CN109069462A - 缺乏至少两种非必需氨基酸的膳食产品 - Google Patents

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Abstract

本发明涉及包含多种氨基酸的膳食产品，其中所述膳食产品包含所有必需氨基酸，并且其中所述膳食产品基本上缺乏至少两种非必需氨基酸；其在癌症治疗中的方法和用途；对于这样的应用的分层方法和生物标志物。

Description

缺乏至少两种非必需氨基酸的膳食产品
发明领域
本发明总体上涉及用于治疗癌症的膳食疗法的领域。更具体地，本发明涉及改变饮食中氨基酸的水平，以便治疗癌症并改进现有的癌症疗法。本发明还涉及用于鉴定将受益于用于治疗癌症的膳食疗法的患者的生物标志物，以及使用所述生物标志物的方法和试剂盒。
发明背景
癌症是一种细胞经历不受控制的生长、超过正常细胞生长极限地生长和分裂的疾病。这些细胞可以侵入并破坏周围的组织。此外，癌细胞可以转移，其中它们可以通过血液或淋巴系统扩散到身体的其他区域。
癌症治疗可以涉及外科手术切除肿瘤、放射疗法缩小肿瘤尺寸或者药物疗法/化学疗法，使用药物或其他医药治疗癌症。癌症的存活率因癌症类型而异；然而，对于已经转移的癌症来说，存活率特别低。对此的一个关键原因是以下事实：药物疗法/化学疗法治疗经常失败，很少彻底根除癌症。正常的非癌细胞只能耐受一定剂量的药物治疗剂/化学治疗剂，导致使用癌症治疗的次优剂量以防止过多的不良副作用。使问题复杂的是，与正常细胞相比，剂对于癌细胞具有受限的选择性，并且癌细胞可能在治疗期间对药物治疗剂/化学治疗剂产生抗性。存活的癌细胞通常仍然能够经历不受控制的增殖，并且癌症持续存在。这导致研究人员寻找治疗癌症的新方法。
在近些年，注意力已经转向癌症代谢，并且特别是癌细胞如何不同于正常细胞，从而呈现出通常与疾病相关联的快速、不受控制的细胞生长。很明显，癌症可以重新编程它们的代谢，以便能够生长、产生新细胞以及适应代谢压力。在治疗癌症时，可以靶向特定代谢通路的酶，或者可选地，可以靶向通路中使用的化学物质和/或代谢物。蛋白质是细胞的关键组分，并且蛋白质合成通路是癌细胞生长的关键。
蛋白质可以从氨基酸合成，并且在哺乳动物中有20种已知的生物学上有活性的氨基酸。这些可以在体内合成(非必需氨基酸)，但不能合成的那些是饮食的必需组分(必需氨基酸)。癌细胞高度依赖利用非必需氨基酸来支持增殖。一些癌症可以从头合成这些来支持增殖，而另一些则依赖于外源氨基酸的吸收。(Jason W.Locasale,Nature ReviewsCancer,2013,13, 572-583；R.Possemato等人，Nature,2011 476,346-350；O.Maddocks等人， Nature,2013,493,542-546；C.Labuschagne等人，Cell Rep.2014,22,7(4), 1248-58)。非必需氨基酸用于蛋白质合成以及癌细胞生长所必需的许多其他合成代谢过程。
癌症对外源氨基酸的依赖有被开发以通过限制饮食中氨基酸的水平来调节癌症可以获得的外源氨基酸的量来治疗癌症的潜力。癌细胞对于生长和存活所需的必要组分的饥饿，可能具有预防癌症生长或诱导癌细胞死亡的效果。这可以单独用作一种疗法，或者与其他策略诸如放射疗法和药物疗法/化学疗法联合使用。
这种策略将要求改进的癌症类型分类方法，以便鉴定可能受益于这种疗法的患者和患者群体。
因此，仍然存在对于改进的鉴定将受益于代谢靶向疗法的患者和患者群体的方法的需要。
公开内容的简述
根据本发明，提供了包含多种氨基酸的膳食产品，其中该膳食产品包含所有必需氨基酸，并且其中该膳食产品基本上缺乏至少两种非必需氨基酸。合适地，膳食产品可以包含至少9种氨基酸。
至少一种基本上缺乏的非必需氨基酸可以选自由甘氨酸、丝氨酸、半胱氨酸、酪氨酸和精氨酸组成的组。
至少两种基本上缺乏的非必需氨基酸可以包含两种或更多种以下氨基酸：甘氨酸、丝氨酸、半胱氨酸、酪氨酸和精氨酸。合适地，膳食产品可以基本上缺乏：
a.甘氨酸、丝氨酸和半胱氨酸；
b.甘氨酸、丝氨酸和精氨酸；
c.甘氨酸、丝氨酸和酪氨酸；
d.甘氨酸、丝氨酸、精氨酸和半胱氨酸；
e.甘氨酸、丝氨酸、酪氨酸和半胱氨酸；
f.半胱氨酸和精氨酸；
g.半胱氨酸和酪氨酸；
h.半胱氨酸和甘氨酸；
i.半胱氨酸、酪氨酸和精氨酸；或
j.甘氨酸、丝氨酸、精氨酸、酪氨酸和半胱氨酸。
合适地，膳食产品还可以包含一种或更多种大量营养元素和/或一种或更多种微量营养元素。
膳食产品还可包含在低于25mg/kg受试者体重/天或低于20mg/kg/天或低于18mg/kg/天或低于16mg/kg/天的水平的甲硫氨酸。
本发明的膳食产品可以配制成基于平均每日总蛋白质消耗至少提供每日推荐摄入量的必需氨基酸(任选的甲硫氨酸除外)。
本发明的膳食产品可以是固体或饮料(beverage)的形式。
本发明还提供了制备本发明膳食产品的工艺，其中将组分溶解或分散在水中并喷雾干燥。
在另一方面，本发明提供了一种药物组合物，其包含本发明的膳食产品或根据本发明生产的膳食产品以及药学上可接受的载体、赋形剂或稀释剂。
合适地，本发明的药物组合物还可以包含选自以下的治疗剂：癌细胞生长抑制剂、放射治疗剂和化学治疗剂。治疗剂可以抑制OXPHOS和/或可以增加活性氧物质和/或可以降低抗氧化剂防御。
在另一方面，本发明提供了本发明的膳食产品或根据本发明的工艺生产的膳食产品或本发明的药物组合物，用于在癌症治疗中使用。
癌症可以选自由肠癌、结肠直肠癌、肝癌、肺癌、骨肉瘤、淋巴瘤、白血病和乳腺癌组成的组。
癌症可以对于野生型KRAS是阳性的。
癌症可以已经解除了对cMyc表达的调控。
膳食产品可以基本上缺乏丝氨酸和/或甘氨酸。
癌症可以与MTAP表达的下调相关联，并且任选地，膳食产品可以具有降低的水平的半胱氨酸或者基本上缺乏半胱氨酸。
合适地，用于在癌症治疗中使用的膳食产品可以与治疗剂组合使用，所述治疗剂选自以下：癌细胞生长抑制剂、放射治疗剂、化学治疗剂、氨基酸代谢/周转/相互转化抑制剂、非必需氨基酸生物合成抑制剂、氨基酸转运抑制剂、促进氨基酸降解的酶或药物或螯合(sequester)氨基酸的物质。
治疗剂可以抑制OXPHOS和/或可以增加活性氧物质和/或可以降低抗氧化剂防御。
在另一方面，本发明提供了本发明的膳食产品或根据本发明生产的膳食产品或本发明的药物组合物在制备用于治疗癌症的药物中的用途。
合适地，癌症可以选自由结肠直肠癌、淋巴瘤、肝癌、肺癌、骨肉瘤和乳腺癌组成的组。
癌症可以对于野生型KRAS是阳性的，和/或癌症可以已经解除了对 cMyc表达的调控和/或下调了MTAP表达。
合适地，本发明的膳食产品可以基本上缺乏丝氨酸、甘氨酸或丝氨酸和甘氨酸。
合适地，本发明的膳食产品可以具有降低的水平的半胱氨酸或者可以基本上缺乏半胱氨酸。
合适地，膳食产品可以与一种或更多种治疗剂组合使用，所述治疗剂选自：癌细胞生长抑制剂、放射治疗剂和化学治疗剂。
治疗剂可以抑制OXPHOS和/或可以增加活性氧物质和/或可以降低抗氧化剂防御。
在另一方面，本发明涉及在受试者中治疗癌症的方法，包括施用治疗有效量的本发明的膳食产品或根据本发明生产的膳食产品或本发明的药物组合物。
合适地，癌症可以选自由结肠直肠癌、肝癌、骨肉瘤、肺癌、淋巴瘤和乳腺癌组成的组。
癌症可以对野生型KRAS是阳性的，和/或可以已经解除了对cMyc表达的调控。
膳食产品可以基本上缺乏丝氨酸和/或甘氨酸。
膳食产品可以与一种或更多种治疗剂组合使用，所述治疗剂选自：癌细胞生长抑制剂、放射治疗剂和化学治疗剂。
治疗剂可以抑制OXPHOS和/或可以增加活性氧物质和/或可以降低抗氧化剂防御。
合适地，在本发明的所有方面，膳食产品可以是对于受试者的唯一营养来源。
治疗在持续至少24小时的时段施用，或者施用直到观察到治疗终点。
膳食产品可以一天施用1次和6次之间。
合适地，通过每天的施用方案至少可以满足必需氨基酸的推荐的每日量。
本发明还提供了KRAS和/或MTAP作为生物标志物鉴定对癌症治疗应答或敏感的患者或患者群体的用途，所述癌症治疗包括基本上缺乏丝氨酸和/或甘氨酸的饮食。
合适地，癌症治疗可以包含基本上缺乏丝氨酸和甘氨酸的饮食。
合适地，癌症治疗可以进一步包括施用选自以下的治疗剂：癌细胞生长抑制剂、放射治疗剂和/或化学治疗剂。
在另一方面，本发明提供了鉴定对包括基本上缺乏丝氨酸的饮食的癌症治疗具有降低可能性的响应性或敏感性的受试者的方法，所述方法包括：
a)确定从受试者分离的生物样品中Kras的表达或活性水平；
b)将生物样品中Kras的表达或活性水平与对照样品或Kras的表达或活性的预定参考水平进行比较，其中与对照样品相比或与预定参考水平相比，生物样品中Kras的表达或活性增加的水平指示对所述癌症治疗的不响应性或不敏感性。
在另一方面，本发明提供了鉴定对包括基本上缺乏丝氨酸的饮食的癌症治疗具有增加可能性的响应性或敏感性的受试者的方法，所述方法包括：
a)确定从受试者分离的生物样品中Kras的表达或活性水平；
b)将生物样品中Kras的表达或活性水平与对照样品或Kras的表达或活性的预定参考水平进行比较，其中与对照样品相比或与预定参考水平相比生物样品中Kras的表达或活性降低的水平，或与对照样品或预定参考水平基本上相同的Kras的表达或活性水平，指示对所述癌症治疗的响应性或敏感性。
在另一方面，本发明提供了鉴定可以受益于包括基本上缺乏丝氨酸的饮食的癌症治疗的受试者的方法，所述方法包括：
a)确定从受试者分离的生物样品中Kras的表达或活性水平；
b)将生物样品中Kras的表达或活性水平与对照样品或Kras的表达或活性的预定参考水平进行比较，其中与对照样品相比或与预定参考水平相比生物样品中Kras的表达或活性降低的水平，或与对照样品或预定参考水平基本上相同的Kras的表达或活性水平，指示患者可以受益于所述癌症治疗。
在另一方面，本发明提供了鉴定对癌症治疗具有增加可能性的响应性或敏感性的受试者的方法，所述癌症治疗包括i)基本上缺乏丝氨酸，和/ 或ii)具有限制水平的半胱氨酸的饮食，所述方法包括：
a)确定从受试者分离的生物样品中MTAP的表达或活性水平；
b)将生物样品中MTAP的表达或活性水平与对照样品或MTAP的表达或活性的预定参考水平进行比较，其中与对照样品相比或与预定参考水平相比生物样品中MTAP的表达或活性降低的水平，或与对照样品或预定参考水平基本上相同的MTAP的表达或活性水平，指示对所述癌症治疗的响应性或敏感性。
在另一方面，本发明提供了鉴定可以受益于癌症治疗的受试者的方法，所述癌症治疗包括i)基本上缺乏丝氨酸，和/或ii)具有限制水平的半胱氨酸的饮食，所述方法包括：
a)确定从受试者分离的生物样品中MTAP的表达或活性水平；
b)将生物样品中MTAP的表达或活性水平与对照样品或MTAP的表达或活性的预定参考水平进行比较，其中与对照样品相比或与预定参考水平相比生物样品中MTAP的表达或活性降低的水平，或与对照样品或预定参考水平基本上相同的MTAP的表达或活性水平，指示患者可以受益于所述癌症治疗。合适地，在所有方面，在生物样品中可以有癌细胞或癌性组织。同样地，在所有方面，对照样品可以是正常细胞或组织样品。正常细胞或组织样品可以是与癌细胞或癌性组织相同类型的细胞或组织。
在另一方面，本发明提供了治疗患有癌症的受试者的方法，所述方法包括：
a)确定从受试者分离的生物样品中Kras表达或活性的水平是否指示对包括基本上缺乏丝氨酸的饮食的癌症治疗的响应性或敏感性；以及
b)向受试者施用癌症治疗，其中在生物样品中Kras的表达或活性水平指示对所述癌症治疗的响应性或敏感性。
在另一方面，本发明提供了治疗患有癌症的受试者的方法，所述方法包括：
a)确定从受试者分离的生物样品中MTAP表达或活性的水平是否指示对癌症治疗的响应性或敏感性，所述癌症治疗包括i)基本上缺乏丝氨酸和/或ii)半胱氨酸有限的饮食；以及
b)向受试者施用癌症治疗，其中在生物样品中MTAP的表达或活性水平指示对所述癌症治疗的响应性或敏感性。
合适地，所述癌症治疗可以包含基本上缺乏丝氨酸和甘氨酸的饮食。
合适地，所述癌症治疗还可以包括施用选自以下的治疗剂：癌细胞生长抑制剂、放射治疗剂和/或化学治疗剂。
确定从受试者分离的生物样品中Kras表达或活性的水平是否指示对包括基本上缺乏丝氨酸的饮食的癌症治疗的响应性或敏感性，所述确定可以包括：
a)确定从受试者分离的生物样品中Kras的表达或活性水平；
b)将生物样品中Kras的表达或活性水平与对照样品或Kras的表达或活性的预定参考水平进行比较，其中与对照样品相比或与预定参考水平相比，生物样品中Kras的表达或活性增加的水平指示受试者对所述癌症治疗的不响应性或不敏感性，并且其中与对照样品相比或与预定参考水平相比生物样品中Kras的表达或活性降低的水平，或与对照样品或预定参考水平基本上相同的Kras的表达或活性水平，指示受试者对所述癌症治疗的响应性或敏感性。
确定从受试者分离的生物样品中MTAP表达或活性的水平是否指示对包括i)基本上缺乏丝氨酸的饮食、和/或ii)半胱氨酸有限的饮食的癌症治疗的响应性或敏感性可以包括：
a)确定从受试者分离的生物样品中MTAP的表达或活性水平；
b)将生物样品中MTAP的表达或活性水平与对照样品或MTAP的表达或活性的预定参考水平进行比较，
其中与对照样品相比或与预定参考水平相比生物样品中MTAP的表达或活性降低的水平，或与对照样品或预定参考水平基本上相同的MTAP的表达或活性水平，指示受试者对所述癌症治疗的增加的响应性或敏感性。
在另一方面，本发明提供了用于在鉴定将受益于包含基本上缺乏丝氨酸和/或甘氨酸的饮食的癌症治疗的受试者中使用的试剂盒，所述试剂盒包含：
a.用于确定Kras的表达或活性的剂；和
b.用于测定的试剂。
合适地，试剂盒还可以包含用于确定MTAP的表达或活性的剂。
试剂盒可以进一步包含这样的说明：即与对照样品相比或与预定参考水平相比，生物样品中Kras的表达或活性增加的水平指示受试者对所述癌症治疗的不响应性或不敏感性，并且其中与对照样品相比或与预定参考水平相比生物样品中Kras的表达或活性降低的水平，或与对照样品或预定参考水平基本上相同的Kras的表达或活性水平，指示受试者对所述癌症治疗的响应性或敏感性。
在另一方面，本发明提供了用于在鉴定将受益于癌症治疗的受试者中使用的试剂盒，所述癌症治疗包含：i)基本上缺乏丝氨酸和/或甘氨酸，和 /或ii)半胱氨酸有限的饮食，所述试剂盒包含：
a.用于确定MTAP的表达或活性的剂；和
b.用于测定的试剂。
试剂盒还可以进一步包含这样的说明：即与对照样品相比或与预定参考水平相比生物样品中MTAP的表达或活性降低的水平，或与对照样品或预定参考水平基本上相同的MTAP的表达或活性水平，指示受试者对所述癌症治疗的响应性或敏感性。
附图简述
本发明的实施方案在下文中参考附图被进一步描述，其中：
图1a.PDAC Kras G12D/+p53+/-，以及1b.PDAC Kras G12D/+ p53R172H/+：将小鼠在～60日龄时置于饮食，直到临床终点(PDAC相关的存活)。从饮食的改变(而不是出生)计算存活。P值使用曼特尔-考克斯检验 (mantel-cox test)计算。
图1c.将小鼠尾静脉注射100μl的100μM 13C3 15N1丝氨酸并放置持续 2h。处死后冷冻组织，然后在代谢物提取缓冲液中均质化，并通过LCMS 定量。P值使用配对的T-检验计算。
图1d.将Kras可诱导细胞系(iKRAS1、iKRAS3和AK196)在含有多西环素(KRAS-ON)或不含多西环素(KRAS-OFF)的完全培养基中生长。通过 qRT-PCR分析丝氨酸合成通路酶的mRNA表达。误差条＝SEM。
图1e.使三种Kras可诱导细胞系(iKRAS1、iKRAS3和AK196)生长持续3天，通过蛋白印迹分析蛋白质表达。跨iKRAS1、iKRAS3和AK196 细胞将SSP和Phospho-ERK1蛋白表达中Kras-ON/Kras-OFF的相对变化 (通过LiCor红外定量测量)取平均值；定量的条带是显示在蛋白印迹中的那些。误差条＝STDEV。
图1f.使Kras可诱导细胞系在含有或不含丝氨酸和甘氨酸(+SG/-SG) 的培养基中生长，并在48和96小时后计数。误差条＝SEM。
图2a.将APCmin/APCmin KRAS类器官(organoid)在有或没有丝氨酸和甘氨酸的情况下生长持续24-48h。
图2b.将APCmin/APCmin KRAS类器官在没有丝氨酸和甘氨酸的情况下生长持续5天，然后接种到含有丝氨酸和甘氨酸的培养基中，并再生长24-72h。图2c.对从在有或没有丝氨酸和甘氨酸的情况下生长的 APCmin/APCmin KRAS类器官中提取的mRNA的qRT-PCR。
图2d.在13C6-葡萄糖存在下持续5小时生长的APCmin/APCmin KRAS 类器官，将代谢物提取出来并通过LCMS分析。P值使用配对的T-检验计算。误差条＝STDEV。
图3a和3b.无丝氨酸/甘氨酸饮食对两种小鼠胰腺癌模型中血清氨基酸水平的影响，通过血清样品的质谱分析来测量。统计比较在图中详述。 a.Pdx1cre；KRasG12D/+；p53+/-小鼠接受正常的食物直到60日龄，然后转换成含有丝氨酸和甘氨酸的对照饮食(Ctr)或缺乏丝氨酸和甘氨酸的匹配饮食 (matched diet)(-SG)，直到临床终点。通过LCMS分析从末端出血中分离的血清。示出了代谢物的相对量(x轴＝峰面积)。误差条＝STDEV。通过T检验(不成对，2尾)计算每种氨基酸的P值，示出了低于0.05的P值。b.Pdx1cre； KRasG12D/+；p53R172H/+小鼠在60日龄时接受对照饮食或无SG(-SG)饮食，直到临床终点。通过LCMS分析从末端出血中分离的血清。示出了代谢物的相对量(x轴＝峰面积)。误差条＝STDEV。通过T检验(不成对，2尾)计算每种氨基酸的P值，示出了低于0.05的P值。
图4a.从HCT116细胞形成的肿瘤的生长速率(人结肠直肠癌，p53wt 或无效(null))。在喂食对照饮食的小鼠中，肿瘤迅速地生长，但是不含丝氨酸和甘氨酸的饮食(-SG)显著地减弱了肿瘤生长。b.来自图4a所示的实验的小鼠的存活率。不含丝氨酸的饮食显著地提高了小鼠的存活率。
图5.丝氨酸饥饿对抗癌药物对HCT116、DLD1和SW480细胞系的生长抑制作用的影响。当与丝氨酸和甘氨酸饥饿同时给与时，相当大比例的化学疗法示出了增强的抗增殖效果。
图6.膳食丝氨酸和甘氨酸限制对来自小鼠的血清样品中的氨基酸水平的影响。给C57BI6小鼠喂食含有所有20种氨基酸的对照饮食，或缺少丝氨酸和甘氨酸但含有所有18种其他氨基酸的饮食。通过LCMS分析血清样品，示出了所有非必需氨基酸的相对量。伴随着饮食，观察到了降低的丝氨酸、甘氨酸和半胱氨酸水平。
图7.从多种细胞系(A549、HCT116、SW480、RKO、MCF7、MDA MB 231和MDA MB 468)的细胞培养基中的半胱氨酸摄取。示出了癌细胞系贪婪地消耗外源半胱氨酸。
图8.半胱氨酸饥饿在多种细胞系(HCT116、HepG2、MDA MB 231、 RKO和U2OS)中的影响。基础培养基＝除丝氨酸、甘氨酸、半胱氨酸外添加所有氨基酸。S＝丝氨酸0.8mM G＝甘氨酸0.4mM C＝半胱氨酸0.4 mM。培养基每24小时更换一次。
图9.半胱氨酸、丝氨酸和甘氨酸联合饥饿和单独饥饿对三种细胞系 (HCT116、SW480和DLD1)细胞数量的影响。将细胞接种在含有不同浓度丝氨酸、甘氨酸和半胱氨酸的培养基中(但富含所有其他氨基酸)，并且在 48h后计数。
图10.丝氨酸和半胱氨酸相互依赖的机制。同型半胱氨酸(homocysteine) 流出从两方面防止丝氨酸汇集物的耗竭；1.丝氨酸衍生的单碳不用于再甲基化，这允许丝氨酸衍生的单碳汇集物改为被用于核苷酸(DNA、RNA) 合成；2.制造半胱氨酸不需要丝氨酸。然而，同型半胱氨酸流出意味着半胱氨酸不能再从头合成，所以必须来自癌细胞之外。为了满足核苷酸和谷胱甘肽(GSH)合成的高合成代谢需求，癌细胞要求外源丝氨酸和半胱氨酸的摄取。
图11.全身代谢和肿瘤代谢总结。
图12.除丝氨酸和甘氨酸外，非必需氨基酸的撤出对HCT116和RKO 细胞生长的影响。示出了通过调节其他氨基酸来改善不含丝氨酸和甘氨酸的饮食的抗癌效果。a.仅丝氨酸和甘氨酸饥饿会降低增殖率。除丝氨酸和甘氨酸的去除外，撤出某些其他非必需氨基酸(天冬氨酸、谷氨酸、脯氨酸和天冬酰胺)对细胞在2天时的增殖率还具有轻微的额外影响。b.仅丝氨酸和甘氨酸饥饿会降低增殖率。此外，单独地去除酪氨酸、精氨酸或半胱氨酸具有更大的抗增殖作用。
图13.丝氨酸、甘氨酸、半胱氨酸、精氨酸和酪氨酸饥饿的不同组合在4天内对HCT116细胞生长和细胞死亡的影响(由细胞数量的％变化示出)。完全培养基(对照)的细胞生长为+1400％。仅酪氨酸饥饿；酪氨酸、丝氨酸和甘氨酸饥饿；仅精氨酸饥饿；以及精氨酸、丝氨酸和甘氨酸饥饿都导致了生长抑制。仅半胱氨酸饥饿；半胱氨酸、丝氨酸和甘氨酸饥饿；丝氨酸、甘氨酸、半胱氨酸和精氨酸饥饿导致生长抑制和细胞死亡。
图14.丝氨酸合成通路酶的表达是对丝氨酸饥饿的敏感性的决定因素。具有丝氨酸合成通路酶(PHGDH、PSAT1、PSPH)表达升高或活性增强的肿瘤对丝氨酸饥饿较不敏感。丝氨酸合成通路活性可以通过癌症中的多种机制增加，包括基因拷贝数扩增、转录激活(例如通过致癌基因Kras)，或者通过表观遗传方式，或者潜在地通过其他机制，例如变构激活。
图15.测量在完全培养基中培养经48小时的在4个细胞系(SW480、 DLD1、HCT116和RKO)中半胱氨酸前体/同型半胱氨酸二聚体的释放。同型半胱氨酸是半胱氨酸从头合成的前体，然而，同型半胱氨酸从癌细胞中释放出来，并检测到同型二聚体，即同型胱氨酸(homocystine)。
图16.在丝氨酸和丝氨酸及甘氨酸饥饿条件下，测量在2个细胞系(HCT116和RKO)中半胱氨酸前体/同型半胱氨酸二聚体的释放。homoC-cys ＝同型半胱氨酸+半胱氨酸二聚体。同型胱氨酸＝同型半胱氨酸+同型半胱氨酸二聚体。
图17.在丝氨酸和丝氨酸及甘氨酸饥饿条件下，测量在2个细胞系 (A549和MDA MB231)中半胱氨酸前体/同型半胱氨酸二聚体的释放。 homoC-cys＝同型半胱氨酸+半胱氨酸二聚体。同型胱氨酸＝同型半胱氨酸+ 同型半胱氨酸二聚体。
图18.不含丝氨酸和甘氨酸的饮食是GEMM中对于淋巴瘤和肠癌的有效治疗干预。a.Eμ-Myc小鼠接受正常的食物直到～60日龄，然后转换成对照饮食(含有丝氨酸和甘氨酸)或缺乏丝氨酸和甘氨酸的匹配饮食(无Ser，无Gly)，直到临床终点(淋巴瘤相关存活)。从饮食的改变(而不是出生)开始计算存活。P值通过曼特尔-考克斯检验计算。b.APCMin/+小鼠接受正常的食物直到～80日龄，然后转换成对照饮食(含有丝氨酸和甘氨酸)或缺乏丝氨酸和甘氨酸的匹配饮食(无Ser，无Gly)，直到临床终点(肠肿瘤相关存活率)。从饮食的改变(而不是出生)开始计算存活。P值通过曼特尔-考克斯检验计算。通过LCMS分析了c.来自Eμ-Myc群组以及d.来自APCMin/+ 群组的血清，示出了相对丰度(按代谢物峰面积)。误差条＝STDEV，通过T 检验(不成对，2尾，*＝P<0.0005)计算P值。所有氨基酸的相对定量见图 21。e.使用以在血清中稀释的13C15N-丝氨酸和甘氨酸的6点校准曲线确定在APCMin/+群组中丝氨酸和甘氨酸的血清浓度。误差条＝STDEV。f.在 7-10周龄诱导Lgr5-creER APCfl/fl小鼠，在第一次他莫昔芬治疗后7天改变饮食，并维持直到临床终点(肠肿瘤相关存活)。从第一次他莫昔芬治疗开始计算存活。通过曼特尔-考克斯检验计算P值。
图19.抗氧化应答的操作增强了饮食诱导的抗癌效果。a.Eμ-Myc小鼠在～60日龄时通过灌胃接受含有100mg/kg/天的苯乙双胍(Phen)的对照或不含丝氨酸和甘氨酸的饮食(无Ser，无Gly)，并被带到临床终点。从饮食的改变(而不是出生)开始计算淋巴瘤相关存活。b.APCMin/+小鼠在～80日龄时转换成对照或不含丝氨酸和甘氨酸的饮食(无Ser，无Gly)，然后四天后接受在饮用水中200mg/kg/天的二甲双胍(Metf)。从饮食的改变，而不是出生开始，计算肠肿瘤相关存活。通过曼特尔-考克斯检验计算P值。存活曲线的完整比较见图22a。c.仅饮食肿瘤负荷数据与二甲双胍+饮食肿瘤负荷的比较。对APCMin+小鼠的小肠(SI)进行肿瘤数的死后计数。通过T检验 (不成对，2尾)计算P值。肿瘤面积数据见图22c。复制以上(a)和(b)中仅饮食的数据。d.源自VillincreER的肠肿瘤类器官；使APCfl/fl小鼠+/-SG，+/- 二甲双胍在所述浓度生长持续两天。绘制了类器官直径的相对变化(相对于 '-药物')。数据是四个独立实验的平均值，误差条＝SEM。通过T检验(不成对，2尾，有对于多重比较的校正)计算P值。e.使APCfl/fl类器官+/-SG+/- 二甲双胍生长持续两天，然后固定并对脂质过氧化产物丙二醛(MDA)免疫染色。数据是三个独立实验的平均值，误差条＝SEM。通过T检验(不成对， 2尾，对于多重比较校正)计算P值。f.使Eμ-Myc小鼠与Tigar-/-小鼠杂交(crossed)，在～60日龄时将群组置于饮食，并且直到临床终点(淋巴瘤相关存活)。从饮食的改变(而不是出生)开始计算存活。通过曼特尔-考克斯检验计算P值。
图20.不含丝氨酸和甘氨酸的饮食对APCmin/+小鼠中肿瘤负荷的影响。 APCMin/+小鼠接受正常的食物直到80日龄，然后转换成对照饮食(含有丝氨酸和甘氨酸)或缺乏丝氨酸和甘氨酸的匹配饮食(无Ser，无Gly；-SG)，直到临床终点(肠肿瘤相关存活)。在饮食改变(80天)或临床终点时，对肠组织进行死后肿瘤测量。通过T检验(不成对，2尾，有对于多重比较的校正) 计算P值。
图21.不含丝氨酸和甘氨酸的饮食对血清氨基酸的影响a.Εμ-myc和 b.APCmin/+小鼠接受正常的食物分别直到～60和～80日龄，然后转换成含有丝氨酸和甘氨酸的对照饮食(Ctr)或缺乏丝氨酸和甘氨酸的匹配饮食(-SG)，直到临床终点。通过LCMS分析从末端出血中分离的血清。示出了代谢物的相对量(x轴＝峰面积)。误差条＝STDEV。通过T检验(不成对)计算P值。
图22.二甲双胍治疗在APCmin/+小鼠中未增强不含丝氨酸和甘氨酸的饮食的抗癌效果。将小鼠在～80天龄转换成不含丝氨酸和甘氨酸的饮食(无 Ser，无Gly)(a)或对照饮食(b)，然后四天后接受200mg/kg/天的在饮用水中的二甲双胍(Metf)。从饮食的改变，而不是出生开始，计算肠肿瘤相关存活。通过曼特尔-考克斯检验计算P值。c.仅饮食肿瘤负荷数据与二甲双胍+饮食肿瘤负荷的比较。对APCmin/+小鼠的小肠(SI)进行肿瘤面积的死后测量。通过T检验(不成对，两尾)计算P值。“仅饮食”数据从图20中复制而来。
图23.体内二甲双胍水平对全身代谢影响很小，并且太低以至于无法使得不含丝氨酸和甘氨酸的饮食的抗癌效果成为可能。a.将APCmin/+小鼠转换成对照或不含丝氨酸和甘氨酸的饮食(-SG)，然后接受200mg/kg/天的在饮用水中的二甲双胍。通过LCMS分析从末端出血中分离的血清。误差条＝STDEV。b.通过LCMS分析来自二甲双胍治疗的小鼠的组织样品。 NC＝正常结肠，NSI＝正常小肠，TC＝肿瘤结肠，TSI＝肿瘤小肠。误差条＝STDEV。c.对于可获得匹配血清和肿瘤(SI或结肠)组织样品的小鼠(Ctr 饮食n＝7，-SG饮食n＝6)，绘制了血清对肿瘤二甲双胍浓度的曲线图。使用相关生物基质(组织/血清)使用六点校准曲线确定所有样品中二甲双胍的浓度。d.使用Agilent 2100Bioanalyser分析来自用二甲双胍治疗的APCmin/+小鼠的血清的葡萄糖和乳酸盐水平。e.将表达截短的APC的人结肠直肠癌细胞DLD1和SW480在没有丝氨酸和甘氨酸(无Ser，无Gly)，或在低丝氨酸和甘氨酸(10μΜ)中的不同浓度的二甲双胍中生长持续三天，之后计数细胞数。数据是一式三个孔的平均值，误差条＝STDEV。
图24.Εμ-myc肿瘤组织(携带肿瘤的脾)的无偏的代谢组学分析 (OPLS-DA；正交偏最小二乘判别分析)的S图(S-plot)(Ctr n＝20，-SG n＝13)。检测到的显示由于饮食导致的减少最多的代谢物是丝氨酸和甘氨酸。还观察到肉碱(carnitine)和胆碱相关代谢物降低的水平。还观察到磷脂酰胆碱 (PC)代谢物以及丙氨酸和苏氨酸的增高的水平。已知SG饥饿会影响糖酵解和OXPHOS(潜在地解释肉碱和丙氨酸水平的变化)以及一碳代谢(潜在地解释胆碱相关代谢物的变化)。
图25.示出了-SG饮食对Eu-myc肿瘤细胞的影响。a.将淋巴瘤细胞从 Eμ-myc小鼠中分离并在培养中扩增。将细胞皮下注射(5x10^5/肋腹)到裸鼠内，并被允许形成肿瘤。一旦肿瘤(Ctr n＝4，-SG n＝4)可见并可测量，将小鼠转换成对照(Ctr)或不含丝氨酸和甘氨酸的饮食(-SG)。处死小鼠，并且在单一时间终点(置于饮食6天)切除肿瘤。示出了平均肿瘤体积(作为起始肿瘤体积的百分比)，误差条＝STDEV。b.为评估每个皮下Εμ-myc肿瘤的细胞数，对每个肿瘤进行了两次单独的细胞计数(使用H&E染色横截面)并取平均值，示出了平均值的平均值，误差条＝SEM。通过T检验(不成对，单尾)计算P值。c.将整个皮下Εμ-myc肿瘤组织切片(Ctr n＝3，-SG n＝4)对于被切割的胱天蛋白酶-3(CC3)和BrdU免疫染色。对整个肿瘤的非坏死区域的图像分析允许定量评估每个肿瘤的％被切割的胱天蛋白酶-3阳性细胞和每个肿瘤的％BrdU阳性细胞。数据是平均值，误差条＝STDEV。d.将 Eμ-myc肿瘤(如上a-c所述)的横截面H&E染色，每个图像的比例尺为4mm，用箭头标记说明性的坏死区域。另外的肿瘤组织切片(标有*)被包括在内，用于比较从饮食改变后发展的肿瘤(这三个肿瘤在饮食改变后两天可以测量，并且在终点前置于饮食4天)。e.通过对(d)中所示出的切片的H&E染色的坏死和非坏死表面积的图像分析来定量坏死。误差条＝STDEV，通过 T检验(不成对，单尾，Ctr，n＝5；-SG，n＝6)计算P值。f.APCmin/+小鼠在 80日龄时被置于对照饮食(Ctr，n＝3)或不含丝氨酸和甘氨酸的饮食(-SG， n＝3)。在单一时间终点(置于饮食的14天)，处死小鼠，并且取出小肠进行组织学分析。将组织切片进行被切割的胱天蛋白酶-3和BrdU的免疫染色。对整个肠的图像分析允许了定量评估每个腺瘤的细胞数、每个腺瘤的％ CC3阳性细胞和％BrdU阳性细胞。数据是在每个小肠切片中鉴定的所有腺瘤的平均值，误差条＝SEM，通过T检验(不成对，单尾)计算P值。对于所有的分析(a-f)，示出了低于0.1的P值。
图26.来自PDAC和Eμ-myc模型的肿瘤组织中SSP酶的表达。通过蛋白质印记法使用Li-Cor扫描仪定量，分析了来自接受对照或不含SG饮食的Eμ-Myc小鼠的PDAC肿瘤和带有肿瘤的脾脏的蛋白质裂解物的SSP 酶表达。示出了SSP酶的相对表达(相对于对照饮食)。误差条＝STDEV。每个组织样品取自不同的小鼠，在条上方显示小鼠/肿瘤数。
图27.示出了-SG饮食导致在Eu-myc肿瘤中降低的丝氨酸和甘氨酸水平，以及降低的GSH/GSSG比率，但在PDAC肿瘤中甘氨酸或GSH/GSSG 比率没有降低。通过LCMS对来自Pdx1cre；KRasG12D/+；p53+/-小鼠的胰腺肿瘤和来自Εμ-myc小鼠的携带肿瘤的脾进行丝氨酸、甘氨酸、GSH(还原的谷胱甘肽)和GSSG(氧化的谷胱甘肽)的分析。通过T检验，不成对，2 尾，计算P值。误差条＝STDEV。
图28.表达Kras的肿瘤类器官更加耐受丝氨酸和甘氨酸饥饿。将 VillincreER；APCfl/fl和VillincreER；APCfl/fl；KRasG12D/+肠肿瘤类器官(每个基因型来自n＝3只小鼠)在没有丝氨酸和甘氨酸的情况下生长持续5天，然后解离并接种到完全生长培养基中。在完全(回收)培养基中每天测量类器官直径。数据是在一次实验中获得的来自三只小鼠的类器官的平均值。误差条＝SEM。
图29示出，缺乏甘氨酸和丝氨酸的饮食降低了已经在体内形成的异种移植肿瘤的生长，降低了肿瘤内丝氨酸和甘氨酸水平，并且这样的水平在体外转化为较慢的癌细胞增殖。a.将HCT116细胞双侧注射(每侧 3x10Λ6个)并且允许形成肿瘤。一旦肿瘤可见并可通过卡尺测量，将小鼠转换成对照饮食或不含丝氨酸和甘氨酸的饮食(-SG)。每周测量三次肿瘤，并且绘制每周平均肿瘤体积，误差条＝SEM。通过T检验(不成对，单尾) 计算P值。b.通过LCMS分析HCT116肿瘤(取自临床终点)中丝氨酸和甘氨酸的绝对浓度(分析每个肿瘤的1-3块)。数据是平均值，条是STDEV。通过T检验(不成对，单尾)计算P值。c.HCT116细胞在体外生长(24孔板)，肿瘤内丝氨酸和甘氨酸浓度显示在“b”中。每24小时更换一次培养基，并在所指定的日期进行细胞计数。数据是来自一个单独的实验对于每个条件一式12个孔的平均值，误差条＝STDEV。d.HCT116细胞在体外生长(24 孔板，对于每个条件一式12个孔)，肿瘤内丝氨酸和甘氨酸浓度显示在“b”中。每24小时更换一次培养基，并在四天后进行细胞计数。数据是三个独立实验的平均值，误差条＝SEM。通过T检验(不成对，单尾)计算P值。
图30.表达kras的细胞通过从头丝氨酸和甘氨酸合成获得丝氨酸和甘氨酸，而不是通过微胞饮增加。使用TMR-标记的葡聚糖摄取测定评估 iKRas细胞中的巨胞吐(Macropinocytosis)。细胞最初以+/-多西环素条件生长持续48h，然后以+/-多西环素、+/-SG条件接种持续40h(最后16h没有 FBS)，然后在匹配培养基中给予TMR葡聚糖/FBS持续30分钟。误差条和线示出平均值和STDEV。
图31a.柔红霉素补充丝氨酸和甘氨酸饥饿。VillincreER；APCfl/fl小鼠以 +/-丝氨酸和甘氨酸、+/-柔红霉素条件在规定浓度下生长两天。绘制了类器官直径的相对变化(相对于'-药物')。数据是三个独立实验的平均值，误差条＝SEM。b.VillincreER；APCfl/fl类器官以+/-丝氨酸和甘氨酸、+/-柔红霉素条件生长两天，然后用丙二醛(MDA)固定并且对于丙二醛(MDA)染色，数据是三个独立实验的平均值，误差条＝SEM。通过T检验(不成对，2尾，有对于多重比较的校正)计算P值。
图32.示出了说明在人类中从头半胱氨酸合成和多胺合成的简化示意图。代谢物以正常文本示出，酶在方框中示出。
图33.示出MTA流出(其为MTAP缺失/失活的指示)与增强的半胱氨酸饥饿敏感性相关。a.使胰腺癌细胞系在配制的缺少半胱氨酸但含有所有19 种其他必需和非必需氨基酸的培养基(基于RPMI培养基)中在24孔板中生长持续三天。使用CASY TT细胞计数器计数细胞数。3天后通过液相色谱 -质谱通过分析培养基样品测量细胞培养基中的甲基硫腺苷(MTA)水平。b. 将结肠直肠和乳腺癌细胞系在配制的缺少半胱氨酸但含有所有19种其他必需和非必需氨基酸的培养基(基于RPMI培养基)中在24孔板中生长持续三天。使用CASY TT细胞计数器计数细胞数。24小时后通过液相色谱- 质谱通过分析培养基样品测量细胞培养基中的甲基硫腺苷(MTA)水平。R2＝由MS Excel计算的相关系数(带有对数趋势线)。
图34.示出MDA-MB-231细胞具有更高的MTA和亚精胺合成速率，表明大量甲硫氨酸被分流到这些细胞中的多胺通路中。相比之下，在 HCT116和SW480细胞中，较少的甲硫氨酸被分流到多胺通路中，并且更多的甲硫氨酸到达可转化为半胱氨酸的同型半胱氨酸/胱硫醚。这有助于解释在半胱氨酸饥饿期间，HCT116和SW480细胞更好的存活。SW480和 MDA-MB-231(M231)细胞在配制的培养基(基于RPMI培养基，缺少碳-12 甲硫氨酸，补充有碳-13标记的甲硫氨酸并含有所有19种其他必需和非必需氨基酸)中生长持续两天。通过液相色谱-质谱分析细胞裂解物。显示了最丰富的同位素体(isotopomer)。MTA＝甲基硫腺苷，Met＝甲硫氨酸，He＝同型半胱氨酸，SAM＝S-腺苷甲硫氨酸。M+x＝质量加x单元。
图35.示出HCT116和SW480细胞能够将MTA再循环回甲硫氨酸，但是MDA-MB-231细胞(其流出MTA)不能将MTA再循环回甲硫氨酸。用碳-13标记的甲硫氨酸追踪代谢物示出，与MDA-MB-231细胞不同，SW480 和HCT116细胞能够再循环多胺通路中已经使用的甲硫氨酸(通过MTA)，其表现为“m+1”甲硫氨酸。使HCT116、SW480和MDA-MB-231(M231)细胞在配制的培养基(基于RPMI培养基，缺少碳-12甲硫氨酸，补充有碳-13 标记的甲硫氨酸并含有所有19种其他必需和非必需氨基酸)中生长持续两天。通过液相色谱-质谱分析细胞裂解物。示出了主要的甲硫氨酸异构体。
图36.示出与HCT116和SW480细胞相比，MDA-MB-231(M231)细胞具有显著的MTA流出，并且甚至在半胱氨酸饥饿期间继续流出MTA。使 HCT116、SW480和MDA-MB-231(M231)细胞在配制的培养基(基于RPMI 培养基，含有或不含有半胱氨酸，缺少碳-12甲硫氨酸，补充有碳-13标记的甲硫氨酸并含有所有19种其他必需和非必需氨基酸)中生长持续两天。代谢物提取物从培养基样品(在特定的时间点采集)制备，并通过液相色谱- 质谱分析。MTA＝甲基硫腺苷。M+x＝质量加x-单元。没有MDA-MB-231 细胞的半胱氨酸饥饿48h时的数据，因为在该时间点没有活细胞剩余。
图37.示出通过敲除MTA基因表达导致诱导MTA流出。使用 CRISPR/Cas9和用于MTAP的靶向序列(Seq 1&2)或非靶向控制序列(NTC) 转染HCT116细胞。从每个序列中分离出几个克隆，并在完全培养基中生长持续4天。蛋白质裂解物通过蛋白质印记法分析MTAP的表达。通过液相色谱质谱分析培养基样品中的MTA含量。
图38.示出HCT116流出同型半胱氨酸(半胱氨酸的上游前体)，但是在半胱氨酸饥饿期间，它们能够重新摄取同型半胱氨酸。HCT116细胞对半胱氨酸饥饿仍然敏感，但没MDA-MB-231(M231)细胞那么敏感。使HCT116、 SW480和MDA-MB-231(M231)细胞在配制的培养基(基于RPMI培养基，含有或不含有半胱氨酸，缺少碳-12甲硫氨酸，补充有碳-13标记的甲硫氨酸并含有所有19种其他必需和非必需氨基酸)中生长持续两天。代谢物提取物从培养基样品(在特定的时间点采集)制备，并通过液相色谱-质谱分析。HC＝同型半胱氨酸。M+x＝质量加x-单元。没有对于MDA-MB-231细胞的半胱氨酸饥饿48h时的数据，因为在该时间点没有活细胞剩余。
图39.示出通过补充同型半胱氨酸可以从半胱氨酸饥饿中拯救细胞，这表明当前体供应充足时，酶CTH和CBS被表达，有活性并且能够进行从头半胱氨酸合成。这些数据支持这样的观点，即前体短缺(而不是CTH 和CBS酶表达的缺陷/不足，或者除CTH和CBS酶表达的缺陷/不足之外) 有助于对半胱氨酸饥饿的敏感性。使结肠直肠和乳腺癌细胞系在24孔板中生长。配制的基础培养基(基于RPMI的培养基)缺少半胱氨酸，但含有所有19种其他必需和非必需氨基酸。将此基础培养基补充所述组分；半胱氨酸0.4mM(+Cys)，同型半胱氨酸0.2mM&0.8mM(HC)，并且生长持续三天。数据是三个孔的平均值。误差条＝STDEV。
图40.示出了AMD1(将甲硫氨酸衍生的SAM分流到多胺合成通路的酶)的抑制保护细胞免受对半胱氨酸饥饿的急性敏感性(即细胞死亡)。将 MDA-MB-231细胞最初接种在24孔板中的完全(DMEM)培养基中。24小时后，用AMD1抑制剂沙多齐特(Sardomozide)(20μM)处理细胞持续16小时或不处理(Ctr)。然后用PBS洗涤细胞，并给予缺少半胱氨酸但含有所有19种其他氨基酸的培养基。图像(a)用光学显微镜拍摄，并且细胞计数(b)使用CASY TT细胞计数器进行。数据是三个孔的平均值。误差条＝STDEV。
详细描述
发明人惊奇地发现，基本上缺乏至少两种非必需氨基酸的饮食可以在癌症或增殖性紊乱的治疗中具有效用。不希望受理论束缚，通过基本上去除肿瘤细胞增殖和生长所需的氨基酸，代谢重塑以提供基本上缺乏氨基酸的来源分流了资源，并且可以减少可用于快速增殖的氨基酸的量，从而减缓或甚至抑制癌细胞的生长，或者引起癌细胞死亡。
合适地，本发明可以涉及用基本上缺乏至少两种非必需氨基酸的处方饮食部分或完全替代患有癌症的受试者的正常饮食。这样的饮食可以潜在地通过提供本文详述的膳食产品，或者通过两种或更多种可以同时或顺序施用的膳食补充剂来实现。潜在地，这样的饮食可以通过适当的食物选择来进一步补充，使用目前可获得的成分，使得饮食保持基本上缺乏两种或更多种非必需氨基酸。
膳食产品
在本发明的第一方面，提供了一种包含多种氨基酸的膳食产品，其中所述膳食产品包含所有必需氨基酸并且其中所述膳食产品基本上缺乏至少两种非必需氨基酸。
“必需氨基酸”，意味着甲硫氨酸、亮氨酸、苯丙氨酸、异亮氨酸、缬氨酸、赖氨酸、苏氨酸、组氨酸和色氨酸。
“膳食产品”是指包含一种或更多种必需氨基酸或其盐或酯的组合物，其用于食品产品中，或与食品产品一起使用或消耗，以向消耗补充剂的受试者提供所需水平的氨基酸或其盐或酯。这些产品中的膳食成分可以包括：维生素、矿物质、草药或其他植物材料(botanicals)、氨基酸以及诸如酶、器官组织、腺体和代谢物的物质。在一些实施方案中，膳食产品是受试者作为其饮食的一部分消耗的外源性氨基酸的唯一来源。合适地，在一些方面，膳食产品可以旨在基本上或完全替代受试者的饮食。因此，在一些方面，膳食产品可以是受试者的完全餐食替代物。
有利地，用本发明的膳食产品替代通常的氨基酸来源诸如蛋白质的消耗将产生基本上缺乏至少两种非必需氨基酸的饮食。这可以为癌症受试者提供治疗益处。
如本文所用，根据本发明的所有方面，术语“受试者”优选地指哺乳动物，包括人、兽医或农场动物、家养动物或宠物，以及通常用于临床研究使用的动物，包括非人灵长类动物、狗和小鼠。更具体地，本发明的受试者可以是人。
合适地，膳食产品可以包含至少9种氨基酸。合适地，膳食产品可以包含至少10种或至少11种或至少12种或至少13种或至少14种或至少 15种或至少16种或至少17种或18种氨基酸。合适地，膳食产品可包含例如9种至18种氨基酸或12-18种氨基酸，或12-17种氨基酸或13-17种氨基酸或14-17种氨基酸。
合适地，至少两种基本上缺乏的氨基酸包括(或基本上由其组成或由其组成)两种或更多种以下氨基酸：甘氨酸、丝氨酸、半胱氨酸、酪氨酸、脯氨酸和精氨酸。可选择地，膳食产品可以缺乏至少三种或至少四种或至少五种或至少六种或至少七种以下氨基酸：甘氨酸、丝氨酸、半胱氨酸、酪氨酸、脯氨酸、精氨酸、丙氨酸、天冬氨酸、谷氨酸、谷氨酰胺和天冬酰胺。合适地，膳食产品可以缺乏七种氨基酸，其中该膳食产品不含丝氨酸和甘氨酸以及以下氨基酸中的五种：半胱氨酸、酪氨酸、脯氨酸、精氨酸、丙氨酸、天冬氨酸、谷氨酸、谷氨酰胺和天冬酰胺。合适地，饮食可以基本上缺乏半胱氨酸，或者可以包含有限水平的半胱氨酸。
在本文中，“基本上由其组成”意指，膳食产品不可缺少对本发明的膳食产品具有实质效果的另外氨基酸。“实质效果”是指显著的治疗效果，其可以被测量为以下之一：a)对于与健康细胞相反的癌症特异性的显著效果； b)对抑制细胞增殖的显著效果；c)对癌细胞毒性的显著效果或d)a)-c)的任何组合。在一些方面，这可以通过比较含有和不含有特定氨基酸的膳食产品并确定氨基酸的缺少是否具有实质效果来测量。
1.用于测量体外氨基酸饥饿对细胞增殖影响的方法：
将细胞以每孔1×10^4至1×10^5个细胞每孔的密度接种到多个重复的 24孔细胞培养板的完整培养基中，并允许粘附过夜。过夜后，粘附细胞应为5-20％融合。用PBS洗涤细胞一次，并接受被特别地配制成含有或缺乏特定的氨基酸/多种氨基酸的各种细胞培养基，包括含有所有氨基酸的对照培养基。每24小时用新鲜的匹配培养基替换培养基。在初始培养基改变后的多个时间点(例如1天、2天、3天、4天和5天)，将板用于细胞计数。每种条件应该使用至少三个孔(即三个重复实验)，并计算平均值。使用Casy TT细胞计数器计数细胞，或者通过固定细胞、用DAPI染色并用Operetta 扫描仪计数。将比较在不同氨基酸条件下在不同时间点的细胞数。由于培养基中改变的氨基酸组成而产生的显著效果被认为是与对照培养基相比细胞数量的变化大于5％，当经至少三次独立实验通过适当TTEST(其中P <0.05被定量为显著效果)进行比较时，这在统计学上是显著的。
2.用于使用小鼠异种移植/同种异体移植/原位模型测量饮食的氨基酸组成对体内癌细胞增殖/肿瘤生长和存活的影响的方法
应该选择合适的癌细胞系，当皮下移植到裸鼠的胁腹时，所述癌细胞系会形成肿瘤(例如HCT116)。将形成肿瘤的适当数量的细胞(例如，3×10^6 个)
皮下注射到小鼠的胁腹。应使用每组至少10只小鼠，既可以双胁腹注射，也可以单胁腹注射。在注射小鼠的同一天，它们应该从正常的食物转换成特别配制的缺少特定氨基酸/多种氨基酸的实验饮食。应包括接受含有所有氨基酸的饮食的对照组。肿瘤长度和宽度每周至少测量两次，直到死亡，并用于计算肿瘤体积。应该允许小鼠存活直到临床终点，在所述临床终点达到预定最大肿瘤体积(当地伦理允许)，然后剔出。应该比较在第一只小鼠死亡/被剔出之前每个测量时间点的平均肿瘤体积。通过适当的 TTEST评估对肿瘤体积的显著效果，其中P<0.05被定量为显著效果。使用Mantel-Cox(对数秩)统计检验计算存活的显著变化，其中P<0.05被定量为显著效果。
可选择地，可以进行上述测定，其中小鼠在注射移植细胞后保持正常食物的饮食，并且仅在检测到可测量的肿瘤后被分配到实验饮食。在这种情况下，肿瘤体积可以作为绝对体积进行比较，或可以作为饮食变化时起始肿瘤体积的百分比进行比较。
可选择地，同种异体移植或原位模型可以以与上述相同的方式使用。
3.用于使用遗传工程化的小鼠模型(GEMM)测量饮食中的氨基酸组成对体内癌细胞增殖/肿瘤生长和存活的影响的方法
应选择合适的GEMM(例如APCmin/+或Eμ-myc)；小鼠应该喂食正常的食物，直到饮食改变。饮食改变的年龄应该在生命的后期(一旦肿瘤开始发生)，但是应该在由于临床终点(肿瘤相关的存活)发生死亡之前。例如在 APCmin/+小鼠中80天以及在Eμ-myc小鼠中60天。在指定的年龄，小鼠应该从正常的食物转换成特别配制的缺少特定氨基酸/多种氨基酸的实验饮食。应包括接受包含有所有氨基酸的饮食的对照组。如果可能，应该测量肿瘤生长(例如通过肿瘤测量，或者通过生物标志物分析，例如来自肿瘤中荧光蛋白标志物的荧光信号)，并且允许小鼠到达临床终点(肿瘤相关存活)。此时还应评估肿瘤负荷(例如通过计数/称重/测量肿瘤)。
应该比较在第一只小鼠死亡/被剔出之前每个测量时间点的平均肿瘤体积。通过适当的TTEST评估对肿瘤体积的显著效果，其中P<0.05被定量为显著效果。使用Mantel-Cox(对数秩)统计检验计算存活的显著变化，其中P<0.05被定量为显著效果。对于终点肿瘤负荷，通过适当的TTEST 评估对肿瘤负荷的显著效果，其中P<0.05被定量为显著效果。
可选择地，饮食可以在生命早期被改变，例如第10天/第20天/第40 天，并且测量和比较上述(3)相同的结果。
合适地，膳食产品可以基本上缺乏丝氨酸。癌细胞可以快速地利用大量的外源丝氨酸来支持其快速增殖。当丝氨酸耗尽时，癌细胞被迫通过丝氨酸合成通路输送糖酵解中间体。有利地，这可导致减少的增殖和/或减少的细胞存活。
合适地，膳食产品可以基本上缺乏甘氨酸。这可以降低甘氨酸和丝氨酸两者的血液水平，因为丝氨酸被用来合成甘氨酸。有利地，本发明示出了，基本上缺乏丝氨酸和甘氨酸两者的饮食可以特别有效。
合适地，膳食产品可以基本上缺乏半胱氨酸。本发明令人惊讶地示出，许多癌细胞系(诸如肺、结肠和乳腺癌细胞系)大量消耗外源半胱氨酸。令人惊讶的是，基本上缺乏半胱氨酸的饮食可抑制细胞生长，并可导致癌细胞死亡，例如在结肠直肠细胞系中示出的。合适地，基本上不含半胱氨酸或具有半胱氨酸水平有限的膳食产品对于具有下调的MTAP表达的受试者可以特别有效。
合适地，膳食产品可以基本上缺乏酪氨酸。本发明已经令人惊讶地发现，酪氨酸的限制可以单独或与其他非必需氨基酸组合降低癌细胞生长。
合适地，膳食产品基本上缺乏：
a.甘氨酸、丝氨酸和半胱氨酸；
b.甘氨酸、丝氨酸和精氨酸；
c.甘氨酸、丝氨酸和酪氨酸；
d.甘氨酸、丝氨酸、精氨酸和半胱氨酸；
e.甘氨酸、丝氨酸、酪氨酸和半胱氨酸；
f.半胱氨酸和精氨酸；
g.半胱氨酸和酪氨酸；
h.半胱氨酸和甘氨酸；
i.半胱氨酸、酪氨酸和精氨酸；或
j.甘氨酸、丝氨酸、精氨酸、酪氨酸和半胱氨酸。
有利地，本发明令人惊讶地示出了，这样的组合在抑制细胞增殖和/ 或诱导癌细胞死亡方面特别有效。
在一方面，膳食产品基本上缺乏甘氨酸、丝氨酸和半胱氨酸。通过本发明已经示出了，这种组合在许多癌细胞系中，例如，包括结肠直肠癌(诸如在HCT116和RKO中)、肝癌(HepG2)、骨肉瘤(U2OS)和乳腺癌(MDA MB 231)，在抑制癌细胞增殖和增加癌细胞死亡方面令人惊讶地有效。
在一方面，膳食产品基本上缺乏甘氨酸、丝氨酸和精氨酸。通过本发明已经示出了，这种组合在结肠直肠癌细胞系中(诸如RKO和HCT116)抑制癌细胞增殖和/或增加癌细胞死亡方面令人惊讶地有效。
在一方面，膳食产品基本上缺乏甘氨酸、丝氨酸和酪氨酸。通过本发明已经示出了，这种组合在结肠直肠癌细胞系中(诸如RKO和HCT116)抑制癌细胞增殖和/或增加癌细胞死亡方面令人惊讶地有效。
在一方面，膳食产品基本上缺乏甘氨酸、丝氨酸、精氨酸和半胱氨酸。令人惊讶的是，这种组合已经被示出在诱导结肠直肠癌细胞系中的细胞死亡方面特别有效。
在一方面，膳食组合物可以基本上缺乏甘氨酸、丝氨酸、精氨酸、酪氨酸和半胱氨酸。
合适地，在所有方面，膳食产品可以包含甲硫氨酸、谷氨酰胺和亮氨酸中的任意一种或其任意组合。有利地，亮氨酸和谷氨酰胺。
膳食产品还可包含在低于25mg/kg受试者体重/天或低于20mg/kg/天或低于18mg/kg/天或低于16mg/kg/天的水平的甲硫氨酸。
除非本文另有说明，本发明的膳食产品可以配制成至少提供基于平均每日总蛋白质消耗的推荐每日摄入量的必需氨基酸。
如基于平均每日总蛋白质消耗量，由医学研究所(Institute of Medicine) 推荐的每日必需氨基酸摄入量为：组氨酸18mg/g蛋白质消耗；异亮氨酸 25mg/g蛋白质；亮氨酸55mg/g蛋白质、赖氨酸51mg/g蛋白质、甲硫氨酸和半胱氨酸组合25mg/g蛋白质；苯丙氨酸和酪氨酸组合47mg/g蛋白质、苏氨酸27mg/g蛋白质、色氨酸7mg/g蛋白质以及缬氨酸32mg/g蛋白质。酪氨酸和半胱氨酸是非必需氨基酸。当本发明的膳食产品基本上缺乏酪氨酸和/或半胱氨酸时，将该膳食产品配制成提供膳食产品中苯丙氨酸和甲硫氨酸的水平将被调整，从而将该膳食产品配制成提供基于平均每日蛋白质消耗至少25mg/g蛋白质量的甲硫氨酸和至少47mg/g蛋白质量的苯丙氨酸。
合适地，半胱氨酸“有限”的膳食产品是一种被配制为提供少于基于平均每日蛋白质消耗的半胱氨酸推荐每日摄入量的膳食产品。例如，半胱氨酸有限的膳食产品可以是提供少于20mg/g蛋白质或少于15mg/g蛋白质或少于10mg/g蛋白质或少于5mg/g蛋白质的膳食产品。
合适地，膳食产品可以被配制成提供每克蛋白质消耗有限水平的总的非必需氨基酸。例如，与每克消耗蛋白质推荐的每日摄入的总非必需氨基酸相比，组合的非必需氨基酸每日摄入可以与基本上缺乏至少一种或至少两种或至少三种或至少四种或至少五种或至少六种或至少七种非必需氨基酸的饮食相当。
例如，医学研究所建议对于成年人，每天以每公斤体重0.8克的速率消耗蛋白质。膳食产品可以配制成在该产品的推荐的每日消耗期间，提供每千克体重至少0.8克蛋白质。
合适地，本发明的膳食产品可以配制成提供上述这些推荐水平。例如，一种或更多种氨基酸可以配制在膳食产品中，以提供基于平均每日总蛋白质消耗的每日平均摄入量的至少2倍、3倍、4倍、5倍或6倍。
合适地，存在于本发明膳食产品中的氨基酸可以是游离形式的氨基酸、以前药形式的氨基酸、盐或氨基酸酯。也可以设想具有一个或更多个N- 末端或C-末端修饰的氨基酸，以及同聚物、同二聚体、异聚物和异二聚体形式。
合适地，膳食产品可以配制成每天施用从一次至八次。优选地，每天一次至四次。因此，膳食产品可以配制成合适的单位剂型。
本发明的膳食产品可以进一步包含一种或更多种大量营养元素和/或微量营养元素。
可以在医学研究所2002年9月发布的Dietary Reference Intakes for Energy,Carbohydrate,Fiber,Fat,Fatty Acids,cholesterol,protein and amino acids中找到关于大量营养元素的指南和建议的每日摄入量。
可以是膳食产品的另外成分的大量营养元素的非详尽列表包括：碳水化合物、纤维和脂肪(诸如n-6多不饱和脂肪酸、n-3多不饱和脂肪酸、饱和脂肪酸和反式脂肪酸以及胆固醇)。
微量营养元素的非详尽列表包括维生素A、维生素C、维生素D、维生素E、维生素K、硫胺素、核黄素、烟酸、维生素B6、叶酸、维生素 B12、泛酸、生物素、胆碱、钙、铬、铜、氟化物、碘、铁、镁、钼、磷、硒、锌、钾、钠和氯化物。合适地，膳食产品可以配制成以可接受的或推荐的每日摄入量提供这些，如出版物"Dietary Reference Intakes:RDA and Al forVitamins and Elements”，NAS.IOM.Food and Nutrition Board中所详述的。
饮食中含有氨基酸失衡，通常以缺乏两种或更多种非必需氨基酸的形式，任选地由一种或更多种其他氨基酸的过剩来补充。例如，基本上缺乏的氨基酸与其他氨基酸的平均丰度相比，可以是至少10倍、15倍、20倍、 30倍、45倍、50倍、100倍或1000倍低。低蛋白质但富含其他营养元素的食物，诸如水果、蔬菜和某些坚果，可以遵循膳食学家的建议消耗，确保膳食中氨基酸的摄入比率保持在预期的比率。这种饮食旨在单独消耗或与药物疗法联合消耗，所述药物疗法诸如那些具有抗癌活性的药物疗法。
在一些实施方案中，本发明的膳食产品跨两种或更多种膳食补充剂配制，这两种或更多种膳食补充剂一起提供本发明的膳食产品。这些可以同时或依次施用于所述受试者，使得由膳食补充剂提供的组合的平均饮食提供本发明的膳食产品。这可以对增加受试者的饮食多样性是有利的。
膳食产品可以粉末、凝胶、溶液、悬浮液、糊状物、固体、液体、液体浓缩物、可重构的粉末、摇瓶(shake)、浓缩物、丸剂、条(bar)、片剂、胶囊或即用型产品的形式提供。设想，当补充剂为片剂、丸剂、胶囊、液体、气雾剂、可注射溶液或其它药学上可接受的制剂形式时，膳食产品也可以是药物组合物。合适地，膳食产品可以是饮料。合适地，饮料可以一天施用2至6次。
合适地，膳食产品可以不是天然存在的食物。
合适地，膳食产品可以包含特定氨基酸之外的另外化合物。合适地，这样的另外化合物可以无助于基本上缺乏的氨基酸的从头合成。
如本文所用，“基本上缺乏”在指氨基酸时是指完全或几乎不含(诸如痕量的)该氨基酸。
任选地，将通过静脉途径施用。任选地，肠胃外施用可以以团注或通过输注来提供。
合适地，膳食产品可以是：
a)管喂肠内营养产品(tube fed enteral nutritional product)(诸如鼻胃营养产品，其可以通过NG管施用；鼻空肠营养产品，其可以通过NJ管施用；或者PEG(经皮内窥镜胃造口术)管营养产品)；
b)肠胃外营养产品(其可以通过中心静脉施用，例如通过静脉导管上的专用管腔施用)；或者
c)静脉输注产品。
优选地，施用可以通过管喂肠内营养。
在某些实施方案中，在至少1天、2天、3天、4天、5天、6天、7 天，至少2周、3周、4周、5周、6周、7周、8周、9周、10周、11周、 12周、13周、14周、15周、16周、17周、18周、19周、20周、21周、 22周、23周、24周、25周、26周或直到观察到治疗终点(例如，观察到肿瘤缩小)的时间段内施用饮食或本发明的膳食产品。
本发明还提供了制备本发明的膳食产品的工艺，其中将氨基酸溶解或分散在水中并喷雾干燥。
适当地，氨基酸可以与另外的组分诸如大量营养元素和微量营养元素混合。可以根据需求加入粘合剂、乳化剂或其他适合用于人或动物消耗的成分。
药物组合物
在另一方面，本发明提供了一种药物组合物，其包含本发明的膳食产品或根据本发明生产的膳食产品以及药学上可接受的载体、赋形剂或稀释剂。
合适的药物制剂的选择和制备的常规程序在例如“Pharmaceuticals- TheScience of Dosage Form Designs”,M.E.Aulton,Churchill Livingstone, 1988中描述。
本发明的组合物可以是以适合用于口服使用的形式(例如片剂、锭剂、硬胶囊或软胶囊、水性或油性悬浮液、乳液、可分散的粉末或颗粒、糖浆或酏剂)。
本发明的组合物可以使用本领域中熟知的常规的药物赋形剂通过常规的程序获得。因此，意图用于口服使用的组合物可以包含例如一种或更多种着色剂、甜味剂、调味剂和/或防腐剂。
合适地，药物组合物被配制成提供治疗有效量的本发明的膳食产品。
用于在状况的疗法中使用的有效量是足以在温血动物，特别是人类中有症状地缓解状况的症状或减慢状况进展的量。
术语“治疗有效量”涵盖化合物或组合物的量，当施用时，所述量足以防止正在治疗的状况、紊乱或疾病的一种或更多种症状的发展，或在某种程度上减轻这些症状。术语“治疗有效量”还涵盖足以引起细胞、组织、器官、系统、动物或人的生物或医学应答的化合物或组合物的量，这是研究者、医学医生或临床医生正在寻求的。在任何个例中，适当的“有效”的量可由本领域中普通技术人员之一使用例行实验确定。应当理解，对于任何特定患者的具体剂量水平和施用频率可以变化，并且将取决于多种因素，包括所用具体化合物的活性；化合物的生物利用度、代谢稳定性、排出速率和作用时间长度；化合物施用的方式和时间；患者的年龄、体重、总体健康状况、性别和饮食；以及正在治疗的特定状况的严重程度。
术语“治疗”("treat”)、“治疗”("treating”)和“治疗”("treatment”)涵盖减轻或消除状况、紊乱或疾病，或一种或更多种与状况、紊乱或疾病相关的症状，并且涵盖减轻或根除状况、紊乱或疾病自身的原因。在某些实施方案中，术语“治疗”("treat”)、“治疗”("treating”)和“治疗”("treatment”)是指向受试者施用化合物、药物组合物或药物剂型，为了减轻、消除或预防状况、紊乱或疾病或与其相关的症状，或其原因。
合适地，本发明的药物组合物可以进一步包含治疗剂，所述治疗剂选自：癌细胞生长抑制剂、放射治疗剂、化学治疗剂、氨基酸代谢/周转/相互转化抑制剂、非必需氨基酸生物合成抑制剂、氨基酸转运抑制剂、促进氨基酸降解的酶或药物或螯合氨基酸的物质。治疗剂可以抑制OXPHOS 和/或可以增加活性氧物质和/或可以降低抗氧化剂防御。
癌症和增殖紊乱
在一方面，本发明提供了本发明的膳食产品或根据本发明的工艺生产的膳食产品或本发明的药物组合物，用于在药物中使用。
例如，本发明提供了本发明的膳食产品或根据本发明的工艺生产的膳食产品或本发明的药物组合物，用于在癌症治疗中使用。
在另一方面，本发明提供了本发明的膳食产品或根据本发明生产的膳食产品或本发明的药物组合物在制备用于治疗癌症的药物中的用途。
在另外的方面，本发明提供了治疗受试者中的癌症的方法，所述方法包括将治疗有效量的膳食产品施用至受试者。
对于所有方面，示例性的癌症包括但不限于肾上腺皮质癌、AIDS相关癌症、AIDS相关淋巴瘤、肛门癌、肛门直肠癌、肛管癌、阑尾癌、儿童小脑星形细胞瘤(childhoodcerebellar astrocytoma)、儿童大脑星形细胞瘤 (childhood cerebral astrocytoma)、基底细胞癌、皮肤癌(非黑色素瘤)、胆管癌、肝外胆管癌、肝内胆管癌、膀胱癌(bladdercancer)、泌尿膀胱癌(urinary bladder cancer)、骨和关节癌、骨肉瘤和恶性纤维组织细胞瘤、脑癌、脑肿瘤、脑干胶质瘤、小脑星形细胞瘤、大脑星形细胞瘤/恶性胶质瘤、室管膜瘤、成神经管细胞瘤、幕上原始神经外胚层肿瘤(supratentorial primitiveneuroectodermal tumors)、视觉通路和下丘脑神经胶质瘤、乳腺癌、支气管腺瘤/类癌、类癌肿瘤、胃肠道、神经系统癌、神经系统淋巴瘤、中枢神经系统癌、中枢神经系统淋巴瘤、宫颈癌、儿童癌症、慢性淋巴细胞白血病、慢性骨髓性白血病、慢性骨髓增生性紊乱、结肠癌、结肠直肠癌、皮肤T 细胞淋巴瘤、淋巴肿瘤、蕈样肉芽肿、Seziary综合征、子宫内膜癌、食管癌、颅外生殖细胞瘤、性腺外生殖细胞瘤、肝外胆管癌、眼癌、眼内黑色素瘤、视网膜母细胞瘤、胆囊癌(gallbladder cancer)、胃(胃)癌(gastric (stomach)cancer)、胃肠道类癌肿瘤、胃肠道间质肿瘤(GIST)、生殖细胞肿瘤、卵巢生殖细胞肿瘤、妊娠滋养层肿瘤胶质瘤、头和颈癌、肝细胞(肝) 癌、霍奇金淋巴瘤(Hodgkin lymphoma)、下咽癌、眼内黑色素瘤、眼部癌症、胰岛细胞肿瘤(内分泌胰腺)、卡波西肉瘤(Kaposi Sarcoma)、肾癌(kidney cancer)、肾癌(renal cancer)、肾癌(kidney cancer)、喉癌(laryngeal cancer)、急性成淋巴细胞白血病、急性骨髓性白血病、慢性淋巴细胞白血病、慢性髓细胞白血病、毛细胞白血病、唇和口腔癌症、肝癌、肺癌、非小细胞肺癌、小细胞肺癌、AIDS相关淋巴瘤、非霍奇金淋巴瘤(non-Hodgkin lymphoma)、原发性中枢神经系统淋巴瘤、Waldenstram巨球蛋白血症、髓母细胞瘤、黑色素瘤、眼内(眼)黑色素瘤、默克尔细胞癌、间皮瘤恶性肿瘤、间皮瘤、转移性鳞状颈部癌、口癌、舌癌、多内分泌瘤形成综合征、蕈样肉芽肿、骨髓发育不良综合征、骨髓增生异常/骨髓增生性疾病、慢性骨髓性白血病、急性髓细胞白血病、多发性骨髓瘤、慢性骨髓增生性紊乱、鼻咽癌、神经母细胞瘤、口癌(oral cancer)、口腔癌(oral cavity cancer)、口咽癌(oropharyngeal cancer)、卵巢癌、卵巢上皮癌、卵巢低恶性潜能肿瘤、胰腺癌、胰岛细胞胰腺癌、副鼻窦和鼻腔癌、甲状旁腺癌、阴茎癌、咽癌 (pharyngeal cancer)、嗜铬细胞瘤、成松果体细胞瘤和幕上原始神经外胚层肿瘤、垂体肿瘤、浆细胞瘤/多发性骨髓瘤、胸膜肺母细胞瘤、前列腺癌、直肠癌、肾盂和输尿管、移行细胞癌(renal pelvis and ureter,transitional cell cancer)、视网膜母细胞瘤、横纹肌肉瘤、涎腺癌、尤文肉瘤家族肿瘤(ewing family of sarcoma tumor)、卡波西肉瘤(Kaposi Sarcoma)、软组织肉瘤、子宫癌、子宫肉瘤、皮肤癌(非黑色素瘤)、皮肤癌(黑色素瘤)、默克尔细胞皮肤癌、小肠癌、软组织肉瘤、鳞状细胞癌、胃(胃)癌(stomach(gastric)cancer)、幕上原始神经外胚层肿瘤、睾丸癌、喉癌、胸腺瘤、胸腺瘤和胸腺癌、甲状腺癌、肾盂和输尿管和其他泌尿器官的移行细胞癌、妊娠滋养层肿瘤、尿道癌、子宫内膜子宫癌、子宫肉瘤、子宫体癌、阴道癌、外阴癌和威尔姆肿瘤(Wilm's Tumor)。在一些实施方案中，癌症选自由结肠直肠癌、肝癌、骨肉瘤、淋巴瘤、乳腺癌和淋巴瘤组成的组。
癌症可以对于野生型KRAS是阳性的。
癌症可以已经解除了对cMyc表达的调控。
癌症可以是可具有下调的MTAP表达的肿瘤。癌症可以是实体瘤或血液恶性肿瘤。
示例性的实体肿瘤包括但不限于间皮瘤、肺癌、非小细胞肺癌(NSCLC)、腺癌、鳞状细胞癌、胶质瘤、胰腺肿瘤、胰腺癌、壶腹癌、胆囊癌、胆道癌、软组织肉瘤、食管癌、子宫内膜癌、软骨肉瘤、骨肉瘤、胃肠道间质瘤和脊索瘤、原发性恶性黑色素瘤、转移性黑色素瘤和原发性乳腺癌。
示例性血液恶性肿瘤包括但不限于弥漫性大细胞淋巴瘤、低度淋巴瘤、 B谱系急性淋巴细胞白血病、套细胞淋巴瘤、T细胞急性白血病、成人T 细胞白血病、T细胞来源淋巴瘤。淋巴瘤可以任选地是转化的。
合适地，本发明的膳食产品可以在治疗疾病或紊乱中具有效用，其中细胞的异常或另外不希望的增殖可导致衰弱性病症。
膳食产品可以基本上缺乏半胱氨酸。合适地，基本上缺乏半胱氨酸的饮食可以在依赖大量摄入外源半胱氨酸的癌症诸如肺癌、结肠直肠癌和乳腺癌中具有效用。合适地，基本上缺乏半胱氨酸的饮食可以在MTAP表达下调的癌症中具有效用。膳食产品可以基本上缺乏丝氨酸和/或甘氨酸。合适地，基本上缺乏丝氨酸和/或甘氨酸的饮食可以在依赖大量消耗外源丝氨酸和/或甘氨酸的癌症诸如肺癌、结肠直肠癌和乳腺癌、淋巴瘤、结肠直肠癌、肝癌、骨肉瘤和乳腺癌中具有效用。
膳食产品可以基本上缺乏精氨酸和/或酪氨酸。合适地，基本上缺乏精氨酸的饮食可以在癌症诸如结肠直肠癌中具有效用。
组合疗法
本发明的膳食产品或药物组合物可以单独使用以提供治疗效果。合适地，本发明的膳食产品或药物组合物也可以与一种或更多种另外的化学治疗剂和/或放射疗法组合使用。
此类化学疗法可以包括以下类别的抗癌剂中的一种或更多种：
(i)抗增殖药/抗肿瘤药及其组合，诸如，烷基化剂(例如顺铂、奥沙利铂、卡铂、环磷酰胺、氮芥、尿嘧啶氮芥、苯达莫司汀、美法仑、苯丁酸氮芥、盐酸氮芥、白消安、替莫唑胺、亚硝基脲、异环磷酰胺(ifosamide)、美法仑、哌泊溴烷、三乙撑蜜胺、三乙撑硫代磷酰胺(triethylenethiophoporamine)、卡莫司汀、洛莫司汀、链佐星和达卡巴嗪)；抗代谢物(例如，吉西他滨和叶酸拮抗物诸如氟嘧啶如5-氟尿嘧啶和替加氟、雷替曲塞、氨甲蝶呤、培美曲塞、胞嘧啶阿拉伯糖苷、氟尿苷、阿糖孢苷、 6-巯基嘌呤、6-硫代鸟嘌呤、氟达拉滨磷酸、喷司他丁(pentostatin)、和吉西他滨和羟基脲)；抗生素(例如，蒽环霉素如阿霉素、博来霉素、多柔比星、柔红霉素、表柔比星、伊达比星、丝裂霉素-C、更生霉素和光辉霉素)；抗有丝分裂剂(例如长春花生物碱如长春新碱、长春花碱、长春地辛和长春瑞滨，以及紫杉烷如紫杉醇和泰索帝(taxotere)，以及polo激酶(polokinase) 抑制剂)；蛋白酶体抑制剂例如卡非佐米和硼替佐米；干扰素治疗；和拓扑异构酶抑制剂(例如，表鬼臼毒素如依托泊苷和替尼泊苷、安吖啶、拓扑替康、伊立替康、米托蒽醌以及喜树碱)；博来霉素、更生霉素、柔红霉素、多柔比星、表柔比星、伊达比星、ara-C、紫杉醇(TaxolTM)、白蛋白结合型紫杉醇(abpaclitaxel)、多西紫杉醇(docetaxel)、光神霉素、脱氧助间型霉素(deoxyco-formycin)、丝裂霉素-C、L-天冬酰胺酶、干扰素(特别是IFN-a)、依托泊苷、替尼泊苷、DNA脱甲基化剂(例如，阿扎胞苷或地西他滨)；以及组蛋白去乙酰化酶(HDAC)抑制剂(例如伏立诺他(vorinostat)、MS-275、帕比司他(panobinostat)、罗米地(romidepsin)、丙戊酸、莫西汀(MGCD0103) 和普拉西诺司他SB939(prasinostat SB939))；
(ii)细胞生长抑制剂诸如抗雌激素(例如他莫昔芬、氟维司群、托瑞米芬、雷洛昔芬、屈洛昔芬和艾多昔芬(iodoxyfene))、抗雄激素(例如比卡鲁胺、氟他胺、尼鲁米特和醋酸环丙孕酮)、LHRH拮抗剂或LHRH激动剂(例如戈舍瑞林、亮丙瑞林和布舍瑞林)、孕激素(例如醋酸甲地孕酮)、芳香化酶抑制剂(例如阿那曲唑、来曲唑、伏氯唑(vorazole)和依西美坦)以及5*还原酶抑制剂诸如非那雄胺；和诺维本(avelbene)、CPT-ll、阿那曲唑、来曲唑、卡培他滨、reloxafme、环磷酰胺、异环磷酰胺和屈洛昔芬(droloxafine)；
(iii)抗侵入剂例如达沙替尼和博舒替尼(SKI-606)，以及金属蛋白酶抑制剂、尿激酶纤维蛋白溶酶原激活剂受体功能(urokinase plasminogen activator receptorfunction)的抑制剂或乙酰肝素酶(heparanase)的抗体；
(iv)生长因子功能的抑制剂：例如，这样的抑制剂包括生长因子抗体和生长因子受体抗体例如抗erbB2抗体曲妥珠单抗(trastuzumab)[赫塞汀TM]、抗EGFR抗体帕尼单抗、抗erbB1抗体西妥昔单抗，酪氨酸激酶抑制剂例如表皮生长因子家族的抑制剂(例如，EGFR家族酪氨酸激酶抑制剂例如吉非替尼、埃罗替尼和6-丙烯酰胺基-N-(3-氯-4-氟苯基)-7-(3-吗啉代丙氧基)- 喹唑啉-4-胺(CI 1033)、阿法替尼、范德塔尼、奥西默蒂尼和罗基列替尼)， erbB2酪氨酸激酶抑制剂诸如拉帕替尼)和共刺激分子诸如CTLA-4、4-lBB 和PD-1的抗体，或细胞因子抗体(IL-10、TGF-β)；肝细胞生长因子家族的抑制剂；胰岛素生长因子家族的抑制剂；细胞凋亡的蛋白调节物的调节剂 (例如Bcl-2抑制剂)；血小板衍生的生长因子家族的抑制剂，例如伊马替尼和/或尼罗替尼(AMN107)；丝氨酸/苏氨酸激酶的抑制剂(例如，Ras/Raf信号传送抑制剂例如法尼基转移酶抑制剂，索拉非尼、替吡法尼和洛那法尼)，通过MEK和/或AKT激酶的细胞信号传送的抑制剂、c-kit抑制剂、abl激酶抑制剂、PI3激酶抑制剂、Plt3激酶抑制剂、CSF-1R激酶抑制剂、IGF 受体激酶抑制剂；极光激酶抑制剂和周期蛋白依赖性激酶抑制剂诸如 CDK2抑制剂和/或CDK4抑制剂；CCR2、CCR4或CCR6拮抗剂；和RAF 激酶抑制剂，如在WO2006043090、WO2009077766、WO2011092469或 WO2015075483中所述的那些。
(v)抗血管生成剂，例如抑制血管内皮生长因子的效应的那些抗血管生成剂，[例如抗血管内皮细胞生长因子抗体贝伐单抗(AvastinTM)]；沙利度胺；来那度胺；和例如VEGF受体酪氨酸激酶抑制剂诸如凡德他尼、瓦他拉尼(vatalanib)、舒尼替尼、阿西替尼和帕唑帕尼；
(vi)基因治疗方法，包括例如替换畸变基因例如畸变p53或畸变的 BRCA1或BRCA2的方法；
(vii)免疫治疗方法，包括例如抗体疗法，诸如阿仑单抗、利妥昔单抗、替伊莫单抗(ibritumomab tiuxetan)和奥法木单抗；干扰素，例如干扰素α；白细胞介素诸如IL-2(阿地白介素(aldesleukin))；白细胞介素抑制剂例如IRAK4抑制剂；癌症疫苗，包括预防性疫苗和治疗疫苗，诸如 HPV疫苗例如加德西(Gardasil)、希瑞适(Cervarix)、Oncophage和 Sipuleucel-T(Provenge)；gp100；基于树突细胞的疫苗(诸如Ad.p53DC)；toll 样受体调节物例如TLR-7或TLR-9拮抗剂；PD-1、PD-L1、PD-L2和CTL4-A 调节剂(例如尼弗罗玛)、抗体和疫苗；其他IDO抑制剂(诸如吲哚美辛)；抗PD-1单克隆抗体(诸如MK-3475和尼弗罗玛)；抗PDL1单克隆抗体(诸如MEDI-4736和RG-7446)；抗PDL2单克隆抗体；和抗CTLA-4抗体(诸如易普利姆玛)；和
(viii)细胞毒性剂例如氟达拉滨(fludaribine)(福达华(fludara))、克拉屈滨(cladribine)、喷司他丁(pentostatin)(NipentTM)；
(ix)靶向疗法，例如PI3K抑制剂，例如艾代拉里(idelalisib)和培福辛(perifosine)；SMAC(胱天蛋白酶的第二线粒体驱动的活化剂)模拟物，也称为凋亡蛋白抑制剂(IAP)拮抗剂(IAP拮抗剂)。这些剂起到抑制lAP例如 XIAP、clAP1和clAP2的作用，并且从而重建细胞凋亡途径。特定的SMAC 模拟物包括Birinapant(TL32711，TetraLogicPharmaceuticals)、LCL161 (Novartis)、AEG40730(Aegera Therapeutics)、SM-164(University of Michigan)、LBW242(Novartis)、ML101(Sanford-Burnham MedicalResearch Institute)、AT-406(Ascenta Therapeutics/University of Michigan)、GDC-0917 (Genentech)、AEG35156(Aegera Therapeutic)和HGS1029(Human GenomeSciences)；以及靶向泛素蛋白酶体系统(UPS)的剂，例如硼替佐米、卡菲佐米、马里佐米(NPI-0052)和MLN9708；以及
(xii)嵌合抗原受体、抗癌疫苗和精氨酸酶抑制剂。
合适地，本发明的组合物可以与一种或更多种消耗氨基酸的治疗酶组合使用。这样的治疗酶可以与本发明的组合物相关。例如，对于基本上缺乏精氨酸的组合物，可以使用治疗酶诸如精氨酸酶。
另外，或者在替代方案中，本发明的组合物可以与一种或更多种参与抑制氨基酸从头合成的化合物组合使用。这样的化合物可以与本发明的组合物相关。例如，对于基本上缺乏丝氨酸的组合物，可以使用抑制丝氨酸从头合成的化合物，诸如PHGDH抑制剂、PSAT1抑制剂和PSPH抑制剂。
本发明方法中使用的治疗剂可以是单一的剂或剂的组合。优选的组合将包括具有不同作用机制的剂。
在本文中，在使用术语“组合”的情况下，应理解的是，这指的是同时、分开或相继的施用。在本发明的一个方面，“组合”指的是同时的施用。在本发明的另一个方面，“组合”指的是分开的施用。在本发明的另外的方面，“组合”指的是相继的施用。在施用是相继或分开的情况下，在施用第二组分中的延迟不应当使得损失组合的有益效果。
如本文使用的，术语“与...组合施用”以及语法等同等意在涵盖向单个患者施用选定的治疗剂，且意图包括其中通过相同或不同的施用途径或在相同或不同的时间施用剂的治疗方案。在一些实施方案中，本文描述的化合物将与其他剂共同施用。这些术语涵盖向动物施用两种或更多种剂使得剂和/或其代谢物两者同时存在于动物中。其包括以单独的组合物同时施用，以单独的组合物在不同时间施用，和/或以其中存在这两种剂的组合物施用。
本文公开的剂可以通过任何途径施用，包括皮内、皮下、口服、动脉内或静脉内施用。
在使用组合治疗的一些实施方案中，当组合时，本发明的膳食产品或药物组合物的量和其它药物活性剂的量对于治疗患者中的靶向病症是治疗有效的。在这种情况下，当组合时，如果组合的量足以减少或完全缓解病症的症状或其他有害影响；治愈病症；逆转、完全停止或减缓病症的进展；或者降低病症恶化的风险，则组合的量是“治疗有效量”。通常，本领域技术人员可以通过例如从本说明书中描述的本发明化合物的剂量范围和其他药物活性化合物的批准或以其他方式公布的剂量范围开始来确定这样的量。
根据本发明的另一方面，提供了如上定义的本发明的膳食产品或药物组合物和如上定义的另外的抗癌剂，用于在癌症的联合治疗中使用。根据本发明的另一方面，提供了一种治疗患有癌症的人或动物受试者的方法，所述方法包括同时地、顺序地或单独地向受试者施用治疗有效量的本发明的膳食产品或药物组合物，与如上定义的另外的抗癌剂。
根据本发明的另一方面，提供了本发明的膳食产品或药物组合物，用于同时地、顺序地或单独地与如上定义的另外的抗癌剂在癌症治疗中使用。
本发明的膳食产品或药物组合物也可以与放射疗法组合使用。合适的放射疗法治疗包括例如X射线疗法、质子束疗法或电子束疗法。放射疗法还可以涵盖使用放射性核素剂，例如131I、32P、90Y、89Sr、153Sm或 223Ra。这样的放射性核素疗法是熟知的，并且可商购。根据本发明的另一方面，提供了如上定义的本发明的膳食产品或药物组合物或其药学上可接受的盐，用于与放射疗法联合地在癌症的治疗中使用。
根据本发明的另一方面，提供了一种治疗患有癌症的人或动物受试者的方法，所述方法包括与放射疗法同时地、顺序地或单独地向受试者施用治疗有效量的本发明的膳食产品或药物组合物或其药学上可接受的盐。
合适地，本发明惊奇地发现，基本上缺乏至少一种氨基酸的饮食联合至少一种化学治疗剂或放射疗法的组合可以不仅仅是加和性的。
合适地，在一些实施方案中，本发明可以提供本发明的膳食产品或药物组合物联合至少一种化学治疗剂或放射疗法的协同组合。
在一个实施方案中，本发明的膳食产品或药物组合物可以与一种或更多种类别的化学治疗剂组合，所述化学治疗剂选自由以下组成的组：HDAC 抑制剂、MTOR抑制剂、酪氨酸激酶抑制剂和蛋白酶体抑制剂。
HDAC抑制剂
合适地，化学治疗剂可以是一种或更多种组蛋白脱乙酰酶(HDAC)抑制剂。HDAC抑制剂调节转录并诱导细胞生长停滞、分化、和凋亡。HDAC 抑制剂(HDACI)也增强在癌症治疗中使用的治疗剂(包括放射和化学治疗药物)的细胞毒性效果。
术语“HDAC”是指从蛋白质中去除乙酰基，例如组蛋白N末端赖氨酸残基的ε-氨基基团的酶家族。HDAC可以是人类HDAC，包括HDAC1、 HDAC2、HDAC3、HDAC4、HDAC5、HDAC6、HDAC7、HDAC8、HDAC9、 HDAC10和HDAC11。HDAC也可以来源于原生动物或真菌来源。
HDAC抑制剂(HDACI)通常包含三种类似于乙酰赖氨酸结构的结构元素。这三种结构元素是锌结合基团(M)，其负责螯合活性位点中的锌，连接基区域(L)，其结合连接活性位点和外部酶表面的疏水通道，以及封端基团(Cap)，其与外部酶表面的残基相互作用。
HDAC抑制剂的实例包括：SAHA、罗咪酯肽(Romidepsin)、丙戊酸、 PCI-24781、ITF-2357、MS275、Panbinoastat、贝林司它他(Belinostat)、伏立诺他(Vorinotat)、MGCD0103和EVP-0334。
本发明已经令人惊讶地发现，HDAC抑制剂诸如罗咪酯肽和伏立诺他可以与本发明的膳食产品或药物组合物协同作用。
合适地，本发明的膳食产品或药物组合物可以与HDAC抑制剂组合使用用于HDAC抑制剂已经在治疗中有用的任何适应症。至少在以下中， HDAC抑制剂已经被批准或正在进行临床试验：例如T细胞淋巴瘤、多发性骨髓瘤、肾癌、霍奇金淋巴瘤、滤泡性淋巴瘤、白血病、急性髓细胞白血病、黑色素瘤、非小细胞肺癌、实体肿瘤、前列腺癌、弥漫性大B细胞淋巴瘤和间皮瘤。优选地，HDAC抑制剂是罗咪酯肽和/或伏立诺他。
mTOR抑制剂
合适地，化学治疗剂可以是雷帕霉素(mTOR)抑制剂的一种或更多种哺乳动物靶。如本文所用，短语“mTOR抑制剂”包括但不限于靶向/抑制mTOR 激酶家族成员活性的化合物、蛋白质或抗体。mTOR活性抑制剂例如包括下式的雷帕霉素：
和雷帕霉素衍生物，例如包括
40-O-取代的雷帕霉素衍生物，诸如
40-O-烷基-雷帕霉素衍生物，诸如40-O-羟烷基-雷帕霉素衍生物，诸如40-O-(2-羟基)-乙基-雷帕霉素(依维莫司)，
32-脱氧雷帕霉素衍生物和32-羟基雷帕霉素衍生物，诸如32-脱氧雷帕霉素，
16-O-取代的雷帕霉素衍生物，诸如16-戊-2-炔氧基-32-脱氧雷帕霉素、 16-戊-2-炔氧基-32(S或R)-二氢-雷帕霉素、16-戊-2-炔氧基-32(S或R)-二氢 -40-O-(2-羟乙基)-雷帕霉素，
在40位氧基团酰化的雷帕霉素衍生物，例如40-[3-羟基-2-(羟基-甲基)-2-甲基丙酸酯]-雷帕霉素(也称为CCI779)，在40位被杂环基取代的雷帕霉素衍生物，例如40-表-(四唑基)-雷帕霉素(也称为ABT578)，
所谓的雷帕类似物(rapalog)，例如在WO9802441或WO0114387中公开的，例如诸如含40-O-磷酸的雷帕霉素衍生物，例如40-O-二甲基膦基- 雷帕霉素，包括AP23573，以及
40-O-烷氧基-烷基-雷帕霉素衍生物，诸如以名称biolimus(biolimus A9) 公开的化合物，包括40-O-(2-乙氧基)-乙基-雷帕霉素(依维莫司)，以及以名称TAFA-93、AP23464、AP23675或AP23841公开的化合物。
本发明已经令人惊讶地发现，mTOR抑制剂诸如替西罗莫司和依维莫司可以与本发明的膳食产品或药物组合物协同作用。
合适地，本发明的膳食产品或药物组合物可以与mTOR抑制剂联合使用，用于mTOR抑制剂已经在治疗中有用的任何适应症。至少在以下中， mTOR抑制剂已经获得批准或者正在进行临床试验：例如淋巴白血病、结肠癌和乳腺癌(mammary cancer)、黑色素瘤和室管膜母细胞瘤(ependymoblastoma)、美国皮肤癌、中枢神经系统肿瘤；肾细胞癌、套细胞淋巴瘤(Mantle cell lymphoma)、乳腺和胰腺神经内分泌。优选地，mTOR 抑制剂是替西罗莫司和/或依维莫司。
酪氨酸激酶抑制剂
合适地，化学治疗剂可以是一种或更多种酪氨酸激酶抑制剂。
酪氨酸激酶在细胞信号转导中起作用。细胞增殖、分化、迁移、代谢和程序性死亡是酪氨酸激酶介导的细胞应答的实例。已知各种酪氨酸激酶抑制剂在癌症治疗中具有效用，并且在一个实施方案中，可以使用任何已知的酪氨酸激酶抑制剂。这样的抑制剂包括可商购的抑制剂和正在开发的抑制剂。
涵盖小分子抑制剂，诸如姜黄素、二氟化姜黄素(DFC)、[3-{5-[4-(环戊氧基)-2-羟基苯甲酰基]-2-[(3-羟基-1,2-苯并异噁唑-6-基)甲氧基]苯基}丙酸](T5224，Roche)、去甲二氢愈创木酸(NDGA)、二氢愈创木酸(DHGA)、 [(E,E,Z,E)-3-甲基-7-(4-甲基苯基)-9-(2,6,6-三甲基-1-环己烯-1-基)-2,4,6,8-九碳四巴豆酸(SR1 1302，TocrisBiosciences)、(EJ-2-苄叉-3-(环己氨基)-2,3- 二氢-1H-茚-1-酮(BCI)、TPI-2、TPI-3、雷公藤内酯、拉帕替尼、依利替尼、舒尼替尼和威罗菲尼(PLX4032)。在一个实施方案中，组合物中使用的c-Fos 抑制剂是姜黄素、二氟化姜黄素(DFC)、[3-{5-[4-(环戊氧基)-2-羟基苯甲酰基]-2-[(3-羟基-1,2-苯并异噁唑-6-基)甲氧基苯基}丙酸](T5224，Roche)、去二氢愈创木酸(NDGA)、二氢愈创木酸(DHGA)和[(E,E,Z,E)-3-甲基-7-(4-甲基苯基)-9-(2,6,6-三甲基-1-环己烯-1-基)-2,4,6,8-九碳四巴豆酸(SR1 1302, Tocris Biosciences)。在一个实施方案中，Dusp-1的抑制剂是(EJ-2-苄叉-3-(环己氨基)-2,3-二氢-1H-茚-1-酮(BCI)，也称为NSC 1501 17、TPI-2、TPI-3和雷公藤内酯(triptolide)。在一个实施方案中，酪氨酸激酶的抑制剂是拉帕替尼、依来替尼、舒尼替尼和威罗菲尼。
根据本发明可用作化学治疗剂的酪氨酸激酶抑制剂的另外实例包括：阿法菲尼(Giotrif)、阿西替尼(Inlyta)、博舒替尼(Bosulif)、克唑替尼(Xalkori)、达沙替尼(Sprycel)、埃罗替尼(Tarceva)、吉非替尼(Iressa)、伊马替尼(Glivec)、拉帕替尼(Tyverb)、尼洛替尼(Tasigna)、帕唑潘尼(Votrient)、瑞戈非尼 (Stivarga)、索拉非尼(Nexavar)和舒尼替尼(Sutent)。
本发明已经令人惊讶地发现，酪氨酸激酶抑制剂诸如达沙替尼和瑞戈非尼可以与本发明的膳食产品或药物组合物协同作用。
合适地，本发明的膳食产品或药物组合物可以与酪氨酸激酶抑制剂组合使用，用于酪氨酸激酶抑制剂在治疗中有用的任何适应症。在至少以下中，酪氨酸激酶抑制剂已经被批准或正在进行临床试验：例如非小细胞肺癌、肾癌、软组织肉瘤、甲状腺癌、慢性髓细胞白血病(CML)、肺癌、急性髓细胞白血病、急性成淋巴细胞白血病、胃肠道间质瘤(GIST)、肉瘤、慢性嗜酸性粒细胞白血病、肠癌、肝癌和胰腺癌。优选地，酪氨酸激酶抑制剂是达沙替尼和/或瑞戈非尼。
合适地，当使用达沙替尼和/或瑞戈非尼时要治疗的癌症是结肠直肠癌、慢性髓细胞白血病(CML)、急性髓细胞白血病、急性成淋巴细胞白血病、肠癌或GIST。
蛋白酶体抑制剂
合适地，化学治疗剂可以是一种或更多种蛋白酶体抑制剂。
蛋白酶体抑制剂是指泛素蛋白酶体系统(UPS)的抑制剂。UPS是非溶酶体蛋白降解通路。泛素与蛋白质表面的结合是一个多步骤过程，其中泛素被E1结合酶激活，并由泛素结合酶(E2)和E3泛素连接酶介导转移。这样的抑制剂可以包括可商购的抑制剂和正在开发的抑制剂。
实例包括：硼替佐米(Velcade)及其类似物(诸如硼酸衍生物、基于苄基丙二酸和氨基酸的衍生物和硼酸酯)、盐硝酰胺A(salinosporamide A)(NPI-0052)、PR-171、E1结合酶抑制剂、POSH抑制剂、MDM2-p53抑制剂和去泛素化酶抑制剂。
本发明已经令人惊讶地发现，蛋白酶体抑制剂诸如卡非佐米可以与本发明的膳食产品或药物组合物协同作用。
合适地，本发明的膳食产品或药物组合物可以与蛋白酶体抑制剂组合使用，用于蛋白酶体抑制剂在治疗中有用的任何适应症。
可用公开的蛋白酶体抑制剂治疗的实体肿瘤的非限制性实例包括胰腺癌；膀胱癌；结肠直肠癌；乳腺癌，包括转移性乳腺癌；前列腺癌，包括雄激素依赖性和雄激素非依赖性前列腺癌；肾癌，包括例如转移性肾细胞癌；肝细胞癌；肺癌，包括例如非小细胞肺癌(NSCLC)、支气管肺泡癌 (BAC)和肺腺癌；卵巢癌，包括例如进行性上皮癌或原发性腹膜癌；宫颈癌；胃癌；食管癌；头和颈癌症，包括例如头颈部鳞状细胞癌；黑色素瘤；神经内分泌癌，包括转移性神经内分泌肿瘤；脑肿瘤，包括例如胶质瘤、间变性少突胶质细胞瘤、成人多形性胶质母细胞瘤和成人间变性星形细胞瘤；骨癌；和软组织肉瘤。
可用公开的蛋白酶体抑制剂治疗的血液恶性肿瘤的非限制性实例包括急性髓细胞白血病(AML)；慢性骨髓性白血病(CML)，包括加速的CMIL 和CML急变期(CMIL-BP)；急性成淋巴细胞白血病(ALL)；慢性淋巴细胞白血病(CLL)；霍奇金病(HD)；非霍奇金淋巴瘤(NHL)，包括滤泡性淋巴瘤和套细胞淋巴瘤；B细胞淋巴瘤；T-细胞淋巴瘤；多发性骨髓瘤(MM)；沃尔登斯特罗姆巨球蛋白血症(Waldenstrom's macroglobulinemia)；骨髓增生异常综合征(MDS)，包括难治性贫血(RA)、伴环形铁粒幼细胞的难治性贫血(RARS)(有过量成纤维细胞的难治性贫血(RAEB)和转化中的 RAEB(RAEB-T)；和骨髓增生综合征。
优选地，蛋白酶体抑制剂是卡非佐米。
合适地，将使用卡非佐米治疗的癌症是多发性骨髓瘤或T细胞淋巴瘤。
EGFR抑制剂
合适地，化学治疗剂可以是一种或更多种表皮生长因子受体(EGFR) 抑制剂。EGFR(也称为ErbB-1或HER-1)抑制剂是指细胞外蛋白配体EGF 家族成员的细胞表面受体抑制剂。EGFR在控制正常细胞生长、凋亡和其他细胞功能方面发挥重要作用。EGFR的突变会导致受体的连续的或异常的激活，从而导致不受调控的细胞分裂，其可以解释某些类型的癌症。
在一方面，术语“EGFR”是指HER2/c-neu(ErbB-2)、HER 3(ErbB-3)和 HER 4(ErbB-4)以及EGFR(ErbB-1)。
本发明已经令人惊讶地发现，EGFR抑制剂比如西妥昔单抗可以与本发明的膳食产品或药物组合物协同作用。
合适地，本发明的膳食产品或药物组合物可以与EGFR抑制剂组合使用，用于EGFR抑制剂在治疗中有用的任何适应症。可用所公开的EGFR 抑制剂治疗的实体肿瘤的非限制性实例包括非小细胞肺癌、胰腺癌、乳腺癌、结肠癌和由表皮生长因子受体上调引起的一些其他癌症。
EGFR抑制剂的实例包括：西妥昔单抗、吉非替尼、依利替尼、拉帕替尼、帕尼单抗、凡德他尼、耐昔妥珠单抗(necitumumab)和奥希替尼 (osimertinib)。
优选地，蛋白酶体抑制剂是西妥昔单抗。
其他感兴趣的化学治疗剂.
在一方面，本发明的膳食产品或药物组合物可以与一种或更多种化学治疗剂组合，所述化学治疗剂选自由以下组成的组：柠檬酸他莫昔芬、二甲双胍、盐酸厄洛替尼、达沙替尼、雌莫司汀磷酸钠、盐酸柔红霉素、伏立诺他、卡博替尼、艾德拉尼(idelalisib)、酒石酸长春瑞滨、西罗莫司、羟基脲、盐酸埃尔法仑、戊柔比星、依维莫司、阿米福汀、视黄酸、磷酸氟达拉滨、达卡巴嗪、威罗菲尼、色瑞替尼、三氧化二砷、替莫唑胺、右雷佐生、瑞戈非尼、索拉非尼、依西美坦、罗咪酯肽、博舒替尼、卡培他滨、来那度胺、别嘌醇(allopurinol)、链佐星、六甲蜜胺、顺铂、盐酸多柔比星、尼罗替尼、咪喹莫特、卡非佐米、范德他尼、维莫德吉、氟尿嘧啶、奥拉帕尼、米托坦、阿那曲唑、盐酸表柔比星、雷洛昔芬、拉帕替尼、盐酸帕唑帕尼、氟维司群、乌拉莫司汀、阿法替尼、异环磷酰胺(ifosfamide)、依托泊苷、三乙撑蜜胺、帕纳替尼及其类似物。
有利地，本发明已经表明，当与丝氨酸和甘氨酸有限的饮食组合时，这些化学治疗剂具有超过加和性的作用(即协同作用)。
因此，在一方面，本发明提供了本发明的膳食产品或药物组合物与一种或更多种用于在癌症治疗中使用的化学治疗剂的协同组合。可以使用导致协同组合的任何剂量的化学治疗剂。
合适地，化学治疗剂可以是柔红霉素。本发明的膳食产品或药物组合物与柔红霉素的组合可用于例如急性髓细胞白血病、急性淋巴细胞白血病、慢性髓细胞白血病和卡波西肉瘤的治疗。
在一方面，每种化学治疗剂的剂量(或化学治疗剂的总组合剂量)可以相当于每天至少0.1g/Kg患者体重，优选地每天至少0.2g/Kg或每天0.3g/Kg 或每天0.4g/Kg或每天0.5g/Kg。合适地，化学治疗剂(或化学治疗剂的组合)的剂量可以相当于每天至少1g/Kg，优选地每天2g/Kg。
例如，对于二甲双胍，当受试者是人时，剂量可以相当于每天至少1g，优选每天2g，或者对于非人的等价剂量。
此外，在另一方面，本发明提供了一种治疗受试者中的癌症的方法，包括施用协同有效的组合：a)本发明的膳食产品以及b)化学治疗剂。合适地，协同组合的组分可以同时地或顺序地施用。
合适地，根据本发明的所有方面，化学治疗剂可以：a)抑制OXPHOS； b)增加活性氧物质(ROS)；c)降低抗氧化剂防御，或d)提供a)-c)的任何组合。
合适地，化学治疗剂可以抑制OXPHOS。例如，化学治疗剂可以是双胍类。不希望受理论束缚，认为本发明的膳食产品或药物组合物(特别是基本上缺乏至少丝氨酸的膳食产品或药物组合物)将改善双胍类的抗肿瘤效果。
合适地，化学治疗剂可以增加ROS水平。不希望受理论束缚，认为本发明的膳食产品或药物组合物(特别是基本上缺乏至少丝氨酸的膳食产品或药物组合物)当与增加ROS水平的化合物组合使用时将具有增强的效果。癌细胞利用大量的外源丝氨酸支持快速增殖，以应对升高的ROS水平。不希望受到理论的束缚，认为当外源丝氨酸耗尽时，癌细胞被迫通过丝氨酸合成通路输送糖酵解中间体，并且代谢重塑可导致减少的增殖和细胞存活。
KRAS
发明人已经惊奇地鉴定，癌性细胞/组织中Kras表达或活性水平指示患者对包括基本上缺乏丝氨酸(和/或甘氨酸)的饮食的癌症治疗的响应性或敏感性的可能性。Kras表达或活性的水平可用于鉴定受试者中将应答包括基本上缺乏丝氨酸的饮食的癌症治疗的癌细胞，例如肿瘤。生物标志物还可用于鉴定对包括基本上缺乏丝氨酸的饮食的癌症治疗具有响应性或敏感性的增加的可能性或降低的可能性的受试者。生物标志物也可用于帮助用于患者癌症的治疗的选择。在这方面，本发明提供生物标志物及其用途，包括包含生物标志物用途的方法和试剂盒。
在一方面，本发明提供了KRAS作为生物标志物以鉴定对包括基本上缺乏丝氨酸的饮食的癌症治疗应答或敏感的患者群体的用途。术语“生物标志物”或“标志物”是指一种有机生物分子，其在取自受试者的样品中与另一种表型状态相比较在一个表型状态中差异存在。如果不同组中生物标志物的平均或中值表达水平的差异被计算为统计学上显著，则生物标志物在不同表型状态之间差异存在。生物标志物单独或组合提供了受试者属于一种或另一种表型状态的相对风险的量度。对于本发明目的而言，生物标志物是用于预测对包括基本上缺乏丝氨酸的饮食的癌症治疗的响应性或敏感性的可能性的标志物。在一些实施方案中，生物标志物是本文公开的基因 (例如核酸)。在一些其他实施方案中，生物标志物是基因的产物(例如蛋白质)。
如本文所用，术语“KRAS”是指从Kirsten大鼠肉瘤病毒中分离的转化基因的人类细胞同源物。KRAS基因属于一类称为致癌基因的基因。当突变后，致癌基因具有将正常细胞癌变的潜力。KRAS基因属于Ras致癌基因家族，Ras致癌基因家族还包括另外两个基因：HRAS和NRAS。从这三个基因产生的蛋白质是GTP酶。这些蛋白质在细胞分裂、细胞分化和细胞自我毁灭(凋亡)中发挥重要作用。
KRAS属于RAS蛋白家族，具有约21kDa的分子量以及GTP水解活性。KRAS存在于细胞膜内部，并且具有响应于作为细胞外生长因子(诸如表皮生长因子(EGF))与受体的结合，将信号传递到细胞中的作用。
活化突变可以在KRAS中发现，并且在大约20％的人类癌症中发现。
如本文所用，术语“KRAS”用于指多肽和核酸分子二者。
优选地，KRAS是人KRAS多肽或核酸分子。
如本文所用，术语“核酸分子”包括DNA分子(例如，cDNA或基因组 DNA)和RNA分子(例如，mRNA)及例如，通过使用核苷酸类似物生成的 DNA或RNA的类似物。核酸分子可以是单链或双链的，但优选地是双链 DNA。
人KRAS的核酸序列信息可以在Ensembl登录号ENSG00000133703 下找到。在一个具体实施方案中，本发明的KRAS基因包含KRAS核酸(例如，Ensembl登录号ENSG0000133703)或其连续片段，或与Ensembl登录号ENSG0000133703的核酸序列或其连续片段至少60％、65％、70％、75％、 80％、85％、90％、95％、98％或至少99％相同的序列。
如本文所用，术语“野生型”KRAS指的是，与在Ensembl登录号 ENSG0000133703下发现的KRAS核酸或多肽相比，不包含突变，例如没有突变的KRAS多肽或核酸。除了本文提供的人KRAS的序列之外，哺乳动物或非哺乳动物物种KRAS的核酸序列可以由本领域技术人员使用本领域已知的方法来鉴定，例如通过核酸测序或使用杂交测定，或者通过使用手动地，或通过使用计算机程序比对，例如下面结合术语“杂交”的定义和同源性程度提到的那些程序。
用于表征已知核酸序列/启动子的直系同源物的杂交测定在本领域是熟知的；参见例如Sambrook,Russell"Molecular Cloning,A Laboratory Manual",Cold SpringHarbor Laboratory,N.Y.(2001):Ausubel,"Current Protocols in MolecularBiology",Green Publishing Associates and Wiley Interscience,N.Y.(1989)。如本文所用，术语“杂交”("hybridization”)或“杂交”("hybridizes”)可以涉及在严格或非严格条件下的杂交。如果没有进一步说明，条件优选地是非严格的。所述杂交条件可以根据例如在Sambrook (2001)loc.cit.；Ausubel(1989)loc.Cit.,或Higgins和Hames(Eds.) "Nucleic acid hybridization,a practical approach"IRL Press Oxford, WashingtonD.C.,(1985)中描述的常规方案建立。条件的设定完全在技术人员的技能范围内，并且可以根据本领域描述的方案确定。因此，仅特异地杂交序列的检测将通常需要严格的杂交和洗涤条件，诸如，例如在65℃ 0.1×SSC、0.1％SDS或2×SSC、60℃、0.1％SDS的高度严格杂交条件。用于检测同源或不完全互补序列的低严格杂交条件可以例如设定在在65℃ 6×SSC、1％SDS。众所周知，探针的长度和待确定核酸的组成构成杂交条件的另外参数。
如本文所用，术语“同源性”和“同一性”可互换地使用。序列之间的序列同源性或同一性的计算如下进行。
为了确定两个氨基酸序列或两个核酸序列的同一性百分数，序列出于最佳比较目的来比对(例如，为最佳比对空位可以被引入第一和第二氨基酸或核酸序列中的一个或两个，并且出于比较目的非同源序列可以被忽略)。在优选的实施方案中，出于比较目的而比对的参考序列的长度为参考序列的长度的至少30％、优选地至少40％、更优选地至少50％、甚至更优选地至少60％、以及甚至更优选地至少70％、75％、80％、82％、84％、85％、 86％、87％、88％、89％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、 98％、99％或100％。然后将在对应的氨基酸位置或核苷酸位置上的氨基酸残基或核苷酸进行比较。当在第一序列中的位置被与在第二序列中相应位置处的相同的氨基酸残基或核苷酸占据时，则分子在该位置处相同(如本文所用，氨基酸或核酸“同一性”等同于氨基酸或核酸“同源性”)。两个序列之间的同一性百分比为考虑到两个序列的最佳对齐所需要被引入的空位的数目和每一个空位的长度的情况下序列所共享的相同位置的数目的函数。
序列的比较和两个序列之间的同一性百分比的确定可以使用数学算法来完成。在优选的实施方案中，两个氨基酸序列之间的同一性百分比如下来确定：使用已被并入GCG软件包(在http://www.gcg.com可得)中的 GAP程序的Needleman等人，(1970)J.Mol.Biol.48:444-453)算法，使用 BLOSUM 62矩阵或PAM250矩阵以及16、14、12、10、8、6或4的空位权重和1、2、3、4、5或6的长度权重。在又另一个优选实施方案中，两个核苷酸序列之间的同一性百分比如下来确定：使用GCG软件包(在 http://www.gcg.com可得)中的GAP程序，使用NWSgapdna.CMP矩阵以及 40、50、60、70或80的空位权重和1、2、3、4、5或6的长度权重。特别优选的参数集(并且如果从业者不确定应该应用什么参数来确定一个分子是否在本发明的序列同一性或同源性限制范围内时，则应该使用的参数集)是BLOSUM 62评分矩阵，其空位罚分为12，空位延伸罚分为4，移码空位罚分为5。
可选择地，两个氨基酸序列或核苷酸序列之间的同一性百分比可以如下来确定：使用已经并入ALIGN程序(2.0版)的Meyers等人(1989,CABIOS, 4:11-17)的算法，使用PAM120权重残余表、12的空位长度罚分和4的空位罚分。
如本文所用，术语“连续片段”是指核酸或氨基酸的非中断序列，也以相同顺序在所提及的序列中出现。特别设想的是具有参考序列长度的至少 25％、50％、70％、75％、80％或90％的连续片段，以及通常具有至少25 个核酸或至少8个氨基酸的连续片段。
在一个实施方案中，核酸片段包括对应于KRAS的结构域、区域或功能位点的序列或由对应于KRAS的结构域、区域或功能位点的序列组成。可选择地，KRAS的核酸片段编码KRAS多肽的表位携带区域。
在另一个实施方案中，KRAS可以选自但不限于以下组成的组：人类 KRAS(NP_004976.2、NP_203524.1等)、小鼠KRAS(NP_067259.4等)、斑马鱼KRAS(NP_001003744.1等)、青蛙KRAS(NP_001095209.1)、牛 KRAS(NP_001 103471.1)、鸡KRAS(NP_001243091.1)、猴KRAS(NP_001248441.1)、NP_001028153.1、NP_113703.1和 NP_001008034.1或其变体或突变体。人KRAS的多肽序列信息可以在 Ensembl登录号ENSG00000133703下找到。在一个具体实施方案中，本发明的KRAS多肽包含KRAS(例如，Ensembl登录号ENSG0000133703)或其连续片段，或与Ensembl登录号ENSG0000133703的多肽序列或其连续片段至少60％、65％、70％、75％、80％、85％、90％、95％、98％或至少99％相同的序列。
KRAS多肽可以是Ensembl登录号为ENSG0000133703的KRAS多肽序列的等位变体。KRAS多肽可以是Ensembl登录号为ENSG0000133703 的KRAS多肽序列的KRAS多肽的表位携带区域。KRAS多肽可以是 Ensembl登录号为ENSG0000133703的KRAS多肽序列的片段，例如生物活性片段。
如本文所用，KRAS多肽的“生物活性片段”包括含有与KRAS多肽例如Ensembl登录号为ENSG0000133703的多肽序列的氨基酸序列足够同源或衍生自该氨基酸序列的氨基酸序列的肽，其包含比全长KRAS多肽更少的氨基酸，并显示出KRAS多肽的至少一种活性。例如，KRAS多肽的生物活性片段可以是包含或由Ensembl登录号为ENSG0000133703的KRAS 多肽序列的KRAS多肽的10个、25个、50个、100个、200个或更多个连续氨基酸组成的多肽。
在确定KRAS活性的上下文中，本文使用的术语“活性”包括例如在蛋白质水平确定酶活性和/或确定表达水平(例如mRNA或蛋白质)。用于确定如本文定义的活性的方法在本领域中是熟知的，并且在下文中也有描述。
在一个实施方案中，KRAS是突变体KRAS，例如活化KRAS突变体。本文使用的术语“活化突变”是指基因中的突变，特别是KRAS基因中的突变，与野生型相比，其导致相应的基因产物，即蛋白质，特别是KRAS蛋白质增加的活性。用于测量蛋白质特别是KRAS蛋白质(增加的)活性的方法，是本领域已知的，并且在下文中也有描述。KRAS基因中的突变可以通过本领域已知的方法检测。例如在(Papadopoulos等人，2006；Shendure 等人，2004)中描述了这样的方法。
本发明提供了鉴定对包括基本上缺乏丝氨酸的饮食的癌症治疗具有降低可能性的响应性或敏感性的受试者的方法，所述方法包括：
a)确定从受试者分离的生物样品中Kras表达或活性的水平；
b)将生物样品中Kras的表达或活性水平与对照样品或Kras的表达或活性的预定参考水平进行比较，其中与对照样品或与预定参考水平相比，生物样品中Kras的表达或活性增加的水平指示对所述癌症治疗的不响应性或不敏感性。
本发明还提供了鉴定对包括基本上缺乏丝氨酸的饮食的癌症治疗具有增加可能性的响应性或敏感性的受试者的方法，所述方法包括：
a)确定从受试者分离的生物样品中Kras表达或活性的水平；
b)将生物样品中Kras的表达或活性水平与对照样品或Kras的表达或活性的预定参考水平进行比较，其中与对照样品相比或与预定参考水平相比生物样品中Kras的表达或活性降低的水平，或与对照样品或预定参考水平基本上相同的Kras的表达或活性水平，指示对所述癌症治疗的响应性或敏感性。
本发明还提供了鉴定可以受益于包含基本上缺乏丝氨酸的饮食的癌症治疗的受试者的方法，所述方法包括：
a)确定从受试者分离的生物样品中Kras表达或活性的水平；
b)将生物样品中Kras的表达或活性水平与对照样品或Kras的表达或活性的预定参考水平进行比较，其中与对照样品相比或与预定参考水平相比生物样品中Kras的表达或活性降低的水平，或与对照样品或预定参考水平基本上相同的Kras的表达或活性水平，指示患者可以受益于所述癌症治疗。
MTAP
发明人已经惊奇地鉴定，癌性细胞/组织中甲硫腺苷磷酸化酶(MTAP) 表达或活性水平指示患者对癌症治疗的响应性或敏感性的可能性，所述癌症治疗包括基本上缺乏i)半胱氨酸和/或ii)丝氨酸的饮食。MTAP表达或活性的水平可用于鉴定受试者中将应答癌症治疗的癌细胞，例如肿瘤，所述癌症治疗包括基本上缺乏半胱氨酸和/或丝氨酸的饮食。生物标志物也可用于帮助用于患者癌症的治疗的选择。在这方面，本发明提供生物标志物及其用途，包括包含生物标志物用途的方法和试剂盒。
在另一方面，本发明提供了MTAP作为生物标志物以鉴定对癌症治疗应答或敏感的患者群体的用途，所述癌症治疗包括基本上缺乏半胱氨酸和 /或丝氨酸的饮食。
本发明还提供了鉴定可以受益于癌症治疗的受试者的方法，所述癌症治疗包含基本上缺乏半胱氨酸的饮食，所述方法包括：
a)确定从受试者分离的生物样品中MTAP的表达或活性水平；
b)将生物样品中MTAP的表达或活性水平与对照样品或MTAP的表达或活性的预定参考水平进行比较，其中与对照样品相比或与预定参考水平相比生物样品中MTAP的表达或活性降低的水平，或与对照样品或预定参考水平基本上相同的MTAP的表达或活性水平，指示患者可以受益于所述癌症治疗。
如本文所用，术语“MTAP”是指S-甲基-5’硫代腺苷磷酸化酶，其催化 S-甲基-5’-硫代腺苷(MTA)可逆地磷酸化成腺嘌呤和5-甲基硫代核糖-1-磷酸。这种酶在多胺代谢中起着重要作用，并且对腺苷和甲硫氨酸两者的回收非常重要。众所周知，MTAP在许多癌症中是不足的，这通常是由MTAP 基因和肿瘤抑制基因p16的共同缺失引起的。
如本文所用，术语“MTAP”用于指多肽和核酸分子二者。
优选地，MTAP是人MTAP多肽或核酸分子。
人MTAP基因的核酸序列信息可以在EnsembI登录号 ENSG00000099810下找到。在一个具体实施方案中，本发明的MTAP基因包含MTAP核酸(例如，Ensembl登录号ENSG00000099810)或其连续片段，或与Ensembl登录号ENSG00000099810的核酸序列或其连续片段至少60％、65％、70％、75％、80％、85％、90％、95％、98％或至少99％相同的序列。
除了本文提供的人类MTAP的序列之外，哺乳动物或非哺乳动物物种 MTAP的核酸序列可以由本领域技术人员使用本领域已知的方法来鉴定，例如通过核酸测序或使用杂交测定，或者通过使用手动地，或通过使用计算机程序比对，例如下面结合术语“杂交”的定义和同源性程度提到的那些程序。
在一个实施方案中，核酸片段包括对应于MTAP的结构域、区域或功能位点的序列或由对应于MTAP的结构域、区域或功能位点的序列组成。可选择地，MTAP的核酸片段编码MTAP多肽的表位携带区域。
在作为选择的实施方案中，MTAP可以是编码人MTAP多肽的核苷酸序列或其变体或突变。
人MTAP的多肽序列信息可以在UniProtKB-Q13126下找到。在一个具体实施方案中，本发明的MTAP多肽包含人MTAP或其连续片段，或与 UniProtKB-Q13126(例如Q13126-1)的多肽序列或其连续片段至少60％、 65％、70％、75％、80％、85％、90％、95％、98％或至少99％相同的序列。
MTAP多肽可以是UniProtKB-Q13126的MTAP多肽序列的等位变体。 MTAP多肽可以是UniProtKB-Q13126的MTAP多肽序列的表位携带区域。 MTAP多肽可以是UniProtKB-Q13126的MTAP多肽序列的片段，例如生物活性片段。
如本文所用，MTAP多肽的“生物活性片段”包括包含与MTAP多肽例如UniProtKB-Q131263的多肽序列的氨基酸序列足够同源或衍生自该氨基酸序列的氨基酸序列的肽，其包含比全长MTAP多肽更少的氨基酸，并显示出MTAP多肽的至少一种活性。例如，MTAP多肽的生物活性片段可以是包含或由UniProtKB登录号Q13126(例如Q13126-1)的MTAP多肽序列的MTAP多肽的10个、25个、50个、100个、200个或更多个连续氨基酸组成的多肽。
在确定MTAP活性的上下文中，本文使用的术语“活性”包括例如在蛋白质水平确定酶活性和/或确定表达水平(例如mRNA或蛋白质)。用于确定如本文定义的活性的方法在本领域中是熟知的，并且在下文中也有描述。
如本文所用，如果治疗在治疗之后或紧随着治疗(after or following thetreatment)减缓癌症或肿瘤生长、阻止癌症或肿瘤生长或减少癌症或肿瘤的一种或更多种症状，例如肿瘤负荷，则受试者对包含基本上缺乏丝氨酸的饮食的癌症治疗是“响应性的”或“敏感性的”。因此，在优选的实施方案中，如果治疗期间或治疗之后治疗减少肿瘤负荷，则受试者是响应性的。在一些实施方案中，如果肿瘤或癌症进入缓解或根除，则受试者对治疗是响应性的。
如本文所用，如果治疗在治疗之后或紧随着治疗不减缓癌症或肿瘤生长、不阻止癌症或肿瘤生长或不减少癌症或肿瘤的一种或更多种症状，例如肿瘤负荷，则受试者对包含基本上缺乏丝氨酸的饮食的癌症治疗是“无响应性的”或“不敏感性的”。
因此，在优选的实施方案中，如果治疗期间或治疗之后肿瘤负荷增加，则受试者是无响应性的。在一些实施方案中，如果在治疗期间或治疗之后肿瘤或癌症扩展、扩散或转移，或者如果癌症的一种或更多种症状恶化，则受试者对治疗是无响应性的。
本发明公开的方法通常包括检测从受试者获得的生物样品中KRAS或 MTAP的表达水平。如本文所用，术语“生物样品”和“从受试者分离的样品”可互换使用，指从受试者分离的组织、细胞和生物流体，以及存在于受试者体内的组织、细胞和流体。
在优选实施方案中，受试者是患有癌症的受试者，并且更优选地，样品是癌细胞或癌症组织的样品。生物样品可以包括单个癌细胞，或者优选地包括多个癌细胞。
在一些实施方案中，生物样品包括从肿瘤获得的癌细胞。在一些实施方案中，生物样品包括不是从肿瘤获得的癌细胞。例如，在一些实施方案中，癌细胞是循环中的癌细胞。生物样品可以包括不是癌细胞的其他组分或细胞。例如，样品可以包括非癌性细胞、组织等。在优选实施方案中，生物样品包括与正常组织隔离(isolated)或分离(separated)的癌细胞。在一些实施方案中，生物样品从癌性组织或器官获得。
可以使用本领域已知的各种方法从受试者获得生物样品。在一些实施方案中，样品为组织活检例如穿刺(punch)活检。样品应根据将要采用的检测方法进行处理。在一些实施方案中，组织或细胞来源的生物样品可以溶解在溶解缓冲液中，所述溶解缓冲液任选含有离液剂、洗涤剂、还原剂、缓冲剂和盐中的一种或更多种。针对mRNA水平分析的生物样品的处理条件可以不同于针对蛋白质水平分析的生物样品的处理条件，并且这些条件是本领域已知的。如果样品是包括凝血因子的血液样品(例如全血样品)，则制剂可以包括抗凝血剂。
样品可以在分析前浓缩，或者用合适的稀释剂稀释。样品可以是冷冻的、新鲜的、固定的(例如福尔马林固定)、离心的和/或包埋的(例如石蜡包埋)等。在评估样品中标志物的量之前，可以对细胞样品进行各种众所周知的收集后制备和储存技术(例如，核酸和/或蛋白质提取、固定、储存、冷冻、超滤、浓缩、蒸发、离心等)。同样，活检也可以接受收集后制备和储存技术，例如固定。
可用本发明的方法分析和治疗的癌症类型包括但不限于以下：结肠直肠癌、肝癌、骨肉瘤、淋巴瘤和乳腺癌。
在本发明的上下文中，KRAS/MTAP的表达是指通过任何合适的方法测量的KRAS/MTAP基因或蛋白质的基因或蛋白质表达水平。
通常，特定基因的表达水平可以通过测量细胞或组织中从 KRAS/MTAP基因转录的mRNA水平反映在转录水平，或者通过测量细胞或组织中的蛋白质水平反映在翻译水平。方法可以是基于细胞的或无细胞的测定。
提供了根据本发明检测样品中KRAS或MTAP表达水平的方法。 KRAS或MTAP的表达水平可以通过测量样品中KRAS或MTAP的mRNA 或蛋白质水平来确定。用于测量样品中mRNA的方法包括，例如，定量聚合酶链式反应(qPCR)、逆转录PCR(RT-PCR)、逆转录实时PCR(RT-qPCR)、使用下一代测序的转录组分析、阵列杂交分析、数字PCR、RNA分析、斑点印记(dot-blot)、原位杂交和RNA酶保护测定。
定量实时PCR特别适用于确定细胞或组织样品中的特定mRNA水平，在这种情况下，mRNA首先被逆转录成cDNA，然后利用基因特异性寡核苷酸PCR引物通过PCR扩增。这种qRT-PCR方法在本领域是熟知的。下一代测序或微阵列也可以用于检测mRNA水平。此外，原位杂交也可以用于原位检测在细胞或组织样品中，例如FFPE组织样品中KRAS的mRNA 水平。
在一些实施方案中，可以使用PCR(例如，qPCR、RT-PCR、RT-qPCR 等)来确定KRAS和/或MTAP的表达。这样的PCR测定是本领域熟知的。例如，在一些实施方案中，用于检测生物样品中来自KRAS/MTAP的mRNA 的方法包括使用至少一种引物通过逆转录从样品产生cDNA；扩增这样产生的cDNA；以及检测扩增的cDNA的存在。此外，这样的方法可以包括一个或更多个步骤，这些步骤允许人们确定生物样品中mRNA的水平(例如，通过同时检查“持家”基因诸如肌动蛋白家族成员的比较性对照mRNA 序列的水平)。任选地，可以确定扩增的cDNA的序列。RNA印迹分析是本领域熟知的常规技术，并例如，在Sambrook等人，MolecularCloning,a Laboratory Manual,third edition,Cold Spring Harbor Press,NY(2000)11803-2500中描述。
在一些实施方案中，可以通过例如探针或引物检测KRAS/MTAP基因。本文所用术语“探针”是指寡核苷酸、多核苷酸或核酸，RNA或DNA，无论是天然存在于纯化的限制性内切酶消化物中还是合成产生的，其能够与具有与探针互补的序列的核酸退火或特异性杂交。探针可以是单链或双链的。探针的准确长度将取决于许多因素，包括温度、探针来源和方法的使用。例如，对于诊断应用，根据靶序列的复杂性，寡核苷酸探针通常包含 15-25个或更多个核苷酸，尽管它可以包含更少的核苷酸。
在一些实施方案中，生物样品包含少量细胞，或者是单细胞。扩增 cDNA和分析在少量细胞(例如1000个至10个细胞)和单细胞中mRNA表达水平的方法是本领域熟知的。这样的方法可以包括例如半随机引发PCR 和基于phi29的cDNA扩增步骤。
这些和其他合适的用于结合(特异性)mRNA的方法在本领域是熟知的，并例如在Sambrook和Russell(2001,loc.cit.)中描述。技术人员能够通过利用检测信号的强度和待确定的基因产物的量之间的相关性，优选地线性相关性，来确定组分的量，特别是所述基因产物的量。
为了检测细胞或组织样品中的KRAS/MTAP蛋白表达，用于测量细胞或组织样品中蛋白水平的任何已知方法可以用于本发明。
用于测量样品中KRAS/MTAP蛋白的表达的方法包括例如免疫测定、配体结合测定、质谱法或高效液相色谱法(HPLC)。一些方法包括免疫测定法，与KRAS/MTAP蛋白特异性免疫反应的抗体藉以在允许与样品中的 KRAS/MTAP蛋白免疫反应的条件下与细胞或组织样品接触，并测量结合抗体的量。示例性的免疫测定包括但不限于放射免疫测定、ELISA、免疫沉淀测定、蛋白质印记法、荧光免疫测定和免疫组织化学、流式细胞术、蛋白质阵列、多重珠阵列、磁捕获、体内成像、荧光共振能量转移(FRET) 和光漂白后的荧光恢复/定位(FRAP/FLAP)。在其它优选的实施方案中，细胞或组织样品中KRAS的存在或不存在通过IHC确定。
应当理解的是，一些免疫测定，例如ELISA，可要求两种不同的生物标志物特异性抗体或配体(例如，捕获配体或抗体，以及检测配体或抗体)。在某些实施方案中，KRAS用表面上的配体或抗体捕获，并且蛋白质生物标志物用酶标记。在一个实例中，一种与生物素或链霉亲和素缀合的检测抗体，以与含有生物素或链霉亲和素的酶建立生物素-链霉亲和素连接。通过将酶底物转化成有色分子来产生信号，并且通过用光传感器测量吸光度来定量溶液的颜色强度。设想的测定可以利用显色报告物和产生可观察到的颜色变化的底物来指示蛋白质生物标志物的存在。也设想用荧光的、电化学发光的和实时PCR报告物来产生可定量的信号。
一些测定任选地包括将一种或更多种抗体固定在固体支持物上，以便于在抗体与样品接触之前清洗和随后分离复合物。固体支持物的实例包括以例如微量滴定板、棒、珠或微珠形式的玻璃或塑料。抗体也可以附着在探针、基底或阵列上。
流式细胞术是一种基于激光的技术，其可用于通过将颗粒悬浮在流体流中并将它们通过电子检测设备来计数、分选和检测蛋白质生物标志物。流式细胞仪具有根据颜色区分不同的颗粒的能力。用在两种或更多种不同的波长发光的不同的染料对颗粒进行不同的染色，允许颗粒被区分开。在 Fulton等人，Clinical Chemistry,43(9):1749-1756(1997)中讨论了多重分析，诸如FLOWMETRIXTM，并且可以允许人们在同一时间用同一样品在一个试管中进行多个分离的分析。
在另一个优选实施方案中，通过质谱法检测本发明的KRAS和/或 MTAP的表达。多维HPLC(高效液相色谱法)可以与质谱法联用来分离 KRAS。
此外，可以在体内或体外检测患者癌症中KRAS和/或MTAP基因或多肽的存在、不存在或表达水平。在一些实施方案中，在从患者分离的含有遗传物质的生物样品中体外检测表达。在一些其他实施方案中，标志物基因的表达可以在体内进行，例如使用诸如“QuantumDot”标记或CT扫描等技术。
KRAS的活性不仅可以通过测量表达水平来确定，还可以通过例如测量KRAS的GTP酶活性或通过测量下游信号通路成员的激活来确定，例如在KRAS的情况下，通过确定磷酸-Akt或磷酸-Erk的水平。用于确定所述蛋白质活性的手段和方法在本领域是熟知的，并且例如可以从Lottspeich (Spektrum Akademischer Verlag，1998)推导。检测细胞Ras-GTP的KRAS 活化测定试剂盒在本领域中是熟知的，例如Jena Bioscience's Ras活化试剂盒以及Cell Biolabs,Inc K-Ras活化测定试剂盒。
MTAP的活性不仅可以通过测量表达水平来确定，还可以通过例如测量甲基硫腺苷(MTA)的细胞流出来确定。
合适地，根据本发明，MTA可作为生物标志物使用。在一个实施方案中，与MTAP相关的方法和用途可以被MTA取代，在此实施方案中，MTA 和对使用i)基本上缺乏丝氨酸和/或ii)半胱氨酸有限的饮食的治疗的“响应性”或“敏感性”之间的相关性是相反的。MTA增强的流出指示对这样的治疗的响应性或敏感性。
如本文所用，术语“活性”是指蛋白质(例如KRAS)的活性，而术语表达水平是指在蛋白质水平(例如由蛋白质印记法等确定)或转录水平(例如剪接、未剪接或部分剪接的mRNA，其可以由RNA印记法、实时PCR等确定)的表达。
如本文所用，术语“增加”可以指通过本文所述方法检测到的生物标志物水平(例如表达或活性)与来自对照的相同生物标志物水平或参考水平相比增加了5％、10％、20％、25％、30％、40％、50％、60％、70％、80％、 85％、90％、95％、96％、97％、98％、99％或更多。在某些实施方案中，术语增加是指生物标志物水平的增加，其中增加的水平是与对照中生物标志物水平或参考水平相比的0.1倍、0.5倍、1倍、2倍、3倍、4倍、5倍或更高。
如本文所用，术语“降低”可以指通过本文所述方法检测到的生物标志物水平(例如表达或活性)与来自对照的相同生物标志物水平或参考水平相比减少了5％、10％、20％、25％、30％、40％、50％、60％、70％、80％、 85％、90％、95％、96％、97％、98％、99％或更多。在某些实施方案中，术语降低是指生物标志物水平的降低，其中降低的水平是与对照中生物标志物水平或参考水平相比的0.1倍、0.5倍、1倍、2倍、3倍、4倍、5倍或更低。
如本文所用，短语“基本上相同”表示两个数值(例如，一个与测试生物样品中的KRAS表达或活性相关，且另一个与对照样品中的KRAS表达或活性相关)之间足够高的相似度，以使得本领域技术人员将认为这两个数值之间的差异在由所述数值测量的生物特征的背景内很小或没有生物学和/ 或统计学意义。作为参考/比较值的函数，所述两个值之间的差异为例如小于约50％、小于约40％、小于约30％、小于约20％和/或小于约10％。
本文公开的方法包括将从受试者分离的样品中检测到的生物标志物 (例如KRAS和/或MTAP)的水平与对照或预定参考水平进行比较。
如本文所用，“对照”是指具有正常水平的生物标志物表达的样品，例如来自不患有或不怀疑患有癌症的健康受试者的样品，或者在KRAS的情况下，不具有或不怀疑具有KRAS突变的样品。优选地，对照样品是正常 (例如，未患病的)细胞或组织样品。优选地，当将要测量的生物标志物是KRAS时，对照样品对于野生型KRAS是阳性的。对照样品可以是与从受试者分离的样品相同的组织或细胞类型。
如本文所用，术语“参考水平”是指与通过本文所述方法从对照样品中检测到的相同生物标志物水平相同的生物标志物水平(即KRAS水平)。可选择地，参考水平可以包括来自参考数据库的生物标志物(例如，KRAS) 的表达水平，其可以用于生成预定的截止值(cutoff value)，即统计上预测症状或疾病或其缺乏的诊断得分，或者可以是基于标准群体样品的预定参考水平，或者可选地，基于受试者的基线表达水平(即器官移植之前)的预定参考水平。优选地，使用相同的测试平台(例如，通过RT-PCT分析mRNA、通过免疫测定分析蛋白质等)分析从受试者分离的生物样品，用于获得参考值。
可选择地，预测可以基于生物标志物(例如KRAS)的标准化表达水平。通过将样品中生物标志物(例如KRAS)的表达与非标志物的参考核酸(例如 mRNA，例如组成性表达的mRNA)的表达进行比较，校正样品中生物标志物(例如KRAS)的绝对表达水平，从而使表达水平标准化。
这种标准化允许比较一个样品与另一个样品中的表达水平，或者来自不同来源的样品之间的表达水平。然后，可以任选地将这种标准化的表达与参考水平或对照进行比较。
在一方面，本发明提供了治疗患有癌症的受试者的方法，所述方法包括：
a)确定从受试者分离的生物样品中Kras表达或活性的水平是否指示对包含基本上缺乏丝氨酸的饮食的癌症治疗的响应性或敏感性；以及
b)向受试者施用癌症治疗，其中在生物样品中Kras的表达或活性水平指示对所述癌症治疗的响应性或敏感性。
在某些实施方案中，基本上缺乏丝氨酸的饮食包括膳食产品或由膳食产品组成。如本文所用，术语“膳食产品”是指包含一种或更多种必需氨基酸或其盐或酯的组合物，其用于食品产品中，或与食品产品一起使用或消耗，以向消耗补充剂的受试者提供所需水平的氨基酸或其盐或酯。这些产品中的膳食成分可以包括：维生素、矿物质、草药或其他植物材料、氨基酸以及诸如酶、器官组织、腺体和代谢物的物质。
膳食产品可以粉末、凝胶、溶液、悬浮液、糊状物、固体、液体、液体浓缩物、可重构粉末、摇瓶、浓缩物、丸剂、条、片剂、胶囊或即用型产品的形式提供。设想，当补充剂为片剂、丸剂、胶囊、液体、气雾剂、可注射溶液或其它药学上可接受的制剂形式时，膳食产品也可以是药物组合物。
如本文所用，“基本上缺乏”是指完全或几乎不含丝氨酸。在各种实施方案中，饮食或膳食产品基本上缺乏丝氨酸。
在一个实施方案中，所述癌症治疗包括基本上缺乏丝氨酸和甘氨酸的饮食。
在一些实施方案中，所述癌症治疗包括在化学治疗或放射治疗方案期间向癌症患者施用基本上缺乏丝氨酸的饮食。优选地，所述癌症治疗进一步包含施用选自以下的治疗剂：癌细胞生长抑制剂、放射治疗剂和化学治疗剂。
如本文所用，癌细胞生长抑制剂、放射治疗剂和化学治疗剂和/或放射疗法。
此类化学疗法可以包括以下类别的抗癌剂中的一种或更多种：
(i)抗增殖药/抗肿瘤药及其组合，诸如，烷基化剂(例如顺铂、奥沙利铂、卡铂、环磷酰胺、氮芥、尿嘧啶氮芥、苯达莫司汀、美法仑、苯丁酸氮芥、盐酸氮芥、白消安、替莫唑胺、亚硝基脲、异环磷酰胺、美法仑、哌泊溴烷、三乙撑蜜胺、三乙撑硫代磷酰胺(triethylenethiophoporamine)、卡莫司汀、洛莫司汀、链佐星和达卡巴嗪)；抗代谢物(例如，吉西他滨和叶酸拮抗物诸如氟嘧啶如5-氟尿嘧啶和替加氟、雷替曲塞、氨甲蝶呤、培美曲塞、胞嘧啶阿拉伯糖苷、氟尿苷、阿糖孢苷、6-巯基嘌呤、6-硫代鸟嘌呤、氟达拉滨磷酸、喷司他丁、和吉西他滨和羟基脲)；抗生素(例如，蒽环霉素如阿霉素、博来霉素、多柔比星、柔红霉素、表柔比星、伊达比星、丝裂霉素-C、更生霉素和光辉霉素)；抗有丝分裂剂(例如长春花生物碱如长春新碱、长春花碱、长春地辛和长春瑞滨，以及紫杉烷如紫杉醇和泰索帝，以及polo激酶抑制剂)；蛋白酶体抑制剂例如卡非佐米和硼替佐米；干扰素治疗；和拓扑异构酶抑制剂(例如，表鬼臼毒素如依托泊苷和替尼泊苷、安吖啶、拓扑替康、伊立替康、米托蒽醌以及喜树碱)；博来霉素、更生霉素、柔红霉素、多柔比星、表柔比星、伊达比星、ara-C、紫杉醇 (TaxolTM)、白蛋白结合型紫杉醇、多西紫杉醇、光神霉素、脱氧助间型霉素、丝裂霉素-C、L-天冬酰胺酶、干扰素(特别是IFN-a)、依托泊苷、替尼泊苷、DNA脱甲基化剂(例如，阿扎胞苷或地西他滨)；以及组蛋白去乙酰化酶(HDAC)抑制剂(例如伏立诺他(vorinostat)、MS-275、帕比司他 (panobinostat)、罗米地(romidepsin)、丙戊酸、莫西汀(MGCD0103)和普拉西诺司他SB939(prasinostat SB939))；
(ii)细胞生长抑制剂诸如抗雌激素(例如他莫昔芬、氟维司群、托瑞米芬、雷洛昔芬、屈洛昔芬和艾多昔芬(iodoxyfene))、抗雄激素(例如比卡鲁胺、氟他胺、尼鲁米特和醋酸环丙孕酮)、LHRH拮抗剂或LHRH激动剂(例如戈舍瑞林、亮丙瑞林和布舍瑞林)、孕激素(例如醋酸甲地孕酮)、芳香化酶抑制剂(例如阿那曲唑、来曲唑、伏氯唑(vorazole)和依西美坦)以及5*还原酶抑制剂诸如非那雄胺；和诺维本(avelbene)、CPT-ll、阿那曲唑、来曲唑、卡培他滨、reloxafme、环磷酰胺、异环磷酰胺和屈洛昔芬(droloxafine)；
(iii)抗侵入剂例如达沙替尼和博舒替尼(SKI-606)，以及金属蛋白酶抑制剂、尿激酶纤维蛋白溶酶原激活剂受体功能的抑制剂或乙酰肝素酶的抗体；
(iv)生长因子功能的抑制剂：例如，这样的抑制剂包括生长因子抗体和生长因子受体抗体例如抗erbB2抗体曲妥珠单抗[赫塞汀TM]、抗EGFR 抗体帕尼单抗、抗erbB1抗体西妥昔单抗，酪氨酸激酶抑制剂例如表皮生长因子家族的抑制剂(例如，EGFR家族酪氨酸激酶抑制剂例如吉非替尼、埃罗替尼和6-丙烯酰胺基-N-(3-氯-4-氟苯基)-7-(3-吗啉代丙氧基)-喹唑啉 -4-胺(CI 1033)、阿法替尼、范德塔尼、奥西默蒂尼和罗基列替尼)，erbB2 酪氨酸激酶抑制剂诸如拉帕替尼)和共刺激分子诸如CTLA-4、4-lBB和PD-l 的抗体，或细胞因子抗体(IL-I0、TGF-β)；肝细胞生长因子家族的抑制剂；胰岛素生长因子家族的抑制剂；细胞凋亡的蛋白调节物的调节剂(例如 Bcl-2抑制剂)；血小板衍生的生长因子家族的抑制剂，例如伊马替尼和/或尼罗替尼(AMN107)；丝氨酸/苏氨酸激酶的抑制剂(例如，Ras/Raf信号传送抑制剂例如法尼基转移酶抑制剂，索拉非尼、替吡法尼和洛那法尼)，通过MEK和/或AKT激酶的细胞信号传送的抑制剂、c-kit抑制剂、abl激酶抑制剂、PI3激酶抑制剂、Plt3激酶抑制剂、CSF-1R激酶抑制剂、IGF受体激酶抑制剂；极光激酶抑制剂和周期蛋白依赖性激酶抑制剂诸如CDK2 抑制剂和/或CDK4抑制剂；CCR2、CCR4或CCR6拮抗剂；和RAF激酶抑制剂，如在WO2006043090、WO2009077766、WO2011092469或 WO2015075483中所述的那些。
(v)抗血管生成剂，例如抑制血管内皮生长因子的效应的那些抗血管生成剂，[例如抗血管内皮细胞生长因子抗体贝伐单抗(AvastinTM)；沙利度胺；来那度胺；和例如VEGF受体酪氨酸激酶抑制剂诸如凡德他尼、瓦他拉尼、舒尼替尼、阿西替尼和帕唑帕尼；
(vi)基因疗法方法，包括例如替换畸变基因例如畸变p53或畸变的 BRCA1或BRCA2的方法；
(vii)免疫疗法方法，包括例如抗体疗法，诸如阿仑单抗、利妥昔单抗、替伊莫单抗和奥法木单抗；干扰素，例如干扰素α；白细胞介素诸如IL-2(阿地白介素)；白细胞介素抑制剂例如IRAK4抑制剂；癌症疫苗，包括预防性疫苗和治疗疫苗，诸如HPV疫苗例如加德西、希瑞适、 Oncophage和Sipuleucel-T(Provenge)；gp100；基于树突细胞的疫苗(诸如 Ad.p53DC)；toll样受体调节物例如TLR-7或TLR-9拮抗剂；PD-1、PD-L1、PD-L2和CTL4-A调节剂(例如尼弗罗玛)、抗体和疫苗；其他IDO抑制剂(诸如吲哚美辛)；抗PD-1单克隆抗体(诸如MK-3475和尼弗罗玛)；抗PDL1 单克隆抗体(诸如MEDI-4736和RG-7446)；抗PDL2单克隆抗体；和抗 CTLA-4抗体(诸如易普利姆玛)；和
(viii)细胞毒性剂例如氟达拉滨(fludaribine)(福达华(fludara))、克拉屈滨(cladribine)、喷司他丁(pentostatin)(NipentTM)；
(ix)靶向疗法，例如PI3K抑制剂，例如艾代拉里(idelalisib)和培福辛(perifosine)；SMAC(胱天蛋白酶的第二线粒体驱动的活化剂)模拟物，也称为凋亡蛋白抑制剂(IAP)拮抗剂(IAP拮抗剂)。这些剂起到抑制lAP例如 XIAP、clAP1和clAP2的作用，并且从而重建细胞凋亡途径。特定的SMAC 模拟物包括Birinapant(TL32711，TetraLogicPharmaceuticals)、LCL161 (Novartis)、AEG40730(Aegera Therapeutics)、SM-164(University of Michigan)、LBW242(Novartis)、ML101(Sanford-Burnham MedicalResearch Institute)、AT-406(Ascenta Therapeutics/University of Michigan)、GDC-0917 (Genentech)、AEG35156(Aegera Therapeutic)和HGS1029(Human GenomeSciences)；以及靶向泛素蛋白酶体系统(UPS)的剂，例如硼替佐米、卡菲佐米、马里佐米(NPI-0052)和MLN9708；以及
(xii)嵌合抗原受体、抗癌疫苗和精氨酸酶抑制剂。
本发明方法中使用的治疗剂可以是单一的剂或剂的组合。优选的组合将包括具有不同作用机制的剂。
如本文使用的，术语“与...组合施用”以及语法等同等意在涵盖向单个患者施用选定的治疗剂，且意图包括其中通过相同或不同的施用途径或在相同或不同的时间施用剂的治疗方案。在一些实施方案中，本文描述的化合物将与其他剂共同施用。这些术语涵盖向动物施用两种或更多种剂使得剂和/或其代谢物两者同时存在于动物中。其包括以单独的组合物同时施用，以单独的组合物在不同时间施用，和/或以其中存在这两种剂的组合物施用。因此，在一些实施方案中，本发明的化合物和其他剂以单一的组合物施用。
本文公开的剂可以通过任何途径施用，包括皮内、皮下、口服、动脉内或静脉内施用。优选地，将通过静脉途径施用。优选地，肠胃外施用可以以团注或通过输注来提供。
根据本发明将施用的治疗剂的浓度将根据几个因素而变化，所述因素包括将施用的化合物的剂量、所用化合物的药代动力学特征和施用途径。剂可以单剂量或重复剂量施用。根据许多因素，包括患者的总体健康状况，以及所选化合物的制剂和施用途径，可以每天或更频繁地施用治疗。
优选地，所述癌症治疗进一步包括施用治疗有效量的所述治疗剂。如本文所用，术语“治疗有效量”是指被施用的足以治疗或预防特定疾病或状况的至少一种剂或化合物的量。结果可以是疾病的病征、症状或病因的减少和/或缓解，或生物系统的任何其他期望的改变。例如，用于治疗用途的“有效量”是包含如本文公开的化合物的组合物提供疾病的临床上显著减轻所需要的量。在任何个体的情况下，可以使用诸如剂量递增研究(doseescalation study)的技术来确定合适的“有效”量。
在某些实施方案中，在至少1天、2天、3天、4天、5天、6天、7 天，至少2周、3周、4周、5周、6周、7周、8周、9周、10周、11周、 12周、13周、14周、15周、16周、17周、18周、19周、20周、21周、 22周、23周、24周、25周、26周或直到观察到治疗终点(例如，观察到肿瘤缩小)的时间段内施用饮食。
当基本上缺乏丝氨酸的饮食包括膳食产品或由膳食产品组成时，膳食产品每天施用1次至10次。
本发明还包括用于检测样品中KRAS和/或MTAP存在的试剂盒。本发明的试剂盒在鉴定将受益于包括基本上缺乏丝氨酸的饮食的癌症治疗的受试者中具有特别的用途。例如，试剂盒可以包括能够检测生物样品中 KRAS多肽或核酸的表达或活性的化合物或剂。试剂盒可以包括能够检测生物样品中MTAP多肽或核酸的表达或活性的化合物或剂。化合物或剂可以被包装在合适的容器中。试剂盒还可以包括用于使用试剂盒来检测KRAS和/或MTAP蛋白或核酸分子的说明。
在一方面，本发明提供了用于在鉴定将受益于包含基本上缺乏丝氨酸的饮食的癌症治疗的受试者中使用的试剂盒，所述试剂盒包含：
a.用于确定Kras的表达或活性的剂；和b.用于测定的试剂。
试剂盒可以进一步包含用于确定MTAP的表达或活性的剂。
在另一方面，本发明提供了用于在鉴定将受益于癌症治疗的受试者中使用的试剂盒，所述癌症治疗包含：i)基本上缺乏丝氨酸，和/或ii)半胱氨酸有限的饮食，所述试剂盒包含：
a.用于确定MTAP的表达或活性的剂；和
b.用于测定的试剂。
在本发明的试剂盒中，剂可以是抗体或核酸分子。
对于基于抗体的试剂盒，试剂盒可以包括：(1)特异性结合本发明的多肽标志物(例如KRAS或MTAP)的第一种抗体(例如，附着于固体支持物)；和任选地，(2)第二种不同的抗体，其结合多肽标志物或第一种抗体并与可检测剂缀合。
对于基于寡核苷酸的试剂盒，试剂盒可以包括：(1)核苷酸探针，例如可检测标记的引物，其与生物标志物(例如KRAS或MTAP)核酸分子杂交，或(2)一对引物或扩增生物标志物核酸分子。
试剂盒还可以包括检测可检测剂所必需的组分(例如酶或底物)。试剂盒还可以包含对照样品或一系列对照样品，这些对照样品可以被测定并与包含的测试样品进行比较。
试剂盒还可包含用于使用的说明。
在一个实施方案中，当试剂盒确定KRAS表达或活性时，所述试剂盒包含说明，即与对照样品相比或与预定参考水平相比，生物样品中Kras 的表达或活性增加的水平指示受试者对所述癌症治疗的不响应性或不敏感性，并且其中与对照样品或与预定参考水平相比生物样品中Kras的表达或活性降低的水平，或与对照样品或预定参考水平基本上相同的Kras的表达或活性水平，指示受试者对所述癌症治疗的响应性或敏感性。
在一个实施方案中，当试剂盒确定MTAP表达或活性时，试剂盒包含说明，即与对照样品相比或与预定参考水平相比生物样品中MTAP的表达或活性降低的水平，或与对照样品或预定参考水平基本上相同的MTAP的表达或活性水平，指示受试者对所述癌症治疗的响应性或敏感性。
实施例
实施例1(图1、图2、图3、图4、图18、图19、图20、图21、图 22和图23)
方法
细胞系和细胞培养物。
从ATCC获得DLD1和SW480细胞，并使用Promega GenePrint 10进行验证。iKRAS细胞(iKRAS1、iKRAS3、AK196)由Ron DePinho(Ying等人，Cell，2012)，(The University ofTexas MD Anderson Cancer Center)友好地提供。细胞培养基购自GIBCO，产品编号示出在括号中。将SW480和 iKRAS(DMEM-21969)和DLD1(RPMI-1640-31870)保持在补充有10％ FBS(10270)、青霉素-链霉素和两性霉素的所述培养基中，具有2mM的 L-谷氨酰胺终浓度。在多西环素2ug/ml(KRAS-ON)的存在下和在有/没有多西环素(KRAS-ON/OFF)的培养基中生长储备iKRAS细胞用于实验。将细胞保持在37℃、5％CO2湿润的培养箱中。使用Mycoalert检测试剂盒 (Lonza)对培养的细胞进行对于支原体的常规检测。
增殖测定.
将iKRas细胞接种在24孔板中的完全DMEM培养基+2ug/ml多西环素中，并允许粘附过夜。然后用PBS洗涤细胞，并接受含有或不含有丝氨酸和甘氨酸、含有或不含有2ug/ml多西环素的测定培养基。在48h和96h 计数一式三个孔(使用Casy TT细胞计数器，Innovatis，Roche Applied Science)，使用“time＝0”板计算从培养基变化时起的相对细胞数。展示的数据来自三次独立的实验。
二甲双胍体外测定
将DLD1和SW480细胞接种到24孔板中，并允许粘附过夜。用PBS 洗涤细胞，并且接受以所述剂量含有或不含有丝氨酸和甘氨酸、含有或不含有二甲双胍的测定培养基，并且允许生长持续三天。使用光学显微镜拍摄代表性的孔，并使用Casy TT细胞计数器计数(图19d)。对于剂量响应实验(图23e)，将细胞以相同的方式接种在不含丝氨酸和甘氨酸的测定培养基中，或接种在含低丝氨酸和甘氨酸(10uM)的测定培养基中，三天后计数一式三个孔。
类器官培养物.
ADF＝Advanced DMEM F/12，含有2mM谷氨酰胺、1％青霉素/链霉素溶液、0.1％AlbuMAX I BSA、10mM HEPES(均为Gibco/Life Technologies)。从小鼠小肠中取出腺瘤，并且切成较小的块，并且用冰冷的PBS洗涤5次。将块在4℃在5mM EDTA中在滚筒上温育持续10分钟。用冰冷的PBS洗涤滤胞腺(crypt)2次以去除EDTA，并在10x胰蛋白酶中在37℃温育持续30分钟。收集富集滤胞腺的上清液，并用5ml ADF通过机械移液洗涤约5次。通过以1200rpm离心持续5分钟来沉淀滤胞腺。将滤胞腺重新悬浮在生长因子减少的基质胶(BDBiosciences)中，并在12孔板中每孔铺板20μl。允许基质胶在37℃培养箱中固化持续30分钟，随后添加适当的补充有0.05μg/ml EGF和0.1μg/ml头蛋白的ADF(每孔总体积 1ml)。通过在冰冷的PBS中收获而分开滤胞腺，并以600rpm旋转沉降持续3分钟。吸取上清液，并用100μl冰冷的PBS使用机械移液分离沉淀物。向试管中添加5ml PBS，并以600rpm旋转沉降持续3分钟，重复直到上清液中没有碎片。用生长因子减少的基质胶重新悬浮最终的滤胞腺沉淀物，并如前所述进行铺板。对于丝氨酸/甘氨酸饥饿，使用不含氨基酸的 Advanced DMEMF/12(Gibco/Life Technologies)构建用于类器官的含有或不含丝氨酸和甘氨酸、包含所有其他氨基酸的测定培养基。
饮食.
从断奶开始，小鼠任意地接受“正常食物”(Rat and Mouse Breeder and Grower,801730,Special Diet Services,SDS,UK)和水。正常食物情况下，膳食氨基酸来源于原料(小麦、麸皮粉、大麦、去皮提取的烤大豆、玉米和鱼粉)中含有的全蛋白，并添加少量纯化的赖氨酸作为补充剂。使用两组实验饮食，两者都基于来自TestDiet(Richmond，IN)的Baker纯化氨基酸饮食(Baker Purified Amino Acid Diet)(Hirakawa等人，Nutr.Res.1984)：“饮食1- 对照”包含所有必需氨基酸加上丝氨酸、甘氨酸、谷氨酰胺、精氨酸、胱氨酸和酪氨酸；“饮食1-无Ser，无Gly”与饮食1-对照相同，但是不含丝氨酸和甘氨酸，其他氨基酸水平成比例增加，以达到相同的总氨基酸含量。先前使用过这些“饮食1”制剂(Maddocks等人，Nature，2013，并且参见下文的“异种移植”)。“饮食2-对照”包含所有必需氨基酸加上丝氨酸、甘氨酸、谷氨酰胺、精氨酸、胱氨酸、酪氨酸、丙氨酸、脯氨酸、谷氨酸和天冬酰胺；“饮食2-无Ser，无Gly/饮食2-不含SG”与饮食2-对照相同，但是不含丝氨酸和甘氨酸，其他氨基酸水平成比例增加，以达到相同的总氨基酸含量。“饮食2”制剂用于Εμ-Myc-Tigar-/-群组使用(图19f)。所有其他群组接受之前公布的“饮食1”制剂。
小鼠.
所有动物研究根据1986年《动物(科学程序)法》(Animals(ScientificProcedures)Act 1986)和2010年欧盟指令(EU Directive 2010)进行，并得到了当地伦理审查程序(University of Glasgow)的批准。将小家鼠(Mus Musculus)群组圈养在一个主动环境富集的有挡板的设施中。先前已经描述了Εμ-Myc11、ApcMin/+、Lgr5creER；Apcfl/fl和Pdx1cre；KrasG12D； Trp53fl/+或Trp53R172H/+小鼠/模型。对于每种基因型使用混合的雄性和雌性群体。每个图/图例中示出了小鼠的数(或来自个体小鼠的样品数)。Εμ-Myc和ApcMin/+小鼠为至少20代C57BL/6J。Εμ-Myc；Tigarfl/fl小鼠为至少50％C57BL/6J。小鼠在以下的时间开始适当的饮食：Εμ-Myc纯育出生后60天，Εμ-Myc；Tigarfl/fl出生后55天，ApcMin/+出生后80天， Lgr5creER；Apcfl/fl诱导后7天，Pdxlcre；KrasG12D；Trp53fl/+或 Trp53R172H/+出生后60天。两次腹腔注射120mg/kg他莫昔芬诱导通过 Lgr5creER重组，两次注射之间休息一天。对于苯乙双胍实验，从饮食变化的同一天开始每天用100mg/kg小鼠体重灌胃Εμ-Myc小鼠。对于二甲双胍实验，ApcMin/+小鼠从饮食改变4天后开始，在它们的饮用水给予200 mg/kg/天。将所有小鼠被带到临床终点。将来自ApcMin/+小鼠的肠固定在甲氧基乙酰苯胺(methacarn)(4:2:1比率的甲醇、氯仿、乙酸)中，以便于肿瘤数量和面积(宽度x长度)的评分。
用于小鼠研究的样品规模根据以前使用这些模型的经验估算，这些模型通过Mantel-Cox(对数秩)分析测试存活的潜在差异。在收集了第一个实验组的数据后(例如，仅置于饮食的Εμ-Myc和APCMin/+组)，后续的组缩小了规模，以使使用的动物数最少(例如，苯乙双胍和二甲双胍治疗组)。在所有实验中，只有在参加研究时具有明显表型的小鼠被排除在外(即未参加)：例如，在Εμ-Myc群组中扩大的淋巴结或扩大的胸腺的迹象，在APCMin/+群组中的贫血。由于与肿瘤无关的疾病而死亡的动物被包括为审查观察(censored observation)。根据随机区块设计，将小鼠分配到实验组：随着通过繁殖小鼠变得可用，将它们基于性别分成多个区块，并且然后随机分配到治疗。注意保持雄性/雌性比率相似，以消除性别作为变异性的潜在来源。将小鼠分配到实验组以及收集终点数据的研究者并不是盲的。
液相色谱质谱法(LCMS)。
样品在由甲醇、乙腈和H2O(50∶30∶20)组成的冷(-20℃)裂解溶剂(LS) 中制备。将10μl的血清样品添加到490μl的LS中，并涡旋，通过离心清除沉淀的蛋白质。通过用PBS洗涤孔，然后每孔加入250μl LS，并在4℃振荡持续10分钟来制备类器官提取物，从孔中去除LS，并且然后通过离心清除蛋白质。将组织样品快速冷冻并储存在-80℃。在裂解之前，将冷冻样品称重，然后使用Precellys匀浆器(Bertin Technologies)在1ml冷LS中匀化。通过离心清除裂解物的蛋白质，并且匀化后用基于重量的LS将裂解物浓度标准化。提取物在由Accela 600LC系统和精密质谱仪(Thermo Scientific)组成的LCMS平台上进行分析。使用SeQuant ZIC-pHILIC柱(2.1 mm×150mm，5μl)(Merck)分离代谢物，将流动相由A＝碳酸铵20mM(调节至pH 9.4)和B＝乙腈混合。使用梯度程序，其从20％的A开始并且2分钟后线性增加，到17分时增加到80％，随后进行洗涤和再平衡步骤。方法的总运行时间为25分钟。将LC流在HESI探针中去溶剂化及电离。精密质谱仪在75-1,000m/z的质量范围内以全扫描模式运行，分辨率为50000，具有极性切换。由LCquan(Thermo Scientific)和MZMine 2.10对原始数据对于代谢物的鉴定和定量进行分析。
蛋白质印迹.
对细胞的蛋白质印迹如先前所述进行(Maddocks等人，Nature，2013；Labuschagne等人，Cell.Rep.，2014；Maddocks等人，Mol.Cell,2016)，简而言之，在补充有完全蛋白酶抑制剂(Roche)、原钒酸钠和氟化钠(两者都是Sigma)的RIPA缓冲液中制备全细胞蛋白质裂解物。使用TissueLyser II (Qiagen)将组织样品在补充有蛋白酶和磷酸酶抑制剂混合液(Pierce/Thermo Scientific)的RIPA缓冲液中裂解。通过离心清除裂解物，使用预制的4-12％的“NuPAGE”或“Bolt”凝胶(Invitrogen，Life Technologies)分离，并转移到硝酸纤维素膜上。使用Li-Cor Odyssey红外扫描仪和软件(Li-Cor Biosciences) 检测和定量蛋白质。对于相关物质的次级抗体是IRDye680和缀合的 IRDye800(Li-CorBiosciences)。使用的初级抗体是：PHGDH(Sigma Life Science，HPA 021241)、PSAT1(Novus Biologicals，NBP1-32920)、PSPH (Santa Cruz，sc-98683)、肌动蛋白I-19-R(Santa-Cruz，sc-1616-R)、pERK[磷酸-p44/p42MAPK(Erk 1/2)(Thr202/Tyr204)](CellSignalling Technology 9101)、AMPKa1(R&D Systems，AF3197)和磷酸-AMPK T172(CellSignalling Technology 2535)。
qRT-PCR.
利用DNA酶使用RNeasy试剂盒(两者都是Qiagen)提取RNA以去除 DNA。如先前所述(Maddocks等人，Nature，2013)使用具有SYBR Green master mix的Applied Biosystems7500Fast Real-Time PCR系统(Applied Biosystems)进行qRT-PCR。引物(5'-3')：小鼠PHGDH正向 TGGCCTCGGCAGAATTGGAAG；小鼠PHGDH反向 TGTCATTCAGCAAGCCTGTGGT；小鼠PSAT1正向 GATGAACATCCCATTTCGCATTGG；小鼠PSAT1反向 GCGTTATACAGAGAGGCACGAATG；小鼠PSPH正向GAGATGGAGCTACGGACATGGAAG；小鼠PSPH反向 CTCCTCCAGTTCTCCCAGCAGCTC。从Primer Design(HK-SY-mo-900 ACTB)购买小鼠ActinB。由Eurofins MWG Operon合成和纯化序列。
统计数据.
使用Mantel-Cox(对数秩)检验、Graphpad Prism(v6)软件计算存活数据的统计比较。T检验使用微软excel(v14.6.1)，或使用Graphpad Prism(v7) 进行。使用1型/配对的(取自同一动物的样本)和2型/未配对的(取自不同动物的样本)T检验。在没有做出潜力差方向预测的情况下，使用双侧/2 尾T检验(例如，跨血清样品中所有氨基酸水平，图21)。在预先存在的数据支持样本间差异方向的预测的情况下，使用单侧/单尾T检验(例如丝氨酸从头合成，图2d)。当呈现的数据是单个数据点的平均值时，误差条是 STDEV，当数据是平均值的平均值时，误差条是SEM。在每种情况下，相关类型的T检验或误差条在图例中指明。在T检验使用进行多次比较进行的情况下，使用Graphpad Prism(v7)软件使用Holm-Sidak方法校正P值。
异种移植物
对8周的CD-1-Foxn1nu雌性小鼠(Charles River)进行3×106HCT116 细胞的双侧皮下注射；右侧为p53+/+，左侧为p53-/-(1ex)。注射后立即将小鼠置于对照饮食(n＝10)(含有丝氨酸和甘氨酸作为氨基酸混合物的一部分)或缺乏丝氨酸和甘氨酸的饮食(n＝10)(Test Diet,International Product Supplies)-制剂如下：
对照饮食成分：蔗糖(25.9％)、玉米淀粉(41.8％)、玉米油(5.0％)、Baker 氨基酸维生素混合物(0.2％)、Baker氨基酸矿物质混合物(10.0％)、碳酸氢钠(1.0％)、DL-α生育酚乙酸酯(0.004％)、乙氧喹(防腐剂，0.019％)、氯化胆碱(0.1％)、氨基酸预混料(16.0％)。氨基酸预混料：L-精氨酸-HCL(1.60％)、 L-胱氨酸(0.64％)、L-谷氨酰胺(1.60％)、甘氨酸(1.33％)、L-组氨酸 -HCL(0.80％)、L-异亮氨酸(1.07％)、L-亮氨酸(1.60％)、L-赖氨酸-HCL(1.87％)、L-甲硫氨酸(0.80％)、L-苯丙氨酸(1.07％)、L-丝氨酸(1.33％)、 L-苏氨酸(1.07％)、L-色氨酸(0.27％)、L-酪氨酸(0.53％)、L-缬氨酸(1.07％)。不含丝氨酸和甘氨酸的饮食具有与对照饮食相同的基本配方，但是氨基酸混合物缺少丝氨酸和甘氨酸。不含丝氨酸和甘氨酸的饮食成分：蔗糖 (25.9％)、玉米淀粉(41.8％)、玉米油(5.0％)、Baker氨基酸维生素混合物 (0.2％)、Baker氨基酸矿物质混合物(10.0％)、碳酸氢钠(1.0％)、DL-α生育酚乙酸酯(0.004％)、乙氧喹(防腐剂，0.019％)、氯化胆碱(0.1％)、氨基酸预混料(16.0％)。氨基酸预混料：L-精氨酸-HCL(1.60％)、L-胱氨酸(0.64％)、 L-谷氨酰胺(1.60％)、L-组氨酸-HCL(0.96％)、L-异亮氨酸(1.28％)、L-亮氨酸(1.92％)、L-赖氨酸-HCL(2.24％)、L-甲硫氨酸(0.96％)、L-苯丙氨酸(1.28％)、 L-苏氨酸(1.28％)、L-色氨酸(0.32％)、L-酪氨酸(0.64％)、L-缬氨酸(1.28％)。
这些饮食具有相等的热值和相等的总氨基酸含量。将动物圈养在无菌 IVC笼中，每周监测三次，并且当肿瘤达到预定大小(体积＝(长度x宽度 2)/2)或溃疡的临床终点时，将动物人道处死。所有动物研究通过了伦理审查程序(Ethical Review Process)(University of Glasgow)批准，并按照1986 年英国动物(科学程序)法案(UK Animals(Scientific Procedures)Act of 1986)(PPL 60/4181)和2010年欧盟指令进行。
结果
我们测试了两种由KRas激活和p53缺失(KrasG12Dp53+/-)或突变 (KrasG12Dp53R172H)驱动的胰腺癌小鼠模型。令人惊讶的是，尽管血清丝氨酸和甘氨酸水平明显下降(图3a和b)，但在两种模型中，没有观察到响应于不含丝氨酸/甘氨酸的饮食的存活率显著变化(图1a和b)。静脉内注射13C-15N标记的丝氨酸揭示了，胰腺正常和肿瘤组织中的丝氨酸摄取量相当，而在APCmin模型中的肠道肿瘤与正常组织相比吸收了显著更多的丝氨酸 (如由丝氨酸和源自丝氨酸的甘氨酸中的标记测量的)(图1c)。这些结果与 APCmin肿瘤对外源性丝氨酸的增加的需求以及因此它们对饮食中丝氨酸限制的敏感性一致。然而，胰腺肿瘤表现为更少地依赖外源性丝氨酸，这解释了它们对饮食的抗性。
淋巴瘤/肠道肿瘤模型和胰腺模型之间的一个明显区别是后者存在活化的KRas。活化的Ras已经被示出通过巨胞饮提高细胞接触胞外蛋白的能力，这种机制可以使细胞更少地依赖游离循环丝氨酸水平。然而，SSP通路酶的过表达也可以去除对胞外丝氨酸的依赖，
促使我们检查KRasG12D表达对这些细胞进行丝氨酸从头合成的能力的影响。使用含有多西环素可诱导型KrasG12D的胰腺细胞，我们发现在下调KRasG12D后，SSP酶在RNA和蛋白质水平上表达的一致下降(图1d和 e)。表达KrasG12D的细胞完全抵抗丝氨酸和甘氨酸饥饿。KrasG12D的失活减缓了这些细胞在完全培养基中的增殖速度，并且重要的是，没有KrasG12D的细胞恢复了对丝氨酸饥饿的敏感性，示出了在不含丝氨酸和甘氨酸的培养基中增殖的进一步下降(图1f)。
我们还使用类器官培养物模型测试了KrasG12D表达是否能赋予对丝氨酸敏感肠肿瘤细胞的抗性。APCmin肠类器官在体外生长为球体，并且与我们的体内研究一致，这些类器官的生长受到丝氨酸和甘氨酸去除的阻碍 (图2a)。相比之下，APCmin/KrasG12D类器官受丝氨酸饥饿的影响要小得多 (图2a)。此外，在不含丝氨酸和甘氨酸的条件中生长持续五天，严重损害了APCmin类器官在重新接种到完全培养基中后的恢复能力，而表达 KrasG12D的类器官做出了迅速的恢复(图2b和图28)。这些表型变化由在表达KrasG12D的肠细胞中SSP酶的更高的基础表达所反映(图2c)。SSP利用糖酵解中间体来制造丝氨酸，因此为了测试这些细胞中的SSP活性，我们在含有13C标记的葡萄糖的培养基中生长类器官并测量标记的葡萄糖和丝氨酸(由葡萄糖合成)的水平(图2d)。虽然在APCmin和APCmin KrasG12D细胞中标记的葡萄糖水平相当，表明在这些细胞中吸收葡萄糖的能力相等，但是在表达KrasG12D的细胞中标记的丝氨酸水平显著地更高，支持在这些细胞中增加的丝氨酸合成速率(图2d)。
在GEM模型中对于PDAC的血清氨基酸水平的分析示出，饮食显著降低了两种模型中丝氨酸和甘氨酸的全身水平(图3a和b)，而其他氨基酸水平要么没有变化，要么显示出微小/不一致的变化。尽管丝氨酸和甘氨酸的这种全身降低，PDAC肿瘤对丝氨酸/甘氨酸饥饿具有抗性，因为它们能够如上文所述上调丝氨酸从头合成(图1和2)。与之相比，在裸鼠中从异种移植人结肠直肠癌细胞系(HCT116)形成的肿瘤对膳食丝氨酸/甘氨酸饥饿敏感。在异种移植模型中，不含丝氨酸/甘氨酸的饮食导致了肿瘤体积的显著减少(图4a)，并显著增加小鼠的存活率(图4b)。
为了评估异种移植模型中做出的观察是否转化为原位(autochthonous) 发生的肿瘤，我们使用了对于淋巴瘤(基于Εμ-Myc表达)和肠肿瘤(基于缺陷的APC表达)的充分建立模型。出生后60-80天，在癌前病变的发展(腺瘤起始发生在APCMin/+小鼠出生后几天，Εμ-Myc小鼠在出生后28-42天内发生肿瘤前病变)之后，小鼠从正常的食物饮食转换成实验饮食，以模拟治疗性(而非预防性)干预。在两种基因型中，不含丝氨酸和甘氨酸的饮食显著延长了存活(图18a和b)。在APCMin/+小鼠中的肿瘤面积指示了，在临床终点，在置于不含丝氨酸/甘氨酸的饮食的小鼠中，存在也有小但显著的肿瘤尺寸减少的趋势，但在置于不含丝氨酸/甘氨酸的饮食的小鼠中，在临床终点，肿瘤数没有显著差异(图20)。
血清样品的液相色谱-质谱(LCMS)分析表明，饮食可重复地导致丝氨酸和甘氨酸水平的显著下降，对其他氨基酸的影响很小或不一致(图18c和 d、图21a和b)。这些变化转化为血清丝氨酸和甘氨酸从对照饮食的约150 μΜ减少到不含丝氨酸和甘氨酸饮食的65μΜ(图18e)。我们使用可诱导肠肿瘤模型(Lgr5-creER APCfl/fl)进一步验证了饮食的存活效果；在这种情况下，小鼠在肿瘤诱导开始后一周被转换成饮食。同样，与对照饮食(含有纯化的氨基酸)或正常食物(含有作为氨基酸来源的全蛋白)相比，所述饮食导致存活显著提高(图18f)。
丝氨酸饥饿激活了丝氨酸从头合成，将糖酵解中间体从能量产生中分流出去。细胞通过增加OXPHOS来应答，以维持ATP水平，并且抑制 OXPHOS可以增强丝氨酸饥饿的抗增殖效果。为了测试这些观察是否会转化为原位发生的肿瘤模型，我们在Εμ-Myc小鼠中将丝氨酸和甘氨酸饥饿与双胍苯乙双胍(biguanide phenformin)(一种复合物I抑制剂)组合。置于正常饮食的小鼠耐受最大剂量的苯乙双胍(100mg/kg/天)，但是在接受缺乏丝氨酸和甘氨酸的饮食的小鼠中引起显著的毒性(类似于大便困难的症状)。虽然这迫使我们削减了进入这项研究的募集，但是已经被募集并且没有屈服于毒性的小鼠(7/14)没有遭受进一步的不利影响。这些小鼠用带有苯乙双胍的饮食维持，并且与仅置于不含丝氨酸和甘氨酸的饮食的动物相比，示出了提高的存活的趋势。然而，由于最初的毒性，存活的小鼠太少，使得这种效果在统计学上不显著(图19a)。这些结果与先前的研究一致，示出了在肿瘤同种异体移植系统中，丝氨酸剥夺和双胍治疗之间存在合作。
为了进一步探索双胍治疗和丝氨酸饥饿之间的潜在协同作用，我们转向了二甲双胍，二甲双胍具有较低的毒性，在临床上作为抗糖尿病剂广泛使用，并正在作为抗癌剂进行试验。虽然口服二甲双胍的系统可用性普遍较差，但一些组织(包括肠)表达有助于二甲双胍摄取的OCT1转运蛋白，使APCMin/+小鼠成为可行的模型。在先前研究的指导下，我们选择了相当于(通过身体表面积计算)人类1g/天的每日剂量的小鼠二甲双胍剂量(200 mg/kg/天)。0.5-1g/天的剂量已经用于二甲双胍的多项结肠直肠癌临床试验，因此我们选择了一个临床相关剂量，但选择了一个次最大剂量，以避免使用苯乙双胍时出现的毒性。然而，我们未能检测到二甲双胍对APCMin/+小鼠存活的显著影响——尽管丝氨酸饥饿的有益影响持续存在(图19b和图 22a和b)。有趣的是，二甲双胍实际上增加了两种饮食组中存在的肿瘤数(对不含丝氨酸和甘氨酸的饮食组来说是统计上显著的)(图19c)，而平均肿瘤面积没有实质性的变化(图22c)。尽管鉴于在源自VillincreER；APCfl/fl小鼠的肠肿瘤类器官中二甲双胍(1000μm)与丝氨酸饥饿的协同作用，这个结果令人惊讶(图19d)，肿瘤类器官数据也示出了低剂量二甲双胍与丝氨酸和甘氨酸饥饿拮抗，保护肿瘤细胞免于饥饿(图19d)。二甲双胍的这些剂量依赖性效果(保护免受丝氨酸和甘氨酸饥饿的效果或增强丝氨酸和甘氨酸饥饿的效果)可能与二甲双胍对活性氧物质(ROS)水平的影响有关，活性氧物质水平随着低剂量二甲双胍下降，但随着高剂量二甲双胍增加(图19e)。
为了研究二甲双胍治疗在丝氨酸/甘氨酸缺乏的小鼠中为什么没有显示为有效的，我们通过质谱法分析了血清和组织。对经二甲双胍治疗小鼠的血清和组织的分析(图23a、23b和23c)示出了二甲双胍水平相对低，并且在预期与丝氨酸和甘氨酸饥饿的抗增殖作用拮抗(而不是增强)的范围内。对血清葡萄糖和乳酸盐的分析示出了，这些低水平的二甲双胍对全身代谢的影响最小(图23d)。在这些浓度，在APC缺陷类器官(如上所述，图19d)或APC截短的结肠直肠癌细胞系中，二甲双胍与丝氨酸/甘氨酸饥饿不具有协同作用，在20μM时示出增加的细胞数的趋势(图23e)。二甲双胍具有长期确立的抗氧化特性，包括硫氧还蛋白的上调，并且我们已经示出了抗氧化剂通过保护细胞免受ROS的侵害，提高了细胞在丝氨酸和甘氨酸饥饿期间的存活。因此，本研究建议，尽管有临床相关剂量和组织渗透，二甲双胍水平过低，无法抑制肿瘤生长。这与之前的研究形成对比，该研究示出APCMin/+小鼠服用二甲双胍后肿瘤面积中度减少(肿瘤数没有变化)，尽管剂量较高。
我们之前已经示出，丝氨酸耗竭使得培养物中的细胞对ROS更敏感，因此为了直接测试体内增加ROS水平是否能增强丝氨酸耗竭饮食的抗肿瘤效果，我们使用了Tigar缺失的小鼠。已经示出了TIGAR蛋白通过限制 ROS来支持肿瘤发展。尽管Εμ-Myc在这种混合品系背景下的表达导致小鼠比纯BI6Eμ-Myc更快地死于淋巴瘤(如图18a所示)，正如预期的那样，我们发现Tigar缺失后存活增加(图19f)。重要的是，Tigar缺失与不含丝氨酸和甘氨酸的饮食的组合具有改善的效果，产生了显著的整体存活增加 (图19f)。这些数据支持这样的概念，即当与不含丝氨酸和甘氨酸的饮食相组合时，增加肿瘤ROS水平将导致生存的提高。由于许多化学治疗剂和放射疗法诱导ROS，将这种饮食与标准抗癌治疗相组合的潜力优异。
实施例2(图5和表1)
方法
将HCT116(每孔6,000个细胞)、DLD1(每孔6,000个细胞)和SW480(每孔10,000个细胞)细胞接种在96孔板中含有或缺少丝氨酸和甘氨酸(但含有所有其他氨基酸)的培养基中。6小时后，向板添加所述剂量(从0.1-10μM 范围)的所述药物，并且细胞再温育持续48小时。此后，将细胞固定在福尔马林(4％)溶液中，并用DAPI核染色剂染色。使用Operetta系统进行细胞计数。结果示于图5中。
将人细胞系HCT116、DLD1和SW480接种到96孔板中在存在所有其他氨基酸并以100μM含有丝氨酸、甘氨酸和半胱氨酸的完整培养基中，或者在存在所有其他氨基酸的低丝氨酸、甘氨酸、半胱氨酸(17-23uM)培养基中。6小时后，向孔中加入所述化学治疗剂(以0.01、0.1和1μM的剂量)，将细胞再温育持续48小时。此后，将细胞用福尔马林固定并用荧光核染色剂染色，用于自动(Operetta)读板器上的细胞计数。细胞数目数据用于推导协同作用得分，以计算当与低丝氨酸/甘氨酸/半胱氨酸组合给予时，哪些药物具有协同作用(即大于加和性作用)(见下文)。结果在表1中示出。
图5中示出的数据表明，当与丝氨酸和甘氨酸饥饿组合时，多种抗癌化学治疗剂(来自多种药物类别)在人类癌细胞中具有增强的抗增殖活性。因此，这一数据表明，在癌症患者中将不含丝氨酸和甘氨酸的饮食与常规化学疗法相组合可以增强化学疗法的抗肿瘤活性，和/或允许它们以较低的剂量使用。
表1示出了特定药物与培养基中丝氨酸、甘氨酸和半胱氨酸减少的组合对三种结肠直肠癌细胞系的平均协同作用得分。
表1
表1中示出的数据示出了，暴露于低浓度的丝氨酸、甘氨酸和半胱氨酸(正如当服用不含丝氨酸和甘氨酸或不含丝氨酸、甘氨酸和半胱氨酸的食物时体内的情况)的人类癌细胞对多种化学治疗剂的抗增殖效果更敏感。对于表1中列出的化学治疗剂，当与低丝氨酸、甘氨酸和半胱氨酸组合时，对抗增殖活性有协同作用；即，每种剂联合氨基酸限制的抗增殖效果大于单独给予的剂的抗增殖效果或单独给予的氨基酸限制效果的总和。因此，这些数据表明，在癌症患者中将不含丝氨酸和甘氨酸/丝氨酸、甘氨酸和半胱氨酸的饮食与常规化学疗法相结合可以增强化学疗法的抗肿瘤活性，和 /或允许它们以较低的剂量使用。
实施例3(图6、图7、图10和图11)
方法
将C57BI6小鼠(每个饮食组n＝3只)喂食对照饮食(参见上文的“饮食2- 对照”)，或者缺少丝氨酸和甘氨酸的饮食(上文的“饮食2-无Ser，无Gly”) 持续六周。如上文所描述的通过LCMS分析末端血清样品，示出了所有非必需氨基酸的相对量。*P<0.05不成对t检验。结果示在图6中。
细胞培养：HCT116和RKO细胞是Bert Vogelstein教授的礼物。从ATCC获得SW480、A549、MDA-MB-231、MDA-MB-468和MCF7细胞。除非另有说明，细胞培养产物从Gibco获得；目录号示出在括号中。将细胞在37℃在空气中5％CO2的潮湿化的环境中生长。将储备细胞保持在补充有10％胎牛血清(FBS；10270)和青霉素-链霉素的McCoy's 5A培养基 (26600)中，或者在补充有10％FBS(G10270)、2mM L-谷氨酰胺和青霉素 -链霉素的DMEM(21969)中。对于饥饿实验，用MEM(21090)配制缺乏丝氨酸和甘氨酸的“测定培养基”，其补充有透析的FBS(HyClone，Thermo Scientific)、2mM L-谷氨酰胺、D-葡萄糖(Sigma-Aldrich；最终浓度17mM)、 MEM维生素(11120)和青霉素-链霉素。
摄取/释放测定：将所述细胞接种在完全培养基中在6孔板中(以适当的接种密度，在测定结束时为～90％融合)，并允许生长持续48小时(培养基在24小时后更新)。在测定开始时，用PBS洗涤细胞，并且每孔接受1.5 ml补充有丝氨酸和甘氨酸(0.4mM)的测定培养基。在所述的时间点，取出 10μl的培养基，并添加到490μl冰冷甲醇/乙腈/H2O(50:30:20)中。如下所述，制备这些样品用于LC-MS。
液相色谱法-质谱法：将样品在4℃振荡持续10分钟，然后在16,000xg 离心持续15分钟，并且收集上清液并由LC-MS分析。分析物以SeQuant ZIC-pHILIC柱(2.1x150mm,5μl)(Merck)使用亲水相互作用液相色谱法分离，并且使用符合Accela自动进样器和Accela600泵(Thermo Scientific) 的Orbitrap Exactive使用高分辨率、精密质谱法检测。洗脱缓冲液为：乙腈用于缓冲液A和H2O中的20mM(NH4)2CO3和0.1％NH4OH用于缓冲液B。编程了线性梯度，从80％缓冲液A开始，并在20分钟后结束于20％缓冲液A，随后以100μl/min的流速进行洗涤(20％缓冲液A)和再平衡(80％缓冲液A)步骤。质谱仪配有电喷雾-电离探针，并且以全扫描和极性切换模式运行，正电压为4.5kV，并且负电压为3.5kV。丝氨酸和甘氨酸的水平通过在细胞裂解物和培养基中刺入的五点校准曲线来定量。代谢物鉴定和数据分析使用LCQUAN软件(Thermo Scientific)进行。结果示于图7中。
结果
图7中示出的数据表明，即使当存在膳食半胱氨酸/胱氨酸时，从饮食中去除丝氨酸和甘氨酸也会导致体内半胱氨酸/胱氨酸水平的耗竭。这种效果很可能发生，因为丝氨酸被用来从头合成半胱氨酸(参见图10和图11)。该数据还表明，甲硫氨酸(一种必需氨基酸，也是体内半胱氨酸的前体)的膳食限制可能会进一步耗竭体内的全身半胱氨酸水平。图7中示出的数据示出，多种形式癌症的癌细胞系贪婪地消耗外源半胱氨酸/胱氨酸，这表明癌细胞需要外源半胱氨酸来生长，并且对于半胱氨酸从头合成可能是有缺陷的(参见图10和图11)。
实施例4(图8、图9、图12和图13)
方法
将所述细胞以每孔2×10^4M至1×10^5细胞接种到24孔板中，并允许粘附过夜。然后用PBS洗涤细胞一次，并添加实验生长培养基。培养基是含有丝氨酸、甘氨酸、半胱氨酸和所有其他氨基酸的完全的(+SGC)，或只缺少丝氨酸和甘氨酸(-SG)，或只缺少半胱氨酸(-C)。使用单独的“时间零点”计数板记录起始细胞数。每24小时更换一次培养基，并且在2天和4天后计数板。相对细胞数通过与“时间零点”时的细胞数进行比较来计算。为了计数，将细胞胰蛋白酶化，重新悬浮在PBS-EDTA中，并且用CASY模型TT细胞计数器(Innovatis,Roche Applied Science)计数。数据是一式三个孔的平均值，误差条是标准差。结果示于图8中。
将所述细胞接种在在24孔板(每孔2x10^4至1x10^5细胞)中含有所述浓度(从500uM到0.16uM范围)的丝氨酸、甘氨酸和半胱氨酸(但富含所有其他氨基酸)的培养基中，并且在48h后计数。为了计数，将细胞胰蛋白酶化，重新悬浮在PBS-EDTA中，并且用CASY模型TT细胞计数器(Innovatis, Roche Applied Science)计数。结果示于图9中。
将所述细胞以每孔2×10^4M至1×10^5细胞接种到24孔板中，并允许粘附过夜。然后用PBS洗涤细胞一次，并添加实验生长培养基。培养基是含有所有氨基酸的完全的(+所有AA)，或只缺少丝氨酸和甘氨酸(-Ser Gly)，或缺少丝氨酸、甘氨酸、天冬酰胺、天冬氨酸、脯氨酸和谷氨酸(-Ser Gly Asn Asp Pro Glu)，或缺少丝氨酸、甘氨酸和酪氨酸(-Ser GlyTyr)，或缺少丝氨酸、甘氨酸和半胱氨酸(-Ser Gly Cys)，或缺少丝氨酸、甘氨酸和精氨酸(-Ser Gly Arg)。使用单独的“时间零点”计数板记录起始细胞数。每24小时更换一次培养基，并且在2天和3天后计数板。相对细胞数通过与“时间零点”时的细胞数进行比较来计算。为了计数，将细胞胰蛋白酶化，重新悬浮在 PBS-EDTA中，并且用CASY模型TT细胞计数器(Innovatis,Roche Applied Science)计数。数据是一式三个孔的平均值，误差条是标准差。结果示于图 12中。
将HCT116细胞以每孔4×10^4细胞接种到24孔板中，并允许其粘附过夜。然后用PBS洗涤细胞一次，并添加实验生长培养基。培养基是含有所有20种氨基酸的完全的，或缺少所述的单个氨基酸(酪氨酸/精氨酸/半胱氨酸)，或缺少所述氨基酸的组合(酪氨酸/精氨酸/半胱氨酸/丝氨酸/甘氨酸)。使用单独的“时间零点”计数板记录起始细胞数。每24小时更换一次培养基，并且在4天后计数板。通过与“时间零点”时的细胞数进行比较来计算细胞数的变化，并计算为百分比(时间零点＝100％)。例如，对于处于完全培养基中的细胞，相比时间零点，四天后的细胞数是1400％。从时间零点变化为负％的细胞发生细胞死亡，并呈现在x轴下方。为了计数，将细胞胰蛋白酶化，重新悬浮在PBS-EDTA中，并且用CASY模型TT细胞计数器 (Innovatis,Roche Applied Science)计数。数据是一式三个孔的平均值，误差条是标准差。结果示于图13中。
结果
图8和图9中的数据示出，外源半胱氨酸的去除抑制了来自多种类型癌症的癌细胞生长，并且半胱氨酸的体外去除在抑制癌细胞增殖方面非常有效，比单独使用丝氨酸和甘氨酸饥饿实现更大的增殖抑制。图12示出了，被去除(即细胞受其饥饿)的外源非必需氨基酸的特定组合决定癌细胞增殖被抑制的程度。通过去除天冬氨酸、天冬酰胺、脯氨酸和谷氨酸，单独去除丝氨酸和甘氨酸的抗增殖效果得到了最小程度的增强。然而，酪氨酸、精氨酸或半胱氨酸单独与丝氨酸和甘氨酸联合的额外去除对增殖具有更显著的影响。图13进一步示出，当从癌细胞中去除半胱氨酸或非必需氨基酸的特定组合时，可以获得细胞毒性效果(即，不仅仅是抗增殖活性)，并且当去除多种非必需氨基酸时，这种效果最大。
实施例5(图14)
方法
丝氨酸合成通路酶(PHGDH、PSAT1和PSPH)的表达通过蛋白质印记 (如上文所描述)在含有或不含有丝氨酸和甘氨酸生长持续48h的所述癌细胞系(左上图)中确定。将所述细胞以每孔2×10^4至1×10^5细胞接种到24 孔板中，并允许粘附过夜。然后用PBS洗涤细胞一次，并且添加含有或不含有丝氨酸和甘氨酸的生长培养基(两种培养基含有所有必需氨基酸和半胱氨酸、精氨酸、谷氨酰胺和酪氨酸)。使用单独的“时间零点”计数板记录起始细胞数。每24小时更换一次培养基，并且在2天和4天后计数板。相对细胞数通过与“时间零点”时的细胞数进行比较来计算。为了计数，将细胞胰蛋白酶化，重新悬浮在PBS-EDTA中，并且用CASY模型TT细胞计数器(Innovatis,Roche Applied Science)计数。数据是一式三个孔的平均值，误差条是平均值的标准误差。结果示于图14中。
结果
图14中的数据示出了癌细胞具有不同水平的进行丝氨酸从头合成的酶的表达，并且这些蛋白的表达影响细胞对丝氨酸和甘氨酸饥饿的敏感性。因此，表达高水平丝氨酸合成酶的细胞抵抗丝氨酸和甘氨酸饥饿的抗增殖作用，但表达低的那些是敏感的。
实施例6(图15、图16和图17)
方法
将所述细胞接种在完全培养基中在6孔板中(以适当的接种密度，在测定结束时为～90％融合)，并允许生长持续48小时(培养基在24小时后更新)。在测定开始时，用PBS洗涤细胞，并且每孔接受1.5ml补充有丝氨酸和甘氨酸二者(0.4mM)或仅丝氨酸(0.4mM)的测定培养基(含有所有必需氨基酸、谷氨酰胺、精氨酸、酪氨酸和半胱氨酸)。在所述的时间点，取出10μl 的培养基，并添加到490μl冰冷甲醇/乙腈/H2O(50:30:20)中。如上所述，制备这些样品用于LC-MS并通过LC-MS进行分析。结果示于图16和17 中。
结果
图15、图16和图17中的数据示出，癌细胞示出用于半胱氨酸从头合成的净流出(即释放)前体。同型半胱氨酸衍生自甲硫氨酸，并且对哺乳动物细胞中半胱氨酸的从头合成至关重要(也参见图10和图11)。同型半胱氨酸以各种形式从这些癌细胞中丧失，这可能促进它们不能制造半胱氨酸，并且因此对半胱氨酸饥饿敏感，并且可以作为未改变的分子(同型半胱氨酸) 或同型二聚体(同型胱氨酸)和异型二聚体(与半胱氨酸的二聚体)通过质谱法检测。
实施例7(图24、图25、图26、图27、图28、图29、图30、图31)
细胞系和细胞培养物
从ATCC获得HCT116细胞，并使用Promega GenePrint 10进行验证。 iKRAS细胞(iKRAS1、iKRAS3、AK196)由Ronald DePinho教授(Ying等人， Cell，2012)，(TheUniversity of Texas MD Anderson Cancer Center)友好地提供。细胞培养基购自GIBCO，产品编号示出在括号中。将iKRAS (DMEM-21969)和HCT116细胞(RPMI-1640-31870)保持在补充有10％FBS (10270)、青霉素-链霉素和两性霉素的所述培养基中，具有2mM的L-谷氨酰胺最终浓度。在多西环素2μg/ml(KRAS-ON)的存在下和在有/没有多西环素(KRAS-ON/OFF)的培养基中生长储备iKRAS细胞用于实验。将细胞保持在37℃、5％CO2湿润的培养箱中。使用Mycoalert检测试剂盒(Lonza) 对培养的细胞进行对于支原体的常规检测。
增殖测定
将HCT116细胞(每孔2.5×10^4)接种在24孔板中的完全RPMI培养基中，并允许粘附过夜。然后用PBS洗涤细胞，并接受补充有不同浓度丝氨酸和甘氨酸的改良的MEM培养基2。每24小时用新鲜的培养基替换培养基。在所述的时间点对孔进行计数(使用Casy TT细胞计数器,Innovatis, Roche Applied Science)，使用“time＝0”板计算从培养基变化起的相对细胞数。
肿瘤类器官培养物
ADF＝Advanced DMEM/F-12，含有2mM谷氨酰胺、1％青霉素/链霉素溶液、0.1％AlbuMAX I BSA，10mM HEPES(均为Gibco/Life Technologies)。切除腺瘤性小肠组织，并且切成较小的块，并且用冰冷的 PBS洗涤5次。将块在4℃在5mM EDTA中在滚筒上温育持续10分钟。用冰冷的PBS洗涤滤胞腺2次以去除EDTA，并在10x胰蛋白酶中在37℃温育持续30分钟。收集富集滤胞腺的上清液，并用5ml ADF通过机械移液洗涤约5次。通过以1200rpm离心持续5分钟来沉淀滤胞腺。将滤胞腺重新悬浮在生长因子减少的基质胶(BD Biosciences)中，并在12孔板中每孔铺板20μl。允许基质胶在37℃培养箱中固化持续30分钟，随后添加适当的补充有0.05μg/ml EGF和0.1μg/ml头蛋白的ADF(每孔总体积1ml)。通过在冰冷的PBS中收获而分开滤胞腺，并以600rpm旋转沉降持续3分钟。吸取上清液，并用100μl冰冷的PBS使用机械移液分离沉淀物。向试管中添加5ml PBS，并以600rpm旋转沉降持续3分钟，重复直到上清液中没有碎片。用生长因子减少的基质胶重新悬浮最终的滤胞腺沉淀物，并如前所述进行铺板。对于SG饥饿，使用不含氨基酸的Advanced DMEM/F-12(Gibco/LifeTechnologies)构建用于类器官的含有或不含丝氨酸和甘氨酸(0.2mM)、包含所有其他氨基酸的测定培养基。为了LCMS分析，将类器官在12孔板中在完全培养基中生长持续三天。抽吸培养基并用PBS洗涤类器官。将培养基用不含葡萄糖的补充有15mM 13C6-葡萄糖 (CK-Gas/Cambridge Isotopes)的Advanced DMEM/F-12(Gibco/Life Technologies)替代。5小时后抽吸培养基，在PBS中短暂洗涤类器官，并如下所述提取代谢物。
类器官成像
将类器官接种在有或没有二甲双胍/柔红霉素(均来自Sigma)的所述培养基中，并允许生长持续两天。使用光学显微镜拍摄用于尺寸定量的图像 (使用ImageJ软件进行)，然后将类器官固定在4％多聚甲醛中。通过用抗丙二醛(MDA)(Abeam，ab6463)免疫染色类器官，用Alexa Fluor 594二级抗体(Thermo Fisher Scientific)评估ROS损伤。将图像在Olympus FV1000 倒置激光扫描共聚焦显微镜上捕获，并且MDA染色使用ImageJ软件定量。
液相色谱质谱法(LCMS)
样品在由甲醇、乙腈和H2O(50∶30∶20)组成的冷(-20℃)裂解溶剂(LS) 中制备。将10μl的血清(从末端出血分离并储存在-80℃)样品添加到490μl 的LS中，并涡旋，通过离心(在4℃以15000rpm持续10分钟)清除沉淀的蛋白质。通过用过量的PBS短暂洗涤孔，然后每孔加入250μl LS，并在4℃放置在摇摆摇床(rocking shaker)上持续10分钟来制备类器官提取物，从孔中去除LS(没有对类器官/基质胶的机械破坏)，并且然后涡旋并通过离心清除。将组织样品快速冷冻并储存在-80℃。裂解前，称重冷冻样品。然后使用Precellys匀浆器(Bertin Technologies)或TissueLyser II(Qiagen)将组织在1ml冷LS中匀化。通过离心清除裂解物的蛋白质，并且匀化后用基于原始组织重量的LS将裂解物浓度标准化至10mg/ml。
提取物在由Accela 600LC系统和精密质谱仪(Thermo Scientific)组成的LCMS平台上进行分析。在MS检测之前，两种LC方法应用于代谢物分离。方法1采用了SeQuant ZIC-pHILIC柱(2.1mm×150mm，5μm)(Merck)，将流动相由A＝碳酸铵20mM(调节至pH 9.4)和B＝乙腈混合。使用梯度程序，其从20％的A开始并且2分钟后线性增加，到17分时增加到80％，随后进行洗涤和再平衡步骤。方法1的总运行时间为25分钟。方法2采用了ZIC-HILIC柱(4.6mm x 150mm，3.5μm)(Merck)，将流动相由A＝有 0.1％甲酸(v/v)的水和B＝有0.1％甲酸的乙腈混合。使用梯度程序，其从20％的A开始并且线性增加到30分时的80％，随后进行洗涤和再平衡步骤。方法2的总运行时间为46分钟。将LC流在HESI探针中去溶剂化及电离。精密质谱仪在75-1,000m/z的质量范围内以全扫描模式运行，分辨率为 50000，具有极性切换。使用在与分析样品匹配的相关基质中稀释的13C-15N 标记的氨基酸(Sigma)通过6点标准曲线实现丝氨酸和甘氨酸的LCMS定量。由LCquan(Thermo Scientific)和MZMine 2.10对原始数据对于代谢物的鉴定和定量进行分析。
无偏的代谢组学
使用ProteoWizard将原始LCMS数据转换为mzML文件，并导入到 MZMine 2.10中进行峰提取和样品比对。将生成的.CSV文件导入到内部宏 (Microsoft Excel 2010)中，用于代谢物鉴定和背景信号的去除。先前已经描述了详细的程序和设置参数(Zhang等人,PLoSOne，2013)。SIMCA 14 (Umetrics)用于多变量分析。在OPLS-DA(正交偏最小二乘判别分析)模型中产生S图，用于靶向最有影响的代谢物。
饮食
从断奶开始，小鼠任意地接受“正常食物”(Rat and Mouse Breeder and Grower,801730,Special Diet Services,SDS,UK)和水。正常食物情况下，膳食氨基酸来源于原料(小麦、麸皮粉、大麦、去皮提取的烤大豆、玉米和鱼粉)中含有的全蛋白，并添加少量纯化的赖氨酸作为补充剂。使用两组实验饮食，两者都基于来自TestDiet(Richmond，IN)的Baker纯化氨基酸饮食 (Baker Purified Amino Acid Diet)(Hirakawa等人，Nutr.Res.1984)：
“饮食1-对照”包含所有必需氨基酸加上丝氨酸、甘氨酸、谷氨酰胺、精氨酸、胱氨酸和酪氨酸；“饮食1-不含SG”与饮食1-对照相同，但是不含丝氨酸和甘氨酸，其他氨基酸水平成比例增加，以达到相同的总氨基酸含量。先前使用过这些“饮食1”制剂(Maddocks等人，Nature，2013)。“饮食2-对照”包含所有必需氨基酸加上丝氨酸、甘氨酸、谷氨酰胺、精氨酸、胱氨酸、酪氨酸、丙氨酸、脯氨酸、谷氨酸和天冬酰胺；“饮食2-不含SG”与饮食2-对照相同，但是不含丝氨酸和甘氨酸，其他氨基酸水平成比例增加，以达到相同的总氨基酸含量。“饮食2”制剂用于Eμ-Myc；Tigar-/-群组使用(图2f)。所有其他群组接受之前公布的“饮食1”制剂。
小鼠-GEM模型
所有动物研究根据1986年《动物(科学程序)法》(Animals(ScientificProcedures)Act 1986)和2010年欧盟指令(EU Directive 2010)(PPLs 60/4181, PPL70/8645&70/8646)进行，并得到了当地伦理审查程序(格拉斯哥大学)(University ofGlasgow)的批准。将小家鼠群组圈养在一个主动环境富集的有挡板的设施中。先前描述了Εμ-Myc(Adams等人，Nature 1985)、 ApcMin/+(Moser等人，Science，1990；Su等人，Science，1992)Lgr5creER； Apcfl/fl(Barker等人，Nature，1990)以及Pdx1cre；KrasG12D/+；Trp53fl/+或Pdx1cre； KrasG12D/+；Trp53R172H/+(Hingorani等人，Cancer Cell，2005；Morten等人，Proc.Natl.Acad.Sci.USA，2010)小鼠/模型。对于每种基因型使用混合的雄性和雌性群体。每个图/图例中示出了小鼠的数(或来自个体小鼠的样品数)。Εμ-Myc和ApcMin/+小鼠为至少20代C57BL/6J(BI6)。Eμ-Myc；Tigar-/-为混合株但至少50％C57BL/6J。胰腺(PDAC)群组处于混合品系背景，但所有群组受到了同窝仔匹配对照的损害(but all cohorts compromisedof litter-matched controls)。小鼠在以下的时间开始适当的饮食：Εμ-Myc(BI6) 出生后60天，Εμ-Myc；Tigar-/-出生后55天，ApcMin/+出生后80天，Lgr5creER； Apcfl/fl诱导后7天，Pdx1cre；KrasG12D；Trp53fl/+或Pdx1cre；KrasG12D；Trp53R172H/+出生后60天。两次腹腔注射120mg/kg他莫昔芬诱导通过Lgr5creER重组，两次注射之间休息一天。对于苯乙双胍实验，从饮食变化的同一天开始每天用100mg/kg小鼠体重灌胃Εμ-Myc小鼠。对于二甲双胍实验，ApcMin/+小鼠从饮食改变四天后开始，在它们的饮用水给予200mg/kg/天。将 VillincreER；APCfl/+；KrasG12D/+小鼠[C57BI/6J N10]在6-8周龄时置于实验饮食，保持置于饮食持续两周，并且然后用单次IP注射他莫昔芬(80mg/kg) 诱导。将肠固定在甲氧基乙酰苯胺(4:2:1比率的甲醇、氯仿、乙酸)中，以便于肿瘤数量和面积(宽度x长度)的评分。除了用于BrdU和胱天蛋白酶染色使用的n＝6只APCmin/+小鼠外，将所有其他GEM小鼠带到了人道临床终点。
用于小鼠研究的样品规模根据以前使用这些模型的经验估算，这些模型通过Mantel-Cox(对数秩)分析测试存活的潜在差异。在收集了第一个实验组的数据后(例如，仅置于饮食的Εμ-Myc和APCMin/+组，图18a和图18b)，后续的组缩小了规模，以使使用的动物数最少(例如，苯乙双胍和二甲双胍治疗组，图19a和图19b)。在所有实验中，在参加研究时具有明显表型的小鼠被排除在外(即未参加)：例如，在Εμ-Myc群组中扩大的淋巴结或扩大的胸腺的迹象，在APCMin/+群组中的贫血。由于与肿瘤无关的疾病而死亡的动物被包括为审查观察(censored observation)。根据随机区块设计，小鼠被分配到实验组：随着通过繁殖小鼠变得可用，将它们基于性别分成多个区块，并且然后随机分配到治疗臂。注意保持雄性/雌性比率相似，以消除性别作为变异性的潜在来源。将小鼠分配到实验组以及收集终点数据的研究者并不是盲的。
小鼠-异种移植/同种移植
通过双侧皮下注射(每侧3×10^6个细胞)将HCT116细胞植入 CD1-Foxn1nu(CD1-裸)雌性小鼠(Charles River，UK)。将小鼠维持在正常食物，并且每天监测，直到形成可见的、可测量的肿瘤。将携带肿瘤的小鼠置于对照(n＝8只小鼠)或不含SG饮食(n＝8只小鼠)，每周用卡尺测量肿瘤三次，在饮食改变后发展的任何相对侧肿瘤(opposing flanktumour)不在分析范围内。对于置于饮食的前五周，绘制平均肿瘤体积。使用公式计算肿瘤体积；体积＝(长度x宽度2)/2。
通过FACS从混合背景的Εμ-Myc小鼠的携带有肿瘤的淋巴结中分离Εμ-Myc淋巴瘤细胞。这些细胞最初在用辐照过的小鼠胚胎成纤维细胞 (MEF)的细胞培养基中扩增并传代，直到它们能够独立生长。培养基是补充有10％FBS、50μMβ-巯基乙醇、青霉素、链霉素、庆大霉素和两性霉素的DMEM/F-12(Gibco/Life Technologies)。通过双侧皮下注射(每侧5×10^5个细胞)将细胞植入CD1-Foxn1nu雌性小鼠(Charles River，UK)。将小鼠维持在正常食物，并且每天监测，直到形成可见的、可测量的肿瘤。
将携带肿瘤的小鼠置于对照或不含SG的饮食中，每2/3天用卡尺测量肿瘤。一旦群组中的第一只小鼠达到临床终点(最大允许肿瘤体积)，将群组中的所有小鼠杀死并且切除肿瘤(这发生在置于饮食6天后)。将肿瘤固定在福尔马林中，石蜡包埋，并且切片进行组织学检查。
BrdU和胱天蛋白酶染色以及坏死定量
处死前两小时，将小鼠注射了250ul含有BrdU的细胞增殖标记试剂 (RPN201，Amersham/GE Heathcare)。使用的抗体：切割的胱天蛋白酶3 ASP-175(Cell SignalingTechnology，9661)、抗BrdU(BD Biosciences, 347580)和EnVision抗兔(Dako，K4003)。组织切片用苏木精Z(CellPath) 复染。使用Leica SCN400F扫描仪扫描染色载玻片，并且使用HALO图像分析软件(Indica Labs)进行分析。对于Εμ-Myc肿瘤细胞数和BrdU和胱天蛋白酶染色，跨整个肿瘤定量，不包括坏死区域。对于APCmin/+小鼠，分析整个小肠的单个横截面，手动鉴定腺瘤，定量在每个腺瘤中的细胞数、胱天蛋白酶和BrdU染色，并对每个小鼠取平均值。坏死用H&E染色的整个肿瘤横截面定量，坏死区域用HALO软件手动定义，并且计算总坏死对非坏死表面积。
葡萄糖和乳酸盐(lactate)定量
根据制造商的说明，使用Agilent 2100 Bioanalyser(Agilent Technologies)对来自小鼠群组的血清(来自末端血液样品)进行对于葡萄糖和乳酸盐水平的分析。
巨胞饮作用测定
巨胞饮作用的分析基于先前描述的方案(Commisso等人，Nature，2013)。最初，用多西环素(KRas-开)或不用多西环素(KRas-关)生长iKRAS细胞持续48小时。然后将细胞接种到玻璃盖玻片上的培养基+/-多西环素和+/-SG 中。24小时后，用缺少FBS的匹配培养基替换培养基，并且再放置持续 16小时。最后，用含有10％FBS和四甲基罗丹明标记的葡聚糖(TMR-葡聚糖，Thermo Fisher Scientific)颗粒(0.5mg/ml)的匹配培养基替换培养基。与葡聚糖一起30分钟后，用PBS洗涤细胞并固定在4％甲醛中。用DAPI和绿色Whole CellStain(Thermo Scientific)对细胞进行复染，并封固在 Vectasheild Hardset(VectorLaboratories)中。图像在Olympus FV1000倒置激光扫描共焦显微镜上拍摄并且使用ImageJ/Fiji图像分析软件对葡聚糖摄取进行定量。
蛋白质印迹法(Western Blot)
对细胞的蛋白质印迹如先前所述进行(Maddocks等人，Nature，2013；Labuschagne等人，Cell.Rep.，2014；Maddocks等人，Mol.Cell,2016)，简而言之，在补充有完全蛋白酶抑制剂(Roche)、原钒酸钠和氟化钠(两者都是Sigma)的RIPA缓冲液中制备全细胞蛋白质裂解物。使用TissueLyser II (Qiagen)将组织样品在补充有蛋白酶和磷酸酶抑制剂混合液(Pierce/Thermo Scientific)的RIPA缓冲液中裂解。通过离心清除裂解物，使用预制的4-12％的“NuPAGE”或“Bolt”凝胶(Invitrogen，Life Technologies)分离，并转移到硝酸纤维素膜上。使用Li-Cor Odyssey红外扫描仪和软件(Li-Cor Biosciences) 检测和定量蛋白质。对于相关物质的次级抗体是IRDye680和缀合的 IRDye800(Li-CorBiosciences)。使用的初级抗体是：PHGDH(Sigma Life Science，HPA 021241)、PSAT1(Novus Biologicals，NBP1-32920)、PSPH (Santa Cruz，sc-98683)、肌动蛋白I-19-R(Santa-Cruz，sc-1616-R)、pERK[磷酸-p44/p42MAPK(Erk 1/2)(Thr202/Tyr204)](CellSignalling Technology 9101)、AMPKa1(R&D Systems，AF3197)和磷酸-AMPK T172(CellSignalling Technology 2535)。
统计数据
使用Mantel-Cox(对数秩)检验、Graphpad Prism(v6)软件计算存活数据的统计比较。T检验使用微软excel(v14.6.1)，或使用Graphpad Prism(v7) 进行。使用1型/配对的(例如取自同一动物的样本)和2型/未配对的(例如取自不同动物的样本)T检验。在没有做出潜力差方向预测的情况下，使用双侧/双尾T检验(例如，跨血清样品中所有氨基酸水平，图1c/延伸的数据图2a)。在预先存在的数据支持样本间差异方向的预测的情况下，使用单侧/单尾T检验(例如丝氨酸从头合成，图4c)。当呈现的数据是单个数据点的平均值时，误差条是STDEV，当数据是平均值的平均值时，误差条是 SEM。在每种情况下，相关类型的T检验或误差条在图例中指明。在T检验使用进行多次比较进行的情况下，使用Graphpad Prism(v7)软件使用 Holm-Sidak方法校正P值。
结果
无偏的代谢组学示出了，置于-SG饮食的Εμ-Myc肿瘤组织(带有肿瘤的脾脏)中减少最多的代谢物是丝氨酸和甘氨酸，这表明该饮食特别降低了丝氨酸和甘氨酸的肿瘤水平(图24)。
-SG饮食对体内Εμ-myc肿瘤细胞的效果示出，在一些肿瘤中存在凋亡增加(如裂解的胱天蛋白酶-3(CC3)增加所示)，并且在其他肿瘤中存在坏死增加，这两种效果都导致肿瘤生长的抑制或减慢(图25)。
当置于对照和-SG饮食生长时，也分析了来自PDAC和Eu-myc模型的肿瘤组织中SSP酶的表达。这些结果表明，Kras在体内控制SSP(图26)。此外，观察到表达Kras的肿瘤类器官(3D细胞培养物)更能抵抗丝氨酸和甘氨酸饥饿，这也表明Kras控制SSP(图28)。
此外，-SG饮食导致在Eu-myc肿瘤(其对-SG饮食敏感)中降低的丝氨酸和甘氨酸水平，以及降低的GSH/GSSG比率(氧化应激的迹象)。但是，在PDAC肿瘤(其携带Kras突变，并且对饮食有抗性)中，-SG饮食没有降低甘氨酸水平或GSH/GSSG比率(图27)。
-SG饮食降低了已经在体内形成的异种移植的HCT116肿瘤的生长(图 29a)，降低了肿瘤内丝氨酸和甘氨酸水平(图29b)。更低的丝氨酸和甘氨酸的肿瘤水平转化为更低的体外癌细胞增殖(图29c和图29d)。
图30中的数据示出了，Kras(在iKRAS1iKRAS3和AK196细胞系中) 获得丝氨酸和甘氨酸的能力不能用微胞饮(一种营养清除形式)来解释，这进一步支持了Kras表达细胞通过从头丝氨酸和甘氨酸合成获得另外的丝氨酸和甘氨酸的想法。巨胞饮作用允许细胞通过吞噬胞外分子(诸如蛋白质，其可以分解代谢成氨基酸)来捕获和使用细胞外营养。在培养的细胞中，巨胞饮作用的上调对应于标记的葡聚糖的摄取的增加，以及葡聚糖染色面积％(细胞)的增加。在所有三种Kras可诱导细胞系中，在丝氨酸和甘氨酸饥饿期间，标记的葡聚糖的摄取没有增加，这表明丝氨酸和甘氨酸饥饿并没有导致巨胞饮作用增加。
图31a和31b中示出的数据显示，柔红霉素(一种常规抗癌剂)与丝氨酸和甘氨酸饥饿一起作用，以增加肿瘤类器官中的活性氧物质水平并减少肿瘤类器官生长。
实施例7(图32、图33、图34、图35、图36、图37、图38、图39、图40)
方法
细胞系和细胞培养物
HCT116、SW480、MDA-MB-231、Panc10.05、CFPAC-1、SW1990、 BxPC-3、AsPC-1、PANC-1、MIA PaCa-2细胞原始地从ATCC获得，并且随后使用Promega GenePrint 10进行验证。将乳腺癌和结肠直肠癌细胞在补充有10％FBS(10270)、最终浓度为2mM的具有L-谷氨酰胺的青霉素- 链霉素和两性霉素的DMEM(Gibco-21969)中生长。将胰腺癌细胞系在补充有10％FBS(10270)、最终浓度为2mM的具有L-谷氨酰胺的青霉素-链霉素和两性霉素、以及胰岛素-转铁蛋白硒溶液(Gibco)1:500的 RPMI-1640(Gibco-31870)培养基中生长。将细胞保持在37℃、5％CO2湿润的培养箱中。使用Mycoalert检测试剂盒(Lonza)对培养的细胞进行对于支原体的常规检测。
用于缺失MTAP和非靶向对照的引导RNA
MTAP_gRNA_1F序列一CACCGGTTTTGCCCCAAAACGAGAG
MTAP_gRNA_1R序列一AAACCTCTCGTTTTGGGGCAAAACC
MTAP_gRNA_2F序列二CACCGGCCTGGTAGTTGACCTTTGA
MTAP_gRNA_2R序列二AAACTCAAAGGTCAACTACCAGGCC
NTC_gRNA_1F CACCGAAAATAGCAGTAAACTCAAC
NTC_gRNA_1R AAACGTTGAGTTTACTGCTATTTTC
根据Ran等人(2013)，gRNA序列与支架RNA一起用于制备sgRNA。
增殖测定
将细胞(4x 10^4-1x 10^5)接种在24孔板中的完全RPMI培养基或DMEM培养基中，并允许粘附过夜。然后用PBS洗涤细胞，并接受补充有所述氨基酸/代谢物/药物的测定培养基。基于RPMI-1640培养基配制测定培养基，但缺少氨基酸，其根据测定单独添加。测定培养基还补充有
另外的维生素B6(20uM)，这是用于半胱氨酸合成的辅助因子。在所述的时间点对细胞进行计数(使用Casy TT细胞计数器、Innovatis,Roche Applied Science)，使用“time＝0”板计算从培养基变化起的相对细胞数。
显微术
图像是用Zeiss光学显微镜以20倍放大倍数捕获的，其与具有Zeiss Zen软件的Zeiss Axiocam数码相机相耦联。
液相色谱质谱法(LCMS)
将细胞在补充有所述氨基酸/代谢物的测定培养基中生长。通用标记的碳-13甲硫氨酸从Cambridge Isotopes/CKGas购买。细胞提取物和培养基样品在由甲醇、乙腈和H2O(50∶30∶20)组成的冷(-20℃)裂解溶剂(LS)中制备。裂解物通过在裂解前计数重复孔基于细胞数来平衡。在向细胞/培养基样品中加入LS后，允许蛋白质沉淀并通过离心清除。提取物在由Accela 600LC系统和精密质谱仪(Thermo Scientific)组成的LCMS平台上进行分析。色谱法采用了ZIC-HILIC柱(4.6mm x 150mm，3.5μm)(Merck)，将流动相由A＝有0.1％甲酸(v/v)的水和B＝有0.1％甲酸的乙腈混合。使用梯度程序，其从20％的A开始并且线性增加到30分时的80％，随后进行洗涤和再平衡步骤。方法2的总运行时间为46分钟。将LC流在HESI探针中去溶剂化及电离。精密质谱仪在75-1,000m/z的质量范围内以全扫描模式运行，分辨率为50000，具有极性切换。由LCquan(Thermo Scientific)和 MZMine 2.10对原始数据对于代谢物的鉴定和定量进行分析。
蛋白质印迹法(Western Blot)
全细胞蛋白质裂解物在补充有蛋白酶和磷酸盐抑制剂混合液的RIPA 缓冲液(Pierce/Thermo Scientific)中制备。通过离心清除裂解物，使用预制的4-12％的“Bolt”凝胶(Invitrogen，Life Technologies)分离，并转移到硝酸纤维素膜上。使用Li-CorOdyssey红外扫描仪和软件(Li-Cor Biosciences) 检测和定量蛋白质。对于相关物质的次级抗体是IRDye680和缀合的 IRDye800(Li-Cor Biosciences)。使用的初级抗体是：兔抗MTAP(Abcam)。
数据展示
数据作为平均值绘制，伴随有误差条显示标准偏差。
半胱氨酸合成概述(图32)
半胱氨酸的合成始于必需氨基酸甲硫氨酸，其通过多个酶促步骤转化为半胱氨酸。多胺是对于细胞生长和增殖的关键分子，并且多胺合成在癌症中已经发现被上调。多胺合成要求甲硫氨酸衍生的代谢物dcSAM，其在多胺(精胺和亚精胺)合成过程中转化为MTA。MTA可以通过包括甲基硫腺苷磷酸化酶(MTAP)的多步酶促通路再循环回甲硫氨酸。当MTAP存在时，多胺合成中产生的MTA的再循环提供了有效的甲硫氨酸利用。然而，当 MTAP被缺失时(如癌症中经常发生的)，MTA不能再循环回甲硫氨酸，并从细胞中释放出来。这意味着恒定量的甲硫氨酸供给被转化为MTA并从细胞中排出。这种甲硫氨酸到多胺合成的持续转移可阻止甲硫氨酸用于其他目的如半胱氨酸合成的利用。
结果
我们已经发现，我们已经测试的所有癌细胞系在某种程度上对半胱氨酸剥夺敏感。值得注意的是，某些细胞系诸如MDA-MB-231被发现对半胱氨酸饥饿极其敏感，其导致细胞急剧死亡(图33、图40)。营养剥夺(诸如氨基酸饥饿)通常会减缓增殖，但不一定会导致剧烈细胞死亡，所以我们研究了为什么某些细胞系高度敏感。
虽然以前已经报道了半胱氨酸饥饿对癌细胞有害，并且这种敏感性可能是由于用于半胱氨酸合成的基因的失活(例如CBS基因的甲基化)，但我们的结果令人惊讶地示出，给细胞补充在CBS上游的代谢前体(同型半胱氨酸)达到从半胱氨酸饥饿的显著拯救(图39)。这表明，用于半胱氨酸合成的酶是存在的并且是活性的，但是存在关于用于半胱氨酸合成的上游前体 (诸如同型半胱氨酸)供应的问题。
虽然已经提出用于从头半胱氨酸合成的酶的表达，特别是CBS和CTH 的表达可以决定对半胱氨酸饥饿的敏感性，但是我们惊奇地发现，对半胱氨酸饥饿最剧烈地敏感的细胞是流出甲硫氨酸衍生的代谢物MTA的细胞 (图33、图34、图36、图32)。MTA流出与对半胱氨酸饥饿的剧烈敏感性密切相关(图33、图39、图36)。MTA流出是由编码酶MTAP的基因的失活或缺失引起的(图37)。MTAP的功能是将MTA再循环回甲硫氨酸，并且从而提供有效的甲硫氨酸代谢(图34、图35)。在没有MTA的情况下，大量甲硫氨酸被分流到多胺通路中，并且不是半胱氨酸合成通路(图34)。与此发现一致的是，AMD1(将甲硫氨酸衍生的SAM分流到多胺合成通路的酶)的抑制能够保护细胞免受对半胱氨酸饥饿的剧烈敏感性(即细胞死亡) (图40)。
在用饮食治疗癌症的情况下；根据我们的体外研究，大多数癌细胞系对半胱氨酸饥饿敏感，但一个子集特别敏感(图33)。我们的研究示出，丧失MTAP表达与对半胱氨酸饥饿的剧烈敏感性密切相关(图33)。失去 MTAP的细胞显示出半胱氨酸合成上游的代谢前体的分流(diversion)(图 34)。MTAP通常在癌症/肿瘤细胞中缺失/失活(Bertino等人，2011)。我们的发现表明，缺乏MTAP表达的肿瘤将会对半胱氨酸饥饿特别敏感。
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Claims (65)

1.一种膳食产品，所述膳食产品包含多种氨基酸，其中所述膳食产品包含所有必需氨基酸，并且其中所述膳食产品基本上缺乏至少两种非必需氨基酸。
2.根据权利要求1所述的膳食产品，其中所述膳食产品包含至少12种氨基酸。
3.根据权利要求1至2所述的膳食产品，其中至少一种所述基本上缺乏的非必需氨基酸选自由甘氨酸、丝氨酸、半胱氨酸、酪氨酸和精氨酸组成的组。
4.根据权利要求1至3中任一项所述的膳食产品，其中所述至少两种基本上缺乏的非必需氨基酸包含两种或更多种以下氨基酸：甘氨酸、丝氨酸、半胱氨酸、酪氨酸和精氨酸。
5.根据前述权利要求中任一项所述的膳食产品，其中所述膳食产品基本上缺乏：
a.甘氨酸、丝氨酸和半胱氨酸；
b.甘氨酸、丝氨酸和精氨酸；
c.甘氨酸、丝氨酸和酪氨酸；
d.甘氨酸、丝氨酸、精氨酸和半胱氨酸；
e.甘氨酸、丝氨酸、酪氨酸和半胱氨酸；
f.半胱氨酸和精氨酸；
g.半胱氨酸和酪氨酸；
h.半胱氨酸和甘氨酸；
i.半胱氨酸、酪氨酸和精氨酸；或
j.甘氨酸、丝氨酸、精氨酸、酪氨酸和半胱氨酸。
6.根据前述权利要求中任一项所述的膳食产品，其中所述膳食产品还包含一种或更多种大量营养元素和/或一种或更多种微量营养元素。
7.根据前述权利要求中任一项所述的膳食产品，其中所述膳食产品还包含低于25mg/kg/天的水平的甲硫氨酸。
8.根据前述权利要求中任一项所述的膳食产品，其中所述产品配制成至少提供基于平均每日总蛋白质消耗的每日推荐摄入量的必需氨基酸。
9.根据前述权利要求中任一项所述的膳食产品，其中所述膳食产品是固体或饮料的形式。
10.制备根据前述权利要求中任一项所述的膳食产品的工艺，其中将组分溶解或分散在水中并喷雾干燥。
11.一种药物组合物，包含根据权利要求1至9中任一项所述的膳食产品或根据权利要求10所产生的膳食产品以及药学上可接受的载体、赋形剂或稀释剂。
12.根据权利要求11所述的药物组合物，其中所述组合物还包含选自以下的治疗剂：癌细胞生长抑制剂、放射治疗剂和化学治疗剂。
13.根据权利要求11或12所述的药物组合物，其中所述治疗剂抑制OXPHOS和/或增加活性氧物质和/或降低抗氧化剂防御。
14.根据权利要求1至9中任一项所述的膳食产品或根据权利要求10产生的膳食产品或根据权利要求11至13中任一项所述的组合物，用于在疗法中使用。
15.根据权利要求1至9中任一项所述的膳食产品或根据权利要求10产生的膳食产品或根据权利要求11至13中任一项所述的组合物，用于在癌症治疗中使用。
16.根据权利要求15所述的用于使用的膳食产品，其中所述癌症选自由结肠直肠癌、肝癌、骨肉瘤、肺癌、淋巴瘤和乳腺癌组成的组。
17.根据权利要求15或权利要求16所述的用于使用的膳食产品，其中所述癌症对野生型KRAS呈阳性。
18.根据权利要求15至17中任一项所述的用于使用的膳食产品，其中所述癌症已经解除了对cMyc表达的调控。
19.根据权利要求15至18中任一项所述的用于使用的膳食产品，其中所述癌症已经下调了MTAP表达。
20.根据权利要求15至19中任一项所述的用于使用的膳食产品，其中所述膳食产品基本上缺乏丝氨酸和/或甘氨酸。
21.根据权利要求15至20中任一项所述的用于使用的膳食产品，其中所述膳食产品与选自以下的治疗剂组合使用：癌细胞生长抑制剂、放射治疗剂和化学治疗剂。
22.根据权利要求21所述的用于使用的膳食产品，其中所述治疗剂抑制OXPHOS和/或增加活性氧物质和/或降低抗氧化剂防御。
23.根据权利要求1至9中任一项所述的膳食产品或根据权利要求10产生的膳食产品或根据权利要求11至13中任一项所述的组合物在制备用于癌症治疗的药物中的用途。
24.根据权利要求23所述的用途，其中所述癌症选自由结肠直肠癌、肝癌、肺癌、淋巴瘤、骨肉瘤和乳腺癌组成的组。
25.根据权利要求22或权利要求23所述的用途，其中癌症对野生型KRAS呈阳性。
26.根据权利要求22至24中任一项所述的用途，其中所述癌症已经解除了对cMyc表达的调控。
27.根据权利要求22至26中任一项所述的用途，其中所述膳食产品基本上缺乏丝氨酸和/或甘氨酸。
28.根据权利要求22至27中任一项所述的用途，其中所述膳食产品与选自以下的治疗剂组合使用：癌细胞生长抑制剂、放射治疗剂和化学治疗剂。
29.根据权利要求28所述的用途，其中所述治疗剂抑制OXPHOS和/或增加活性氧物质和/或降低抗氧化剂防御。
30.一种治疗受试者中的癌症的方法，包括施用治疗有效量的根据权利要求1至9中任一项所述的膳食产品或根据权利要求10产生的膳食产品或根据权利要求11至13中任一项所述的组合物。
31.根据权利要求30所述的方法，其中所述癌症选自由结肠直肠癌、肝癌、肺癌、骨肉瘤、淋巴瘤和乳腺癌组成的组。
32.根据权利要求30所述的方法，其中所述癌症对野生型KRAS呈阳性。
33.根据权利要求30所述的方法，其中所述癌症已经解除了对cMyc表达的调控。
34.根据权利要求30所述的方法，其中所述癌症已经下调了MTAP表达。
35.根据权利要求30所述的方法，其中所述膳食产品基本上缺乏丝氨酸和/或甘氨酸。
36.根据权利要求30所述的方法，其中所述膳食产品与选自以下的治疗剂组合使用：癌细胞生长抑制剂、放射治疗剂和化学治疗剂。
37.根据权利要求36所述的方法，其中所述治疗剂抑制OXPHOS和/或增加活性氧物质。
38.根据权利要求30所述的方法，其中所述膳食产品是受试者的唯一营养来源。
39.根据权利要求30所述的方法，其中所述治疗在至少24小时的时间段施用或者施用直到观察到治疗终点。
40.根据权利要求30所述的方法，其中所述膳食产品每天施用1次和6次之间。
41.根据权利要求40所述的方法，其中通过每天的施用方案至少满足必需氨基酸的推荐的每日量。
42.KRAS或MTAP作为生物标志物鉴定对癌症治疗响应或敏感的患者或患者群体的用途，所述癌症治疗包括基本上缺乏丝氨酸的饮食。
43.根据权利要求42所述的用途，其中所述癌症治疗包括基本上缺乏丝氨酸和甘氨酸的饮食。
44.根据权利要求42或权利要求43所述的用途，其中所述癌症治疗进一步包括施用选自以下的治疗剂：癌细胞生长抑制剂、放射治疗剂和/或化学治疗剂。
45.一种鉴定对癌症治疗具有降低可能性的响应性或敏感性的受试者的方法，所述癌症治疗包括基本上缺乏丝氨酸的饮食，所述方法包括：
a)确定从所述受试者分离的生物样品中Kras的表达或活性水平；
b)将所述生物样品中Kras的表达或活性水平与对照样品或Kras的表达或活性的预定参考水平进行比较，
其中与所述对照样品相比或与所述预定参考水平相比，所述生物样品中Kras的表达或活性增加的水平指示对所述癌症治疗的不响应性或不敏感性。
46.一种鉴定对癌症治疗具有增加可能性的响应性或敏感性的受试者的方法，所述癌症治疗包括基本上缺乏丝氨酸的饮食，所述方法包括：
a)确定从所述受试者分离的生物样品中Kras表达或活性的水平；
b)将所述生物样品中Kras表达或活性的水平与对照样品或Kras表达或活性的预定参考水平进行比较，
其中与所述对照样品相比或与所述预定参考水平相比所述生物样品中Kras的表达或活性降低的水平，或与所述对照样品或所述预定参考水平基本上相同的Kras的表达或活性水平，指示对所述癌症治疗的响应性或敏感性。
47.一种鉴定可受益于癌症治疗的受试者的方法，所述癌症治疗包括基本上缺乏丝氨酸的饮食，所述方法包括：
a)确定从所述受试者分离的生物样品中Kras表达或活性的水平；
b)将所述生物样品中Kras表达或活性的水平与对照样品或Kras表达或活性的预定参考水平进行比较，
其中与所述对照样品相比或与所述预定参考水平相比所述生物样品中Kras的表达或活性降低的水平，或与所述对照样品或所述预定参考水平基本上相同的Kras的表达或活性水平，指示所述患者可受益于所述癌症治疗。
48.一种鉴定对癌症治疗具有增加可能性的响应性或敏感性的受试者的方法，所述癌症治疗包括i)基本上缺乏丝氨酸、和/或ii)具有限制水平的半胱氨酸的饮食，所述方法包括：
a)确定从所述受试者分离的生物样品中MTAP的表达或活性水平；
b)将所述生物样品中MTAP的表达或活性水平与对照样品或MTAP的表达或活性的预定参考水平进行比较，
其中与所述对照样品相比或与所述预定参考水平相比所述生物样品中MTAP的表达或活性降低的水平，或与所述对照样品或所述预定参考水平基本上相同的MTAP的表达或活性水平，指示对所述癌症治疗的响应性或敏感性。
49.一种鉴定可受益于癌症治疗的受试者的方法，所述癌症治疗包括i)基本上缺乏丝氨酸、和/或ii)具有限制水平的半胱氨酸的饮食，所述方法包括：
a)确定从所述受试者分离的生物样品中表达或活性的水平；
b)将所述生物样品中MTAP的表达或活性水平与对照样品或MTAP的表达或活性的预定参考水平进行比较，
其中与所述对照样品相比或与所述预定参考水平相比所述生物样品中MTAP的表达或活性降低的水平，或与所述对照样品或所述预定参考水平基本上相同的MTAP的表达或活性水平，指示所述患者可受益于所述癌症治疗。
50.根据权利要求45至49所述的方法，其中所述生物样品是癌细胞或癌性组织。
51.根据权利要求50所述的方法，其中所述对照样品是正常细胞或组织样品。
52.根据权利要求51所述的方法，其中所述正常细胞或组织样品是与所述癌细胞或癌性组织相同类型的细胞或组织。
53.一种治疗患有癌症的受试者的方法，包括：
a)确定从所述受试者分离的生物样品中Kras和/或MTAP表达或活性的水平是否指示对包括基本上缺乏丝氨酸的饮食的癌症治疗的响应性或敏感性；以及
b)向所述受试者施用癌症治疗，其中在所述生物样品中Kras和/或MTAP的表达或活性水平指示对所述癌症治疗的响应性或敏感性。
54.根据权利要求49所述的方法，其中所述癌症治疗包括基本上缺乏丝氨酸和甘氨酸的饮食。
55.根据权利要求53或54所述的方法，其中所述癌症治疗还包括施用选自以下的治疗剂：癌细胞生长抑制剂、放射治疗剂和/或化学治疗剂。
56.根据权利要求53至55中任一项所述的方法，其中确定从所述受试者分离的生物样品中Kras表达或活性的水平是否指示对包括基本上缺乏丝氨酸的饮食的癌症治疗的响应性或敏感性包括：
a)确定从所述受试者分离的生物样品中Kras表达或活性的水平；
b)将所述生物样品中Kras表达或活性的水平与对照样品或Kras表达或活性的预定参考水平进行比较，
其中与对照样品相比或与预定参考水平相比，所述生物样品中Kras的表达或活性增加的水平指示所述受试者对所述癌症治疗的不响应性或不敏感性，并且其中与对照样品相比或与预定参考水平相比所述生物样品中Kras的表达或活性降低的水平，或与对照样品或预定参考水平基本上相同的Kras的表达或活性水平，指示所述受试者对所述癌症治疗的响应性或敏感性。
57.根据权利要求53至56中任一项所述的方法，其中确定从所述受试者分离的生物样品中MTAP表达或活性的水平是否指示对包括基本上缺乏丝氨酸的饮食的癌症治疗的响应性或敏感性包括：
a)确定从所述受试者分离的生物样品中MTAP的表达或活性水平；
b)将所述生物样品中MTAP的表达或活性水平与对照样品或MTAP的表达或活性的预定参考水平进行比较，
其中与对照样品相比或与预定参考水平相比所述生物样品中MTAP的表达或活性降低的水平，或与对照样品或预定参考水平基本上相同的MTAP的表达或活性水平，指示所述受试者对所述癌症治疗的响应性或敏感性。
58.一种用于在鉴定将受益于癌症治疗的受试者中使用的试剂盒，所述癌症治疗包括基本上缺乏丝氨酸的饮食，所述试剂盒包括：
a.用于确定Kras的表达或活性的剂；和
b.用于测定的试剂。
59.根据权利要求53所述的试剂盒，所述试剂盒还包含这样的说明：即与对照样品相比或与预定参考水平相比，生物样品中Kras的表达或活性增加的水平指示所述受试者对所述癌症治疗的不响应性或不敏感性，并且其中与所述对照样品相比或与预定参考水平相比所述生物样品中Kras的表达或活性降低的水平，或与所述对照样品或所述预定参考水平基本上相同的Kras的表达或活性水平，指示所述受试者对所述癌症治疗的响应性或敏感性。
60.根据权利要求58或59所述的试剂盒，其中所述试剂盒包含用于确定MTAP的表达或活性的剂。
61.一种用于在鉴定将受益于癌症治疗的受试者中使用的试剂盒，所述癌症治疗包括基本上缺乏丝氨酸的饮食，所述试剂盒包括：
a.用于确定MTAP的表达或活性的剂；和
b.用于测定的试剂。
62.根据权利要求1所述的膳食产品，所述膳食产品参考说明书和附图，基本上如本文所述。
63.根据权利要求11所述的药物组合物，所述药物组合物参考说明书和附图，基本上如本文所述。
64.根据权利要求15所述的用于使用的膳食产品或根据权利要求23所述的用途或根据权利要求25或权利要求53所述的治疗方法，其参考说明书和附图，基本上如本文所述。
65.KRAS或MTAP作为生物标志物的用途，其参考说明书和附图，基本上如本文所述。
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