TWI551288B - Antimicrobial activity enhancer for chemotherapeutic agents - Google Patents

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Description

化學療法劑之抗腫瘤活性增強劑
本發明係關於含有支鏈胺基酸之用以增強對包含癌幹細胞之癌的化學療法劑之抗腫瘤活性之劑、含有支鏈胺基酸之用以誘導癌幹細胞之分化之劑、組合支鏈胺基酸與化學療法劑而成之包含癌幹細胞之癌轉移/復發的抑制或治療劑等。
癌幹細胞係腫瘤中所含之癌細胞次群體之一，具有自我複製能力及多分化能力，進行同域性移入後時，具有致癌能力(非專利文獻1)。
於各種癌中，已知癌幹細胞存在有特異表現之標記(marker)，基於該等標記的表現，可評估癌細胞是否為癌幹細胞。肝臟癌幹細胞之標記已知有EpCAM、AFP等(非專利文獻2)。大腸癌幹細胞之標記已知有CD44、CD24等(非專利文獻3)。乳癌幹細胞之標記已知有CD44、CD24、EpCAM等(非專利文獻1)。
癌幹細胞一般而言，增殖速度慢，因此對化學療法劑會顯現抗性。相對於此，分化後的癌細胞(癌非幹細胞)，其增殖速度快，因此對化學療法劑的感受性高。化學療法劑中許多是以癌細胞之增殖機制為標的，因此化學療法劑之治療中，僅針對癌非幹細胞為標的，可能無法有效地殺傷癌幹細胞。因此，即使藉由化學療法劑之治療使大部 分的癌細胞退縮，只要有極少數的癌幹細胞殘留，則可能復發，此可認為是癌常見產生轉移/復發的原因。因此，只要能夠促進癌幹細胞朝向癌非幹細胞的分化，使對化學療法劑的感受性提高，期待能夠有效地治療或預防包含癌幹細胞之癌整體。
支鏈胺基酸(BCAA)至今已被報告會抑制肝癌的發生或進展(專利文獻1~4)。進一步，已被報告藉由長期投予支鏈胺基酸，會抑制肝細胞癌的復發(非專利文獻4)。又，支鏈胺基酸藉由抑制Akt之活化，會抑制顯示高胰島素血症或具有高胰島素血症危險性之患者中之癌的發生或進展(專利文獻5)。又，已報告支鏈胺基酸會增強IFN作用物質之抗C型肝炎病毒活性(專利文獻6)。
但是，支鏈胺基酸對於癌幹細胞朝向癌非幹細胞之分化的效果，至今尚未明朗。
[先前技術文獻] [專利文獻]
[專利文獻1]WO2003/16208
[專利文獻2]WO2004/058243
[專利文獻3]WO2007/018278
[專利文獻4]WO2006/06729
[專利文獻5]WO2007/018281
[專利文獻6]WO2007/013677
[非專利文獻]
[非專利文獻1]PNAS,vol.100,No.7,pages 3983-3988,2003
[非專利文獻2]Cancer Research,vol.65,No.8,pages 1451-1461,2008
[非專利文獻3]PNAS,vol.171,No.8,pages 3722-3727,2010
[非專利文獻4]日消誌(日本消化器病學會雜誌)，vol.105、pages 808-816,2008
本發明係開發促進癌幹細胞朝向癌非幹細胞的分化、且提高對化學療法劑之感受性的技術，並且基於此，提供有效地治療包含癌幹細胞之癌、且預防癌復發的手段。
本發明者等人，為了解決上述課題重複戮力研究的結果，發現特定之BCAA會促進癌幹細胞朝向癌非幹細胞的分化、且提高對化學療法劑的感受性，因而完成本發明。
亦即，本發明係如下所述。
[1]一種對包含癌幹細胞之癌用以增強化學療法劑之抗腫瘤活性之劑，其係含有由異白胺酸、白胺酸及纈胺酸中選出之至少一種支鏈胺基酸或其鹽。
[2]如[1]之劑，其係對於罹患包含癌幹細胞之癌的 哺乳動物、或曾經罹患過包含癌幹細胞之癌的哺乳動物，與化學療法劑組合來投予。
[3]如[1]之劑，其係含有異白胺酸或其鹽、白胺酸或其鹽、及纈胺酸或其鹽。
[4]如[1]之劑，其中化學療法劑為代謝拮抗劑、烷化劑、抗癌性抗生素、植物鹼、或分子標的治療劑。
[5]如[1]之劑，其中化學療法劑為5FU。
[6]如[1]之劑，其中包含癌幹細胞之癌為化學療法劑抗性之癌。
[7]如[1]之劑，其中包含癌幹細胞之癌為胃癌、肝癌、乳癌或大腸癌。
[8]一種用以治療包含癌幹細胞之癌之劑，其係使由異白胺酸、白胺酸及纈胺酸中選出之至少一種支鏈胺基酸或其鹽；與化學療法劑組合而成。
[9]如[8]之劑，其係含有異白胺酸或其鹽、白胺酸或其鹽、及纈胺酸或其鹽。
[10]如[8]之劑，其中化學療法劑為代謝拮抗劑、烷化劑、抗癌性抗生素、植物鹼、或分子標的治療劑。
[11]如[8]之劑，其中化學療法劑為5FU。
[12]如[8]之劑，其中包含癌幹細胞之癌為化學療法劑抗性之癌。
[13]如[8]之劑，其中包含癌幹細胞之癌為胃癌、肝癌、乳癌或大腸癌。
[14]一種用以預防包含癌幹細胞之癌的轉移或復發 之劑，其係使由異白胺酸、白胺酸及纈胺酸中選出之至少一種支鏈胺基酸或其鹽；與化學療法劑組合而成。
[15]如[14]之劑，其係含有異白胺酸或其鹽、白胺酸或其鹽、及纈胺酸或其鹽。
[16]如[14]之劑，其中化學療法劑為代謝拮抗劑、烷化劑、抗癌性抗生素、植物鹼、或分子標的治療劑。
[17]如[14]之劑，其中化學療法劑為5FU。
[18]如[14]之劑，其中包含癌幹細胞之癌為化學療法劑抗性之癌。
[19]如[14]之劑，其中包含癌幹細胞之癌為胃癌、肝癌、乳癌或大腸癌。
[20]一種用以誘導癌幹細胞之分化之劑，其係含有由異白胺酸、白胺酸及纈胺酸中選出之至少一種支鏈胺基酸或其鹽。
[21]如[20]之劑，其係含有異白胺酸或其鹽、白胺酸或其鹽、及纈胺酸或其鹽。
[22]如[20]之劑，其中癌幹細胞為胃癌幹細胞、肝癌幹細胞或大腸癌幹細胞。
[23]一種用以抑制包含癌幹細胞之癌的轉移之劑，其係含有由異白胺酸、白胺酸及纈胺酸中選出之至少一種支鏈胺基酸或其鹽。
[24]如[23]之劑，其係含有異白胺酸或其鹽、白胺酸或其鹽、及纈胺酸或其鹽。
[25]如[23]之劑，其中包含癌幹細胞之癌為胃癌、 肝癌、乳癌或大腸癌。
[26]一種由異白胺酸、白胺酸及纈胺酸中選出之至少一種支鏈胺基酸或其鹽，其係用於化學療法劑之抗腫瘤活性的增強。
[27]一種含有由異白胺酸、白胺酸及纈胺酸中選出之至少一種支鏈胺基酸或其鹽；及化學療法劑之組合物，其係使用於包含癌幹細胞之癌的治療。
[28]一種含有由異白胺酸、白胺酸及纈胺酸中選出之至少一種支鏈胺基酸或其鹽；及化學療法劑之組合物，其係使用於預防包含癌幹細胞之癌的轉移或復發。
[29]一種由異白胺酸、白胺酸及纈胺酸中選出之至少一種支鏈胺基酸或其鹽，其係使用於癌幹細胞之分化誘導。
[30]一種由異白胺酸、白胺酸及纈胺酸中選出之至少一種支鏈胺基酸或其鹽，其係使用於抑制包含癌幹細胞之癌的轉移。
[31]一種哺乳動物中之化學療法劑抗腫瘤活性增強方法，其係包含將有效量之由異白胺酸、白胺酸及纈胺酸中選出之至少一種支鏈胺基酸或其鹽投予至該哺乳動物。
[32]一種哺乳動物中之包含癌幹細胞之癌之治療方法，其係包含將有效量之由異白胺酸、白胺酸及纈胺酸中選出之至少一種支鏈胺基酸或其鹽；及化學療法劑投予至該哺乳動物。
[33]一種預防哺乳動物中之包含癌幹細胞之癌的轉 移或復發之方法，其係包含將有效量之由異白胺酸、白胺酸及纈胺酸中選出之至少一種支鏈胺基酸或其鹽；及化學療法劑投予至該哺乳動物。
[34]一種哺乳動物中之癌幹細胞之分化誘導方法，其係包含將有效量之由異白胺酸、白胺酸及纈胺酸中選出之至少一種支鏈胺基酸或其鹽投予至該哺乳動物。
[35]一種抑制哺乳動物中包含癌幹細胞之癌的轉移之方法，其係包含將有效量之由異白胺酸、白胺酸及纈胺酸中選出之至少一種支鏈胺基酸或其鹽投予至該哺乳動物。
支鏈胺基酸可促進癌幹細胞朝向癌非幹細胞之分化，且提高對化學療法劑之感受性，因此藉由將其與化學療法劑組合，而投予至罹患包含癌幹細胞之癌的患者，能夠有效地治療癌。
又，藉由將支鏈胺基酸與化學療法劑組合，而投予至曾經罹患過包含癌幹細胞之癌的患者，能夠有效的預防癌的轉移或復發。
本發明係提供含有由異白胺酸、白胺酸及纈胺酸中選出之至少一種支鏈胺基酸或其鹽(較佳為異白胺酸或其鹽、白胺酸或其鹽、及纈胺酸或其鹽)，且用以增強對包含 癌幹細胞之癌之化學療法劑的抗腫瘤活性之劑(或組成物)及/或用以誘導癌幹細胞的分化之劑(或組成物)(以下，亦將該等製劑稱為本發明之劑或組成物)。
在另外的樣態中，本發明之劑(或組成物)可為用以抑制包含癌幹細胞之癌的轉移之劑(或組成物)。
本發明之劑或組成物，係基於發現了由異白胺酸、白胺酸及纈胺酸中選出之至少一種支鏈胺基酸或其鹽(較佳為包含異白胺酸或其鹽、白胺酸或其鹽、及纈胺酸或其鹽之組合)，會促進癌幹細胞朝向癌非幹細胞之分化；且藉由此效果，會增強對包含癌幹細胞之癌之化學療法劑的抗腫瘤活性此一事實而完成者。一般而言，癌幹細胞之增殖速度慢，故會顯示對化學療法劑的抗性。相對於此，分化之癌細胞(癌非幹細胞)，一般而言增殖速度快，故對於化學療法劑的感受性高。因此，將由異白胺酸、白胺酸及纈胺酸中選出之至少一種支鏈胺基酸或其鹽(較佳為包含異白胺酸或其鹽、白胺酸或其鹽、及纈胺酸或其鹽之組合)，應用於包含癌幹細胞之癌，藉由促進癌幹細胞朝向癌非幹細胞之分化，對該癌之化學療法劑的感受性增高，結果對該癌之化學療法劑的抗腫瘤活性會增強。
在另外的樣態中，本發明之劑或組成物，係基於發現了由異白胺酸、白胺酸及纈胺酸中選出之至少一種支鏈胺基酸或其鹽(較佳為包含異白胺酸或其鹽、白胺酸或其鹽、及纈胺酸或其鹽之組合)，會促進癌幹細胞朝向癌非幹細胞之分化，藉由此效果，會抑制包含癌幹細胞之癌的轉 移能力此一事實而完成者。
本發明中，癌幹細胞意指具有自我複製能力及多分化能力，且進行同域性移入後時，具有引起腫瘤能力(在此所形成之腫瘤，為癌幹細胞所由來起源之腫瘤的擬表型)之癌細胞(Nat Rev Cancer,vol.5,pages425-436,2006)。
在各種癌當中，已知癌幹細胞中有特異表現之標記的存在，因此基於該等標記的表現，能夠評估癌細胞是否為癌幹細胞、或癌中是否含有癌幹細胞。其一樣態中，肝臟癌幹細胞為EpCAM+AFP+(Cancer Research,vol.65,No.8,pages 1451-1461,2008)。其一樣態中，大腸癌幹細胞為CD44+CD24+(PNAS,vol.171,No.8,pages 3722-3727,2010)。其一樣態中，乳癌幹細胞為CD44+CD24low+EpCAM+(PNAS,vol.100,No.7,pages 3982-3988,2003)。其一樣態中，胰臟癌幹細胞為CD44+。此處，該等標記之表現，係藉由使用了對該等標記蛋白質之特異抗體的流式細胞儀分析或免疫組織學之染色來評估，藉由至少任一方法而觀察到有特異染色時，則決定該標記表現為陽性(+)。有用於流式細胞儀分析或免疫組織學染色之對該等標記蛋白質的特異抗體，已廣泛地市售，只要所屬技術領域中具有通常知識者即可使用該等抗體輕易地評估癌細胞是否為癌幹細胞、或癌中是否含有癌幹細胞。
其他樣態中，胃癌幹細胞為CD44+。
又，以該等癌幹細胞之標記表現的減少當作指標，能夠評估癌幹細胞朝向癌非幹細胞之分化。在特定條件下，比起處理前，該處理後之癌中癌幹細胞的標記表現減少時，藉由該處理能夠使癌幹細胞被誘導朝向癌非幹細胞分化。於此，癌細胞全體中表現癌幹細胞之標記蛋白質的細胞數比率、或癌全體中癌幹細胞之標記蛋白質的量之任一者減少時，則判斷癌幹細胞之標記表現減少。
本發明中，癌係包含來自任何組織的癌。癌可列舉例如肝癌、大腸癌、腎臟癌、黑色素瘤、胰腺癌、甲狀腺癌、胃癌、肺癌(小細胞肺癌、非小細胞肺癌)、腦腫瘤、子宮癌、乳癌、多發性骨肉瘤、卵巢癌、慢性白血病、前列腺癌、急性淋巴性白血病、胚細胞瘤、急性骨髓性白血病、惡性淋巴瘤、纖毛癌、小兒惡性腫瘤、膽囊．膽管癌等，但不限定於該等。
其一樣態中，本發明之劑所應用之包含癌幹細胞之癌，為化學療法劑抗性。「化學療法劑抗性」，意指認可對人類應用之最大用量化學療法劑，在投予時不顯示顯著的可檢出反應之性質。如上所述，癌幹細胞之增殖速度慢，對化學療法劑會顯示抗性，因此化學療法劑抗性之癌中可能含有多量的癌幹細胞。因而，藉由對於對特定化學療法劑具有抗性之癌應用本發明之劑或組成物，期待會促進由癌幹細胞朝向癌非幹細胞之分化，對癌之該化學療法劑的感受性會變高。
上述癌中，肝癌、大腸癌、腎臟癌、黑色素瘤、胰腺 癌、甲狀腺癌、胃癌、肺癌、乳癌及非小細胞肺癌，已知一般而言對化學療法劑的感受性低，化學療法劑難以發揮效果。因此，藉由將本發明之劑或組成物應用於該等之癌(較佳為胃癌、肝癌、乳癌或大腸癌)，並促進該等癌中所含之癌幹細胞的分化，期待會對該等癌之化學療法劑的感受性變高。
本發明中，化學療法劑意指直接作用於癌細胞，抑制其分裂，具有殺傷能力之化合物。化學療法劑可列舉代謝拮抗劑、鉑製劑、烷化劑、抗癌性抗生素、植物鹼、分子標的治療劑等。
代謝拮抗劑意指癌細胞分裂/增殖時，以與作為核酸材料之物質之化學構造相近的物質來妨礙DNA合成，抑制癌細胞之代謝，且抑制增殖之化學療法劑。代謝拮抗劑可列舉5-氟尿嘧啶(5FU)、替加氟、卡莫氟、去氧氟尿苷、溴尿苷、賽德薩、依諾他濱、羥基硫夫拉定、羥基脲(hydroxycarbamide)、滅殺除癌、磷酸福達樂等嘧啶代謝拮抗劑；6-巰基嘌呤、6-硫鳥嘌呤、硫肌苷、鹽酸健擇等嘌呤代謝拮抗劑等。其一樣態中，代謝拮抗劑較佳為嘧啶代謝拮抗劑、更佳為5-氟尿嘧啶或替加氟。
鉑製劑意指於DNA之構成鹼基之鳥糞嘌呤、腺嘌呤的N-7位，以2個氯原子部位來鍵結，於DNA鏈內形成交聯，阻礙DNA合成，藉以發揮抑制癌細胞之增殖之效果的化學療法劑。鉑製劑可列舉順鉑、卡鉑定、奈達鉑、益樂鉑等。
烷化劑意指藉由使DNA烷化而切斷，而發揮抑制癌細胞之增殖的效果之化學療法劑。烷化劑可列舉氮芥子氣、氮芥子氣N-氧化物、氮芥苯丁酸等之氮芥子氣系烷化劑；卡波醌、噻替派等之乙烯亞胺衍生物；補束剋、甲苯磺酸英丙舒凡等之磺酸酯類；鹽酸尼莫司汀等之亞硝基脲衍生物等。
抗癌性抗生素可列舉絲裂黴素C、博來黴素、培洛黴素、道諾黴素、阿克拉黴素、阿黴素(doxorubicin)、吡柔比星、THP-阿黴素(THP-adriamycin)、4’-表阿黴素(epidoxorubicin)、泛艾黴素(epirubicin)等之蒽環黴素系抗生素抗腫瘤劑；色黴素A3、放線菌黴素D等。
植物鹼可列舉長春花鹼、長春新鹼、長春花鹼醯胺(vindesine)等之長春花生物鹼類；依妥普賽(etoposide)、坦尼普賽(teniposide)等之表鬼臼毒素(epipodophyllotoxin)類；太平洋紫杉醇(paclitaxel)、歐洲紫杉醇(docetaxel)等之紫杉烷系生物鹼等。
分子標的治療劑，意指以癌細胞增殖相關之分子作為標的，藉由阻礙其分子而具有殺傷癌細胞之活性的化合物。分子標的治療劑，可列舉基利克(imatinib)、艾瑞莎(gefitinib)、得舒緩(erlotinib)、凡德他尼(vandetanib)、紓癌特(sunitinib)、蕾莎瓦(sorafenib)、莫須瘤(rituximab)、爾必得舒(cetuxinab)、瑞米凱德(infliximab)、賀癌平(trastuzumab)、癌思停(bevacizumab)等。
其一樣態中，本發明之劑或組成物，係用以增強對包含肝臟癌幹細胞之肝臟癌之代謝拮抗劑(較佳為嘧啶代謝拮抗劑、更佳為5-氟尿嘧啶或替加氟)的抗腫瘤活性者。
其一樣態中，本發明之劑或組成物，係用以增強對包含大腸癌幹細胞之大腸癌之代謝拮抗劑(較佳為嘧啶代謝拮抗劑、更佳為5-氟尿嘧啶或替加氟)的抗腫瘤活性者。
其一樣態中，本發明之劑或組成物，係用以增強對包含胃癌幹細胞之胃癌、包含結腸癌幹細胞之結腸癌、包含子宮頸癌幹細胞之子宮頸癌、包含子宮體癌幹細胞之子宮體癌、包含消化器癌幹細胞之消化器癌、包含胰腺癌幹細胞之胰腺癌、包含直腸癌幹細胞之直腸癌、包含乳癌幹細胞之乳癌、或包含卵巢癌幹細胞之卵巢癌之代謝拮抗劑(較佳為嘧啶代謝拮抗劑、更佳為5-氟尿嘧啶或替加氟)的抗腫瘤活性者。
本發明之劑或組成物中，有效成分(支鏈胺基酸)之異白胺酸、白胺酸及纈胺酸各均可使用L-體、D-體、DL-體，然較佳為L-體、DL-體、更佳為L-體。
異白胺酸、白胺酸及纈胺酸各不僅遊離體，亦能夠以鹽的形態使用。鹽的形態雖可列舉酸加成鹽或鹼加成鹽等，但只要化學上可容許的鹽，可採用任意形態。本發明之劑或組成物，通常以作為醫療目的使用的觀點而言，鹽的形態較佳為作為醫藥而容許之鹽。
作為醫藥而容許之鹽，可列舉例如與酸之鹽、與鹼之鹽。分別加成於異白胺酸、白胺酸或纈胺酸而形成作為醫藥而容許之鹽的酸者，可列舉例如氯化氫、溴化氫酸、硫酸、磷酸等無機酸；乙酸、乳酸、檸檬酸、酒石酸、馬來酸、富馬酸或單甲基硫酸等有機酸。分別加成於異白胺酸、白胺酸或纈胺酸而形成作為醫藥而容許之鹽的鹼者，可列舉例如鈉、鉀等金屬之氫氧化物；鈣等金屬之碳氧化物、氨等無機鹼；乙烯二胺、丙烯二胺、乙醇胺、單烷基乙醇胺、二烷基乙醇胺、二乙醇胺、三乙醇胺等有機鹼。
本發明之劑或組成物，只要含有由異白胺酸、白胺酸及纈胺酸中選出之至少一種支鏈胺基酸或該等之鹽即可，以下樣態係包含於本發明中：僅含有異白胺酸或其鹽作為支鏈胺基酸之樣態；僅含有白胺酸或其鹽作為支鏈胺基酸之樣態；僅含有纈胺酸或其鹽作為支鏈胺基酸之樣態；含有異白胺酸或其鹽及白胺酸或其鹽作為支鏈胺基酸之樣態；含有異白胺酸或其鹽及纈胺酸或其鹽作為支鏈胺基酸之樣態；含有白胺酸或其鹽及纈胺酸或其鹽作為支鏈胺基酸之樣態；以及含有異白胺酸或其鹽、白胺酸或其鹽、及纈胺酸或其鹽作為支鏈胺基酸之樣態。
本發明之劑或組成物，較佳為含有異白胺酸或其鹽、 白胺酸或其鹽、及纈胺酸或其鹽。
本發明之劑或組成物中所含之支鏈胺基酸的摻混比(重量比)，所屬技術領域中具有通常知識者可在本發明之劑具有所期望之活性(例如誘導癌幹細胞之分化的活性、或增強對包含癌幹細胞之癌之化學療法劑的抗腫瘤活性之活性)的範圍作適當調整，但例如在含有異白胺酸或其鹽、白胺酸或其鹽、及纈胺酸或其鹽之樣態中，該3種胺基酸之摻混比(異白胺酸：白胺酸：纈胺酸)，以重量比計通常為1：1~3：0.5~2.0、較佳為1：1.5~2.5：0.8~1.5、更佳為1：1.9~2.2：1.1~1.3、最佳為1：2：1.2。再者，本發明之劑含有異白胺酸之鹽、白胺酸之鹽、或纈胺酸之鹽的情況時，重量比之計算係將各支鏈胺基酸之鹽全部換算為遊離體後來進行。
本發明之劑及組成物，能夠投予至動物(較佳為人類等哺乳動物)。
將本發明之劑或組成物使用作為用以增強對包含癌幹細胞之癌之化學療法劑的抗腫瘤活性之劑(或組成物)、或使用作為用以誘導癌幹細胞之分化之劑(或組成物)時，其投予形態/劑型可為經口投予、非經口投予之任意者，經口投予劑可列舉散劑、顆粒劑、膠囊劑、錠劑、咀嚼劑等固形劑；溶液劑、糖漿劑等液劑；又非經口投予劑可列舉注射劑、輸液劑、經鼻/經肺用噴劑等。本發明之劑或組成物可藉由通常方法製劑化為該等劑型之醫藥。
由減輕對患者負擔的觀點而言，支鏈胺基酸較佳為對 於對象者經口投予。另一方面，對難以經口投予的患者，可將支鏈胺基酸作為胺基酸輸液而經靜脈/動脈投予。
又，本發明之劑，可依製劑上的需要，摻混適當之藥學上容許的載體，例如賦形劑、結合劑、潤滑劑、溶劑、崩解劑、溶解輔助劑、懸濁化劑、乳化劑、等張化劑、安定化劑、無痛化劑、防腐劑、抗氧化劑、矯味矯臭劑、著色劑等來製劑化。進一步地，本發明之組成物可與上述載體一起調製。
賦形劑可列聚乳糖、葡萄糖、D-甘露醇等糖類；澱粉類、結晶纖維素等纖維素類等之有機系賦形劑；碳酸鈣、高嶺土等無機系賦形劑等。結合劑可列舉α化澱粉、明膠、阿拉伯膠、甲基纖維素、羧基甲基纖維素、羧基甲基纖維素鈉、結晶纖維素、D-甘露醇、海藻糖、羥基丙基纖維素、羥基丙基甲基纖維素、聚乙烯吡咯烷酮、聚乙烯醇等。潤滑劑可列舉硬脂酸、硬脂酸鹽等脂肪酸鹽；滑石、矽酸鹽類等。溶劑可列舉精製水、生理食鹽水等。崩解劑可列舉低取代度羥基丙基纖維素、經化學修飾之纖維素或澱粉類等。溶解輔助劑可列舉聚乙二醇、丙二醇、海藻糖、苯甲酸苄酯、乙醇、碳酸鈉、檸檬酸鈉、水楊酸鈉、乙酸鈉等。懸濁化劑或乳化劑可列舉硫酸月桂酯鈉、阿拉伯膠、明膠、卵磷脂、單硬脂酸甘油、聚乙烯醇、聚乙烯吡咯烷酮、羧基甲基纖維素鈉等纖維素類；聚山梨醇酯類、聚氧乙烯硬化蓖麻油等。等張化劑可列舉氯化鈉、氯化鉀、糖類、甘油、尿素等。安定化劑可列舉聚乙二醇、葡萄聚 糖硫酸鈉、其他胺基酸類等。無痛化劑可列舉葡萄糖、葡萄糖酸鈣、鹽酸普羅卡因等。防腐劑可列舉對氧苯甲酸酯類、氯丁醇、苄醇、苯乙醇、去氫乙酸、山梨酸等。抗氧化劑可列舉亞硫酸鹽、抗壞血酸等。矯味矯臭劑可列舉醫藥及食品領域中通常所使用的甘味料、香料等。著色劑可列舉醫藥及食品領域中通常所使用之著色料。
本發明之劑或組成物中之有效成分為胺基酸，安全性優良，因此於其一樣態中，本發明之劑或組成物可作為飲食品而提供。將本發明之劑或組成物作為飲食品而提供的情況時，並無特別困難，例如可藉由將有效成分之支鏈胺基酸(較佳為異白胺酸或其鹽、白胺酸或其鹽、及纈胺酸或其鹽)與果汁、牛乳、糕餅、果凍等飲食品混合來調製。亦可添加維生素類或其他補充劑類。所得之飲食品亦可作為保健機能食品而提供。
保健機能食品，意指含有對身體之生理學機能或生物學活動帶來影響之保健機能成分，且對於飲食生活中以特定保健目的而攝取者，藉由該攝取可期待該保健目的之食品。
保健機能食品，有時依情況亦稱為機能性食品、健康食品(包含營養補充劑)等。機能性食品意指利用食品中所含之生體調節成分之機能而製作的食品、健康食品一般係指對增進健康有用的食品群。其中亦包含以特定營養素作為主成分的營養補充劑。
保健機能食品中，係包含特定保健用食品及營養機能 食品，而藉由使接受化學療法劑之投予的罹患包含癌幹細胞之癌的患者、或使曾經罹患過包含癌幹細胞之癌的患者作為日常營養輔助食品而攝取，可提高癌對該化學療法劑之感受性。
如此之保健機能食品，可添附其係用以增強對包含癌幹細胞之癌之化學療法劑的抗腫瘤活性的標示。
本發明之劑或組成物中所含的支鏈胺基酸(較佳為異白胺酸或其鹽、白胺酸或其鹽、及纈胺酸或其鹽)之含量，雖隨製劑形態等而相異，但通常相對於製劑全體，通常為1~100重量%、較佳為10~100重量%、更佳為30~100重量%、又更佳為50~100重量%。
本發明之劑及組成物之適合的例子，可列舉以1：2：1.2(異白胺酸：0.952g、白胺酸：1.904g、纈胺酸：1.144g)之重量比含有異白胺酸、白胺酸及纈胺酸之支鏈胺基酸製劑Livact(註冊商標)顆粒(味之素股份有限公司)(經口投予劑)。
又，適合的非經口投予劑，可列舉高濃度胺基酸輸液類之Aminic((註冊商標)點滴靜脈注射(味之素製藥股份有限公司))、Morihepamin((註冊商標)點滴靜脈注射(味之素製藥股份有限公司))。
本發明之劑或組成物的投予量，雖依對象患者的年齡/體重/病態、投予方法等而不同，但在含有異白胺酸或其鹽、白胺酸或其鹽、及纈胺酸或其鹽之樣態中，一般成人的情況時，通常依1天的量異白胺酸0.5~30.0g、白胺酸 1.0~60.0g、纈胺酸0.5~30.0g為標準。較佳一天的量為異白胺酸2.0~10.0g、白胺酸3.0~20.0g、纈胺酸2.0~10.0g、更佳為異白胺酸2.5~3.5g、白胺酸5.0~7.0g、纈胺酸3.0~4.0g，3種支鏈胺基酸之全體量者，較佳為每1天2.0g~50.0g左右，將之依照需要，分為1~6次、較佳分為1~3次投予。再者，本發明之劑或組成物含有支鏈胺基酸之鹽時，投予量的計算，係將各支鏈胺基酸之鹽全部換算為遊離體後來進行。
算出上述本發明中使用之有效成分的支鏈胺基酸之投予量(攝取量)時，係以本發明中作為目的之疾病的治療、預防等目的所使用之藥劑有效成分，來決定前述的算出範圍，因此關於與其不同目的，例如通常的飲食生活之必要、或別的疾病的治療目的所攝取或投予的支鏈胺基酸，並無必要將其包含在前述算出範圍內。例如，並不需要將通常的飲食生活中所攝取之每一天的支鏈胺基酸量由前述本發明中有效成分之每一天投予量中扣除而算出。
本發明之劑含有由異白胺酸、白胺酸及纈胺酸中選出之二種或三種支鏈胺基酸或其鹽的樣態時，本發明之有效成分的異白胺酸、白胺酸及纈胺酸或該等之鹽可各自單獨、或以任意組合含有於製劑中、或亦可全部含有於1種製劑中。若是另外進行製劑化來投予時，該等之投予路徑、投予劑型可相同、亦可相異，又各自的投予時機，可同時亦可分開。係依所合併使用的藥劑種類或效果來作適當決定。亦即，本發明之劑可為同時含有複數的支鏈胺基酸或 該等之鹽的製劑、亦可為分別另外製劑化來合併使用的併用劑。本發明包含該等之形態全部。特別是在相同製劑中含有全部之支鏈胺基酸或該等之鹽的樣態(例如在相同製劑中含有異白胺酸或其鹽、白胺酸或其鹽、及纈胺酸或其鹽的樣態)，可簡便地投予故較佳。
本發明中，「重量比」意指本發明之劑及組成物中各自之胺基酸成分的重量比。例如，將異白胺酸、白胺酸及纈胺酸之各有效成分含於1個製劑中時，為各自含量之比；將各有效成分各自單獨或以任意組合而含於複數製劑中時，為各製劑中所含之各有效成分的重量比。
又，本發明中，實際投予量之比，係為每投予對象(即患者)之各有效成分1次投予量或1天投予量的比。例如，異白胺酸、白胺酸及纈胺酸之各有效成分含於1個製劑中，並將其投予至投予對象時，重量比係相當於投予量比。將各有效成分單獨以或任意組合含於複數製劑中來投予時，1次或1天投予之各製劑中之各有效成分合計量的比係相當於重量比。
異白胺酸、白胺酸、及纈胺酸已被廣泛使用於醫藥/食品領域，已確立安全性，例如，將以1：2：1.2之比含有該等支鏈胺基酸之本發明之劑及組成物的急性毒性(LD50)，在小鼠的經口投予中為10g/Kg以上。
如上所述，由異白胺酸、白胺酸及纈胺酸中選出之至少一種支鏈胺基酸或其鹽(較佳為包含異白胺酸或其鹽、白胺酸或其鹽、及纈胺酸或其鹽之組合)，會促進癌幹細 胞朝向癌非幹細胞的分化，藉由此效果，會增強對包含癌幹細胞之癌之化學療法劑的抗腫瘤活性。因此，於其一樣態中，本發明之劑或組成物，係對罹患包含癌幹細胞之癌的哺乳動物(例如人類)進行投予。藉由使由異白胺酸、白胺酸及纈胺酸中選出之至少一種支鏈胺基酸或其鹽(較佳為包含異白胺酸或其鹽、白胺酸或其鹽、及纈胺酸或其鹽之組合)對該哺乳動物所保持的癌中所含的癌幹細胞作用，會促進癌幹細胞朝向癌非幹細胞的分化，增強對該癌之化學療法劑的抗腫瘤活性。
在另外的樣態中，由異白胺酸、白胺酸及纈胺酸中選出之至少一種支鏈胺基酸或其鹽(較佳為包含異白胺酸或其鹽、白胺酸或其鹽、及纈胺酸或其鹽之組合)，會促進癌幹細胞朝向癌非幹細胞的分化，抑制CD44等與癌轉移相關的黏著分子的表現，藉由此效果，會抑制包含癌幹細胞之癌的轉移能力。因此，於其一樣態中，本發明之劑或組成物，係對罹患包含癌幹細胞之癌的哺乳動物(例如人類)投予。藉由使由異白胺酸、白胺酸及纈胺酸中選出之至少一種支鏈胺基酸或其鹽(較佳為包含異白胺酸或其鹽、白胺酸或其鹽、及纈胺酸或其鹽之組合)對該哺乳動物保持的癌中所含的癌幹細胞作用，會促進癌幹細胞朝向癌非幹細胞的分化，不需要合併使用化學療法劑即會抑制該癌的轉移。
在別的樣態中，本發明之劑或組成物，係對曾經罹患過包含癌幹細胞之癌的哺乳動物(例如人類)來投予。癌 幹細胞一般而言細胞增殖慢，對化學療法劑有抗性，因此一旦包含癌幹細胞之癌發病後，化學療法劑等之治療結果，外觀上癌即使緩解，癌的症狀消失，但體內殘存有癌幹細胞，此可認為是癌之轉移或復發的原因。癌之復發，意指藉由治療，癌的症狀完全或一部分緩解後，癌細胞再度增殖，再次出現癌之症狀或惡化之意。因此，藉由將本發明之劑或組成物對曾經罹患過包含癌幹細胞之癌的哺乳動物(例如人類)投予，會促進可能殘存在該哺乳動物體內之癌幹細胞朝向癌非幹細胞的分化，增強對化學療法劑的感受性。
因此，在較佳之樣態中，本發明之劑或組成物係與化學療法劑組合來投予至哺乳動物。藉由將本發明之劑或組成物與化學療法劑組合來投予至罹患有包含癌幹細胞之癌之哺乳動物，能夠有效率地治療該癌。又，藉由將本發明之劑或組成物與化學療法劑組合來投予至曾經罹患過包含癌幹細胞之癌的哺乳動物，能夠有效率地預防該癌之轉移或復發。
因此，本發明係提供：使由異白胺酸、白胺酸及纈胺酸中選出之至少一種支鏈胺基酸或其鹽(較佳為異白胺酸或其鹽、白胺酸或其鹽、及纈胺酸或其鹽)(以下有時將該等單純稱為支鏈胺基酸)、與化學療法劑組合而成之用以治療包含癌幹細胞之癌之劑(或組成物)及/或用以預防包含癌幹細胞之癌的轉移或復發之劑(或組成物)(以下，亦將該等之製劑稱為本發明之預防或治療劑)。
本發明之預防或治療劑相關各用語的定義，若無特別指明，係與上述本發明之劑或組成物之相關各用語定義相同。
可應用本發明之預防或治療劑的癌，係與上述本發明之劑或組成物能夠應用的癌相同。其一樣態中，本發明之劑所適用之包含癌幹細胞之癌，係對化學療法劑有抗性。
癌當中，肝癌、大腸癌、腎臟癌、黑色素瘤、胰腺癌、甲狀腺癌、胃癌、肺癌、乳癌及非小細胞肺癌，已知一般而言對化學療法劑之感受性低，化學療法劑難以發揮效果。因此，將本發明之預防或治療劑應用於該等之癌(較佳為胃癌、肝癌、乳癌或大腸癌)時，本發明之預防或治療劑中所含之支鏈胺基酸(較佳為異白胺酸或其鹽、白胺酸或其鹽、及纈胺酸或其鹽)會促進癌中所含有的癌幹細胞的分化，該等之癌對化學療法劑的感受性會變高，於其藉由本發明之預防或治療劑中所含的化學療法劑之作用，結果可期待有效地殺傷癌幹細胞。
其一樣態中，本發明之預防或治療劑係含有代謝拮抗劑(較佳為嘧啶代謝拮抗劑、更佳為5-氟尿嘧啶或替加氟)作為化學療法劑，且用以預防或治療包含肝臟癌幹細胞之肝臟癌者。
其一樣態中，本發明之預防或治療劑，係含有代謝拮抗劑(較佳為嘧啶代謝拮抗劑、更佳為5-氟尿嘧啶或替加氟)作為化學療法劑，且用以預防或治療包含大腸癌幹細胞之大腸癌者。
其他樣態中，本發明之預防或治療劑，係含有代謝拮抗劑(較佳為嘧啶代謝拮抗劑、更佳為5-氟尿嘧啶或替加氟)作為化學療法劑，且用以預防或治療包含胃癌幹細胞之胃癌者。
其一樣態中，本發明之預防或治療劑，係含有代謝拮抗劑(較佳為嘧啶代謝拮抗劑、更佳為5-氟尿嘧啶或替加氟)作為化學療法劑，且用以預防或治療包含胃癌幹細胞之胃癌、包含結腸癌幹細胞之結腸癌、包含子宮頸癌幹細胞之子宮頸癌、包含子宮體癌幹細胞之子宮體癌、包含消化器癌幹細胞之消化器癌、包含胰腺癌幹細胞之胰腺癌、包含直腸癌幹細胞之直腸癌、包含乳癌幹細胞之乳癌、或包含卵巢癌幹細胞之卵巢癌者。
合併使用支鏈胺基酸與化學療法劑時，支鏈胺基酸與化學療法劑之投予時期並無限定，可將支鏈胺基酸與化學療法劑對投予對象同時投予、亦可隔出時間差來投予。支鏈胺基酸及化學療法劑之投予量，只要係在能夠達成目標之效果(治療包含癌幹細胞之癌的效果、預防包含癌幹細胞之癌的轉移或復發之效果)的範圍，並無特殊限定，可隨投予對象、投予路徑、症狀、組合等來作適當選擇。支鏈胺基酸較佳為投予促進癌幹細胞朝向癌非幹細胞之分化的量，化學療法劑係投予殺傷該癌非幹細胞的量。
支鏈胺基酸與化學療法劑之投予形態並無特殊限定，只要係投予時將支鏈胺基酸與化學療法劑組合即可。如此之投予形態，可列舉例如(1)將支鏈胺基酸與化學療法 劑同時製劑化而得之單一製劑的投予、(2)將支鏈胺基酸與化學療法劑各別製劑化而得之2種製劑以相同投予路徑同時投予、(3)將支鏈胺基酸與化學療法劑各別製劑化而得之2種製劑以以相同投予路徑隔出時間差投予、(4)將支鏈胺基酸與化學療法劑各別製劑化而得之2種製劑以不同投予路徑同時投予、(5)將支鏈胺基酸與化學療法劑各別製劑化而得之2種製劑以不同投予路徑隔出時間差投予(例如，以支鏈胺基酸→化學療法劑之順序投予、或相反的順序投予)等。
本發明之預防或治療劑的投予形態/劑型，可為經口投予、非經口投予之任意者，經口投予劑可列舉散劑、顆粒劑、膠囊劑、錠劑、咀嚼劑等固形劑；溶液劑、糖漿劑等液劑，又，非經口投予劑可列舉注射劑、輸液劑、經鼻/經肺用噴劑等。本發明之劑或組成物，可藉由通常方法製劑化為該等劑型之醫藥。
又，本發明之預防或治療劑，可依照製劑上的需要，摻混適當之在藥學上容許的載體，例如賦形劑、結合劑、潤滑劑、溶劑、崩解劑、溶解輔助劑、懸濁化劑、乳化劑、等張化劑、安定化劑、無痛化劑、防腐劑、抗氧化劑、矯味矯臭劑、著色劑等而製劑化。
將支鏈胺基酸與化學療法劑各別製劑化時，含有支鏈胺基酸之製劑中的支鏈胺基酸之含量，係與上述本發明之劑或組成物相同。
又，將支鏈胺基酸與化學療法劑各別製劑化時，含有 化學療法劑之製劑中的化學療法劑之含量，只要係可藉由與支鏈胺基酸的合併使用，治療包含癌幹細胞之癌、或預防包含癌幹細胞之癌的轉移或復發，則並無特殊限定，雖隨著製劑之形態或化學療法劑之種類而不同，但通常相對於製劑全體為約0.1~99.9重量%、較佳為約1~99重量%、更佳為約10~90重量%左右。
將支鏈胺基酸及化學療法劑同時製劑化而作為單一製劑使用時，依據上述之含量即可。此時，支鏈胺基酸與化學療法劑之摻混比，能夠依投予對象、投予路徑、症狀、化學療法劑之種類等作適當選擇。
支鏈胺基酸之投予量，與上述本發明之劑或組成物中之支鏈胺基酸的的投予量相同，於含有異白胺酸或其鹽、白胺酸或其鹽、及纈胺酸或其鹽之樣態中，一般成人的情況時，通常1天的量以異白胺酸0.5~30.0g、白胺酸1.0~60.0g、纈胺酸0.5~30.0g為標準。較佳一天的量為異白胺酸2.0~10.0g、白胺酸3.0~20.0g、纈胺酸2.0~10.0g；更佳為異白胺酸2.5~3.5g、白胺酸5.0~7.0g、纈胺酸3.0~4.0g，3種支鏈胺基酸之全體量而言，每1天2.0g~50.0g左右較佳，依照需要係將其分割為1~6次、較佳為1~3次來投予。
化學療法劑之投予量，只要能夠藉由與支鏈胺基酸合併使用，治療包含癌幹細胞之癌，或預防包含癌幹細胞之癌的轉移或復發，則無特殊限定，可隨投予對象、症狀、投予路徑、抗腫瘤劑之種類等作適當設定。
支鏈胺基酸及/或化學療法劑之投予頻率，雖隨投予對象、症狀、投予路徑、抗腫瘤劑之種類等而不同，但例如為1~7天1次之頻率、較佳為1~3天1次之頻率。支鏈胺基酸及/或化學療法劑之投予次數，雖亦隨投予對象、症狀、投予路徑、抗腫瘤劑之種類等而不同，但通常為1~15次、較佳為2~10次左右。
將上述之支鏈胺基酸與化學療法劑各自分別製劑化而合併使用投予時，可將含有支鏈胺基酸之製劑與含有化學療法劑之製劑同時期投予，亦可先投予含有化學療法劑之製劑後，再投予含有支鏈胺基酸之製劑，亦可先投予含有支鏈胺基酸之製劑，之後投予含有化學療法劑之製劑。隔開時間差投予時，時間差係隨著投予之有效成分、劑形、投予方法而不同，例如，先投予含有支鏈胺基酸之製劑時，可列舉投予含有支鏈胺基酸之製劑後，於1分鐘~14天以內投予含有化學療法劑之製劑的方法。先投予含有化學療法劑之製劑時，可列舉投予化學療法劑後，1分鐘~14天以內投予含有支鏈胺基酸之製劑的方法。
如上所述，癌幹細胞之增殖速度慢，故對化學療法劑具有抗性。相對於此，分化後之癌細胞(癌非幹細胞)，一般而言增殖速度快，故對化學療法劑之感受性高。因而，藉由將由異白胺酸、白胺酸及纈胺酸中選出之至少一種支鏈胺基酸或其鹽(較佳為、異白胺酸或其鹽、白胺酸或其鹽、及纈胺酸或其鹽)應用於癌幹細胞，促進癌幹細胞朝向癌非幹細胞之分化，包含癌幹細胞之癌對化學療法劑 的感受性變高，結果，能夠以高效率殺傷包含癌幹細胞之癌。
基於如此理論，化學療法劑的投予，較佳為與上述支鏈胺基酸(較佳為異白胺酸或其鹽、白胺酸或其鹽、及纈胺酸或其鹽)之投予同時、或自上述支鏈胺基酸(較佳為異白胺酸或其鹽、白胺酸或其鹽、及纈胺酸或其鹽)投予之一定期間後。亦即，本發明之治療或預防劑的投予樣態，較佳為含有將上述支鏈胺基酸(較佳為異白胺酸或其鹽、白胺酸或其鹽、及纈胺酸或其鹽)與化學療法劑同時投予的步驟、或投予上述支鏈胺基酸(較佳為異白胺酸或其鹽、白胺酸或其鹽、及纈胺酸或其鹽)，之後投予化學療法劑的步驟。
因此，本發明之預防或治療劑的投予流程，較佳為包含：(1)將上述之支鏈胺基酸(較佳為異白胺酸或其鹽、白胺酸或其鹽、及纈胺酸或其鹽)及化學療法劑同時投予單次或複數次、(2)將上述之支鏈胺基酸(較佳為異白胺酸或其鹽、白胺酸或其鹽、及纈胺酸或其鹽)投予單次或複數次作為第一階段、將化學療法劑投予單次或複數次作為第二階段、(3)將上述之支鏈胺基酸(較佳為異白胺酸或其鹽、白胺酸或其鹽、及纈胺酸或其鹽)投予單次或複數次作為第一階段、將上述之支鏈胺基酸(較佳為異白胺酸或其 鹽、白胺酸或其鹽、及纈胺酸或其鹽)及化學療法劑於同時投予單次或複數次作為第二階段、(4)重複(2)或(3)之步驟複數次等步驟。
(1)之具體的樣態，例如可列舉在預防或治療包含肝臟癌幹細胞之肝臟癌時，將含有上述支鏈胺基酸(較佳為異白胺酸或其鹽、白胺酸或其鹽，及纈胺酸或其鹽)的輸液劑，於施行肝動脈注入化學療法時，與化學療法劑一起注入動脈內。亦可進一步地，將干擾素與上述輸液劑及化學療法劑一起注入動脈內。
於(2)~(4)中，第一階段最後的投予與第二階段最後的投予之間隔，雖隨投予對象、症狀、投予路徑、化學療法劑之種類等而不同，但通常為1分鐘~14天以內。
於(2)~(4)中，亦可在第一階段中之上述支鏈胺基酸(較佳為異白胺酸或其鹽、白胺酸或其鹽、及纈胺酸或其鹽)之投予後，確認癌幹細胞是否已朝向癌非幹細胞分化。例如上述，能夠將癌幹細胞之標記的表現，藉由使用了會特異的辨識該標記蛋白質之抗體的免疫學手法來測定，藉以實施該確認。與上述之支鏈胺基酸投予前比較，該投予後癌中之癌幹細胞的標記表現減少時，可視為藉由該投予而誘導了癌幹細胞朝向癌非幹細胞的分化。此外，確認了有誘導癌幹細胞朝向癌非幹細胞之分化後，能夠實施第二階段之化學療法劑投予。
在另外的樣態中，藉由將本發明之劑或組成物對曾經罹患過包含癌幹細胞之癌的哺乳動物(例如人類)投予，會促進可能殘存在該哺乳動物體內之癌幹細胞朝向癌非幹細胞的分化，癌幹細胞朝向癌非幹細胞的分化被促進，抑制CD44等癌轉移相關之黏著分子的表現，藉由此效果，會抑制包含癌幹細胞之癌的轉移能力。因此，藉由將本發明之劑或組成物投予至曾經罹患過包含癌幹細胞之癌的哺乳動物，可在不需要合併使用化學療法劑之下，有效率地預防該癌的轉移或復發。
[實施例]
接著，藉由實施例進一步詳述本發明。再者，以下實施例係具體說明本發明之一例者，本發明並非限定於此。
實施例1：BCAA對人類肝臟癌細胞株HAK4中之幹細胞標記及分化標記之表現的效果
將人類肝臟癌細胞株HAK4以12000個/well之濃度播種至培養盤，於2mM BCAA或LC 2.5%培養基中培養72小時。BCAA為由異白胺酸、白胺酸及纈胺酸所構成之混合物(重量比：異白胺酸：白胺酸：纈胺酸=1：2：1.2)。BCAA之濃度「2mM」，係異白胺酸、白胺酸及纈胺酸之全胺基酸濃度的合計。
LC 2.5%培養基之組成係如以下之表所示。再者，LC 2.5%之「2.5%」表示牛血清的含量。
再者，Fischer’s ratio，意指Valine+Leucine+Isoleucine/Tyrosine+Phenylalanine。
72小時培養後回收細胞，於細胞之片狀沈澱中加入1ml之ISOGEN(Nippon Gene)以溶解細胞，於室溫靜置5分鐘。於所得之溶解物中加入0.2ml氯仿，激烈震盪15秒，靜置於室溫2~3分鐘，以12000×g、4℃離心分離15分鐘。去除有機相及中間相，於所得之水相中加入0.5ml異丙醇，於室溫靜置5~10分鐘，以12000×g、4℃離心分離10分鐘。去除上清液，於沈澱物中加入至少1ml之75(v/v)%乙醇，漩渦攪拌(vortex)，以7500×g、4℃ 離心分離5分鐘。去除上清液，將沈澱物短時間乾燥，加入蒸餾水溶解，藉以得到全RNA溶液。
藉由使用了RT-PCR 7500之RT-PCR，定量EpCAM(Epithelial cell adhesion molecule；肝臟癌幹細胞之標記)、AFP(α-feto protein；肝臟癌標記及肝臟癌幹細胞之標記)及CYP3A4(cytochrome P450 3A4；分化標記)之mRNA表現。使用RT-PCR之引子係如下表所示。
結果如圖1所示。藉由BCAA，於HAK4細胞中，肝臟癌幹細胞之標記即EpCAM及AFP的表現會降低、分化標記即CYP3A4的表現上昇。
實施例2：合併使用5FU(5-fluorouracil)與BCAA對人類肝臟癌細胞株HAK4的效果(in vitro試驗)
將人類肝臟癌細胞株HAK4以3000個/well的濃度播種於培養盤，於以下條件下培養72小時：
．LC 2.5%培養基
．BCAA(2mM)
．5FU(2.5μg/ml)
．BCAA(2mM)+5FU(2.5μg/ml)
72小時後，使用ApoAlert Annexin V-FITC Apoptosis kit(Clontech)，將細胞以annexin V染色及固定，以Array Scan(陣列掃描)(Thermo Fisher)檢測凋亡(apoptosis)細胞(%)。
亦即，以1X Binding Buffer潤洗96孔盤中之細胞，於各孔中加入含有annexin V(1μl)之1X Binding Buffer 40μl，於黑暗中，在室溫靜置5~15分鐘。洗淨細胞，於2%甲醛中固定。加入含有赫斯特33258溶液之PBS 100μl，於黑暗中靜置5分鐘後，以Array Scan檢測凋亡細胞(%)。
結果如圖2所示。於BCAA單獨處理中，並無觀察到凋亡細胞數的顯著變化。藉由5FU單獨處理，凋亡細胞增加，合併使用BCAA時，增強了5FU之凋亡誘導。由以上結果，顯示BCAA會增強5FU之抗腫瘤效果。
實施例3：BCAA對人類肝臟癌細胞株HAK1B中之幹細胞標記及分化標記的表現之效果
與實施例1同樣地，將人類肝臟癌細胞株HAK1B以4000個/well之濃度播種於培養盤，於2mM BCAA或LC 2.5%培養基中培養72小時。72小時培養後，回收細胞，藉由ISOGEN(Nippon Gene)純化全RNA。藉由RT-PCR ，定量EpCAM、AFP及CYP3A4之mRNA表現。
結果如圖3所示。藉由BCAA，與HAK4細胞同樣地，於HAK1B細胞中，肝臟癌幹細胞之標記即EpCAM及AFP之表現亦降低、分化標記即CYP3A4之表現上昇。由以上結果，顯示BCAA會誘導肝臟癌之癌幹細胞朝向癌非幹細胞之分化，使癌幹細胞減少。
實施例4：合併使用5FU(5-fluorouracil)與BCAA，對人類肝臟癌細胞株HAK1B之效果(in vivo試驗)
於7週齡之雌BALB/c裸鼠(由日本Charles River購入)中皮下移植700萬個/個體之HAK1B細胞。1週後基於腫瘤面積實施分群。將5FU 250μg/tumor(vehicle 10% DMSO/DW)投予至腫瘤內(參照Cancer Research,70(11),4687-4697,2010)，並且供予3(w/w)% BCAA混餌食或3(w/w)%酪蛋白混餌食2週。亦即，4群之處置係如以下所述：
1群：vehicle+酪蛋白混餌食(控制群)
2群：5FU+酪蛋白混餌食
3群：vehicle+BCAA混餌食
4群：5FU+BCAA混餌食
使用游標卡尺由腫瘤外側測定腫瘤體積(長徑x短徑x高度(mm3))，藉以監測腫瘤體積隨時間經過的變化。第43天解剖，測量腫瘤之重量及體積。
結果如圖4~6所示。BCAA單獨處理群(3群)，相較於控制群(1群)，並無觀察到腫瘤重量及腫瘤體積之顯著變化。藉由5FU單獨處理，腫瘤重量及腫瘤體積顯著減少(2群)，合併使用BCAA時，5FU之腫瘤重量及腫瘤體積的減少效果會增強。由以上結果，顯示BCAA於體內亦可增強5FU之抗腫瘤效果。
實施例5：BCAA對人類大腸癌細胞株HCT116中之幹細胞標記表現的效果
將HCT116細胞(人類大腸癌細胞株)以4000個/well播種於培養盤，於2mM BCAA或LC 2.5%培養基中培養72小時。72小時培養後，回收細胞，與抗CD44抗體(一次抗體)於1小時室溫靜置，再與接合Cy5之二次抗體於1小時室溫靜置。以4%三聚甲醛固定細胞，以赫斯特(Hoechst)33258溶液染色(於5分鐘室溫靜置)，以PBS取代染色液，藉由Array Scan解析CD44陽性細胞之比例。CD44係大腸癌幹細胞標記。
結果如圖7所示。藉由BCAA，於HCT116細胞中，大腸癌幹細胞之標記即CD44的表現顯著地降低。由以上結果，顯示BCAA不只是肝臟癌幹細胞，亦會誘導大腸癌幹細胞朝向非幹細胞之分化。
實施例6：合併使用5FU與BCAA對人類大腸癌細胞株HCT116之效果(in vitro試驗)
將HCT116細胞(人類大腸癌細胞株)以4000個/well之濃度播種於培養盤，於以下條件下培養72小時：
．LC 2.5%培養基
．BCAA(2mM)
．5FU(2μg/ml)
．BCAA(2mM)+5FU(2μg/ml)
72小時後，使用ApoAlert Annexin V-FITC Apoptosis kit(Clontech)將細胞以annexin V染色及固定，以Array Scan(Thermo Fisher)檢測凋亡細胞(%)。
結果如圖8所示。藉由5FU單獨處理，凋亡細胞會增加，合併使用BCAA時，5FU之凋亡誘導會增強。由以上結果，顯示BCAA不只是肝臟癌，在大腸癌中亦會增強5FU之抗腫瘤效果。
實施例7：BCAA對人類大腸癌細胞株HCT116之轉移的效果(in vivo試驗)
將人類大腸癌細胞HCT116，以1×105個/隻移植至BALB/c裸鼠(雌、6週齡、各群5隻)。HCT116細胞預先以4mM BCAA處理7天。控制群係不以4mM BCAA處理HCT116細胞。細胞之移植，係由如下方式進行：將小鼠肌肉層切開後，露出脾臟，將脾臟兩端血管寬鬆地以線綑綁，以注射針對脾臟慢慢地打入HCT116細胞(100μl )，將兩端之線綑綁止血後，取出脾臟，縫合肌肉層，以釘書針固定皮膚。將小鼠以一般方式養育3週後，使小鼠安樂死，測定肝臟表面之轉移癌的個數。
結果，控制群中，全部的5隻小鼠均觀察到在肝臟表面有轉移癌的形成，但在BCAA處理群中，僅於1隻觀察到轉移癌的形成。又，每1隻之轉移癌的個數，亦藉由BCAA處理而顯著地被抑制(圖9)。由以上結果，顯示了BCAA會減少大腸癌的轉移能力。又，與實施例5的結果合併時，顯示該BCAA之抑制大腸癌轉移的效果，可能是由CD44表現降低而造成。
實施例8：合併使用5FU與BCAA對人類胃癌細胞株MKN45之效果(in vitro試驗)
將MKN45細胞(人類胃癌細胞株)以4000個/100μl/well播種於96孔盤，於以下條件培養72小時：
．LC培養基(10% FBS)
．LC培養基+BCAA(2mM或4mM)
．LC培養基+5FU(0.05μg/ml、0.1μg/ml、0.5μg/ml或1μg/ml)
．LC培養基+BCAA(2mM或4mM)+5FU(0.05μg/ml、0.1μg/ml、0.5μg/ml或1μg/ml)
72小時後，添加WST-8試藥(10μl/well)，顯色1小時後，測定OD450nm之吸光度。以無刺激群之吸光度 為100%時的相對值來表示各群的吸光度。再者，WST-8係藉由細胞內脫氫酵素而被還原，生成水溶性的甲(formazan)，藉由直接測定此甲在450nm之吸光度，可容易地測量活細胞數。細胞數與所生成之甲的量係成直線的比例關係。
結果如圖10所示。藉由5FU單獨處理，活細胞數減少，合併使用BCAA時，會增強5FU導致之活細胞數的減少。由以上結果，顯示BCAA在胃癌亦可增強5FU之抗腫瘤效果。
實施例9：合併使用5FU與BCAA對人類胃癌細胞株MKN45之效果(in vitro試驗)
將MKN45細胞(人類胃癌細胞株)以4000個/100μl/well播種於96孔盤，於以下條件下培養72小時：
．LC培養基(10% FBS)
．LC培養基+BCAA(2mM或4mM)
．LC培養基+5FU(0.05μg/ml或0.1μg/ml)
．LC培養基+BCAA(2mM或4mM)+5FU(0.05μg/ml或0.1μg/ml)
72小時後，去除上清液，以三聚甲醛固定細胞後，以Hoechst試藥進行核染色，以陣列掃描之cell cycle模式來解析凋亡細胞的比例。
結果如圖11所示。藉由合併使用5FU與BCAA，凋 亡細胞數顯著地增加。由以上結果，顯示BCAA所造成之5FU對胃癌之抗腫瘤效果的增強，可能是由凋亡之增強所造成。
實施例10：BCAA對人類胃癌細胞株MKN45中幹細胞標記之表現的效果
將MKN45細胞(人類胃癌細胞株)以4000個/100μl/well播種於96孔盤，在RPMI1640培養基(10% FBS)或含有BCAA(2mM或4mM)之RPMI1640培養基(10% FBS)中培養72小時。72小時後去除上清液，以三聚甲醛固定後，與抗CD44抗體(一次抗體)於1小時室溫靜置、再與接合Texas Red之二次抗體靜置1小時。去除上清液，以Hoechst試藥進行核染色後，以Array Scan之target activation模式來解析CD44陽性細胞的比例。
結果如圖12所示。藉由BCAA，於MKN45細胞中，胃癌幹細胞之標記即CD44的表現顯著地降低。由以上結果，顯示BCAA會誘導胃癌幹細胞朝向非幹細胞之分化。
實施例11：合併使用TS-1與BCAA對人類胃癌細胞株MKN45之效果(in vivo試驗)
於6週齡之雌BALB/c裸鼠中皮下移植1×106個/小鼠之MKN45細胞。1週後基於腫瘤體積實施分群。除去星期六日以外，每天經口投予TS-1 10mg/kg(vehicle 0.5% CMC)、TS-1 10mg/kg+BCAA 0.75g/kg、或BCAA 0.75g/kg共6週。亦即，4群中之處置係如以下所述：
1群：CMC(vehicle)
2群：TS-1
3群：TS-1+BCAA
4群：BCAA
再者，TS-1係含有如以下組成之替加氟、吉莫斯特(gimeracil)、及奧替拉西鉀(oteracil potassium)的抗癌劑。
使用游標卡尺，由腫瘤外側測定腫瘤體積(長徑x短徑x高度(mm3))，藉以監測腫瘤體積隨時間經過的變化。第43天解剖，測量腫瘤之重量及體積。
結果如圖13所示。TS-1或BCAA單獨處理群中，相較於CMC群，可觀察到腫瘤體積減少的傾向，但是並無觀察到顯著的變化。藉由合併使用TS-1與BCAA，腫瘤體積顯著地減少。由以上結果，顯示BCAA於體內會增強TS-1之抗腫瘤效果。
實施例12：5FU及BCAA對人類乳癌細胞株MDA-MB231 之增殖及幹細胞標記表現的效果
將MDA-MB231細胞懸濁於RPMI-10%(含有10% FBS之RPMI培養基)中，以2000個/well播種於培養盤。次日，將培養基如以下方式交換，進一步培養5天。
1群：RPMI-10%
2群：含有BCAA(4mM)之RPMI-10%
3群：含有5-FU(0.25μg/ml)之RPMI-10%
4群：含有5-FU(0.25μg/ml)之RPMI-10%
5天後將細胞核以赫斯特試藥(Hoechst reagent)染色，計算細胞數。又，對1群及2群，以抗CD44抗體染色，藉由使用了螢光顯微鏡定量裝置(Thermo Fisher)的Array Scan，來解析CD44陽性細胞之比例。
結果如圖14及15所示。藉由5FU單獨處理，活細胞數會減少，合併使用BCAA時，會增強5FU所造成之活細胞數的減少。由以上結果，顯示BCAA於乳癌中會增強5FU之抗腫瘤效果。又，藉由BCAA，於MDA-MB231細胞中亦觀察到乳癌幹細胞之標記即CD44的表現有降低的傾向。由以上結果，顯示了BCAA誘導乳癌幹細胞朝向非幹細胞分化之可能性。
實施例13：BCAA對人類肝臟癌細胞株HAK1B之幹細胞標記表現的效果(in vivo試驗)
於7週齡之雌BALB/c裸鼠(由日本Charles River購
入)中皮下移植700萬個/個體之HAK1B細胞。1週後基於腫瘤面積實施分群。將5FU 250μg/tumor(vehicle 10% DMSO/DW)投予至腫瘤內(參照Cancer Research,70(11),4687-4697,2010)，並且供給3(w/w)% BCAA混餌食或3(w/w)%酪蛋白混餌食2週。亦即，4群當中之處置係如以下所述：
1群：vehicle+酪蛋白混餌食(控制群)
2群：5FU+酪蛋白混餌食
3群：vehicle+BCAA混餌食
4群：5FU+BCAA混餌食
第15天，取出腫瘤組織，使用TriPure Isolation Reagent(Roche)抽出RNA。使用High Capacity cDNA RT kit(Applied Biosystems)來合成cDNA。藉由RT-PCR，定量EpCAM(Epithelial cell adhesion molecule；肝臟癌幹細胞之標記)的mRNA表現。RT-PCR所用的引子與實施例1相同。
結果如圖16所示。藉由BCAA，HAK1B細胞中之肝臟癌幹細胞之標記即EpCAM降低。由以上結果，顯示BCAA在體內亦會誘導肝臟癌之癌幹細胞朝向癌非幹細胞之分化，減少癌幹細胞，藉以增大腫瘤對5FU之感受性。
實施例14：合併使用BCAA對人類胃癌細胞株MKN45之 幹細胞標記表現的效果(in vivo試驗)
於6週齡之雌BALB/c裸鼠中，皮下移植1×106個/小鼠之MKN45細胞。1週後基於腫瘤體積實施分群。除去星期六日以外，每天經口投予TS-1 10mg/kg(vehicle 0.5% CMC)、TS-1 10mg/kg+BCAA 0.75g/kg、或BCAA 0.75g/kg共6週。亦即，4群之處置係如以下所示：
1群：CMC(vehicle)
2群：TS-1
3群：TS-1+BCAA
4群：BCAA
43天後，取出腫瘤組織，使用TriPure Isolation Reagent(Roche)抽出RNA。使用High Capacity cDNA RT kit(Applied Biosystems)來合成cDNA。藉由RT-PCR，來定量CD44(癌幹細胞之標記)、nanog(未分化標記)及ABCB5(ABC轉運蛋白，已報告癌幹細胞中有表現)之mRNA表現。RT-PCR所用之引子係如以下所述。
結果如圖17所示。藉由BCAA，MKN45細胞中之CD44、nanog及ABCB5的表現降低。由以上結果，顯示BCAA在體內亦會誘導胃癌之癌幹細胞朝向癌非幹細胞之分化，減少癌幹細胞，藉以增大腫瘤對TS-1之感受性。
[產業上之可利用性]
支鏈胺基酸會促進癌幹細胞朝向癌非幹細胞之分化，且提高對化學療法劑之感受性，因此藉由將之與化學療法劑組合，投予至罹患包含癌幹細胞之癌的患者，能夠有效地治療癌。
又，藉由將支鏈胺基酸與化學療法劑組合，投予至曾經罹患過包含癌幹細胞之癌的患者，能夠有效地預防癌的轉移或復發。
因此，本發明係有用於作為用以預防或治療癌的醫藥等。
本申請案係以在日本申請的日本特願2011-32511(申請日：2011年2月17日)及日本特願2011-215605(申請日：2011年9月29日)為基礎，其內容全部包含於本說明書中。
圖1表示BCAA對HAK4細胞中之EpCAM1、AFP及CYP3A4的mRNA表現之效果。縱軸表示以LC2.5%處理 時之表現為1時，各基因之相對mRNA表現量。T-test,n=6,＊p<0.05，平均值+SE。
圖2表示合併使用5FU與BCAA之HAK4細胞的凋亡誘導。縱軸表示Annexin V陽性細胞之百分比。T-test,n=7,＊p<0.05，平均值+SE。
圖3表示BCAA對HAK1B細胞中之EpCAM1、AFP及CYP3A4的mRNA表現之效果。縱軸表示以LC2.5%處理時之表現為1時，各基因之相對mRNA表現量。T-test,n=6,＊p<0.05，平均值+SE。
圖4表示經移植HAK1B細胞之Balb/c裸鼠中，腫瘤體積隨時間經過的變化。1群：vehicle+酪蛋白混餌食(控制群)、2群：5FU+酪蛋白混餌食、3群：vehicle+BCAA混餌食、4群：5FU+BCAA混餌食。
圖5表示第15天之腫瘤體積。Dunnet test,n=6,＊p<0.05,＊＊＊p<0.001，平均值+SE。
圖6表示第15天之腫瘤重量。Dunnet test,n=6,＊p<0.05,＊＊＊p<0.001，平均值+SE。
圖7表示BCAA對HCT116細胞之CD44表現的效果。縱軸表示CD44陽性細胞之百分比。T-test,n=7,＊p<0.05，平均值+SE。
圖8表示合併使用5FU與BCAA之HCT116細胞的凋亡誘導。縱軸表示Annexin V陽性細胞之百分比。T-test,n=14,＊p<0.05，平均值+SE。
圖9表示BCAA對HCT116細胞之肝臟轉移的效果。 縱軸表示小鼠每1隻之肝轉移數。
圖10表示合併使用5FU與BCAA之MKN45細胞的細胞死亡誘導。縱軸表示OD450nm之相對值。T-test,＊p<0.05,n=8。
圖11表示合併使用5FU與BCAA之MKN45細胞的凋亡誘導。縱軸表示凋亡細胞之百分比。T-test,＊p<0.05,n=8。
圖12表示BCAA對MKN45細胞之CD44表現的效果。縱軸表示CD44陽性細胞之百分比。T-test,＊p<0.01,n=8。
圖13表示6週後之腫瘤體積。Dunnet test,n=6,＊＊p<0.01，平均值+SE。
圖14表示合併使用5FU與BCAA之MDA-MB231細胞的增殖抑制。Student test vs 5FU,＊＊＊p<0.001，平均值+SE。
圖15表示BCAA對MDA-MB231細胞之CD44表現的效果。縱軸表示CD44陽性細胞之百分比。Student test vs RPMI-10%，平均值+SE。
圖16表示體內之BCAA對HAK1B細胞之EpCAM mRNA表現的效果。T-test,n=6,＊p<0.05。
圖17表示體內之BCAA對MKN45細胞之CD44、nanog、及ABCB5之mRNA表現的效果。Dunnet test,n=8,＊p<0.05,＊＊p<0.01,＊＊＊p<0.005 v.s.control。
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<400> 14

Claims (20)

  1. 一種含有有效量之異白胺酸、白胺酸及纈胺酸之支鏈胺基酸或其鹽之用以製造對包含癌幹細胞之癌增強化學療法劑之抗腫瘤活性之劑的用途，其中上述異白胺酸：白胺酸：纈胺酸的重量比為1：1~3：0.5~2.0。
  2. 如申請專利範圍第1項之用途，其中，對於罹患包含癌幹細胞之癌的哺乳動物、或曾經罹患過包含癌幹細胞之癌的哺乳動物，前述劑與化學療法劑組合來投予。
  3. 如申請專利範圍第1項之用途，其中前述化學療法劑為代謝拮抗劑、烷化劑、抗癌性抗生素、植物鹼、或分子標的治療劑。
  4. 如申請專利範圍第1項之用途，其中前述化學療法劑為5FU。
  5. 如申請專利範圍第1項之用途，其中前述包含癌幹細胞之癌為化學療法劑抗性之癌。
  6. 如申請專利範圍第1項之用途，其中前述包含癌幹細胞之癌為胃癌、肝癌、乳癌或大腸癌。
  7. 一種含有有效量之異白胺酸、白胺酸及纈胺酸之支鏈胺基酸或其鹽與化學療法劑組合而成之用以製造治療包含癌幹細胞之癌之劑的用途，其中上述異白胺酸：白胺酸：纈胺酸的重量比為1：1~3：0.5~2.0。
  8. 如申請專利範圍第7項之用途，其中前述化學療 法劑為代謝拮抗劑、烷化劑、抗癌性抗生素、植物鹼、或分子標的治療劑。
  9. 如申請專利範圍第7項之用途，其中前述化學療法劑為5FU。
  10. 如申請專利範圍第7項之用途，其中前述包含癌幹細胞之癌為化學療法劑抗性之癌。
  11. 如申請專利範圍第7項之用途，其中前述包含癌幹細胞之癌為胃癌、肝癌、乳癌或大腸癌。
  12. 一種含有有效量之異白胺酸、白胺酸及纈胺酸之支鏈胺基酸或其鹽與化學療法劑組合而成之用以製造預防包含癌幹細胞之癌的轉移或復發之劑的用途，其中上述異白胺酸：白胺酸：纈胺酸的重量比為1：1~3：0.5~2.0。
  13. 如申請專利範圍第12項之用途，其中前述化學療法劑為代謝拮抗劑、烷化劑、抗癌性抗生素、植物鹼、或分子標的治療劑。
  14. 如申請專利範圍第12項之用途，其中前述化學療法劑為5FU。
  15. 如申請專利範圍第12項之用途，其中前述包含癌幹細胞之癌為化學療法劑抗性之癌。
  16. 如申請專利範圍第12項之用途，其中前述包含癌幹細胞之癌為胃癌、肝癌、乳癌或大腸癌。
  17. 一種含有有效量之異白胺酸、白胺酸及纈胺酸之支鏈胺基酸或其鹽之用以製造誘導癌幹細胞分化之劑的用 途，其中上述異白胺酸：白胺酸：纈胺酸的重量比為1：1~3：0.5~2.0。
  18. 如申請專利範圍第17項之用途，其中前述癌幹細胞為胃癌幹細胞、肝癌幹細胞或大腸癌幹細胞。
  19. 一種含有有效量之異白胺酸、白胺酸及纈胺酸之支鏈胺基酸或其鹽之用以製造抑制包含癌幹細胞之癌的轉移之劑的用途，其中上述異白胺酸：白胺酸：纈胺酸的重量比為1：1~3：0.5~2.0。
  20. 如申請專利範圍第19項之用途，其中前述包含癌幹細胞之癌為胃癌、肝癌、乳癌或大腸癌。
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