vehicle)及/或輔劑導入動物中。適用之媒劑係相關技藝上習知者，且包括例如：水、緩衝水、生理食鹽水、甘胺酸、玻尿酸等。所得水溶液可呈本身形式包裝，或經過冷凍乾燥，凍乾物先經過加水後再如上述投藥。組成物可依需要包含醫藥上可接受之輔助物質，以接近生理條件，如：pH調整劑及緩衝劑、滲透性調整劑、濕化劑等，例如：乙酸鈉、乳酸鈉、氯化鈉、氯化鉀、氯化鈣、脫水山梨糖醇單月桂酸酯、三乙醇胺油酸鹽等。在本發明之一具體實施例中，保護性分子係經過包埋，因此所得組成物具耐水性。在一具體實施例中，分子係與促進分子與飼料結合之結合劑組合，其特別適用於經口投藥法。此等耐水性結合物質可為任何具有此等性質之物質。其實例包括(但不限於)：瓊脂或其他糖化合物、白蛋白、藻酸鹽或任何類似組成物。
在另一具體實施例中，自特定菌株或生物型單離之保護性分子可與其他菌株或生物型或疾病之其他序列及組份組合，以達成對抗多種微生物之保護作用。此等不同微生物序列或組份可能依序投藥或漸進式或形成混合物同時投藥。本發明之疫苗組成物之依序或漸進式投藥法可能需要誘發足夠對抗多種微生物菌株之免疫力程度。本發明之疫苗組成物可進行單一或多重投藥法。可能需要多重投藥法來誘發足夠之免疫力程度。可藉由測定中和性分泌及血清抗體來追蹤所誘發免疫力程度，並依需要調整劑量或重覆接種疫苗，以維持所需保護程度。
保護性分子可依任何合適方式“投藥”，包括(但不限於)：浸入含保護性分子之組成物或物質(例如，用於蝦時，將疫苗提供給蝦周邊之水域)、非經腸式(parenterally)(皮下或肌內注射至動物器官或體腔、反向餵管(經直腸)及經口(口服或攝取飼料)、及穿皮式或氣體交換。疫苗可採用任何方式投藥，包括(但不限於)：針筒、霧化器、噴霧器、無針頭注射裝置或顆粒轟擊基因槍(生物射彈顆粒轟擊法(Biolistic bombardment))、經由微脂粒傳遞系統、裸傳遞系統、電穿孔法、病毒、載體、病毒載體或可食性傳遞系統，其中，保護性分子係例如：含於飼料或水中而食入，或以任何其他合適方式食入。經口或浸入投藥法提供之優點為容易投藥，且可以讓保護性分子投予一群動物。保護性分子之注射法適用於繁殖動物，亦即，已達到或接近繁殖成熟度之成年動物。免疫原性製劑及疫苗之投藥方式應與劑量調配物相容，其用量應為醫療上有效、具免疫原性及保護性之用量。
投藥量依所處理個體而定，包括例如個體之免疫系統建立保護性反應之能力。初始投藥法及追加劑量(booster dose)之合適療程亦可以變化，但可包括初始投藥後，再接續投藥。提供有效量保護性分子之需求亦需與提供較高量保護性分子之成本平衡。有效成本之疫苗係指製造成本低於其使用後所得價值之疫苗。
熟悉此相關技藝之人士可採用任何方法測定與決定本發明任何組成物及疫苗。例如，若該製程涉及使用標靶分子干擾時，可採用全身或特定組織RNA萃取物，使用延伸超過產生dsRNA之引子組所涵蓋區域之引子或完全從產生dsRNA之引子組所涵蓋區域移出之引子，進行定量性RT-PCR或RT-PCR或核酸雜化法或北方墨點法。
若疫苗涉及蛋白質之製造時，西方墨點法為一種直接快速分析樣本候選疫苗組成物之方法，以定量樣本中多肽或其片段含量。熟悉此相關技藝之人士有各種不同選項。在一具體實施例中，由多肽含量與來自其他生物型之類似多肽之已知有效標準物比較，製備其中多肽含量至少達此標準或更高之疫苗，或可使用試驗動物測試此疫苗。
仍未確定水生無脊椎動物(如蝦)是否產生抗體。雖然已觀察到免疫防禦反應，但若依據目前免疫學免疫學法則，咸信此等動物未產生抗體(參見Kurtz,Trends in Immunology,Vol. 25 No. 5,2005年4月)。熟悉此相關技藝之人士可採用簡單之免疫墨點技術來測定抗體產量，或藉由測定抗體產量來追蹤所誘發免疫力，或為了測定保護性分子產量或病原體本身，以達到最適當劑量或依需要可以重覆接種疫苗，以維持所需保護作用程度。例如，可進行ELISA。ELISA可在來自接受接種之個體所收集之樣本中進行，以決定針對該疫苗之抗體是否包含產生抗多肽抗體之序列、衍生物、同源物或變異株或其片段，或使用抗體決定該疫苗分子是否已成功表現。個體樣本係採用抗多肽抗體為參考物測定。
本發明疫苗之有效性亦可進行定量分析(例如，與適當對照組比較，測定疾病之下降)或定性分析(例如，自組織或體液單離病原菌或病毒，且若可能檢測時，則採用免疫過氧化酶分析法等等檢測組織樣本中之抗原)。症狀之分析及測量動物體重增加程度亦可證實該疾病在特定劑量下有減輕之效應。在另一實施例中，可製備一定範圍之劑量，及測定保護性反應。可在二種、三種或更多種不同劑量下調配候選疫苗，以決定最低保護性劑量。例如，當採用RP時，除了測定IFA效價外，可採用qPCR分析法決定疫苗中之基因組當量數，並與IFA效價比較，得到GE：RP比例。此等分析法有助於確保均一性。在另一實施例中，此等試驗法顯示豬流感之有效劑量為約1X108 RP。在另一實施例(但不限於)為：可製備二種、三種或更多種劑量範圍，如下列實例在攻毒時測定蝦之罹病率及死亡率。較佳具體實施例中所選擇之劑量為可提供動物保護作用且亦為有效成本之劑量。
熟悉此相關技藝之人士咸了解，有許多種不同方法可以測定疫苗有效性。
本發明可以在水生無脊椎動物中達到對抗疾病之保護作用，且該保護作用之期效比過去此等動物可達到之期效更長。可在至少一次攻毒或曝露到病原性微生物後維持保護作用期效超過7天，且使用本發明已可達到保護作用期效至少2週、至少20天、21、22、23、24、25、26、27、28、29、30、31、32、33、34、35、36、37、38、39、40、41、42、43、44、45、46、47、48、49、50、51、52、53、54、55、56、57、58、59、60天或更久。本文在一具體實施例中所顯示之保護性反應亦可針對特別疾病，而不針對另一種疾病，因此證實具有特異性記憶。
提出下列實施例來說明，但無意限制本發明範圍。
實施例1
本文說明一種製造自體複製子顆粒之方法(有些操作者亦稱ARP為RNA顆粒或複製子顆粒)。在第一項實驗中，在豬中證實RP疫苗可以於活體內產生外來抗原，誘發免疫反應。
取得2週齡的豬，稱體重、標記標籤及隨機分成2組，每組8隻(表3)。接種疫苗之前，收集血清，以確保豬沒有流感抗體。
試驗期間收集血清，使用A/懷俄明州/03/2003病毒，進行血球凝集抑制試驗(HI)分析法。所有豬在試驗前均為HI陰性，第1組豬在試驗期間保持陰性(沒有示個別之豬數據)。然而，在第2組針對HA蛋白質誘發可靠且持久之抗體反應(表4)。此反應在初次劑量時開始出現，在第二劑量後即快速升高。第21天時，所有豬之效價均達1280至5120之間，並維持此程度至62天試驗結束為止。雖然此實驗之豬沒有使用毒性之病毒攻毒，但基於過去之試驗及通常可接受之保護程度(>40)，此HI抗體程度應已具有保護性。
吾等已成功顯示所製造之RP疫苗可共同表現PRRSV GP5及M蛋白質，並形成雜二聚體。Erdman MM、Harris DL、Kamrud KI”共同表現PRRSV GP5及M蛋白質之複製子顆粒(Replicon particle co-expression of PRRSV GP5 and M proteins)”Proc CRWAD 2006。於活體外成功表現後，進行豬試驗，來決定GP5-M RP疫苗是否可誘發豬之免疫反應。自PRRSV陰性來源取得2至3週齡之豬。在豬上標記標籤、稱體重及隨機分成2組，每組8隻(表5)。在接種疫苗前先收集血清，以確保豬沒有針對PRRSV之抗體。
所有豬均於第48天接受同源性PRRSV菌株(HLV013)經肌內注射2 ml之106 TCID50進行攻毒。兩組在攻毒前均對Marc 145細胞產生病毒中和性抗體，但西方墨點分析顯示仍出現針對PRRSV蛋白質之抗體。攻毒後，接種組8隻豬中有3隻及對照組8隻豬中有0隻在7天內產生中和效價。所有豬在攻毒後14天時驗屍。接種組8隻豬中有5隻及對照組8隻豬中有4隻產生中和效價。然而，接種組之幾何平均效價(GMT)(GMT=27.8)仍高於對照組(GMT=9.5)。肺灌洗液之病毒效價顯示對照組8隻豬中有7隻呈病毒陽性，接種組8隻豬中僅4隻呈病毒陽性。肺病灶得分顯示接種組之粗觀病變(平均分數16.3)低於對照組(平均分數22.3)。
結果及成果 ARP疫苗構築法
整個疫苗發展過程從PRRSV陽性血清樣本費時3週調配成GP5與M單一發動子ARP疫苗，並再經過一週製成GP5/M雙重發動子ARP疫苗。基於其發展速度於本實驗中對吾等之重要性，吾等採用此實驗藉由共同注射GP5及M單一發動子ARP來測試，因為其可在較短時間內產生，且技術性的挑戰較低。然而，單一發動子與雙重發動子方法為有利之選項，且其所需時間比一般發展新型習知自體疫苗需要單離及讓病毒生長時所需之時間更短。
可於樣本上進行PCR，針對PRRS提供陽性診斷結果且亦產生製造ARP疫苗時所需基因之cDNA。亦可預期進行此整個過程之時間比一般由豬生產者製造傳統自體疫苗所需時間短。
為了發展新ARP疫苗，需識別擁有已出現臨床PRRSV之豬之大型豬生產者。從患病動物收集血清樣本送到愛荷華州立大學(Iowa State University)。採用RT-PCR確認診斷結果及製造標靶基因之cDNA，用於產生疫苗。採用專一性引子PRRSV GP5及M基因，分別擴增ORF5及6。雖然不一定需要製造疫苗，但可單離活病毒，以製備傳統之死自體疫苗，及用於對豬攻毒。單離株稱為PRRSV菌株Pennway。
選殖PRRSV GP5及M基因至基於VEE之活減毒疫苗菌株(稱為TC-83)之複製子載體(第3圖)。採用IFA及西方墨點分析GP5與M複製子載體，證實所需蛋白質之表現。然後由複製子使用助手RNA經由共電穿孔法封裝至顆粒中，製成ARP。自培養液中收集ARP，採用抗原專一性IFA測定ARP製劑之感染效價，並於CPE分析法中測試，以確定沒有有複製能力之病毒。
疫苗調配物
安慰劑疫苗係由2 ml之無菌PBS(HyClone Laboratories)製成。
ARP針對GP5 ARP之初始效價為2.11e9/ml及針對M ARP為3.56e9。使用PBS稀釋各ARP至效價1e8/ml。各劑量包含1 ml之GP5 ARP及1 ml之M ARP，含在同一隻針筒中共同注射。
使用來自相同菌株之失活化PRRSV疫苗製造ARP疫苗。讓病毒在Marc-145細胞上生長至85% CPE，並自上清液中收集。測得病毒效價為2.7e5 TCID50/ml。病毒在65℃下90分鐘而失活化。取製劑樣本接種至Marc-145細胞上，以確認其中沒有活病毒。溶胞液使用Emulsigen-D輔劑(MVP laboratories,Ralston,NE)調配，每劑量添加1.6 ml之溶胞液與0.4 ml之輔劑。
PRRSV MLV疫苗為Inglevac PRRS ATP(Boehringer Ingelheim Vetmedica,Inc)。依製造商之指示使用疫苗，其指示疫苗之單一劑量為2 ml。
豬試驗
從愛荷華農場依據臨床症狀及血清學取得無PRRSV感染病例之三週齡豬。豬於愛荷華州立大學之BSL-2動物機構接受標記標籤、稱體重及隨機分成5組，每組10隻豬。組別說明示於表5，接種疫苗-攻毒試驗之時間表示於表6。第1組包括嚴格陰性對照組豬，既未接種疫苗亦未接受攻毒。第2、3、4組中所有豬均於第0天經肌內(IM)接受接種，第28天再接種一次。第2組接受安慰劑疫苗，第3組接受ARP疫苗，及第4組接受失活化PRRSV疫苗。第5組於第0天接受一劑MLV疫苗。
PRRSV=豬繁殖及呼吸症候群病毒，M=基質蛋白質，GP5=醣蛋白5，ARP=自體複製子顆粒，MLV=改質之活病毒，NA=無法採用，IM=肌內，IN=經鼻內
於第56天時，使用2 ml之1×105 TCID50/ml毒性之PRRSV菌株Pennway，經IN對豬進行攻毒。追蹤豬接受攻毒後之臨床症狀，包括呼吸困難、昏睡及斜臥，但均未出現此等症狀。在接受攻毒後21天對豬進行麻醉，驗屍，收集組織進行實驗室檢驗，包括定量肺部粗觀病灶得分、組織病理學、IDEXX ELISA、病毒效價測定及病毒中和度。
病理學
驗屍時，依據Halbur等人說明，由對處理不知情之病理專科獸醫師決定粗觀病理肺病灶程度(Halbur PG,Paul PS,Meng XJ,Lum MA,Andrews JJ,Rathje JA，”於來自剖腹生產之五週齡豬模式中比較所單離9株美國豬繁殖與呼吸症候群病毒(PRRSV)之病原性(Comparative pathogenicity of nine US porcine reproductive and respiratory syndrome virus(PRRSV) isolates in a five-week-old cesarean-derived,colostrum-deprived pig model)”，J Vet Diagn Invest 1996；8：11-20)。
簡言之，為各肺部切片編號，且肺部得分代表肺葉出現肺炎之百分比。各肺葉之得分加總後，得到該豬隻之肺部總分。此實驗之肺部病變相當溫和且以組別之肺部總得分綜合說明於第4圖。亦依Halbur等人之說明(如上述文獻)，在肺部及心臟切片上進行組織病理學分析。
此等結果綜合顯示於第5至7圖。間質性肺炎為每隻豬之四片不同切片使用0(正常)至6(嚴重且擴散)分級之平均值。結果顯示各組之間沒有統計性差異。於相同切片上，採用0(正常)至6(嚴重增生)檢視肺淋巴性增生。結果顯示安慰劑組及失活化疫苗組在統計上(p<0.05)均顯示增生程度高於嚴格陰性組。未觀察到其他統計上差異。採用0(正常)至3(嚴重心肌炎)檢視心臟切片之感染徵兆。結果顯示各組之間沒有統計上差異。
儘管吾等進行之其他分析法顯示成功攻毒結果，但病理結果卻顯示不大之統計差異。PRRSV試驗所誘發之病灶及臨床症狀基於各種不同理由(包括菌株差異)而可能變化很大或幾乎沒有變化。因此，可將其他如下文說明之測定法(如：病毒血症及抗體分析法)視為分析PRRSV疫苗之黃金標準。
IDEXX族群檢測(HerdChek) PRRS 2XR ELISA
IDEXX ELISA檢測針對PRRSV之核病毒衣殼體(N)蛋白質之抗體。此等抗體雖然不會提供免於疾病之保護作用，但卻提早展現對PRRSV之反應。過去之研究亦顯示S/P(樣本對陽性比例，IDEXX ELISA通常使用該樣本訊號對背景之比例)效價與病毒血症程度之關係，因此，可依此方式採用效價來比較各組之間感染程度之差異。Johnson W、Roof M、Vaugh E、Christopher-Hennings J、Johnson CR、Murtaugh M.，”豬繁殖及呼吸症候群病毒(PRRSV)之病原性及體液免疫反應與急性感染之病毒量相關(Pathogenic and humoral immune response to porcine reproductive and respiratory syndrome virus(PRRSV)are related to viral load in acute infection)”，Veterinary Immunology and Immunopathology 2004;102:233-47。
於攻毒後第0、7、14及21天收集所有豬之血清樣本。樣本送至南達科他(South Dakota)州立大學進行測定。S/P比例0.40則視為陽性。結果顯示於第8圖，以每組平均S/P比例表示。結果顯示，攻毒當天，第1至4組中所有豬均保持陰性。此結果讓吾等確認試驗期間未曾從側面導入活病毒。第5組所有豬於攻毒當天均呈IDEXX陽性，其係所預期結果，因為N蛋白質為MLV疫苗之主要部份。ARP組中所有豬在攻毒之前均保持陰性，此結果促成此疫苗可與IDEXX ELISA組合用於區分自然感染動物與免疫接種動物(DIVA)之想法。第2至4組在攻毒14天後出現血清轉換。然而，ARP組仍顯著低於其他處理組，其透過驗屍顯示，此組之感染程度較低。此比較結果不可能出現在MLV組，因為其在攻毒之前即呈陽性，嚴格陰性組在試驗期間仍保持陰性。
螢光呈色中和反應分析法
螢光呈色中和反應(FFN)分析法檢測對抗PRRSV之血清中和抗體。於攻毒後第0、7、14及21天收集所有豬之血清樣本。樣本送至南達科他(South Dakota)州立大學進行如上述測定。所使用之試驗病毒為PRRSV菌株Pennway，當反效價4則視為陽性。各組之陽性豬數目綜合說明於第9圖。攻毒當天任一組均沒有出現陽性。然而在攻毒後，由驗屍發現ARP及MLV組出現之陽性豬多於失活化組及安慰劑組。嚴格陰性組中所有豬在試驗期間均保持陰性。陽性豬較多之結果並不令人意外，因為ARP與MLV組之平均中和效價高於其他處理組，如第10圖所顯示。
雖然吾等過去的研究已顯示所表現之PRRSV GP5及M可在攻毒前誘發中和抗體，但吾等並未在此試驗中發現此結果。然而，其可能歸因於此試驗所使用GP5之糖基化作用所致。其係由傾向於高度糖基化之野生菌株製成之新疫苗。雖然在攻毒之前沒有中和抗體，但由攻毒後各組之間之差異可證明，ARP組的確出現類似MLV組之促發效應。
活病毒效價測定
於攻毒後第0、7、14及21天收集血清樣本，並在驗屍時收集支氣管肺泡灌洗液(BAL)，如上述測定活PRRSV之存在。簡言之，樣本於包含長滿Marc-145細胞之96孔盤上稀釋10倍。分別塗覆臨床樣本，進行四重覆。分析盤於37℃及5% CO2下培養7天，或直到不再觀察到新CPE為止。採用Reed-Muench公式計算TCID50/ml效價。檢測限值為5.6e1 TCID50/ml。
攻毒當天，所有組對活病毒均呈陰性，嚴格陰性組在試驗期間均保持保護陰性。攻毒後7天，4組攻毒組均檢測到病毒中，且在病毒血症中檢測到顯著差異(第11圖)。在攻毒後14天及21天沒有在血清中檢測到活病毒。
BAL液體之試驗顯示，僅在第2及5組中出現一個陽性樣本，在第3及4組中出現兩個陽性樣本(未顯示數據)。
RT-PCR
如上述在攻毒後0、7、14及21天所收集之血清樣本上進行RT-PCR。簡言之，使用Qiagen Virus Spin Kit套組萃取病毒RNA。使用PRRSV之ORF7基因(編碼N蛋白質)之專一性引子測試萃取液，進行二重覆測定。結果以每組之陽性豬數目表示(第12圖)。
雖然PCR為另一種檢測病毒血症之分析法，但PCR與活病毒效價測定不相符之結果並不令人意外。以一種方法檢測活病毒，而另一種方法卻僅檢測沒活病毒時亦可能存在之核酸。PCR結果顯示，攻毒後14天之ARP與MLV組出現病毒血症之豬數比安慰劑組顯著減少。
實施例2
此次研究中，α病毒複製子係來自α病毒委內瑞拉馬腦炎病毒(VEEV)之TC-83菌株。過去之研究中，來自人類H5N1單離株之表現HA基因之VEEV複製子疫苗可保護雞免於致死性攻毒。Schultz-Cherry S、Dybing JK、Davis NL、Williamson C、Suarez DL、Johnston R、Perdue ML、“由α病毒複製子系統表現之流感病毒(A/HK/156/97)血液凝集素可保護雞對抗源於香港之H5N1病毒之致死性感染(Influenza virus(A/HK/156/97)hemagglutinin expressed by an alphavirus replicon system protectschickens against lethal infection with Hong Kong-origin H5NI viruses)“，Virolog.y. 2000 Dec 5；278(1)：55-9. PubMed PMID：11112481。
近來，吾等之研究小組首先分析豬之VEEV複製子顆粒疫苗。Erdman MM、Kamrud KI、Harris DL及Smith J，2010，“發展用於人類人類之α病毒複製子顆粒疫苗於豬中誘發高度抗體對抗流感病毒血液凝集素：概念之驗證(Alphavirus Replicon Particle Vaccines Developed for Use in Humans Induce High Levels of Antibodies to Influenza Virus Hemagglutinin in Swine: Proof of concept)”,Vaccine 28：594-596。
此研究之目的在於分析於接種疫苗-攻毒模式中作為豬疫苗之表現複製子之重組體新型H1N1 HA蛋白質。
材料及方法 新型H1N1 HA複製子亞單位疫苗製法
血液凝集素(HA)核苷酸序列係來自全球共享禽流感數據倡議組織(Global Initiative on Sharing Avian)(GISAID)資料庫。基因係由商業公司(DNA2.0,Menlo Park,CA,USA)，分別使用專一之AscI及PacI限制酶切割位置處理5’及3’末端而合成。選殖HA基因至pVEK(TC-83)複製子載體之AscI/PacI位置(Hooper JW、Ferro AM、Golden JW、Silvera P、Dudek J、Alterson K、Custer M、Rivers B、Morris J、Owens G、Smith JF及Kamrud KI，2009，“以α病毒複製子分子傳遞天花疫苗誘發小鼠及非人類靈長類保護性免疫力(Molecular Smallpox Vaccine Delivered by Alphavirus Replicons Elicits Protective Immunity in Mice and Non-Human Primates)”,Vaccine 13(13)”)，並如過去所說明選擇最適當構築體(Kamrud KI、Custer M、Dudek JM、Owens G、Alterson KD、Lee JS、Groebner JL、Smith JF，”IRES元素之無發動子α病毒複製子分析法(Alphavirus replicon approach to promoterless analysis of IRES elements)”Virology.2007 Apr 10；360(2)：376-87. Epub 2006 Dec 6. PubMed PMID：17156813；PubMed Central PMCID：PMC1885372)。然後測定HA基因序列，以確定整個選殖過程維持適當序列。如過去所說明於活體外製造RNA轉錄本(Kamrud等人(2007)，如上述文獻)。由複製子RNA與綠猴腎細胞(Vero cell)於電穿孔法測光管中混合及以脈衝處理。培養細胞一夜後，使用RIPA緩衝液(Pierce,Rockford,IL,USA)分解。所得溶胞液採用西方墨點分析法測定蛋白質表現，及採用新型H1N1 HA-專一性ELISA法測定HA蛋白質濃度。稀釋溶胞液至特定HA濃度，並使用Emulsigen-D(MVP Technologies,Omaha,NE,USA)作為輔劑製造疫苗。
西方墨點分析法
取包含重組體HA蛋白質之綠猴腎細胞溶胞液通過12%SDS-PAGE凝膠(Invitrogen,Carlsbad,CA,USA)分離，然後轉移至PVDF膜(Invitrogen,Carlsbad,CA)上。所採用之梯度為SeeBlue Plus2預染色標準物(Invitrogen,Carlsbad,CA,USA)。轉移後，以5%脫脂奶粉於室溫下進行阻斷。膜與豬多株抗-HA培養2小時，洗滌3次後，與山羊抗-豬IgG辣根過氧化酶共軛物(ImmunoJackson Research Laboratories,Inc,West Grove,PA,USA)培養1小時，洗滌3次。採用TMB受質(KPL,Gaithersburg,MD,USA)進行檢測。
動物試驗
取得3週齡之沒有豬流感病毒(SIV)及豬繁殖及呼吸症候群病毒(PRRSV)之豬。豬隨機分成4組，每組5隻豬。接種疫苗之前，收集血清，進行對抗新型H1N1 A/加州/04/2009菌株之同源性血球凝集抑制試驗(HI)分析法，以確定陰性抗體狀態。收集試驗期間之血清，並採用相同HI分析法測定，以追蹤接種疫苗後之血清轉換。依循初始/追加接種疫苗計畫。在豬約4週齡時第0天投予第一劑疫苗。第21天時，為豬追加接種疫苗，於第47天時攻毒，並於第52天驗屍。豬接受磷酸鹽緩衝生理食鹽水(PBS)(第1組)或不同濃度之新型H1 HA重組體蛋白質(第2至4組)。經氣管使用毒性之A/加州/04/2009(CDC# 2009712047)，以2x105 TCID50/ml之劑量對豬進行攻毒。自攻毒當天起，直到攻毒後5天試驗結束時，每天在鼻部收集塗拭檢體，以單離活病毒。在即將攻毒前先稱豬之體重，然後在驗屍時再稱一次，決定平均每日體重增量。驗屍時，由專科病理學家決定肺部病灶之實變。取肺部組織於福馬林中固定，供進行SIV免疫組織化學(IHC)及組織病理學分析。收集肺部之支氣管肺泡灌洗液(BALF)，供單離活病毒。此動物試驗係由愛荷華州立大學機構動物照護與使用委員會(Institutional Animal Care and Use Committee)核准。
粗觀肺部病灶評分法、組織病理學及SIV免疫組織化學
由一位對處理組不知情之專科獸醫病理學家進行肺部評分、組織病理學分析及SIV免疫組織化學(IHC)分析法。驗屍時，目視估測每片肺葉之肺炎感染程度，並基於各肺葉對肺部總體積之加權比值計算整個肺部之總百分比(Halbur PG、Paul PS、Frey ML、Landgraf J、Eernisse K、Meng XJ、Lum MA、Andrews JJ、Rathje JA，”兩株美國豬繁殖及呼吸症候群病毒分離株與Lelystad病毒之病原性比較(Comparison of the pathogenicity of two US porcine reproductive and respiratory syndrome virus isolates with that of the Lelystad virus)”，Vet Pathol. 1995 Nov；32(6)：648-60. PubMed PMID：8592800)。自氣管及所有肺葉收集組織樣本，於10%福馬林中固定。依例行方式處理組織，以蘇木及曙紅染色。依據Vincent等人所使用之方法為肺部樣本評分(Vincent AL、MaW、Lager KM、Janke BH、Webby RJ、Garcia-Sastre A、Richt JA，”截短之NS1改質活流感病毒疫苗對豬經鼻投藥法之效力(Efficacy of intranasal administration of a truncated NS1 modified live influenza virus vaccine in swine)”，Vaccine. 2007 Nov 19;25(47): 7999-8009. Epub 2007 Sep 29. PubMed PMID: 17933442；PubMed Central PMCID：PMC2099695)。豬流感病毒IHC係依據Vincent等人說明之方法製造(Vincent LL、Janke BH、Paul PS、Halbur PG，”採用免疫組織化學試驗法於經福馬林固定之譛蠟包埋組織中證實豬流感病毒(Demonstration of swine influenza virus in formalin-fixed,paraffin-embedded tissues by use of an immunohistochemical test)“，第14屆IPVS會議給錄(Proceedings of the 14th IPVS Congress)。1996；97)。所有組織製劑及染色法均由愛荷華州立大學獸醫診斷實驗室(Veterinary Diagnostic Laboratory)執行。
活病毒分離法
由鼻部塗拭檢體測定活病毒效價及於支氣管肺泡灌洗液(BALF)樣本中單離活病毒，簡言之，取鼻部塗拭檢體及BALF樣本解凍，離心去除細胞碎片。所得上清液於96孔分析盤中，以杜氏改良伊格氏培養基(Dulbecco’s Modified Eagle Medium)(DMEM)(Gibco,Carlsbad,CA,USA)(包含1%抗生素-抗黴菌素(Gibco,Carlsbad,CA,USA)及1% L-麩醯胺(Mediatech,Manassas,VA,USA))稀釋10倍。製成稀釋液後，自各孔取出100μl移至包含單一層豬睪丸(ST)細胞之96孔盤之各孔中。分析盤於37℃下培養，直到不再觀察到CPE為止，通常需3至5天。出現CPE之孔即視為陽性，並採用Reed-Meunch之TCID50/ml方法計算效價(Reed LJ及Muench H，”50%末端點之簡單估算方法(A simple method of estimation of 50% end points)”，American journal of Hygiene. 27；493-497. 1938)。
血球凝集抑制分析法
由明尼蘇達大學獸醫診斷實驗室(University of Minnesota Veterinary Diagnostic Laboratory)依據標準實驗室程序，採用血球凝集抑制試驗(HI)分析法測定流感病毒之抗體。簡言之，以受體破壞性酵素處理血清，受熱失活化，以20%火雞紅血球吸附，及離心。上清液於V型微滴定盤中，使用等體積(含4至8個凝集單位)A/加州/04/2009進行連續稀釋，分析盤於室溫下培養後再添加0.5%火雞紅血球。效價之定義為血球凝集作用受到抑制時之最高稀釋度之倒數。
直接抗原捕捉ELISA
由未知樣本、陰性對照組及純化之新型H1蛋白質(Protein Sciences,Meriden,CT,USA)經過捕捉緩衝液(50 mM碳酸鹽/碳酸氫鹽，pH 9.6)稀釋及於4℃下培養一夜(100μl/孔)，直接捕捉至NUNC Maxisorp(Rochester,NY,USA)96-孔微分析盤上。微分析盤經過洗滌緩衝液(20 mM磷酸鹽緩衝生理食鹽水，0.05% Tween-20，pH 7.2)洗滌4次。以含1.25%脫脂奶粉之捕捉緩衝液於37℃下阻斷1小時(200μl/孔)。經過4次洗滌後，添加豬多株抗-HA至孔中(100μl)，於37℃下培養1小時(於含1.25% NFDM之洗滌緩衝液稀釋1/500)。洗滌4次後，添加山羊抗-豬IgG-HRP標記(Jackson ImmunoResearch,West Grove,PA,USA)至孔中(100μl)，於37℃下培養1小時(於含1.25% NFDM之洗滌緩衝液中稀釋1/2000)。洗滌最後4次後，再添加100μl之TMB受質(KPL,Gaithersburg,MD,USA)，於37℃下培養20分鐘。測定620 nm下之吸光度，並使用純化之新型H1蛋白質繪製標準曲線。採用標準曲線之線性迴歸分析來計算未知物中新型H1濃度。
統計分析
採用單因子變方分析法(ANOVA)分析同源性HI效價、粗觀及組織病理學肺部評分、IHC及BALF結果、log10換算鼻部塗拭檢體病毒效價、及ADG(JMP 8.0.1,SAS Institute Inc.,Cary,NC,USA)。統計顯著性設定在p<0.05。
結果 疫苗製法
依據上述方法將新型H1N1 HA基因嵌插至α病毒複製子平台中。嵌插後分析之核苷酸序列證實整個選殖過程中已維持正確HA基因序列。於蛋白質溶胞物中進行西方墨點分析法，於動物試驗之疫苗製劑所採用之各種不同HA劑量中證實所表現之新型HA蛋白質。採用新型HA ELISA測定HA濃度，並稀釋至指定HA濃度(表8)。參見第13圖。
抗體效價
採用同源性HI分析法測定接種疫苗後血清之專一性抗體反應。接種疫苗之豬在一劑之後並未出現血球凝集抑制效價，但除了第2組中一隻豬外，其餘在追加接種疫苗後7及14天均呈陽性(1：40)(未顯示數據)。於攻毒當天，第2至4組之同源性HI效價顯著高於第1組(表9)。
病理學評估
驗屍時，肺部主要在腹側前方肺葉中出現粗觀之深紅紫色實變病灶。第2至4組之肺部之病灶得分及實變顯著低於第1組之豬(表3)。所有接種組之病理學得分亦比未接種組顯著下降(表3)。來自第1組未接種組之豬肺部切片出現約50%呼吸道之支氣管上皮中斷及支氣管週圍淋巴細胞聚集如套狀(lymphocytic cuffing)。接種組第2至4組證實僅有偶發發呼吸道輕微被細胞聚集如套狀。亦於肺部切片上證實豬流感病毒IHC。所有5個取自未接種組第1組之豬肺部之流感抗原均呈陽性，而接種組第2至4組中僅2隻豬呈陽性。此外，於驗屍時，在取自每隻豬之氣管樣本上進行SIV IHC(未顯示數據)。雖然所有組之氣管IHC樣本均呈陽性，但接種組與未接種組之間沒有顯著差異。陽性氣管IHC結果與過去所提出新型H1N1於雪貂中病源學具有相關性(Munster VJ、de Wit E、van den Brand JM、Herfst S、Schrauwen EJ、Bestebroer TM、van de Vijver D、Boucher CA、Koopmans M、Rimmelzwaan GF、Kuiken T、Osterhaus AD、Fouchier RA，”豬來源之2009 A(H1N1)流感病毒於雪貂中之病源學與傳播(Pathogenesis and transmission of swine-origin 2009 A(H1N1)influenza virus in ferrets)”，Science. 2009 Jul 24；325(5939)：481-3. Epub 2009 Jul 2. PubMed PMID：19574348)。
病毒分離
從攻毒後1天之鼻部塗拭檢體沒有檢測到活流感病毒(表4)。攻毒後第2天，於第1、3與4組檢測到活流感病毒，但各組之平均病毒效價之間沒有顯著差異。攻毒後第3天，第2與4組之效價顯著低於第1組。第4及5天時，第2至4組之效價均低於第1組。在攻毒期間，第2組之豬鼻部塗拭檢體均沒有檢測到活病毒。同樣地，各組之間陽性BAL樣本數已顯著減少(表3)。攻毒後第5天，接種組中僅共3隻豬可在BAL樣本中檢測到活病毒，而未接種組中所有5隻豬均呈病毒分離陽性。
平均體重日增量
所有豬均於攻毒當天稱體重，及於驗屍時再稱一次。在5天攻毒期間，第3與4組之平均體重日增量(ADG)均顯著高於第1組。第2組之ADG較高，但沒有顯著高於第1組(p=0.08)。
設計一個類似試驗，其中未涉及流感病毒攻毒或相關之分析；於接種動物中僅測定依此方式製造之重組體HA疫苗之免疫原性。此試驗中，採用上述方法，將三種其他流感病毒之HA基因(H1-β、H1-δ、H1-γ及H3)嵌插至α病毒複製子平台中。嵌插後分析核苷酸序列，證實整個選殖過程中仍維持正確HA基因序列。於分別使用HA構築體產生之蛋白質溶胞物上進行西方墨點分析，以證實HA蛋白質之表現(未顯示數據)。此實驗中，採用不同稀釋度之HA疫苗為接種組之豬接種(所使用之疫苗及計畫均示於下表11及12)；用於接種豬之稀釋度顯示於表11。採用上述方法，以同源性HI效價分析不同重組體HA疫苗所誘發之免疫反應，其中以分析法中可以抑制病毒之血球凝集作用之血清之最終稀釋度之倒數作為終點效價。此試驗所測定之HI效價綜合說明於表12。
討論
新型H1N1在人類族群中之爆發已突顯流感病毒之人畜共通可能性。甚至在這十年大流行之前，有許多報告提出豬傳播流感給人類之病例。因此，控制此人畜共通疾病威脅之部份方式為對豬接種疫苗，對抗豬流感病毒。此研究中，吾等已證實，基於α病毒複製子表現系統可以快速製造有效之豬流感疫苗，以因應所爆發之新型人畜共通菌株。其中提出使用經由α病毒複製子表現系統製造之重組體蛋白質為豬接種。使用此系統製造之複製子顆粒(RP)疫苗近來已用於誘發保護作用對抗豬流感病毒(SIV)及豬繁殖及呼吸症候群病毒(PRRSV)。(Erdman MM、Kamrud KI、Harris DL、Smith J，2010，”以發展用於人類之α病毒載體疫苗於豬中針對流感病毒血液凝集素誘發高力抗體：概念驗證(Alphavirus Vector Vaccines Developed for Use in Humans Induce High Levels of Antibodies to Influenza Virus Hemagglutinin in Swine: Proof of Concept)“，Vaccine 28:594-596；Bosworth B、Erdman M、Stine D、Harris I、Irwin C、Jens M、Loynachan A、Owens G、Kamrud K、Harris DL，2010，”以病毒樣複製子顆粒疫苗保護豬對抗流感(Virus-like replicon particle vaccine protects pigs against influenza)”，Comparative Immunology,Microbiology and Infectious Diseases 33(2010)e99-e103)。此概念研究之第一個證據證明投藥給豬之複製子顆粒疫苗可以誘發高抗體H1效價對抗人類流感菌株。後來使用表現系群IV H3N2 SIV單離株之HA基因之RP疫苗之研究證實，對豬投予流感HARP疫苗不僅可以誘發抗體反應，而且可以提供顯著保護作用對抗同源性病毒攻毒。與此等早期研究相反，本研究採用α病毒複製子表現系統於活體外製造重組體HA蛋白質；然而，亦證實產生類似抗體反應及免於病毒攻毒之保護作用。
結果證實，感染A/加州/04/2009之豬流感可以誘發臨床症狀，其粗觀病灶類似其他SIV菌株(Vincent AL、Ma W、Lager KM、Janke BH、Webby RJ、Garca-Sastre A、Richt JA，”截短之NS1改質流感病毒疫苗對豬經鼻內投藥之效力(Efficacy of intranasal administration of a truncated NS1 modified live influenza virus vaccine in swine)”，Vaccine. 2007 Nov 19；25(47)：7999-8009. Epub 2007 Sep 29. PubMed PMID：17933442；PubMed Central PMCID：PMC2099695；Vincent AL、Lager KM、Ma W、Lekcharoensuk P、Gramer MR、Loiacono C、Richt JA，”源於美國之血液凝集素亞型1豬流感病毒之評估(Evaluation of hemagglutinin subtype 1 swine influenza viruses from the United States)”，Vet Microbiol. 2006 Dec 20；118(3-4)：212-22. Epub 2006 Aug 1. PubMed PMID：16962262；Sreta D、Kedkovid R、Tuamsang S、Kitikoon P、Thanawongnuwech R，”離乳小豬豬流感病毒病源學(Thai單離株)：實驗性研究(Pathogenesis of swine influenza virus(Thai isolates) in weanling pigs: an experimental trial)”，Virol J. 2009 Mar 25；6：34. PubMed PMID：19317918；PubMed Central PMCID：PMC2678088)。與過去之研究相反，此研究有數隻豬(主要在未接種組)出現臨床症狀，以咳嗽及打噴嚏為主。此差異可能歸因於過去研究中所採用迷你豬模式(Itoh Y等人，”新型豬源性H1N1流感病毒之活體外及活體內特徵分析(In vitro and in vivo characterization of new swine-origin H1N1 influenza viruses)“，Nature. 2009 Aug 20；460(7258)：1021-5. PubMed PMID：19672242；PubMed Central PMCID：PMC2748827)。此研究中，投予疫苗以誘發專一性抗體效價，減輕粗觀及組織病理學肺部病灶，及減少鼻與肺部之病毒量。接種組豬亦證實其平均體重日增量高於未接種組。此等結果證實此重組體新型HA蛋白質可有效作為對抗新型H1N1豬流感之疫苗。
此研究亦證實可使用α病毒複製子表現系統快速且有彈性地製造疫苗。從GISAID資料庫取得新型HA序列開始，到為豬投予第一劑疫苗劑量為止所需時間短於兩個月。製造流感疫苗之傳統方法遠需要更長時間，且需依賴於胚胎蛋中或組織培養細胞上複製病毒，然後再進行失活化處理。在流感大流行時，快速轉換以防止進一步傳播及降低人畜共通可能性很重要。α病毒複製子平台可以快速嵌插任何流感HA(或其他)基因，由於其在流感病毒之間之抗原性轉變及微變性保持恆定，使其成為值得注意之流感疫苗技術。
美國尚未在豬中識別出新型H1N1。然而，已在數個國家之豬群中證實，包括鄰近之加拿大(ProMED-mail，”流感大流行(H1N1)2009(Influenza Pandemic(H1N1)2009)”,Animal health(08)：Singapore,Swine. ProMED-mail;04 Sept: 20090904.3114. www.promedmail.org. 2009;OIE World Animal Health Information Database)”,ProMED-mail；04 Sept：20090904.3114. www.promedmail.org. 2009;OIE World Animal Health Information Database. Vol 22 Nos. 18-40. 2009年4月30日-10月1日。http：//www.oie.int/wahis/public.php？page=weekly_report_index&admin=0.2009)。數項最近研究已提出報導，新型H1N1病毒已從感染豬成功傳播至未曾接觸病毒之豬(Brookes SM、Irvine RM、Nunez A、Clifford D、Essen S、Brown IH、Van Reeth K、Kuntz-Simon G、Loeffen W、Foni E、Larsen L、Matrosovich M、Bublot M、Maldonado J、Beer M、Cattoli G，”豬之流感A(H1N1)感染(Influenza A(H1N1)infection in pigs)”，Vet Rec. 2009 Jun 13；164(24)：760-1. PubMed PMID：19525527；Lange E、Kalthoff D、Blohm U、Teifke JP、Breithaupt A、Maresch C、Starick E、Fereidouni S、Hoffmann B、Mettenleiter TC、Beer M、Vahlenkamp TW，”豬之實驗性感染新型豬源性流感病毒A/H1N1後之病源學及傳播(Pathogenesis and transmission of the novel swine-origin influenza virus A/H1N1 after experimental infection of pigs)“，J Gen Virol. 2009 Sep；90(Pt 9)：2119-23. Epub 2009 Jul 10. PubMed PMID：19592456)。因此，為豬接種疫苗對抗新型H1N1可以預防或延緩病毒進入美國豬族群或降低其在豬及人類族群之發生率，且亦可提高豬肉產品之消費信心。
自已有豬曝露到流感病毒之地區取得動物組織或體液。採用實施例1說明之RT-PCR法單離病毒之HA。將編碼HA之序列導入載體，並溶解已感染複製子之綠猴腎細胞，以製造HA抗原(並與適當輔劑混合)，或於另一實驗中，採用實施例1說明之製法製造RP疫苗。對豬投予疫苗，及測定罹病率與死亡率結果。
實施例3
口蹄疫(FMD)為偶蹄類動物之高度傳染性疾病，其藉由接觸及空氣快速傳播(Bachrach HL，”口蹄疫：對全世界之衝擊及控制法(Foot-and-mouth disease: world-wide impact and control measures)”，述於：Kurstak E、Maramorosch K編輯之”病毒與環境(Viruses and environment.)”，New York：Academic Press；1978. p. 299-310)。FMD已於台灣、日本、南韓、英國及荷蘭爆發，這些國家在過去數十年未曾發生過FMD，因而造成重大經濟損失，包括屠殺大量動物及喪失外銷市場。即使英國在2007年夏天因源於Pirbright地區之政府機構：英國動物健康研究院(Institute of Animal Health)及Merial疫苗製造實驗室之FMDV，而極有限度地爆發FMD爆發，但仍造成重大經濟損失(約1億美元)。此等爆發結果證實沒有FMD的國家(如美國)仍很容易感染此疾病。疾病控制程序包括限制動物流動、屠殺已感染及已曝露之動物，及在某些狀態下接種疫苗。然而，目前疫苗(其係活病毒經過化學性失活化之製劑)之數項缺點包括無法快速誘發保護作用。
可共同表現FMDV衣殼體及3C蛋白酶編碼區之RP疫苗製法係由衣殼體-3C蛋白酶匣導入複製子載體中，產生可用於為牛免疫接種之RP。參見GenBank登錄號AY593768(2005)。衣殼體-3C蛋白酶匣係得自位於USDA、ARS、ARS、NAA普蘭島動物疾病中心外來動物疾病研究單位(NAA Plum Island Animal Disease Center Foreign Animal Disease Research Unit)等公家機構。此等接種疫苗結果顯示於第19圖及表14 。
接受接種一劑1x109 IU之A24 RP之牛在FMDV攻毒後展現免於全身性疾病之幾近完全保護作用(一隻動物在一個蹄上出現病灶，其他動物則沒有症狀)。有一半動物接受5x108 IU之A24 RP，其受到保護免於顯著全身性疾病侵害。劑量A：1x109 IU。劑量B：5x108 IU。”攻毒前”一欄所示之數字代表陽性動物數/總動物數。由接種疫苗後第0、7、14及21天所收集之血清進行病毒分析法。結果如下所示。最高劑量組之所有動物均證實第7天之FMDV中和抗體可維持整個攻毒期間(第21天)。
本文說明兩種對抗口蹄疫病毒(FMDV)之候選之快速反應疫苗製法。第一種製法包括將表現FMDV基因之複製子RNA封裝至顆粒(RP)中。使用自體來源如上述製備類似RP，及依下文所述，為動物接種。純化之RP代表疫苗。第二種製法包括將表現FMDV基因之複製子RNA導入細胞中，產生蛋白質溶胞物；然後在製得疫苗抗原後，溶解已轉染之細胞，收集重組體亞單位(RS)溶胞物疫苗。這兩種基於複製子之方法均有能力區分已接種動物及已感染動物。
製備共同表現FMDV衣殼體及FMDV之3C蛋白酶編碼區之複製子載體。此等FMDV蛋白質之表現產生類似病毒顆粒(VLP)，因為3C蛋白酶處理外殼蛋白質，讓其自行組裝成抗原性VLP。將會表現P1-2A衣殼體編碼區、2B編碼區及完整3C蛋白酶編碼區。(Moraes MP、Mayr GA、Mason PW、Grubman MJ，”投予一劑口蹄疫病毒(FMDV)菌株A24之表現複製缺陷人類腺病毒第5型之衣殼體蛋白質後對抗同源性攻毒之早期保護作用(Early protection against homologous challenge after a single dose of replication-defective human adenovirus type 5 expressing capsid proteins of foot-and-mouth disease virus(FMDV)strain A24)”，Vaccine 2002；20：1631-9)。由於大多數FMDV非結構蛋白質不包括在經基因工程處理進入複製子之基因中，因此接受此基因接種之動物可以與已感染之動物明確區分。
選拔表現最高相對量且產生最高效價RP之複製子純系。採用可與FMCV之所有7種血清型交叉反應之單株抗體進行產率與表現分析。
第一種方法為將表現FMDV衣殼體及3C蛋白酶編碼區之複製子RNA導入培養之細胞中，產生RNA亞單位(RS)疫苗。一旦帶有FMDV基因之複製子進入細胞中後，各該細胞即會表現FMDV蛋白質。溶解細胞，收集細胞中所表現之FMDV蛋白質，產生構成RS疫苗之FMDV蛋白質溶胞物。簡言之，於活體外(Promega RiboMAX轉錄系統)，由複製子質體產生RNA轉錄本，並利用離心管式預注層析管柱(凝膠結合及溶離)或粒度排阻層析法純化，然後經過瓊脂膠體分析法，以分析完整性，及利用紫外線(UV)吸光度定量。取指定質量之複製子RNA與認可之綠猴腎細胞於電穿孔法之測定槽中混合，採用針對轉染效率及蛋白質表現之最佳條件進行脈衝處理。取電穿孔細胞懸浮液接種至各旋轉瓶之培養基(內含血清)中，於37℃及5% CO2下培養18至24小時。培養後，以胰蛋白酶處理細胞，離心集結成塊。細胞集結塊再使用哺乳動物溶胞緩衝液(RIPA溶胞及萃取緩衝液，Thermo Scientific)再懸浮，而溶解細胞。採用西方墨點分析法測定所得溶胞物之效力，以證實蛋白質表現。
在RS效力分析法中，採用針對FMDV VP2衣殼體蛋白質之西方墨點密度測定分析法來測定FMDV抗原之相對濃度。該相對抗原濃度將與採用BCA蛋白質分析試劑(雙辛可寧酸(bicinchoninic acid)，Pierce,Rockford,IL)方法及牛血清白蛋白蛋白質標準曲線所測定之總細胞蛋白質濃度相關。FMDV抗原之最高濃度將基於可能之最小調配稀釋度及與試驗動物之實際接種有關之體積限制而定。除了最高濃度FMDV抗原劑量外，將再調配兩種FMDV抗原溶胞物稀釋度。這兩種其他稀釋度將代表最高劑量之1：5及1：10稀釋度。
第二種方法為產生FMDV RP疫苗。FMDV RP疫苗製法為利用電穿孔法，將表現FMDV基因之複製子RNA及兩個助手RNA引至綠猴腎細胞中。在進行電穿孔約18小時後，自細胞中收集FMDV RP；該RP當藉由接種疫苗導入動物中時，可表現FMDV衣殼體及3C蛋白酶編碼區。簡言之，如上述於活體外，由複製子及助手質體製造RNA轉錄本，並利用離心管式預注層析管柱(凝膠結合及溶離)或粒度排阻層析法純化後，經過瓊脂膠體分析，以分析完整度，並採用紫外線定量。取指定質量之複製子RNA及助手RNA與認可之綠猴腎細胞於電穿孔法之測定槽中混合，採用各種不同參數進行脈衝處理，以判斷針對轉染效率及PR產率之最佳條件。取電穿孔細胞懸浮液接種至各滾轉瓶之無血清培養基中，於37℃及5% CO2下培養18至24小時。培養後，合併來自滾轉瓶中之培養基及細胞，泵壓通過已有填充之深度濾器。使用高NaCl濃度緩衝液，自細胞及濾器中溶離出RP，並存放在-80℃下備用。於CPE分析法中，由抗原專一性IFA測定RP製劑之感染效價，並在指定之MOI下測試，以確定沒有可檢測到之有複製能力之病毒。由CPE分析法得到陰性結果後，則認為RP製劑不需要檢測RCV，隨後可在BL1實驗室條件下操作。
採用效力分析法，依據IFA分析法及qRT-PCR分析法測定RP效價，以決定與各RP相關之RNA數量。決定RNA套數總數量有助於確認每批疫苗之間之一致性。計算效力之方法係以對疫苗H3抗原具專一性之IFA為基礎。觀察H3陽性細胞並定量。於放大10倍下，在孔中每個視野計數格包含20至50個H3陽性細胞下，目測IFA組織培養盤之各孔。每孔共計算5個視野。依相同方式計算兩重覆之孔。採用10個讀數之平均值來計算效力或RP/ml。取10次計數之平均值代入下列公式中，決定H3陽性細胞總數：效力=(平均值)x(稀釋度)x(100)/(0.12)，其中，平均值代表樣本中10次陽性H3細胞計數之平均值，稀釋度代表已經計算H3陽性細胞數平均值之孔數，100為代表組織培養盤之孔中表面積之常數，及0.12為代表所測試RNA顆粒疫苗體積之常數(ml)。
採用針對FMDV VP2衣殼體蛋白質之西方墨點之密度測定分析法測定FMDV抗原之相對濃度。相對抗原濃度將與使用BCA蛋白質分析試劑(雙辛可寧酸(bicinchoninic acid),Pierce,Rockford,IL)方法及牛血清白蛋白蛋白質標準曲線測定之總細胞蛋白質濃度相關。將依據儘可能最低之調配稀釋度及實際對動物接種疫苗時之體積限制，決定FMDV抗原之最高濃度。除了FMDV抗原最高濃度劑量外，亦另外調配FMDV抗原溶胞物之兩種稀釋度。該另外兩種稀釋度將代表最高劑量之1：5及1：10稀釋度。
動物
物種/種系/品系：牛，沒有限制種系或品系
性别：沒有限制
約略初始年齡：接種疫苗時間為3至6個月大。沒有體重限制及/或稱重(第0天)。
約略隻數：登記10隻
供應來源/起源：動物來源於商業農場或生產系統
身份標識：每隻動物均在耳朵上單獨編號
條件/調適：投予研究獸醫用產物(IVP)之前先調適5天
處理/飼養：依據研究單位之標準程序餵食及供水給動物，配合實驗動物管理及使用委員會(Institutional Animal Care an d Use Committee)(IACUC)之核准及設備規定處理動物。
淘汰標準：僅容許臨床上健康之動物登記參與研究。在投予IVP前，由研究員及/或參與之獸醫決定應淘汰之不適合研究之動物。任何於研究中淘汰動物之理由均包括在最終報告中。
分組：在投予IVP前，在分組計畫中記錄已登記參與研究之各動物編號。
接種疫苗及攻毒法
於第0天，收集所有牛之血液(基線)。於第0天，以試驗物(T02、T03)或假接種物(T01)對牛接種一次。於第7天及第14天，收集所有牛(T01至T03)之血液，並測試針對FMDV A24之血清病毒中和(SVN)抗體之存在。依據OIE指示，使用FMDV血清型A24 Cruzerio SGD菌株對牛進行攻毒。進行攻毒投藥時，每隻動物在接受鎮定處理後，於舌部上表面不同部位進行皮內接種(共0.5至1.0 mL)。
RP或RS疫苗特別適合，因為目前美國仍沒有核准之FMDV疫苗。美國反而需依賴其他國家來源，且彼等疫苗似乎對美國菌株及生物型無效。本發明中，以美國為主之FMDV可為生物型，且可快速製備疫苗。
自曾曝露過FMDV病毒之動物部位取得組織或體液。採用實施例1所說明之RT-PCR法單離病毒之FMDV衣殼體及3C蛋白酶編碼區。將序列導入載體中，並以該載體感染綠猴腎細胞後，溶解該細胞，或在另一實驗中，採用實施例1所說明製程製備RP疫苗。對動物投予疫苗，並測定罹病率及死亡率結果。
實施例4
下文中證實以干擾性RNA及自體來源作為動物疫苗之用途。下文所示彼等實驗中製備IMNV疫苗及WSSV VP28疫苗，其使用蝦養殖場作為感興趣之核酸之來源，先於無疾病動物中擴增後才定序。
RNAi序列測定法
為了評估可能針對IMNV誘發RNAi之候選序列，於活體外合成相對應於病毒基因組區之dsRNA。用於活體外轉錄之模板DNA製法為採用自商品取得之核酸純化套組(Qiagen RNeasy Mini)萃取病毒RNA。採用由可取得之序列(GenBank登錄號EF061744)設計之專一性寡核苷酸引子製造針對IMNV基因組之cDNA(Senapin,S.、Phewsaiya,K.,Briggs,M.,Flegel,T. W.，2006，”採用基因組定序法及交替RT-PCR檢測方法證實印尼爆發感染性壞疽病病毒(IMNV)(Outbreaks of infectious myonecrosis virus(IMNV) in Indonesia were confirmed by genomesequencing and use of an alternative RT-PCR detection method)”，Aquaculture 266,32-38)。依據製造商之指示(Thermoscript RT Invitrogen)，添加5 uL之RNA萃液至反應混合物中，並於50℃下培養60分鐘進行逆轉錄。經過逆轉錄後，添加模板cDNA(~50 ng)至PCR套組混合物(PCR master mix)(PuReTaq Ready-To-Go PCR Beads)中，採用IMNV基因組專一區之寡核苷酸引子進行熱循環(表18)。循環條件為95℃下4小時，然後依下列條件進行35次循環：94℃下30分鐘，55℃下30分鐘，72℃下1小時，及最後在72℃下延展10小時。
用於實驗1至3之dsRNA序列(參見本文所附之序列表)：
dsRNA#3(SEQ ID NO：1)
dsRNA#3 5’截型(SEQ ID NO：2)
dsRNA#3 3’截型(SEQ ID NO：3)
dsRNA #2(SEQ ID NO：4)
dsRNA#1(SEQ ID NO：5)
GFP dsRNA (SEQ ID NO：6)
然後選殖產物至pCR4.0載體(Zero Blunt TOPO PCR選殖套組，Invitrogen)，並轉化至大腸桿菌(E. coli)(TOP10,Invitrogen)中。採用來自此等轉化體之質體製劑作為活體外合成dsRNA之模板來源。dsRNA係依據製造商之指示，使用Ambion RNAi套組製備。簡言之，可在一個DNA模板之5’末端使用反向T7 RNA聚合酶或由該區之相反末端之單一T7發動子使用兩個模板，或由兩個模板轉錄成黏接之互補RNA分子。用於轉錄之DNA模板為添加T7發動子序列而使用上述引子序列擴增之PCR產物(參見例如：Ujvari,A及Martin,CT之”T7RNA聚合酶發動子內最基本結合性元素之識別(Identification of a Minimal Binding Element within the T7 RNA Polymerase Promoter)”,J. Mol. Biol.(1997) 273,775-781)；Sousa等人(2003)“T7RNA聚合酶(T7RNA polymerase)”，Prog Nucleic Acid Res Mol Biol 73: 1-41)。PCR循環條件為95℃下4小時，然後依下列條件進行35次循環：94℃下30分鐘，61℃下30分鐘，72℃下i小時，及最後在72℃下延展10小時。此等純系於37℃下培養一夜(16小時)，形成dsRNA。dsRNA產物再與DNase I及RNase培養1小時，採用所提供之管柱進行純化。採用凝膠電泳法證實所合成之dsRNA，並與分子量梯度比對(pGEM ladder,Promega)，並採用光譜測定法定量產物(BioRad SmartSpec)。
動物飼養法
自蝦改良系統(Shrimp Improvement Systems)(Plantation Key,Florida)取得無特定病原菌(SPF)之後期蝦苗，於生物安全動物養殖設備中飼養。動物置入含有人造海水(Crystal Sea Marine Mix)、牡蠣殼打氣式生物濾床及活性碳濾床之1000升塑膠水槽中。以市售肥育飼料餵養動物(Rangen 35/10,Buhl,Idaho)，直到體重為5克為止。
病毒接種菌製法
修改Hasson等人之方法(Hasson,K. W.、Lightner,D. V.、Poulos,B. T.、Redman,R. M.、White,B. L.、Brock,J. A.、Bonami,J. R.，1995，”白對蝦之陶拉症候群：病毒學證據(Taura syndrome in Penaeus vannamei: demonstration of a viral etiology)”，Disease of Aquatic Organisms 23,115-126)進行病毒接種。簡言之，自蝦改良系統(Shrimp Improvement Systems)取得經過PCR測定陽性感染IMNV之完整冷凍動物。自此等動物取出尾部肌肉，於TN緩衝液(0.02 M Tns-HC1，0.4 M NaCl，pH 7.4)中稀釋1：3，並於無菌華林均質器(Waring blender)中均質化5分鐘。取浸解物置入離心管中，於4000 x g下離心。移出上清液，再於15,000 x g下離心30分鐘。於25,000 x g下進行最後一次離心60分鐘。此上清液於無菌2%生理食鹽水中稀釋1：10，經0.2微米針筒過濾器(Whatman)過濾。此澄清液再分等份裝至冷凍管中，於-80℃下冷凍，供用於攻毒試驗。
攻毒劑量測定法
取製好之病毒母液於無菌2%生理食鹽水中稀釋10倍及100倍，製成一系列接種菌稀釋液。取稀釋10倍及稀釋100倍之病毒母液注射至20隻各重5至8克之未曾接受處理之SPF動物之第三腹肢。每日兩次觀察動物死亡率。所有劑量在各種不同時間點均造成100%死亡率。母液濃度費時兩天達到100%死亡率，10倍稀釋液需7天，及100倍稀釋液需12天(第15圖)。採用病毒母液之100倍稀釋液作為所說明攻毒實驗之病毒攻毒劑量。
組織病理學
取死亡前之病危動物先於達威森固定液(Davidson’s fixative)中固定24小時後，再轉移至70%EtOH中。以石蠟包埋組織，切片及使用蘇木染色，分析IMNV病灶之存在。
動物之接種
取dsRNA於不含RNase之水中稀釋至指定濃度，製備雙股RNA(dsRNA)。使用結核菌素針筒注射50 μL至動物第三腹肢。
研究設計#1
在包含人造海水及牡蠣殼打氣式生物濾床之200升水槽中飼養20隻體重5至7克之SPF幼蝦，並適應72小時。適應後，與異源性dsRNA對照組比對，分析對應於IMNV基因組中三個不同節段之四個獨立dsRNA構築體。共接種2 μg活體外合成之dsRNA至動物體內，再隨機分組。接種疫苗48小時後，動物接受IMNV攻毒。每天計算動物死亡率。取病危動物固定處理後，供進行組織病理分析。此處理後，自接種疫苗及接受dsRNA #3攻毒之存活動物(n=16)再飼養60天，再以未稀釋之病毒母液攻毒。
研究設計#2
在包含人造海水之200升水槽中飼養10隻體重5至7克之動物，並適應72小時。適應後，6個實驗組接受2、0.2或0.02 μg劑量之dsRNA構築體(dsRNA #2或dsRNA #3)，對照組接受2 ug異源性eGFP dsRNA對照物。此等動物組分成接種疫苗後2天接受攻毒2天，及接種疫苗後10天接受攻毒。每天分析死亡率，及取病危動物固定處理後，供進行組織病理分析。
結果 實驗#1
其中兩個dsRNA構築體證實對IMNV攻毒具有保護作用。在接種疫苗後30天，dsRNA#2(SEQ ID NO：4)之存活率為62%(38%死亡率)，相較於未接種對照組僅3%(97%死亡率)。dsRNA #3(SEQ ID NO：1)之效力甚至更高，存活率為80%(第16圖)。依據單向變方分析(Oneway ANOVA)，及隨後採用SPSS軟體進行圖奇氏多重比較試驗(Tukey’s multiple comparison test)，計算注射dsRNA #2及#3之動物與對照組之間之顯著差異性(P<0.05)。其證明注射dsRNA #1、dsRNA GFP或2%生理食鹽水對照組之動物之間沒有顯著差異。未攻毒對照組在研究期間仍保持100%存活率。接受非序列專一性dsRNA之動物具有類似未接種組之死亡率。
來自dsRNA#3(SEQ ID NO：1)組之存活動物在接受高100倍之病毒濃度進行第二次攻毒(第一次病毒攻毒後60天)後具有100%(16/16)存活率。此顯示即使在第一次與第二病毒攻毒之間分隔長時期，仍對該攻毒具有可靠之保護作用。
實驗#2
構築體dsRNA #3(SEQ ID NO：1)即使在最低劑量下，及在接種疫苗與攻毒之間分隔最長時期，仍展現最佳保護作用，具有80%存活率(第18圖)。相對之下，低劑量之dsRNA#2(SEQ ID NO：4)對存活率之影響較小，其在攻毒後之存活率為10%與30%。然而，當在48小時後攻毒時，未接種組均無存活率，且非序列專一性投藥組之存活率則為10%(第17圖)。未攻毒對照組之存活率為100%。30天後，依據單向變方分析(Oneway ANOVA)，及隨後採用SPSS軟體進行圖奇氏多重比較試驗(Tukey’s multiple comparison test)，注射dsRNA #2及#3之動物與對照組之間出現顯著差異(P<0.05)。注射RNA #1、dsRNA GFP或2%生理食鹽水對照組之動物之間則無顯著差異。
實驗#3
為了測定是否需要整個dsRNA#3序列來提供上述保護作用，再取兩個由全長度dsRNA#3經過簡單截短後之dsRNA(dsRNA#3 5’截型及dsRNA#3 3’截型)進行測試。如上述採用體重5至7克之動物測試新dsRNA#3序列(各dsRNA使用2μg)。構築體dsRNA #3 3’截型(SEQ ID NO：3)依0.02μg劑量接種疫苗，當傳遞10天後，顯示100%保護性(第19圖)。dsRNA 5’截型(SEQ ID NO：2)及原始dsRNA3(SEQ ID NO：1)則在接種疫苗10天後接受攻毒時，在25天(攻毒後15天)展現90%保護性。
此等實驗顯示，較佳序列對透過下列所說明載體系統傳遞之RNAi啟動組份之劑量及持續時間具有極強烈影響。
採用如上述相同製程之其他截型亦顯示保護作用。154bp序列(dsRNA#3 223-376，SEQ ID NO：61)展現100%保護作用，82bp序列(dsRNA#3 194-275，SEQ ID NO：56)展現100%保護作用及56bp序列(dsRNA#3 219-274，SEQ ID NO：51)展現73%保護作用。
複製子顆粒
如上述製造複製子顆粒(如上述文獻)。
α病毒複製子概念驗證
表現WSSV及IMNV病毒之結構蛋白質及反股序列之α病毒複製子顆粒製法為自已合成之基因序列商品(GeneArt)選殖基因至現成之α病毒主幹載體中。採用自泰國單離之毒性WSSV之序列(AF369029.2 GI：58866698)製造所需WSSV基因(此例中為VP19、VP28，及VP19互補序列(VP19反股序列))。IMNV序列係源於寄存在基因銀行GenBank之自印尼單離之可利用序列(EF061744.1 GI：124303516)，及已公開序列之跨越95-474鹼基區之反向互補序列。基因構築體之設計在5’及3’末端均包括適當限制酶切割位置，以促進選殖至複製子質體中。將保護性分子嵌入複製子載體中後，分析所嵌插之序列，以識別構築體(愛荷華州立大學DNA定序儀)。複製子質體DNA經過線形化後，使用自商品取得之活體外轉錄套組(RiboMAX T7 Express,Promega)，經過失控轉錄法，產生RNA轉錄本。該包含標靶基因之複製子RNA(VP28、VP19、VP19反股、IMNV-dsRNA#3之ssRNA)及編碼VEE衣殼體或醣蛋白基因之兩種助手RNA係採用相同失控轉錄法製備。取指定量(預先優化)複製子及助手RNA與綠猴腎細胞於電穿孔槽中混合，採用預先優化之方形波電穿孔參數進行脈衝處理。添加經過電穿孔處理之細胞之懸浮液至包含無血清培養基之滾轉瓶中，於37℃與5% CO2下培養16至18小時。自培養液中收集複製子顆粒(RP)，由抗原專一性IFA測定RP製劑之感染效價，並於細胞病變效應(CPE)分析法中測試，以確定其中沒有可檢測到之有複製能力之病毒。RP經過分子排阻/離子交換過濾法純化。由IFA測定純化後之整批RP之效力(感染效價)，並調配該製劑，及在-80℃下冷凍。
用於複製子質體之嵌插序列(參見本文所附序列表)：
VP28(SEQ ID NO：29)
VP19(SEQ ID NO：30)編碼蛋白質，其亦轉錄產生dsRNA
VP19-反股(SEQ ID NO：31)
VP19-IR(產生dsRNA之反向重覆DNA)(SEQ ID NO：32)
DNA轉錄產生dsRNA#3之反股股(SEQ ID NO：33)
紅色螢光蛋白質(RFP)(SEQ ID NO：34)
測定所得RP製劑之效價(IU/ml)。所得RP製劑之效價(IU/ml)之代表性實例為：VP-19 RP=1.4E8 IU/mL，VP-28 RP=1.2E8 IU/mL，及VP19-反股RP=5.86E7 IU/mL，IMNV RNA3反股=3.49E8/ml IU/mL。RP製劑均證實沒有可檢測到之有複製能力之病毒，而通過CPE分析。經過釋放分析法後，認為RP適用於下文說明之研究中。實驗#5中再產生一組反股VP19複製子，其可以提高效價至1.26E8IU/mL。
用作攻毒病毒母液之WSSV製劑係採用含有WSSV之毒性菌株之白蝦(L. vannamei)之SPF母群進行擴增(Don Lightner,亞利桑納大學(University of Arizona))。取50隻體重約12克之SPF幼蝦經口曝露至來自病危蝦之WSSV呈PCR陽性之感染組織(所採用之感染組織在使用前係存放在-80℃下)。以TN緩衝液(0.02 M Tris-HC1、0.4 M NaCl，pH 7.4)之1：3稀釋液感染組織，並於華林均質器(Waring blender)中均質化5分鐘。取浸解物置入離心管中，於4000 x g下離心。移除上清液，再於15,000 x g下離心30分鐘。於25,000 x g下進行最後一次離心步驟60分鐘。此上清液於無菌2%生理食鹽水中依1：10稀釋，並經0.2微米針筒濾器(Whatman)過濾。此澄清液再分成等份分裝至冷凍管中，於-80℃冷凍供進行攻毒研究。取病毒接種菌於2%生理食鹽水中製成一系列稀釋度，注射至SPF動物中，測定最優化攻毒劑量。含一份接種菌與10,000份2%生理食鹽水之攻毒劑量在攻毒後14天造成10至20%存活率，以此作為所說明研究之病毒攻毒劑量。
病毒攻毒：在初次注射RP後3天，注射實驗動物進行攻毒。觀察實驗組與對照組在21天期間之死亡率。實驗終止時，剩餘個體經過鎮定處理，及於冰浴中麻醉，完整地固定在達威森固定液(Davidson’s fixative)中，送交組織學分析。取得鰓組織樣本，於-20℃下冷凍以供需要時進行PCR試驗。
實驗#4 實驗設計
取體重約5克之SPF幼白蝦(L.vannamei)置入16個含10隻動物與人造海水(Crystal Sea Marine Mix)之水槽中，鹽度30ppt，保持在25℃。每個實驗組使用三個重覆水槽。在實驗動物腹血腔注射50uL表現VP28(SEQ ID NO：29)或VP19(SEQ ID NO：30)之RP(濃度為10E8IU/Ml)或VP19反股RP(SEQ ID NO：31)(濃度為10E7IU/mL)。假注射對照組則注射50μL之細胞培養基作為對照組。採用VP19裸雙股RNA(SEQ ID NOs：49及50)作為陽性疫苗對照組，因為其在先前實驗中提供100%保護作用。
實驗#5 實驗設計
取體重約5克之SPF幼白蝦(L.vannamei)置入15個含10隻動物與人造海水(Crystal Sea Marine Mix)之水槽中，鹽度30ppt，保持在25℃。在實驗動物腹血腔注射50uL表現VP19之RP(濃度為10E8IU/mL)或VP19反股RP(濃度為10E7IU/mL)。假注射對照組則注射50μL細胞培養基作為對照組。在接種疫苗10天後，採用VP19裸雙股RNA作為陽性疫苗對照組，因為其在先前實驗中提供100%保護作用。
實驗#6　實驗設計
取SPF蝦苗及後期蝦苗置入包含25 mL海水及10E7 IU/mL表現RFP報導子蛋白質之RP之培養皿中。於室溫下進行浸泡曝露2小時。然後將動物轉移至500 mL含海水及氣泡石之燒瓶中。於曝露24、48及72小時後殺死整個蝦苗，採用落射螢光顯微鏡分析螢光。對照組動物則浸入包含細胞培養基之水槽中，採用相同方法分析。採用此研究法來決定a)RP感染性是否可以完整保留通過消化道，及b) RP是否有能力於蝦苗及後期蝦苗動物中感染及表現外來蛋白質。
實驗#7
取體重約5克之SPF幼白蝦(L. vannamei)置入含10隻動物與人造海水(Crystal Sea Marine Mix)之水槽中，鹽度30 ppt，保持在25℃。為了分析接受投予專一性dsRNA或非專一性dsRNA之動物長期保留免疫反應之時間，經IM注射(5μg)動物，投予專一性dsRNA(VP19或VP28)或非專一性(eGFP)，並在投藥後3天進行攻毒。第一次攻毒後，僅觀察到輕微死亡率，在21天後進行第二次攻毒。
實驗#8
為了比較傳遞方法及測定經口傳遞之序列是否具有保護性，取體重約5克之SPF幼白蝦(L. vannamei)置入含10隻動物與人造海水(Crystal Sea Marine Mix)之水槽中，鹽度30 ppt，保持在25℃。實驗動物經過禁食24小時後，注射5μg dsRNA VP19或逆向灌食(灌腸)5μg VP19 dsRNA(於無菌生理食鹽水中稀釋)。於疫苗投藥後14天對動物進行攻毒。
結果 實驗#4
攻毒後21天時，VP19 dsRNA(對照組)、VP19 RP、VP19反股RNA-RP或VP28 RP分別展現100%、70%、40%及40%存活率。陽性對照組展現20%存活率(第20圖)。此研究證實，由RP表現之VP19 dsRNA及VP19可提供保護作用，對抗由WSSV造成之死亡。由實驗1及7可見，觀察到長達至少24天之保護作用。參見第16、17、18及19B圖。所提供之保護作用長達至少30天及至少40天。將重覆此研究，並在接種後分析此保護作用之時效。
實驗#5
在接種疫苗後3天接受攻毒之組中，VP19 RP、VP19反股-RP及陽性對照組分別在攻毒後14天展現5%、35%及0%存活率。在接種疫苗後10天接受攻毒之組中，VP19 dsRNA(對照組)、VP19 RP及VP19反股RNA-RP分別在攻毒後21天展現95%、5%及60%存活率。接種疫苗後10天之陽性對照組展現20%整體存活率。參見第21及22圖。
實驗#6
由於對照組與實驗組之腸組織中均含有自體螢光，因此很難由螢光評估後期蝦苗階段。反之，當與接受RFPRP後48及72小時之對照組比較時，蝦苗階段之評估結果(Mysis及Zoea)證實腸部及鰓部中出現強烈專一性RFP螢光。此表示蛋白質可傳遞至水生無脊椎動物消化道中，且對蝦苗動物進行浸泡式接種疫苗可以提供複製子顆粒可可行之傳遞系統。
實驗#7
在攻毒後21天觀察到VP19(100%存活率)、VP28(83%)、非專一性dsRNA(33.3%)及未接種對照組(20%)之間之存活率出現差異(第23、24圖)。此證實專一性及非專一性dsRNA之間在保護性反應期間出現差異。
實驗#8
經由IM及逆向灌食對動物投與VP19 dsRNA，與對照組比較，證實其具有保護作用(存活率分別為95%及100%)(第25圖)。
實驗#9 研究設計：
在200升水槽中飼養體重3至5克之SPF生長期動物，並適應24小時。在水槽中加裝牡蠣殼打氣式生物濾床，讓其在含氨之LT水槽中成熟。將動物分成三組，一組接受dsRNA3 82 bp dsRNA片段，一組接受eGFP(綠色螢光蛋白質(GFP)基因(Sheen等人之.,Plant J.(1995) 8(5)：777-84)作為異源性dsRNA對照處理組，及另一組接受無菌水作為無dsRNA處理組。dsRNA處理組接受100μL含5μg活體外合成dsRNA注射2天後，以IMNV攻毒。動物接受1：100稀釋度之IMNV澄清液攻毒2天後，再接種dsRNA疫苗。每天計算各組動物數量共30天，並分析死亡率。取病危動物於達威森固定液(Davidson’s fixative)中固定，供進行組織學分析。取得肌肉組織樣本，進行qPCR分析。結束研究時，動物冷凍在-80℃下。
用於製造dsRNA #3之引子為SEQ ID NO：59、SEQ ID NO：60，產生SEQ ID NO：56。製造GFP之引子包括SEQ ID NO：7、SEQ ID NO：8，且SEQ ID NO：6為製造對照組之GFP dsRNA之DNA。
結果
接受dsRNA3 82bp處理之動物在經過IMNV攻毒後，證實有50%存活率。相較於接受eGFP dsRNA或無菌水之對照組動物則證實其存活率為0%(第26圖)。
結論
當在感染IMNV 2天後投藥，dsRNA 3 82bp可成功降低死亡率。
實驗#9
實驗動物
取體重3至5克之無專一性病原菌(SPF)白蝦(L.vannamei)飼養在200L水槽(10動物/槽)中，讓其適應48小時。每個水槽包含裝設有牡蠣殼生物濾床及活性碳之人造海水。
飼料調配物
使用VP19 dsRNA(如上述SEQ ID NO：30)或IMNV dsRNA3(非截型，SEQ ID NO：1)製備以幾丁聚醣包埋之顆粒。取0.2克幾丁聚醣溶於100ml乙酸鈉緩衝液。取1.0mL此溶液移至含99ml之50mM乙酸鈉緩衝液之新瓶子內(1：100稀釋度)，產生0.002% w/v幾丁聚醣溶液。取120μg之各dsRNA(VP 19及dsRNA3)於硫酸鈉溶液(0.2M乙酸鈉及0.2M乙酸)中稀釋至總體積300μl。取300μl之dsRNA溶液與300μl之0.002%幾丁聚醣溶液合併。溶液於55℃水浴中加熱1分鐘，並快速渦轉混合30秒。試管隨後在13,200 x g下離心10分鐘。離心後，利用吸管使溶液再懸浮，並加在1克磨成粉之飼料上。先添加全部600μl幾丁聚醣-dsRNA溶液，然後添加600μl之2%瓊脂糖。使用吸管尖頭混合飼料，形成混合均勻之團塊，幾分鐘後即固化。
實驗設計
3天後，使用100μL經過0.2微米過濾且於2%無菌生理食鹽水中稀釋WSSV 1：1×105之WSSV澄清液攻毒各處理組之蝦。每天餵養10%生質量，並每天換水10%，以排除脫殼、過量之飼料及排便物。觀察死亡率21天，取死亡動物樣本在-80℃下冷凍，供進一步試驗。
結果
使用WSSV攻毒後，接受包覆VP19 dsRNA之飼料處理之動物證實有67%存活率。此外，接受包覆含VP19 dsRNA之幾丁聚醣奈米顆粒之飼料處理之動物在經過WSSV攻毒後，證實有33%存活率。而接受假處理飼料之動物(陽性對照組)則在攻毒後之存活率為0%(參見第27圖)。
實驗#10
HV156：dsRNA期間
該實驗證實接種疫苗後30天之dsRNA81(194-275)及dsRNA3(95-474)疫苗效力。
在15個200升水槽中飼養體重3至5克之SPF生長期動物，並讓其適應24小時。在水槽中裝設牡蠣殼打氣式生物濾床，讓其在含氨之LT水槽中成熟。對dsRNA處理組注射100μL於無RNase水中稀釋之2.0μg之dsRNA(DE3發酵產物，參見Timmons等人之2001文獻)。投予dsRNA後30天，使用致死劑量之IMNV注射動物進行攻毒。攻毒後每天分析各組共21天，並評估臨床症狀及死亡率。
結果
本研究法係於第51天(攻毒後21天)結束。結束時，處理組之存活率顯著高於(P<.0001，採用圖奇氏HSD試驗(Tukey’s HSD)後進行單向ANOVA)對照組。接受投予dsRNA3之動物在接受dsRNA3後具有100%存活率，接受dsRNA81之動物之平均存活率為93.33%(90%、90%及100%)。假投藥之對照組則在結束具有6.67%之平均存活率(0%、10%及10%)(第28圖)。
結論
於DE3大腸桿菌中製造之這批dsRNA3及dsRNA81產物對致死性IMNV攻毒具有高度保護性，長達投藥後30天。
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<213>　人工序列
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<223>　人工序列說明：合成性聚核苷酸
<400>　43
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<211>　875
<212>　RNA
<213>　人工序列
<220>
<223>　人工序列說明：合成性聚核苷酸
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<221>　經修飾鹼基
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<223>　a,c.u,g,未知或其他
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<212>　RNA
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<212> RNA
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<213> Penaeid shrimp infectious myonecrosis virus
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<213>　斑節蝦之感染性壞疽病病毒
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<212>　DNA
<213>　人工序列
<220>
<223>　人工序列說明：合成性寡核苷酸
<400>　79
第1A圖係VEE基因組構造及複製策略之圖示說明，及第1B圖係VEE複製子顆粒疫苗及封裝系統之圖示。
第2圖係IMNV基因組轉錄及轉譯產物之圖示，其顯示靶向RNAi之區域，以深灰線或灰影指示預測之蛋白質產物，以深黑線表示製造dsRNA之標靶區域。
第3圖係載體pERK-3/M/GP5之圖譜。
第4圖係顯示不同處理組之肺部粗觀總得分之圖示。以不同字母表示之處理組出現顯著差異(ANOVA，p<0.05)。
第5圖係顯示不同處理組之間質性肺炎得分之圖示。以不同字母表示之處理組出現顯著差異(ANOVA，p<0.05)。
第6圖係顯示綜合肺部淋巴性增生得分之圖示。以不同字母表示之處理組出現顯著差異(ANOVA，p<0.05)。
第7圖係顯示綜合心臟病變得分之圖示。以不同字母表示之處理組出現顯著差異(ANOVA，p<0.05)。
第8圖係顯示每組之平均IDEXX ELISA S/P效價之圖示。以不同字母表示之各組在攻毒後之天數內出現顯著差異(ANOVA，p<0.01)。各組之長條圖依序代表：嚴格陰性、安慰劑、ARP、失活化及MLV。
第9圖係顯示各組中FFN效價4之豬數量之圖示。以不同字母表示之各組在攻毒後之天數內出現顯著差異(卡方測定，p<0.05)。各組之長條圖依序代表：嚴格陰性、安慰劑、ARP、失活化及MLV。
第10圖係顯示各組之FFN效價幾何平均值之圖示。以不同字母表示之各組在攻毒後之天數內出現顯著差異(ANOVA，p<0.01)。各組之長條圖依序代表：嚴格陰性、安慰劑、ARP、失活化及MLV。
第11圖係顯示在攻毒後7天滴定活病毒效價之圖示。以不同字母表示之各組出現顯著差異(ANOVA，p<0.01)。
第12圖係顯示每組10隻豬中透過RT-PCR測定為PRRSV陽性血清之豬數量之圖示。以不同字母表示之各組在攻毒後之天數內出現顯著差異(卡方測定，p<0.05)。各組之長條圖依序代表：嚴格陰性、安慰劑、ARP、失活化及MLV。
第13圖係證實重組體HA表現之西方墨點結果。第1條帶為標準梯度；第2條帶：綠猴腎細胞溶胞物(陰性對照組)；第3條帶：重組體HA(28.5μg/ml)；第4條帶：重組體HA(1.14μg/ml)；第5條帶：重組體HA(0.57μg/ml)；第6條帶：重組體HA(0.38μg/ml)。
第14圖係顯示在接種疫苗後或攻毒後指定天數時，測定對抗FMDV A24之中和抗體之研究之圖示。對照組為各組中第一條長條圖，劑量A為第二條長條圖，及劑量B為第三條長條圖。
第15圖係顯示澄清後之接種菌於2%生理食鹽水中稀釋製成之一系列稀釋液之圖示。假接種法係接受等劑量之2%生理食鹽水。每種處理之N=20隻蝦。
第16圖係顯示實施例4中實驗1之結果之圖示。對蝦注射2 μg之dsRNA構築體，並在投藥後48小時使用IMNV攻毒。每種處理之N=3組20隻蝦。
第17圖係顯示實施例4中實驗2之結果之圖示。使用dsRNA之一系列稀釋液接種蝦，並在投藥後48小時進行攻毒。每種處理之N=10隻蝦。
第18圖係顯示實施例4中實驗2之結果之圖示。使用dsRNA之一系列稀釋液注射蝦，並在投藥後10天進行攻毒。每種處理之N=10隻蝦。
第19A圖係顯示實施例4中實驗3之結果之圖示。對蝦注射0.02μg之dsRNA#3、dsRNA3之3’截型或dsRNA3之5’截型，並在投藥後10天進行攻毒。每種處理N=3組10隻蝦。
第19B圖係顯示實施例4中實驗3之結果之圖示，其中，如圖19A所示進行注射，但改用其他截型dsRNA#3。
第20圖係顯示實施例4中實驗4之結果之圖示。對蝦接種複製子或dsRNA a16nd，並在投藥後3天進行攻毒。每種處理之N=3組10隻蝦。
第21圖係顯示實施例4中實驗5之結果之圖示。對蝦接種複製子，並在投藥後3天進行攻毒。每種處理之N=3組10隻蝦。
第22圖係顯示實施例4中實驗5之結果之圖示。對蝦接種複製子，並在投藥後10天進行攻毒。每種處理之N=3組10隻蝦。
第23圖係顯示實施例4中實驗8在第一次攻毒後之WSSV存活率結果之圖示。
第24圖係顯示第一次攻毒後21天進行第二次WSSV攻毒後之存活率之圖示。
第25圖係顯示利用注射法或逆向灌食接種疫苗後之存活率之圖示。動物於接種疫苗後14天進行攻毒。
第26圖係顯示在經過攻毒後2天投予dsRNA，經過攻毒後之動物存活率之圖示。X軸為攻毒後天數。Y軸為存活率百分比。dsRNA3與eGFP dsRNA組係接受5μg之dsRNA處理，及攻毒對照組係接受等體積無菌水處理。
第27圖係顯示使用包含不同溶液之飼料處理後之蝦存活百分比之圖示。X軸為使用WSSV感染後天數，及Y軸為動物存活百分比。n=30隻動物，每種處理三重覆，各10隻。
第28圖係顯示以不同長度之dsRNA接種後(第0天)及感染IMNV後(第10天)之蝦存活率之圖示。IMNV基因組上之dsRNA標靶位置及長度係以註解說明。

Claims (16)

  1. 一種用於保護水生無脊椎動物免於感染性壞疽病病毒(IMNV)之組成物之製造方法，包括：a)識別IMNV之標靶核酸分子，其中該標靶核酸分子係SED ID NO：72或其片段；b)製備選自下列所組成群組之保護性分子：(i)dsRNA分子，包含可以雜合至該標靶核酸分子之至少一種RNA分子；及(ii)反股RNA分子，包含作為該標靶核酸分子之互補之序列；以及c)製備包含該保護性分子之組成物；其中該組成物不包含含有該保護性分子之表現匣或載體，且該組成物包含水生無脊椎動物餵料，其中該組成物當經口投予至水生無脊椎動物時保護該水生無脊椎動物免於IMNV，其中該動物係蝦子。
  2. 如申請專利範圍第1項所述之方法，其中，包含對應於所有或一部份之該標靶核酸分子之序列之該至少一種RNA分子係選自至少10bp、至少20bp、至少30bp及至少50bp之RNA分子所組成之群組。
  3. 如申請專利範圍第1項所述之方法，其中，該dsRNA進一步包含作為所有或一部份之該標靶核酸分子之互補之至少一種RNA分子。
  4. 如申請專利範圍第3項所述之方法，其中，包含對應於所有或一部份之該標靶核酸分子之序列之該至少一種RNA分子，以及該作為所有或一部份之該標靶核酸分子之互補之至少一種RNA分子係選自至少10bp、至少20bp、至少30bp及至少50bp之RNA分子所組成之群組。
  5. 如申請專利範圍第1項所述之方法，其中，該dsRNA係經由選自下列所組成群組之核酸分子製造：SEQ ID NO：1、SEQ ID NO：2、SEQ ID NO：3、SEQ ID NO：4、SEQ ID NO：51、SEQ ID NO：56和SEQ ID NO：61以及其片段，其中，該dsRNA分子係產生保護性反應。
  6. 如申請專利範圍第3項所述之方法，其中，對應於所有或一部份之該標靶核酸分子之該RNA係選自下列所組成之群組：SEQ ID NO：35、SEQ ID NO：37、SEQ ID NO：39、SEQ ID NO：41、SEQ ID NO：52、SEQ ID NO：57和SEQ ID NO：62以及其片段，以及作為所有或一部份之該標靶核酸分子之互補之該RNA係選自下列所組成之群組：SEQ ID NO：36、SEQ ID NO：38、SEQ ID NO：40、SEQ ID NO：42、SEQ ID NO：53、SEQ ID NO：58和SEQ ID NO：63以及其片段。
  7. 如申請專利範圍第1項所述之方法，其中，保護性分子係經投予，使得該顆粒被傳遞至該動物之消化道。
  8. 如申請專利範圍第1項所述之方法，其中，在曝露後，保護該動物免於IMNV至少20天。
  9. 一種用於經口投予水生無脊椎動物之餵料組成物，包含選自下列所組成群組之保護性分子：a)dsRNA分子，包含可與IMNV之標靶核酸分子雜合之至少一種RNA分子，其中該標靶核酸分子係SED ID NO：72或其片段；及b)反股RNA分子，包含IMNV之標靶核酸分子之互補之序列，其中該標靶核酸分子係SED ID NO：72或其片段；其中，該組成物不包含含有該保護性分子之表現匣或載體且當對該水生無脊椎動物經口投予時，該保護性分子保護該動物免於IMNV，其中該動物係蝦子。
  10. 如申請專利範圍第9項所述之餵料組成物，其中，該至少一RNA分子或該dsRNA係如申請專利範圍第2、3、4、7或8項所定義者。
  11. 如申請專利範圍第9項所述之餵料組成物，其中，該保護性分子係經投予以使該保護性分子係經傳遞至該動物的消化道。
  12. 如申請專利範圍第9項所述之餵料組成物，其中，在曝露後，保護該動物免於IMNV至少20天。
  13. 一種保護性分子於製備用於保護水生無脊動物免於感染IMNV之藥劑的用途，其中該保護性分子係選自下列所組成群組：(i)dsRNA分子，包含可與IMNV之該標靶核酸分子雜合之至少一種RNA分子；及(ii)反股RNA分子，包含作為IMNV之該標靶核酸分子之互補之序列；其中，該保護性分子係不含在表現匣或載體中，其中該標靶核酸分子係SED ID NO：72或其片段。
  14. 如申請專利範圍第13項所述之用途，其中，該至少一RNA分子或dsRNA係如申請專利範圍第2、3、4、5或6項所定義。
  15. 如申請專利範圍第13項所述之用途，其中，該保護性分子係經投予以使該保護性分子係經傳遞至該動物的消化道。
  16. 如申請專利範圍第13項所述之用途，其中，在曝露後，保護該動物免於IMNV至少20天。
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