TWI572366B

TWI572366B - 杏仁酸於製備美白暨抗皺之化妝料組成物之用途

Info

Publication number: TWI572366B
Application number: TW103110727A
Authority: TW
Inventors: 謝銘峻; 梁家華
Original assignee: 洸鼎生物科技有限公司
Priority date: 2014-03-21
Filing date: 2014-03-21
Publication date: 2017-03-01
Also published as: TW201536337A

Description

杏仁酸於製備美白暨抗皺之化妝料組成物之用途

本發明係有關於一種杏仁酸於製備美白暨抗皺之化妝料組成物之用途，尤其係指具有抑制酪胺酸酶活性以及降低皮膚細胞黑色素生成並增加膠原蛋白含量之杏仁酸，將其用於製備美白淡斑之化妝料組成物或醫藥組成物，可達到美白以及肌膚抗皺之功效。

按，現代人除了食衣住行的基本生活需求之外，美容保養的需求也漸漸受到重視，不僅女性重視美容保養，連男性也都趨之若鶩，故人體使用之美容保養用品即為目前廠商爭相開發之重點。覆蓋人體體表之皮膚係人類與外界環境接觸的第一層防護，最容易受到外界的刺激與紫外線傷害，為了保護皮膚不受到陽光中紫外線的傷害，皮膚中的黑色素細胞(melanocytes)會合成黑色素(melanin)來防禦抵抗陽光中的紫外線，當人體不斷受到有害化學物質、過度光照或體內產生的自由基攻擊時，容易導致細胞受損老化或大量黑色素生成。因此，如何保養皮膚以減緩皮膚老化速度及黑色素生成，便成為消費者追求之方向，例如有雀斑或老人斑的人們希望能改善其膚質(減黑)，或是其他愛美人士要求白還要更透白的皮膚等等。

目前，經研究證實具有美白效果的天然物質例如維生素 C(vitamin C，L-ascorbic acid)、麴酸(kojic acid)、杜鵑花酸(acelaic acid)和熊果素(arbutin)等等，雖然這些物質對於美白的確有顯著的功效，卻各有其使用上之限制，例如維生素C在陽光下或接觸空氣易被氧化，並且不耐熱，當濃度超過5%以上會對皮膚產生刺激性及紅腫；麴酸非常的不穩定容易被氧化而變色及引起皮膚過敏，且長期過量使用麴酸產品會導致細胞毒性且發生病變；此外，有些美白劑之作用係為直接破壞黑色素細胞，易造成細胞的毒殺性。因此，用以抑制黑色素組成物成分之安全性與其作用濃度是亟需重視的。

杏仁酸(Mandelic acid)，又名苯乙醇酸，學名為α-羥基苯乙酸(2-Hydroxy-2-phenylacetic acid)，由於其化學結構式類似抗生素，對於大腸桿菌和鏈球菌都有良好的抗菌效果，因此在早期杏仁酸主要係被應用於治療泌尿道感染的問題上，並用作口服抗生素。直到美國著名的皮膚專科醫師Dr.James E.Fulton才開始將杏仁酸應用於皮膚醫學美容領域，作為臉部換膚之用。杏仁酸屬於親脂性果酸，滲透角質層能力較強，溫和不刺激，不易產生一般果酸換膚的副作用如紅腫、灼傷及結痂等，因此比其他換膚成份都更為有效。然，目前卻沒有具體研究證實杏仁酸於美白上之確切功效為何。

今，發明人即是鑑於上述現有之美白組成物於實際實施使用時仍具有多處缺失，於是乃一本孜孜不倦之精神，並藉由其豐富專業知識及多年之實務經驗所輔佐，而加以改善，並據此研創出本發明。

本發明主要目的為提供一種杏仁酸於製備美白暨抗皺之化妝料組成物之用途，其係具有抑制酪胺酸酶活性以及降低皮膚細胞黑色素生成並增加膠原蛋白含量之杏仁酸，進一步地，將杏仁酸用於製備美白淡斑之化妝料組成物或醫藥組成物，可達到美白之功效。

為了達到上述實施目的，本發明一種杏仁酸於製備美白暨抗皺之化妝料組成物之用途，其係施予一重量百分濃度為10%~30%之杏仁酸於皮膚，以抑制蘑菇酪胺酸酶活性以及抑制黑色素生成；其中杏仁酸之pH值係為3.5~7.0，最佳係為pH值3.5及7.0；藉此，可用以抑制蘑菇酪胺酸酶活性以及抑制黑色素生成。

本發明亦提供一種含杏仁酸之化妝料組成物於美白之用途，其係施予一有效劑量之化妝料組成物於皮膚，以抑制蘑菇酪胺酸酶活性以及黑色素生成；其中化妝料組成物由重量百分濃度10%~30%之杏仁酸(最佳可例如為10%之杏仁酸)、0.5%~1.5%之1,3-丁二醇(1,3-butanediol)及剩餘重量百分濃度之無菌水所構成，杏仁酸之pH值係為3.5~7.0，最佳係為pH值3.5及7.0。

於本發明之一實施例中，最佳可例如為施予一重量百分濃度為10%之杏仁酸於皮膚，以抑制蘑菇酪胺酸酶活性以及抑制黑色素生成。

於本發明之一實施例中，施予一重量百分濃度為10%之杏仁酸於皮膚，可進一步增加膠原蛋白含量。

根據本發明杏仁酸之用途，可進一步用於製備美白淡斑或增加膠原蛋白含量之化妝料組合物，以提供使用者更佳之美白除皺保養品選擇。

第一圖：杏仁酸之抑制蘑菇酪胺酸酶活性測定

第二圖：杏仁酸之抑制細胞黑色素含量測定

第三圖：杏仁酸之增加膠原蛋白含量測定

本發明之目的及其結構功能上的優點，將依據以下圖面所示之結構，配合具體實施例予以說明，俾使審查委員能對本發明有更深入且具體之瞭解。

本發明一種杏仁酸(mandelic acid，MA)於製備美白暨抗皺之化妝料組成物之用途，其係施予一重量百分濃度為10%~30%之杏仁酸(最佳可例如為重量百分濃度10%之杏仁酸)於皮膚，以抑制蘑菇酪胺酸酶(mushroom tyrosinase)活性以及抑制黑色素生成；其中杏仁酸之pH值係為3.5~7.0(最佳係為pH值3.5及7.0)，並且施予一重量百分濃度為10%之杏仁酸可進一步增加膠原蛋白含量。

再者，本發明亦揭示一種含杏仁酸之化妝料組成物於製備美白暨抗皺之化妝料組成物之用途，其係施予一有效劑量之化妝料組成物於皮膚，以抑制蘑菇酪胺酸酶活性以及黑色素生成；其中化妝料組成物由重量百分濃度10%~30%(最佳可例如為重量百分濃度10%)之杏仁酸、0.5%~1.5%之1,3-丁二醇(1,3-butanediol)及剩餘重量百分濃度之無菌水所構成，杏仁酸之pH值係為3.5~7.0，最佳係pH值3.5及7.0，並且施予一重量百分濃度為10%之杏仁酸可進一步增加膠原蛋白含量。

此外，藉由下述具體實施例，可進一步證明本發明可實際應用之範圍，但不意欲以任何形式限制本發明之範圍。

I.〈藥物配製〉

本實施例之杏仁酸係由廣德科苑化工有限公司購得。秤取杏仁酸的粉末1g，並加入1ml無菌水及50μl 1,3-丁二醇，隨後加熱至90℃約10分鐘使其溶解，此濃度為100%，並調製成pH 1.9或pH 3.5，再以0.22μm過濾膜過濾，用以進行以下試驗。

II.〈培養液及緩衝液之配製〉

(1)配製DMEM medium(供B16及Hs68細胞使用)：

秤取13.4g的DMEM粉末，加入1.5g碳酸氫鈉(sodium bicarbonate)，4.5g葡萄糖，先以250ml的去離子水溶解後，再加入1ml/L gentamicin，之後以去離子水定量至1公升，並以孔徑0.22μm過濾膜過濾，儲存於4℃備用。

(2)配製Phosphate-buffered saline(PBS)：

秤取8g氯化鈉、0.2g氯化鉀、1.44g之Na₂HPO₄‧7H₂O以及0.24g之KH₂PO₄，溶解於980ml去離子水後，將pH值調整至7.4，再加去離子水至1公升，高溫滅菌後，室溫儲存。

(3)配製10倍Trypsin-EDTA溶液：

秤取0.5g之trypsin以及0.2g之2-[2-(bis(carboxymethyl)amino)ethyl-(carboxymethyl)amino]acetic acid(EDTA)，加入PBS至100ml後，以0.22μm濾膜過濾，儲存於-20℃。

III.〈細胞培養與保存〉

老鼠黑色素瘤細胞(mouse melanoma,B16 cells)和人類皮膚纖維母細胞(human skin fibroblast,Hs68 cells)，以含有10% fetal bovine serum(FBS) 的DMEM培養液，置於37℃，5%二氧化碳的細胞培養箱內培養，每週更換培養基2-3次。

繼代培養時，係移除舊的培養液，以PBS緩衝液清洗細胞表層1-2次後，加入適量1倍Trypsin-EDTA溶液，於37℃培養箱中作用數分鐘，待細胞自培養瓶壁脫落，立即加入新鮮細胞培養液，以無菌吸管將細胞均勻打散後，分裝適當的細胞數至新的培養瓶繼續培養。

再者，欲冷凍保存的細胞應在生長旺盛，且存活率高之狀態，約為80-90%緻密度。將生長情形良好的細胞，依細胞繼代培養的操作，收集細胞至裝有適量細胞培養液的15ml離心管，以1,200rpm離心10分鐘。離心後去除上清液，並另外配製含有0.5% DMSO的細胞培養液作為細胞冷凍保存液，將此冷凍保存液加入離心後的細胞中，混合均勻打散細胞，取適量細胞液分裝至冷凍管中，再放至冷凍盒。冷凍盒放入-80℃冰箱，隔天移入液態氮桶內長期儲存。

此外，為避免冰晶對細胞造成傷害，解凍細胞的原則為快速解凍。從液態氮桶取出細胞冷凍管，並迅速移放至37℃水浴箱內急速解凍，輕搖冷凍管使其盡快融化至殘餘少部分冰塊，隨即將細胞冷凍保存液(10% FBS,0.5% DMSO,medium)吸至無菌15ml離心管，以1,000rpm離心5分鐘。移除上清液，加入新鮮細胞培養液將沉澱的細胞打散並移至75cm²細胞培養瓶中，於37℃、5% CO₂細胞培養箱中生長，平均每隔2天更換一次培養液。

IV.〈細胞存活度試驗〉

採用MTT assay檢測。將1×10⁴/100μl老鼠黑色素瘤細胞(B16)培養在96孔盤(96-well plate)，並在37℃及5% CO₂培養箱中培養至少24 小時。之後，加入欲檢測之各濃度(0.1%、1%、10%、20%、30%)的杏仁酸，於37℃及5% CO₂培養箱中反應至作用時間。達反應時間，移除舊的培養液，以PBS清洗一次，並換上新的的培養液，加入10μl的MTT(3-(4,5-cimeth-ylthiazol-2-yl)-2,5-diphenyl tetrazolium bromide)溶液反應，於37℃、5% CO₂反應四小時之後移除培養液，加入100μl的DMSO溶解formazan沉澱物，最後於波長570nm下測定吸光值。結果顯示，杏仁酸大於30%，會造成較大的細胞死亡量，故本發明係使用小於30%含量之杏仁酸。

實驗一：杏仁酸於抑制蘑菇酪胺酸酶活性之分析

〈抑制蘑菇酪胺酸酶活性測定〉

取不同濃度(0.1%、1%、10%、20%、30%)的杏仁酸樣品以及維生素C(Ascorbic acid)進行蘑菇酪胺酸酶(mushroom tyrosianse)活性實驗，其中，不同濃度的維生素C係作為對照標準品。於96孔盤(96-well multiplate)中，取配置樣品20μL加入25μL酪胺酸酶(50 unit)混合後，於室溫下靜置10分鐘，以分光光度計檢測492nm之吸光值最為背景值，隨後取155μl、2.5mM的L-多巴(L-Dopa)加入96孔盤中，以分光光度計(BioTek,Synergy^TM2,USA)檢測各孔的反應混合物於492nm下的吸光值變化。其酪胺酸酶活性抑制率(%)計算公式為[1-(樣品於492nm之吸光值/未添加樣品之控制組於492nm之吸光值)]×100%。

實驗結果請參閱第一圖，pH 3.5的杏仁酸分別在不同濃度0.01%、1%、10%、20%及30%的作用下，抑制蘑菇酪胺酸酶活性(inhibition of mushroom tyrosinase activity)之效能隨著作用濃度增加而提升，其抑制率分別為13%、17%、91%、93%及99%。結果證實杏仁酸具有抑制體外蘑菇酪胺酸酶活性的效果，尤其係以濃度為10%~30%之杏仁酸具有較佳抑制蘑菇酪胺酸酶活性的效果。

實驗二：杏仁酸於抑制細胞黑色素含量之分析

將1×10⁵/mL老鼠黑色素瘤細胞(B16 cells)培養在96孔盤(96-well multiplate)中，並使用含有α-MSH的培養液在37℃、5% CO₂培養箱中生長24小時以上。加入Phenol red free medium和10%杏仁酸，作用72小時之後，抽取等量上清液，以405nm測量吸光值。

實驗結果請參閱第二圖，以pH3.5及pH7.0的杏仁酸以10%的作用濃度加入B16細胞作用72小時之後，由pH3.5及pH7.0的杏仁酸對於黑色素生成的抑制率分別為42.6%、39.7%。由上述結果得知，pH3.5及pH7.0的杏仁酸在10%作用濃度下對B16細胞確實具有抑制黑色素生成的能力。

實驗三：杏仁酸於細胞內膠原蛋白含量之分析

將1.5×10⁵cell/ml之Hs68細胞培養在直徑3公分培養盤(3cm-dish)中24小時，移除上清液再加入含有不同濃度(5%或10%)之杏仁酸之無血清培養液培養48小時，其中，不同濃度的甘醇酸(glycolic Acid)係作為對照標準品；PBS清洗後，刮除細胞，離心1,200rpm、5分鐘，再去除上清液。本試驗是利用套組(Sircol soluble collagen assay kit)進行膠原蛋白測定。首先將100μl細胞液混合1ml之sircol dye reagent，接著在室溫下均勻搖晃30分鐘，再離心1,2000rpm、10分鐘，直接倒掉上清液，再加入750μl ice-cold acid-salt wash reagent，再離心1,2000rpm、10分鐘，將sircol dye reagent完全去除乾淨。之後加入250μl之alkali reagent混合均勻，取100μl至96-well盤，在555nm測吸光值。

實驗結果請參閱第三圖，將不同濃度(5%和10%)之杏仁酸作用於人類纖維母細胞Hs68細胞中培養48小時之後，杏仁酸於10%時，比控制組(control)的膠原蛋白含量多了17%，由此試驗證實10%以上之杏仁酸可以有效的增加膠原蛋白之含量。

綜上所述，本發明證實杏仁酸具有抑制酪胺酸酶、抑制黑色素生成以及增加膠原蛋白含量之功效，故杏仁酸可應用於作為美白淡斑及增加膠原蛋白之化妝料組成物、保養品或醫藥組成物，並且此醫藥組成物可與一皮膚外用劑合併使用。上述“皮膚外用劑”意指一通常在化妝品或醫藥品中被使用的外用成份，包括，但不限於：其他的美白劑、保濕劑、抗氧化劑、紫外線吸收劑、介面活性劑、增稠劑、色料以及皮膚營養劑等等，可例如為濃縮精華液之成分或添加於面膜中使用，提供使用者以一適當量施予皮膚，進而達到保護皮膚免於紫外線傷害、美白之功效。

值得注意的是，本發明之杏仁酸之酸鹼值符合法定pH值3.5以上，使用pH小於3.5(例如pH 1.9)之杏仁酸雖然可抑制黑色素生成；然，施予人體皮膚時可能造成皮膚刺激、紅腫等問題。另，當pH 3.5杏仁酸之濃度小於10%時，其無法達到較佳抑制黑色素生成之效果；若濃度大於30%，雖可抑制黑色素生成，但其亦可能造成使用者皮膚刺激、紅腫、過敏等問題。故，本發明中pH 3.5杏仁酸之最佳濃度係為10%~30%。

由上述之實施說明可知，本發明與現有技術相較之下，本發明藉由具體實驗證實杏仁酸具有抑制蘑菇酪胺酸酶活性以及抑制黑色素生成之活性，若進一步運用於作為塗抹皮膚之化妝料組成物、保養品或醫藥組成物，將可達到美白淡斑以及肌膚抗皺之功效。

綜上所述，本發明之杏仁酸於製備美白暨抗皺之化妝材料組成物之用途，的確能藉由上述所揭露之實施例，達到所預期之使用功效，且本發明亦未曾公開於申請前，誠已完全符合專利法之規定與要求。爰依法提出發明專利之申請，懇請惠予審查，並賜准專利，則實感德便。

惟，上述所揭之圖示及說明，僅為本發明之較佳實施例，非為限定本發明之保護範圍；大凡熟悉該項技藝之人士，其所依本發明之特徵範疇，所作之其它等效變化或修飾，皆應視為不脫離本發明之設計範疇。

Claims

一種中性(pH7.0)之杏仁酸溶液於製備美白暨抗皺之化妝料組成物之用途，其係施予一有效劑量之化妝料組成物於皮膚，以抑制蘑菇酪胺酸酶活性以及黑色素生成並增加膠原蛋白含量；其中該化妝料組成物由重量百分濃度10%~30%之杏仁酸、0.5%~1.5%之1,3-丁二醇(1,3-butanediol)及剩餘重量百分濃度之無菌水所構成。
如申請專利範圍第1項所述之用途，其中該化妝料組成物由重量百分濃度10%之杏仁酸、0.5%~1.5%之1,3-丁二醇(1,3-butanediol)及剩餘重量百分濃度之無菌水所構成。