KR101919747B1 - 화학요법제의 항종양 활성 증강제 - Google Patents

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Abstract

본 발명은 이소류신, 류신 및 발린으로부터 선택되는 적어도 1종의 분기쇄 아미노산 또는 이의 염을 함유하는, 암 줄기세포를 포함하는 암에 대한, 화학요법제의 항종양 활성을 증강시키기 위한 제제에 관한 것이다. 또한, 본 발명은 이소류신, 류신 및 발린으로부터 선택되는 적어도 1종의 분기쇄 아미노산 또는 이의 염과, 화학요법제를 조합하여 이루어지는, 암 줄기세포를 포함하는 암을 치료하기 위한 제제에 관한 것이다. 또한, 본 발명은 이소류신, 류신 및 발린으로부터 선택되는 적어도 1종의 분기쇄 아미노산 또는 이의 염과, 화학요법제를 조합하여 이루어지는, 암 줄기세포를 포함하는 암의 전이 또는 재발을 예방하기 위한 제제에 관한 것이다.

Description

화학요법제의 항종양 활성 증강제{POTENTIATOR OF ANTITUMOR ACTIVITY OF CHEMOTHERAPEUTIC AGENT}
본 발명은, 분기쇄(分岐鎖) 아미노산을 함유한, 암 줄기세포를 포함하는 암에 대한 화학요법제의 항종양 활성을 증강시키기 위한 제제, 분기쇄 아미노산을 함유한, 암 줄기세포의 분화를 유도하기 위한 제제, 분기쇄 아미노산과 화학요법제를 조합하여 이루어지는 암 줄기세포를 포함하는 암의 전이·재발 억제 또는 치료제 등에 관한 것이다.
암 줄기세포는 종양에 포함되는 암 세포의 서브파퓰레이션(subpopulation)의 하나이며, 자기 복제능 및 다분화능을 가지고 있어, 동소성(同所性)의 이입을 실시했을 때에, 암 야기 능력을 가지고 있다(비특허문헌 1).
여러 종류의 암에 있어서, 암 줄기세포에 특이적으로 발현되는 마커의 존재가 알려져 있고, 이들 마커 발현에 기초하여 암 세포가 암 줄기세포인지의 여부를 평가할 수 있다. 간암 줄기세포의 마커로서는, EpCAM, AFP 등이 알려져 있다(비특허문헌 2). 대장암 줄기세포의 마커로서는, CD44, CD24 등이 알려져 있다(비특허문헌 3). 유방암 줄기세포의 마커로서는, CD44, CD24, EpCAM 등이 알려져 있다(비특허문헌 1).
암 줄기세포는 일반적으로 증식의 속도가 느리기 때문에, 화학요법제에 대해 저항성을 나타낸다. 이에 반하여, 분화된 암 세포(암 비줄기세포)는 증식의 속도가 빠르기 때문에, 화학요법제에 대한 감수성이 높다. 화학요법제의 대부분은 암 세포의 증식 메커니즘을 표적으로 하기 때문에, 화학요법제에 의한 치료에서는, 암 비줄기세포만을 표적으로 하고 있어, 암 줄기세포를 효과적으로 살상할 수 없을 가능성이 있다. 그 때문에 화학요법제에 의한 치료에 의해 대부분의 암 세포가 퇴축(退縮)하여도, 극히 소수의 암 줄기세포가 남아 있으면 재발이 일어날 수 있게 되고, 이것이 암에 있어서 종종 전이·재발이 생기는 원인이라고 여겨지고 있다. 따라서, 암 줄기세포의 암 비줄기세포로의 분화를 촉진시키고, 화학요법제에 대한 감수성을 높일 수 있으면, 암 줄기세포를 포함하는 암 전체를 효율적으로 치료 또는 예방할 수 있을 것으로 기대되고 있다.
분기쇄 아미노산(BCAA)은, 지금까지 간암의 발생이나 진전을 억제하는 것이 보고되어 있다(특허문헌 1 내지 4). 또한, 분기쇄 아미노산의 장기 투여에 의해, 간세포암의 재발이 억제되는 것이 보고되어 있다(비특허문헌 4). 또한, 분기쇄 아미노산이 Akt의 활성화를 억제함으로써, 고인슐린 혈증을 나타내거나 또는 고인슐린 혈증의 위험성이 있는 환자에 있어서의 암의 발생이나 진전을 억제하는 것이 보고되어 있다(특허문헌 5). 또한, 분기쇄 아미노산이 IFN 작용 물질의 항C형 간염 바이러스 활성을 증강시키는 것이 보고되어 있다(특허문헌 6).
그러나, 분기쇄 아미노산의, 암 줄기세포의 암 비줄기세포로의 분화에 대한 효과에 관해서는 지금까지 밝혀져 있지 않다.
특허문헌 1: W02003/16208 특허문헌 2: W02004/058243 특허문헌 3: W02007/018278 특허문헌 4: W02006/06729 특허문헌 5: W02007/018281 특허문헌 6: W02007/013677
비특허문헌 1: PNAS, vol. 100, No. 7, pages 3983-3988, 2003 비특허문헌 2: Cancer Research, vol. 65, No. 8, pages 1451-1461, 2008 비특허문헌 3: PNAS, vol. 171, No. 8, pages 3722-3727, 2010 비특허문헌 4: 닛쇼지(日消誌), vol. 105, pages 808-816, 2008
본 발명은, 암 줄기세포의 암 비줄기세포로의 분화를 촉진시키고, 화학요법제에 대한 감수성을 높이는 기술을 개발하고, 이에 기초하여 효과적으로 암 줄기세포를 포함하는 암을 치료하고, 암의 재발을 예방하는 수단을 제공하는 것이다.
본 발명자들은 상기 과제를 해결하기 위해 예의 연구를 거듭한 결과, 특정한 BCAA가 암 줄기세포의 암 비줄기세포로의 분화를 촉진시키고, 화학요법제에 대한 감수성을 높이는 것을 밝혀내어 본 발명을 완성하였다.
즉, 본 발명은 이하와 같다.
[1] 이소류신, 류신 및 발린으로부터 선택되는 적어도 1종의 분기쇄 아미노산 또는 이의 염을 함유한, 암 줄기세포를 포함하는 암에 대한, 화학요법제의 항종양 활성을 증강시키기 위한 제제.
[2] 암 줄기세포를 포함하는 암에 이환(罹患)되어 있는 포유동물, 또는 암 줄기세포를 포함하는 암의 이환력(罹患歷)을 갖는 포유동물에 대해, 화학요법제와 조합하여 투여되는, [1]의 제제.
[3] 이소류신 또는 이의 염, 류신 또는 이의 염, 및 발린 또는 이의 염을 함유하는, [1]의 제제.
[4] 화학요법제가, 대사 길항제, 알킬화제, 항암성 항생 물질, 식물 알칼로이드, 또는 분자 표적 치료제인, [1]의 제제.
[5] 화학요법제가 5FU인, [1]의 제제.
[6] 암 줄기세포를 포함하는 암이 화학요법제 저항성의 암인, [1]의 제제.
[7] 암 줄기세포를 포함하는 암이, 위암, 간암, 유방암 또는 대장암인, [1]의 제제.
[8] 이소류신, 류신 및 발린으로부터 선택되는 적어도 1종의 분기쇄 아미노산 또는 이의 염과, 화학요법제를 조합하여 이루어지는, 암 줄기세포를 포함하는 암을 치료하기 위한 제제.
[9] 이소류신 또는 이의 염, 류신 또는 이의 염, 및 발린 또는 이의 염을 함유하는, [8]의 제제.
[10] 화학요법제가, 대사 길항제, 알킬화제, 항암성 항생 물질, 식물 알칼로이드, 또는 분자 표적 치료제인, [8]의 제제.
[11] 화학요법제가 5FU인, [8]의 제제.
[12] 암 줄기세포를 포함하는 암이 화학요법제 저항성의 암인, [8]의 제제.
[13] 암 줄기세포를 포함하는 암이, 위암, 간암, 유방암 또는 대장암인, [8]의 제제.
[14] 이소류신, 류신 및 발린으로부터 선택되는 적어도 1종의 분기쇄 아미노산 또는 이의 염과, 화학요법제를 조합하여 이루어지는, 암 줄기세포를 포함하는 암의 전이 또는 재발을 예방하기 위한 제제.
[15] 이소류신 또는 이의 염, 류신 또는 이의 염, 및 발린 또는 이의 염을 함유하는, [14]의 제제.
[16] 화학요법제가, 대사 길항제, 알킬화제, 항암성 항생 물질, 식물 알칼로이드, 또는 분자 표적 치료제인, [14]의 제제.
[17] 화학요법제가 5FU인, [14]의 제제.
[18] 암 줄기세포를 포함하는 암이 화학요법제 저항성의 암인, [14]의 제제.
[19] 암 줄기세포를 포함하는 암이, 위암, 간암, 유방암 또는 대장암인, [14]의 제제.
[20] 이소류신, 류신 및 발린으로부터 선택되는 적어도 1종의 분기쇄 아미노산 또는 이의 염을 함유하는, 암 줄기세포의 분화를 유도하기 위한 제제.
[21] 이소류신 또는 이의 염, 류신 또는 이의 염, 및 발린 또는 이의 염을 함유하는, [20]의 제제.
[22] 암 줄기세포가, 위암 줄기세포, 간암 줄기세포 또는 대장암 줄기세포인, [20]의 제제.
[23] 이소류신, 류신 및 발린으로부터 선택되는 적어도 1종의 분기쇄 아미노산 또는 이의 염을 함유하는, 암 줄기세포를 포함하는 암의 전이를 억제하기 위한 제제.
[24] 이소류신 또는 이의 염, 류신 또는 이의 염, 및 발린 또는 이의 염을 함유하는, [23]의 제제.
[25] 암 줄기세포를 포함하는 암이, 위암, 간암, 유방암 또는 대장암인, [23]의 제제.
[26] 화학요법제의 항종양 활성의 증강에 있어서 사용하기 위한, 이소류신, 류신 및 발린으로부터 선택되는 적어도 1종의 분기쇄 아미노산 또는 이의 염.
[27] 암 줄기세포를 포함하는 암의 치료에 있어서 사용하기 위한, 이소류신, 류신 및 발린으로부터 선택되는 적어도 1종의 분기쇄 아미노산 또는 이의 염, 및 화학요법제를 함유하는 조합물.
[28] 암 줄기세포를 포함하는 암의 전이 또는 재발의 예방에 있어서 사용하기 위한, 이소류신, 류신 및 발린으로부터 선택되는 적어도 1종의 분기쇄 아미노산 또는 이의 염, 및 화학요법제를 함유하는 조합물.
[29] 암 줄기세포의 분화 유도에 있어서 사용하기 위한, 이소류신, 류신 및 발린으로부터 선택되는 적어도 1종의 분기쇄 아미노산 또는 이의 염.
[30] 암 줄기세포를 포함하는 암의 전이의 억제에 있어서 사용하기 위한, 이소류신, 류신 및 발린으로부터 선택되는 적어도 1종의 분기쇄 아미노산 또는 이의 염.
[31] 이소류신, 류신 및 발린으로부터 선택되는 적어도 1종의 분기쇄 아미노산 또는 이의 염의 유효량을 포유동물에게 투여하는 것을 포함하는, 당해 포유동물에 있어서의 화학요법제의 항종양 활성 증강 방법.
[32] 이소류신, 류신 및 발린으로부터 선택되는 적어도 1종의 분기쇄 아미노산 또는 이의 염, 및 화학요법제의 유효량을 포유동물에게 투여하는 것을 포함하는, 당해 포유동물에 있어서의 암 줄기세포를 포함하는 암의 치료 방법.
[33] 이소류신, 류신 및 발린으로부터 선택되는 적어도 1종의 분기쇄 아미노산 또는 이의 염, 및 화학요법제의 유효량을 포유동물에게 투여하는 것을 포함하는, 당해 포유동물에 있어서의 암 줄기세포를 포함하는 암의 전이 또는 재발의 예방 방법.
[34] 이소류신, 류신 및 발린으로부터 선택되는 적어도 1종의 분기쇄 아미노산 또는 이의 염의 유효량을 포유동물에게 투여하는 것을 포함하는, 당해 포유동물에 있어서의 암 줄기세포의 분화 유도 방법.
[35] 이소류신, 류신 및 발린으로부터 선택되는 적어도 1종의 분기쇄 아미노산 또는 이의 염의 유효량을 포유동물에게 투여하는 것을 포함하는, 당해 포유동물에 있어서의 암 줄기세포를 포함하는 암의 전이의 억제 방법.
분기쇄 아미노산은 암 줄기세포의 암 비줄기세포로의 분화를 촉진시키고, 화학요법제에 대한 감수성을 높이므로, 이를 화학요법제와 조합하여, 암 줄기세포를 포함하는 암에 이환되어 있는 환자에게 투여함으로써, 효과적으로 암을 치료하는 것이 가능하다.
또한, 분기쇄 아미노산을 화학요법제와 조합하여, 암 줄기세포를 포함하는 암의 이환력이 있는 환자에게 투여함으로써, 효과적으로 암의 전이나 재발을 예방하는 것이 가능하다.
도 1은, HAK4 세포에서의 EpCAM1, AFP 및 CYP3A4의 mRNA 발현에 대한 BCAA의 효과를 도시한다. 세로축은, LC 2.5% 처리시에 있어서의 발현을 1이라고 했을 경우의 각 유전자의 상대적인 mRNA 발현량을 나타낸다. T-검정, n=6, *p<0.05, 평균값+SE.
도 2는, 5FU와 BCAA의 병용에 의한 HAK4 세포의 아포토시스 유도를 도시한다. 세로축은 아넥신 V 양성 세포의 퍼센티지를 나타낸다. T-검정, n=7, *p<0.05, 평균값+SE.
도 3은, HAK1B 세포에서의 EpCAM1, AFP 및 CYP3A4의 mRNA 발현에 대한 BCAA의 효과를 도시한다. 세로축은, LC 2.5% 처리시에 있어서의 발현을 1이라고 했을 경우의 각 유전자의 상대적인 mRNA 발현량을 나타낸다. T-검정, n=6, *p<0.05, 평균값+SE.
도 4는, HAK1B 세포를 이식한 Balb/c 누드마우스에 있어서의 종양 체적의 경시적 변화를 도시한다. 1군: 비히클+카세인 혼합식(컨트롤군), 2군: 5FU+카세인 혼합식, 3군: 비히클+BCAA 혼합식, 4군: 5FU+BCAA 혼합식.
도 5는, 15일째에 있어서의, 종양 체적을 도시한다. 더넷 검정(Dunnet test), n=6, *p <0.05, ***p<0.001, 평균값+SE.
도 6은, 15일째에 있어서의, 종양 중량을 도시한다. 더넷 검정, n=6, *p <0.05, ***p<0.001, 평균값+SE.
도 7은, HCT116 세포의 CD44 발현에 대한 BCAA의 효과를 도시한다. 세로축은 CD44 양성 세포의 퍼센티지를 나타낸다. T-검정, n=7, *p<0.05, 평균값+SE.
도 8은, 5FU와 BCAA의 병용에 의한 HCTI16 세포의 아포토시스 유도를 도시한다. 세로축은 아넥신 V 양성 세포의 퍼센티지를 나타낸다. T-검정, n=14, *p <0.05, 평균값+SE.
도 9는, HCT116 세포의 간 전이에 대한 BCAA의 효과를 도시한다. 세로축은 마우스 1마리당의 간 전이 수를 나타낸다.
도 10은, 5FU와 BCAA의 병용에 의한 MKN45 세포의 세포사 유도를 도시한다. 세로축은 OD450nm의 상대값을 나타낸다. T-검정, *p<0.05, n=8.
도 11은, 5FU와 BCAA의 병용에 의한 MKN45 세포의 아포토시스 유도를 도시한다. 세로축은 아포토시스 세포의 퍼센티지를 나타낸다. T-검정, *p<0.05, n=8.
도 12는, MKN45 세포의 CD44 발현에 대한 BCAA의 효과를 도시한다. 세로축은 CD44 양성 세포의 퍼센티지를 나타낸다. T-검정, *p<0.01, n=8.
도 13은, 6주일 후에 있어서의, 종양 체적을 도시한다. 더넷 검정, n=6, **p<0.01, 평균값+SE.
도 14는, 5FU와 BCAA의 병용에 의한 MDA-MB231 세포의 증식 억제를 도시한다. 스튜던트 검정(Student test) vs 5FU, ***p<0.001, 평균값+SE.
도 15는, MDA-MB231 세포의 CD44 발현에 대한 BCAA의 효과를 도시한다. 세로축은 CD44 양성 세포의 퍼센티지를 나타낸다. 스튜던트 검정 vs RPMI-10%, 평균값+SE.
도 16은, 인 비보(in vivo)에 있어서의, BCAA의 HAK1B 세포의 EpCAM mRNA 발현에 대한 효과를 도시한다. T-검정, n=6, *p<0.05.
도 17은, 인 비보에 있어서의, BCAA의 MKN45 세포의 CD44, nanog, 및 ABCB5의 mRNA 발현에 대한 효과를 도시한다. 더넷 검정, n=8, *p<0.05, **p<0.01, ***p<0.005 v.s. 컨트롤.
본 발명은, 이소류신, 류신 및 발린으로부터 선택되는 적어도 1종의 분기쇄 아미노산 또는 이의 염(바람직하게는, 이소류신 또는 이의 염, 류신 또는 이의 염, 및 발린 또는 이의 염)을 함유하는, 암 줄기세포를 포함하는 암에 대한, 화학요법제의 항종양 활성을 증강시키기 위한 제제(또는 조성물) 및/또는 암 줄기세포의 분화를 유도하기 위한 제제(또는 조성물)(이하, 이들 제제를 본 발명의 제제 또는 조성물이라고도 칭한다)를 제공하는 것이다.
다른 형태에 있어서, 본 발명의 제제(또는 조성물)는 암 줄기세포를 포함하는 암의 전이를 억제하기 위한 제제(또는 조성물)일 수 있다.
본 발명의 제제 또는 조성물은 이소류신, 류신 및 발린으로부터 선택되는 적어도 1종의 분기쇄 아미노산 또는 이의 염(바람직하게는, 이소류신 또는 이의 염, 류신 또는 이의 염, 및 발린 또는 이의 염을 함유하는 조합)이, 암 줄기세포의 암 비줄기세포로의 분화를 촉진시키고, 이 효과에 의해 암 줄기세포를 포함하는 암에 대한 화학요법제의 항종양 활성을 증강시키는 것을 밝혀낸 것에 기초하여 완성한 것이다. 일반적으로, 암 줄기세포는 증식의 속도가 느리기 때문에, 화학요법제에 대해 저항성을 나타낸다. 이에 반해, 분화된 암 세포(암 비줄기세포)는, 일반적으로 증식의 속도가 빠르기 때문에, 화학요법제에 대한 감수성이 높다. 따라서, 이소류신, 류신 및 발린으로부터 선택되는 적어도 1종의 분기쇄 아미노산 또는 이의 염(바람직하게는, 이소류신 또는 이의 염, 류신 또는 이의 염, 및 발린 또는 이의 염을 함유하는 조합)을, 암 줄기세포를 포함하는 암에 적용하고, 암 줄기세포의 암 비줄기세포로의 분화를 촉진시킴으로써, 당해 암의 화학요법제에 대한 감수성이 높아지고, 그 결과, 당해 암에 대한 화학요법제의 항종양 활성이 증강된다.
다른 형태에 있어서, 본 발명의 제제 또는 조성물은, 이소류신, 류신 및 발린으로부터 선택되는 적어도 1종의 분기쇄 아미노산 또는 이의 염(바람직하게는, 이소류신 또는 이의 염, 류신 또는 이의 염, 및 발린 또는 이의 염을 함유하는 조합)이, 암 줄기세포의 암 비줄기세포로의 분화를 촉진시키고, 이 효과에 의해 암 줄기세포를 포함하는 암의 전이 능력을 억제하는 것을 밝혀낸 것에 기초하여 완성된 것이다.
본 발명에 있어서 암 줄기세포란, 자기 복제능 및 다분화능을 가지고 있어, 동소성의 이입을 실시했을 때에, 종양 야기 능력을 갖고 있는(여기서 형성되는 종양은, 암 줄기세포가 유래하는 기원의 종양 표현형모사(phenocopy)임) 암 세포를 말한다(Nat Rev Cancer, vol. 5, pages 425-436, 2006).
여러 종류의 암에 있어서, 암 줄기세포에 특이적으로 발현되는 마커의 존재가 알려져 있으므로, 이들 마커의 발현에 기초하여 암 세포가 암 줄기세포인지의 여부, 또는 암에 암 줄기세포가 포함되는지를 평가할 수 있다. 일 형태에 있어서, 간암 줄기세포는 EpCAM+AFP+이다(Cancer Research, vol. 65, No. 8, pages 1451-1461, 2008). 일 형태에 있어서, 대장암 줄기세포는 CD44+CD24+이다(PNAS, vol. 171, No. 8, pages 3722-3727, 2010). 일 형태에 있어서, 유방암 줄기세포는 CD44+CD24Low +EpCAM+이다(PNAS, vol. 100, No. 7, pages 3982-3988, 2003). 일 형태에 있어서, 췌장암 줄기세포는 CD44+이다. 여기서, 이들 마커의 발현은, 이들 마커 단백질에 대한 특이적 항체를 사용한 유세포 분석법(flow cytometry) 또는 면역 조직학적 염색에 의해 평가하고, 적어도 어느 하나의 방법에 의해 특이적 염색이 확인된 경우에 당해 마커 발현 양성(+)이라고 결정한다. 유세포 분석법 또는 면역 조직학적 염색에 유용한 이들 마커 단백질에 대한 특이적 항체는 널리 시판되고 있으므로, 당업자라면 이러한 항체를 사용하여 용이하게 암 세포가 암 줄기세포인지의 여부, 또는 암에 암 줄기세포가 포함되는지를 평가할 수 있다.
다른 형태에 있어서, 위암 줄기세포는 CD44+이다.
또한, 이들 암 줄기세포의 마커 발현의 감소를 지표로, 암 줄기세포의 암 비줄기세포로의 분화를 평가할 수 있다. 특정 조건하에서의 처리 전과 비교하여 당해 처리 후에 암에 있어서의 암 줄기세포의 마커의 발현이 감소했을 경우, 당해 처리에 의해 암 줄기세포의 암 비줄기세포로의 분화가 유도되었다고 할 수 있다. 여기서, 암 세포 전체에 있어서의 암 줄기세포의 마커 단백질을 발현하고 있는 세포 수의 비율, 또는 암 전체에 있어서의 암 줄기세포의 마커 단백질량의 어느 한쪽이 감소된 경우에, 암 줄기세포의 마커의 발현이 감소되었다고 판단된다.
본 발명에 있어서, 암에는 모든 조직 유래의 암이 포함된다. 암으로서는, 예를 들면, 간암, 대장암, 신장암, 흑색종, 췌장암, 갑상선암, 위암, 폐암(소세포폐암, 비소세포폐암), 뇌종양, 자궁암, 유방암, 다발성골육종, 난소암, 만성백혈병, 전립선암, 급성 림프성백혈병, 간세포종, 급성 골수성백혈병, 악성 림프종, 섬모암, 소아악성종양, 담낭·담관암 등을 들 수 있지만, 이들에 한정되지 않는다.
일 형태에 있어서, 본 발명의 제제가 적용되는, 암 줄기세포를 포함하는 암은 화학요법제 저항성이다. 「화학요법제 저항성」이란, 사람에게 적용이 인정되고 있는 최대 용량의 화학요법제의 투여시에 있어서, 유의적으로 검출가능한 응답을 나타내지 않는 성질을 말한다. 상기한 바와 같이, 암 줄기세포는 증식의 속도가 느리기 때문에, 화학요법제에 대해 저항성을 나타내기 때문에, 화학요법제 저항성의 암에는, 많은 암 줄기세포가 포함되어 있을 가능성이 있다. 그래서, 특정한 화학요법제에 저항성을 갖는 암에 대해, 본 발명의 제제 또는 조성물을 적용함으로써, 암 줄기세포로부터 암 비줄기세포로의 분화가 촉진되어, 암의 당해 화학요법제에 대한 감수성이 높아지는 것이 기대된다.
상기의 암 중, 간암, 대장암, 신장암, 흑색종, 췌장암, 갑상선암, 위암, 폐암, 유방암 및 비소세포폐암은, 일반적으로 화학요법제에 대한 감수성이 낮아, 화학요법제가 효과를 내기 어려운 것으로 알려져 있다. 따라서, 본 발명의 제제 또는 조성물을 이들 암(바람직하게는 위암, 간암, 유방암 또는 대장암)에 적용하여, 이들 암에 포함되는 암 줄기세포의 분화를 촉진시킴으로써, 이들 암의 화학요법제에 대한 감수성이 높아지는 것이 기대된다.
본 발명에 있어서 화학요법제란, 암 세포에 직접 작용하여, 그 분열을 억제하고, 살상하는 능력을 갖는 화합물을 말한다. 화학요법제로서는, 대사 길항제, 백금 제제, 알킬화제, 항암성 항생 물질, 식물 알칼로이드, 분자 표적 치료제 등을 들 수 있다.
대사 길항제란, 암 세포가 분열·증식할 때에, 핵산의 재료가 되는 물질과 화학적 구조가 근사한 물질로 DNA의 합성을 방해하여, 암 세포의 대사를 저해하여, 증식을 억제하는 화학요법제를 말한다. 대사 길항제로서는, 5-플루오로우라실(5FU), 테가푸르, 카르모푸르, 독시플루리딘, 브록수리딘, 시타라빈, 에노시타빈, 하이드록시피리딘, 하이드록시카바미드, 메토트랙사트, 인산플루다라빈 등의 피리미딘 대사 길항제; 6-머캅토푸린, 6-티오구아닌, 티오이노신, 염산 겜시타빈 등의 푸린 대사 길항제 등을 들 수 있다. 일 형태에 있어서, 대사 길항제는 바람직하게는 피리미딘 대사 길항제이고, 보다 바람직하게는 5-플루오로우라실 또는 테가푸르이다.
백금 제제란, DNA의 구성 염기인 구아닌, 아데닌의 N-7위치에, 2개의 염소 원자 부위에서 결합하고, DNA쇄 내에 가교를 형성하여, DNA 합성을 저해함으로써 암 세포의 증식을 억제하는 효과를 발휘하는 화학요법제를 말한다. 백금 제제로서는, 시스플라틴, 카보플라틴, 네다플라틴, 옥살리플라틴 등을 들 수 있다.
알킬화제란, DNA를 알킬화함으로써 절단하여 암 세포의 증식을 억제하는 효과를 발휘하는 화학요법제를 말한다. 알킬화제로서는, 니트로겐 머스타드, 니트로겐 머스타드 N-옥사이드, 클로람부실 등의 니트로겐 머스타드계 알킬화제; 카르보콘, 티오테파 등의 에틸렌이민 유도체; 부술판, 토실산인프로술판 등의 술폰산에스테르류; 염산니무스틴 등의 니트로소우레아 유도체 등을 들 수 있다.
항암성 항생 물질로서는, 마이토마이신 C, 블레오마이신, 페플로마이신, 다우노루비신, 아클라루비신, 독소루비신, 피라루비신, THP-아드리아마이신, 4'-에피독소루비신, 에피루비신 등의 안트라사이클린계 항생 물질 항종양제; 크로모마이신 A3, 액티노마이신 D 등을 들 수 있다.
식물 알칼로이드로서는, 빈블라스틴, 빈크리스틴 및 빈데신 등의 빈카알칼로이드류; 에토포시드, 테니포시드 등의 에피포도필로톡신류; 파클리탁셀, 도세탁셀 등의 탁산계 알칼로이드 등을 들 수 있다.
분자 표적 치료제란, 암 세포의 증식에 관련된 분자를 표적으로 하여, 그 분자를 저해함으로써 암 세포를 살상하는 활성을 갖는 화합물을 말한다. 분자 표적 치료제로서는, 이마티닙, 게피티닙, 에를로티닙, 반데타닙, 수니티닙, 소라페닙, 리툭시맙, 세툭시맙, 인플릭시맙, 트라스투주맙, 베바시주맙 등을 들 수 있다.
일 형태에 있어서, 본 발명의 제제 또는 조성물은, 간암 줄기세포를 포함하는 간암에 대한, 대사 길항제(바람직하게는 피리미딘 대사 길항제, 보다 바람직하게는 5-플루오로우라실 또는 테가푸르)의 항종양 활성을 증강시키기 위한 것이다.
일 형태에 있어서, 본 발명의 제제 또는 조성물은, 대장암 줄기세포를 포함하는 대장암에 대한, 대사 길항제(바람직하게는 피리미딘 대사 길항제, 보다 바람직하게는 5-플루오로우라실 또는 테가푸르)의 항종양 활성을 증강시키기 위한 것이다.
일 형태에 있어서, 본 발명의 제제 또는 조성물은, 위암 줄기세포를 포함하는 위암, 결장암 줄기세포를 포함하는 결장암, 자궁경암 줄기세포를 포함하는 자궁경암, 자궁체암 줄기세포를 포함하는 자궁체암, 소화기암 줄기세포를 포함하는 소화기암, 췌장암 줄기세포를 포함하는 췌장암, 직장암 줄기세포를 포함하는 직장암, 유방암 줄기세포를 포함하는 유방암, 또는 난소암 줄기세포를 포함하는 난소암에 대한, 대사 길항제(바람직하게는 피리미딘 대사 길항제, 보다 바람직하게는 5-플루오로우라실 또는 테가푸르)의 항종양 활성을 증강시키기 위한 것이다.
본 발명의 제제 또는 조성물에 있어서의 유효 성분(분기쇄 아미노산)인, 이소류신, 류신 및 발린은 각각 L-체, D-체, DL-체의 어느 것이라도 사용가능하지만, 바람직하게는 L-체, DL-체이며, 더 바람직하게는 L-체이다.
이소류신, 류신 및 발린은 각각 유리체뿐만 아니라, 염의 형태로도 사용할 수 있다. 염의 형태로서는, 산부가염이나 염기부가염 등을 들 수 있지만, 화학적으로 허용될 수 있는 염이면 어느 형태를 취할 수도 있다. 본 발명의 제제 또는 조성물이 통상적으로는 의료 목적으로 사용되는 관점에서, 염의 형태로서는 의약으로서 허용되는 염이 바람직하다.
의약으로서 허용되는 염으로서는, 예를 들면 산의 염, 염기의 염을 들 수 있다. 이소류신, 류신 또는 발린에 각각 부가하여 의약으로서 허용되는 염을 형성하는 산으로서는, 예를 들면, 염화수소, 브롬화수소산, 황산, 인산 등의 무기산이나, 아세트산, 락트산, 시트르산, 타르타르산, 말레산, 푸마르산 또는 모노메틸황산 등의 유기산을 들 수 있다. 이소류신, 류신, 또는 발린에 각각 부가하여 의약으로서 허용되는 염을 형성하는 염기로서는, 예를 들면, 나트륨, 칼륨 등의 금속의 수산화물이나, 칼슘 등의 금속의 탄산화물, 암모니아 등의 무기염기, 에틸렌디아민, 프로필렌디아민, 에탄올아민, 모노알킬에탄올아민, 디알킬에탄올아민, 디에탄올아민, 트리에탄올아민 등의 유기 염기를 들 수 있다.
본 발명의 제제 또는 조성물은, 이소류신, 류신 및 발린으로부터 선택되는 적어도 1종의 분기쇄 아미노산 또는 이들 염이 함유되어 있으면 좋고, 이하의 형태가 본 발명에 포함된다:
이소류신 또는 이의 염만을 분기쇄 아미노산으로서 함유하는 형태;
류신 또는 이의 염만을 분기쇄 아미노산으로서 함유하는 형태;
발린 또는 이의 염만을 분기쇄 아미노산으로서 함유하는 형태;
이소류신 또는 이의 염 및 류신 또는 이의 염을 분기쇄 아미노산으로서 함유하는 형태;
이소류신 또는 이의 염 및 발린 또는 이의 염을 분기쇄 아미노산으로서 함유하는 형태;
류신 또는 이의 염 및 발린 또는 이의 염을 분기쇄 아미노산으로서 함유하는 형태; 및
이소류신 또는 이의 염, 류신 또는 이의 염, 및 발린 또는 이의 염을 분기쇄 아미노산으로서 함유하는 형태.
본 발명의 제제 또는 조성물은, 바람직하게는 이소류신 또는 이의 염, 류신 또는 이의 염, 및 발린 또는 이의 염을 함유한다.
본 발명의 제제 또는 조성물에 함유되는 분기쇄 아미노산의 배합비(중량비)는, 당업자라면 본 발명의 제제가 원하는 활성(예를 들면, 암 줄기세포의 분화를 유도하는 활성, 또는 암 줄기세포를 포함하는 암에 대한, 화학요법제의 항종양 활성을 증강시키는 활성)을 갖는 범위에서, 적절히 조정하는 것이 가능하지만, 예를 들면 이소류신 또는 이의 염, 류신 또는 이의 염, 및 발린 또는 이의 염을 함유하는 형태에 있어서는, 이러한 3종의 아미노산의 배합비(이소류신:류신:발린)는, 중량비로서, 통상 1:1 내지 3:0.5 내지 2.0이며, 바람직하게는 1:1.5 내지 2.5:0.8 내지 1.5이며, 보다 바람직하게는 1:1.9 내지 2.2:1.1 내지 1.3이며, 가장 바람직하게는 1:2:1.2이다. 또한, 본 발명의 제제가 이소류신의 염, 류신의 염, 또는 발린의 염을 함유할 경우, 중량비의 계산은 각 분기쇄 아미노산의 염을, 모두 유리체로 환산한 후에 실시하는 것으로 한다.
본 발명의 제제 및 조성물은 동물(바람직하게는, 사람 등의 포유동물)에게 투여할 수 있다.
본 발명의 제제 또는 조성물을, 암 줄기세포를 포함하는 암에 대한, 화학요법제의 항종양 활성을 증강시키기 위한 제제(또는 조성물), 또는 암 줄기세포의 분화를 유도하기 위한 제제(또는 조성물)로서 사용할 경우, 그 투여 형태·제형은 경구 투여, 비경구 투여의 어느 것이라도 좋고, 경구 투여제로서는, 산제, 과립제, 캡슐제, 정제, 츄어블제 등의 고형제, 용액제, 시럽제 등의 액제를 들 수 있고, 또한, 비경구 투여제로서는, 주사제, 수액제, 경비(經鼻)·경폐(經肺)용 스프레이제 등을 들 수 있다. 본 발명의 제제 또는 조성물은 통상의 방법에 의해, 이들 제형의 의약으로 제제화될 수 있다.
환자에 대한 부담을 경감시키는 관점에서는, 분기쇄 아미노산은 대상자에 대해 경구 투여하는 것이 바람직하다. 한편, 경구 투여가 곤란한 환자에 대하여는, 분기쇄 아미노산을 아미노산 수액으로서 경정맥·동맥 투여할 수 있다.
또한, 본 발명의 제제는 제제상의 필요에 따라, 적당한 약학적으로 허용되는 담체, 예를 들면, 부형제, 결합제, 활택제, 용제, 붕괴제, 용해 보조제, 현탁화제, 유화제, 등장화제, 안정화제, 무통화제, 방부제, 항산화제, 교미교취제(矯味矯臭劑), 착색제 등을 배합하여 제제화된다. 또한 본 발명의 조성물은 상기 담체와 함께 조제할 수 있다.
부형제로서는, 유당, 포도당, D-만니톨 등의 당류, 전분류, 결정 셀룰로스 등의 셀룰로스류 등의 유기계 부형제, 탄산칼슘, 고령토 등의 무기계 부형제 등을, 결합제로서는, α화 전분, 젤라틴, 아라비아 고무, 메틸셀룰로스, 카복시메틸셀룰로스, 카복시메틸셀룰로스나트륨, 결정 셀룰로스, D-만니톨, 트레할로스, 하이드록시프로필셀룰로스, 하이드록시프로필메틸셀룰로스, 폴리비닐피롤리돈, 폴리비닐 알코올 등을, 활택제로서는, 스테아르산, 스테아르산염 등의 지방산염, 활석, 규산염류 등을, 용제로서는, 정제수, 생리적 식염수 등을, 붕괴제로서는, 저치환도 하이드록시프로필셀룰로스, 화학 수식된 셀룰로스나 전분류 등을, 용해 보조제로서는, 폴리에틸렌글리콜, 프로필렌글리콜, 트레할로스, 벤조산벤질, 에탄올, 탄산나트륨, 시트르산나트륨, 살리실산나트륨, 아세트산나트륨 등을, 현탁화제 또는 유화제로서는, 라우릴황산나트륨, 아라비아 고무, 젤라틴, 레시틴, 모노스테아르산글리세린, 폴리비닐 알코올, 폴리비닐 피롤리돈, 카복시메틸셀룰로스나트륨 등의 셀룰로스류, 폴리소르베이트류, 폴리옥시에틸렌 경화 피마자유 등을, 등장화제로서는, 염화나트륨, 염화칼륨, 당류, 글리세린, 요소 등을, 안정화제로서는, 폴리에틸렌글리콜, 덱스트란황산나트륨, 그 이외의 아미노산류 등을, 무통화제로서는, 포도당, 글루콘산칼슘, 염산프로카인 등을, 방부제로서는, 파라옥시벤조산에스테르류, 클로로부탄올, 벤질 알코올, 펜에틸 알코올, 데하이드로아세트산, 소르빈산 등을, 항산화제로서는, 아황산염, 아스코르브산 등을, 교미교취제로서는, 의약 및 식품 분야에 있어서 통상적으로 사용되는 감미료, 향료 등을, 착색제로서는, 의약 및 식품 분야에 있어서 통상적으로 사용되는 착색료를 들 수 있다.
본 발명의 제제 또는 조성물에 있어서의 유효 성분이 아미노산이며, 안전성이 우수하기 때문에, 일 형태에 있어서, 본 발명의 제제 또는 조성물은 음식품으로서 제공하는 것이 가능하다. 본 발명의 제제 또는 조성물을 음식품으로서 제공할 경우에는 특별히 곤란성은 없고, 예를 들면, 유효 성분인 분기쇄 아미노산(바람직하게는, 이소류신 또는 이의 염, 류신 또는 이의 염, 및 발린 또는 이의 염)을, 쥬스, 우유, 과자, 젤리 등의 음식품과 혼합함으로써 조제할 수 있다. 비타민류나 기타 서플리먼트류를 첨가하여도 좋다. 수득된 음식품은 보건 기능 식품으로서 제공하는 것도 가능하다.
보건 기능 식품이란, 신체의 생리학적 기능이나 생물학적 활동에 영향을 주는 보건 기능 성분을 포함하며, 식생활에 있어서 특정한 보건 목적으로 섭취하는 것에 대하여, 그 섭취에 의해 당해 보건의 목적을 기대할 수 있는 식품이다.
보건 기능 식품은, 경우에 따라서는 기능성 식품, 건강 식품(영양 서플리먼트를 포함함) 등이라고 호칭될 경우도 있다. 기능성 식품이란 식품 중에 함유되는 생체 조절 성분의 기능을 살려서 만들어지는 식품이며, 건강 식품이란 일반적으로는 건강 증진에 도움이 된다고 되어 있는 식품군을 말한다. 그 중에는 특정한 영양소를 주성분으로 한 영양 서플리먼트도 포함된다.
보건 기능 식품에는, 특정 보건용 식품 및 영양 기능 식품을 포함하며, 화학요법제의 투여를 받고 있는, 암 줄기세포를 포함하는 암에 이환되어 있는 환자, 또는 암 줄기세포를 포함하는 암에 이환력을 가진 환자에 있어서의 일상의 영양 보조 식품으로서 섭식시킴으로써, 암의 당해 화학요법제에 대한 감수성을 높일 수 있다.
이러한 보건 기능 식품에는, 암 줄기세포를 포함하는 암에 대한 화학요법제의 항종양 활성을 증강시키기 위해서 사용하는 것이라는 표시를 첨부할 수 있다.
본 발명의 제제 또는 조성물에 함유되는 분기쇄 아미노산(바람직하게는, 이소류신 또는 이의 염, 류신 또는 이의 염, 및 발린 또는 이의 염)의 함유량은, 제제의 형태 등에 따라 상이하지만, 통상, 제제 전체에 대해 통상 1 내지 100중량%, 바람직하게는 10 내지 100중량%, 보다 바람직하게는 30 내지 100중량%, 더 바람직하게는 50 내지 100중량%이다.
본 발명의 제제 및 조성물의 적합한 예로서는, 이소류신, 류신 및 발린을, 1:2:1.2(이소류신: 0.952g, 류신: 1.904g, 발린: 1.144g)의 중량비로 함유하는 분기쇄 아미노산 제제 리박트(등록 상표) 과립(아지노모토 가부시키가이샤)(경구 투여제)을 들 수 있다.
또한, 적합한 비경구 투여제로서는, 고농도 아미노산 수액류의 아미닉((등록 상표) 점적 정주(아지노모토세이야쿠 가부시키가이샤)), 모리헤파민((등록 상표) 점적 정주(아지노모토세이야쿠 가부시키가이샤))를 들 수 있다.
본 발명의 제제 또는 조성물의 투여량은, 대상 환자의 연령·체중·병태, 투여 방법 등에 따라서도 다르지만, 이소류신 또는 이의 염, 류신 또는 이의 염, 및 발린 또는 이의 염을 함유하는 형태에 있어서는, 일반 성인의 경우, 통상 1일량으로서, 이소류신 0.5 내지 30.0g, 류신 1.0 내지 60.0g, 발린 0.5 내지 30.0g을 기준으로 한다. 바람직하게는, 1일량으로서, 이소류신 2.0 내지 10.0g, 류신 3.0 내지 20.0g, 발린 2.0 내지 10.0g, 보다 바람직하게는, 이소류신 2.5 내지 3.5g, 류신 5.0 내지 7.0g, 발린 3.0 내지 4.0g이며, 3종의 분기쇄 아미노산의 전체량으로서는 1일당 2.0g 내지 50.0g 정도가 바람직하고, 이를 필요에 따라 1 내지 6회, 바람직하게는 1 내지 3회로 분할하여 투여한다. 또한, 본 발명의 제제 또는 조성물이, 분기쇄 아미노산의 염을 함유할 경우, 투여량의 계산은 각 분기쇄 아미노산의 염을, 모두 유리체로 환산한 후에 실시하는 것으로 한다.
상기 본 발명에서 사용하는 유효 성분인 분기쇄 아미노산의 투여량(섭취량)에 관해서 산출할 때, 본 발명에서 목적으로 하는 질환의 치료, 예방 등의 목적으로 사용되는 약제의 유효 성분으로서 상기의 산정 범위가 정해져 있으므로, 이와는 다른 목적으로, 예를 들면 통상의 식생활의 필요로부터, 또는 다른 질환의 치료 목적으로, 섭취 또는 투여되는 분기쇄 아미노산에 관해서는 이를 상기 산정에 포함시킬 필요는 없다. 예를 들면, 통상적인 식생활로부터 섭취되는 1일당 분기쇄 아미노산의 양을 상기 본 발명에 있어서의 유효 성분의 1일당 투여량으로부터 공제하여 산정할 필요는 없다.
본 발명의 제제가 이소류신, 류신 및 발린으로부터 선택되는 2종 또는 3종의 분기쇄 아미노산 또는 이의 염을 함유하는 형태일 경우, 본 발명의 유효 성분인 이소류신, 류신 및 발린 또는 이들 염은, 각각이 단독으로, 또는 임의의 조합으로 제제에 함유되어 있어도 좋고, 또는 모두가 1종의 제제 중에 함유되어 있어도 좋다. 별도 제제화하여 투여할 경우, 이들의 투여 경로, 투여 제형은 동일해도 상이해도 좋고, 또한 각각을 투여하는 타이밍도 동시라도 따로따로라도 좋다. 병용하는 약제의 종류나 효과에 의해 적절히 결정한다. 즉, 본 발명의 제제는, 복수의 분기쇄 아미노산 또는 이들 염을 동시에 함유하는 제제라도 좋고, 또한, 각각을 별도 제제화하여 병용하는 것과 같은 병용제라도 좋다. 이들 형태 모두를 포함하는 것이다. 특히, 동일 제제 중에 모든 분기쇄 아미노산 또는 이들 염을 함유하는 형태(예를 들면, 동일 제제 중에, 이소류신 또는 이의 염, 류신 또는 이의 염, 및 발린 또는 이의 염을 함유하는 형태)가, 간편하게 투여할 수 있어서 바람직하다.
본 발명에 있어서 「중량비」는, 본 발명의 제제 및 조성물 중의 각각의 아미노산 성분의 중량의 비를 나타낸다. 예를 들면, 이소류신, 류신 및 발린의 각 유효 성분을 하나의 제제 중에 함유시킨 경우에는 개개의 함유량의 비이며, 각 유효 성분의 각각을 단독으로 또는 임의의 조합으로 복수 제제 중에 함유시킨 경우에는, 각 제제에 함유되는 각 유효 성분의 중량의 비이다.
또한, 본 발명에 있어서 실제 투여량의 비는, 투여 대상(즉 환자)당 각 유효 성분 1회 투여량 또는 1일 투여량의 비이다. 예를 들면, 이소류신, 류신 및 발린의 각 유효 성분을 하나의 제제 중에 함유시키고, 이를 투여 대상에 투여할 경우에는, 중량비가 투여량 비에 상당한다. 각 유효 성분을 단독으로 또는 임의의 조합으로 복수의 제제 중에 함유시켜 투여할 경우에는, 1회 또는 1일 투여한 각 제제 중의 각 유효 성분의 합계량의 비가 중량비에 상당한다.
이소류신, 류신, 및 발린은 이미 의약·식품 분야에 있어서 널리 사용되고 있어, 안전성은 확립되어 있으며, 예를 들면, 이들 분기쇄 아미노산을 1:2:1.2의 비로 함유하는 본 발명의 제제 및 조성물에 있어서의 급성 독성(LD5O)은, 마우스의 경구 투여에 있어서 10g/Kg 이상이다.
상술한 바와 같이, 이소류신, 류신 및 발린으로부터 선택되는 적어도 1종의 분기쇄 아미노산 또는 이의 염(바람직하게는, 이소류신 또는 이의 염, 류신 또는 이의 염, 및 발린 또는 이의 염을 함유하는 조합)이, 암 줄기세포의 암 비줄기세포로의 분화를 촉진시키고, 이 효과에 의해 암 줄기세포를 포함하는 암에 대한, 화학요법제의 항종양 활성을 증강시킨다. 따라서, 일 형태에 있어서, 본 발명의 제제 또는 조성물은, 암 줄기세포를 포함하는 암을 이환하고 있는 포유동물(예, 사람)에 대해 투여된다. 당해 포유동물이 유지하고 있는 암에 포함되는 암 줄기세포에, 이소류신, 류신 및 발린으로부터 선택되는 적어도 1종의 분기쇄 아미노산 또는 이의 염(바람직하게는, 이소류신 또는 이의 염, 류신 또는 이의 염, 및 발린 또는 이의 염을 함유하는 조합)이 작용함으로써, 암 줄기세포의 암 비줄기세포로의 분화가 촉진되고, 당해 암에 대한 화학요법제의 항종양 활성이 증강된다.
다른 형태에 있어서, 이소류신, 류신 및 발린으로부터 선택되는 적어도 1종의 분기쇄 아미노산 또는 이의 염(바람직하게는, 이소류신 또는 이의 염, 류신 또는 이의 염, 및 발린 또는 이의 염을 함유하는 조합)이, 암 줄기세포의 암 비줄기세포로의 분화를 촉진시키고, CD44 등의 암 전이에 관여하는 접착 분자의 발현을 억제하고, 이 효과에 의해 암 줄기세포를 포함하는 암의 전이능이 억제된다. 따라서, 일 형태에 있어서, 본 발명의 제제 또는 조성물은 암 줄기세포를 포함하는 암을 이환하고 있는 포유동물(예, 사람)에 대해 투여된다. 당해 포유동물이 유지하고 있는 암에 포함되는 암 줄기세포에, 이소류신, 류신 및 발린으로부터 선택되는 적어도 1종의 분기쇄 아미노산 또는 이의 염(바람직하게는, 이소류신 또는 이의 염, 류신 또는 이의 염, 및 발린 또는 이의 염을 함유하는 조합)이 작용함으로써, 암 줄기세포의 암 비줄기세포로의 분화가 촉진되어, 화학요법제의 병용을 필요로 하지 않고, 당해 암의 전이가 억제된다.
다른 형태에 있어서, 본 발명의 제제 또는 조성물은 암 줄기세포를 포함하는 암의 이환력을 갖는 포유동물(예, 사람)에 대해 투여된다. 암 줄기세포는 일반적으로 세포 증식이 느리고, 화학요법제에 대해 저항성이기 때문에, 일단 암 줄기세포를 포함하는 암을 발증한 경우, 화학요법제 등에 의한 치료 결과, 겉으로 보기에는 암이 완화되어, 암의 증상이 소실된 경우라도, 체내에 암 줄기세포가 잔존하고 있어서, 이것이 암의 전이나 재발의 원인이 되고 있는 것이라고 여겨지고 있다. 암의 재발이란, 치료에 의해 암의 증상이 완전하게 또는 일부 완화된 후에, 다시 암 세포가 증식하여, 암의 증상이 다시 나타나거나 악화되는 것을 의미한다. 따라서, 본 발명의 제제 또는 조성물을, 암 줄기세포를 포함하는 암의 이환력을 갖는 포유동물(예, 사람)에 대해 투여함으로써, 그 포유동물의 체내에 잔존하고 있을 가능성이 있는 암 줄기세포의 암 비줄기세포로의 분화를 촉진시켜, 화학요법제에 대한 감수성을 증강시킨다.
따라서, 바람직한 형태에 있어서, 본 발명의 제제 또는 조성물은 화학요법제와 조합하여, 포유동물에게 투여된다. 본 발명의 제제 또는 조성물을 화학요법제와 조합하여, 암 줄기세포를 포함한 암을 이환하고 있는 포유동물에게 투여함으로써, 당해 암을 효율적으로 치료할 수 있다. 또한, 본 발명의 제제 또는 조성물을 화학요법제와 조합하여, 암 줄기세포를 포함하는 암의 이환력을 갖는 포유동물에게 투여함으로써, 당해 암의 전이나 재발을 효율적으로 예방할 수 있다.
따라서, 본 발명은 이소류신, 류신 및 발린으로부터 선택되는 적어도 1종의 분기쇄 아미노산 또는 이의 염(바람직하게는, 이소류신 또는 이의 염, 류신 또는 이의 염, 및 발린 또는 이의 염)(이하 이들을 단지 분기쇄 아미노산이라고 칭하는 경우가 있다)과, 화학요법제를 조합하여 이루어지는, 암 줄기세포를 포함하는 암을 치료하기 위한 제제(또는 조성물) 및/또는 암 줄기세포를 포함하는 암의 전이 또는 재발을 예방하기 위한 제제(또는 조성물)(이하, 이들 제제를 본 발명의 예방 또는 치료제라고도 칭한다)도 제공하는 것이다.
본 발명의 예방 또는 치료제에 관한 각 용어의 정의는 특별히 기재하지 않는 한, 상기한 본 발명의 제제 또는 조성물에 관한 각 용어의 정의와 동일하다.
본 발명의 예방 또는 치료제를 적용하는 것이 가능한 암은, 상기 본 발명의 제제 또는 조성물이 적용가능한 암과 동일하다. 일 형태에 있어서, 본 발명의 제제가 적용되는, 암 줄기세포를 포함하는 암은 화학요법제 저항성이다.
암 중, 간암, 대장암, 신장암, 흑색종, 췌장암, 갑상선암, 위암, 폐암, 유방암 및 비소세포폐암은 일반적으로 화학요법제에 대한 감수성이 낮아, 화학요법제가 효과내기 어려운 것으로 알려져 있다. 따라서, 본 발명의 예방 또는 치료제를 이들 암(바람직하게는 위암, 간암, 유방암 또는 대장암)에 적용하면, 본 발명의 예방 또는 치료제에 함유되는 분기쇄 아미노산(바람직하게는, 이소류신 또는 이의 염, 류신 또는 이의 염, 및 발린 또는 이의 염)이 암에 포함되는 암 줄기세포의 분화를 촉진시켜, 이들 암의 화학요법제에 대한 감수성이 높아지고, 여기에 본 발명의 예방 또는 치료제에 포함되는 화학요법제가 작용함으로써, 결과적으로 암 줄기세포의 효과적인 살상이 기대된다.
일 형태에 있어서, 본 발명의 예방 또는 치료제는 화학요법제로서 대사 길항제(바람직하게는 피리미딘 대사 길항제, 보다 바람직하게는 5-플루오로우라실 또는 테가푸르)를 포함하고, 간암 줄기세포를 포함하는 간암을 예방 또는 치료하기 위한 것이다.
일 형태에 있어서, 본 발명의 예방 또는 치료제는 화학요법제로서 대사 길항제(바람직하게는 피리미딘 대사 길항제, 보다 바람직하게는 5-플루오로우라실 또는 테가푸르)를 포함하고, 대장암 줄기세포를 포함하는 대장암을 예방 또는 치료하기 위한 것이다.
다른 형태에 있어서, 본 발명의 예방 또는 치료제는 화학요법제로서 대사 길항제(바람직하게는 피리미딘 대사 길항제, 보다 바람직하게는 5-플루오로우라실 또는 테가푸르)를 포함하고, 위암 줄기세포를 포함하는 위암을 예방 또는 치료하기 위한 것이다.
일 형태에 있어서, 본 발명의 예방 또는 치료제는 화학요법제로서 대사 길항제(바람직하게는 피리미딘 대사 길항제, 보다 바람직하게는 5-플루오로우라실 또는 테가푸르)를 포함하고, 위암 줄기세포를 포함하는 위암, 결장암 줄기세포를 포함하는 결장암, 자궁경암 줄기세포를 포함하는 자궁경암, 자궁체암 줄기세포를 포함하는 자궁체암, 소화기암 줄기세포를 포함하는 소화기암, 췌장암 줄기세포를 포함하는 췌장암, 직장암 줄기세포를 포함하는 직장암, 유방암 줄기세포를 포함하는 유방암, 또는 난소암 줄기세포를 포함하는 난소암을 예방 또는 치료하기 위한 것이다.
분기쇄 아미노산과 화학요법제를 병용할 때에는, 분기쇄 아미노산과 화학요법제의 투여 시기는 한정되지 않고, 분기쇄 아미노산과 화학요법제를, 투여 대상에 대해 동시에 투여해도 좋고, 시간차를 두고 투여해도 좋다. 분기쇄 아미노산 및 화학요법제의 투여량은, 목적으로 하는 효과(암 줄기세포를 포함하는 암을 치료하는 효과, 암 줄기세포를 포함하는 암의 전이 또는 재발을 예방하는 효과)를 달성할 수 있는 범위에서 특별히 한정되지 않고, 투여 대상, 투여 루트, 증상, 조합 등에 의해 적절히 선택할 수 있다. 분기쇄 아미노산은 바람직하게는, 암 줄기세포의 암 비줄기세포로의 분화를 촉진하는 양이 투여되고, 화학요법제는 당해 암 비줄기세포를 살상하는 양이 투여된다.
분기쇄 아미노산과 화학요법제의 투여 형태는 특별히 한정되지 않고, 투여시에, 분기쇄 아미노산과 화학요법제가 조합되어도 좋다. 이러한 투여 형태로서는, 예를 들면, (1) 분기쇄 아미노산과 화학요법제를 동시에 제제화하여 수득되는 단일 제제의 투여, (2) 분기쇄 아미노산과 화학요법제를 각각 제제화하여 수득되는 2종 제제의 동일 투여 경로에서의 동시 투여, (3) 분기쇄 아미노산과 화학요법제를 각각 제제화하여 수득되는 2종 제제의 동일 투여 경로에서의 시간차를 둔 투여, (4) 분기쇄 아미노산과 화학요법제를 각각 제제화하여 수득되는 2종 제제의 다른 투여 경로에서의 동시 투여, (5) 분기쇄 아미노산과 화학요법제를 각각 제제화하여 수득되는 2종 제제의 다른 투여 경로에서의 시간차를 둔 투여(예를 들면, 분기쇄 아미노산→화학요법제의 순서로 투여, 또는 역순서로 투여) 등을 들 수 있다.
본 발명의 예방 또는 치료제의 투여 형태·제형은 경구 투여, 비경구 투여의 어느 것이라도 좋고, 경구 투여제로서는 산제, 과립제, 캡슐제, 정제, 츄어블제 등의 고형제, 용액제, 시럽제 등의 액제를 들 수 있고, 또한, 비경구 투여제로서는 주사제, 수액제, 경비·경폐용 스프레이제 등을 들 수 있다. 본 발명의 제제 또는 조성물은 통상의 방법에 의해, 이들 제형의 의약으로 제제화될 수 있다.
또한, 본 발명의 예방 또는 치료제는 제제상의 필요에 따라 적당한 약학적으로 허용되는 담체, 예를 들면, 부형제, 결합제, 활택제, 용제, 붕괴제, 용해 보조제, 현탁화제, 유화제, 등장화제, 안정화제, 무통화제, 방부제, 항산화제, 교미교취제, 착색제 등을 배합하여 제제화된다.
분기쇄 아미노산과 화학요법제를 각각 제제화할 경우, 분기쇄 아미노산을 포함하는 제제 중의 분기쇄 아미노산의 함유량은, 상기한 본 발명의 제제 또는 조성물과 동일하다.
또한, 분기쇄 아미노산과 화학요법제를 각각 제제화할 경우, 화학요법제를 포함하는 제제 중의 화학요법제의 함유량은, 분기쇄 아미노산과의 병용에 의해, 암 줄기세포를 포함하는 암을 치료하고, 또는 암 줄기세포를 포함하는 암의 전이 또는 재발을 예방할 수 있는 한 특별히 한정되지 않고, 제제의 형태나 화학요법제의 종류에 따라 상이하지만, 통상, 제제 전체에 대해 약 0.1 내지 99.9중량%, 바람직하게는 약 1 내지 99중량%, 더 바람직하게는 약 10 내지 90중량% 정도이다.
분기쇄 아미노산 및 화학요법제를 동시에 제제화하여 단일의 제제로서 사용할 경우에도, 상기에 준한 함유량이면 좋다. 이 경우, 분기쇄 아미노산과 화학요법제의 배합비는, 투여 대상, 투여 루트, 증상, 화학요법제의 종류 등에 따라 적절히 선택할 수 있다.
분기쇄 아미노산의 투여량은, 상기의 본 발명의 제제 또는 조성물에 있어서의 분기쇄 아미노산의 투여량과 동일하고, 이소류신 또는 이의 염, 류신 또는 이의 염, 및 발린 또는 이의 염을 함유하는 형태에 있어서는, 일반적인 성인의 경우, 통상 1일량으로서, 이소류신 0.5 내지 30.0g, 류신 1.0 내지 60.0g, 발린 0.5 내지 30.0g을 기준으로 한다. 바람직하게는, 1일량으로서, 이소류신 2.0 내지 10.0g, 류신 3.0 내지 20.0g, 발린 2.0 내지 10.0g, 보다 바람직하게는, 이소류신 2.5 내지 3.5g, 류신 5.0 내지 7.0g, 발린 3.0 내지 4.0g이며, 3종의 분기쇄 아미노산의 전체량으로서는 1일당 2.0g 내지 50.0g정도가 바람직하고, 이를 필요에 따라 1 내지 6회, 바람직하게는 1 내지 3회로 분할하여 투여한다.
화학요법제의 투여량은, 분기쇄 아미노산과의 병용에 의해, 암 줄기세포를 포함하는 암을 치료하고, 또는 암 줄기세포를 포함하는 암의 전이 또는 재발을 예방할 수 있는 한 특별히 한정되지 않고, 투여 대상, 증상, 투여 루트, 항종양제의 종류 등에 따라 적절히 설정할 수 있다.
분기쇄 아미노산 및/또는 화학요법제의 투여 빈도는, 투여 대상, 증상, 투여 루트, 항종양제의 종류 등에 따라서도 다르지만, 예를 들면 1 내지 7일에 1회의 빈도, 바람직하게는 1 내지 3일에 1회의 빈도이다. 분기쇄 아미노산 및/또는 화학요법제의 투여 횟수는, 투여 대상, 증상, 투여 루트, 항종양제의 종류 등에 따라서도 다르지만, 통상 1 내지 15회, 바람직하게는 2 내지 10회 정도이다.
상기의 분기쇄 아미노산과 화학요법제를 각각 별도로 제제화하여 병용 투여할 때에는, 분기쇄 아미노산을 함유하는 제제와 화학요법제를 함유하는 제제를 같은 시기에 투여해도 좋지만, 화학요법제를 함유하는 제제를 먼저 투여한 후, 분기쇄 아미노산을 함유하는 제제를 투여해도 좋고, 분기쇄 아미노산을 함유하는 제제를 먼저 투여하고, 그 후에 화학요법제를 함유하는 제제를 투여해도 좋다. 시간차를 두고 투여할 경우, 시간차는 투여하는 유효 성분, 제형, 투여 방법에 따라 다르지만, 예를 들면, 분기쇄 아미노산을 함유하는 제제를 먼저 투여할 경우, 분기쇄 아미노산을 함유하는 제제를 투여한 후, 1분 내지 14일 이내에 화학요법제를 함유하는 제제를 투여하는 방법을 들 수 있다. 화학요법제를 함유하는 제제를 먼저 투여할 경우, 화학요법제를 투여한 후 1분 내지 14일 이내에 분기쇄 아미노산을 함유하는 제제를 투여하는 방법을 들 수 있다.
상술한 바와 같이, 암 줄기세포는 증식의 속도가 느리기 때문에, 화학요법제에 대해 저항성을 갖는다. 이에 대해 분화된 암 세포(암 비줄기세포)는, 일반적으로 증식의 속도가 빠르기 때문에, 화학요법제에 대한 감수성이 높다. 그래서, 암 줄기세포에 이소류신, 류신 및 발린으로부터 선택되는 적어도 1종의 분기쇄 아미노산 또는 이의 염(바람직하게는, 이소류신 또는 이의 염, 류신 또는 이의 염, 및 발린 또는 이의 염)을 적용하여, 암 줄기세포의 암 비줄기세포로의 분화를 촉진시킴으로써, 암 줄기세포를 포함하는 암의 화학요법제에 대한 감수성이 높아지고, 결과적으로, 높은 효율로 암 줄기세포를 포함하는 암을 살상하는 것이 가능하게 된다.
이러한 이론에 기초하면, 화학요법제의 투여는 상기의 분기쇄 아미노산(바람직하게는, 이소류신 또는 이의 염, 류신 또는 이의 염, 및 발린 또는 이의 염)의 투여와 동시 또는 상기의 분기쇄 아미노산(바람직하게는, 이소류신 또는 이의 염, 류신 또는 이의 염, 및 발린 또는 이의 염)의 투여로부터 일정 기간 후인 것이 바람직하다. 즉, 본 발명의 치료 또는 예방제의 투여 형태로는, 바람직하게는 상기의 분기쇄 아미노산(바람직하게는, 이소류신 또는 이의 염, 류신 또는 이의 염, 및 발린 또는 이의 염)과 화학요법제를 동시에 투여하는 공정, 또는 상기의 분기쇄 아미노산(바람직하게는, 이소류신 또는 이의 염, 류신 또는 이의 염, 및 발린 또는 이의 염)을 투여하고, 그 후 화학요법제를 투여하는 공정이 포함된다.
따라서, 본 발명의 예방 또는 치료제의 투여 프로토콜에는, 바람직하게는,
(1) 상기의 분기쇄 아미노산(바람직하게는, 이소류신 또는 이의 염, 류신 또는 이의 염, 및 발린 또는 이의 염) 및 화학요법제를 동시에 단회 또는 복수회 투여하는 것,
(2) 제1 단계로서 상기의 분기쇄 아미노산(바람직하게는, 이소류신 또는 이의 염, 류신 또는 이의 염, 및 발린 또는 이의 염)을 단회 또는 복수회 투여하고, 제2 단계로서 화학요법제를 단회 또는 복수회 투여하는 것,
(3) 제1 단계로서 상기의 분기쇄 아미노산(바람직하게는, 이소류신 또는 이의 염, 류신 또는 이의 염, 및 발린 또는 이의 염)을 단회 또는 복수회 투여하고, 제2 단계로서 상기의 분기쇄 아미노산(바람직하게는, 이소류신 또는 이의 염, 류신 또는 이의 염, 및 발린 또는 이의 염) 및 화학요법제를 같은 시기에 단회 또는 복수회 투여하는 것,
(4) (2) 또는 (3)의 공정을 복수회 반복하는 것
등의 공정이 포함된다.
(1)의 구체적인 형태로서는, 예를 들면, 간암 줄기세포를 포함하는 간암을 예방 또는 치료할 경우에, 상기의 분기쇄 아미노산(바람직하게는, 이소류신 또는 이의 염, 류신 또는 이의 염, 및 발린 또는 이의 염)을 함유하는 수액제를, 간동맥 주입 화학 요법 시행시에 화학요법제와 함께 동맥 내에 주입하는 것을 들 수 있다. 또한, 인터페론을 상기 수액제 및 화학요법제와 함께 동맥 내에 주입해도 좋다.
(2) 내지 (4)에 있어서, 제1 단계의 최후의 투여와 제2 단계의 최후의 투여 간격은, 투여 대상, 증상, 투여 루트, 화학요법제의 종류 등에 따라서도 다르지만, 통상 1분 내지 14일 이내이다.
(2) 내지 (4)에 있어서, 제1 단계에서의 상기의 분기쇄 아미노산(바람직하게는, 이소류신 또는 이의 염, 류신 또는 이의 염, 및 발린 또는 이의 염)의 투여 후에, 암 줄기세포가 암 비줄기세포로 분화된 것인가 아닌가를 확인해도 좋다. 당해 확인은 예를 들면 상기한 바와 같이, 암 줄기세포의 마커의 발현을, 당해 마커 단백질을 특이적으로 인식하는 항체를 사용한 면역학적 수법에 의해 측정함으로써 실시할 수 있다. 상기의 분기쇄 아미노산의 투여 전과 비교하여 당해 투여 후에 있어서 암에 있어서의 암 줄기세포의 마커의 발현이 감소된 경우에, 당해 투여에 의해 암 줄기세포의 암 비줄기세포로의 분화가 유도되었다고 할 수 있다. 그리고, 암 줄기세포의 암 비줄기세포로의 분화의 유도를 확인한 후에, 제2 단계인 화학요법제의 투여를 실시할 수 있다.
다른 형태에 있어서, 본 발명의 제제 또는 조성물을, 암 줄기세포를 포함하는 암의 이환력을 갖는 포유동물(예, 사람)에 대해 투여함으로써, 그 포유동물의 체내에 잔존하고 있을 가능성이 있는 암 줄기세포의 암 비줄기세포로의 분화를 촉진시키고, 암 줄기세포의 암 비줄기세포로의 분화가 촉진되어, CD44 등의 암의 전이에 관여하는 접착 분자의 발현을 억제하고, 이 효과에 의해 암 줄기세포를 포함하는 암의 전이 능력이 억제된다. 따라서, 본 발명의 제제 또는 조성물을, 암 줄기세포를 포함하는 암의 이환력을 갖는 포유동물에게 투여함으로써, 화학요법제의 병용을 필요로 하지 않고, 당해 암의 전이나 재발을 효율적으로 예방할 수 있다.
실시예
다음에, 실시예에 의해 본 발명을 더욱 상세하게 설명한다. 또한, 이하의 실시예는 본 발명의 일례에 관해서 구체적으로 설명하는 것이며, 본 발명을 이에 한정하는 것은 아니다.
실시예 1: 사람 간암 세포주 HAK4 에 있어서의 줄기세포 마커 및 분화 마 커의 발현에 대한 BCAA 의 효과
사람 간암 세포주 HAK4를 12000개/well의 농도로 플레이트에 파종하고, 2mM BCAA 또는 LC 2.5% 배지 중에서 72시간 배양하였다. BCAA는 이소류신, 류신 및 발린으로 이루어지는 혼합물(중량비: 이소류신:류신:발린=1:2:1.2)이다. BCAA의 농도 「2mM」는 이소류신, 류신 및 발린의 전 아미노산 농도의 합계이다.
LC 2.5% 배지의 조성을 이하의 표에 기재한다. 또한, LC 2.5%의 「2.5%」는 소 혈청의 함유량을 나타내고 있다.
조성 (nmol/ml)
글리신 280
L-알라닌 307
L-세린 151
L-트레오닌 138
L-시스틴 2HCl 67
L-메티오닌 75
L-글루타민 689
L-아스파라진 64
L-글루탐산 53
L-아스파르트산 4
L-발린 175
L-류신 100
L-이소류신 53
L-페닐알라닌 99
L-티로신 133
L-트립토판 45
L-리신-HCl 184
L-아르기닌-HCl 92
L-히스티딘 HCl-H2O 85
L-프롤린 176
피셔 비 1.42
또한, 피셔 비(Fischer's ratio)는 발린+류신+이소류신/티로신+페닐알라닌를 의미한다.
72시간 배양 후에 세포를 회수하여, 세포의 펠렛에 1ml의 ISOGEN(닛뽄·진)을 가함으로써 세포를 용해하고, 5분 동안 실온에 정치시켰다. 수득된 용해물에 0.2ml의 클로로포름을 첨가하여, 15초 동안 격렬하게 흔들어, 2 내지 3분 동안 실온에 정치시키고, 12000×g, 4℃에서 15분 동안 원심분리하였다. 유기상 및 중간상을 제거하고, 수득된 수상에 0.5ml의 이소프로판올을 가하여, 5 내지 10분 동안 실온에 정치시키고, 12000×g, 4℃에서 10분 동안 원심분리하였다. 상청을 제거하고, 침전물에 적어도 1ml의 75(v/v)% 에탄올을 가하여, 교반(vortex)시키고, 7500×g, 4℃에서 5분 동안 원심분리하였다. 상청을 제거하고, 침전물을 단시간 건조시키고, 증류수를 가하여 용해함으로써, 전 RNA 용액을 수득하였다.
RT-PCR 7500을 사용한 RT-PCR에 의해, EpCAM(상피 세포 부착 분자; 간암 줄기세포의 마커), AFP(α-태아 단백질; 간암 마커 및 간암 줄기세포의 마커) 및 CYP3A4(사이토크롬 P450 3A4; 분화 마커)의 mRNA의 발현을 정량하였다. RT-PCR에 사용한 프라이머를 이하의 표에 기재한다.
Figure 112013083638860-pct00001
결과를 도 1에 도시한다. BCAA에 의해, HAK4 세포에 있어서, 간암 줄기세포의 마커인 EpCAM 및 AFP의 발현이 저하되어, 분화 마커인 CYP3A4의 발현이 상승하였다.
실시예 2: 사람 간암 세포주 HAK4 에 대한 5 FU (5- 플루오로우라실 )와 BCAA 의 병용 효과(인 비트로( in vitro ) 시험)
사람 간암 세포주 HAK4를 3000개/well의 농도로 플레이트에 파종하고, 이하의 조건하에서 72시간 배양하였다:
·LC 2.5% 배지
·BCAA(2mM)
·5FU(2.5㎍/ml)
·BCAA(2mM)+5FU(2.5㎍/ml)
72시간 후에, ApoAlert 아넥신 V-FITC 아폽토시스 키트(Clontech)를 사용하여 세포를 아넥신 V로 염색 및 고정하고, 어레이 스캔(Thermo Fisher)으로 아포토시스 세포(%)를 검출하였다.
즉, 96구멍 플레이트 중의 세포를 1X 결합 버퍼로 린스하고, 각 웰에 아넥신 V(1㎕)를 함유하는 1X 결합 버퍼를 40㎕ 가하여, 암중(暗中), 실온에서 5 내지 15분 동안 인큐베이트하였다. 세포를 세정하고, 2% 포름알데히드 중에서 고정시켰다. 훼흐스트(Hoechst) 33258 용액을 함유하는 PBS를 100㎕ 가하여, 암중 5분 동안 인큐베이트한 후, 어레이 스캔으로 아포토시스 세포(%)를 검출하였다.
결과를 도 2에 도시한다. BCAA 단독 처리에서는, 아포토시스 세포 수에 유의적인 변화는 확인되지 않았다. 5FU 단독 처리에 의해 아포토시스 세포가 증가하고, BCAA를 병용하면, 5FU에 의한 아포토시스 유도를 증강시켰다. 이상의 결과로부터, BCAA는 5FU의 항종양 효과를 증강시키는 것이 시사되었다.
실시예 3: 사람 간암 세포주 HAK1B 에 있어서의 줄기세포 마커 및 분화 마커의 발현에 대한 BCAA 의 효과
실시예 1과 같이, 사람 간암 세포주 HAK1B를 4000개/well의 농도로 플레이트에 파종하고, 2mM BCAA 또는 LC 2.5% 배지 중에서 72시간 배양하였다. 72시간 배양 후에 세포를 회수하여, ISOGEN(닛뽄·진)에 의해 전 RNA를 정제하였다. RT-PCR에 의해, EpCAM, AFP 및 CYP3A4의 mRNA의 발현을 정량하였다.
결과를 도 3에 도시한다. BCAA에 의해, HAK4 세포와 같이, HAK1B 세포에 있어서도, 간암 줄기세포의 마커인 EpCAM 및 AFP의 발현이 저하되고, 분화 마커인 CYP3A4의 발현이 상승하였다. 이상의 결과로부터, BCAA가 간암의 암 줄기세포의 암 비줄기세포로의 분화를 유도하여, 암 줄기세포를 감소시키는 것이 시사되었다.
실시예 4: 사람 간암 세포주 HAK1B 에 대한 5 FU (5- 플루오로우라실 )와 BCAA 의 병용 효과(인 비보 시험)
7주령의 암컷의 BALB/c 누드마우스(니혼찰스리바에서 구입)에게 HAK1B 세포를 700만개/개체 피하 이식하였다. 1주일 후에 종양 면적에 기초하여 군 분리를 실시하였다. 5FU 250㎍/종양(비히클 10% DMSO/DW)를 종양 내에 투여함과 동시에 (Cancer Research, 70(11), 4687-4697, 2010 참조), 3(w/w)% BCAA 혼합식 또는 3(w/w)% 카세인 혼합식을 2주 동안 공여하였다. 즉, 4개 군에 있어서의 처치는 이하와 같다:
1군: 비히클+카세인 혼합식(컨트롤군)
2군: 5FU+카세인 혼합식
3군: 비히클+BCAA 혼합식
4군: 5FU+BCAA 혼합식
노기스를 사용하여 종양 외측으로부터 종양 체적(장경×단경×높이(㎣))을 측정함으로써, 경시적인 종양 체적 변화를 모니터하였다. 43일째에 부검하여, 종양의 중량 및 체적을 계측하였다.
결과를 도 4 내지 6에 도시한다. BCAA 단독 처리군(3군)에서는, 컨트롤군(1군)과 비교하여, 종양 중량 및 종양 체적에 있어서의 유의적인 변화는 확인되지 않았다. 5FU 단독 처리에 의해 종양 중량 및 종양 체적이 유의적으로 감소되고(2군), BCAA를 병용하면, 5FU에 의한 종양 중량 및 종양 체적의 감소 효과가 증강되었다. 이상의 결과로부터, BCAA는 인 비보에 있어서도 5FU의 항종양 효과를 증강시키는 것이 시사되었다.
실시예 5: 사람 대장암 세포주 HCT116 에 있어서의 줄기세포 마커의 발현에 대한 BCAA 의 효과
HCT116 세포(사람 대장암 세포주)를 4000개/well로 플레이트에 파종하고, 2mM BCAA 또는 LC 2.5% 배지 중에서 72시간 배양하였다. 72시간 배양 후에 세포를 회수하여, 항 CD44 항체(1차 항체)와 1시간 실온에서 인큐베이트하고, 또한 Cy5를 콘주게이트한 2차 항체와 1시간 실온에서 인큐베이트하였다. 세포를 4% 파라포름알데히드로 고정시키고, 훼흐스트 33258 용액으로 염색하여(5분 동안 실온에서 인큐베이션), 염색액을 PBS로 치환하여, 어레이 스캔에 의해 CD44 양성 세포의 비율을 해석(解析)하였다. CD44는 대장암 줄기세포 마커이다.
결과를 도 7에 도시한다. BCAA에 의해, HCT116 세포에 있어서, 대장암 줄기세포의 마커인 CD44의 발현이 유의적으로 저하되었다. 이상의 결과로부터, BCAA가 간암 줄기세포뿐만아니라, 대장암 줄기세포의 비줄기세포로의 분화를 유도하는 것이 시사되었다.
실시예 6: 사람 대장암 세포주 HCT116 에 대한 5 FU 와 BCAA 의 병용 효과(인 비트로 시험)
HCT116 세포(사람 대장암세포주)를 4000개/well의 농도로 플레이트에 파종하고, 이하의 조건하에서 72시간 배양하였다:
·LC 2.5% 배지
·BCAA(2mM)
·5FU(2㎍/ml)
·BCAA(2mM)+5FU(2㎍/ml)
72시간 후에, ApoAlert 아넥신 V-FITC 아폽토시스 키트(Clontech)를 사용하여 세포를 아넥신 V로 염색 및 고정하고, 어레이 스캔(Thermo Fisher)으로 아포토시스 세포(%)를 검출하였다.
결과를 도 8에 도시한다. 5FU 단독 처리에 의해 아포토시스 세포가 증가하고, BCAA를 병용하면, 5FU에 의한 아포토시스 유도가 증강되었다. 이상의 결과로부터, BCAA는 간암뿐만 아니라 대장암에 있어서도, 5FU의 항종양 효과를 증강시키는 것이 시사되었다.
실시예 7: 사람 대장암 세포주 HCT116 의 전이에 대한 BCAA 의 효과( 인 비보 시험)
사람 대장암 세포 HCT116을, BALB/c 누드마우스(암컷, 6주령, 각 군 5마리)에게 1×105개/마리 이식하였다. HCT116 세포는, 미리 7일 동안, 4mM BCAA로 처리하였다. 컨트롤군은 HCT116 세포를 4mM BCAA로 처리하지 않았다. 세포의 이식은 마우스의 근층(筋層)을 절개 후, 비장(脾臟)을 노출시켜, 비장의 양단 혈관을 느슨하게 실로 묶고, 비장에 주사 바늘로 천천히 HCT116 세포를 이입하고(100㎕), 양단의 실을 묶어서 지혈 후, 비장을 적출하고, 근층을 봉합하고, 피부를 스테이플러로 찍음으로서 실시하였다. 3주 동안, 마우스를 통상 사육한 후에, 마우스를 안락사시켜서, 간 표면의 전이암의 개수를 측정하였다.
그 결과, 컨트롤군에서는, 5마리 전체 마우스에 있어서 간 표면에 전이 암의 형성이 확인되었지만, BCAA 처리군에서는, 1마리에서만, 전이 암의 형성이 확인되었다. 또한, 1마리당의 전이 암의 개수도, BCAA 처리에 의해 유의적으로 억제되었다(도 9). 이상의 결과로부터, BCAA에 의해 대장암의 전이능을 감소시키는 것이 나타났다. 또한, 실시예 5의 결과와 합하면, 이 BCAA에 의한 대장암의 전이 억제 효과는, CD44의 발현 저하에 의한 가능성이 시사되었다.
실시예 8: 사람 위암 세포주 MKN45 에 대한 5 FU 와 BCAA 의 병용 효과(인 비트로 시험)
MKN45 세포(사람 위암 세포주)를 4000개/100㎕/well로 96구멍 플레이트에 파종하고, 이하의 조건으로 72시간 배양하였다:
·LC 배지(10% FBS)
·LC 배지+BCAA(2mM 또는 4mM)
·LC 배지+5FU(0.05㎍/ml, 0.1㎍/ml, 0.5㎍/ml 또는 1㎍/ml)
·LC 배지+BCAA(2mM 또는 4mM)+5FU(0.05㎍/ml, 0.1㎍/ml, 0.5㎍/ml 또는 1㎍/ml)
72시간 후에, WST-8 시약을 첨가하고(10㎕/well), 1시간 발색 후, OD 450nm의 흡광도를 측정하였다. 무자극군의 흡광도를 100%라고 했을 때의 상대값으로 각 군의 흡광도를 나타냈다. 또한, WST-8은 세포내 탈수소 효소에 의해 환원되어, 수용성의 포르마잔을 생성하고, 이 포르마잔의 450nm의 흡광도를 직접 측정함으로써, 용이하게 생세포(生細胞) 수를 계측할 수 있다. 세포 수와 생성된 포르마잔의 양은 직선적인 비례 관계에 있다.
결과를 도 10에 도시한다. 5FU 단독 처리에 의해 생세포 수가 감소되고, BCAA를 병용하면, 5FU에 의한 생세포 수의 감소가 증강되었다. 이상의 결과로부터, BCAA는 위암에 있어서도, 5FU의 항종양 효과를 증강시키는 것이 시사되었다.
실시예 9: 사람 위암 세포주 MKN45 에 대한 5 FU 와 BCAA 의 병용 효과(인 비트로 시험)
MKN45 세포(사람 위암 세포주)를 4000개/100㎕/well로 96구멍 플레이트에 파종하고, 이하의 조건하에서 72시간 배양하였다:
·LC 배지(10% FBS)
·LC 배지+BCAA(2mM 또는 4mM)
·LC 배지+5FU(0.05㎍/ml 또는 0.1㎍/ml)
·LC 배지+BCAA(2mM 또는 4mM)+5FU(0.05㎍/ml 또는 0.1㎍/ml)
72시간 후에, 상청을 제거하고, 파라포름알데히드로 세포를 고정 후, 훼흐스트 시약으로 핵염색하여, 어레이 스캔의 세포 사이클 모드로 아포토시스 세포의 비율을 해석하였다.
결과를 도 11에 도시한다. 5FU와 BCAA의 병용에 의해, 아포토시스 세포 수가 유의적으로 증가하였다. 이상의 결과로부터, BCAA에 의한, 5FU의 위암에 대한 항종양 효과의 증강은 아포토시스의 증강에 의한 가능성이 시사되었다.
실시예 10: 사람 위암 세포주 MKN45 에 있어서의 줄기세포 마커의 발현에 대한 BCAA 의 효과
MKN45 세포(사람 위암 세포주)를 4000개/100㎕/well로 96구멍 플레이트에 파종하고, RPMI1640 배지(10% FBS) 또는 BCAA(2mM 또는 4mM) 함유 RPMI1640 배지(10% FBS) 중에서 72시간 배양하였다. 72시간 후에 상청을 제거하고, 파라포름알데히드로 고정 후, 항 CD44 항체(1차 항체)와 1시간 실온에서 인큐베이트하고, 또한 텍사스 레드(Texas Red)를 콘주게이트한 2차 항체와 1시간 인큐베이트하였다. 상청을 제거하고, 훼흐스트 시약으로 핵염색 후, 어레이 스캔의 표적 활성화 모드로 CD44 양성 세포의 비율을 해석하였다.
결과를 도 12에 도시한다. BCAA에 의해, MKN45 세포에 있어서, 위암 줄기세포의 마커인 CD44의 발현이 유의적으로 저하되었다. 이상의 결과로부터, BCAA가 위암 줄기세포의 비줄기세포로의 분화를 유도하는 것이 시사되었다.
실시예 11: 사람 위암 세포주 MKN45 에 대한 TS -1과 BCAA 의 병용 효과( 인 비보 시험)
6주령의 암컷의 BALB/c 누드마우스에 MKN45 세포를 1×106개/마우스 피하 이식하였다. 1주일 후에 종양 체적에 기초하여 군 분리를 실시하였다. TS-1 10㎎/㎏(비히클 0.5% CMC), TS-1 10mg/kg+BCAA 0.75g/kg, 또는 BCAA 0.75g/㎏을 토·일을 제외한 매일, 6주 동안 경구 투여하였다. 즉, 4개 군에 있어서의 처치는 이하와 같다:
1군: CMC(비히클)
2군: TS-1
3군: TS-1+BCAA
4군: BCAA
또한, TS-1은 테가푸르, 기메라실, 및 오테라실 칼륨을 이하의 조성으로 함유하는 항암제이다.
TS-1 0.2g중
테가푸르 20mg
기메라실 5.8mg
오테라실 칼륨 19.6mg
노기스를 사용하여 종양 외측으로부터 종양 체적(장경×단경×높이(㎣))을 측정함으로써, 경시적인 종양 체적 변화를 모니터하였다. 43일째에 부검하여, 종양의 중량 및 체적을 계측하였다.
결과를 도 13에 도시한다. TS-1 또는 BCAA 단독 처리군에서는, CMC군과 비교하여, 종양 체적의 감소 경향은 확인되었지만, 유의적인 변화는 확인되지 않았다. TS-1과 BCAA의 병용에 의해, 종양 체적이 유의적으로 감소되었다. 이상의 결과로부터, BCAA는 인 비보에 있어서 TS-1의 항종양 효과를 증강시키는 것이 시사되었다.
실시예 12: 사람 유방암 세포주 MDA - MB231 의 증식 및 간세포 마커 발현에 대한 5 FU 및 BCAA 의 효과
MDA-MB231 세포를 RPMI-10%(10% FBS를 함유하는 RPMI 배지)에 현탁하고, 2000개/well로 플레이트에 파종하였다. 다음 날에, 배지를 이하와 같이 교환하여, 5일 동안 더 배양하였다.
1군: RPMI-10%
2군: BCAA(4mM)를 함유하는 RPMI-10%
3군: 5-FU(0.25㎍/ml)를 함유하는 RPMI-10%
4군: 5-FU(0.25㎍/ml)+BCAA(4mM)를 함유하는 RPMI-10%
5일 후에 세포핵을 훼흐스트 시약에 의해 염색하여, 세포 수를 카운트하였다. 또한, 1군 및 2군에 대해서는, 항 CD44 항체로 염색하여, 형광 현미경 정량 장치(Thermo Fisher)를 사용한 어레이 스캔에 의해 CD44 양성 세포의 비율을 해석하였다.
결과를 도 14 및 15에 도시한다. 5FU 단독 처리에 의해 생세포 수가 감소되고, BCAA를 병용하면, 5FU에 의한 생세포 수의 감소가 증강되었다. 이상의 결과로부터, BCAA는 유방암에 있어서, 5FU의 항종양 효과를 증강시키는 것이 시사되었다. 또한, BCAA에 의해, MDA-MB231 세포에 있어서, 유방암 줄기세포의 마커인 CD44의 발현이 저하되는 경향이 확인되었다. 이상의 결과로부터, BCAA가 유방암 줄기세포의 비줄기세포로의 분화를 유도하는 가능성이 시사되었다.
실시예 13: 사람 간암 세포주 HAK1B 의 줄기세포 마커 발현에 대한 BCAA 의 효과( 인 비보 시험)
7주령의 암컷의 BALB/c 누드마우스(니혼찰스리바에서 구입)에게 HAK1B 세포를 700만개/개체 피하 이식하였다. 1주일 후에 종양 면적에 기초하여 군 분리를 실시하였다. 5FU 250㎍/종양(비히클 10% DMSO/DW)을 종양 내에 투여함과 동시에(Cancer Research, 70(11), 4687-4697, 2010 참조), 3(w/w)% BCAA 혼합식 또는 3(w/w)% 카세인 혼합식를 2주 동안 공여하였다. 즉, 4개 군에 있어서의 처치는 이하와 같다:
1군: 비히클+카세인 혼합식(컨트롤군)
2군: 5FU+카세인 혼합식
3군: 비히클+BCAA 혼합식
4군: 5FU+BCAA 혼합식
15일째에, 종양 조직을 적출하여, TriPure 단리 시약(Roche)을 사용하여 RNA를 추출하였다. 고성능 cDNA RT 키트(Applied Biosystems)를 사용하여 cDNA를 합성하였다. RT-PCR에 의해, EpCAM(상피 세포 부착 분자; 간암 줄기세포의 마커)의 mRNA의 발현을 정량하였다. RT-PCR에 사용한 프라이머는 실시예 1과 동일하다.
결과를 도 16에 도시한다. BCAA에 의해, HAK1B 세포에 있어서의 간암 줄기세포의 마커인 EpCAM이 저하되었다. 이상의 결과로부터, BCAA가 인 비보에 있어서도, 간암의 암 줄기세포의 암 비줄기세포로의 분화를 유도하여, 암 줄기세포를 감소시킴으로써, 종양의 5FU로의 감수성을 증대시키는 것이 시사되었다.
실시예 14: 사람 위암 세포주 MKN45 의 줄기세포 마커 발현에 대한 BCAA 의 병용 효과(인 비보 시험)
6주령의 암컷의 BALB/c 누드마우스에 MKN45 세포를 1×106개/마우스 피하 이식하였다. 1주일 후에 종양 체적에 기초하여 군 분리를 실시하였다. TS-1 10㎎/㎏(비히클 0.5% CMC), TS-1 10mg/kg+BCAA 0.75g/kg, 또는 BCAA 0.75g/㎏을 토·일을 제외한 매일, 6주 동안 경구 투여하였다. 즉, 4개 군에 있어서의 처치는 이하와 같다:
1군: CMC(비히클)
2군: TS-1
3군: TS-1+BCAA
4군: BCAA
43일 후에, 종양 조직을 적출하여, TriPure 단리 시약(Roche)을 사용하여 RNA를 추출하였다. 고성능 cDNA RT 키트(Applied Biosystems)를 사용하여 cDNA를 합성하였다. RT-PCR에 의해, CD44(암 줄기세포의 마커), nanog(미분화 마커) 및 ABCB5(ABC트랜스포터, 암 줄기세포에 발현되고 있는 것이 보고되어 있다)의 mRNA의 발현을 정량하였다. RT-PCR에 사용한 프라이머는 이하와 같다.
Figure 112013083638860-pct00002
결과를 도 17에 도시한다. BCAA에 의해, MKN45 세포에 있어서의 CD44, nanog 및 ABCB5의 발현이 저하되었다. 이상의 결과로부터, BCAA가 인 비보에 있어서도, 위암의 암 줄기세포의 암 비줄기세포로의 분화를 유도하여, 암 줄기세포를 감소시킴으로써, 종양의 TS-1에 대한 감수성을 증대시키는 것이 시사되었다.
[산업상의 이용 가능성]
분기쇄 아미노산은 암 줄기세포의 암 비줄기세포로의 분화를 촉진시키고, 화학요법제에 대한 감수성을 높이므로, 이를 화학요법제와 조합하여, 암 줄기세포를 포함하는 암에 이환되어 있는 환자에게 투여함으로써, 효과적으로 암을 치료하는 것이 가능하다.
또한, 분기쇄 아미노산을 화학요법제와 조합하여, 암 줄기세포를 포함하는 암의 이환력이 있는 환자에게 투여함으로써, 효율적으로 암의 전이나 재발을 예방하는 것이 가능하다.
따라서, 본 발명은 암의 예방이나 치료를 위한 의약 등으로서 유용하다.
본 출원은, 일본에서 출원된 특원2011-32511(출원일: 2011년 2월 17일) 및 특원2011-215605(출원일: 2011년 9월 29일)를 기초로 하고 있고, 그 내용은 본 명세서에 모두 포함되는 것이다.
<110> Ajinomoto Co., Inc. Kurume University <120> Potentiator of antitumor activity of chemotherapeutic agent <130> 091817 <150> JP2011-032511 <151> 2011-02-17 <150> JP2011-215605 <151> 2011-09-29 <160> 14 <170> KopatentIn 1.71 <210> 1 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial <220> <223> forward primer for human EpCAM <400> 1 gctggtgtgt gaacactgct 20 <210> 2 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial <220> <223> reverse primer for human EpCAM <400> 2 acgcgttgtg atctccttct 20 <210> 3 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial <220> <223> forward primer for human AFP <400> 3 aaatgcgttt ctcgttgctt 20 <210> 4 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial <220> <223> reverse primer for human AFP <400> 4 gccacaggcc aatagtttgt 20 <210> 5 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial <220> <223> forward primer for human CYP 3A4 <400> 5 aaggtcgcct caaagagaca 20 <210> 6 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial <220> <223> reverse primer for human CYP 3A4 <400> 6 tgcactttct gctggacatc 20 <210> 7 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial <220> <223> PCR primer for human CD44 <400> 7 aaggtggagc aaacacaacc 20 <210> 8 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial <220> <223> PCR primer for human CD44 <400> 8 agctttttct tctgcccaca 20 <210> 9 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial <220> <223> PCR primer for human Nanog <400> 9 ttccttcctc catggatctg 20 <210> 10 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial <220> <223> PCR primer for human Nanog <400> 10 tctgctggag gctgaggtat 20 <210> 11 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial <220> <223> PCR primer for human ABCB5 <400> 11 atgtacagtg gctccgttcc 20 <210> 12 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial <220> <223> PCR primer for human ABCB5 <400> 12 acacggctgt tgtcaccata 20 <210> 13 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial <220> <223> PCR primer for human beta-actin <400> 13 gatgagattg gcatggcttt 20 <210> 14 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial <220> <223> PCR primer for human beta-actin <400> 14 caccttcacc gttccagttt 20

Claims (35)

  1. 이소류신 또는 이의 염, 류신 또는 이의 염, 및 발린 또는 이의 염을 함유하는, 암 줄기세포를 포함하는 암에 대한, 5FU 또는 TS-1인 화학요법제의 항종양 활성을 증강시키기 위한 제제.
  2. 삭제
  3. 삭제
  4. 삭제
  5. 삭제
  6. 삭제
  7. 이소류신 또는 이의 염, 류신 또는 이의 염, 및 발린 또는 이의 염과, 5FU 또는 TS-1인 화학요법제를 조합하여 이루어지는, 암 줄기세포를 포함하는 암을 치료하기 위한 제제.
  8. 삭제
  9. 삭제
  10. 삭제
  11. 삭제
  12. 이소류신 또는 이의 염, 류신 또는 이의 염, 및 발린 또는 이의 염과, 5FU 또는 TS-1인 화학요법제를 조합하여 이루어지는, 암 줄기세포를 포함하는 암의 전이 또는 재발을 예방하기 위한 제제.
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  21. 이소류신 또는 이의 염, 류신 또는 이의 염, 및 발린 또는 이의 염의 유효량및 5FU 또는 TS-1인 화학요법제를 암 줄기세포에 첨가하는 공정을 포함하는, 시험관내 (in vitro) 5FU 또는 TS-1인 화학요법제의 항종양 활성 증강 방법.
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