TWI564017B - 紅茄綠果醇類萃取區分物用於製備兼具抑菌及抑制黑色素生成的外用組成物之用途 - Google Patents

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紅茄綠果醇類萃取區分物用於製備兼具 抑菌及抑制黑色素生成的外用組成物之用途
本發明是有關於一種植物萃取區分物之用途，特別是有關於一種紅茄綠果醇類萃取區分物用於製備兼具抑菌及抑制黑色素生成的外用組成物之用途。
青春痘，又稱為「痤瘡」(acne)，主要好發於十二歲到三十歲左右的患者，其產生是由多種因素相互影響而造成，這些因素包括雄性素(androgen)分泌增加、刺激皮脂(sebum)異常分泌過多、毛囊皮脂腺導管開口處角化過度、痤瘡桿菌(Propionibacterium acnes)過度增殖、以及皮囊與毛囊周圍的發炎反應而引起。
當皮膚發炎時，亦刺激黑色素細胞產生黑色素，而黑色素則是由酪胺酸酶催化而生成。當青春痘痊癒後，黑色素會沉著，使得皮膚看起來變紅、黑，發炎的皮膚曬過太陽後更為明顯。
植物中的天然抗菌成份多為廣效性，比起化學合成之殺菌藥劑，毒性較低且副作用也較小，又不易產生抗藥性。
現今市售外用產品，例如化妝品或皮膚外用醫藥品，其抑菌或抑制黑色素生成之有效成份多屬化學合成化合物，一般毒性較高、副作用也較高且容易產生抗藥性。然而，單一的天然抗菌成份雖然毒性及副作用較低，但抑菌或抑制黑色素生成的效果有限。
有鑑於此，亟需發展一種適用於化妝品或皮膚外用醫藥品之天然成份，以改善習知天然抗菌成份效果不足的缺點。
因此，本發明之一態樣是在提供一種紅茄綠果甲醇萃取區分物用於製備兼具抑菌及抑制黑色素生成外用組成物之用途，其中紅茄綠果甲醇萃取區分物為有效成份，以於體外抑制微生物的生長以及抑制黑色素的生成。
本發明之另一態樣係在提供一種利用紅茄綠果甲醇萃取區分物於體外抑制微生物生長的方法，其係利用上述紅茄綠果甲醇萃取區分物，以於體外抑制環境微生物或痤瘡微生物的生長。
本發明之又一態樣係在提供一種利用紅茄綠果甲醇萃取區分物於體外抑制黑色素生成的方法，其係利用上述紅茄綠果甲醇萃取區分物，以於體外抑制酪胺酸酶之活性 或抑制黑色素瘤細胞之黑色素的生成。
根據本發明之上述態樣，提出一種紅茄綠果甲醇萃取區分物用於製備兼具抑菌及抑制黑色素生成外用組成物之用途。在一實施例中，前述兼具抑菌及抑制黑色素生成的外用組成物可包括紅茄綠果甲醇萃取區分物以及化妝品或醫藥學上可接受之載劑，其中紅茄綠果甲醇萃取區分物為有效成份，而兼具抑菌及抑制黑色素生成的外用組成物可包括0.04mg/mL至2.0mg/mL之紅茄綠果甲醇萃取區分物，以於體外抑制微生物的生長以及抑制黑色素的生成。前述紅茄綠果甲醇萃取區分物可由紅茄(Solanum integrifolium Poir.)之未熟綠果依序經乙醇粗萃取步驟、第一劃分步驟以及第二劃分步驟而得，第一劃分步驟可利用水/乙酸乙酯進行，且第二劃分步驟可利用甲醇/正己烷進行。
根據本發明之另一態樣，提出一種利用紅茄綠果甲醇萃取區分物於體外抑制微生物生長的方法，其中紅茄綠果甲醇萃取區分物之有效濃度可例如為0.04mg/mL至0.1mg/mL，且紅茄綠果甲醇萃取區分物可由紅茄之未熟綠果依序經乙醇粗萃取步驟、第一劃分步驟以及第二劃分步驟而得此甲醇萃取區分物具有複數種活性，以於體外抑制環境微生物或痤瘡微生物的生長。
依據本發明一實施例，上述環境微生物可例如為大腸桿菌(Escherichia coli)、沙門氏豬霍亂桿菌(Salmonella choleroaesuis)、綠膿桿菌(Pseudomonas aeruginosa)或仙人掌桿菌(Bacillus cereus)。
依據本發明一實施例，上述痤瘡微生物可例如為痤瘡丙酸桿菌(Propionibacterium acnes)或金黃色葡萄球菌(Staphyloccoccus aureus)。
根據本發明之又一態樣，提出一種利用紅茄綠果甲醇萃取區分物於體外抑制黑色素生成的方法，其中紅茄綠果甲醇萃取區分物之有效濃度可例如為0.4mg/mL至2.0mg/mL，且紅茄綠果甲醇萃取區分物係由紅茄之未熟綠果依序經乙醇粗萃取步驟、第一劃分步驟以及第二劃分步驟而得，以於體外抑制酪胺酸酶之活性或抑制黑色素瘤細胞之黑色素生成之活性。
應用本發明紅茄綠果甲醇萃取區分物用於製備兼具抑菌及抑制黑色素生成的外用組成物之用途，其係依序利用水/乙酸乙酯以及甲醇/正己烷，對紅茄之未熟綠果進行劃分步驟，由甲醇層所得之甲醇萃取區分物具有複數種活性，可於體外抑制微生物的生長且抑制黑色素生成，進而應用於製備兼具抑菌及抑制黑色素生成的外用組成物。
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為讓本發明之上述和其他目的、特徵、優點與實施例能更明顯易懂，所附圖式之詳細說明如下：【圖1A與圖1B】係繪示利用本發明實施例1之紅茄綠果甲醇萃取區分物對數個微生物菌液濃度之抑制率直條圖。
【圖2】係繪示利用本發明實施例1之紅茄綠果甲醇萃取區分物對B16細胞存活率的直條圖。
【圖3】係繪示利用本發明實施例1之紅茄綠果甲醇萃取區分物抑制B16細胞之細胞內黑色素直條圖。
【圖4】係繪示利用本發明實施例1之紅茄綠果甲醇萃取區分物對洋菇酪胺酸酶之雙倒數圖。
承前所述，本發明提供一種紅茄綠果甲醇萃取區分物用於製備兼具抑菌及抑制黑色素生成的外用組成物之用途，其中紅茄綠果甲醇萃取區分物是依序經乙醇粗萃取步驟以及數個劃分步驟而得。
本發明此處所稱「紅茄(Solanum integrifolium Poir)」為茄科一年生草本植物，具有消炎鎮痛及散淤消腫的功效，原產於非洲地區、南美巴西及秘魯等地。目前台灣只限於花蓮地區的原住民喜歡栽種及食用。紅茄果實為扁圓形漿果，徑約6-8公分，有4-6瓣深裂，果面有革質亮光，單果重10-15公克。在一實施例中，本發明之紅茄係於夏季(6-8月)由花蓮區農業改良場所取得。
本發明此處所稱紅茄之「未熟綠果」係指淺綠色嫩果。一般而言，未熟綠果可生食或用於料理中，成熟後逐漸由綠色(綠果)變橙色或猩紅色(紅果)，老果變為暗紅色。紅茄果形奇特，不僅可觀賞、作為花藝材料，還可藥用，具有消炎鎮痛、散淤消腫的功效，民間認為可治胃痛、淋巴 結核、腋窩生瘡等病症。
在一實施例中，本發明提供一種紅茄綠果甲醇萃取區分物用於製備兼具抑菌及抑制黑色素生成的外用組成物之用途。在一實施例中，前述兼具抑菌及抑制黑色素生成的外用組成物可包括紅茄綠果甲醇萃取區分物以及化妝品或醫藥學上可接受之載劑，其中紅茄綠果甲醇萃取區分物為有效成份，而兼具抑菌及抑制黑色素生成的外用組成物可包括0.04mg/mL至2.0mg/mL之紅茄綠果甲醇萃取區分物，以於體外抑制微生物的生長以及抑制黑色素的生成。
在上述實施例中，紅茄綠果甲醇萃取區分物可以選擇性先將紅茄之未熟綠果切成小塊，然後以不高於例如60℃之溫度下，進行乾燥步驟，而形成果乾。在其他實施例中，前述乾燥步驟亦可於40至60℃之溫度下進行，然以於約50℃之溫度下進行為較佳。本發明所屬技術領域中任何具有通常知識者應可理解的是，倘若以高於60℃之溫度進行乾燥步驟，紅茄綠果原本所含之活性成份將會被破壞或者有效含量會降低，則後續所得之醇類萃取區分物，無法以特定有效含量達成抑制微生物的生長且抑制黑色素生成的功效。
接著，對上述果乾進行粉碎步驟，在一實施例中，可利用市售粉碎機，使前述果乾形成粗粉，以便於後續進行粗萃取步驟以及多個劃分步驟，因此粗粉的粒徑不拘。
在粉碎步驟之後，可使用乙醇對前述粗粉進行至少一次之粗萃取步驟，以獲得乙醇粗萃物。在一實施例 中，前述粗粉與乙醇之比例可為1(kg)：15(L)至1(kg)：20(L)，然以1(kg)：16.7(L)為較佳，以獲得乙醇粗萃物。粗萃取步驟可重覆進行1至3次，以合併乙醇粗萃物。
在粗萃取步驟之後，利用等體積之水與乙酸乙酯對前述乙醇粗萃物進行至少一次之第一劃分步驟，以由乙酸乙酯層獲得乙酸乙酯萃取區分物。第一劃分步驟可重覆進行1至3次，以合併乙酸乙酯萃取區分物。
在第一劃分步驟之後，利用等體積之甲醇與正己烷對前述乙酸乙酯萃取區分物進行至少一次之第二劃分步驟，以由甲醇層獲得甲醇萃取區分物。第二劃分步驟可重覆進行1至3次，以合併甲醇萃取區分物。
本發明以特定溶劑配合特定萃取及特定劃分的流程，由紅茄綠果獲得甲醇萃取區分物，經證實具有複數種活性，可於體外抑制微生物的生長以及抑制黑色素的生成。在一實施例中，前述所得之紅茄綠果甲醇萃取區分物可包含但不限於多酚類。在一實施例中，上述紅茄綠果甲醇萃取區分物可於體外抑制環境微生物或痤瘡微生物，其中環境微生物可包括但不限於大腸桿菌(Escherichia coli)、沙門氏豬霍亂桿菌(Salmonella choleroaesuis)、綠膿桿菌(Pseudomonas aeruginosa)或仙人掌桿菌(Bacillus cereus)，而痤瘡微生物可例如為痤瘡丙酸桿菌(Propionibacterium acnes)或金黃色葡萄球菌(Staphyloccoccus aureus)。
其次，上述紅茄綠果甲醇萃取區分物亦可於體 外抑制該黑色素的生成。在一實施例中，上述紅茄綠果甲醇萃取區分物具有抑制酪胺酸酶之活性以及抑制黑色素瘤細胞B16細胞之黑色素生成之活性，藉此抑制該黑色素的生成。在一例示中，前述之黑色素瘤細胞可例如為B16細胞。
另外，上述紅茄綠果甲醇萃取區分物可應用於製備兼具抑菌及抑制黑色素生成的外用組成物。在應用時，前述外用組成物可包括0.04mg/mL至2.0mg/mL之紅茄綠果甲醇萃取區分物作為有效成份，以及化妝品或醫藥學上可接受之載劑，藉此於體外抑制微生物的生長以及抑制黑色素的生成。
在一例示中，當前述外用組成物用於體外抑制微生物的生長時，前述外用組成物可包括0.04mg/mL至0.1mg/mL之紅茄綠果甲醇萃取區分物，以抑制前述環境微生物及痤瘡微生物之生長。在另一例示中，當前述外用組成物用於抑制黑色素的生成時，前述外用組成物可包括0.4mg/mL至2.0mg/mL之紅茄綠果甲醇萃取區分物，以抑制酪胺酸酶之活性以及抑制B16細胞之黑色素生成之活性。
在一些實施例中，本發明提供一種利用上述紅茄綠果甲醇萃取區分物於體外抑制微生物生長的方法，其係利用有效濃度例如0.04mg/mL至0.1mg/mL之上述紅茄綠果甲醇萃取區分物，以於體外抑制環境微生物或痤瘡微生物的生長。
在其他實施例中，本發明提供一種利用紅茄綠果甲醇萃取區分物於體外抑制黑色素生成的方法，其係利用 有效濃度例如0.4mg/mL至2.0mg/mL之紅茄綠果甲醇萃取區分物，以於體外抑制酪胺酸酶之活性或抑制黑色素瘤細胞之黑色素生成之活性。
本發明以特定萃取方式，由紅茄綠果獲得甲醇萃取區分物作為有效成份，證實紅茄綠果甲醇萃取區分物具有複數種活性，可於體外抑制微生物的生長以及抑制黑色素的生成。
以下利用數個實施例以說明本發明之應用，然其並非用以限定本發明，本發明技術領域中具有通常知識者，在不脫離本發明之精神和範圍內，當可作各種之更動與潤飾。
實施例1：製備紅茄綠果甲醇萃取區分物
此實施例是參考2014年7月15日公開之「Anti-Inflammatory Effect and Mechanism of the Green Fruit Extract of Solanum integrifolium Poir.,BioMed Research International 2014；網址http：//dx.doi.org/10.1155/2014/953873」一文的方法，使用夏季(6-8月)由花蓮區農業改良場取得紅茄之未熟綠果，獲得紅茄綠果甲醇萃取區分物，其全文一併列為本發明之參考文獻。首先，將紅茄之未熟綠果切成小塊，然後於於50℃之溫度下，進行乾燥步驟，以形成果乾。接著，利用市售粉碎機進行粉碎步驟，以使前述果乾形成粗粉。在粉碎步驟之後，使用20L之乙醇對1.2kg之粗粉進行粗萃取步 驟，並重覆3次，以獲得乙醇粗萃物。然後，利用真空濃縮法合併3次粗萃取步驟之乙醇粗萃物(280g，回收率約23.3%)。
在粗萃取步驟之後，將真空乾燥後之乙醇粗萃物再懸浮於水中，並利用等體積之乙酸乙酯對前述乙醇粗萃物水溶液進行第一劃分步驟，並重覆3次，以由乙酸乙酯層獲得乙酸乙酯萃取區分物。然後，在55℃之溫度下，利用旋轉蒸發法合併3次第一劃分步驟之乙酸乙酯萃取區分物。
在第一劃分步驟之後，將旋轉蒸發後之乙酸乙酯萃取區分物再懸浮於甲醇中，並利用等體積之正己烷對前述乙酸乙酯萃取區分物甲醇溶液進行第二劃分步驟，並重覆3次，以由甲醇層獲得甲醇萃取區分物。
實施例2：評估紅茄綠果甲醇萃取區分物之抑菌效果
1.培養菌株
此實施例利用痤瘡丙酸桿菌(Propionibacterium acnes；P.acnes；寄存編號BCRC 10723)、金黃色葡萄球菌(Staphylococcus aureus subsp.aureus,S.aureus；寄存編號BCRC 12657)、大腸桿菌(Escherichia coli；E.coli；寄存編號BCRC 10675)、仙人掌桿菌(Bacillus cereus；B.cereus；寄存編號BCRC 10603)、綠膿桿菌(Pseudomonas aeruginosa；P.aeruginosa；寄存編號BCRC 10944)、沙門氏桿菌(Salmonella choleraesuis；S.choleraesuis；寄存編號 BCRC 10744)。以上菌株皆購自於台灣新竹食品工業發展研究所(Food Industry Research and Development Institute；FIRDI)生物資源保存及研究中心(Bioresource Collection and Research Center；BCRC)。
以上菌株可根據BCRC提供的方法或習知培養方法進行例行培養。首先，取0.1mL至0.2mL之菌體懸浮液滴入裝有胰化酪蛋白大豆培養基(Tryptone Soya Broth；TSB；SIGMA,USA)之試管隔夜培養。接著，以接種環沾取菌株懸浮液，以劃線法稀釋塗佈在營養瓊脂(nutrient agar；NA)平板的四區。為活化菌株及純化菌種，痤瘡丙酸桿菌(P.acnes)於37℃厭氧培養3-4天；金黃色葡萄球菌(S.aureus)、大腸桿菌(E.coli)、綠膿桿菌(P.aeruginosa)、沙門氏桿菌(S.choleraesuis)則於37℃隔夜培養；而仙人掌桿菌(B.cereus)於30℃隔夜培養。在進行抑菌試驗時，從NA平板取單一菌落至含有TSB培養液的試管進行隔夜培養後，進行以下測試。
2.評估紅茄綠果甲醇萃取區分物抑制菌體生長之效果
2.1.抑制菌液濃度試驗
此實施例是利用0.1mg/mL的紅茄綠果甲醇萃取區分物，評估對環境中常見之微生物(如大腸桿菌、綠膿桿菌、沙門氏桿菌、仙人掌桿菌)以及痤瘡相關之微生物(如痤瘡丙酸桿菌、金黃色葡萄球菌)之抗菌活性。
首先，取180μL之菌體濃度105至107 CFUs/mL的菌液(含TSB培養液)至96孔(well)細胞培養盤，再分別加入20μL實施例1之紅茄綠果甲醇萃取區分物(1mg/mL)，痤瘡丙酸桿菌(P.acnes)於37℃厭氧培養3-4天；金黃色葡萄球菌(S.aureus)、大腸桿菌(E.coli)、綠膿桿菌(P.aeruginosa)、沙門氏桿菌(S.choleraesuis)則於37℃隔夜培養；而仙人掌桿菌(B.cereus)於30℃隔夜培養。
各菌株經上述培養後，取出96孔細胞培養盤，分別由各孔中取10μL菌液用磷酸鹽緩衝液作連續稀釋，再以傾注法(pour plate)倒於培養皿計數培養基(plate count agar；PCA)上，待凝固後，將金黃色葡萄球菌(S.aureus)、大腸桿菌(E.coli)、綠膿桿菌(P.aeruginosa)、沙門氏桿菌(S.choleraesuis)之培養皿倒置於37℃ 18至24小時培養；痤瘡丙酸桿菌(P.acnes)倒置後，在37℃厭氧培養3-4天；而仙人掌桿菌(B.cereus)於30℃ 18至24小時培養。培養後，計算菌落數，再乘以稀釋倍數而得到總活菌數(CFUs/mL)，並利用下式(I)計算出抑制率(%)，其結果如圖1A與圖1B。
請參閱圖1A與圖1B，其係繪示利用本發明實施例1之紅茄綠果甲醇萃取區分物對數個微生物菌液濃度之抑制率直條圖。由結果顯示，實施例1之紅茄綠果甲醇萃取區分物於體外確實可抑制上述六種菌株的生長，其中對痤 瘡丙酸桿菌(P.acnes)與金黃色葡萄球菌(S.aureus)之抑菌效果較佳，其中對痤瘡丙酸桿菌之抑制率為92.04%，對金黃色葡萄球菌之抑制率為79.09%；對於大腸桿菌(E.coli)及沙門氏桿菌(S.choleraesuis)之抑菌效果次之，其中對大腸桿菌之抑制率為71.46%，對沙門氏桿菌之抑制率為53.48%；而對於綠膿桿菌(P.aeruginosa)及仙人掌桿菌(B.cereus)的抑菌效果則再次之，其中對綠膿桿菌之抑制率為32.41%，對仙人掌桿菌之抑制率為23.85%。因此，紅茄綠果甲醇萃取區分物於體外確實可抑制上述微生物的生長。
2.2最小抑菌濃度(MIC)試驗
本發明此處所稱之最小抑菌濃度(minimal inhibitory concentrations；MICs)係指待測物抑制細菌生長所需的最小濃度。在此實施例中，首先，取180μL之菌體濃度105至107CFUs/mL的菌液(含TSB培養液)至96孔細胞培養盤，再分別加入20μL不同濃度之實施例1紅茄綠果甲醇萃取區分物、95%酒精及磷酸鹽緩衝液，痤瘡丙酸桿菌(P.acnes)在37℃厭氧培養3-4天，而金黃色葡萄球菌(S.aureus)則於37℃隔夜培養。
各菌株經上述培養後，取出96孔細胞培養盤，分別由各孔中取10μL菌液用磷酸鹽緩衝液作連續稀釋，再以傾注法倒於PCA上，待凝固後，金黃色葡萄球菌(S.aureus)之培養皿倒置於37℃隔夜培養；痤瘡丙酸桿菌(P. acnes)倒置後，在37℃厭氧培養3-4天。培養後，計算菌落數，再乘以稀釋倍數而得到總活菌數(CFUs/mL)，並利用上式(I)計算出抑制率(%)，其結果如表1所示。
請參閱表1，其係顯示利用本發明實施例1之紅茄綠果甲醇萃取區分物對痤瘡丙酸桿菌與金黃色葡萄球菌之最小抑菌濃度(MIC)。由結果顯示，以較低濃度的實施例1紅茄綠果甲醇萃取區分物確實可於體外有效抑制上述二種菌株的生長，其中對於痤瘡丙酸桿菌(P.acnes)與金黃色葡萄球菌(S.aureus)之MIC分別為0.04mg/mL與0.05mg/mL。
實施例3：評估紅茄綠果甲醇萃取區分物抑制黑色素生成的效果
1.細胞株培養
本實施例使用的細胞株為黑色素瘤細胞B16-F10(BCRC 60031)，是源於小鼠皮膚的黑色素瘤細胞，購自於台灣新竹食品工業發展研究所(FIRDI)生物資源保存及研究中心(BCRC)。
以上細胞株可根據BCRC提供的方法或習知培養方法進行例行培養。細胞生長之培養液為杜貝可改良的伊格氏培養液(Dulbecco’s modified Eagle’s medium；DMEM)，其含有10%胎牛血清(fetal bovine serum；FBS)，於37℃、5% CO2的恆溫培養箱培養2-3天，待細胞生長至培養皿的八、九分滿即進行繼代培養。
2.細胞存活率分析(MTT assay)
MTT[3-(4,5-Dimethylthiazol-2-yl)-2,5-di phenyltetrazolium bromide]為黃色化合物，是一種接受氫離子的染料，可作用於活細胞線粒體中的呼吸鏈，在琥珀酸脫氫酶(SDH)及細胞色素C的作用下，四氮唑環會開裂生成紫色的甲臢(formazan)結晶。因為紫色結晶的生成量與活細胞數目成正比，利用DMSO將紫色甲臢結晶溶解出來後，再利用吸光度的測定去評估存活細胞數量，可評估待測物對細胞生長的影響。
此實施例將含有B16細胞株(1x105cells/mL，每孔1mL)的DMEM培養液分別置入6孔細胞培養盤，每孔添加20μL的2mM酪胺酸(tyrosine)後，再分別加入10μL的50μg/mL或100μg/mL實施例1之紅茄綠果甲醇萃取區分物。培養3天後，取出培養液，每孔加入100μL/well MTT溶液後反應2至4小時。之後，離心去除上清液，於每孔加入200μL的DMSO溶解紫色結晶，再與離心後的細胞沉澱物(pellet)均勻混合後，取100μL至96孔細 胞培養盤，利用ELISA Reader測定實驗組與對照組的OD550nm，並利用下式(II)計算出細胞存活率(%)，其結果如圖2所示。
請參閱圖2，其係繪示利用本發明實施例1之紅茄綠果甲醇萃取區分物對B16細胞之存活率直條圖。由結果顯示，相較於未加紅茄綠果甲醇萃取區分物的對照組相比，添加50μg/mL及100μg/mL的實施例1紅茄綠果甲醇萃取區分物，B16細胞之存活率皆為89.5%，表示紅茄綠果甲醇萃取區分的濃度為50μg/mL至100μg/mL時，不具細胞毒性。
3.抑制細胞內黑色素生成之試驗
此實施例將含有B16細胞株(1x105cells/mL，每孔1mL)的DMEM培養液分別置入6孔細胞培養盤，每孔添加20μL的2x(2mM)酪胺酸(tyrosine)後，再分別加入10μL的50μg/mL或100μg/mL實施例1之紅茄綠果甲醇萃取區分物。培養3天後，利用刮勺將每孔貼壁的細胞刮起後，移至1.5mL離心管(eppendorf)離心5分鐘並去除上清液後，再用1mL的PBS清洗一次。然後，加入100μL的1N NaOH水溶液，在80℃水浴中處理1小時，以打破細胞並釋放出細胞內黑色素。之後，取100μL反應物至96孔細胞培養盤，利用ELISA Reader測定實驗組與 對照組的OD405nm，並利用下式(III)計算出細胞內黑色素含量(%)，其結果如圖3所示。
請參閱圖3，其係繪示利用本發明實施例1之紅茄綠果甲醇萃取區分物抑制B16細胞之細胞內黑色素的直條圖。由結果顯示，相較於未加紅茄綠果甲醇萃取區分物的對照組(細胞內黑色素含量為100%)相比，添加50μg/mL及100μg/mL的實施例1紅茄綠果甲醇萃取區分物，B16細胞之細胞內黑色素含量分別為83.6%以及64.1%，表示當紅茄綠果甲醇萃取區分的濃度越高，B16細胞之細胞內黑色素含量就趨於越低。
4.抑制洋菇酪胺酸酶活性之試驗
目前已知酪胺酸(tyrosine)經酪胺酸酶(tyrosinase)作用，會氫化生成L-DOPA，接著經酪胺酸酶作用而生成黑色素。
此實施例將實施例1之紅茄綠果甲醇萃取區分物與酪胺酸酶及酵素基質L-酪胺酸(L-tyrosine)共同作用，再偵測其作用溶液的吸光值，並以麴酸(Kojic acid)作為正對照組，來評估紅茄綠果甲醇萃取區分物抑制酪胺酸酶活性達百分之五十時的濃度(IC50)，其結果如表2。
請參閱表2，其係顯示利用本發明實施例1之紅茄綠果甲醇萃取區分物對B16細胞之存活率直條圖。由結果顯示，表二結果顯示，萃取物抑制酪胺酸酶活性達百分之五十濃度(IC50)為0.393+0.050mg/mL，而麴酸IC50則為0.003+0.000mg/mL，確實具有體外抑制酪胺酸酶活性之功效。
另外，為進一步釐清紅茄綠果甲醇萃取區分物對洋菇酪胺酸酶的抑制機轉，將96孔細胞培養盤置於冰上，每孔加入70μL的50mM磷酸緩衝液(pH6.5)，接著分別加入2μL溶劑、不同濃度的實施例1紅茄綠果甲醇萃取區分物(0.5mg/mL、2mg/mL)或麴酸(作為正對照組)，然後加入100μL不同濃度的L-酪胺酸(0.5、1、2、4mM/mL)。之後，將96孔細胞培養盤與洋菇酪胺酸酶溶液移至室溫(10℃至40℃)下回溫5分鐘後，再加入30μL酪胺酸酶溶液(100unit/mL)，在室溫下反應20分鐘。隨後，利用ELISA Reader測定實驗組與對照組的OD490nm，利用酵素動力學的雙倒數作圖法(Lineweaver-Burk plots)，判斷實施例1 之紅茄綠果甲醇萃取區分物對酪胺酸酶之抑制機轉，並計算出最大反應速率(Vmax；OD490nm/min)及米氏常數(Km；mM)，其結果如表3與圖4所示，其中Km值代表酵素對基質的親和力，當Km值越大，就表示酵素對基質的親和力越小；Vmax則指整個反應的最大反應速率，代表產物的生成率。
請參閱表3，其係顯示利用本發明實施例1之紅茄綠果甲醇萃取區分物對痤瘡丙酸桿菌與金黃色葡萄球菌之最小抑菌濃度(MIC)。由表3的結果顯示，紅茄綠果甲醇萃取區分物之濃度為0.5mg/mL時，Km值為1.20±0.005mM，Vmax則為0.031±0.0005(OD490nm/min)；而紅茄綠果甲醇萃取區分物之濃度為2.0mg/mL時，Km值為1.95±0.005mM，Vmax則為0.032±0.0005(OD490nm/min)。Km值隨抑制物濃度增加有越來越大趨勢，代表實施 例1之紅茄綠果甲醇萃取區分物可降低洋菇酪胺酸酶對基質(即L-酪胺酸)之親和力。
請參閱圖4，其係顯示利用本發明實施例1之紅茄綠果甲醇萃取區分物對洋菇酪胺酸酶之雙倒數圖，其中橫軸為酪胺酸濃度的倒數值，縱軸為最大反應速率(Vmax)的倒數值。直線401代表對照組(未添加紅茄綠果甲醇萃取區分物)之洋菇酪胺酸酶與酪胺酸濃度的結果，直線403及直線405分別代表添加0.5mg/mL及2.0mg/mL之紅茄綠果甲醇萃取區分物對洋菇酪胺酸酶與酪胺酸濃度的結果。
由圖4的結果顯示，實施例1之紅茄綠果甲醇萃取區分物與麴酸之Vmax值相當接近，幾乎相交於Y軸上，代表紅茄綠果甲醇萃取區分物對於酪胺酸酶的抑制作用傾向於競爭性抑制。
實施例4：評估紅茄綠果甲醇萃取區分物之總多酚含量
目前較普遍用於檢測抗氧化總多酚含量的方法是Folin-Ciocalteu比色法，其中Folin-Ciocalteu試劑的鎢鉬酸與總多酚化合物反應後會被還原，生成藍色化合物，且顏色的深淺與總多酚含量呈正相關，一般常以沒食子酸(gallic acid)作為標準品進行定量。
首先，將Na2CO3與原始濃度Folin-Ciocalteau試劑分別溶於二次去離子水(ddH2O)中，以配製成2% Na2CO3水溶液與12.5% Folin-Ciocalteau試劑。接著，以沒食子酸作為標準品，於96孔細胞培養盤之每孔加入20μL不同濃度的沒食子酸 (0、5、10、15、20、25、30、35μg/mL)或實施例1之紅茄綠果甲存萃取區分物(1mg/mL)，再加入10μL Folin-Ciocalteau試劑(12.5%)均勻混合反應10分鐘。然後，加入200μL Na2CO3水溶液(2%)均勻混合反應10分鐘。之後，利用ELISA Reader測定實驗組與對照組的OD620nm後，計算出標準曲線，藉此計算出實施例1之紅茄綠果甲醇萃取區分物相對於沒食子酸之總多酚含量。上述實施例1之每mg的紅茄綠果甲醇萃取區分物之總多酚含量為80μg GAE/mg dw(即每mg乾重之紅茄綠果甲醇萃取區分物含有相當於80μg之沒食子酸的總多酚含量)。
綜言之，由上述數個實施例證實，本發明依序利用水/乙酸乙酯以及甲醇/正己烷，對紅茄之未熟綠果進行劃分步驟，由甲醇層所得之甲醇萃取區分物，經實驗證實具有複數種活性，可抑制微生物的生長且抑制黑色素生成，進而應用於外用組成物。在其他實施例中，當上述紅茄綠果醇類萃取區分物應用於外用組成物時，以0.4mg/mL至2.0mg/mL之紅茄綠果甲醇萃取區分物，可於體外抑制微生物的生長以及抑制黑色素的生成。在一例子中，當前述外用組成物包括0.04mg/mL至0.1mg/mL之紅茄綠果甲醇萃取區分物時，可抑制前述環境微生物及痤瘡微生物之生長。在另一例示中，當前述外用組成物包括0.4mg/mL至2.0mg/mL之紅茄綠果甲醇萃取區分物時，可抑制酪胺酸酶之活性以及抑制B16細胞之黑色素生成之活性，當然亦兼具抑制前述環境微生物及痤瘡微生物之生長的功效。
需補充的是，本發明雖以特定的製程、特定的分析方法或特定儀器作為例示，說明本發明之紅茄綠果醇類萃取區分物及其製造方法與含彼之外用組成物，惟本發明所屬技術領域中任何具有通常知識者可知，本發明並不限於此，在不脫離本發明之精神和範圍內，本發明之紅茄綠果醇類萃取區分物亦可使用其他的製程、其他分析方法或其他儀器進行。
由上述實施例可知，本發明的紅茄綠果醇類萃取區分物及其製造方法，其優點在於依序利用水/乙酸乙酯以及甲醇/正己烷，對紅茄之未熟綠果進行劃分步驟，由甲醇層所得之甲醇萃取區分物，可有效抑制微生物的生長且抑制黑色素生成，進而應用於外用組成物。
雖然本發明已以數個實施例揭露如上，然其並非用以限定本發明，在本發明所屬技術領域中任何具有通常知識者，在不脫離本發明之精神和範圍內，當可作各種之更動與潤飾，因此本發明之保護範圍當視後附之申請專利範圍所界定者為準。

Claims (8)

  1. 一種紅茄綠果甲醇萃取區分物用於製備兼具抑菌及抑制黑色素生成的外用組成物之用途，其中該兼具抑菌及抑制黑色素生成的外用組成物包含該紅茄綠果甲醇萃取區分物以及一化妝品或醫藥學上可接受之載劑，該紅茄綠果甲醇萃取區分物為一有效成份，該兼具抑菌及抑制黑色素生成的外用組成物包括0.04mg/mL至2.0mg/mL之紅茄綠果甲醇萃取區分物，以於體外抑制一微生物的生長以及抑制黑色素的生成，且該紅茄綠果甲醇萃取區分物係由紅茄(Solanum integrifolium Poir.或Solanum aethiopicum L.)之未熟綠果依序經乙醇粗萃取步驟、一第一劃分步驟以及一第二劃分步驟而得，該第一劃分步驟利用水/乙酸乙酯進行，且該第二劃分步驟是利用甲醇/正己烷進行。
  2. 根據申請專利範圍第1項所述之紅茄綠果甲醇萃取區分物用於製備兼具抑菌及抑制黑色素生成的外用組成物之用途，其中該微生物為一環境微生物，且該環境微生物包括大腸桿菌(Escherichia coli)、沙門氏豬霍亂桿菌(Salmonella choleroaesuis)、綠膿桿菌(Pseudomonas aeruginosa)及仙人掌桿菌(Bacillus cereus)。
  3. 根據申請專利範圍第1項所述之紅茄綠果甲醇萃取區分物用於製備兼具抑菌及抑制黑色素生成的外用組成物之用途，其中該微生物為一痤瘡微生物，且該痤瘡微生物包括痤瘡丙酸桿菌(Propionibacterium acnes) 以及金黃色葡萄球菌(Staphyloccoccus aureus)。
  4. 根據申請專利範圍第2項或第3項所述之紅茄綠果甲醇萃取區分物用於製備兼具抑菌及抑制黑色素生成的外用組成物之用途，其中該外用組成物包括0.04mg/mL至0.1mg/mL之紅茄綠果甲醇萃取區分物。
  5. 根據申請專利範圍第1項所述之紅茄綠果甲醇萃取區分物用於製備兼具抑菌及抑制黑色素生成的外用組成物之用途，其中於體外抑制該黑色素的生成包括抑制酪胺酸酶之活性以及抑制B16細胞之黑色素生成之活性。
  6. 根據申請專利範圍第5項所述之紅茄綠果甲醇萃取區分物用於製備兼具抑菌及抑制黑色素生成的外用組成物之用途，其中該外用組成物包括0.4mg/mL至2.0mg/mL之紅茄綠果甲醇萃取區分物。
  7. 一種利用紅茄綠果甲醇萃取區分物於體外抑制微生物生長的方法，其中該紅茄綠果甲醇萃取區分物之一有效濃度為0.04mg/mL至0.1mg/mL，且該紅茄綠果甲醇萃取區分物係由紅茄之未熟綠果依序經乙醇粗萃取步驟、一第一劃分步驟以及一第二劃分步驟而得，以於體外抑制一環境微生物或一痤瘡微生物的生長，且其中該第一劃分步驟利用水/乙酸乙酯進行，且該第二劃分步驟是利用甲醇/正己烷進行。
  8. 根據申請專利範圍第7項所述之利用紅茄綠果甲醇萃取區分物於體外抑制微生物生長的方法，其中該微生物包括大腸桿菌、沙門氏豬霍亂桿菌、綠膿桿菌、 仙人掌桿菌、痤瘡丙酸桿菌以及金黃色葡萄球菌。
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L Wang,et al."Anti-Inflammatory Effect and Mechanism of the Green Fruit Extract of Solanum integrifolium Poir.",Hindawi Publishing Corporation BioMed Research International Volume 2014, Article ID 953873, 11 pages. *

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