TWI594982B - 低細胞毒性血管阻斷劑 - Google Patents

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TWI594982B
TWI594982B TW104126409A TW104126409A TWI594982B TW I594982 B TWI594982 B TW I594982B TW 104126409 A TW104126409 A TW 104126409A TW 104126409 A TW104126409 A TW 104126409A TW I594982 B TWI594982 B TW I594982B
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Description

低細胞毒性血管阻斷劑
本發明係關於一種化學化合物作為血管阻斷劑於治療的用途。
功能性血管網絡，它提供了必要的營養和氧氣，以維持整個身體的平衡，扮演對所有組織的發展、生長、存活、擴建和修復至關重要的角色。此外，脈管系統(vasculature)的異常的組成、分布和組合也被發現與幾種疾病，如癌症、代謝性疾病和免疫疾病等相關聯。因此，靶向脈管系統代表了一個可用於經由分子和生物醫學技術和治療藥物開發的一些臨床應用的新疆界。
脈管靶向劑可分為血管靶向劑(VTA)(例如，抗血管生成劑)和血管阻斷劑(VDA)(Dumontet和Jordan，2010；Hollebecque等人，2012；Lorusso等人，2011)。還有一些目前明確定義在腫瘤科有用的VTA和VDA，以抗有絲分裂劑為代表，如紫杉烷(例如，紫杉醇和多西紫杉醇)和Combretastatin A4(CA4)。然而，這些目前正在開發的藥物表現出狹窄的療效區間，需處理高毒性、複雜的結構和合成、耐藥性、純化方法和臨床治療副作用的問題。例如，秋水仙素，強效類的癌症治療藥物之一，由 於高毒性和隨之發生的極窄治療指數，並未表現出作為臨床適用抗癌治療劑的實質價值。因此，具有較寬療效區間的有益和有用新化合物的發現能改善上述問題。
在本發明的一方面，係關於用於阻斷血流的式(I)化合物、其多晶型、互變異構物、鏡像異構物、立體異構物、溶劑化物或醫藥上可接受的鹽：
其中每個R1-R6獨立為R、硝基、亞硝基、氰基、疊氮化物、異硫代硝基、OR、OC(O)R、OC(O)OR、OC(O)NRR'、SO2R、SO3R、SO2NRR'、SR、NRR'、NRSO2NR'R"、NRSO2R'、NRSO3R'、NRC(O)R'、NRC(O)NR'R"、NRC(O)OR'、NRC(N)NR'R"、C(O)R、C(O)OR、C(O)NRR'；並且其中每個R、R'和R"獨立為氫、鹵素、烷基、烯基、炔基、環烷基、雜環烷基、環烯基、雜環烯基、芳基、雜芳基、環基或雜環基。
如上述化合物，其中每個R1-R6獨立為氫、鹵素、烷基、烯基、炔基、環烷基、雜環烷基、環烯基、雜環烯基、芳基、雜芳基、環 基或雜環基。
一或多個上述化合物，其中R為氫、鹵素或甲基。
一或多個上述化合物，其中R1-R6獨立為為氫或鹵素。
上述的一個或多個化合物，其中所述化合物阻斷至非癌組織細胞的血流。受益於阻斷血流至非癌組織細胞的病症或疾病可以包括動脈瘤、動靜脈畸形、靜脈畸形、淋巴管畸形、血管瘤、局部缺血性視網膜病、糖尿病視網膜病、脈絡膜新血管形成、濕性老年黃斑部病變和其他相關的病症。
上述的一個或多個化合物，其中所述化合物阻斷至癌組織細胞的血流。受益於阻斷血流至癌組織細胞的病症或疾病可以包括骨癌、腦和中樞神經系統腫瘤、乳癌、結腸直腸癌、內分泌癌、胃腸癌、生殖泌尿癌、婦癌、頭頸癌、白血病、肺癌、淋巴瘤、眼癌、皮膚癌，軟組織肉瘤、泌尿系統癌及其它類型或相關的病症。
在本發明的另一方面，其係關於用於阻斷血流的醫藥組合物，包括治療有效量的上述任一化合物及醫藥可接受載體。
上述藥物組合物，其中治療有效量的上述任一化合物介於5毫克/公斤和50毫克/公斤間。
在本發明的另一方面，其係關於上述任一化合物或上述藥物組合物於製造阻斷血流的藥物的用途。
在本發明的另一方面，其係關於阻斷血流的方法，包括以上述任一化合物或上述藥物組合物接觸細胞。
在本發明的另一方面，其係關於抑制α-微管蛋白聚合的式(I) 化合物、其多晶型、互變異構物、鏡像異構物、立體異構物、溶劑化物或醫藥上可接受的鹽：
其中每個R1-R6獨立為R、硝基、亞硝基、氰基、疊氮化物、異硫代硝基、OR、OC(O)R、OC(O)OR、OC(O)NRR'、SO2R、SO3R、SO2NRR'、SR、NRR'、NRSO2NR'R"、NRSO2R'、NRSO3R'、NRC(O)R'、NRC(O)NR'R"、NRC(O)OR'、NRC(N)NR'R"、C(O)R、C(O)OR、C(O)NRR'；並且其中每個R、R'和R"獨立為氫、烷基、烯基、炔基、環烷基、雜環烷基、環烯基、雜環烯基、芳基、雜芳基、環基或雜環基。
在本發明的另一方面，其係關於用於抑制α-微小管蛋白聚合的醫藥組合物，包括治療有效量的上述任一化合物及醫藥可接受載體。
在本發明的另一方面，其係關於上述任一化合物或上述藥物組合物於製造抑制α-微小管蛋白聚合的藥物的用途。
在本發明的另一方面，其係關於抑制α-微管蛋白聚合的方法，包括以上述任一化合物或上述藥物組合物接觸細胞。
在本發明的另一方面，其係關於抑制類毛細管狀管形成的式(I)化合物、其多晶型、互變異構物、鏡像異構物、立體異構物、溶劑化物 或醫藥上可接受的鹽：
其中每個R1-R6獨立為R、硝基、亞硝基、氰基、疊氮化物、異硫代硝基、OR、OC(O)R、OC(O)OR、OC(O)NRR'、SO2R、SO3R、SO2NRR'、SR、NRR'、NRSO2NR'R"、NRSO2R'、NRSO3R'、NRC(O)R'、NRC(O)NR'R"、NRC(O)OR'、NRC(N)NR'R"、C(O)R、C(O)OR、C(O)NRR'；並且其中每個R、R'和R"獨立為氫、烷基、烯基、炔基、環烷基、雜環烷基、環烯基、雜環烯基、芳基、雜芳基、環基或雜環基。
在本發明的另一方面，其係關於用於抑制類毛細血管形成的醫藥組合物，包括治療有效量的上述任一化合物及醫藥可接受載體。
在本發明的另一方面，其係關於上述任一化合物或上述藥物組合物於製造抑制類毛細血管形成的藥物的用途。
在本發明的另一方面，其係關於抑制類毛細管狀管形成的方法，包括以上述任一化合物或上述藥物組合物接觸細胞。
在本發明的另一方面，其係關於治療腫瘤或癌症的式(I)化合物、其多晶型、互變異構物、鏡像異構物、立體異構物、溶劑化物或醫藥上可接受的鹽，其中腫瘤或癌症是骨癌、腦和中樞神經系統腫瘤、乳癌、 結腸直腸癌、內分泌癌、胃腸癌、生殖泌尿癌、婦癌、頭頸癌、白血病、肺癌、淋巴瘤、眼癌、皮膚癌，軟組織肉瘤、泌尿系統癌及其它類型或相關的病症：
其中每個R1-R6獨立為R、硝基、亞硝基、氰基、疊氮化物、異硫代硝基、OR、OC(O)R、OC(O)OR、OC(O)NRR'、SO2R、SO3R、SO2NRR'、SR、NRR'、NRSO2NR'R"、NRSO2R'、NRSO3R'、NRC(O)R'、NRC(O)NR'R"、NRC(O)OR'、NRC(N)NR'R"、C(O)R、C(O)OR、C(O)NRR'；並且其中每個R、R'和R"獨立為氫、烷基、烯基、炔基、環烷基、雜環烷基、環烯基、雜環烯基、芳基、雜芳基、環基或雜環基。
在本發明的另一方面，其係關於用於治療腫瘤或癌症的醫藥組合物，包括治療有效量的上述任一化合物及醫藥可接受載體。
如上述組合物，其中腫瘤或癌症是胃腸癌。
如上述組合物，其中腫瘤或癌症是結腸直腸癌。
在本發明的另一方面，其係關於上述任一化合物或上述藥物組合物於製造治療腫瘤或癌症的藥物的用途，其中腫瘤或癌症是骨癌、腦和中樞神經系統腫瘤、乳癌、結腸直腸癌、內分泌癌、胃腸癌、生殖泌尿 癌、婦癌、頭頸癌、白血病、肺癌、淋巴瘤、眼癌、皮膚癌，軟組織肉瘤、泌尿系統癌及其它類型或相關的病症。
在本發明的另一方面，其係關於治療腫瘤或癌症的方法，其中腫瘤或癌症是骨癌、腦和中樞神經系統腫瘤、乳癌、結腸直腸癌、內分泌癌、胃腸癌、生殖泌尿癌、婦癌、頭頸癌、白血病、肺癌、淋巴瘤、眼癌、皮膚癌，軟組織肉瘤、泌尿系統癌及其它類型或相關的病症，包括以上述任一化合物或上述醫藥組合物接觸細胞。
在下文中，將參照附圖描述本發明的一些較佳態樣。
圖1a和圖1b顯示SB01、SB01-M2、紫杉醇和CA4對五個癌細胞株增殖的效果；圖2顯示SB01、SB01-M2、紫杉醇和CA4對AGS細胞和HUVEC細胞增殖的效果；圖3a-3d顯示SB01、SB01-M2、紫杉醇和CA4對AGS和HUVEC細胞的細胞週期分布的效果；圖4顯示SB01、SB01-M2、紫杉醇和CA4對AGS和HUVEC細胞的細胞週期分布的另一效果；圖5顯示SB01、SB01-M2、紫杉醇和CA4對AGS和HUVEC細胞中α-微小管蛋白的蛋白質含量的效果；圖6a-6d顯示SB01、SB01-M2、紫杉醇和CA4對AGS和HUVEC細胞中α-微小管蛋白的分布和結合的效果；圖7a-7d顯示SB01、SB01-M2、紫杉醇和CA4對AGS和HUVEC細胞中α- 微小管蛋白的分布和結合的另一效果；圖8a和8b顯示SB01、SB01-M2、紫杉醇和CA4對AGS和HUVEC細胞的細胞形態的效果；圖9顯示SB01、SB01-M2、紫杉醇和CA4對HUVEC細胞的類毛細管狀管形成的另一效果；圖10a和10b顯示SB01、SB01-M2、紫杉醇和CA4對HUVEC細胞的類毛細管狀管形成的另一效果；圖11顯示SB01、SB01-M2、紫杉醇和CA4對COLO 250細胞和HUVEC細胞增殖的效果；圖12a和12b顯示SB01和SB01-M2對在體內腫瘤細胞的細胞凋亡效果；圖13a和13b顯示SB01和SB01-M2對腫瘤中小血管的效果；圖14顯示出SB01、SB01-M1和SB01-M2對血管內皮細胞的增殖效果；圖15顯示SB01、SB01-M1和SB01-M2對腫瘤血管破壞的效果；和圖16顯示SB01、SB01-M1和SB01-M2對在體內腫瘤細胞的細胞凋亡效果。
本發明是基於一種VDA藥物及其代謝物和試驗的出乎意料發現的進一步研究。為更清楚理解本發明，提供下列定義：
此處提及的「烷基、烯基、炔基、芳基、雜芳基、環基和雜環基」包括經取代和未經取代部分。「經取代」這個術語是指一個或多個取代基(其可以相同或不同)，每個取代一個氫原子。取代基的實例包括，但不限於，鹵素、氰基、硝基、羥基、胺基，氫硫基、烷基、烯基、炔基、 芳基、雜芳基、環基、雜環基、烷氧基、芳氧基、烷基硫烷基、芳硫基、烷胺基、芳胺基、二烷胺基、二芳胺基，烷羰基、芳羰基、雜芳羰基、烷羧基、芳羧基、雜芳羧基、烷氧羰基、芳氧羰基、雜芳氧羰基、烷脲基、芳脲基、雜脲基、芳胺甲醯基、芳胺甲醯基、雜胺甲醯基，其中每個烷基(包括烷)、烯基、芳基、雜芳基、環基和雜環基視情況被鹵素、氰基、硝基、羥基、胺基、氫硫基、烷基、芳基、雜芳基、烷氧基、芳氧基，烷羰基、芳羰基、烷羧基、芳羧基、烷氧羰基或芳氧羰基。
如本文所使用的，術語「烷基」是指含有1至6個碳原子的直鏈或支鏈烷基。烷基的實例包括甲基、乙基，正丙基、異丙基、三級丁基、和正戊基。類似地，術語「烯基」或「炔基」是指含有2至6個碳原子的直鏈或支鏈烯基或炔基基團。術語「烷氧基」指的是指-O-烷基基團。
術語「芳基」是指烴環體系(單環或雙環)具有至少一個芳環。芳基基團的實例包括，但不限於，苯基、萘基和芘基。
術語「雜芳基」是指一個烴環體系(單環或雙環狀)具有至少一個芳香環，該芳香環包括至少一個雜原子如氧、氮或硫作為環體系的一部分，而至其餘的是碳。雜芳基基團的實例包括，但不限於，呋喃基、吡咯基、噻吩基、噁唑基、咪唑基、噻唑基、吡啶基、嘧啶基、喹唑啉基，和吲哚基。
術語「環基」和「雜環基」是指有4至14個環原子的部分或完全飽和單環或雙環狀環體系。雜環基環包含一個或多個雜原子(例如，氧、氮或硫)作為環體系的一部分，其餘部分為碳。例示性環基和雜環基環是環己烷、哌啶、哌嗪、嗎啉、硫代嗎啉、和1,4-氧氮雜環庚烷。
如本文所使用的術語「鹵素」是指氟、氯、溴、和碘。
如本文所使用的術語「可藥用鹽」指保留母化合物的所需生物活性並且不賦予不需要毒性作用的鹽。這些鹽的例子是：(a)與無機酸，例如鹽酸、氫溴酸、硫酸、磷酸、硝酸和類似物所形成的酸加成鹽；以及與有機酸，例如乙酸、草酸、酒石酸、琥珀酸、馬來酸、富馬酸、葡糖酸、檸檬酸、蘋果酸、抗壞血酸、苯甲酸、單寧酸、棕櫚酸、藻酸，聚谷氨酸、萘磺酸、甲磺酸、對甲苯磺酸、萘二磺酸、聚半乳糖醛酸及類似物所形成的鹽；(b)由元素離子如氯、溴、和碘所形成的鹽，和(c)從鹼衍生的鹽，諸如銨鹽、鹼金屬鹽，如鈉和鉀鹽、鹼土金屬鹽諸如鈣鹽和鎂鹽，以及與有機鹼如二環己基胺和N-甲基-D-葡萄糖胺所形成的鹽。
如本文所使用的，術語「治療有效量」的化合物的或藥物組合物是指其量足以提供在蒙受增殖疾病，諸如癌症的動物，較佳為人，期望的治療效果。例如，期望的治療效果可包括，但不限於，腫瘤生長(例如腫瘤生長延遲)，腫瘤大小，或轉移的調節、與特定相關的毒性和副作用的減少，腫瘤壞死或缺氧的增加、腫瘤血管生成的減少、腫瘤再生長的減少，CEP和其它促血管發生細胞腫瘤滯留的降低、臨床損傷或癌症症狀的改善或最小化、延長受試者的存活時間超過不進行該治療所被預期的存活時間，和在投藥前對無任何腫瘤形成的動物的腫瘤生長預防，即，預防性投藥。
I. 化合物
可描述本發明化合物為下式(I)，或其多晶型、互變異構物、鏡像異構物、立體異構物、溶劑化物或醫藥上可接受的鹽
其中每個R1-R6獨立為R、硝基、亞硝基、氰基、疊氮化物、異硫代硝基、OR、OC(O)R、OC(O)OR、OC(O)NRR'、SO2R、SO3R、SO2NRR'、SR、NRR'、NRSO2NR'R"、NRSO2R'、NRSO3R'、NRC(O)R'、NRC(O)NR'R"、NRC(O)OR'、NRC(N)NR'R"、C(O)R、C(O)OR、C(O)NRR'；並且其中每個R、R'和R"獨立為氫、鹵素、烷基、烯基、炔基、環烷基、雜環烷基、環烯基、雜環烯基、芳基、雜芳基、環基或雜環基。
為了說明而無任何限制，本發明的代表性的化合物具有式(II)如下：
其中每個R1-R6獨立為R、硝基、亞硝基、氰基、疊氮化 物、異硫代硝基、OR、OC(O)R、OC(O)OR、OC(O)NRR'、SO2R、SO3R、SO2NRR'、SR、NRR'、NRSO2NR'R"、NRSO2R'、NRSO3R'、NRC(O)R'、NRC(O)NR'R"、NRC(O)OR'、NRC(N)NR'R"、C(O)R、C(O)OR、C(O)NRR'；並且其中每個R、R'和R"獨立為氫、鹵素、烷基、烯基、炔基、環烷基、雜環烷基、環烯基、雜環烯基、芳基、雜芳基、環基或雜環基；當R1-R6為氫，例如(6-甲氧基-1H-吲哚-3-基)-(3,4,5-三甲氧基-苯基)-甲酮("SB01")。
另一代表化合物如以下式(III)
其中每個R1-R6獨立為R、硝基、亞硝基、氰基、疊氮化物、異硫代硝基、OR、OC(O)R、OC(O)OR、OC(O)NRR'、SO2R、SO3R、SO2NRR'、SR、NRR'、NRSO2NR'R"、NRSO2R'、NRSO3R'、NRC(O)R'、NRC(O)NR'R"、NRC(O)OR'、NRC(N)NR'R"、C(O)R、C(O)OR、C(O)NRR'；並且其中每個R、R'和R"獨立為氫、鹵素、烷基、烯基、炔基、環烷基、雜環烷基、環烯基、雜環烯基、芳基、雜芳基、環基或雜環基；當R1-R6為氫，例如(6-羥基-1H-吲哚-3-基)-(3,4,5- 三甲氧基-苯基)-甲酮("SB01-M2")。
本發明化合物可以根據美國專利7,632,955號揭露的方法和本領域具有通常知識者可得的其他方法來製備。
本發明化合物可以與藥物可接受的稀釋劑、賦形劑或載體結合，以用於本發明的藥物組合物。
在本發明的藥物組合物的製造中，本發明化合物，包括其醫藥可接受鹽，通常和包括但不限於稀釋劑，賦形劑，或載體的醫藥可接受載體混合。當然，載體必須是在與製劑中的任何其它成分相容的意義上是可接受的，而且必須對患者無害。所述載體可以是固體或液體，或兩者，並且較佳地與化合物一起配製為單位劑量製劑，例如，錠劑，其可含有重量比0.01或0.5%以上至95%以上或99%的活性化合物。本發明化合物可經實質上包括混合各成分，其視情況包含一種或多種輔助成分的任何習知藥學技術與載體混合。
II. 化合物和組合物的用途
本發明化合物顯著地顯示某些類型癌細胞株和人類臍靜脈內皮細胞(HUVEC)的抗增殖作用。該等化合物可用於治療增殖性疾病，如腫瘤或癌症，包括但不限於骨癌、腦和中樞神經系統腫瘤、乳癌、結腸直腸癌、內分泌癌、胃腸癌、生殖泌尿癌、婦癌、頭頸癌、白血病、肺癌、淋巴瘤、眼癌、皮膚癌、軟組織肉瘤、泌尿系統癌症，以及其它類型的或相關的病症。特別是，本發明的一些化合物相較於大多數現有的VDA藥物表現出不可預期的低細胞毒性。
各種被用作抗癌化療藥物的細胞毒性化合物(例如，紫杉烷 和長春花生物鹼)已被發現通過干擾微管細胞骨架和有絲分裂構造也具有過去幾年備受關注的血管靶向活性。然而，這些目前正在開發的藥物表現出狹窄的療效區間，需處理高毒性、複雜的結構和合成、抗藥性、純化方法和臨床治療副作用的問題。因此，本發明具有寬療效區間的化合物能改善上述問題。
如此寬的療效區間顯示作為臨床適用抗癌治療劑的實質價值。在毒性控制下，本發明化合物可獨立使用或與其它抗癌或抗腫瘤劑結合使用，例如用於治療腫瘤或癌症受試者的靶向腫瘤或癌細胞藥劑。
待治療個體通常是人類個體，儘管本發明化合物可用於本領域技術人員習知的任何合適個體，特別是哺乳動物個體，包括，除了人以外，馬、牛、狗、兔、家禽、羊，和類似動物。如上所述，本發明提供了在醫藥可接受載體中包含本發明化合物的醫藥組合物，用於口服、直腸、局部、經頰、胃腸外、肌內、皮內、或靜脈內和經皮施用。本發明範圍內任何特定化合物的治療有效劑量視化合物到化合物，患者到患者而不同，並且將取決於患者的狀況和遞送途徑。
作為一般建議，約0.1至約100毫克/公斤的劑量將具有治療功效。考慮較高劑量的毒性可限制劑量至較低劑量，如最高至約10毫克/公斤，所有的重量基於活性成分計算，包括使用鹽的情況下。與大多數現有的VDA藥物不同，本發明的一些具低細胞毒性的化合物的可使用高劑量，如超過25毫克/公斤、超過50毫克/公斤或更高。例如，SB01-M2的劑量可以是25-50毫克/公斤。
本發明的化合物或組合物可用於阻斷血流。本發明的一些 化合物，例如SB01-M2可能會關閉血流而不引起細胞毒性作用並顯示出寬的治療區間以作為新的抗癌藥。因此，本發明的化合物或組合物可以用於阻斷血流至不僅只腫瘤或癌症組織也可是非癌症細胞，如動脈瘤、動靜脈畸形、靜脈畸形、淋巴管畸形、血管瘤、局部缺血性視網膜病、糖尿病視網膜病、脈絡膜新血管形成、濕性老年黃斑部病變和其他相關的病症。
本發明的化合物或組合物也用於抑制α-微小管蛋白聚合。
本發明的化合物或組合物可以抑制抑制類毛細管狀管形成。
在以下非限制性實施例對本發明進行更詳細解釋。
III. 實例
實例1：SB01和SB01-M2在癌細胞和HUVEC
1.1 細胞培養和細胞株
人類臍靜脈內皮細胞(HUVEC)和人類癌細胞株從American Type Culture Collection(ATCC，美國，維吉尼亞州，馬納薩斯)、Bioresource Collection and Research Center(BCRC，食品工業發展研究所，台灣新竹)，或Japanese Collection of Research Bioresources Cell Bank(JCRB細胞庫，生物醫學創新研究所，日本)取得。內皮細胞常規培養在補充有低血清生長補充劑(LSGS)(2%胎牛血清；FBS)(Invitrogen，Life Technologies，美國)的Medium 200，作為在37℃下含有5%二氧化碳的潮濕空氣中適合來自大血管的內皮細胞生長在培養環境中的完整成分。在37℃含有5%二氧化碳的潮濕空氣下含有10%FBS的DMEM/F12培養基中常規培養屬於頭頸癌的人類口腔鱗狀細胞癌(OSCC)細胞株HSC-3和SAS、人類卵巢腺癌細胞株SK-OV-3以及人類前列腺癌細胞株PC-3至預期的匯合。在37℃含有5%二氧 化碳的潮濕空氣下含有10%FBS的RPMI 1640培養基中培養人類胃腺癌細胞株AGS。SB01(DBPR104，BPROL075)、SB01代謝物M2(SB01-M2，BPROL082)和紫杉醇由杏國新藥股份有限公司(台灣)提供。Combretastatin A4(CA4)和抗肌動蛋白和α-微小管蛋白購自默克公司(美國)。
1.2 癌細胞和內皮細胞的增殖
如Hsu,S.C.,Ou,C.C.,Li,J.W.,Chuang,T.C.,Kuo,H.P.,Liu,J.Y.,Chen,C.S.,Lin,S.C.,Su,C.H.,and Kao,M.C.(2008).Ganoderma tsugae extracts inhibit colorectal cancer cell growth via G(2)/M cell cycle arrest.J Ethnopharmacol 120,394-401所述，採用MTT分析進行實驗，調查SB01和SB01-M2對人類腫瘤細胞和血管內皮細胞的影響。
最初篩選五個癌細胞株，包括HSC-3、SAS、SK-OV-3、PC-3和AGS，對藥物最敏感的癌細胞株和內皮細胞一起進行進一步的研究。如圖1a和圖1b所示，四種化合物：SB01、SB01-M2、紫杉醇和CA4在第72小時未對四種癌細胞株，包括HSC-3，SAS，SK-OV-3和PC-3，顯示出明顯的抗增殖效果。唯一存在SB01-M2的IC50值可達60μM作用於SAS癌細胞。意外地，人類胃腺癌細胞株AGS是基於初始篩選試驗對藥物最敏感的癌細胞株，而SB01、SB01-M2、紫杉醇和CA4在72小時IC50值分別約為7.53nM、148.89nM、8.46nM和5.94nM。
隨後，利用AGS和HUVEC細胞在24、48和72小時進行進一步的時間進程試驗。如下表1和圖1a和1b所示，4種測試化合物顯示對AGS和HUVEC細胞的增殖有顯著抑制作用。SB01、SB01-M2、紫杉醇和CA4對AGS在72小時的IC50值分別為7.2nM、921.75nM(約0.9μM)、7.70nM和6.27 nM。
SB01-2作用在AGS在72小時IC50的差異(即，SB01-M2-LD為148.89nM和SB01-M2-HD為921.75nM)可能是由於人為誤差和實驗設計中濃度的大範圍。對於HUVEC，在72小時4個測試化合物的IC50分別為8.18nM、6145.67nM(約6.1μM)、53.43nM和7.11nM。這些數據表示，在4個測試化合物中，SB01-M2對AGS(102-103nM)和HUVEC細胞的增殖(103-104nM)有較少的抑制作用，代表SB01-M2相較於其它三個化合物具有較低的 細胞毒性。
1.3 癌細胞和內皮細胞的細胞週期的分布
如先前Hsu,S.C.,Ou,C.C.,Li,J.W.,Chuang,T.C.,Kuo,H.P.,Liu,J.Y.,Chen,C.S.,Lin,S.C.,Su,C.H.,and Kao,M.C.(2008).Ganoderma tsugae extracts inhibit colorectal cancer cell growth via G(2)/M cell cycle arrest.J Ethnopharmacol 120,394-401中所述，採用流式細胞儀進行進一步實驗測試與SB01和SB01-M2接觸的AGS和HUVEC的細胞週期分布。
細胞經72小時的SB01-M2或其它化合物(SB01、紫杉醇和CA4)的IC50劑量作用(由實例1.2獲得)48和72小時。如示於下表2和圖3，在48和72小時四個試驗化合物都明顯有助於AGS和HUVEC細胞的G2/M期阻滯並影響sub-G1期的誘發。
有趣的是，SB01(66.93±5.49%在48小時和68.56±8.31%在72小時)和SB01-M2(64.32±9.63%在48小時和61.29±7.74%在72小時低劑量，以及71.45±4.22%在48小時和64.33±6.14%在72小時高劑量)作用導致AGS累積在G2/M期停滯伴隨著自G1期的喪失顯著多於紫杉醇(21.71±4.26%在48小時和22.28±2.45%在72小時)和CA4(29.59±10.91%在48小時和20.30±3.64%在72小時)。然而，所有的四個試驗化合物於HUVEC細胞顯著導致G1、G2/M和sub-G1期的類似效果。此外，如示於圖4，在24小時SB01和高劑量SB01-M2有助於AGS的G2/M期停滯比HUVEC細胞更明顯。
1.4 微管在腫瘤細胞和內皮細胞的組合
以前述些微調整的西方點墨法(見Ou,C.C.,Hsu,S.C.,Hsieh,Y.H.,Tsou,W.L.,Chuang,T.C.,Liu,J.Y.,and Kao,M.C.2008)對α-微管蛋白(微管的主要組成)蛋白質表現進行進一步的分析。在AGS和HUVEC的微管分布和組合是由免疫螢光法可視化，並使用螢光顯微鏡觀察影像(見Shi,K.,Jiang,Q.,Li,Z.,Shan,L.,Li,F.,An,J.,Yang,Y.,and Xu,C.(2013).Sodium selenite alters microtubule assembly and induces apoptosis in vitro and in vivo.J Hematol On col 6,7.)。
細胞亦經四種測試化合物72小時的IC50劑量作用48和72小時。如圖5，使用西方點墨法測試在AGS和HUVEC細胞中微管蛋白的蛋白含量的影響。
在統計上四種測試化合物皆未影響AGS細胞內α-微管蛋白含量，經SB01、SB01-M2(LD和HD)和CA4作用後相較於以紫杉醇處理在趨勢上差異在於α-微管蛋白含量的變化；後者導致AGS細胞內α-微管蛋白含量以時間依賴的方式增加。
令人驚訝地，經SB01、SB01-M2和CA4作用在HUVEC細胞顯示α-微管含量在48小時明顯下降，而只有以SB01-M2作用顯著降低α-微管含量直到72小時。此外，為了確定在與SB01和SB01-M2接觸的AGS和HUVEC細胞內細胞微管網狀系統的反應，進行α-微管蛋白的免疫染色測定法。如示於圖6a-6d(放大400倍)和圖7a-7d(放大200X倍)，未經測試化合物處理的AGS和HUVEC細胞內細胞微管網狀系統顯示正常排列和組合。然而，經SB01和SB01-M2處理48和72小時似乎導致AGS和HUVEC細胞內α-微管蛋白聚合(解聚)的抑制，類似於CA4介導的微管網狀系統的改變。CA4， 一個公知的微管結合劑和VDA，被用作陽性對照以顯示通過在秋水仙素結合位點結合的微管解聚。相反地，紫杉醇在48和72小時顯著促成AGS和HUVEC細胞內微管聚合(虛線箭頭)。此外，我們還觀察到與SB01、SB01-M2、紫杉醇和CA4接觸的HUVEC細胞的細胞形態被劇烈地改變。SB01、SB01-M2和CA4從紡錘形、圓形或甚至不規則形狀改變了HUVEC的細胞形態。而較厚細胞形態的形成是由於紫杉醇引起的微管聚合，如圖6c和6d、圖7c和7d和圖8。除了細胞微管網狀系統的改變，四個試驗化合物都似乎致使伴隨產生多個微核和巨細胞的AGS和HUVEC細胞內有絲分裂災變的發現也引起了更多注意(實線箭頭)(圖6a-6d、7a-7d和8b)。
1.5 內皮細胞的類毛細管狀管生成
內皮細胞的類毛細管狀管形成是血管生成的重要一步。根據實例1.4獲得的結果，SB01和SB01-M2處理導致抑制α-微管蛋白聚合，隨後從紡錘形至圓形或甚至不規則形狀改變內皮細胞的細胞形態。四個試驗化合物以IC50在72小時的劑量處理HUVEC6小時，以進一步驗證SB01和SB01-M2是否能阻斷血管內皮細胞的正常生理功能。利用類毛細管狀管形成分析測試SB01-M2對HUVEC自發類毛細管狀管形成的影響。如圖9和圖10a和10b，四個試驗化合物皆顯示對類毛細管狀管形成長度明顯抑制效果，而與其它三個化合物相比只有經SB01-M2作用4、6和8小時後顯著抑制HUVEC的管形成數量。這些結果也表示SB01-M2可能被用來作為潛在的抗血管生成劑。
上述實驗顯示，所有化合物(SB01、SB01-M2、紫杉醇和CA4)明顯展現出對AGS和HUVEC細胞的抗增殖作用，並也促進了這兩個 細胞株的G2/M期停滯和細胞凋亡。四個試驗化合物中，與其它三種化合物比較SB01-M2似乎對AGS和HUVEC細胞也具有較低的細胞毒性。
此外，經SB01和SB01-M2作用似乎相對於AGS細胞更明顯減少HUVEC細胞內α-微管蛋白含量，並且引起α-微管蛋白聚合的抑制，隨後從紡錘形至圓形，甚至不規則形狀改變HUVEC的細胞形態。最明顯的，如同，紫杉醇和CA4的其他化合物，SB01和SB01-M2可能導致伴隨產生AGS和HUVEC的巨細胞和多微核的有絲分裂災變。
此外，上述數據還顯示，SB01和SB01-M2處理導致HUVEC類毛細管狀管形成中斷，其為血管生成的重要一步。
總之，關於SB01-M2，上述實驗表明它對AGS和HUVEC細胞增殖和細胞存活具有較低細胞毒性但表現出明顯的抗微管活性和有絲分裂災變，這可能是有吸引力的機制證明SB01-M2是具血流阻斷能力和較低細胞毒性作用的新形態VDA。
更具體地，與其它良好表徵的臨床使用抗有絲分裂劑，如紫杉醇、CA4和甚至SB01比較，SB01-M2對多種人類癌細胞，包括HSC-3、SAS、SK-OV-3和PC-3(10-100μM和甚至更高)，以及內皮細胞(HUVEC)(1-10μM)的增殖和存活有較少的抑制作用。甚至在藥物敏感細胞株(AGS)，SB01-M2的IC50在72小時達0.9μM(102-103nM)高於紫杉醇(7.7nM)和CA4(6.27nM)，這表示SB01-M2比其他三個化合物具有較低的細胞毒性(參見表I、圖1a、1b和2)。儘管低細胞毒性，SB01-M2的機制仍然顯著造成G2/M細胞週期停滯和細胞凋亡(表2，圖3a-3d和4)。儘管直方圖顯示經SB01和SB01-M2作用後只有少部分sub-G1期被誘發，這表示它們仍 然在凋亡性細胞死亡之前誘發G2/M期停滯。
紫杉醇和CA4是習知的微管結合(抗有絲分裂)劑。紫杉醇屬於紫杉烷，是通過誘發微管聚合來穩定微管的充分表徵微管抑製劑。相反地，CA4是習知的微管結合劑和VDA，它通過在秋水仙素結合位點結合至微管會導致微管的解聚。根據免疫螢光的結果(圖6a-6d和7a-7d)，SB01和SB01-M2作用導致在48和72小時AGS和HUVEC細胞內類似於CA4介導的微管系統改變的α-微管蛋白聚合的抑制(解聚)。像許多以影響微管穩定干擾有絲分裂的正常進程的抗有絲分裂劑，SB01和SB01-M2引起解聚並導致細胞週期停滯在G2/M期。
有趣的是，有人指出，SB01是CA4的一種新的合成雜環類似物，在SB01、SB01-M2和CA4間表現出對α-微管解聚的類似效果。然而，SB01和SB01-M2的結構分析目前尚無法解釋CA4、SB01和SB01-M2之間的相似性。因此，此一發現是無法預期的，可能指向影響微管穩定的新標的。
此外，如同其他兩個化合物，在上述數據中的最重要的發現是有絲分裂災變的產生，這是SB01和SB01-M2作用後AGS和HUVEC細胞內巨細胞形成和多微核產生的特性(圖6a-6d、7a-7d和8a、8b)。先前報告還指出，在外部刺激處理後，如輻射後延遲程序性細胞死亡，內皮細胞(HUVEC)有絲分裂災變形成。此外，一些文獻還說明誘導抗有絲分裂劑誘發的有絲分裂阻抑根據不同濃度的藥物，如紫杉醇，顯示不同機制。SB01和SB01-M2的作用無法預期地也導致了這結果。此外，這發現也可能被用來解釋為什麼經SB01和SB01-M2作用後AGS和HUVEC細胞內誘發少部分的sub-G1期。
有趣的是，上述數據也證實SB01和SB01-M2表現出對HUVEC的類毛細管狀管形成長度在作用4、6及8小時顯著抑制效果(圖9和10a和10b)。此外，SB01-M2與其他三個化合物相比也顯著抑制管形成數。這些結果表明，SB01-M2可能被用作抗血管生成劑。
總之，本實施例證明，SB01和SB01-M2顯然有助於AGS和HUVEC細胞的G2/M期停滯和抗微管活性以及有絲分裂災變，並進一步SB01-M2可能是一個具有較低細胞毒性的新抗有絲分裂和微管中斷劑。這些發現提供了一個有吸引力的機制來解釋SB01-M2的發現作為具阻斷血流能力和較低細胞毒性作用的新一類VDA。
實例2：SB01和SB01-M2作用在HUVEC和人類直腸癌細胞
2.1 細胞株
人類臍靜脈內皮細胞(HUVEC)和人類直腸癌細胞COLO 205(BCRC 60054；ATCC CCL-222 TM)從American Type Culture Collection(ATCC，美國，維吉尼亞州，馬納薩斯)取得。在37℃下5%二氧化碳的潮濕空氣中，HUVEC和COLO 205分別在補充有為10%小牛血清(FCS)的Medium 200和PRMI 1640常規培養。
2.2 內皮細胞的增殖
使用MTS分析進行實驗來研究這些化合物活性對抗活化(生長因子補充)和靜態(生長因子剝奪)人臍靜脈內皮細胞(HUVEC)。如表3所示，SB01和紫杉醇顯著抑制活化和靜態的HUVEC增殖。
在48小時用於活化HUVEC的SB01半數有效濃度(EC50)(陽性對照)約為14.86nM。在48小時用於靜態HUVEC的SB01 EC50值約為13.91nM。在此實驗條件下無法偵測用於活化和靜態HUVEC的SBM2 EC50(>1000nM)(見表3)。這些數據表明，SBM2可能不抑制人類內皮細胞的增殖。
2.3 腫瘤脈管系統阻斷
評估具有取自直腸癌COLO 205細胞的固體腫瘤的動物，以決定SB01和SB01-M2的腫瘤脈管系統阻斷的效果。以SB01-LD(25毫克/公斤，n=5)、SB01-HD(50毫克/公斤，n=5)、SBM2-LD(25毫克/公斤，n=5)、SBM2-HD(50毫克/公斤，n=5)、CA4(50毫克/公斤，n=5)和對照組(n=5)經尾靜脈靜脈注射植入腫瘤小鼠。注射Hoechst 33342染料到尾靜脈並在給藥24小時後犧牲。為觀察小鼠死前的生理形態，測量每隻小鼠的腫瘤大小和體重。
使用H33342 Hoechst螢光染料灌注組織學上測定給藥24小時後腫瘤脈管系統阻斷對這些化合物的反應。如圖11，經SBM2作用導致具 有取自直腸癌COLO 205固體腫瘤的動物的腫瘤脈管系統顯著阻斷。腫瘤切片的Hoechst染料染色定量分析顯示經SBM2至25毫克/公斤作用引起約48%的血管阻斷而至50毫克/公斤引起38%的血管阻斷，如圖11。
評估腫瘤內細胞凋亡程度並發現SB01和SB01-M2可能改變固體腫瘤微環境(如，細胞凋亡程度)。利用原位細胞凋亡試劑盒，POD(TUNEL，羅氏公司)組織學上測定給藥24小時後細胞凋亡對SB01-M2的反應。使用NIH Image 1的軟體計算染色核佔總核區域的百分比且每個樣品隨機拍攝6張照片。如示於圖12a和12b，相較於對照組，給予25和50毫克/公斤的SB01(靜脈內)，50毫克/公斤SBM2(靜脈內)的COL0205移植瘤內的細胞凋亡百分比分別增加約1.37、1.82、1.22倍。給予25毫克/公斤SBM2(靜脈內)(0.94倍)和50毫克/公斤CA4(靜脈內)(0.83倍)的腫瘤中未觀察到細胞凋亡誘發作用。
2.4 腫瘤異種移植的小血管數量
為特異性確認SBM2在腫瘤內皮細胞上的效果，CD31的IHC染色塗佈應用在腫瘤切片。組織學影像資料由病理學家進行進一步分析以指出施用試劑後血流阻塞和血管內皮細胞損傷。病理學家認為給予SBM2明顯引起血流堵塞。此外，雖然血管結構沒有顯著中斷，內皮細胞排列被中斷(圖13a和13b)。
固體瘤的增殖和移轉依賴由周圍脈管系統的供給營養素和氧氣。因此，它提供靶向支持腫瘤生長脈管的推力。事實上，血管阻斷劑(VDA)，如CA4和ZD6126(5)，通過靶向建立的腫瘤脈管系統並引起血管的急性和顯著關閉發揮它們的影響，最終導致選擇性腫瘤壞死。然而，仍 然需要一種用於改善癌症治療發現更有效和有用VDA。
實驗後，本發明化合物(如，SB01和SBM2)的表現出較寬治療區間。體外篩選測定(MTS測試)被用來確定下活化或靜態生長條件的內皮細胞(HUVEC)的不同特性。此外，進一步產生具有來自直腸癌COLO 205細胞固體腫瘤的動物以測量這些化合物在阻斷腫瘤血管的效果。數據顯示SBM2在實驗條件下不展現對HUVEC增殖的顯著抑制效果(藥物濃度：0.1-1000nM)，這表示低劑量SBM2不具有抗有絲分裂的效果。以組織學螢光強度來評估VDA對關閉腫瘤中血流的影響。總之，結果表明SB01和SB01-M2表現出對腫瘤脈管系統的阻斷效果。此外，也顯現，給予SB01和SB01-M2的COLO 205-異種移植腫瘤中些微改變了固體腫瘤微環境，如腫瘤內細胞凋亡程度。總結，此實驗指出，SB01和SB01-M2可用作無細胞毒性作用的血管靶向劑。
實例3：SB01、SB01-M1和SB01-M2作用在腫瘤脈管系統
具有式(IV)的化合物如下也是本發明代表化合物：
其中每個R1-R6獨立為R、硝基、亞硝基、氰基、疊氮化物、異硫代硝基、OR、OC(O)R、OC(O)OR、OC(O)NRR'、SO2R、 SO3R、SO2NRR'、SR、NRR'、NRSO2NR'R"、NRSO2R'、NRSO3R'、NRC(O)R'、NRC(O)NR'R"、NRC(O)OR'、NRC(N)NR'R"、C(O)R、C(O)OR、C(O)NRR'；並且其中每個R、R'和R"獨立為氫、鹵素、烷基、烯基、炔基、環烷基、雜環烷基、環烯基、雜環烯基、芳基、雜芳基、環基或雜環基；例如當R1及R3-R6為氫，(6-甲氧基-5-羥基-1H-吲哚-3-基)-(3,4,5-三甲氧基-苯基)-甲酮(SB01-M1)。
3.1 細胞培養和細胞株
人類臍靜脈內皮細胞(HUVEC)和人類大腸癌細胞株COLO 205細胞從American Type Culture Collection(ATCC，美國，維吉尼亞州，馬納薩斯)取得。在37℃ 5%二氧化碳的潮濕空氣下分別在補充有10%小牛血清(FCS)的Medium 200和PRMI 1640常規培養HUVEC和COLO 205。
3.2 化學試劑和抗體
SB01、SB01-M1、SB01-M2、紫杉醇、供SB01載劑-1(乙醇/PEG300/SOLUTOL 30/20/50%，體積/體積/體積)，和載劑-2(TPGS1000/Transcutol-HP/PEG400 20/20/60%，體積/體積/體積)均取自杏輝藥業有限公司(台灣)。Combretastatin A-4(CA4)來自默克公司(美國)。AQueous One Solution Reagent來自Promega公司(美國)。原位細胞凋亡檢測試劑盒是從羅氏公司(瑞士)獲得。H33342 Hoechst螢光染料從Invitrogen，Life Technologies公司(美國)購得。抗CD31抗體(ab28364)購得自Abcam公司(美國)。
3.3 內皮細胞增殖試驗
使用如先前所述(4)MTS分析來決定內皮細胞增殖。以0.1 至1000nM的濃度範圍使用測試化合物(例如，SB01和紫杉醇)。活化生長條件下，將HUVEC以9000/孔個細胞的密度接種在於含有2%FCS的Medium 200中的96孔板。為靜態生長條件下，將HUVEC以15,000/孔個細胞的密度接種在於含有0.5%FCS的基礎培養基(Medium 200)中。細胞粘附到培養板後，加入各種劑量的測試藥物至細胞，然後將培養物培養48小時。使用根據製造商的建議含有MTS的CellTiter 96® AQueous One Solution Reagent測定相對細胞增殖率。最終的溶液通過使用分光光度計在492nm的波長下測量。
3.4 血管阻斷分析
如前所述進行體內血液阻斷實驗(4)。簡言之，將5×106 COLO 205細胞皮下植入到雌性BALB/c裸小鼠(BALB/cAnN.Cg-Foxn1nu/CrlNarl)後肢側翼區域。總共55隻小鼠用於該實驗；當COLO 205異種移植腫瘤生長至300立方毫米的平均尺寸植入腫瘤小鼠被經由尾靜脈靜脈內注射完全溶解於6倍生理鹽水稀釋的載劑-1的SB01(25或50毫克/公斤)、SB01-M1(25或50毫克/公斤)、SB01-M2(5或10毫克/公斤)和CA4(50毫克/公斤)或經口強飼(50或100毫克/公斤)的懸浮於載劑-2溶液。給予這些測試化合物二十四小時後，然後將小鼠靜脈注射10毫克/公斤的H33342 Hoechst螢光染料(用於血液灌注)。1分鐘後，犧牲小鼠和切除COLO 205異種移植腫瘤供其他組織學檢查，如H&E染色(用於壞死的測量)、CD31染色(用於內皮細胞檢測)和終端脫氧核糖核苷酸轉移酶介導的dUTP缺口末端標記(TUNEL)染色(用於細胞凋亡的測量)。 免疫染色切片用Scan-Scope(Aperio Technologies)在20倍放大倍率掃描。 使用NIH ImageJ(版本1.47)軟體進行H33342 Hoechst和TUNEL染色的量化。
3.5 SB01、SB01-M1和SB01-M2對內皮細胞增殖的影響
使用MTS分析檢測SB01、SB01-M1和SB01-M2對活化(生長因子補充)和靜止(生長因子剝奪)人類臍靜脈內皮細胞(HUVEC)的內皮細胞增殖抑制活性。如示於表4和補充圖14中，兩種化合物SB01和顯著抑制活化和靜態的HUVEC的增殖。
在48小時活化內皮細胞的SB01半數有效濃度(EC50)約為為14.86nM。對於靜態HUVEC，在48小時這三種藥物的EC50值分別約為13.91nM和27.59nM。本實驗條件下活化和靜態HUVEC的SB01-M1和SB01-M2的EC50為不可檢測(>1000nM)。
3.2 SB01、SB01-M1和SB01-M2的腫瘤脈管系統的阻斷效果
進一步評估具有來自直腸癌COLO 205細胞的固體腫瘤的動物被以決定SB01、SB01-M1和SB01-M2在阻斷腫瘤脈管系統的功效。
以SB01-LD(25毫克/公斤，n=5)、SB01-HD(50毫克/公斤，n=5)、SB01-M1-LD(25毫克/公斤，n=5)、SB01-M1-HD(50毫克/公斤， n=5)、SB01-M2-LD(5毫克/公斤，n=5)、SB01-M2-HD(10毫克/公斤，n=5)、CA4(50毫克/公斤，n=5)和對照組(6倍稀釋載劑-1，n=5)經尾靜脈靜脈注射五十五隻腫瘤植入小鼠。注射Hoechst 33342染料到尾靜脈並在給藥24小時後犧牲。為觀察小鼠死前的生理形態，測量每隻小鼠的腫瘤大小和體重結果示於下表中：
表13：
在實驗過程中，我們發現了一些組小鼠有較低的運動能力，特別是在給予SB01-HD的組。
利用H33342 Hoechst螢光染料灌注組織學測量腫瘤脈管系統阻斷對這些化合物作用24小時後的反應。如圖15，經SB01、SB01-M1和SB01-M2作用導致在具有來自COLO 205固體腫瘤的動物中顯著的腫瘤脈管系統阻斷。腫瘤切片中的Hoechst染料染色定量分析顯示給予SB01導致大約在25毫克/公斤54%的血管關閉和在50毫克/公斤73%的血管關閉。經SB01-M1作用在25毫克/公斤導致大約48%的血管關閉和在50毫克/公斤導致大約38%的血管關閉。經SB01-M2作用分別在5和10毫克/公斤導致大約為0%和34%的腫瘤血管灌注減少。經50和100毫克/公斤作用造成腫瘤血管灌注最高至100%的減少。
評估腫瘤內的細胞凋亡程度(例如，細胞凋亡程度)以確定經SB01、SB01-M1和SB01-M2作用後固體腫瘤微環境的改變。利用原位細胞凋亡試劑盒，POD(TUNEL，羅氏公司)在給藥24小時後進行組織學測定細胞凋亡對這些測試化合物的反應。以NIH ImageJ的軟體計算染色核對比總核領域百分比並且每個樣本隨機拍攝6張照片。如圖16，相較於對照組，給予25和500毫克/公斤SB01(靜脈內)和50毫克/公斤SB01-M1的(靜 脈內)的COLO205移植瘤內細胞凋亡的百分比分別約增加了1.17、1.65和1.11倍。未在經25毫克/公斤的SB01-M1(靜脈內)(0.83×)、5和10毫克/公斤SB01-M2(靜脈內)(分別為0.64×和0.91)和50毫克/公斤的CA4(靜脈內)(0.75×)作用的腫瘤中觀察到對細胞凋亡誘發作用。
細胞增殖和實體瘤的轉移依賴於營養素由周圍脈管系統的供給和氧氣。因此，它提供了動力供靶向支持腫瘤生長的脈管系統。事實上，血管阻斷劑(VDA)，如CA4和ZD6126(5)，通過靶向建立的腫瘤脈管系統和引起血管的急性和顯著關閉，最終導致選擇性腫瘤壞死發揮它們的影響。然而，窄的療效區間局限性限制了它們在癌症治療的應用。測試化合物(例如，SB01、SB01-M1和SB01-M2)在基於活化或靜態生長條件內皮細胞(HUVEC)的差異化特性的體外篩選分析(MTS測試)顯示出較寬的療效區間。此外，進一步產生具有來自直腸癌COLO 205細胞固體瘤的動物以證明這些測試化合物阻斷腫瘤脈管系統顯著效果。
類似CA4，該實驗表明SB01對於活化的或靜態的HUVEC無選擇性地顯著抑制內皮細胞(HUVEC)的增殖(表4和圖14)。此外，該數據還表明於我們的實驗條件下這兩種SB01代謝物(SB01-M1和SB01-M2)未顯示對HUVEC的增殖明顯抑制的效果(藥物濃度：0.1-1000nM)。SB01-M1和SB01-M2對活化和靜態內皮細胞的EC50是無法檢測的(>1000nM)。連同實例1和2，這兩個SB01代謝物明顯表現出對匯合非增殖的內皮細胞的增殖選擇性，這是以前未預期的。
已從螢光強度進行組織學評估VDA對關閉腫瘤血流的影響。依據Hoechst染料染色(圖15)，與對照組比較經CA4(50毫克/公斤) 作用使約70%的血管關閉。然而，根據該實驗設計和在本實施例中的分析方法，實驗結果是令人驚訝的多。相較於CA4，經相同劑量(50毫克/公斤)的SB01作用也導致約70%的血管關閉和給予25毫克/公斤大約50%保留。雖然SB01-M1和SB01-M2效果較少，其中在高劑量給藥不能阻斷超過50%腫瘤脈管系統，10毫克/公斤的SB01-M2可導致約40%的腫瘤血管阻斷效果。
總之，數據顯示，SB01顯著抑制內皮細胞(HUVEC)的增殖而不具活化或靜止HUVEC的選擇性。給予SB01也導致在COLO 205-異種移植動物中腫瘤脈管系統阻斷。該結果也顯示SB01-M1和SB01-M2表現出腫瘤脈管系統阻斷作用，而且這兩個SB01代謝物不顯示對HUVEC增殖顯著抑制作用。此外，這也表明固體腫瘤微環境，如腫瘤內細胞凋亡的程度，在給予SB01和兩個SB01代謝物的COLO 205-異種移植腫瘤中稍有改變。總結，這個實例說明SB01、SB01-M1和SB01-M2可用於血管靶向劑而不涉及副作用。
本發明的以上具體態樣為用於說明目的公開並且本發明並不限於所公開的特定形式或方法。熟知此技術人員將理解各種調整、增加和替代是可能的。因此，本發明將涵蓋落入所附權利要求的範圍之內的所有調整、等同和替代。

Claims (11)

  1. 一種式(I)化合物於製備阻斷至非癌組織細胞血流的藥物的用途， 其中R及R1-R6為氫。
  2. 如請求項1的用途，其中受益於阻斷血流至非癌組織細胞的病症或疾病係選自由動脈瘤、動靜脈畸形、靜脈畸形、淋巴管畸形、血管瘤、局部缺血性視網膜病、糖尿病視網膜病、脈絡膜新血管形成、濕性老年黃斑部病變和其他相關的病症組成之群。
  3. 一種式(I)化合物於製備阻斷至癌組織細胞血流的藥物的用途， 其中R及R1-R6為氫，且該化合物使用劑量為25毫克/公斤以上。
  4. 如請求項3的用途，其中受益於阻斷血流至癌組織細胞的病症或疾病係選自由骨癌、腦和中樞神經系統腫瘤、乳癌、結腸直腸癌、內分泌癌、胃腸 癌、生殖泌尿癌、婦癌、頭頸癌、白血病、肺癌、淋巴瘤、眼癌、皮膚癌，軟組織肉瘤、泌尿系統癌及其它類型或相關的病症。
  5. 如請求項1-4任一項的用途，其中該阻斷血流的藥物包括治療有效量的式(I)化合物或醫藥上可接受的鹽和醫藥可接受載劑。
  6. 如請求項1或2的用途，其中治療有效量介於5毫克/公斤和50毫克/公斤之間。
  7. 一種式(I)化合物於製備抑制類毛細管狀管形成的藥物的用途， 其中每個R及R1-R6獨立為氫、鹵素、含有1至6個碳原子的烷基，其中該用途不是癌症或腫瘤治療。
  8. 如請求項7的用途，其中R為氫、鹵素或甲基。
  9. 如請求項8的用途，其中R1-R6獨立為為氫或鹵素。
  10. 如請求項7-9任一項的用途，其中該抑制類毛細管狀管形成的藥物包括治療有效量的式(I)化合物或醫藥上可接受的鹽和醫藥可接受載劑。
  11. 如請求項10的用途，其中治療有效量介於5毫克/公斤和50毫克/公斤之間。
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