TWI570237B - 益生菌組合物之用途 - Google Patents

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Description

益生菌組合物之用途
本發明係有關於一種微生物組合物之用途，特別係指益生菌組合物之用途。
按，心血管疾病(cardiovascular disease,CVD)係已經成為全世界人之健康隱憂，據統計，未來全世界約有3分之1人口之死因係為心血管疾病，並且以台灣來說，死亡原因為心血管疾病者約占全部死因之4分之1。更進一步來說，心血管疾病係包含有冠狀性動脈心臟病(coronary heart disease,CHD)、腦血管疾病、高血壓性心臟病，其中，冠狀性動脈心臟病，又稱為冠心病，為目前最常見之心臟病，亦為猝死之最主要原因。造成冠狀性動脈心臟病之原因主要為動脈粥狀硬化(atherosclerosis)，其係起因於血管內膜層結構及組成已改變，造成血管內血液流動功能受損或是血流不足，換言之，當心臟冠狀動脈發生粥狀硬化，會發生心肌梗塞或心絞動等心臟疾病之病徵，因而導致心肌細胞壞死以及凋亡。另有研究結果顯示成年後哺乳動物之心臟係缺乏再生能力或是再生能力極差，心臟心肌細胞數目於出生後不會再增加，不過於外界刺激下，如疾病，心臟心肌細胞會增大，使得心肌擴大增厚，此即所謂之心肌肥大。而心肌肥大會逐漸導致心臟功能不全，引發心肌凋亡。不論如何，當心肌細胞凋亡後，則會使個體 成為心臟衰竭之高風險族群，嚴重者甚而會死亡，因此，心肌凋亡對於個體健康與生命之影響甚鉅。
乳酸菌係為一種能利用碳水化合物進行發酵而產生多量乳酸之細菌，廣泛地存在於自然界中，可來自於動物，如原料奶或是腸道，或是來自植物，如蔬菜水果。大體來說，乳酸菌包含有乳酸桿菌(Lactobacillus)、乳酸球菌(Lactococcus)、念球菌(Leuconostoc)、小球菌(Pediococcus)、鏈球菌(Streptococcus)、需氧球菌(Aerococcus)、肉食桿菌(Carnobacterium)、腸球菌(Enterococcus)、酒球菌(Oenococcus)、俳徊球菌(Vagococcus)和魏斯氏菌(Weisella)等，其中，乳酸桿菌種類最多。而依據功能性來說，乳酸菌則可分為非腸駐型乳酸菌以及腸駐型乳酸菌。由於乳酸菌過去被發現可用以延長食物保存期限、改善食物口味、提高營養價值，故早期被大量使用於食品加工產業中。而近期許多研究中，發現乳酸菌係有助於改善人體健康之改善，例如降低血清中膽固醇、提昇免疫機能、調整消化道功能、抑制致病菌生長、抑制腫瘤生長等，並且基於乳酸菌對於人體來說屬於安全性較佳者，因此，目前乳酸菌儼然成為食品添加物或保健食品之新寵。
本發明係有關於具有生物活性之乳酸菌組合物，具體來說，該乳酸菌組合物係包含有鼠李乳酸桿菌LCR177(Lactobacillus rhamnosus LCR177)BCRC910473、乳酸片球菌PA318(Pediococcus acidilactici PA318)BCRC910474以及青春雙岐桿菌(Bifidobacterium adolescentis)BCRC14609，而能用以保護心肌細胞之生理功效，減少心肌細胞凋亡發生。
據此，本發明之主要目的係在提供使用該乳酸菌組合物製備預防/治療心血管疾病之醫藥組合物之用途，其中，該醫藥組合物中細胞含有效量之該乳酸菌組合物以及醫藥上可接受之載體及/或賦形劑。
本發明之另一目的係在於提供一食品組合物，其係包含本發明所揭該乳酸菌組合物，用以預防心血管疾病之發生。
而所謂醫藥組合物，其係可依據使用需求而製備成為任何得以進入人體之形式，例如：錠劑、膠囊、噴劑、滴劑、粉劑、膠狀物、軟嚼錠、懸浮液、丸粒。
所謂醫藥上可接受之載體，係指符合任何標準醫藥上可接受之物質，例如，鹽類緩衝液、葡萄糖、水、甘油、有機溶劑或上述至少任二之組合。
所謂賦形劑，係指添加於醫藥組合物中之物質，用以減少醫藥組合物之不良氣味，以及增加醫藥組合物之穩定性，例如，色素、甜味劑、風味添加劑、防腐劑、濃縮劑、溶解劑、穩定劑、表面活性劑、黏合劑、崩解劑、填充劑。
所謂食品組合物，係得搭配飲食添加物或食品組成份而製備成為不同型態，例如飲品、乳製品、餅乾、穀製品、沖泡包、膠囊、錠劑、膠凍、粉劑、糖果、甜點等。
必須加以說明者，以上僅為對於本發明說明書及申請專利範圍中所提名詞之例示性說明，並非用以限制本發明說明書及申請專利範圍。
第一圖A至E係為各該組小鼠心臟切片以蘇木紫-伊紅染色 之結果。
第二圖A至E係為各該組小鼠心臟切片以梅生三色染色法染色之結果。
第三圖A係為各該組小鼠心臟組織中FADD蛋白之表現。
第三圖B係為各該組小鼠心臟組織中FADD蛋白之表現量。
第四圖A係為各該組小鼠心臟組織中凋亡蛋白酶8之表現。
第四圖B係為各該組小鼠心臟組織中凋亡蛋白酶8之表現量。
第五圖A係為各該組小鼠心臟組織中截短Bid蛋白之表現。
第五圖B係為各該組小鼠心臟組織中截短Bid蛋白之表現量。
第六圖A係為各該組小鼠心臟組織中Bad蛋白之表現。
第六圖B係為各該組小鼠心臟組織中Bad蛋白之表現量。
第六圖C係為各該組小鼠心臟組織中磷酸化Bad蛋白之表現量。
第七圖A係為各該組小鼠心臟組織中Bcl-2蛋白及Bcl-xL蛋白之表現。
第七圖B係為各該組小鼠心臟組織中Bcl-xL蛋白之表現量。
第七圖C係為各該組小鼠心臟組織中磷酸化Bcl-2蛋白之表現量。
第八圖A係為各該組小鼠心臟組織中凋亡蛋白酶3之表現。
第八圖B係為各該組小鼠心臟組織中凋亡蛋白酶3之表現量。
第九圖A係為各該組小鼠心臟組織中磷酸化IGF1接受器及磷酸化PI3K蛋白之表現。
第九圖B係為各該組小鼠心臟組織中磷酸化IGF1接受器之表現量。
第九圖C係為各該組小鼠心臟組織中磷酸化PI3K蛋白之表現量。
第十圖A係為各該組小鼠心臟組織中磷酸化Bad蛋白及磷酸化Akt蛋白之表現。
第十圖B係為各該組小鼠心臟組織中酸化Akt蛋白之表現量。
第十圖C係為各該組小鼠心臟組織中磷磷酸化Bad蛋白之表現量。
須先加以說明者，先前文獻中係已經揭露當促細胞凋亡分子被活化後，會啟動蛋白質水解酶執行細胞凋亡之程序，例如凋亡蛋白酶3(Caspase 3)及凋亡蛋白酶9(Caspase 9)係屬於效應酶(effector caspase)，被活化後會開始切割其他蛋白質，使凋亡過程被啟動；凋亡蛋白酶8(pro-caspase 8)係屬於起始酶(Initiator caspase)，作用於效應酶之上游，用以由細胞膜傳遞凋亡訊息而活化效應酶。
凋亡蛋白酶係依據活化路徑不同而受到上游不同之促凋亡蛋白因子影響，具體來說，如去磷酸化之Bad蛋白得與Bcl-2家族蛋白結合形成二聚體，誘導粒線體釋放細胞色素c(Cytochrome c)至細胞質中，活化凋亡蛋白酶3而造成細胞凋亡；而倘若當Bad蛋白被如Akt、PKA、Raf1、Rsk1、Pak1等蛋白磷酸化後，Bad蛋白則不具活性，因而無法與Bcl-2家族蛋白形成二聚體，自無法誘導細胞凋亡程序之發生。另如當Fas接受器(Fas receptor)與Fas配體(Fas ligand)結合時，Fas接受器細胞質部份係與Fas相 關死亡受體蛋白(Fas-associating protein with death domain，FADD)及未活化之凋亡蛋白酶8形成死亡訊息複體(Death-inducing signaling complex，DISC)，透過蛋白水解酶作用產生活化態之凋亡蛋白酶8，用以切除Bid蛋白N端，形成截短Bid蛋白(truncated Bid，tBid)而轉位至粒線體上，與其他促進凋亡的蛋白交互作用，使粒線體之膜電位改變，並且促使粒線體釋放細胞色素c，活化凋亡蛋白酶3，造成細胞凋亡。
以下，藉由若干實例並搭配圖式更進一步說明本發明。
實例一：製備心肌細胞損傷模式小鼠
取複數隻八周齡雄性Wistar鼠適應兩週，隨機分為五組，每組10隻，於不同條件下飼養八週，其中，第一組係作為控制組，投予正常飲食及一般水；第二組係餵食高熱量飼料；第三組係餵食高熱量飼料以及低劑量之本發明所揭乳酸菌組合物；第四組係餵食高熱量飼料以及中劑量之本發明所揭乳酸菌組合物；第五組係餵食高熱量飼料以及高劑量之本發明所揭乳酸菌組合物。
本發明所揭乳酸菌組合物之添加劑量算法，其係依據體重60kg之成人除以受試物之每日人體建議攝取量而得到每公斤體重之建議攝取量。將每公斤體重之建議攝取量乘以實驗動物相對於人體之代謝係數，可得實驗動物每日之攝取劑量，其中，大白鼠相對於人體之代謝係數為6.25。據此，高劑量係為每天餵食每隻老鼠0.1683公克；中劑量係為每天餵食每隻老鼠0.0168公克；低劑量則為每天餵食每隻老鼠0.0017公克。
實例二：本發明所揭乳酸菌組合物係能縮小心肌細胞間之間 隙及改善心肌細胞纖維化之情形
將實例一中飼養八週後之各組小鼠犧牲，摘取各該小鼠之心臟檢體，以冷磷酸鹽緩衝液放血並且沖洗乾淨，移除各該心臟檢體上殘餘之脂肪組織及血管部份，再將多餘水分去除。將各該組小鼠之心臟組織以10%福馬林固定至少24小時，進行脫水程序如下：先將固定之左心室心臟組織浸泡於磷酸鹽緩衝液中約30分鐘，再浸泡於0.85%氯化鈉中約30分鐘，而後將各該心臟組織以濃度為70%、85%、95%及100%之酒精分別浸泡15、30、30及30分鐘，其中，浸泡於70%及100%酒精中之步驟須重複兩次，並且使用新鮮酒精而使各該心臟組織充分脫水。
將脫水完成之各該心臟組織浸泡於100%二甲苯(xylene)中約30分鐘，重複一次後，再浸泡於以1：1比例混合之二甲苯及石蠟溶液中，於溫度60℃下處理約45分鐘，而後於溫度60℃下浸泡在100%石蠟約20分鐘而重複3次，即完成各該心臟組織之包埋。
將包埋完成之各該組心臟組織進行切片，厚度約為0.2μm，脫蠟後而分別將各該組心臟組織切片以蘇木紫-伊紅(hematoxylin and eosin)以及梅生三色染色法(masson trichrome staining)進行染色，觀察各該組小鼠之心肌細胞排列形式，結果分別如第一圖及第二圖所示，其中，各該圖A至E係分別依序代表第一組至第五組之心臟組織切片染色結果。
由第一圖之結果顯示，第二組小鼠心肌細胞間之間隙係明顯大於第一組小鼠心肌細胞間之間隙；相較於第一組小鼠，第三組至第五組小鼠心肌細胞間之間隙分別較小，並且小鼠心肌細胞間之間 隙係隨著餵食本發明所揭乳酸菌組合物劑量之增加而縮小。
由第二圖之結果顯示，第二組小鼠心肌細胞間之間隙不僅增加，並且有部份纖維化之情形發生，如第二圖B中藍紫色部位所示；而第三組至第五組小鼠之心臟組織纖維化之情形係較第二組者減少。
由上可知，第二組小鼠心臟組織有受拉扯變形之情形發生，並且纖維化情形嚴重，確實為心肌損傷模式小鼠；再者，本發明所揭乳酸菌組合物係具有縮小心肌細胞間隙以及減緩心臟組織纖維化之功效，並且隨著餵食劑量增加而使效果越佳。
實例三：本發明所揭乳酸菌組合物係能抑制心肌細胞凋亡
取各該組小鼠之左心室組織約0.1公克，加入均質緩衝液(Homogenization Buffer)，以4℃、轉速12000rpm進行離心40分鐘，將上清液置於-80℃冰箱之沈澱一夜後，再以4℃、轉速12000rpm進行離心40分鐘，取得其上清液，即為各該組心臟組織之蛋白萃取液。
取各該組小鼠心臟組織之蛋白萃取液以西方墨點法(Western blotting)觀察並且測定各組小鼠心臟組織中FADD蛋白、截短Bid蛋白、凋亡蛋白酶8、Bad蛋白、磷酸化Bad(p-Bad)蛋白、Bcl-2蛋白、Bcl-xL蛋白、凋亡蛋白酶3、p-IGF1接受器、磷酸化PI3K(p-PI3K)蛋白、磷酸化Akt(p-Akt)蛋白之表現量，結果如第三圖至第十圖所示。
由第三圖可知，FADD蛋白表現量於第二組之表現量係較第一組上升，而第三組至第五組之FADD蛋白表現量係較第二組之FADD蛋白 表現量低。
由第四及五圖之結果可知，截短Bid蛋白與活化態之凋亡蛋白酶8分別於第二組小鼠心臟組織中大量表現，而截短Bid蛋白與活化態之凋亡蛋白酶8分別於第三組至第五組小鼠心臟細胞中有顯著低於第二組之表現量，其中又以於第五組中之表現量為最低。
由第六圖之結果可知，相較於第一組，第二組之心臟組織中Bad蛋白表現量係升高，而去磷酸化之Bad蛋白表現量係降低；第三組至第五組之心臟組織中Bad蛋白表現量分別顯著低於第二組，並且去磷酸化之Bad蛋白表現量係較第二組增加。
由第七圖之結果可知，相較於第一組，第二組之心臟組織中與粒線體有關之Bcl-2蛋白及Bcl-xL蛋白表現量皆為較高；而Bcl-2蛋白或Bcl-xL蛋白表現量於第三組至第五組係分別顯著高於第二組。
由第八圖之結果可知，活化態之凋亡蛋白酶3於第二組小鼠心臟組織之表現量係高於第一組，而相較第二組心臟組織中大量表現凋亡蛋白酶3，第三組至第五組心臟組織中凋亡蛋白酶3之表現量皆顯著下降。
由第九及十圖之結果可知，於第二組心臟細胞中，磷酸化IGF1接受器、磷酸化PI3K蛋白、磷酸化Bad蛋白或磷酸化Akt蛋白之表現量係低於第一組，而第三組至第五組心臟組織中p-IGF1接受器、磷酸化PI3K蛋白、磷酸化Bad蛋白或磷酸化Akt蛋白之表現量係分別高於第二組。
由第三圖至第十圖之結果顯示，餵食本發明所揭乳酸菌 組合物係會抑制細胞凋亡路徑上之蛋白表現，如FADD蛋白、截短Bid蛋白、Bad蛋白、凋亡蛋白酶8、凋亡蛋白酶3，使如Bcl-2蛋白、Bcl-xL蛋白或磷酸化Bad蛋白等之抗細胞凋亡蛋白表現增加，並且活化存活路徑上之PI3K蛋白或磷酸化Akt蛋白，使之表現增加。據此，本發明所揭乳酸菌組合物係能有效減少心肌細胞凋亡發生，達到保護心臟細胞之功效。
由上述說明可知，本發明所揭乳酸菌組合物確實具有改善及保護心臟組織損傷或是心肌凋亡之功效，因而作為治療或預防心血管疾病醫藥組合物之有效成份，或是製備成為一食品，作為日常保健之用。

Claims (1)

  1. 一種使用乳酸菌組合物作為製備治療及/或預防心臟衰竭之醫藥組合物之用途，其中，該乳酸菌組合物係包含有鼠李乳酸桿菌LCR177(Lactobacillus rhamnosus LCR177)BCRC910473、乳酸片球菌PA318(Pediococcus acidilactici PA318)BCRC910474以及青春雙岐桿菌(Bifidobacterium adolescentis)BCRC14609，而心臟衰竭係由心肌凋亡所引發者。
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