TWI627966B - 用於輸送治療劑至腦腫瘤之細菌衍生的完整微細胞 - Google Patents

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Abstract

完整的、細菌衍生的微細胞的全身性投藥在治療顯著的濃度下致使微細胞在一腦腫瘤的微環境中快速的累積，不需要穿過血腦障壁的內皮胞吞作用/胞吞轉送作用或藉由根據傳統的方法的任何其它機制，奈米粒子已進入至那微環境中。因此，各種不同的腦腫瘤，原發性與轉移性這兩者，可以藉由全身性投藥一治療有效量的一包含有複數個該等微細胞的組成物而被治療，各個微細胞是一用於對抗腫瘤的一活性劑的載劑，諸如放射核種、一功能性核酸或一編碼一功能性核酸的質體，或者一化學治療劑。

Description

用於輸送治療劑至腦腫瘤之細菌衍生的完整微細胞
本發明是有關於用於輸送治療劑至腦腫瘤之細菌衍生的完整微細胞。
發明背景
原發性腦腫瘤(Primary brain tumors)是由一不同群的腫瘤[衍生自各種不同的細胞譜系(cell lineages)]所構成。根據世界衛生組織分類(Louis et al.,2007)，中樞神經系統的腫瘤被分類為星形(astrocytic)、寡樹突神經膠質(oligodendroglial)或混合型[寡星形(oligoastrocytic)]。這些腫瘤藉由亞型而被進一步分類並且根據組織學而被分級為I至IV，以第IV級為最侵犯性。多形性神經膠質母細胞瘤(Glioblastoma multiforme,GBM)，最侵犯性的原發性惡性腦腫瘤的類型，佔所有原發性腦腫瘤的大約45%至50%(Wrensch et al.,2002；Behin et al.,2003)並且在35歲的年齡以下的成人中扮演癌症死亡的第二大原因(Allard et al.,2009)。
儘管許多的治療努力，包括減積手術 (cytoreductive surgery)、放射治療(radiation therapy)以及化學治療(chemotherapy)，針對神經膠瘤(glioma)病患的預後仍然非常不足(Stewart,2002；Stupp et al.,2005)。大多數最後逐漸發展為復發性以及進行性疾病，在此之後中位數存活(median survival)為大約6個月(Wong et al.,1999；Lamborn et al.,2008)。針對GBM病患的中位數存活是大約12-14個月(Stupp et al.,2005)。
另外，來自於原發性腫瘤[諸如乳房、肺以及皮膚(黑色素瘤)]的腦轉移是一種顯著的以及發展中的公共衛生問題。在2009年，在美國估計有250,000的病患被診斷有腦轉移(brain metastases)(Fox et al.,2011)，這要比原發性腦腫瘤的發生率多出10-倍以上(Jemal et al.,2009)。針對具有腦轉移的病患的預後是非常不足的，並且大多數的病患在診斷之後存活僅4-6個月。現行的治療攝生法(treatment regimens)提供微小的存活效益(Eichler and Loeffler,2007)。
由於神經膠瘤擴散浸潤性的本性以及鄰近於活體腦結構，完全的外科切除是幾乎不可能的。由於所謂的血腦障壁(blood brain barrier,BBB)，全身性治療亦是被限制的。參見，大體而言，Cecchelli et al.(2007)。
此障壁存在於腦的毛細管內皮(capillary endothelium)中，並且其已是一歷時超過100年的研究對象。確切地，大多數用於腦腫瘤的藥物候選者從未成功至臨床(Pardridge,2007)的事實主要是歸因於其等不能越過BBB並 且達到具有一治療效用的位準(Groothuis,2000)。
儘管歷時數十年之大量的努力，在治療腦癌上的治癒率仍是非常不好的。腦癌治療因而在腫瘤學中代表最大的挑戰之一。此外，普遍的共識是BBB是藥物輸送至腦腫瘤中的主要限制性因素。
因此，全世界有相當多的努力是朝向開發以及發展足夠小去越過BBB並且改善GBM病患的存活結果的新藥物。另外，運送藥物通過BBB並且進入腦腫瘤微環境(brain tumor microenvironment)中的技術正在開發中。
下列為已被研究的試圖避開BBB限制之方法：
1.高張溶液的BBB破壞(Hyperosmotic BBB disruption)(Kroll and Neuwelt,1998)。
2.化學屏障修飾(Chemical barrier modification)(Black et al.,1997)。
3.試圖將治療劑與具有跨越BBB的輸送體的化合物聯結(Bickel et al.,2001；Zhang and Pardridge,2007)。
4.將藥物直接投藥至腦腫瘤中及其周圍(Hassenbusch et al.,2002；Hau et al.,2002；Reardon et al.,2002；Weber et al.,2002)。此方法需要將藥物-裝填的粉片(drug-loaded wafer)放置在一腫瘤切除床(tumor resection bed)周圍，將試劑滴注至一腫瘤切除空腔中或其周圍，或將藥物直接滴注至腫瘤團塊(tumor mass)中。
5.對流增強輸送法(Convection-Enhanced Delivery)或“CED”(Bobo et al.,1994；Morrison et al.,1994； Hadjipanayis et al.,2008；Hadjipanayis et al.,2010)。在CED中，一小的流體靜壓力差(hydrostatic pressure differential)是藉由一注射泵(syringe pump)而被施加，俾以直接地分配輸注液至中樞神經系統(central nervous system,CNS)的區域。CED是一種極小侵入性的外科方法，其藉由一壓力梯度(pressure gradient)(此可通過BBB)在腦中提供流體對流(fluid convection)。治療劑可以以一最低的毒性被輸送至腦中，因此亦能輸送至正常組織及輸送至常藉由全身性輸送進入的器官。
發明概要
鑑於影響在這領域中傳統的方法的缺點，一方法被提供來用於全身性投藥以一治療有效量的一包含有複數個完整的、細菌衍生的微細胞(minicell)的組成物，其中該複數個微細胞當中的每一者包含一抗-腫瘤試劑(anti-neoplastic agent)。同樣地，本詳細說明預期該組成物供用於製備一用來治療一腦腫瘤之醫藥品的用途。該複數個可以包括至少大約108微細胞，包括，但不限於，至少1010微細胞。此外，一如此處所述的組成物可以含有少於大約10EU游離內毒素(free endotoxin)和/或每108微細胞(例如，每1010微細胞)至多1親代細菌細胞(parent bacterial cell)。
由微細胞所圍繞的抗-腫瘤試劑可以是一放射核種(radionuclide)(例如，諸如釔-90、鎝-99m、碘-123、碘-131、銣-82、鉈-201、鎵-67、氟-18、氙-133，或者銦-111)，其 可以被附著於在微細胞的表面上的一蛋白質或一碳水化合物，或者其可以被附著於在微細胞的表面上所附著的腫瘤標靶配位子的表面上。在本文中，該組成物可以含有，例如，介於大約30Gy至大約100Gy之間的放射性。該抗-腫瘤試劑亦可以是一化學治療藥物(chemotherapy drug)，其中，例如，該組成物含有至多大約1mg的化學治療藥物。此外，該抗-腫瘤試劑可以是一功能性核酸(functional nucleic acid)或一編碼一功能性核酸的聚核苷酸(polynucleotide)。因此，該功能性核酸可以抑制一促進腫瘤細胞增生(proliferation)、血管生成(angiogenesis)或抗化學治療和/或抑制細胞凋亡(apoptosis)或細胞週期停滯(cell cycle arrest)的基因。例示的功能性核酸的種類是選自於下列所構成的群組中的核糖核酸分子：siRNA、miRNA、shRNA、lincRNA、反訊息RNA(antisense RNA)以及核糖酵素(ribozyme)。
根據前述的任何特定的具體例，上述複數個微細胞當中的每一者可包含有一對於一非-吞噬哺乳動物細胞表面受體(non-phagocytic mammalian cell surface receptor)[例如，一腫瘤細胞抗原(tumor cell antigen)]具有一專一性的配位子。因此，該配位子可包含有，例如，一專一性地辨認該腫瘤細胞抗原的抗體。
本詳細說明的方法學可被用來治療一系列的腦腫瘤，由下列所構成的群組而被例示，但不限於：神經膠質母細胞瘤(glioblastoma)、星形細胞瘤(astrocytic tumor)、寡樹突神經膠細胞瘤(oligodendroglial tumor)、室管膜瘤 (ependymoma)、顱咽管瘤(craniopharyngioma)、腦下垂體瘤(pituitary tumor)、腦的原發性淋巴瘤(primary lymphoma of the brain)、松果腺瘤(pineal gland tumor)、腦的原發性生殖細胞瘤(primary germ cell tumor of the brain)，以及其等之組合。被治療的腫瘤可以是一原發性腦腫瘤(primary brain tumor)或一轉移性腦腫瘤(metastatic brain tumor)。
其它目的、特徵以及優點是由以下的詳細說明而變得明顯。詳細說明以及特定的實施例是僅供用於例示說明，由於在特定的具體例之精神以及範疇內各種不同的改變以及修飾將由此詳細說明而變得明顯。
圖1：人類(U87-MG)及狗的腦腫瘤細胞[以抗-EGFR MAb處理，繼而R-藻紅素綴合的山羊抗-小鼠IgG(R-phycoerythrin conjugated goat anti-mouse IgG)處理]上之EGF受體定量。使用FACS分析該等細胞並與螢光的R-藻紅素微珠標準品相比較。除了一次抗體之外，對照組細胞是以相同的方法予以處理。EGFR定量結果顯示，針對BCD-1、U87-MG、BCD-9、BCD-8以及J3T細胞之每個細胞的EGFR濃度(呈一遞減的順序)分別為2,866,854、1,465,755、930,440、774,352以及287,622。針對各個細胞株的結果被顯示為對照組(帶有深色邊緣的曲線)以及抗-EGFR MAb-處理的(沒有深色邊緣的曲線)。
圖2：顯示用以測定狗及人類(U87-MG)的腦癌細胞對於多柔比星(Doxorubicin)之敏感度的一細胞增生(MTS) 分析的結果多柔比星(Doxorubicin)。誤差槓：±SEM。
圖3：來自於FACS分析的代表性灰階分布圖顯示EGFR微細胞Dox結合至狗及人類腦癌細胞的效率。在各個例子中>95%的細胞顯示EGFR微細胞Dox的顯著的結合。被處理以非-專一性標靶的gp120微細胞Dox的細胞未顯示任何與細胞的結合。抗-gp120抗體是針對HIV病毒殼蛋白質gp120(HIV viral capsid protein gp120)，其在任何的腫瘤細胞中未被發現到。
圖4：人類以及狗的腦腫瘤細胞被處理以EGFR微細胞DOX以及對照組gp120微細胞Dox歷時3小時。被結合至腫瘤細胞的微細胞是在處理以山羊抗-小鼠IgG2a-AF488(綠色螢光，以較淺色的網點而被顯示)[其結合至一被用來標靶各自的微細胞的雙專一性抗體(bispecific antibody)的抗-LPS組分(IgG2a)]之後而被顯影。右側的影像或各個縱向區是針對dox自體螢光(紅色螢光，有如較深色的網點)而被顯影以及顯示dox是在大多數經轉染的細胞的核內。影像是利用Leica螢光顯微鏡而被拍攝。比例尺：20μm。
圖5：以EGFR微細胞Dox治療後，在帶有晚期腦腫瘤的7隻狗中的腫瘤穩定化/退化。針對各隻狗在治療之前(預劑量)的MRI掃描是被顯示於左側的縱向欄位中。中間以及右側的縱向欄位顯示以EGFR微細胞Dox治療後的MRI掃描，以及針對各個MRI的用劑後數目是被顯示。經描繪的MRI截面包括矢狀(BCD-1以及-6)、軸向(BCD-2至-5)以及冠狀(BCD-7)。腫瘤體積(大小呈cm)被顯示於各個MRI下方，以 及一箭頭意指各自腫瘤的位置。
圖6：針對帶有腦癌的7隻狗(BCD-1至BCD7)之血清生化參數(serum biochemistry parameter)在治療後被測定。在各個圖中的水平線代表在狗中的正常參考範圍。誤差槓：±SEM。
圖7：帶有腦癌的7隻狗(BCD-1至BCD7)的治療後血清血液學參數(serum hematology parameter)被測定。在各個圖中的水平線代表在狗中的正常參考範圍。誤差槓：±SEM。
圖8：7隻腦癌狗在以EGFR微細胞Dox治療後的血清TNFα、IL-6以及IL-10反應被說明。
圖9：以EGFR微細胞Dox治療後，7隻腦癌狗(存活)中的抗-LPS抗體反應被描繪。
圖10：例示說明帶有腦癌的7隻狗之存活(天數)(左側的y-軸並以長條表示)是隨著被投藥的EGFR微細胞Dox的劑量數目(右側的y-軸並以與各個長條相聯結的菱形顯示)。有條紋的長條表示持續的以及在緩解中的狗。較深色的實心長條表示顯示穩定的疾病直到腫瘤復發的狗，可能由於dox抗性的發生，以及這些狗被安樂死。較淺色的實心長條是有關在緩解中但死於一無關的感染的一隻狗。
圖11：(a)T1對比後的MRI以及SPECT的對位的掃描分別地被顯示[(i)以及(iii)]，以及在一經融合的影像展現(ii)下呈3正交平面(冠狀、矢狀以及橫軸)。攝取的面積以及其被定位的區域是藉由箭頭被表示。攝取要比在額外的- 大腦病灶中還低，在頭部的任一側上被雙向地看見，但其是在腦內所觀察到的唯一攝取。(b)針對另一隻動物的結果被顯示。僅有針對MRI(i)以及SPECT(iii)的橫軸視圖被展現。在MRI上所證明的，強烈的攝取異常是明顯的。影像(ii)是T1對比後的MRI、SPECT以及經融合的影像的一對位的展現。箭頭表示一經放射性標記的微細胞的強烈定位的面積，其對應於在MRI掃描上的部分異常。(c)被顯示的是在注射後第30分鐘以及第3小時之時全身、2D平面影像。與甲狀腺以及某些頸部攝取一起，早期攝取在肝臟中被看見，在晚期掃描中可看見帶有一些排泄至腸中。
圖12：在Balb/c nu/nu小鼠(每組n=8)中人類胰腺癌(MIA PaCa)異種移植物(xenograft)被i.v.投藥以游離的吉西他賓(Gemcitabine)(Gemzar®)或EGFR-標靶的、Gemzar-包裝的微細胞(EGFR微細胞Gemzar)任一者。所有的微細胞治療接受每劑量109微細胞。治療天數被顯示於x-軸(三角形)下方。誤差槓：+/- SEM。圖表顯示在投藥之後的指示的天數之時的腫瘤體積。
圖13：在Balb/c nu/nu小鼠(每組n=8)中人類乳癌(MDA-MB-468)異種移植物被i.v.投藥以游離的卡鉑(carboplatin)或微細胞(以卡鉑而被包裝)，其是非-標靶的或EGFR-標靶的(EGFR微細胞卡鉑)任一者。所有的微細胞治療接受每劑量109微細胞。治療天數被顯示於x-軸下方(箭頭)。誤差槓：+/- SEM。圖表顯示在投藥之後的指示的天數之時的腫瘤體積。
較佳實施例之詳細說明
本揭露內容提供用於治療腦腫瘤的組成物以及方法。在此方面，發明人發現：當全身性投藥時，被包裝以一或多種抗-腫瘤試劑的完整的、細菌衍生的微細胞在治療顯著的濃度下快速地累積於一腦腫瘤的微環境中。此發現是令人意外的，因為微細胞(大約呈400nm的直徑)要比傳統的理解設定為一能夠通過血腦障壁(BBB)的粒子之12nm的上限還大得多。參見Sarin et al.(2008)以及Laquintana et al.(2009)。
因此，發明人確定：各種不同的腦腫瘤，原發性與轉移性這兩者，可以藉由全身性投藥以一治療有效量的一包含有複數個該等微細胞的組成物而被治療，各個微細胞是一用於對抗腫瘤的一活性劑的載劑(vehicle)。
(A)定義
除非另外有所定義，在本詳細說明中所使用的所有技術性與科學術語具有有如由那些熟習此相關技藝者所共同瞭解的相同意義。
為了方便，在說明書、實施例以及隨文檢附的申請專利範圍中所使用的特定的術語以及慣用語的意義在下面被提供。其它的術語以及慣用語在說明書各處而被定義。
除非本文另外清楚地指定，單數的形式“一”、“一種”以及“該”包括複數的引述。
在此處被相互交換使用的，“癌症(cancer)”、“腫瘤(neoplasm)”、“腫瘤(tumor)”、“惡性(malignancy)”以及“癌(carcinoma)”，意指展現出特徵為細胞增生的一顯著的失控的一異常的生長表現型的細胞或組織。本揭露內容的方法以及組成物特別適用於惡性的、轉移前的、轉移性以及非-轉移性細胞。
“藥物”意指在動物(特別是哺乳動物以及人類)中產生一局部的或全身性效用的任何生理上或藥用活性物質。
在本詳細說明中被相互交換使用的術語“個體(individual)”、“個體(subject)”、“宿主(host)”以及“病患(patient)”，意指任何哺乳動物個體，有關牠們的診斷、治療或治療是所欲的。個體、個體、宿主或病患可以是一人類或一非-人類動物。因此，適合的個體可包括，但不限於：非-人類靈長動物、牛、馬、狗、貓、天竺鼠、兔、大鼠以及小鼠。
術語“治療(treatment)”、“治療(treating)”、“治療(treat)”以及類似者意指在一腦腫瘤病患中獲得一所欲的藥理學的和/或生理學的效用。該效用在完全或部分預防的腦腫瘤或其之症狀上可以是預防性的和/或在腦腫瘤和/或歸因於腦腫瘤的副作用的一部分或完整的穩定或治癒上可以是治療性的。治療涵蓋在一哺乳動物(特別是一人類)中的一腦腫瘤的任何治療。特別地，一所欲的效用是腫瘤反應，其可被測量為腫瘤團塊的減少或腫瘤團塊增加的抑制。除 了腫瘤反應之外，總存活、無惡化存活(progress-free survival)或腫瘤復發時間的增加或一副作用的減少在臨床上亦可被用來作為一所欲的治療效用。
(B)治療
本揭露內容是藉由實驗證據被反映以及被證實：與發明人的發現一致，當靜脈內(i.v.)投藥時，細菌衍生的以及完整的微細胞(其是呈大約400nm的直徑)在治療顯著的濃度下快速地累積於腦腫瘤微環境中。發明人亦發現到：此腦腫瘤穿透不依賴BBB內皮胞吞作用(endothelial endocytosis)/胞吞轉送作用(transcytosis)或任何其它已被提出之奈米粒子(nanoparticles)藉此進入至腦腫瘤微環境中的機制。因此，來自於傳統知識的優勢，這些發現是相當意想不到的。
1.關於一穿過BBB的大小限制的傳統知識
奈米粒子已被認為作為用於攜帶藥物通過BBB的潛在性載體(potential carrier)(Juillerat-Jeanneret,2008)。就此觀點而言例示的是一奈米微粒藥物輸送策略，致力於藉由將奈米粒子結合至包含BBB的內皮細胞的管腔中的受體，繼而藉由胞吞作用以及胞吞轉送作用穿過內皮細胞並且至腦腫瘤微環境中而克服。下面所討論的另一方法涉及開發一“增強的滲透以及滯留效應(enhanced permeation and retention effect)”來產生穿過BBB的內皮細胞之間的微小間隙的粒子的通道。
2.奈米粒子的胞吞轉送作用
被塗佈以聚山梨醇酯80(polysorbate 80)(Tween®80)的聚(丁基氰基丙烯酸酯)[Poly(butyl cyanoacrylate)](PBCA)奈米粒子被顯示能夠腦輸送一些在游離的形式下不通過BBB的藥物(Kreuter et al.,1995,1997,2001,2002,2003,and 2008；Steiniger et al.,2004)。
由於聚山梨醇酯80選擇性地促使特定的血漿蛋白質(特別是脂蛋白E以及B)在這些奈米粒子的表面上的吸附(Petri et al.,2007；Re et al.,2011)，其能夠使這些奈米粒子與被知曉在與BBB關聯的內皮微血管中被過度-表現的各自的低-密度脂蛋白受體(low-density lipoprotein receptors)(LDLr；Xin et al.,2011)結合(Dehouck et al.,1994)。
結合至LDLr後，奈米粒子是藉由血管內皮細胞被內化(Zensi et al.,2009)，經由胞吞轉送作用穿過這些細胞以及接著被運輸至腦腫瘤微環境中。
全世界努力去發展用於治療腦腫瘤的奈米粒子，集中於找出藉由胞吞轉送作用BBB-關聯的內皮細胞以及進入至腦腫瘤微環境中而穿過BBB之創新的方式。這是一主要的挑戰，因為這些粒子必須在胞吞轉送作用之細胞內的運動期間維持完整以及不被溶酶體降解。後者是高度酸性細胞內腔室，其通常降解經胞飲攝入的物質。
此方法的一額外的嚴重缺點是LDLr不專一於BBB。其僅在與BBB關聯的內皮細胞中被過度-表現。因此，這些奈米粒子具有進入至許多正常組織以及正常中樞神經 系統中的潛力因為這些受體是廣布地坐落於遍及循環系統的內皮細胞中。迄今，該等受體尚未被發現到其僅專一於BBB相關聯的血管，因此對於正常組織產生的嚴重毒性的可能性繼續存在著一關係。
3.被動進入至腦腫瘤中
最近的證據已指出在惡性神經膠瘤微血管(malignant glioma microvasculature)的BBB中的孔大小的生理上限是僅大約12nm(Sarin et al.,2008)。進一步地，已被顯示的是：分子必須有如<400道耳頓一樣地小(Bickel,2005；Pardridge,2007)，俾以能夠穿過在BBB中所發現到的孔。
大小限制在本領域中的研究者以及臨床家中被廣泛地接受。例如，一篇針對近期文獻的回顧文獻推論出奈米粒子必須小於12nm並且具有長的血半衰期，俾以穿過惡性神經膠瘤微血管的BBB(Laquintana et al.,2009)。
就此，各種不同的奈米粒子已被研究，包括脂質體(liposomes)、聚合型奈米粒子(polymeric nanoparticles)、固態脂質奈米粒子(solid lipid nanoparticles)、聚合型微胞(polymeric micelles)以及樹枝狀聚合物(dendrimers)。在靜脈內投藥之後，因為腦腫瘤血管的BBB破壞，這些粒子可以溢出至腦腫瘤中，但也同樣至正常腦組織中(以較少的量)(Moghimi et al.,2005)。
此在帶有BBB破壞的腦腫瘤中的奈米粒子的被動標靶通常與上述的增強的滲透以及滯留(EPR)效應連結， 其被認為在藥物輸送至固體腫瘤上扮演一關鍵性的角色。例如，Laquintana et al.(2009)反映當前的觀點：脂質體，其典型範圍是介於50至150nm之間，餘留在微血管內，藉此經囊封的小的化學治療藥物擴散穿過脂質體膜以及穿過帶有惡性神經膠瘤的BBB的孔。因此，較大的粒子(50至150nm)被認為不能經由障壁中的破壞而溢出穿過BBB。
因此，傳統的理解是，為了經由EPR效應而被動地穿過BBB以及在腦腫瘤微環境中達到藥理學上顯著的數量，奈米粒子應該是呈<12nm的大小以及巨分子(諸如藥物)應該具有一為<400道耳頓的分子量。此理解是在一篇Pardridge(2010)的回顧文獻(其強調“在腦部藥物發展中單一最重要的因素是一有效的腦部藥物標靶技術的有效性”)中被強調。
這是因為大多數的用於中樞神經系統(CNS)的候選者藥物不穿過血腦障壁(BBB)。生物製劑(Biopharmaceuticals)，其等是大分子藥物，不穿過BBB。因此，在缺少腦部標靶技術下，重組蛋白質(recombinant proteins)、單株抗體(monoclonal antibodies)、胜肽、短的干擾RNA(siRNA)以及基因治療法不能被發展用於腦，因為這些藥物不穿過BBB。有關於小分子，通常被假定這些試劑會穿過BBB。然而，所有小分子有>98%不穿過BBB(Pardridge et al.,2005)。僅有具有一分子量(MW)<400道耳頓(Da)的脂溶性小分子經由脂質-調節作用(lipid-mediation)穿過BBB。然而，大多數的小分子藥物(small molecule drugs)具有一MW>400Da，或具有高水溶性，其防止通過BBB的自由擴散。因此，即使CNS藥物發展者是集中於小分子，很可能一BBB 藥物標靶技術將仍然被需要用於針對大多數藥物的CNS小分子藥物發展計畫的成功的實現。
4.腦腫瘤進入之額外的障壁
除了BBB之外，腦部攝取是進一步由在腦部微血管內皮細胞(brain capillary endothelial cells)內一相對少數的窗(fenestrae)以及胞飲小泡(pinocytotic vesicles)，以及由周圍的胞外基質(extracellular matrix)、外膜細胞(pericytes)與星狀細胞足突(astrocyte foot processes)的存在所限制(Hawkins and Davis,2005)。此外，憑藉許多藥物運輸蛋白(drug transport proteins)(其等將藥物移出腦部)的功效，BBB慣例地被認為對於藥物以及巨分子是堅不可摧的。
例如，已被顯示的是，ATP-依賴的輸送體(ATP-dependent transporter)可嚴格地限制治療劑的腦穿透，即使那些具有適合的物理化學性質者被預期相對容易穿過BBB。這些輸送體大多屬於2種超家族：ATP-結合的卡匣(ATP-binding cassette)(ABC)以及溶質載體家族(solute carrier families)。P-醣蛋白(P-glycoprotein)(P-gp,ABCB1)、乳癌抗性蛋白質(breast-cancer-resistance protein)(BCRP,ABCG2)以及多重抗藥性關聯性蛋白質(multidrug resistance associated proteins)(MRPs,ABCCs)是ABC家族的重要成員。參見Schinkel(1999),Borst et al.(2000),Sun et al.(2003),Schinkel and Jonker(2003),Kusuhara and Sugiyama(2005),Loscher and Potschka(2005)，以及Nicolazzo and Katneni(2009)。
因此，本案發明人發現到非常令人驚訝地是：完整的、細菌衍生的微細胞累積於腦腫瘤中，儘管事實上微細胞要比要進入至腦腫瘤中的奈米粒子的一致的大小上限(<12nm)還大相當多(~400nm)。亦意想不到的是發現微細胞經由BBB破壞而被動地進入腦。就此觀點而言，發明人做出令人驚訝的觀察：與腦腫瘤有關聯的血管不僅是屬於BBB-類型。被發現到的是，即使在一早期階段，一生長中的腫瘤具有許多血管，特別是在其核心之處。該等血管缺乏完整性；亦即，該等血管具有大的窗以及是“滲漏的”，不像BBB-類型血管。因此，在違反傳統的理解下，與微細胞一樣大的粒子，亦即要比上面所討論的BBB的一致孔大小限制還大很多，然而要比滲漏的血管壁中的窗還小；因此，其等會被動地溢出穿過這些窗並且至腦腫瘤微環境中。
此外，根據發現，發明人發現到：完整的、細菌衍生的微細胞的相對大的大小在治療顯著的微細胞濃度在腦腫瘤微環境中是如何快地被達到實際上是一正向的，甚至是關鍵的因素。亦即，粒子越小，越有可能的是：粒子將會由血管中的血流所限制。相較之下，微細胞是一相對較大的團塊的粒子，以及其等因而較少藉由血流所施加的力而被影響。因此，微細胞較可能沿著一通過微血管的路徑而致使對著微血管的內皮壁的重複的碰撞。此純粹物理現象增加微細胞(作為較大的粒子)被推進穿過滲漏的脈管系統(vasculature)中的窗的可能性，有如發明人發現到的， 是腫瘤中BBB破壞的標誌。
在人類腦中有超過1000億毛細管，呈現一大約400哩的總長度，但這些毛細管的內皮內的體積是僅大約1μL/g腦(Pardridge,2011)。依據發現，此在腦中非常高密度的血管亦被認為促使腦腫瘤中的微細胞快速、高-濃度累積。
認知到與BBB有關聯的毛細管腔的直徑可如同1μm一樣地小，發明人洞悉：如同完整的、細菌衍生的微細胞一樣大的粒子(~400nm)會是BBB-關聯的微血管的直徑的大約一半以及因而會從經破壞的BBB(其間隙是呈大於400nm的大小)中快速地溢出。另一方面，根據發現，因為哺乳動物身體的正常的脈管系統中的窗以大小計不超過大約100μm，被全身性導入的完整的、細菌衍生的微細胞被保留在一般血管系統中直到其等由網狀內皮系統中的專業吞噬細胞所清除為止或者直到其等從滲漏的脈管系統中被動地溢出至腦腫瘤微環境中為止。
因此，當奈米粒子的2種類型(例如，呈直徑小於12nm的奈米粒子以及完整的、細菌衍生的微細胞)以相同數目被i.v.投藥時，那麼將會預期到的是，當脈管系統具有大於12nm的孔時，較小的粒子的循環濃度會快速地減少，因為其等會溢出正常組織中的血液循環之外。被知曉的是，例如，肝以及胃腸道組織具有大約100nm的正常的脈管系統(Wisse et al.,2008)，以及周圍的皮膚具有範圍落在~40nm內的窗。相較之下，微細胞會太大以致無法落在正常的 脈管系統之外；因此，如上所述，其等被預期在正常的血液循環中保持在高濃度，藉此較多的數目將會溢出至腦腫瘤微環境中。
因此，依據一個具體例，本揭露內容提供一用於治療一腦腫瘤而需要投藥一治療有效量的一包含有攜帶一抗-腫瘤試劑的複數個完整的、細菌衍生的微細胞的組成物。較佳地，該包含有微細胞的組成物的投藥是全身性的，例如，靜脈內的或動脈內的。
(C)抗-腫瘤試劑
有如所注意到的，本揭露內容的微細胞組成物在輸送抗-腫瘤試劑至腦腫瘤上是有用的。在本文中，慣用語“抗-腫瘤試劑”意指一藥物，不論化學的或生物的，防止或抑制腫瘤細胞的生長、發育、成熟或擴散。
在本揭露內容的全文中，與傳統的醫藥實務一致，選擇一用於治療一特定的腦腫瘤病患的抗-腫瘤試劑取決於數種因素。這些因素包括，但不限於：病患的年齡、Karnofsky計分值以及病患可能已接受的任何先前的治療。通常參見，PRINCIPLES AND PRACTICE OF NEURO-ONCOLOGY,M.Mehta(Demos Medical Publishing 2011)，以及PRINCIPLES OF NEURO-ONCOLOGY,D.Schiff and P.O’Neill,eds.(McGraw-Hill 2005)。
一般而言，可應用於一特定的腦癌的護理的標準建議，在第一個例子中，應該告知要使用的活性劑的選擇的臨床考量。例如，此看法會引導來自於一目錄的一活性 劑的選擇，加州大學洛杉磯分校已發表適合用於治療腦腫瘤的抗-腫瘤試劑，在下面表1中被重現。
依據本揭露內容，可供包裝至完整的、細菌衍生的微細胞中接而被投藥以治療一腦癌的藥物亦可選自於下面所詳述的種類中的一者。
多官能烷基化試劑(Polyfunctional alkylating agents)：
藉由環磷醯胺(Cyclophosphamide)(Cytoxan)、雙氯乙基亞胺(Mechlorethamine)、苯丙胺酸氮芥(Melphalan)[威克瘤(Alkeran)]、氯芥苯丁酸(Chlorambucil)[瘤克寧(Leukeran)]、噻替哌(Thiopeta)(Thioplex)、硫酸布他卡因(Busulfan)[邁樂寧(Myleran)]而被例示。
烷基化藥物(Alkylating drugs)：
藉由丙卡巴肼(Procarbazine)(Matulane)、達卡巴仁(Dacarbazine)(DTIC)、六甲密胺(Altretamine)(Hexalen)、瘤克寧錠(Clorambucil)、二氯二胺鉑(Cisplatin)[順鉑(Platinol)]、卡鉑(Carboplatin)、異環磷醯胺(Ifosafamide)、益樂鉑(Oxaliplatin)而被例示。
抗代謝物(Antimetabolites)：
藉由胺甲碟呤(Methotrexate)(MTX)、6-硫嘌呤(6-Thiopurines)[巰嘌呤(Mercaptopurine)[6-MP]、硫鳥嘌呤(Thioguanine)[6-TG]]、巰嘌呤(Purinethol)、硫鳥嘌呤(Thioguanine)、氟達拉濱磷酸鹽(Fludarabine phosphate)、克拉曲濱(Cladribine)：[祿斯得停(Leustatin)]、噴司他丁(Pentostatin)、氟尿嘧啶(Flurouracil)(5-FU)、阿糖胞苷(Cytarabine)(ara-C)、阿扎胞苷(Azacitidine)而被例示。
植物生物鹼(Plant alkaloids)、類萜(terpenoids)以及拓撲異 構脢抑制劑(topoisomerase inhibitors)：
藉由長春鹼(Vinblastine)(Velban)、長春花新鹼(Vincristine)(Oncovin)、癌得散(Vindesine)、長春瑞濱(Vinorelbine)、鬼臼毒素(Podophyllotoxins)[依託泊苷(etoposide){VP-16}以及替尼泊苷(teniposide){VM-26}]、喜樹鹼(Camptothecins)[托泊替康以及伊立替康(irinotecan)]、紫杉烷(Taxanes)[諸如太平洋紫杉醇(Paclitaxel)(紫杉醇)以及多西紫杉醇(Docetaxel)(泰索帝)]而被例示。
抗生素(Antibiotics)：
藉由多柔比星(Doxorubicin)[阿德力黴素(Adriamycin)、Rubex、Doxil]、柔紅黴素(Daunorubicin)、艾達魯比辛(Idarubicin)、放線菌素(Dactinomycin)[可美淨(Cosmegen)]、普卡黴素(Plicamycin)(Mithramycin)、絲裂黴素(Mitomycin)：絲裂黴素(Mutamycin)、博來黴素(Bleomycin)[博來霉素(Blenoxane)]而被例示。
荷爾蒙劑(Hormonal agents)：
藉由雌激素(Estrogen)以及雄性素抑制劑(Androgen Inhibitors)[它莫西芬(Tamoxifen)以及氟他胺(Flutamide)]、促性腺激素-釋素促效劑(Gonadotropin-Releasing Hormone Agonists)[亮丙瑞林(Leuprolide)以及戈舍瑞林(Goserelin)(諾雷德)]、芳香酶抑制劑(Aromatase Inhibitors)[氨苯乙哌啶酮(Aminoglutethimide)以及安美達錠(Anastrozole)(Arimidex)]而被例示。
各種抗癌藥物：
藉由安吖啶(Amsacrine)、天冬醯胺酸酶(Asparaginase)(El-spar)、羥基脲(Hydroxyurea)、米托蒽醌(Mitoxantrone)[米托蒽醌(Novantrone)]、米托坦(Mitotane)(Lysodren)、視黃酸衍生物、骨髓生長因子[沙格司亭(sargramostim)以及惠爾血添(filgrastim)]、阿米福汀(Amifostine)而被例示。
試劑破壞的葉酸鹽代謝：
例如，培美曲塞(Pemetrexed)。
DNA低甲基試劑(DNA hypomethylating agents)：
例如，阿扎胞苷(Azacitidine)、地西他濱(Decitabine)。
聚(二磷酸腺苷[ADP]-核糖)聚合酶(PARP)途徑抑制劑{Poly(adenosine diphosphate[ADP]-ribose)polymerase(PARP)pathway inhibitors}：
諸如Iniparib、Olaparib、Veliparib。
PI3K/Akt/mTOR途徑抑制劑(PI3K/Akt/mTOR pathway inhibitors)：
例如，依維莫司(Everolimus)。
組蛋白去乙醯酶(HDAC)抑制劑[Histone deacetylase(HDAC)inhibitors]：
例如，Vorinostat、Entinostat(SNDX-275)、Mocetinostat(MGCD0103)、Panobinostat(LBH589)、羅咪酯肽(Romidepsin)、丙戊酸(Valproic acid)。
細胞週期蛋白-依賴型激酶(CDK)抑制劑[Cyclin-dependent kinase(CDK)inhibitors]：
例如，Flavopiridol、Olomoucine、Roscovitine、Kenpaullone、AG-024322(Pfizer)、Fascaplysin、Ryuvidine、Purvalanol A、NU2058、BML-259、SU 9516、PD-0332991、P276-00。
熱休克蛋白(HSP90)抑制劑[Heat shock protein(HSP90)inhibitors]：
例如，格爾德霉素(Geldanamycin)、坦螺旋霉素(Tanespimycin)、阿螺旋霉素(Alvespimycin)、瑞迪士可黴素(Radicicol)、魚藤素(Deguelin)、BIIB021。
鼠類雙微粒體2(MDM2)抑制劑[Murine double minute 2(MDM2)inhibitors]：
例如，順-咪唑啉(Cis-imidazoline)、Benzodiazepinedione、螺-吲哚酮(Spiro-oxindoles)、異喹啉酚(Isoquinolinone)、噻吩(Thiophene)、5-Deazaflavin、色胺(Tryptamine)。
未分化淋巴瘤激酶(ALK)抑制劑[Anaplastic lymphoma kinase(ALK)inhibitors]：
例如，胺吡啶(Aminopyridine)、二胺基嘧啶(Diaminopyrimidine)、吡啶并異喹啉(Pyridoisoquinoline)、Pyrrolopyrazole、吲哚咔唑(Indolocarbazole)、吡咯嘧啶(Pyrrolopyrimidine)、Dianilinopyrimidine。
聚[ADP核糖]聚合酶(PARP)抑制劑{Poly[ADPribose]polymerase(PARP)inhibitors}：
藉由苯甲醯胺(Benzamide)、酞嗪酮(Phthalazinone)、三環吲哚(Tricyclic indole)、苯并咪唑(Benzimidazole)、吲唑 (Indazole)、Pyrrolocarbazole、酞嗪酮、異吲哚啉酮(Isoindolinone)而被例示。
在本揭露內容中可使用的活性劑不限於那些藥物種類或上面所列舉的特定的試劑。不同的發現平台持續產生針對癌細胞的獨特的分子特徵的新試劑；事實上，成千上萬該等化學以及生物藥物已被發現，其等僅有某些於此被列舉。然而，根據本揭露內容的發現，完整的、細菌衍生的微細胞提供包裝各種不同的活性劑(親水性或疏水性)之令人驚訝的能力，意指實質上任何該等藥物，當被包裝於微細胞中時，具有治療一腦癌的潛力。
原則上，一用於治療一腦腫瘤的特定的抗-腫瘤試劑的潛在適合性部分是試劑是否可有效地被輸送至腦中的一功能。帶有本發現的優勢，藉此負載藥物的微細胞越過BBB以及專一性地輸送一藥物有效負載至一腦腫瘤中，此外，在治療一腦腫瘤上已被證實無效的許多藥物現在將會是用於該治療的可行的候選者。因此，在此詳細說明中，該標題“抗-腫瘤試劑”是不限於針對腦癌治療之已知功效的藥物，而且確切地其包含被確定具有一或多種上述對抗腫瘤細胞的活性的試劑。
同樣地，例示的抗-腫瘤試劑的種類是放射核種、化學治療藥物以及功能性核酸，包括，但不限於調節性RNAs(regulatory RNAs)。
1.放射核種
一“放射核種”是一具有一不穩定核的原子，亦即 特徵為可被給予一在核內的新產生的輻射粒子(radiation particle)或一原子的電子(atomic electron)過剩能(excess energy)者。因此，一放射核種經歷放射性衰變(radioactive decay)，以及發出伽馬射線和/或次原子粒子。許多的放射核種在此技藝中是被知曉的，以及它們有許多是被知曉適合用於醫療用途，諸如釔-90(yttrium-90)、鎝-99-m(technetium-99m)、碘-123、碘-131、銣-82(rubidium-82)、鉈-201(thallium-201)、鎵-67(gallium-67)、氟-18(fluorine-18)、氙-133(xenon-133)以及銦-111(indium-111)。
放射核種已被發現到在核子醫學上(nuclear medicine)的廣泛的用途，特別是作為用於損害腫瘤細胞的貝他射線發射體(beta-ray emitter)。因此，在本揭露內容中，放射核種被適當地使用作為抗-腫瘤試劑。
放射核種可藉由任何已知的技術而與完整的、細菌衍生的微細胞相締合。因此，一蛋白質或其它微細胞-表面部分(minicell-surface moiety)(參見下方)可利用一商業上可獲得的標記方法而被標記以一放射核種，諸如利用Pierce Iodination試劑，一Pierce Biotechnology Inc.(Rockford,IL)的產品，在Rice et al.(2011)中被詳述。另擇地，放射核種可被併入至在微細胞內部的蛋白質。
在最近的情況中，一生成微細胞的細菌菌株是使用編碼外來蛋白質的質體DNA而被轉形。當微細胞是在不對稱性細胞分裂(asymmetric cell division)期間被形成時，許多質體DNA的複本分離至微細胞細胞質中。在經放射性標 記的胺基酸的存在下，所形成的重組型微細胞在條件下被培育而使得在微細胞內部所表現的、來自於質體DNA的外來蛋白質將攜帶放射核種的胺基酸併入。例如，根據Clark-Curtiss以及Curtiss(1983)的操作程序，重組型微細胞是在含有35S-甲硫胺酸的最低生長培養基(minimal growth medium)中被培育，藉此新表現的、質體-編碼的蛋白質將35S-甲硫胺酸併入。為了使重組型微細胞被包裝以其它所欲的放射核種，一類似的方法可被使用。
在微細胞表面上的寡醣(oligosaccharide)亦可利用，例如，由Fukuda(1994)所描述的已為公眾接受的操作程序而被放射性標記。對於微細胞是特有的例示的該等寡醣是在衍生自革蘭氏-陰性細菌的微細胞的表面上所發現到的脂多醣(lipopolysaccharide)(LPS)的O-多醣組分(O-polysaccharide component)(參見下方)。
在此方面，一較佳的方法學是放射性標記一被用來標靶微細胞至特定的腫瘤之雙專一性抗體。參見下面的G段落以及US 2007/0237744專利公開案，其等內容在此被併入本案以作為參考資料。亦即，“被包覆”在一微細胞上的雙專一性抗體暴露一顯著量的用於放射性標記的額外的表面蛋白質。因此，達到與放射性標記相締合的抗體-包覆的微細胞的一較高的比活性(specific activity)是有可能的。相較之下，未經包覆的微細胞的放射性標記，亦即，當放射核種僅標記特有的部分時，會致使較弱的標記(較低的比活性)。在一個具體例中，此較弱的標記被認為會發生因為衍 生自革蘭氏-陰性細菌的微細胞的外膜-關聯性蛋白質是藉由LPS(有如下面所進一步討論的，其包含有覆蓋微細胞表面的長鏈的O-多醣)而被遮蔽。
本揭露內容的一用於治療一腦腫瘤的組成物會以一劑量或以多重劑量被輸送而完全地供應至少足以減少腫瘤團塊(若無法完全消滅腫瘤)之腫瘤內輻射的一位準。治療的進展可根據此方式按個別情況而被監測。然而，一般而言，被包裝在組成物中的放射性的數量將會典型地在大約30至50Gy，儘管本發明亦預期一較高數量的放射性(例如，大約50至100Gy)，其給予一介於大約30Gy以及大約100Gy之間的總範圍。
在某些例子中，被包裝在組成物中的放射性的數量甚至可比上面所提到的還低，給予攜帶微細胞的放射核種高效率以及專一性地輸送至一腦腫瘤。因此，在一方面該組成物含有大約20至40Gy，或大約10至30Gy，或大約1至大約20Gy，或少於10Gy。
2.化學治療藥物
在本揭露內容中所使用的一抗-腫瘤試劑亦可是一化學治療藥物。在此詳細說明中，“化學治療藥物”、“化學治療劑(chemotherapeutic agent)”以及“化學治療(chemotherapy)”是被相互交換地使用來意指一具有能力殺死或破壞一腫瘤細胞的藥物。一化學治療劑可以是一小分子藥物或一生物藥物(biologic drug)，有如下面被進一步詳述的。
相較於一巨分子，“小分子藥物”子範疇包含特徵為具有(i)在一生物過程上的一效用以及(ii)一相對低的分子量之有機化合物。典型地，小分子藥物是大約800道耳頓或更低，其中“大約”表示合格的分子量值是受到量測精確度上的變異以及大約為數道耳頓或數十道耳頓的實驗誤差所影響。因此，一小分子藥物可具有一為大約900道耳頓或更低，大約800或更低，大約700或更低，大約600或更低，大約500或更低，或大約400道耳頓或更低的分子量。更特別地，一小分子化學治療藥物可具有一為大約400道耳頓或更高，大約450道耳頓或更高，大約500道耳頓或更高，大約550道耳頓或更高，大約600道耳頓或更高，大約650道耳頓或更高，大約700道耳頓或更高，或大約750道耳頓或更高的分子量。在另一個具體例中，被包裝至微細胞中的小分子化學治療藥物具有一為介於大約400以及大約900道耳頓之間，介於大約450以及大約900道耳頓之間，介於大約450以及大約850道耳頓之間，介於大約450以及大約800道耳頓之間，介於大約500以及大約800道耳頓之間，或介於大約550以及大約750道耳頓之間的分子量。
為了此詳細說明的目的，一“生物藥物”被定義，相較之下，意指可藉由一生物過程而被產生的任何生物活性巨分子，不包括下面所討論的“功能性核酸”，以及按大小具備有如上面所定義的小分子藥物資格的多肽。“生物藥物”子範疇因而不包括以及不與小分子藥物以及功能性核酸子範疇重疊。例示的生物藥物是治療的蛋白質 (therapeutic protein)以及抗體，不論天然或重組型或例如利用藥物化學以及藥物設計的工具而被人工合成。
迄今為止被廣泛地理解的是大於400道耳頓的分子會不能越過在BBB中所發現到的孔(Bickel,2005；Pardridge,2007)；因此，其等將會不適合用於治療腦腫瘤。然而，當被包裝至微細胞中時，該等化學治療藥物繞過BBB到達經標靶的腦腫瘤細胞。
由於無法接受的毒性或其它安全考量，不論是一小分子藥物或一生物藥物，何況是被設計用於化學治療目的的特定的分子，仍然在臨床前或臨床試驗的期間失敗。本案發明人已顯示：將一化學治療藥物包裝在一微細胞中，繼而全身性輸送至一腫瘤病患(諸如一腦腫瘤病患)，致使藥物輸送至腫瘤細胞。再者，即使在腫瘤細胞被分解而含有藥物的細胞質被釋出至鄰近的正常組織之後，結果對於正常組織沒有毒性。這是因為藥物已經被結合至腫瘤細胞結構(諸如DNA)，而不能再攻擊正常細胞。因此，本發明對於輸送高毒性的化學治療藥物至一腫瘤病患是特別有用的。
在此詳細說明中，慣用語“高毒性的化學治療藥物(highly toxic chemotherapy drug)”或“超毒性的化學治療藥物(supertoxic chemotherapy drug)”意指當相較於其等針對一標的癌症的有效劑量時，具有一相對低的致死劑量的化學治療藥物。因此，在一個方面，一高毒性的化學治療藥物具有一要比其針對標的癌症[諸如，(1)一癌症類型，藥 物針對其而被設計，(2)第一癌症類型，其中一臨床前或臨床試驗是針對那藥物而被進行，或(3)癌症類型，其中藥物在所有被測試的癌症中顯示最高的效力]的半有效劑量(median effective dose)(ED50)還低的半致死劑量(median lethal dose)(LD50)。例如，一高毒性的化學治療藥物可具有一要比相對於針對一標的癌症的藥物的ED50還低大約500%、400%、300%、250%、200%、150%、120%或100%的LD50。在另一個方面，一高毒性的化學治療藥物具有一最大亞-致死劑量(sub-lethal dose)(亦即，不造成嚴重的或不可逆毒性的最高劑量)而是低於其針對一標的癌症的最低有效劑量，例如，大約500%、400%、300%、250%、200%、150%、120%、100%、90%、80%、70%、60%，或50%的最低有效劑量。
因此，依據本詳細說明的一個具體例，在一個體中的一腦腫瘤是藉由一包含有全身性投藥一治療有效量的一包含有複數個完整的、細菌衍生的微細胞(其等各個包含一高毒性的化學治療藥物)的組成物的方法而被治療。因此，下面所討論的美登醇(Maytansinoids)以及雙卡霉菌素(duocarmycins)作為如此所使用的超毒性化學治療藥物的種類之代表。
在本文中，適合的癌症化學治療藥物包括氮芥(nitrogen mustards)、亞硝基脲(nitrosoureas)、次乙亞胺(ethyleneimine)、烷磺酸鹽(alkane sulfonates)、四(tetrazine)、鉑化合物(platinum compounds)、嘧啶類似物、 嘌呤類似物、抗代謝物、葉酸鹽類似物、蒽環黴素類(anthracyclines)、紫杉烷(taxanes)、長春花生物鹼(vinca alkaloids)、拓撲異構脢抑制劑，以及特別是荷爾蒙劑。
例示的小分子藥物子範疇的化學治療藥物是放線菌素-D(Actinomycin-D)、威克瘤、Ara-C、安美達錠、BiCNU、白卡羅他邁(Bicalutamide)、博來黴素(Bleomycin)、硫酸布他卡因、卡培他濱(Capecitabine)、卡鉑、卡鉑(Carboplatinum)、卡莫司汀、CCNU、氯芥苯丁酸、順氯氨鉑、克拉曲濱、CPT-11、環磷醯胺、阿糖胞苷、胞嘧啶阿拉伯醣苷(Cytosine arabinoside)、環磷醯胺(Cytoxan)、達卡巴仁、放線菌素、柔紅黴素、右雷佐生(Dexrazoxane)、多西紫杉醇、多柔比星、DTIC、表阿黴素(Epirubicin)、次乙亞胺、依託泊苷、氟脫氧尿苷(Floxuridine)、氟達拉濱(Fludarabine)、氟尿嘧啶(Fluorouracil)、氟他胺、福莫司汀(Fotemustine)、吉西他賓、六甲銨(Hexamethylamine)、羥基脲、艾達魯比辛、依弗醯胺(Ifosfamide)、伊立替康、環己亞硝、雙氯乙基亞胺、苯丙胺酸氮芥、巰嘌呤、胺甲碟呤、絲裂黴素、米托坦、米托蒽醌、益樂鉑、太平洋紫杉醇、裴米卓耐特(Pamidronate)、噴司他丁、普卡黴素、丙卡巴肼、類固醇、鏈脲佐菌素(Streptozocin)、STI-571、鏈脲佐菌素、它莫西芬、替莫唑胺(Temozolomide)、替尼泊苷、四、硫鳥嘌呤、沙奧特帕(Thiotepa)、雷替曲塞(Tomudex)、托泊替康、曲奧舒凡(Treosulphan)、三甲曲沙(Trimetrexate)、長春鹼、長春花新鹼、癌得散、長春瑞濱、VP-16以及截瘤達 (Xeloda)。
美登醇(分子量：~738道耳頓)是美登素(maytansine)的一群化學衍生物，具有強烈細胞毒性。根據本發明，由於毒性關係，儘管用於人類病患使用被認為是不安全的，美登醇是適合用於經由微細胞輸送至腦腫瘤病患。
雙卡霉菌素(分子量：~588道耳頓)是一系列的相關天然產物，從鏈黴菌屬細菌(Streptomyces bacteria)中被首次分離。其等亦具有強烈細胞毒性但用於人類使用被認為是不安全的。如同美登醇，雙卡霉菌素是適合供用於本發明的化學治療藥物。
生物化學治療藥物的子範疇包括，但不限於：天冬醯胺酸酶、AIN-457、Bapineuzumab、Belimumab、Brentuximab、Briakinumab、Canakinumab、Cetuximab、Dalotuzumab、Denosumab、Epratuzumab、Estafenatox、Farletuzumab、Figitumumab、Galiximab、Gemtuzumab、Girentuximab(WX-G250)、賀癌平(Herceptin)、Ibritumomab、Inotuzumab、Ipilimumab、美泊利單抗(Mepolizumab)、莫羅莫那-CD3(Muromonab-CD3)、Naptumomab、Necitumumab、尼妥珠單抗(Nimotuzumab)、奧瑞珠單抗(Ocrelizumab)、Ofatumumab、Otelixizumab、Ozogamicin、Pagibaximab、Panitumumab、Pertuzumab、Ramucirumab、Reslizumab、Rituximab、REGN88、Solanezumab、Tanezumab、Teplizumab、Tiuxetan、托西莫單抗(Tositumomab)、群司珠單抗 (Trastuzumab)、Tremelimumab、Vedolizumab、Zalutumumab以及Zanolimumab。
該組成物可含有至多大約1mg的化學治療藥物。另擇地，化學治療藥物的數量可為至多大約750μg、500μg、250μg、100μg、50μg、10μg、5μg、1μg、0.5μg或0.1μg。在另一個方面，當沒有被包裝至微細胞中而被使用時，該組成物含有具有一相對於藥物的治療有效量少於大約1/1,000，或另擇地少於大約1/2,000、1/5,000、1/10,000、1/20,000、1/50,000、1/100,000、1/200,000或1/500,000的數量的一化學治療藥物。根據本揭露內容的又另一個方面，該組成物可含有至少大約1nmol的化學治療藥物。因此，本揭露內容亦包含當化學治療藥物的數量是分別至少大約2nmol、大約3nmol、大約4nmol、大約5nmol、大約10nmol、大約20nmol、大約50nmol、大約100nmol以及大約800nmol時的具體例。
3.功能性核酸
“功能性核酸”意指當導入至一宿主細胞中時，專一性地干擾一蛋白質的表現的一核酸分子。有關於治療一腦腫瘤，依據本揭露內容，較佳的是經由完整的、細菌衍生的微細胞被輸送至腫瘤細胞的一功能性核酸有效負載抑制一促進腫瘤細胞增生、血管生成或抗化學治療和/或抑制細胞凋亡或細胞週期停滯的基因[亦即一“腫瘤-促進基因(tumor-promoting gene)”]。
一般情況是在此揭露內容中所使用的功能性核 酸分子具有藉由與一針對一蛋白質的轉錄本交互作用來減少一蛋白質的表現的能力。有關本揭露內容的微細胞有效負載的範疇包括調節性RNAs(regulatory RNAs)，諸如siRNA、shRNA、短RNAs(典型地呈少於400鹼基的長度)、微-RNAs(miRNAs)、核糖酵素(ribozymes)以及誘餌RNA(decoy RNA)、反訊息核酸以及特別是LincRNA。就此觀點而言，“核糖酵素(ribozyme)”意指具有以一核苷酸鹼基序列-專一性的方式重複地水解其它RNA分子的一酵素活性的一RNA分子。“反訊息寡核苷酸(Antisense oligonucleotide)”意指與部分的一特定的基因轉錄本互補的一核酸分子，而使得該分子會與轉錄本雜交以及阻斷其之轉譯。一反訊息寡核苷酸可包含有RNA或DNA。標題“LincRNA”或“長基因間非-編碼RNA(long intergenic non-coding RNA)”包含長於200核苷酸的非-蛋白質編碼轉錄本。例如，有如由Khalil et al.,Proc Nat’l Acad.USA 106：11667-72(2009)所討論的，LincRNAs可調節轉錄、剪接和/或基因的轉譯。
依據本揭露內容，各個類型的調節性RNA可以是抑制一如上所述的腫瘤-促進基因的功能性核酸的來源，以及因此那是適用的。因此，在本揭露內容的一個較佳具體例中，完整的微細胞攜帶調控一轉錄後的、基因-靜默的RNA干擾(RNAi)機制的siRNA分子，其可被用來標靶腫瘤-促進基因。例如，參見MacDiarmid et al.,Nature Biotech.27：645-51(2009)(帶有化學治療藥物的抗體-呈現的微細胞輸送抵銷發展出對於藥物的抗性的siRNAs)，以及Oh and Park, Advanced Drug Delivery Rev.61：850-62(2009)(輸送治療性siRNAs俾以分別治療乳、卵巢、子宮頸、肝、肺以及前列腺癌)。
有如所注意到的，“siRNA”通常意指大約10至大約30核苷酸長的雙股RNA分子，這是針對其等專一性地干擾蛋白質表現的能力而被命名。較佳地，siRNA分子是12-28核苷酸長，更較佳地15-25核苷酸長、還更較佳地19-23核苷酸長以及最較佳地21-23核苷酸長。因此，siRNA分子可呈12、13、14、15、16、17、18、19、20、21、22、23、24、25、26、27、28或29核苷酸的長度。
一股的長度指定一siRNA分子的長度。例如，一被描述為21核糖核苷酸長(21-mer)的siRNA可能包含有用於黏合19連續鹼基配對(contiguous base pairing)的RNA的2反向股。在各股上的2剩餘的核糖核苷酸會形成一“外伸(overhang)”。當一siRNA含有不同長度的2股時，較長的股指定siRNA的長度。例如，一含有一股為21核苷酸長以及一第二股為20核苷酸長的dsRNA，構成一21-mer。
協助專一性siRNA以及一般調節性RNA的設計的工具是立即可用的。例如，一以電腦為基礎的siRNA設計工具在www.dharmacon.com的網際網路上是可用的。
在另一個較佳具體例中，本揭露內容的完整的微細胞攜帶miRNAs，其類似於siRNA，能夠調控一轉錄後、基因-靜默的RNA干擾(RNAi)機制。亦類似於siRNA，由miRNA所調控的基因-靜默效用可被用來標靶腫瘤-促進基 因。例如，參見Kota et al.,Cell 137：1005-17(2009)(經由轉染輸送一miRNA致使在鼠類肝癌模型中癌細胞增生的抑制，腫瘤-專一性細胞凋亡以及免於疾病病程之顯著的保護而沒有毒性)，以及Takeshita,et al.,Molec.Ther.18：181-87(2010)(經由短暫的轉染輸送合成miRNA抑制轉移性前列腺腫瘤細胞在骨組織上的生長)。
儘管兩者都調控RNA干擾，miRNA以及siRNA具有顯著的差異。就此觀點而言，“miRNA”通常意指一種17-至27-核苷酸的單股RNA分子(代替雙股的有如在本案中的siRNA)。因此，miRNA分子可呈17、18、19、20、21、22、23、24、25、26、27核苷酸的長度。較佳地，miRNA分子是21-25核苷酸長。
在miRNAs以及siRNAs之間的另一個差異是前者通常不完全與mRNA標的互補。另一方面，siRNA必須完全互補於mRNA標的。因此，siRNA通常致使一單一、特定的標的之靜默，而miRNA是不規則的。
此外，儘管兩者都被裝配至RISC[RNA-誘導的靜默複合體(RNA-induced silencing complex)]中，siRNA以及miRNA不同在於其等在RISC裝配之前各自的初始加工處理。這些差異在Chu et al.,PLoS Biology 4：1122-36(2006)，以及Gregory et al.,Methods in Molecular Biology 342：33-47(2006)中被詳細地描述。
許多資料庫作用為miRNA存儲處。例如，參見miRBase(www.mirbase.org)以及tarbase (http：//diana.cslab.ece.ntua.gr/DianaToolsNew/index.php？r=tarbase/index)。在傳統的使用中，miRNA典型地是以字首“-mir”，組合以一順序數(sequential number)而被命名。例如，一在小鼠mir-352之後被發現的新miRNA將會被命名小鼠mir-353。
再者，協助調節性RNA(包括miRNA)的設計的工具是立即可用的。就此觀點而言，一以電腦為基礎的miRNA設計工具在wmd2.weigelworld.org/cgi-bin/mirnatools.pl的網際網路上是可用的。
有如上面所注意到的，在本揭露內容中所使用的一功能性核酸會抑制一促進腫瘤細胞增生、血管生成或抗化學治療的基因。被抑制的基因亦會自身抑制細胞凋亡或細胞週期停滯。可藉由一功能性核酸而被標靶的基因的實例是在下面被提供。
較佳地，本揭露內容的功能性核酸標靶促進抗藥性、抑制細胞凋亡或促進一腫瘤表現型的基因或一蛋白質的轉錄本。在這些內文中功能性核酸策略的成功的應用已在此技藝中被達成，但沒有微細胞載體的優勢。參見，例如，Sioud(2004),Caplen(2003),Nieth et al.(2003)、Caplen and Mousses(2003)、Duxbury et al.(2004)、Yague et al.(2004)以及Duan et al.(2004)。
促使抗藥性的蛋白質構成功能性核酸的較佳標的。該等蛋白質可以促使後天性抗藥性(acquired drug resistance)或先天性抗藥性(intrinsic drug resistance)。當得 病的細胞(諸如腫瘤細胞)對藥物有初始反應，但在隨後的治療循環上變得有抵抗力，抗性表現型被獲得。涉及後天性抗藥性的有用的標的包括ATP結合的卡匣輸送體(ATP binding cassette transporters)[諸如P-醣蛋白(P-gp、P-170、PGY1、MDR1、ABCB1、MDR-關聯性蛋白質、多重抗藥性蛋白質1)、MDR-2以及MDR-3]。MRP2(多重-抗藥性關聯性蛋白質)、BCR-ABL[斷裂點叢集區域-Abelson原致癌基因(breakpoint cluster region-Abelson protooncogene)]、一STI-571抗性-關聯性蛋白質、肺抗性-相關的蛋白質、環氧合酶-2(cyclooxygenase-2)、核因子卡帕(nuclear factor kappa)、XRCC1(X-射線交叉-互補組1)、ERCC1(切除交叉-互補基因)、GSTP1(麩胱甘肽S-轉移酶)、突變β-微管蛋白(mutant β-tubulin)以及生長因子(諸如IL-6)是涉及後天性抗藥性的額外的標的。
促使抗藥性特別有用的標的包括ATP結合的卡匣輸送體(諸如P-醣蛋白、MDR-2、MDR-3、BCRP、APT11a以及LRP)。
有用的標的亦包括促進細胞凋亡抗性的蛋白質。這些包括Bcl-2(B細胞白血病/淋巴瘤)、Bcl-XL、A1/Bfl 1、焦點黏合激酶(focal adhesion kinase)、二氫二醇去氫酶(dihydrodiol dehydrogenase)以及p53突變蛋白質。
有用的標的進一步包括致癌以及突變腫瘤抑制因子蛋白質(oncogenic and mutant tumor suppressor protein)。這些的例示是β-連接素(β-Catenin)、PKC-α(蛋白質激酶C)、 C-RAF、K-Ras(V12)、DP97 Dead box RNA解旋酶(DP97 Dead box RNA helicase)、DNMT1(DNA甲基轉移酶1)、FLIP(似Flice抑制性蛋白質)、C-Sfc、53BPI、多梳家族蛋白EZH2(Polycomb group protein EZH2)(zeste同源物的增強子)、ErbB1、HPV-16 E5以及E7(人類乳頭狀瘤病毒早期5以及早期7)、Fortilin & MCI1P[骨髓母細胞白血病1蛋白質(Myeloid cell leukemia 1 protein)]、DIP13α[DDC交互作用蛋白質13a(DDC interacting protein 13a)]、MBD2[甲基CpG結合領域(methyl CpG binding domain)]、p21、KLF4(似Kruppel因子4)、tpt/TCTP[轉譯控制的腫瘤蛋白質(Translational controlled tumor protein)]、SPK1以及SPK2[神經胺醇激酶(Sphingosine kinase)]、P300、PLK1(似Polo激酶-1)、Trp53、Ras、ErbB1、VEGF[血管內皮生長因子(Vascular endothelial growth factor)]、BAG-1[BCL2-關聯性永生基因1(BCL2-associated athanogene 1)]、MRP2、BCR-ABL、STI-571抗性-關聯性蛋白質(STI-571 resistance-associated protein)、肺抗性-相關的蛋白質(lung resistance-related protein)、環氧合酶-2(cyclooxygenase-2)、核因子卡帕、XRCC1、ERCC1、GSTP1、突變β-微管蛋白以及生長因子。
亦有用作為標的是由胞質多聚腺苷酸化元素結合蛋白質(cytoplasmic polyadenylation element binding proteins,CEPBs)所例示的全面性調控元素。例如，CEPB4是在神經膠質母細胞瘤以及胰腺癌中被過度表現，該蛋白 質活化數以百計的與腫瘤生長有關聯的基因，而其沒有在健康的細胞中被偵測到的(Oritz-Zapater et al.,2011)。因此，依據本詳細說明，一神經膠質母細胞瘤的治療可能是藉由一含有完整的、細菌衍生的微細胞[其包含抵銷CEPB4的過度表現的一試劑(諸如一siRNA或中斷藉由腦腫瘤細胞所造成的CEPB4表現的其它功能性核酸分子)]的組成物的投藥而被達成。
(D)腦腫瘤
有如上面所詳述的，血管完整性的缺失是所有類型與階段的腦腫瘤的特性的事實意指依據本揭露內容的方法學可適用於治療任何腦腫瘤。就此觀點而言，“腦腫瘤”意指顱內的或在中樞脊髓管中的一固體腫瘤。
有超過120種的腦腫瘤。大多數醫療機構利用世界衛生組織(WHO)分類系統來鑑別腦腫瘤。WHO藉由細胞來源以及細胞如何作用來分類，從最低侵犯性(良性)到最高侵犯性(惡性)。一些腫瘤類型被分配為一範圍落在I級(最低侵犯性)至IV級(最高侵犯性)內的級別，其表示生長的速率。在分級系統中，取決於腫瘤類型會有所差別。個別腫瘤的類別以及級別有助於預測其可能的作用行為。最頻繁被診斷的類型包括聽神經瘤(acoustic neuroma)、星狀細胞瘤(astrocytoma)[包括I級-纖維性星狀細胞瘤(pilocytic astrocytoma)、II級-低-級別星狀細胞瘤、III級-未分化星狀細胞瘤(anaplastic astrocytoma)以及IV級-神經膠質母細胞瘤(GBM)]、脊索瘤(chordoma)、CNS淋巴瘤、顱咽管瘤、 其它神經膠瘤[腦幹神經膠瘤(brain stem glioma)、室管膜瘤、混合的神經膠瘤、視神經膠瘤(optic nerve glioma)以及室管膜下室管膜瘤(subependymoma)]、神經管胚細胞瘤(medulloblastoma)、腦脊髓膜瘤(meningioma)、轉移性腦腫瘤、寡樹突細胞瘤(oligodendroglioma)、腦下垂體瘤(pituitary tumors)、原發性神經外胚細胞瘤(primitive neuroectodermal tumors)(PNET)、其它腦-相關的病況，以及神經鞘瘤(schwannoma)。
在兒童中，這些腦腫瘤類型是更常見的：腦幹神經膠瘤、顱咽管瘤、室管膜瘤、幼年型纖維性星狀細胞瘤(juvenile pilocytic astrocytoma,JPA)、神經管胚細胞瘤、視神經膠瘤、松果體瘤(pineal tumor)、原發性神經外胚細胞瘤(PNET)以及橫紋肌瘤(rhabdoid tumor)。
本技術可被應用於治療任何腦腫瘤，包括，但不限於上述的類型以及級別，只要血管生成已被觸發。實際上，此基準適合至少當一腫瘤是藉由MRI而可偵測時，亦即，當其已生長至一大小而使得新的血管化被需要時。因此，本發明的方法學適合用於治療下列階段的任一者之一原發性腦腫瘤或一轉移性續發腦腫瘤：
I級：組織是良性。細胞看起來幾乎像是正常腦細胞，以及細胞生長是緩慢的。
II級：組織是惡性。細胞看起來要比在一為I級腫瘤中的細胞還不像是正常細胞。
III級：惡性組織具有看起來非常不同於正常細胞的細 胞。異常細胞是主動地生長。這些看起來異常的細胞被稱為未分化的(anaplastic)。
IV級：惡性組織具有看起來最異常以及傾向生長非常快速的細胞。
不同的腫瘤類型被知曉過度表現特定的受體於其等之細胞表面上。例如，轉移至腦的乳癌傾向具有過度表現HER2受體的一較大比例的轉移性乳癌細胞(Palmieri et al.,2007)。相同的作者顯示EGF受體表現在腦轉移中亦是高更多的。在另一個實例中，α3β1整合素受體(α 3β1 integrin receptor)已被顯示在已轉移至腦的肺癌細胞中被過度表現(Yoshimasu et al.,2004)。
因此被啟發的是，一依據本詳細說明的起因於一特定的原發性癌症的腦轉移的治療可據此適合利用一標的配位子(其具有一相稱於原發性癌症的專一性)，以供試劑-包裝的微細胞。因此，針對起因於一原發性乳癌的腦轉移，一治療可以使用一展現HER2專一性的配位子，隨著該配位子被附著於微細胞。同樣地，為了治療由原發性肺癌所造成的腦轉移，配位子可以是展現α3β1專一性的一者(諸如一抗-α3β1抗體)等等。
根據傳統的技術，單株抗體(例如抗-HER2，有如Roche/Genentech產品的群司珠單抗)的全身性投藥被理解不去治療起因於原發性乳癌的腦轉移。此認知是來自於抗體活性劑不能有效地越過血腦障壁而足以在腦轉移性腫瘤中達到治療顯著的濃度的事實。例如，參見Stemmler et al. (2007){在腦脊髓液中的群司珠單抗位準僅在一受損的血-腦障壁的病況[諸如腦膜性癌症(meningeal carcinomatosis)或放射治療(radiotherapy)]下增加}。因此，所有更令人驚訝的以及顯著的是一如此處所描述的組成物用以治療轉移性腦癌(藉由一配位子以上述的方式來標靶)的有效性。
(E)微細胞
“微細胞”意指缺少染色體(“無-染色體”)並且是藉由在二分裂(binary fission)期間擾亂細胞分裂與DNA分離的相互配合所產生的一細菌細胞的一衍生物。微細胞是不同於其它小的囊泡[諸如所謂的“細胞膜疹(membrane blebs)”(呈大小~0.2μm或更小)]，其在特定的情況下自發地被產生以及被釋出，但其不是由於特定的基因重排或游離基因態基因表現(episomal gene expresssion)而被產生以及被釋出。同樣地，完整的微細胞是不同於細菌殘骸(bacterial ghosts)，其不是由於特定的基因重排或游離基因態基因表現而被產生。因此，在此揭露內容中所使用的細菌衍生的微細胞是足夠完整的，並且是與特徵為被破壞的或被降解的，甚至被移除的一外部或定義的膜的無-染色體形式的其它細菌細胞衍生物不同。參見U.S.專利號第7,183,105號第111欄，第54行之處以及下列等等。以本揭露內容的微細胞為特徵的完整的膜允許在微細胞內的治療有效負載的滯留，直到有效負載在一腫瘤細胞內被釋出、攝取後為止。
在此揭露內容中所使用的微細胞可從細菌細胞[諸如大腸桿菌以及鼠傷寒沙門桿菌(S.typhymurium)]中被 製備。原核生物的染色體複製被連結至正常二分裂，其涉及中間-細胞間隔(mid-cell septum)形成。在大腸桿菌中，例如，min基因(諸如minCD)的突變，會移除細胞分裂期間在細胞極之處的間隔形成的抑制，致使一正常子細胞以及一沒有染色體的微細胞的生成。參見de Boer et al.,1992；Raskin & de Boer,1999；Hu & Lutkenhaus,1999；Harry,2001。
除了min操縱子突變之外，在一系列的影響間隔形成的其它基因重排或突變之後，較少染色體的微細胞(chromosome-less minicells)亦被產生，例如，在枯草桿菌(B.subtilis)中的divIVB1中。參見Reeve and Cornett(1975)。微細胞亦可在涉及細胞分裂/染色體分離的蛋白質的基因表現的位準上的一擾動之後而被形成。例如，minE的過度表現導致微細胞的極體分裂(polar division)以及生成。同樣地，較少染色體的微細胞可起因於染色體分離上的缺陷，例如，在枯草桿菌中的smc突變(Britton et al.,1998)，在枯草桿菌中的spoOJ刪除(Ireton et al.,1994)、在大腸桿菌中的mukB突變(Hiraga et al.,1989)，以及在大腸桿菌中的parC突變(Stewart and D’Ari,1992)。進一步地，CafA會在複製之後增強細胞分裂的速率和/或抑制染色體分配(chromosome partitioning)(Okada et al.,1994)，致使鍊接的細胞(chained cells)以及較少染色體的微細胞的形成。
因此，本揭露內容的微細胞可從任何細菌細胞(是革蘭氏陽性或革蘭氏陰性起源的一者)中被製備。此外， 有如上面所注意到的，被使用於本揭露內容中的微細胞應具有完整的細胞壁(亦即，是“完整的微細胞”)，以及應從其它小的囊泡(諸如細胞膜疹，其不歸屬於特定的基因重排或游離基因態基因表現)中被區別以及被分離。
在一個特定的具體例中，有如所提及的，用於微細胞的親代(來源)細菌可為革蘭氏陽性，或可為革蘭氏陰性。因此，在一個方面，親代細菌是選自於下列的一或多者：Terra-/Glidobacteria(BV1)、變形菌門(Proteobacteria)(BV2)、BV4[包括螺旋體門(Spirochaetes)、鞘脂桿菌綱(Sphingobacteria)以及Planctobacteria]。根據另一個方面，細菌是選自於下列的一或多者：厚壁菌門(Firmicutes)(BV3)[諸如桿菌(Bacilli)、梭菌(Clostridia)或無壁菌/柔膜菌綱(Tenericutes/Mollicutes)]或放線菌(Actinobacteria)(BV5)[諸如放線菌目(Actinomycetales)或雙歧桿菌目(Bifidobacteriales)]。
在又一個進一步的方面，細菌是選自於下列的一或多者：真細菌(Eobacteria)[綠彎菌門(Chloroflexi)、異常球菌-棲熱菌門(Deinococcus-Thermus)]、藍綠菌(Cyanobacteria)、熱脫硫桿菌門(Thermodesulfobacteria)、耐熱菌(thermophiles)[產水菌門(Aquificae)、熱袍菌門(Thermotogae)]、阿伐、貝他、伽瑪[腸桿菌科(Enterobacteriaceae)]、δ或ε變形菌門、螺旋體門、纖維桿菌門(Fibrobacteres)、綠菌門/擬桿菌門(Chlorobi/Bacteroidetes)、衣原體門/疣微菌門(Chlamydiae/Verrucomicrobia)、浮黴菌 屬(Planctomycetes)、酸桿菌門(Acidobacteria)、產金菌門(Chrysiogenetes)、脫鐵桿菌門(Deferribacteres)、梭桿菌門(Fusobacteria)、芽單胞菌門(Gemmatimonadetes)、硝化螺旋菌門(Nitrospirae)、互養菌門(Synergistetes)、網團菌門(Dictyoglomi)、黏膠球形菌綱(Lentisphaerae)、芽孢桿菌目(Bacillales)、有芽胞桿菌科(Bacillaceae)、李斯特菌科(Listeriaceae)、葡萄球菌科(Staphylococcaceae)、乳桿菌目(Lactobacillales)、腸球菌科(Enterococcaceae)、乳酸桿菌科(Lactobacillaceae)、明串珠菌科(Leuconostocaceae)、鏈球菌科(Streptococcaceae)、梭菌目(Clostridiales)、鹽厭氧菌目(Halanaerobiales)、嗜熱厭氧菌目(Thermoanaerobacterales)、黴形體目(Mycoplasmatales)、蟲原體目(Entomoplasmatales)、厭氧枝原體目(Anaeroplasmatales)、非固醇菌原體目(Acholeplasmatales)、Haloplasmatales、放線菌亞目(Actinomycineae)、放線菌科(Actinomycetaceae)、棒桿菌亞目(Corynebacterineae)、分枝桿菌科(Mycobacteriaceae)、諾卡氏菌科(Nocardiaceae)、棒狀桿菌科(Corynebacteriaceae)、弗蘭克氏菌亞目(Frankineae)、弗蘭克氏菌科(Frankiaceae)、微球菌亞目(Micrococcineae)、短桿菌科(Brevibacteriaceae)以及雙歧桿菌科(Bifidobacteriaceae)。
有關藥學用途，本揭露內容的一組成物應包含有盡可能完全地從免疫原性組分以及其它毒性汙染物中被分離出的微細胞。用於純化細菌衍生的微細胞以移除游離內毒素以及親代細菌細胞的方法學是在WO 2004/113507中被 描述，其在此處以其整體被併入本案以作為參考資料。簡言之，純化過程達到移除：(a)較小的囊泡，諸如細胞膜疹，其通常是呈小於0.2μm的大小，(b)從細胞膜中所釋出的游離內毒素，以及(c)親代細菌(不論活的或死的)，以及其等之殘骸，其等也是游離內毒素的來源。該移除可使用特別是一為0.2μm的過濾器來移除較小的囊泡以及細胞殘骸、一為0.45μm的過濾器在親代細胞的誘導之後來移除親代細胞而被執行，俾以形成絲狀結構、用來殺死活的細菌細胞的抗生素以及抗游離內毒素的抗體。
下面的純化過程是本案發明人的一發現，不管其等細菌來源的差異，所有完整的微細胞是大約呈400nm的大小，亦即大於細胞膜疹以及其它較小的囊泡並且又小於親代細菌。有關微細胞的大小測定可藉由使用固態(諸如電子顯微鏡)，或者藉由以液態為基礎的技術[例如動態光散射(dynamic light scattering)]而被完成。由各個該種技術所產生的大小數值會具有一誤差範圍，並且數值會在技術之間而稍微不同。因此，在一乾燥狀態下的微細胞的大小可藉由電子顯微鏡而被測量為大約400nm±50nm。另一方面，動態光散射可測量呈大約500nm±50nm的大小之相同的微細胞。同樣地，藥物-包裝的、配位子-標靶的微細胞可再次利用動態光散射而被測量為大約600nm±50nm。
如上面所描述的，此大小數值的散佈實際上是立即被提供的，例如，用於從免疫原性組分以及其它毒性汙染物中分離微細胞的目的。亦即，一完整的、細菌衍生的 微細胞的特徵在於：由一硬質膜(rigid membrane)所圍繞的細胞質，該硬質膜給予微細胞一堅固的、球面結構。此結構在穿透-電子顯微鏡下是明顯的，其中微細胞直徑是穿過微細胞，在硬質膜的外限界之間被測量。此測量提供上面所提及的呈400nm±50nm的大小數值。
衍生自革蘭氏陰性細菌的一微細胞的另一個結構元素是脂多醣(LPS)的O-多醣組分，其是藉由脂質A錨(lipid A anchor)而被包埋於外膜中。該組分是一由重複的碳水化合物-殘基單元(repeat carbohydrate-residue unit)的所構成的鏈，每鏈具有多達70至100個由4至5種糖組成的重複單元。因為這些鏈是不堅固的，在一液態環境中，有如在活體內，其等可採用一波浪、撓性結構而提供在一珊瑚海環境中的海藻的整體外觀；亦即，該等鏈與液體一起移動，而其餘者錨定至微細胞膜。
有如上面所注意到的，被O-多醣組分所影響，動態光散射可提供一針對微細胞大小呈大約500nm至大約600nm的數值。然而，來自於革蘭氏陰性以及革蘭氏陽性細菌的微細胞一樣立即地通過一為0.45μm的過濾器，這證實一為400nm±50nm的有效微細胞大小。上面所提及的在大小上的散佈是被本發明所涵蓋的，並且特別地是藉由在慣用語“大約呈400nm的大小”中的修飾語“大約”以及類似者而被表示。
有關於毒性汙染物，本揭露內容的一組成物可含有少於大約350EU游離內毒素。就此觀點而言例示的是分 別具有大約250EU、大約200EU、大約150EU、大約100EU、大約90EU、大約80EU、大約70EU、大約60EU、大約50EU、大約40EU、大約30EU、大約20EU、大約15EU、大約10EU、大約9EU、大約8EU、大約7EU、大約6EU、大約5EU、大約4EU、大約3EU、大約2EU、大約1EU、大約0.9EU、大約0.8EU、大約0.7EU、大約0.6EU、大約0.5EU、大約0.4EU、大約0.3EU、大約0.2EU、大約0.1EU、大約0.05EU以及大約0.01EU的游離內毒素的位準。
本揭露內容的一組成物亦可含有至少大約108微細胞，例如，至少大約5×108。另擇地，該組成物可含有大約109或1010微細胞，例如，5×109、1×1010或5×1010微細胞。再者，在所有該等微細胞的數目中，本揭露內容的一組成物可含有少於大約10個汙染的親代細菌細胞，例如，少於大約9、8、7、6、5、4、3、2或1個親代細菌細胞。
(F)將一抗-腫瘤試劑包裝至微細胞中
可由一核酸所編碼的抗-腫瘤試劑(諸如蛋白質以及功能性核酸)可藉由將一載體(諸如一編碼抗-腫瘤試劑的質體)轉形至親代細菌細胞內而被導入至微細胞中。當一微細胞是從親代細菌細胞中被形成時，微細胞保留質體和/或表現產物：抗-腫瘤試劑的特定複本。更多將一表現產物包裝至一微細胞中的詳細說明是在WO 03/033519中被提供，其之內容以其整體被併入本揭露內容以作為參考資料。
例如，在WO 03/033519中所呈現的數據證明的是攜帶哺乳動物基因表現質體的重組型微細胞可被輸送至 吞噬細胞(phagocytic cell)以及非-吞噬細胞(non-phagocytic cell)。該申請案亦描述使用被攜帶於游離基因態-複製的質體DNAs(episomally-replicating plasmid DNAs)上的異源性核酸(heterologous nucleic acids)對生成微細胞的親代細菌菌株的基因轉形。當親代細菌以及微細胞分離時，某些游離基因態DNA(episomal DNA)分離至微細胞中。生成的重組型微細胞是藉由哺乳動物吞噬細胞而立即地被吞沒以及變得被降解於細胞內吞噬溶菌體(intracellular phagolysosomes)內。此外，某些重組型DNA逃脫吞噬溶菌體膜(phagolysosomal membrane)以及被輸送至哺乳動物細胞核，重組型基因於該處被表現。
核酸亦可直接地被包裝至微細胞中。因此，一核酸可藉由將複數個完整的微細胞與一緩衝液中的核酸一起共-培育而直接地被包裝至完整的微細胞中。緩衝液組成物可被改變，有如在此領域中所詳知的條件的作用，俾以最佳化核酸在完整的微細胞中的負載。緩衝液亦可取決於核苷酸序列以及要被負載於微細胞中的核酸的長度而被改變。一旦被包裝，核酸餘留在微細胞內部而免於被降解。例如，使用被培育於無菌鹽水中的siRNA-包裝的微細胞的延長的培育研究顯示，沒有siRNAs的洩漏。
在另一個具體例中，針對不同mRNA標的之多重核酸可被包裝在相同的微細胞中。此一方法可被用來反制抗藥性以及細胞凋亡抗性。例如，癌症病患經常展現出對於化學治療藥物的抗性。該抗性可藉由基因[諸如多重抗藥 性(multi-drug resistance,MDR)幫浦以及特別是抗-細胞凋亡基因]的過度表現而被調控。為了反制此抗性，微細胞可被包裝以治療顯著的濃度的功能性核酸至MDR-關聯性基因，並且在化學治療之前被投藥給一病患。此外，將針對不同mRNA標的的多重功能性核酸包裝至相同微細胞中會增強治療成功，因為大多數分子標靶被進行突變以及具有多重對偶基因。更多將一核酸直接地包裝至一微細胞中的詳細說明是在WO 2009/027830中被提供，其之內容以其整體被併入本揭露內容以作為參考資料。
不論親水性或疏水性的小分子藥物可藉由產生一介於一含有細胞外培養基的微細胞以及微細胞細胞質之間的藥物的濃度梯度(concentration gradient)而被包裝至微細胞中。當細胞外培養基含有一要比微細胞細胞質還高的藥物濃度時，藥物自然地降低此濃度梯度至微細胞細胞質。然而，當濃度梯度被逆轉時，藥物不移出微細胞外。
為了以正常地非水溶性的藥物來裝填微細胞，藥物最初會被溶解於一適當的溶劑中。例如，太平洋紫杉醇可被溶解於一為1：1的乙醇以及cremophore EL[聚乙氧基蓖麻油(polyethoxylated castor oil)]的混合物中，繼而以PBS的一稀釋來完成一太平洋紫杉醇的溶液，該溶液於水性介質中被部分地稀釋，並且攜帶極微量的有機溶劑來確保藥物維持在溶液中。微細胞可用於藥物裝填而被培育於此最終培養基中。因此，發明人發現：即使疏水性藥物也會擴散至微細胞的細胞質或膜中，以達成一高的以及治療顯著 的胞質藥物裝填。這是意想不到的，因為微細胞膜是由一疏水性磷脂雙層(hydrophobic phospholipid bilayer)(其被預期防止疏水性分子擴散至細胞質中所組成。
下面實施例10證明將下列不同的代表性小分子藥物(例示不同大小以及化學特性)裝填至微細胞中：多柔比星、太平洋紫杉醇、氟-太平洋紫杉醇(Fluoro-paclitaxel)、順氯氨鉑、長春鹼、Monsatrol、胸苷酸合成酶(Thymidylate synthase)(TS)抑制劑OSI-7904、伊立替康、5-氟尿嘧啶(5-Fluorouracil)、吉西他賓以及卡鉑。再者，所形成的小分子藥物-包裝的微細胞全面地顯示在活體外以及在活體內顯著的抗-腫瘤效力。因此，此處所呈現的這些數據清楚地證明微細胞裝填方法的有效性以及多樣性。
(G)將微細胞導引至特定的哺乳動物細胞
根據此揭露內容的一個進一步的方面，有如上面所描述的，一組成物的微細胞是經由一配位子而被導引至一標的哺乳動物腫瘤細胞。在某些具體例中，配位子是“雙專一性(bispecific)”。亦即，配位子展現一針對微細胞以及哺乳動物(腫瘤)細胞組分這兩者的專一性，而使得其等造成一特定的微細胞結合至標的細胞，藉此後者吞沒前者。利用雙專一性配位子來標靶一微細胞至一腫瘤細胞被進一步描述於WO 05/056749以及WO 05/079854中，其等各自內容在此處以其整體被併入本案以作為參考資料。一旦此一配位子被附著於一微細胞，配位子的未滿專一性(unoccupied specificity)[“單一專一性(monspecificity)”]存在直到其與標 的(腫瘤)哺乳動物細胞交互作用為止。
配位子可從微細胞或其等之親代細胞內部中被表現並且接著被展現於微細胞表面上。另擇地，配位子可被附著於(“包覆於”)微細胞的細胞膜，例如，憑藉配位子-受體交互作用。在任一個例子中，配位子不需要一針對該微細胞的專一性，而僅展現一針對一具有哺乳動物細胞特性的組分的專一性。亦即，該組分在治療中不需要專一於腫瘤細胞本身，或甚至專一於特定種類的腫瘤細胞，只要腫瘤細胞將組分呈現於其等之細胞表面上。有如本案發明人發現的(亦參見下面的實例)，當靜脈內投藥時，微細胞快速地累積於腫瘤微環境中。此累積[以有如一上面所描述的滲漏的腫瘤脈管系統(leaky tumor vasculature)的作用形式而存在]造成微細胞-包裝的治療劑標靶輸送有效負載至腫瘤的細胞。然而，與本揭露內容一致，其會是有益的以及有時對於標靶一要被治療的腫瘤的一組分的配位子是較佳的。
在本揭露內容的一經投藥的組成物中所含有的微細胞的任一例子中，當有如上面所描述的累積於腦腫瘤微環境中時，接觸以及結合至標靶的腫瘤細胞，引起其等被攝取至細胞中，接著是藉由治療有效負載而被影響。有如上面所描述的，那有效負載可為一細胞毒性藥物，例如多柔比星或任何其它抗-腫瘤藥物。有效負載亦可為siRNA或miRNA，例如一抗-細胞凋亡RNAi序列(諸如抗-Bcl2)。
發明人發現到此標靶的輸送方法可廣泛地應用 於一系列的哺乳動物腫瘤細胞，包括對於微細胞的專一性黏著以及胞吞作用通常是有抵抗力的細胞。例如，由一針對一抗-HER2受體或抗-EGF受體所組成的配位子將微細胞有效地結合至位在一系列的標靶的、非-吞噬細胞上的各自的受體。這些細胞包括肺、卵巢、腦、乳房、前列腺以及皮膚癌細胞。
由此所達到的結合優於由各個類型的非-吞噬細胞所造成的微細胞的快速胞吞作用。一般而言，一用於本揭露內容的適合的標的細胞特徵為：表現一當結合一配位子時促進胞吞作用的細胞表面受體。宿主細胞對於黏著通常是有抗性的。因此，當被一配位子所附著時，宿主細胞活化其之胞吞作用機制俾以移除配位子。
術語“胞吞作用(endocytosis)”包含：(1)吞噬作用(phagocytosis)以及(2)胞飲作用(pinocytosis)，其本身為一範疇包括：(2a)巨胞飲作用(macropinocytosis)，其不需要受體結合；以及(2b)網格蛋白-調控的胞吞作用(clathrin-mediated endocytosis)、(2c)胞膜窖-調控的胞吞作用(caveolae-mediated endocytosis)，以及(2d)網格蛋白-/胞膜窖-獨立的胞吞作用(clathrin-/caveolae-independent endocytosis)，其等全部傾向接近晚期-內體(endosome)/溶酶體(lysosome)途徑。本案發明人發現，在一微細胞上的配位子以及一哺乳動物細胞表面受體之間的交互作用，會活化一特定的胞吞作用途徑，其涉及對於晚期-內體/溶酶體腔室的受體調控的胞吞作用(rME)。憑藉此一胞吞作用途徑，本 案發明人進一步發現：微細胞能夠釋放其等之有效負載至標的哺乳動物細胞的細胞質中。假如有效負載是一編碼的核酸，該核酸不僅在晚期-內體/溶酶體腔室中不被完全地降解，而且被表現於標的哺乳動物細胞中。
根據此揭露內容，在上面所描述的標靶輸送方法中有用的配位子包括結合至位在一標的細胞上的一表面組分以及位在一微細胞上的一表面組分的任何試劑。較佳地，位在一標的細胞上的表面組分是一受體。該等配位子可包含有一多肽和/或碳水化合物組分。抗體是較佳的配位子。
例如，一帶有針對一位在標的哺乳動物腦腫瘤細胞上的表面組分(諸如一腫瘤抗原)的專一性的抗體，可被用來將微細胞有效地標靶至在要被治療的腦腫瘤中的標的細胞。細胞表面受體的實例包括：表皮生長因子受體(epidermal growth factor receptor,EGFR)、血管內皮生長因子受體(vascular endothelial growth factor receptor,VEGFR)、血小板-衍生的生長因子受體(platelet-derived growth factor receptor,PDGFR)以及似胰島素生長因子受體(insulin-like growth factor receptor,IGFR)，其等全部於一系列的固體腫瘤中被高度表現，包括腦腫瘤以及被過度表現於某些垂體腺瘤(pituitary adenomas)中的葉酸鹽受體。雙專一性配位子亦可被標靶至突變的或變異體受體，例如被表現於50%至80%的人類GBMs中的IL-13Rα2受體(Debinski et al.,2000；Jarboe et al.,2007；Okada et al.,2008；Wykosky et al.,2008)，但不同於其之生理學對應體IL4R/IL13R(其被表現於正常 組織中)(Hershey 2003)。IL13Rα2實際上是正常腦細胞中缺少的(Debinski and Gibo,2000)。此外，轉移至腦的腫瘤可以過度表現特定的受體以及這些受體亦可為適合的標的。例如，一研究(Da Silva et al.,2010)顯示乳癌的腦轉移表現HER家族的所有成員的酪胺酸激酶受體(tyrosine kinase receptor)。HER2被擴增並且於20%的腦轉移中被過度表現，EGFR於21%的腦轉移中被過度表現，HER3於60%的腦轉移中被過度表現，以及HER4於22%的腦轉移中被過度表現。有趣地，HER3表現在存在於腦中的乳癌細胞中被增加。
較佳的配位子包含有抗體和/或抗體衍生物。在現今的用途中，術語“抗體”包含由在活體外或在活體內產生的一免疫原性反應所獲得的一免疫球蛋白分子(immunoglobulin molecule)。因此，“抗體”範疇包括單株抗體(monoclonal antibodies)以及人類化抗體(humanized antibodies)，以及抗體衍生物，諸如單-鏈抗體片段(single-chain antibody fragment)(scFv)，雙專一性抗體等等。很多不同的雙專一性蛋白質以及以抗體為基礎的配位子被知曉，有如由Caravella and Lugovskoy(2010)的回顧文獻所證明的，在此以其整體被併入本案以作為參考資料。在本揭露內容中有用的抗體以及抗體衍生物亦可藉由重組型DNA技術而被獲得。
(H)配方以及投藥途徑與時程
本揭露內容的一組成物的配方可以單位劑型(unit dosage form)而被呈現，例如，在安瓿或小玻璃瓶中， 或在多重-劑量容器中，具有或不具有一被添加的防腐劑。配方可為一溶液(solution)，一懸浮液(suspension)，或在油性或水性載劑中的一乳劑(emulsion)，以及可含有配方劑(formulatory agent)[諸如懸浮、穩定和/或分散劑(suspending,stabilizing and/or dispersing agent)]。一適合的溶液是與接受者的血液等張的，並且由鹽水、林格氏液(Ringer's solution)以及右旋糖溶液(dextrose solution)所例示。另擇地，配方可呈凍乾粉末形式，用於以一適合的載劑[例如無菌、無熱原水(pyrogen-free water)或生理鹽水]來復水(reconstitution)。配方亦可呈一存積性製劑(depot preparation)的形式。該等長效配方可藉由植入(implantation)(例如，皮下地或肌肉內地)或藉由肌肉內注射(intramuscular injection)而被投藥。
在某些方面，一包括一治療有效量的一抗-腫瘤試劑的含有微細胞的組成物被提供。根據本揭露內容，一抗-腫瘤試劑的一“治療有效”量是一在考慮中的試劑的劑量，例如，當一siRNA或一化學治療藥物被投藥至一個體時會引起一藥理學反應。
因此，在本揭露內容的內文中，有如下面進一步所描述的，在一動物模型中或在一人類個體中，當攜帶一治療有效負載的微細胞被投藥時，一治療有效量可參考預防或改善腦腫瘤或腦腫瘤的一症狀而被判斷。在一特定的例子中，對於一特定的個體，一證實“治療有效量”的數量可能不是對於同樣針對腦腫瘤而被治療的個體是100%有效的，即使該劑量是被熟習的從事者認定為一“治療有效 量”。就此觀點而言，適當的劑量亦將會隨著一作用(例如腦腫瘤的類型、階段以及嚴重性)而改變。無論如何，依據本揭露內容，本例示的活體外測試(實施例3以及4)以及活體內測試(實施例5、7以及8)，以及用於定量在活體內的藥物的分配的方法學(實施例9)，當考量整體詳細說明時，能夠使一在藥物候選者的臨床前或臨床試驗中有知識者經由例行性實驗來決定用於一特定的適應症的活性劑的治療有效量。同樣地，當“治療有效量”被用來意指在一藥學組成物中的微細胞的數目時，數目可根據何種抗-腫瘤試劑被包裝至微細胞中以及該試劑在治療一腦腫瘤上的效力而被確定。就此觀點而言，治療效用可使用一臨床或病理參數(諸如腫瘤團塊)而被測量。因此，一腫瘤團塊的減少或經減少的增加可被用來測量治療效用。
在本揭露內容中的配方可經由各種不同的途徑並且對一哺乳動物身體中的各種不同部位而被投藥，俾以達到局部地或全身性地任一所欲的治療效用。在一個特定的方面，投藥的途徑是靜脈內注射(intravenous injection)。
一般而言，當將任何潛在毒性減到最小時，本揭露內容的配方可在由例行性測試所定義的適當的劑量下被使用，以獲得最佳生理學效用。劑量攝生法(dosage regimen)可根據各種不同的因素(包括年齡、重量、性別、病患的醫療狀況；腦腫瘤的嚴重性或階段、投藥的途徑，以及病患的腎臟以及肝功能)而被選擇。
在達成產生具有最小副作用的最大效力的範圍 內的微細胞以及治療劑的濃度下的最佳精確度典型地將會需要一根據試劑可利用性的動力學的攝生法來標靶位址以及標靶細胞。當決定用於一治療攝生法的最佳濃度時，微細胞或試劑的分配、平衡以及排除可被考量。微細胞以及治療劑的劑量可分別被調整來達到所欲的效用。
此外，配方的劑量投藥可利用一藥物動力學/藥力學模型化系統(pharmacokinetic/pharmacodynamic modeling system)而被最佳化。因此，一或多種劑量攝生法可被選擇以及一藥物動力學/藥力學模型可被用來決定一或多種劑量攝生法的藥物動力學/藥力學圖譜。根據一特定的該圖譜，用於投藥的劑量攝生法的一者接著可被選擇而達到所欲的藥物動力學/藥力學反應。例如，參見WO 00/67776。
本揭露內容的一配方可對一腦腫瘤病患投藥至少一週一次，歷時數週的期間。因此，該配方可被投藥至少一週一次，歷時一為數週至數月的期間。
更具體而言，本發明的配方可被投藥至少一天一次歷時大約2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、21、22、23、24、25、26、27、28、29、30或31天。另擇地，配方可被投藥大約每天一次或大約每2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、21、22、23、24、25、26、27、28、29、30或31天一次或更多。
在本揭露內容的另一個具體例中，配方可被投藥 大約每週一次或大約每2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19或20週一次或更多。另擇地，配方可被投藥至少一週一次歷時大約2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19或20週或更多。
另擇地，配方可被投藥大約每月一次或大約每2、3、4、5、6、7、8、9、10、11或12月一次或更多。
配方可以一個單一每日劑量而被投藥。另擇地，每日總劑量可以每天2、3或4次的分開的劑量而被投藥。
下面實施例僅是例示的，而非限制，以及提供本揭露內容一更完整的理解。
實施例1. 多柔比星-包裝的、狗的EGFR-標靶的微細胞的製備
有如先前由MacDiarmid et al.(2007)所描述的，微細胞是衍生自鼠傷寒沙門桿菌(S.typhimurium)的一minCDE-染色體刪除突變株，被純化、被包裝以多柔比星(dox)以及經由包含有抗-微細胞表面O-多醣以及抗-狗的EGFR專一性的一個雙專一性單株抗體(MAb)的附著而被標靶(被命名為EGFR微細胞Dox)。
EGFR微細胞Dox最初的特徵在於其等用於i.v.投藥至帶有晚期腦癌的7隻狗(被命名為BCD-1至BCD-7的狗)中的適合性。2隻額外的狗(BCD-8以及BCD-9)，存在於獸醫專科中心但不參加研究因為其等具有非常晚期的腦腫瘤以及被安樂死。腦生檢樣品提供各自的腦腫瘤細胞以供活體 外研究。
實施例2. 抗-人類EGFR單株抗體用於結合至狗的腦腫瘤細胞之特性
EGFR的上升調節以及過度表現在~60%的在人類(Smith et al.,2001)以及狗(Higgins et al.,2010)這兩者中的GBM案例中是被詳知的。假如一專一性狗的EGFR MAb的不可利用性，商業上可獲得的抗-人類EGFR MAb是在狗及人類腦腫瘤細胞株中被測試以測定MAb對於在狗的腦腫瘤細胞上的EGFR的交叉反應(cross-reactivity)。
在可行的情況下，腦腫瘤生檢樣品是從個案研究狗中被獲得。來自於BCD-1、-8以及-9的組織樣品是以1mg/mL膠原蛋白酶(collagenase)[配於含有10%胎牛血清(FCS)以及Penstrep的杜貝可氏改良的依格氏培養基(DMEM)]予以處理歷時10min。未經分解的組織是藉由透過一雙層的無菌紗布拭子(sterile gauze swab)的過濾而被移除。膠原蛋白酶分解是藉由將細胞稀釋以5mL培養基以及在1,200g下離心歷時5min而被終止。細胞被洗滌以一額外的5mL培養基繼而重複離心以及再懸浮。細胞接著被塗盤於組織培養瓶(tissue culture flask)中。
狗GBM細胞株，J3T(Rainov et al.,2000)，是得自於轉譯基因體研究中心的Dr.Michael Berens(Phoenix,AZ,USA)。所有的狗之腦腫瘤細胞培養物被維持於補充有10%(vol/vol)FCS、100U/mL盤尼西林(penicillin)、100U/mL鏈黴素(streptomycin)、2mM 1-麩胺酸(1-glutamine)以 及2mM非必需胺基酸(nonessential amino acid)的DMEM中。
人類GBM-星狀細胞瘤上皮細胞株(U87-MG)是得自於美國類型培養物收集中心(ATCC)以及生長於具有5%胎牛血清(FBS)的OPTI-MEM培養基(Invitrogen,USA)中。
細胞是藉由使用2mM EDTA/PBS而從培養瓶中分離而被收集以及被區分為1×106細胞/管。細胞是在封阻溶液(blocking solution)[具有2% BSA以及0.1%疊氮化鈉(sodium azide)的PBS]中被洗滌2次，以及在冰上被培育於封阻溶液中歷時10min，繼而在冰上培育以1μg/μL抗-人類EGFR單株抗體(IgG2a；Calbiochem)歷時45min。在以封阻溶液2次洗滌之後，細胞在冰上被培育以R-藻紅素綴合的山羊抗-小鼠IgG(Molecular Probes/Invitrogen)歷時45min以及使用和緩的攪拌。在封阻溶液中2次洗滌之後，細胞是在PBS中被再散浮以及被使用於流動式細胞測量術分析(flow cytometry analysis)。作為對照組，PBS代替一次抗體被用來測定自體螢光(autofluorescence)。
被染色的細胞懸浮液(cell suspension)是利用CXP Cytometer軟體(Beckman Coulter)以流動式細胞測量術FC 500而被測量。EGF受體的數目是藉由分析流動式細胞測量術與螢光的R-藻紅素微珠標準品(量子R-PE MESF珠；Bang Laboratories Inc,Fishers,IN,USA)相比較而被測定。校正曲線(calibration curve)是藉由將已知的每株等效的R- 藻紅素分子的數目對其之平均螢光強度(mean fluorescence intensity)的對數繪圖而被產生。細胞螢光強度被外推至一標準螢光校正曲線上。在減去負對照組之後，平均螢光的數值被轉換為每細胞所結合的抗體的數目。
結果顯示(圖1)MAb強烈地結合至狗(J3T、BCD-1、-8以及-9)及人類(U87-MG)這兩者腦癌細胞上的EGFR。
利用FACS分析的受體定量研究顯示(圖1)有關BCD-1、U87-MG、BCD-9、BCD-8以及J3T細胞的每細胞EGFR濃度(呈一減少的順序)分別是2,866,854、1,465,755、930,440、774,352以及287,622。這顯示出各個細胞類型過度表現EGFR。
因此，抗-人類EGFR MAb對於狗的EGFR之結合交叉反應，在對於狗及人類腦癌細胞的活體外結合分析之後被確認。
因此，為了達成腦腫瘤細胞的主動標靶，抗-人類EGFR MAb被選擇去包覆Dox-包裝的微細胞。
實施例3. 狗的腦癌細胞對於化學治療藥物多柔比星的敏感度的測定
在利用dox-包裝的、EGFR-標靶的微細胞來治療帶有晚期腦癌的狗之前，測定狗的腦腫瘤細胞對於化學治療藥物多柔比星是否是敏感的或具抗性的是重要的。
狗的腦腫瘤細胞BCD-1、-8、-9以及J3T以及人類腦腫瘤細胞株U87-MG以每井5×103細胞被接種至96井盤 中。細胞在37℃、5% CO2下被培育過夜。
多柔比星被添加至100μL的含有範圍落在1.7nM至8,600nM內的濃度下的血清的相關培養基中的細胞並且被培育歷時72小時。
為了測量多柔比星的細胞毒性效應(cytotoxic effect)，一MTS細胞增生分析被執行。20μL的MTS溶液(CellTitre 96® Aqueous One MTS reagent-Promega)被添加至各個井以及在黑暗中被培育歷時30分鐘。吸光值是在一為490nm的波長下被讀取。數據是利用非-線性迴歸(non-linear regression)以及一個4-參數曲線調整(4-parameter curve fit)而在Prism GraphPad(La Jolla,CA,USA)中被分析。
細胞增生分析顯示所有上面的細胞株對於多柔比星是同樣敏感的(圖2)。
實施例4. 將 EGFR 微細胞 Dox 結合至狗的腦腫瘤細胞之效率
狗及人類腫瘤細胞是分別使用專一性以及非-專一性-標靶的微細胞、EGFR微細胞Dox以及gp120微細胞Dox而被轉染歷時2hrs，以及洗去非-附著微細胞後，細胞被處理以標誌有Alexa-Fluor 488螢光染料(AF-488)的抗-小鼠IgG2a MAb。gp120 MAb是針對人類免疫缺乏病毒1外套糖蛋白gp120(human immunodeficiency virus 1 envelope glycoprotein gp120)以及在此研究中所測試的任何腦腫瘤細胞株的表面上未被發現到。細胞接著是利用FACS而被分析。結果顯示(圖3)在各個例子中，當被處理以EGFR微細胞Dox時， >95%的細胞強烈地發出螢光，以及當被處理以對照組gp120微細胞Dox時，細胞不顯示螢光。
被觀察到的結合效率是利用螢光顯微鏡來直接顯影EGFR微細胞Dox對腦腫瘤細胞的結合以及還有多柔比星在癌症細胞中的細胞內輸送而進一步被確認。
EGFR微細胞Dox被用來轉染狗的腦腫瘤及人類對照組細胞株。轉染後的第3小時以及洗去剩餘未結合的微細胞，仍然附著於細胞株的微細胞是藉由將EGFR標靶MAb標記以抗-IgG2a-AF488而被顯露。結果顯示(圖4)專一性標靶的微細胞(EGFR微細胞Dox)以大量結合至人類以及狗的腦癌細胞而對照組微細胞則無。此外，大多數被處理以EGFR微細胞Dox的細胞在細胞核中顯示dox自體螢光，這顯示一顯著數目的微細胞已被胞飲攝入、溶解於細胞內溶酶體(intracellular lysosome)中以及dox已被細胞內釋出。此藉由雙專一性抗體-標靶的、藥物-包裝的微細胞細胞內輸送藥物至不同腫瘤細胞株的機制已由本申請案的作者在之前被描述以及被公開(MacDiarmid et al.,2007)。
上面的結果提供用於將微細胞包裝以dox以及將其等標靶至EGFR的理論基礎。
實施例5. 使用 EGFR 微細胞 Dox 治療7隻晚期腦癌狗以及抗-腫瘤效力
在此研究中的狗是作為病患而被呈送給獸醫專科中心(VSC)或小動物專門醫院(SASH)(在雪梨，澳洲)的寵物狗。研究參與被提供給標準治療已被狗的擁有者拒絕的、 或者如果發生沒有有意義的標準治療存在其中的重病之病患。狗是依照國家衛生暨醫藥研究委員會(National Health and Medical Research Council)、澳洲關於實驗動物的護理以及使用的規範(Australia guidelines for the care and use of laboratory animals)，並且具有EnGeneIC動物倫理委員會(EnGeneIC Animal Ethics Committee)認可而被治療。簽名的經告知的同意是從所有擁有者中被獲得。所有病患在那時或由於任何原因所造成的死亡之時接受屍體剖驗檢查。
所有的腦腫瘤是在可行的情況下藉由組織學(histology)或細胞學(cytology)而被診斷。死前診斷是根據磁振造影(magnetic resonance imaging)(MRI)以及臨床症狀(clinical sign)上的外觀特徵的一組合。組織學診斷在這些腦腫瘤個案中被認為太侵犯性以及診斷是藉由屍體剖驗而被確認。
所使用的分級法取決於組織類型以及腫瘤的解剖部位，以及臨床狀態(clinical status)而改變。這些包括，但不限於：身體檢查(physical examination)、完整的血球計數(complete blood count)、血清生化圖譜(serum biochemistry profile)、尿分析法(urinalysis)、凝血狀況(coagulation profile)、胸腔放射顯影(thoracic radiographs)、腹部超音波掃描(abdominal ultrasound)以及磁振造影(MRI)。MRI掃描是使用一為1.5T Phillips Achieva而被執行。
所提供的狗用於研究是合適的，牠們具有合乎需要的功能狀態，以及血液性與血清生化參數來接受治療。 所有的狗在參與研究之時具有可測量的疾病但在疾病的階段或疾病負擔上沒有限制。病患被允許持續用藥來幫助預防癲癇(seizures)以及CNS水腫。先前已針對伴隨的病況而被開處方的用藥亦被允許持續。另擇的治療在試驗期間不被允許。
使用每劑量1×1010 EGFR微細胞Dox的治療是在一為每週的基礎上被執行。治療是藉由一經滅菌置放的周邊靜脈導管(peripheral vein catheter)(左邊頭部)以2mL而被投藥歷時一為2分鐘的滴注。
病患入院以及3mL血液是藉由頸靜脈穿刺(jugular venipuncture)而被收集。這是被置放至用於血液學的鉀EDTA中以及用於生化的血清促凝劑(serum clot activator)管。一額外的5mL是在EGFR微細胞Dox的投藥前以及在微細胞投藥後的第4小時之時被收集。狗在整個臨床治療期間被監測並且在EGFR微細胞Dox治療後的第4小時之時在缺少任何毒性副作用下，狗被送回家。
血液被置放於一無菌管中，在室溫(20至22℃)下在1,580×g下被離心歷時15min以及血清被滅菌地收集。血清被儲存在-80℃下直到被需要用於細胞激素或抗體反應分析為止。病患在治療之前15分鐘被預-用藥以縮蘋酸氯菲安明(chlorpheniramine maleate)(呈0.5mg/kg)以及磷酸鈉迪皮質醇(dexamethasone sodium phosphate)(呈0.2mg/kg)。
個案研究是在接受伴隨臨床觀察的初始臨床分期(clinical staging)以及腦的MRI的7隻晚期腦癌狗中被執 行。
被命名為BCD-1至BCD-7的狗病患顯示晚期腦腫瘤的典型臨床症狀，包括癲癇(seizures)、運動失調(ataxia)、部分肢體麻痺(partial limb paralysis)、周邊視覺的部分缺失(part loss of peripheral vision)以及攻擊性行為(aggressive behavior)(參見下面表2)。
1×1010 EGFR微細胞Dox的靜脈內(i.v.)巨量注射是在狗中每週一次被投藥以及臨床評估、血清血液學、生化、免疫反應(對於微細胞顯性抗原：LPS的抗體效價)以及細胞激素反應研究是每週被執行。腦的MRI掃描是大約每8週被執行俾以測定抗-腫瘤反應。要在狗中被投藥的微細胞的劑量是從帶有晚期血管肉瘤(hemangiosarcoma)的20隻狗中的研究以及恒河猴中的毒物學試驗中被事先決定(數據未顯示)。
結果顯示在臨床分期之時所確定的腦腫瘤的異常臨床症狀(表2)在大約5至15用劑的EGFR微細胞Dox之後回復至正常。
反應是藉由MRI掃描被評估。反應是依據有關固體腫瘤的固體腫瘤反應評估標準(Response Criteria In Solid Tumors)(RECIST v 1.1)而被分類。此外，腦腫瘤體積是利用公式：長度×寬度×高度×(π/6)而被評估。一完全反應(complete response,CR)被定義為所有被知曉的嚴重疾病的消失，一部分反應(partial response,PR)被定義為從基準但不是一CR的腫瘤大小上的一為≧50%減少，穩定的疾病是 針對不符合標準或CR、PR或進行性疾病的腫瘤而被命名以及進行性疾病(progressive disease,PD)被定義為在腫瘤大小上≧25%增加或新病灶的出現。
MRI掃描顯示在所有狗中，腫瘤生長已被停滯以及在一個案中，BCD-2，在僅僅5用劑的EGFR微細胞Dox之後沒有大腫瘤團塊的跡象(圖5)。
實施例6. 雖然以 EGFR 微細胞 Dox 重複用劑，對於帶有腦癌的狗沒有毒性
毒性是針對胃腸道的功能異常的症狀[厭食(anorexia)、腹瀉(diarrhoea)、嘔吐(vomiting)以及腸炎(enteritis)]以及體質性症狀[精神萎靡/疲勞(lethargy/fatigue)]藉由顧客調查表而被評估。血液以及生化毒性是在各個治療之前在一為每週的基礎上被測定。毒性是在狗以及貓v1.0(dogs and cats v1.0)中的化學治療或生物抗-腫瘤治療之後依據獸醫合作腫瘤學組織-常見不良事件評價標準(Veterinary Co-operative Oncology Group-common terminology criteria for adverse events)(VCOG-CTCAE)而被分級。
體重在整個治療的期間維持不變。體溫在用劑之後的第一小時內從38.5℃增加至39℃以及在第4小時之時回復正常。
來自於狗的血清是在用劑以EGFR微細胞Dox之前以及用劑之後的第4小時之時被收集(5mL)。血清生化以及血液圖譜(圖6以及7)的評估是由IDEXX實驗室(雪梨，澳洲)而 被執行。有關狗的參考範圍是由IDEXX實驗室而被提供。
血清生化參數維持在正常參考範圍內(圖6)。在初始臨床分期之時，所有的狗在肝酵素丙胺酸轉胺酶(alanine aminotransferase)(ALT)以及鹼性磷酸酶(alkaline phosphatase)(ALP)上顯示顯著的提升，可能因為所有的狗針對難以控制的癲癇接受使用呈範圍落在0.5至2mg/kg內的劑量的糖皮質素(glucocorticoid)[去氫皮質醇(prednisolone)]一天一次以及苯巴比妥(phenobarbitone)(1mg一天2次)的傳統治療。肝超音波(Liver ultrasound)是針對所有的狗而例行性地被執行以及未顯示任何肝腫瘤的徵兆。整個研究中，肝維持正常，這表示儘管EGFR微細胞Dox的重複用劑，在肝中沒有不良事件。
有關所有的狗的血液學指標在整個研究中維持在正常範圍內(圖7)。
實施例7. 在以 EGFR 微細胞 Dox 重複用劑之後在腦癌狗中的細胞激素以及抗體反應
狗的血清是依據製造商的操作指南在確認各個ELISA之後利用由R&D系統(R&D Systems)(USA)所供應的ELISA雙套套組(ELISA duoset kits)針對狗的發炎性細胞激素TNFα、IL-6以及抗-發炎性細胞激素IL-10而被分析。高結合微井盤(High binding Microwell plates)(Greiner)是利用TMB受質(Sigma)而被開發以及在一Biotek uQuant盤讀取儀中在450nm下被讀取。
發炎性細胞激素TNFα反應隨著各個狗改變以及 沒有顯示一致的態樣。儘管重複用劑，3隻狗(BCD-2、-4以及-6)在TNFα上沒有顯示提升(圖8)。BCD-5以及BCD-7在TNFα上亦沒有顯示提升直到用劑分別為9以及10然而隨後的3以及7用劑分別顯示一顯著的升高但沒有臨床不良症狀。BCD-1在臨床分期之時具有提升的TNFα以及隨後的97用劑的EGFR微細胞Dox在TNFα上沒有顯示進一步提升。
當在用劑後的第4小時之時，發炎性細胞激素IL-6顯示一趨勢(圖8)，在IL-6上有一小的尖峰(spike)，其在第24小時之時回復至正常。隨後的用劑不致使一IL-6尖峰的增加以及趨勢在各個用劑後維持相同。一例外是BCD-4，其之IL-6在整個研究中維持正常(39用劑歷時288天)。
有趣地，當在TNFα以及IL-6上有尖峰時，抗-發炎性細胞激素IL-10被提升(圖8)。已確認的是單核球(monocyte)以及巨噬細胞(macrophage)在以各種不同的調節劑(諸如細菌的LPS)活化之後分泌IL-10(Sabat et al.,2010)。
從鼠傷寒沙門桿菌(Sigma)中所純化出的LPS在包覆緩衝液(10mM碳酸鈉，pH 9.6)中被塗盤於井(250ng/井)中以及在4℃下被培育過夜。盤是使用含有1% BSA(配於PBS中)的封阻緩衝液在37℃下被封阻歷時1小時。連續稀釋的血清樣品被添加至各個盤以及在4℃下被培育過夜。在洗滌之後，被結合的抗體是使用山羊抗-狗的IgG辣根過氧化酶(HRP)綴合物(RDI)而被偵測。
抗體效價被定義為給予一為一半-最大光學密度 (450nm)讀值的倒數血清稀釋。KC Junior軟體(KC Junior Software)被用來對各個血清樣品配適一個2參數曲線。所有樣品以二重複被分析以及數據表示平均值的標準誤差(standard errors of the mean)。
O-多醣血清抗體效價(圖9)顯示一藉由劑量3(歷時3週)在IgG效價上一為20-倍增加的典型反應以及在針對各個狗的整個研究的期間達到一不具有進一步提升的水平頂(plateau)。這是不令人驚訝的因為LPS的O-多醣組分被知曉為一T-細胞獨立的第1型抗原(T-cell independent type 1 antigen)以及這些抗原主要藉由刺激細胞分裂受體[例如類鐸受體(Toll-like receptors)(TLRs)]而活化B細胞。
實施例8. 被投藥的 EGFR 微細胞 Dox 的重複用劑的數目以及帶有晚期腦癌的狗的存活
有趣地，BCD-1至BCD-7狗分別存活822、709、471、288、408、140以及101天並且分別接受97、43、44、39、32、20以及13用劑的EGFR微細胞Dox(圖10)。BCD-2、-3以及-5持續存活並且BCD-2已沒有接受用劑而沒有腫瘤的復發歷時超過300天。BCD-4存活288天並且屬於穩定的疾病但死於一腎感染。事後分析(Post mortem analysis)顯示：死亡是與腦腫瘤不相關的。令人驚訝地，儘管非常多的劑量的EGFR微細胞Dox被全身性地投藥，沒有不良事件的臨床症狀。
實施例9. 在帶有晚期腦癌的2隻狗的腦中的 EGFR 微細胞的活體內造影(in-vivo imaging)
由於粒子的非常小的尺寸，每粒子具有攜帶足夠螢光分子而能夠顯像的能力，以及在任何特定的器官的活體內所達到的濃度，在活體內的奈米粒子生物分佈(nanoparticle biodistribution)已被限制，特別在一大型動物物種中。此外，當前的理解為：由於BBB的存在，大於12nm的奈米粒子不會進入腦腫瘤。然而，在所有7隻狗中所觀察到的顯著的抗-腫瘤效力促使申請人測定EGFR微細胞Dox是否確實以某種方式進入至腦腫瘤中，儘管其等具有令人生畏的~400nm的大尺寸。
EGFR微細胞被放射性標記以123碘以及1×1010微細胞是在BCD-3以及BCD-5中被i.v.投藥。狗被鎮靜以及利用單光子電腦斷層攝影(Single-photon emission computed tomography)(SPECT)而被顯影。這兩隻狗皆亦優先具有MRI掃描來清楚地顯示腫瘤大小以及位置。
動物被注射以大約40MBq的經放射性標記的[123I]-EGFR微細胞並且在歷時接續的4小時之不同時間點之時被顯影。所有影像是在一被配適有低能量[全功能平行式孔準直儀(all purpose parallel hole collimators)]的Picker 3000XP三重-偵測器(Picker 3000XP triple-detector)SPECT(單光子電腦斷層攝影)的伽瑪攝影機上被執行。所有獲取使用一為159keV±10%的光峰窗設定(photopeak window setting)。動物在造影之前被給予一些輕微麻醉(light anaesthesia)。一隻狗(BCD-3)以一仰臥的姿勢在注射後第30分鐘以及第3小時之時被非-斷層射影地造影俾以研究生物 分佈。覆蓋頭以及軀幹的多重平面影像是在這2個時間點以及連接的獲取後被收集於一為256×256基質中每床位置歷時2分鐘來給予全身2D掃描。所有的斷層射影(SPECT)影像被獲取於128×128基質中，利用3°放射增量的120投影(總計360°)每投影歷時20秒。所有數據被轉移至一離線的核子醫學工作站(off-line nuclear medicine workstation)(HERMES,Nuclear Diagnostic,Stockholm,Sweden)以及利用一疊代重建演算法(iterative reconstruction algorithm)(OSEM，8子集，4疊代)而被重建。影像是使用一個zoom軟體2.0而被重建來給予測量1.78×1.78×2.56mm(X×Y×Z)的三維像素。影像重建後是使用一階數(order)為10以及截止值(cut-off)為1.25循環.像素-1的Butterworth濾波器(Butterworth filter)而被過濾。預先在狗上所獲取的MRI掃描被輸入至工作站中以及解剖(MRI)與功能(SPECT)掃描被登錄於軟體中。
全身掃描(圖11ci以及ii)顯示從最早的時間點(注射後第30分鐘)的肝中經標記的[123I]-EGFR微細胞的強烈攝取。此事實，附加缺少甲狀腺的早期顯像，表示微細胞的良好標記。排出至腸中在較晚期影像中是可見的，有如某些在頸中的兩側腺的攝取以及一(假定的)游離[123I]-碘存在的小量的甲狀腺攝取。
腦的SPECT影像(圖11ai-iii以及11biii；SPECT)顯示對應於在MRI掃描(圖11ai-iii以及11bi；MRI)上所看見的腦腫瘤的面積下的一放射性的焦點。T1對比後對位的MRI以及SPECT的重疊的影像(圖11ai-iii以及11biii； SPECT/MRI)顯示經聚焦的放射性被定位在各個狗的腫瘤的核心中。
這些實例證明在帶有晚期腦腫瘤的個案中100%的抗-腫瘤效力，一隨著本揭露內容所達成的空前的結果。其亦是一非常令人驚訝的結果，被給予下列考量。
1.大小相似於多柔比星(579.98道耳頓)的藥物[諸如太平洋紫杉醇(853.9道耳頓)以及長春鹼(810.9道耳頓)]從此之後將不會被考慮用於全身性(i.v.)輸送以及治療腦腫瘤。有如上面所討論的，假如大約400道耳頓的一致性截止值，其等絲毫不被預期可越過BBB。
2.數十年的研究已產生替莫唑胺作為用於治療腦癌的唯一FDA-認可的藥物；這是因為其是具有一分子量為194.15道耳頓的唯一藥物，那是低於用於越過BBB的被理解的400-道耳頓截止值。
3.即使其已被認為用於治療腦腫瘤，多柔比星在傳統化學治療中在一一般病患(60kg)中通常在一為100mg至125mg的劑量下被投藥。這等同於每i.v.劑量100,000μg至125,000μg，被認為一最小量去達到在治療某些癌症上的治療效力。根據本揭露內容，相較之下，在1×1010 EGFR微細胞Dox中所攜帶的多柔比星劑量是大約4μg，其是低於用於傳統dox化學治療所投藥的25,000-倍至31,250-倍的劑量。這背離於傳統的實務，根據本揭露內容，將會結合癌症治療的現行理解來勸阻臨床家不要考慮在任何內文中此一低藥物劑量的可能性，更不用說在本文中的腦癌。
4.根據本揭露內容的微細胞輸送載劑的用途與上面所討論的一致性大小限制(其依次地藉由在腦腫瘤中的BBB破壞的一傳統的觀點而被告知)矛盾。然而，本揭露內容所獲得的數據顯示：完整的、細菌衍生的微細胞在顯著的濃度下快速地進入至腦腫瘤中，例如，這能夠使經放射性標記的微細胞在腦腫瘤微環境中的造影。結果亦證明在每一位被治療的個體中之高度顯著的腫瘤穩定化/退化，關於一先前僅由極差的結果所代表的臨床腫瘤學的領域的一前所未見的成就，其與本揭露內容一致強調一有效治療典範。
實施例10. 將各種不同的小分子藥物包裝至微細胞中
此實例說明將許多不同的小分子藥物裝填至微細胞中以及所形成的小分子藥物-包裝的含有微細胞的組成物的顯著抗-腫瘤效力這兩者的可行性。所涉及的小分子藥物為：A.多柔比星；B.太平洋紫杉醇；C.氟-太平洋紫杉醇；D.順氯氨鉑；E.長春鹼；F.Monsatrol；G.胸苷酸合成酶(TS)抑制劑OSI-7904；H.伊立替康；I.5-氟尿嘧啶；J.吉西他賓；以及K.卡鉑。
包裝多柔比星、長春鹼以及太平洋紫杉醇。將多柔比星、螢光長春鹼以及氟-太平洋紫杉醇包裝至完整的微細胞中的有效性已在本案發明人的發表：MacDiarmid et al., Cancer Cell 11：431-45(2007)中被證明。MacDiarmid et al.Cancer Cell (2007)的圖1E，帶有不同螢光顏色俾以顯示微細胞分別被包裝以大量的多柔比星(DOX)、長春鹼(VIN)以及太平洋紫杉醇(PAC)。
一旦被包裝，多柔比星、氟-太平洋紫杉醇以及 順氯氨鉑不會滲漏至微細胞外。MacDiarmid et al.Cancer Cell (2007)進一步使用動力學來證明：不僅是藥物(多柔比星、氟-太平洋紫杉醇以及順氯氨鉑)充分地被裝填至完整的微細胞中，這些藥物一旦被包裝不會滲漏至完整的微細胞外(參見文獻中的圖2A)。
多柔比星以及太平洋紫杉醇包裝的微細胞在治療乳癌異種移植物(breast cancer xenograft)上是有效的。此外，在MacDiarmid et al.Cancer Cell (2007)的圖4A中所呈現的數據顯示人類乳癌異種移植物是使用多柔比星-或太平洋紫杉醇-包裝的微細胞而有效地被治療。
monastrol-包裝的微細胞的抗-腫瘤效用。由本案發明人所發表的另一篇文獻：MacDiarmid et al.,Cell Cycle 17：1-7(2007)，呈現數據來證明monastrol-包裝的微細胞在抑制含有人類乳癌異種移植物的小鼠中的腫瘤生長上的有效性(參見文獻中的圖1A)。
有如在圖1A中所顯示的，monastrol有效地被包裝至完整的微細胞中以及人類乳癌異種移植物是使用monastrol-包裝的微細胞而有效地被治療。
被包裝以胸苷酸合成酶抑制劑OSI-7904(thymidilate synthase inhibitor OSI-7904)的微細胞的抗-腫瘤效用。同樣地，人類結腸癌異種移植物是使用藥物-裝填的微細胞而有效地被治療。MacDiarmid et al.(2007)的圖1B顯示OSI-7904-裝填的微細胞在一低於OSI-7904L的微脂體配方~385-倍，低於微脂體配方OSI-7904L的劑量下是更 有效的。微細胞輸送載體因而顯著地增加OSI-7904的治療指數(therapeutic index)。
伊立替康-抗性人類結腸癌異種移植物的有效治療。伊立替康亦已被包裝至完整的微細胞中。進一步地，在使用shRNA-MDR1-包裝的微細胞繼而伊立替康-標靶的微細胞的雙重系列治療(dual sequential treatment)之後，伊立替康-抗性人類結腸癌異種移植物的有效治療是在MacDiarmid et al.,Nature Biotechnology 27：643-51(2009)(另一篇由本案發明人的發表)中的圖5A以及5A中被證明。
5-氟尿嘧啶-抗性人類結腸癌異種移植物的有效治療。如同伊立替康，5-氟尿嘧啶亦被包裝至完整的微細胞中以及5-氟尿嘧啶-抗性人類結腸癌異種移植物的有效治療是在使用shRNA-MDR1-包裝的微細胞繼而5-氟尿嘧啶-標靶的微細胞的雙重系列治療之後被達成。參見MacDiarmid et al.,(2009)的補充圖4A以及4B。
使用吉西他賓(Gemzar ® )-包裝的微細胞的人類胰腺癌異種移植物的有效治療。圖12證明人類胰腺癌異種移植物是使用吉西他賓(Gemzar®)-包裝的微細胞而有效地被治療。
在Balb/c nu/nu小鼠中的人類胰腺癌(MIA PaCa)被i.v.投藥以游離的Gemzar或EGFR-標靶的、Gemzar-包裝的微細胞(EGFR微細胞Gemzar)任一者。圖12顯示儘管微細胞劑量僅攜帶~50ng的Gemzar，EGFR微細胞Gemzar治療的抗-腫瘤 效力在抗-腫瘤效力上是正好如同在一為每劑量400,000ng的劑量下被給予的游離的Gemzar一樣有效。
卡鉑用於治療人類乳癌異種移植物。卡鉑-包裝的微細胞用於治療人類乳癌異種移植物的效用是在圖13中被證明。
在Balb/c nu/nu小鼠中的人類乳癌(MDA-MB-468)被i.v.投藥以游離的卡鉑或被包裝以卡鉑的非-標靶的微細胞或EGFR-標靶的、卡鉑-包裝的微細胞(EGFR微細胞卡鉑)任一者。圖13中的結果顯示EGFR微細胞卡鉑治療在達成腫瘤穩定化上是高度有效的，即使卡鉑的劑量是低於游離的卡鉑劑量~1,000-倍。
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Claims (31)

  1. 一種一治療有效量的一組成物於製造一藥劑的用途，該藥劑係用於治療在一個體中的一腦腫瘤，其中該組成物包含有複數個完整的、細菌衍生的微細胞(minicell)，其中：(A)該複數個微細胞中的每一者(i)包含專一性辨認一腫瘤細胞抗原的一抗體，以及(ii)含有一抗-腫瘤試劑；以及(B)該腦腫瘤具有數個在其壁中有窗(fenestration)的血管，該等微細胞可被動地溢出該窗。
  2. 如申請專利範圍第1項的用途，其中該抗-腫瘤試劑是一放射核種。
  3. 如申請專利範圍第2項的用途，其中該放射核種係選自於釔-90、鎝-99m、碘-123、碘-131、銣-82、鉈-201、鎵-67、氟-18、氙-133，或者銦-111。
  4. 如申請專利範圍第2項的用途，其中該放射核種係附著於在該微細胞表面上的一蛋白質或一碳水化合物。
  5. 如申請專利範圍第4項的用途，其中該放射核種係附著與該微細胞表面相結合的一雙專一性抗體。
  6. 如申請專利範圍第2-5項中任一項的用途，其中該組成物含有約30Gy至約100Gy的放射性。
  7. 如申請專利範圍第1項的用途，其中該抗-腫瘤試劑是一化學治療藥物。
  8. 如申請專利範圍第7項的用途，其中該化學治療藥物具有大於約400道耳頓的分子量。
  9. 如申請專利範圍第7或8項的用途，其中該化學治療藥物具有一低於用於一經標靶的癌症的該化學治療藥物之ED50的LD50。
  10. 如申請專利範圍第7或8項的用途，其中該組成物含有至多約1mg的該化學治療藥物。
  11. 如申請專利範圍第1項的用途，其中該抗-腫瘤試劑是一功能性核酸或編碼一功能性核酸的一聚核苷酸。
  12. 如申請專利範圍第11項的用途，其中該功能性核酸抑制一促進腫瘤細胞增生、血管生成或對化學治療有抗性的基因，及/或一抑制細胞凋亡或細胞週期停滯的基因。
  13. 如申請專利範圍第11項的用途，其中該功能性核酸係選自於siRNA、miRNA、shRNA、lincRNA、反訊息RNA(antisense RNA)及核糖酵素。
  14. 如申請專利範圍第1項的用途，其中該抗-腫瘤試劑是編碼一促進細胞凋亡之基因的一聚核苷酸。
  15. 如申請專利範圍第1項的用途，其中該複數個微細胞當中的每一者包含對於一非-吞噬哺乳動物細胞表面受體具有專一性的一配位子。
  16. 如申請專利範圍第15項的用途，其中該受體係一腫瘤細胞抗原。
  17. 如申請專利範圍第1項的用途，其中該複數個微細胞包括至少約108個微細胞。
  18. 如申請專利範圍第17項的用途，其中該複數個微細胞包括至少約1010個微細胞。
  19. 如申請專利範圍第1或18項的用途，其中該組成物含有小於大約10EU游離內毒素。
  20. 如申請專利範圍第1項的用途，其中該組成物每108微細胞含有至多1親代細菌細胞。
  21. 如申請專利範圍第1項的用途，其中該腦腫瘤是選自於下列所構成的群組：神經膠質母細胞瘤、星形細胞瘤、寡樹突神經膠細胞瘤、室管膜瘤、顱咽管瘤、腦下垂體瘤、腦的原發性淋巴瘤、松果腺瘤、腦的原發性生殖細胞瘤，以及其等之組合。
  22. 如申請專利範圍第21項的用途，其中該腦腫瘤是轉移性腦腫瘤。
  23. 如申請專利範圍第1項的用途，其中該腦腫瘤是神經膠質母細胞瘤(glioblastoma)。
  24. 如申請專利範圍第23項的用途，其中該腫瘤是階段II、III或IV級的腫瘤。
  25. 如申請專利範圍第23項的用途，其中該腫瘤是階段III或IV級的腫瘤。
  26. 如申請專利範圍第23項的用途，其中在該腫瘤中已開始血管生成(angiogenesis)。
  27. 如申請專利範圍第23項的用途，其中在該腫瘤中已開始血管形成(vascularization)。
  28. 如申請專利範圍第1項的用途，其中該腫瘤是階段II、III或IV級的腫瘤。
  29. 如申請專利範圍第1項的用途，其中該腫瘤是階段III或IV級的腫瘤。
  30. 如申請專利範圍第1項的用途，其中在該腫瘤中已開始血管生成(angiogenesis)。
  31. 如申請專利範圍第1項的用途，其中在該腫瘤中已開始血管形成(vascularization)。
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